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• Libni Libni Ram Ramos

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MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio

PRACTICA Núm. 7 ESTERILIZACION POR CALOR SECO Y CALOR HUMEDO I. OBJETIVO Demostrar la diferencia de “penetrabilidad” del calor seco y del calor húmedo usando como indicador la viabilidad de una bacteria.

II. INTRODUCCION Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad. Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos. La muerte de las bacterias por el calor es consecuencia de la desnaturalización de sus proteínas. Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de Hidrógeno), de las proteínas de los cuales depende su funcionalidad son más lábiles cuando las proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el “calor húmedo” es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes proteicos importantes para la célula que el “calor seco”. Es por eso que se dice que el calor húmedo tiene mayor “penetrabilidad” que el calor seco. El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propósito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este proceso se flama “Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo sometido a éste, se le denomina entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda forma viviente.

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El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puede esterilizar por calor húmedo y por calor seco. En ambos casos hay numerosos factores que condicionan la efectividad del proceso: Cantidad de agua, temperatura, presión, tiempo de contacto, superficie de esterilización, pH, “edad” de las bacterias, la presencia o no de esporas, composición del medio de suspensión, etc. Las células vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismo varían considerablemente en cuanto a su resistencia al calor. La muerte de los microorganismos es más rápida a pH ácido. Las concentraciones elevadas de azúcares, proteínas o grasas disminuyen la penetración del calor y habitualmente aumentan la resistencia de los organismos al calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal pueden incrementar o bien reducir la resistencia al calor, dependiendo del organismo.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS − 2 tubos de ensayo conteniendo cada uno un aplicador contaminado con cultivo bacteriano. − 2 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estéril. − Gradilla. − Canastilla para colocar los tubos rotulados con “A”. − Vaso de precipitados para colocar los tubos rotulados con “H”. − Mechero Bunsen. − Cerillos ó encendedor. − Masking tape. − Asa bacteriológica. − Autoclave. − Horno de calor seco. IV. TECNICA 1. Rotular uno de los tubos conteniendo un aplicador contaminado con la palabra Horno y el otro con la palabra Autoclave, anotando además el nombre del alumno o número de equipo, para su identificación.

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2. Esterilizar los cultivos por el método correspondiente, según el rótulo, en ambos casos a una temperatura de 121 °C y un tiempo de 15 minutos. 3. Después de este período, sacar los tubos y añadirles, en condiciones asépticas, caldo nutritivo estéril. 4. Incubar a 37 °C, por 24-48 horas. 5. Después de este período observar si hubo o no desarrollo en los tubos, el cual se manifiesta mediante turbidez del medio. 6. Anotar los resultados y sacar conclusiones en cuanto al poder de penetrabilidad del calor seco y del calor húmedo.

MANEJO DE AUTOCLAVE: 1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay suficiente, agregarla hasta que casi llegue a la parrilla inferior. 2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien colocado para evitar algún problema y cerrar la puerta ajustándola bien. Debe de quedar herméticamente cerrado. 3. Abrir la válvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave. 4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termómetro), empezará a salir una mezcla de vapor-aire por la válvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a ésto se le flama purgar el autoclave. 5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida de vapor y dejar que la presión suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada (vigilar el manómetro), lo que proporciona una temperatura de 121 °C. Observar que no es la presión del autoclave lo que mata a los microorganismos sino la elevada temperatura que puede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a presión. 6. En ese momento empezar a contar el tiempo. 7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presión, apagar la fuente de calor y dejar que el autoclave se enfríe sólo (no abrir la válvula de salida de vapor), hasta que la presión haya bajado a 0 libras.

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8. Abrir el autoclave y sacar el material.

MANEJO DEL HORNO DE CALOR SECO: 1. Para efectos de esta práctica, encender el horno eléctrico y mediante el termostato, elevar la temperatura hasta que llegue a 121 °C y mantener esta temperatura constante. 2. Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta. 3. Empezar a contar 15 minutos de exposición a esa temperatura. 4. Después de este período, apagar el horno, abrir la puerta y sacar el material. Si aún está caliente, usar un guante de asbesto.

V. CUESTIONARIO 1. Dibujar y describir un Autoclave y un Horno de calor seco. 2. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el Autoclave? Dar ejemplos. 3. ¿Cuál es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr la esterilización en el Horno de calor seco? 4. ¿Por qué es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilización? 5. ¿En qué consisten los métodos de Arnoldización y Pasteurización?

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