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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 14 Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens ASIGNATURA

: Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE

: Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO

: Rómulo Aycachi Inga

CICLO

: 2007 - II Lambayeque, 03 de abril de 2008.

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PRÁCTICA Nº 14

Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens I.

Introducción:

El género Clostridium está formado por más de cien especies con limitada relación genética y propiedades bioquímicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales así como también en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayoría son saprofitos, pero los patógenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, tétanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibióticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad esta vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formación de esporas, crecer rápidamente y producir toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotoxinas. Clostridium perfringens es la especie del género Clostridium más frecuentemente aislada en materiales clínicos. Es un bacilo gram positivo grande (1μm de ancho por 4 μm de largo, en promedio) de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rápidamente en anaerobiosis, produciendo colonias grandes (1 a 3 μm de diámetro) que muestran doble halo de hemólisis en las placas de agar sangre. Sus características morfológicas, la demostración de presencia de esporas, el rápido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioquímicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rápida detección en el laboratorio. C. perfringens es agente etiológico de muchas enfermedades y es la tercera causa de toxinfección alimentaria bacteriana después Samonella spp. y Saphylococcus aureus. Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E. C. perfringens A es el responsable de la mayoría de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina (polipéptido de 35.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un superantígeno promoviendo la liberación de mediadores de inflamación en forma masiva. La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. En el intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteración de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una pérdida de iones y metabolitos. Esta pérdida electrolítica altera la función metabólica intracelular provocando daño morfológico y eventual lisis. La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado número de organismos productores de enterotoxinas (100 millones). Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulación y la liberación de enterotoxinas. No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a través de alimentos preparados comercialmente y destinados a restaurantes o instituciones. Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo es necesario recuperar el agente de la muestra clínica y del paciente. Se deben recuperar al menos 100.000 UFC de C. perfringens por gramo de alimento y 1.000.000 de microorganismos por gramo de heces en las primeras 24 horas. Es posible detectar anticuerpos contra la enterotoxina pero ellos no tienen valor protector

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II. III. IV.

Objetivos: Determinar la presencia de C. perfringens sulfito reductores de muestras de alimentos. Familiarizarse con los métodos de aislamientos de bacterias anaeróbicas en alimentos. Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos microorganismos en los alimentos. Materiales: Medios de Cultivo: Agar Wilson-Blair. Diluyente: Agua peptonada Muestras: Agua de acequia, pescado fresco salado. Baño María

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Tubos de ensayo con tapa rosca Pipetas Frascos estériles Gradillas Mechero Bunsen

Procedimiento:

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Para muestra de agua: a. Tomamos 5 tubos de ensayo a los cuales les agregaremos 5 mL de aguas servidas a cada uno. b. Luego agregaremos el medio Wilson-Blair, previamente calentado (disuelto) en el baño María. c. El agua servida debe haber sido también calentada, previamente, en el baño María a 80 ºC por 10 min. d. Al medio le agregamos la solución sulfato-ferrosa. e. Luego incubamos los tubos en anaerobiosis a 37 ºC por 48 h. f. Se observarán, de ser positivas, colonias negras en la profundidad. g. Los resultados se dan en “esporas de Clostridium sulfito reductoras/100 mL”.

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Para muestra de alimentos: a. La muestra de pescado es eviscerada, le sacamos la piel, las agallas y si hubiera, los intestinos. b. Luego, ponemos todo eso en un frasco estéril y le agregamos el diluyente (agua peptonada) la cantidad suficiente. Homogenizamos. c. Luego realizamos las diluciones respetivas (10-1, 10-2, 10-3). d. De las diluciones realizadas sembramos por método de “siembra en profundidad”, una placa por cada dilución. e. Luego enviamos a incubar, en anaerobiosis, a 37 ºC por 48 h. f. Al igual que en la anterior, la positividad de las colonias se verá por su característico color negro.

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V. -

10-1

Resultados: En la muestra de alimentos (pescado fresco salado), no se llegó a aislar C. perfringens. En las placas utilizadas crecieron otro tipo de bacterias, pero no con las características deseadas, típicas del género a estudiar.

10-2 -

10-3

El grupo que trabajó con la muestra de agua obtuvo resultados positivos (sulfitoreductores).

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VI.

Preguntas:

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¿Cuáles son las pruebas bioquímicas utilizadas para identificar C. perfringens? a. Para la identificación bioquímica de C. perfringens se realizan las sgte. Pruebas bioquímicas:  Fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, ramnosa, manitol.  Hidrólisis de: almidón, gelatina, esculina, caseína, DNA, lecitina.  Producción de: hidrógeno sulfurado, indol, gas.

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¿Cómo se consigue un medio anaerobio para la incubación de las bacterias de este tipo?  Como los anaerobios estrictos varían en su sensibilidad al oxígeno, existen diferentes métodos para disminuir la cantidad de oxígeno en los cultivos; algunos sencillos y otros mucho más complejos.  Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de cultivo y los tapones apropiados, proporcionan condiciones anóxicas suficientemente buenas para el crecimiento de muchos anaerobios.  También es posible añadir algún compuesto químico que reacciona con el oxígeno del aire y la reduce hasta H2O. Un buen ejemplo de esto es el tioglicolato, comúnmente utilizado para ensayar el requerimiento de oxígeno de un microorganismo. Después de que el tioglicolato reaccione con el oxígeno del tubo, el oxígeno puede penetrar solamente en la parte superior, donde el medio contacta con el aire.  Para quitar todas las trazas de oxígeno para el cultivo de anaerobios puede utilizarse una “jarra de anaerobios”. El aire de la jarra de sustituye por una mezcla de hidrógeno y anhídrido carbónico y, en presencia de un catalizador, se consumen las trazas de oxígeno que todavía quedan, esto proporciona condiciones totalmente anóxicas para el crecimiento de anaerobios estrictos.

VII. -

Referencias:

Apuntes sobre bacteriología (2003) Clostridium perfringens y Clostridium botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf PINEDA, Yuraima, APONTE, Fanny y SANTANDER, Jorge. AISLAMIENTO DE Clostridium perfringens EN UN TERNERO DE VENEZUELA. RC, jun. 2004, vol.14, no.3, p.226-229. ISSN 0798-2259. MADIGAN, M., J. MARTINKO, P. PACK. 1998. Biología de los Microorganismos de Brock. 8º edic. Edit. Prentice Hall. Madrid.

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