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• Mingo Mango

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AMILASA CNPG Liquiform Instrucciones de Uso

Finalidad . Sistema para determinación de la α-Amilasa en muestras de sangre, orina y otros líquidos biológicos. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.]

Principio . La α-Amilasa hidroliza el sustrato α-(2-cloro-4-nitrofenil)β-1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2-α-CNP), liberando 2-cloro-4nitrofenol (CNP) y 1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2). La velocidad de formación de 2-cloro-4-nitrofenol puede ser medida fotométricamente y proporciona una medida directa de la actividad de la α-Amilasa en la muestra. α-Amilasa Gal-G2-α-CNP + H2O

Gal-G2 + CNP

Características del sistema . Los métodos más recientes para la determinación de la α-Amilasa se basan en la producción de p-nitrofenol a partir de la hidrólisis de sustratos de oligosacáridos bien definidos, con grupos bloqueadores ligados en el glúcido terminal. La acción hidrolítica de la α-Amilasa en estos oligosacáridos produce varias cadenas de diferentes tamaños, siendo necesario acoplar reacciones enzimáticas auxiliares para liberar el p-nitrofenol. En muchos casos la presencia de trazas de amilasa, como contaminante de las enzimas auxiliares, disminuye considerablemente la estabilidad de estos sustratos. El ensayo propuesto utiliza un sustrato cromogénico, 2-cloro-4nitrofenol, unido a 1,4-galactopiranosilmaltosida (Gal-G2). La α-Amilasa actúa directamente sobre este sustrato, liberando una cantidad mayor al 90 % del cromógeno CNP, cuya velocidad de formación puede ser medida cinéticamente. Se utiliza un sustrato en medio líquido, que no requiere el empleo de enzimas auxiliares para la formación del producto coloreado, obteniéndose entonces una prolongada estabilidad del sustrato. El sistema Labtest se correlaciona muy bien con los métodos que utilizan sustratos bloqueados con benzilidina o etilidina y demuestra poseer una mejor sensibilidad con una linealidad hasta de 20 veces el valor de referencia superior. El método es fácilmente aplicable en analizadores automáticos capaces de medir una reacción cinética a 405 nm.

Metodologia . Sustrato Gal-G2-α-CNP. Reactivo 1.

1 - Sustrato - Almacenar entre 2 - 8 ºC. Contiene tampón 50 mmol/L, α -(2-cloro-4-nitrofenil)- β -1,4galactopiranosilmaltosida 3,0 mmol/L, cloruro de sodio 300 mmol/L, cloruro de calcio 5 mmol/L, tiocianato de potasio 900 mmol/L, azida sódica 14,6 mmol/L, estabilizadores y surfactantes.

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Los reactivos no abiertos, cuando almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en el rótulo. Durante su manipuleo están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y bacteriana que pueden provocar reducción de la estabilidad.

Precauciones y cuidados especiales Pipetear el sustrato con la boca, soplar sobre el sustrato, usar material contaminado con sudor o saliva y conversar junto al frasco destapado, son acciones que pueden contaminar el reactivo con cantidades microscópicas de sudor o saliva capaces de deteriorar irremediablemente el sustrato. Como ocurre en todas las reacciones enzimáticas, la rigurosa observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de enorme importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Estudios de estabilidad mostraron que la absorbancia del sustrato, medida contra agua, presenta un incremento de 0,006 por mes. Elevaciones repentinas de la absorbancia del sustrato indican una contaminación con saliva o sudor. No utilizar el reactivo cuando su absorbancia medida contra agua a 405 nm sea igual o mayor que 0,300 o cuando el sustrato se muestre turbio o con señales de contaminación. Se deben aplicar los cuidados habituales de bioseguridad en la manipulación de los reactivos. El sustrato contiene azida sódica que es tóxica. Hay que tomar cuidado para evitar la ingestión y en caso de contacto con ojos y piel se deben lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y buscar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las tuberías de plomo y cobre. Por ello, utilizar abundante cantidad de agua para descartar el reactivo. El reactivo contiene también tiocianato de potasio que es venenoso. No ingerir.

Materiales necesarios y no suministrados 1. Fotómetro con cubeta termostatizada, capaz de medir con exactitud la absorbancia en 405 nm; 2. Pipetas para dispensar muestras y reactivo;

3. Cronómetro. Muestra Se debe crear un Procedimiento Operacional Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para recoger, preparar y almacenar la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico.

Usar suero o plasma (heparina) y líquidos (ascítico, duodenal o pleural). Las muestras con Citrato, EDTA u Oxalato no deben ser usadas porque producen resultados falsamente disminuidos. La actividad enzimática es estable 7 días entre 15 - 25 ºC y varios meses entre 2 - 8 ºC. No usar muestras con señales de contaminación bacteriana. Las muestras de orina deben ser recogidas en el intervalo de 2 a 24 horas. Cuando se determina la amilasa en una muestra de una micción, se debe determinar también la creatinina en la misma muestra. El resultado se deberá reportar como Relación Amilasa/Creatinina (U/g), con el objetivo de compensar las variaciones de la actividad de la amilasa en las muestras obtenidas en cada micción. Las muestras de orina deben almacenarse entre 2 - 8 ºC. No adicionar conservador alguno. Como ningún test conocido puede asegurar que las muestras de material biologico no transmiten infecciones, todas ellas deben ser consideradas como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas se deben seguir las normas establecidas para bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico, deberán aplicarse las normativas locales, regionales o federales de protección ambiental.

Interferencias

Calculos . Véase linealidad. Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción las que incluyen: 1. Longitud de onda: 405 nm ± 0,2 nm.

2. Cubeta termostatizada a 37 ± 0,2 ºC con 1,0 cm de espesor de solución. 3. Ancho medio de banda ≤8 nm. 4. Luz espuria ≤0,1 %. Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda la línea Calibra para calibración del sistema Amilase CNPG Liquiform. (A2 - A1) ∆A = 2 Actividad de la Amilasa (U/L) = ∆A de la Prueba x 3953 El factor fue calculado según las condiciones de reacción propuestas. Hay que calcular un nuevo factor cuando cualquier modificación sea efectuada. Ver método para el cálculo del factor.

Valores de bilirrubina hasta 20 mg/dL y hemoglobina hasta 180 mg/dL no interfieren en la reacción. Valores de triglicéridos hasta 1800 mg/dL no producen interferencias. Valores de triglicéridos entre 1800 y 3500 mg/dL producen una interferencia negativa de aproximadamente el 10 %.

A1 de la Prueba = 0,197 A2 de la Prueba = 0,266

Medicamentos colinérgicos, narcóticos (morfina) y alcohol producen resultados falsamente elevados de la amilasa sérica.

∆A de la Prueba =

Ejemplo

(0,266 - 0,197) = 0,034 2

La presencia de macroamilasa en la muestra de suero, que resulta del complejamiento de la amilasa con proteínas de elevado peso molecular, puede producir resultados falsamente elevados de la amilasa sérica en ausencia de pancreatitis.

Procedimiento

Actividad de la Amilasa (U/L) = 0,034 x 3953 = 134 Amilasa Orina / Hora Amilasa(U/L) x Volumen de orina (mL) Amilasa Urinaria (U/h) = 1000 x tiempo de recolección (h)

1. En un tubo 12x75 pipetear 1,0 mL de Sustrato.

Relación Amilasa / Creatinina

2. Añadir

0,02 mL de muestra, homogeneizar y transferir inmediatamente a la cubeta termostatizada a 37±0,2 ºC. Esperar 1 minuto.

3. Hacer

la lectura de la absorbancia inicial (A1), disparando simultáneamente el cronómetro. Repetir la lectura después de 2 minutos (A2). Para veificar la linealidad de la reacción, hacer también una lectura con intervalo de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia en cada minuto es constante.

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Amilasa (U/L) x 100 Relación Amilasa / Creatinina (U/g) = Creatinina (mg/dL) Método para el cálculo del factor VT x 1000 Factor de calibración = ε x VM x d VT = Volumen total del ensayo (1,02 mL) VM = Volumen de la muestra (0,02mL) 1000 = Factor de conversión de U/mL a U/L d = Camino óptico de la cubeta (1cm) ε = absortividad milimolar del 2-cloro-4-nitrofenol a 405 nm, pH 6,0 a 37 ºC (12,9)

Amilasa en orina (U/L) x Creatinina en suero (mg/dL) Relación (%) = x 100 Amilasa en suero (U/L) x Creatinina en orina (mg/dL)

Ejemplo 1,02 x 1000 Factor =

= 3953 12,9 x 0,02 x 1

Calibración . La absortividad molar del 2 cloro-4-nitrofenol, producto de la reacción, es utilizada como sistema de referencia para la calibración del ensayo. Calibraciones manuales Obtener el factor de calibración al hacer la manutención del instrumento o cuando cambiar las aplicaciones. Sistemas automáticos Blanco de reactivos: agua o solución del NaCl 150 mmol/L (0,85%); Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. Las concentraciones de la Amilasa en los calibradores de la línea Calibra son trazables al absortividad molar del 2 cloro-4-nitrofenol. Intervalo de las calibraciones Calibración del blanco al usar nuevo frasco de reactivo; Calibración de 2 o 3 puntos al cambiar el lote; Calibración de 2 o 3 puntos cuando el control interno de la calidad indicar

Valores de referencia . Estos valores se deben usar únicamente como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca en la población atendida su propio rango de valores de referencia. Suero / Plasma 25 a 125 U/L Orina Hasta 30 U/h Relación Amilasa urinaria / Creatinina urinaria Hasta 400 U/g Depuración de la Amilasa / Depuración de la Creatinina 1,0 a 4,0% Conversión de U/L para Unidades SI: µkat = U/L x 0,0167 8

Características del desempeño

Exactitud . En dos muestras con concentraciones de amilasa iguales a Linealidad El resultado de la medición es lineal hasta 2000 U/L. Para valores más altos, diluir la muestra con solución NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar una nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Diluir la muestra de modo tal que el valor encontrado se sitúe entre 100 y 1500 U/L. Se sugiere la verificación de la linealidad metodológica y fotométrica como mínimo semestralmente, utilizando muestras con valores de hasta 2000 U/L.

Control interno de la calidad . El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina con claridad los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados para evaluar la imprecisión e desviaciones de calibración. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación máximo y el error 5,6,7 total sean basados en los componentes de la variación biológica (VB) . Se sugiere utilizar las prepaciones estabilizadas de la línea Qualitrol Labtest para el control interno de la calidad en ensayos del laboratorio clínico.

Relación depuración de la amilasa / depuración de la creatinina . En la mayoría de los casos de pancreatitis aguda ocurren elevaciones concomitantes de la amilasa sérica y de la urinaria, pero en ciertos casos, la elevación de la amilasa urinaria no es acompañada por una elevación paralela de la amilasa sérica. Por lo tanto, la validez de la relación depuración de la amilasa/depuración de la creatinina, expresada en porcentaje, proporciona un mayor valor diagnóstico en los casos de pancreatitis aguda y pancreatitis recurrente. Para ello, se debe determinar la actividad de la amilasa y la concentración de la creatinina, ambas en suero y en orina, y aplicar los resultados en la siguiente fórmula :

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95, 148 y 482 U/L, se añadieron cantidades diferentes de analitos, obteniéndose recuperaciones de entre el 93,5 y el 95,9 %. El error sistemático proporcional medio obtenido fue igual a 5,3%.

Especificidad . El método propuesto fue comparado con un método que usa un sustrato CNPG3 utilizando 40 muestras con valores situados entre 7,9 y 988U/L. La comparación resultó en la ecuación de regresión y = 1,003x - 1,646 con un coeficiente de correlación (r) igual a 0,998. En los niveles de decisión iguales a 75, 125 y 400U/L la diferencia sistemática fue igual a 1,8; 1,0 y 0,3% respectivamente.

Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

N 9 20 20

Media 85 131 397

DE 1,32 1,25 2,10

CV (%) 1,55 0,95 0,53

Reproducibilidad - imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

N 9 20 20

Media 85 131 397

DE 2,28 2,19 2,74

CV (%) 2,69 1,67 0,69

Sensibilidad metodológica . Utilizándose la absorbancia mínima detectable como parámetro, se verificó que el límite de sensibilidad fotométrica es 3,9 U/L, correspondiendo a una absorbancia igual a 0,001.

Efectos de la dilución de la matriz . Dos muestras con valores iguales a 2146 y 2281 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando factores de dilución que variaron de 2 a 4, la media encontrada fue 103,8%.

Presentación Producto

Referencia

Amilasa CNPG Liquiform

25-2/30

Contenido 1

2 x 30 mL

Observaciones 1. La limpieza y secado del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.

2. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua deionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad ≥1 megaohm.cm o conductividad ≤1 microsiemens/cm y concentración de silicatos testes Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests

Risco biológico Riesgo biológico Biological risk

Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy)

Marca CE Marcado CE CE Mark

Material Calibrador Material Calibrador Calibrator Material

Tóxico Tóxico Poison

Material Calibrador Material Calibrador Calibrator Material

Reagente Reactivo Reagent

Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at)

Fabricado por Elaborado por Manufactured by

Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community

Número do lote Denominación de lote Batch code

Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use

Controle Control Control

Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number

Controle negativo Control negativo Negative control

Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes

Controle positivo Control positivo Positive control

Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device

Controle Control Control

Liofilizado Liofilizado Lyophilized

Corrosivo Corrosivo Corrosive

Ref.: 170309

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