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División de Ciencias Biológicas y de la Salud Licenciatura Química Farmacéutica Biológica

Modulo VI: Evaluación de materias primas para la elaboración de medicamentos

Practica de laboratorio N° 1 Uso de la espectroscopía ultravioleta visible para la identificación y cuantificación de fármacos

Docente: Dra. Georgina Alarcón Ángeles Equipo 5 Edgar Francisco Flores de la Cruz Cristal Aidee Jiménez Juárez Jorge Antonio Juárez Álvarez Miguel Sánchez Barba Bárbara Varela Petrissans

Laboratorio: G-202

Trimestre: 15-Primavera

Fecha: 28 de mayo de 2015

INTRODUCCIÓN La espectrofotometría se refiere a métodos de análisis químico que utilizan un haz de luz para medir la concentración de sustancias. Una de las técnicas más importantes es el UV-visible debido a su aplicación en la industria farmacéutica. (Barajas, 2011). La espectroscopia UV-visible es utilizada en laboratorios como instrumentos para análisis cualitativos y cuantitativos de compuestos químicos; y para la identificación de fármacos los cuales tienden a absorber en las regiones Uvvisible, posibles, este efecto se lleva a cabo por la presencia de grupos cromóforos en las moléculas que se encuentran en la muestra. Utiliza una radiación del espectro electromagnético con una longitud de onda comprendida entre los 100 y los 800 nm (Elmer, 2010). La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), en donde ocurre una transición de los electrones más externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles más altos de energía. Esta metodología no tiene selectividad y por esta razón se utilizan en fármacos que presentan absorción en la misma región del espectro. (Nieves, 2011). Mediante esta técnica son posibles preparar curvas de calibración, mediante patrones que muestran un cambio en la pendiente o el uso de un nuevo lote de reactivos, también, se utiliza para la determinación de mezclas de diferentes tipos de compuestos en los fármacos. Sin embargo esto permite un mejor desarrollo para predecir la cantidad de sustancias sin la separación de analitos. (Arévalo, 2006). Por consiguiente dos elementos muy importantes en este método es la transmitancia T de una sustancia en solución que es la relación de la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, y la cantidad de luz que incidió sobre ella y la absorbancia A que nos indica la cantidad de luz absorbida por la muestra. (Caballero, 2011).

Antecedentes La espectrofotometría, fue descubierta por la dispersión de la luz en 1704 por newton, por los cuales se desarrollaron técnicas experimentales. Años más tarde fraunhofer creó un sistema óptico, con el uso de prismas y rendija lo cual permitió detectar el espectro de la luz solar las líneas de absorción. Gracias a esto se obtuvieron conocimientos de que cada elemento químico posee un espectro de emisión de líneas características. (Téllez, 2008).

En 1859 bunsen y Kirchhoff se consideraron como los fundadores del análisis espectral y los primeros que construyeron un equipo antecesor al espectrofotómetro. Años después el desarrollo de sistemas de detección fotoeléctrica permitió en los años 40 la sustitución de equipos de detección fotográfica poco eficientes. En ese momento la técnica espectroscópica se empezó a utilizar. (Applied, 2010). El desarrollo de sistemas de detección fotoeléctrica permitió en los años 40 la sustitución de los equipos de detección fotográfica, poco eficientes, y la generalización de esta técnica espectroscópica. (Grisales, 2013). El Ácido Acetil salicílico (AAS) (conocido popularmente como aspirina), es un fármaco de la familia de los salicilatos, usado frecuentemente como antiinflamatorio, analgésico (para el alivio del dolor leve y moderado), antipirético (para reducir la fiebre) y antiagregante. La acción de estos analgésicos se basa en la inhibición de la síntesis de prostaglandinas (mediadores del dolor y de la inflamación) en los tejidos periféricos. De ahí que estas sustancias tengan una enorme importancia sanitaria, ya que comercializadas como medicamentos y administradas al cuerpo humano ayudan a atenuar distintas dolencias.

Estructura química de AAS

OBJETIVO:   

Aplicar la espectroscopia ultravioleta visible para la identificación de fármacos Determinar el coeficiente de absortividad de fármacos como ácido acetilsalicílico, cafeína y acetaminofén Determinar la concentración de una muestra problema a partir de una curva de calibración

MATERIAL Y REACTIVOS    

Espectrofotómetro de UV-VIS Celdas de cuarzo de 1 cm Piseta de agua destilada 5 Matraces aforados de 100 mL

      

5 Matraces aforados de 10 mL 5 Matraces aforados de 5 mL 3 Vasos de precipitado de 30 mL 3 Vasos de precipitado de 10 mL 3 Pipetas volumétricas de 1mL 2 Pipetas graduadas de 1 mL 1 Espátula

  

ácido acetilsalicílico metanol Agua desionizada

METODOLOGÍA Identificación del fármaco. Prepare por triplicado una solución del fármaco de estudio que contenga al 1mg/100mL en metanol. Obtenga el espectro de absorción en la región del Ultravioleta, y determine la longitud de onda máxima y el coeficiente de absortividad. Preparación de la Curva de calibración Preparar la solución del fármaco, pesando 10 mg y disolver en metanol a 100ml, a partir de esta solución preparar por triplicado 5 soluciones que contengan 10μg/ml, 8μg/ml, 6μg/ml, 4μg/ml, 2μg/ml, en matraces aforados de 10 o 5 ml (según convenga). Leer las absorbancias a la longitud de onda correspondiente.

Procedimiento 1) Pese exactamente la cantidad que se requiere, anote el peso real con todos los decimales 2) Prepare las soluciones a las concentraciones deseadas, sea exacto en el aforo 3) Obtenga los espectros de absorción 4) El blanco (blanco se refiere al disolvente con el cual se disolvió el fármaco, se dice también que es todo lo que contiene la solución sin el analito) 5) El fármaco iniciando con la concentración de 6) Seleccione la longitud de onda de estudio para la curva de calibración

7) Obtenga las absorbancias de: el blanco, posteriormente de las soluciones del fármaco de la más diluida a la más concentrada. 8) Haga una Tabla de concentración y Absorbancia 9) Obtenga los siguientes parámetros: coeficiente de absortividad al 1%, coeficiente molar, la ecuación de la recta 10)Obtenga la absorbancia de las muestras problema y determine la concentración. DIAGRAMA DE FLUJO

Pesar 10 mg de AAS

Seleccionar las longitudes de onda de estudio

Obtener espectro de absorción de a solución de las concentrciones de la mas diluida a la mas concentrada

Disolver en metanol y aforar en 100 mL

Obtener espectro de absorción de a solución 10µg/mL

Hacer una tabla de concentración y Absorbancia

Preparar soluciones de concentración 20µg/mL, 16 µg/mL, 12µg/mL, 10µg/mL, 8µg/mL, 4µg/mL

Obtener espectro de absorción del blanco

Realizar curva de calibración

PLAN DE TRABAJO ANALIST A Edgar

ACTIVIDAD • •

Lavado del área de trabajo Preparación de solución de concentración 14 µg/mL

• •

Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 4µg/mL Lavado de material para entrega

Antonio

Miguel

• • •

Lavado de material Pesada de AAS Preparación de disolución de concentración 100 µg/mL, 20µg/mL y 10µg/mL

•

Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 20µg/mL, 10µg/mL, 8µg/mL

•

Cálculos de para preparar las soluciones

•

Preparación de solución de concentración 12 µg/mL

•

Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 12 µg/mL

•

Recoger el material con el laboratorista

•

Preparación de solución de concentración 16 µg/mL

•

Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 16 µg/mL, 4µg/Ml

•

Desecho de reactivos

Bárbara

PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES C1= 103 µg/mL V1= 2mL

(103 C 2=

µg )(2 mL) mL = 20.6 µg/mL 10 mL

C2= 20.6 µg/mL V2= 10 mL C1= 103 µg/mL V1= 1.6 mL C2= 16.48 µg/mL V2= 10 mL C1= 103 µg/mL

(103 C 2=

µg )(1.6 mL) mL 10 mL

= 16.48 µg/mL

(103

V1= 1.4 mL

C 2=

µg )(1. 4 mL) mL 10 mL

= 14.42 µg/mL

C2= 14.42 µg/mL V2= 10 mL C1= 103 µg/mL V1= 1.2 mL

( 103 C 2=

µg )(1.2 mL) mL 10 mL

= 12.36 µg/mL

C2= 12.36 µg/mL V2= 10 mL

C1 = 103 µg/mL V1= 1 mL

µg )(mL) mL 10 mL

( 103 C 2=

= 10.3 µg/mL

C2= 10.3 µg/mL V2= 10 mL C1 = 103 µg/mL V1= 0.8 mL

( 103 C 2=

µg )(0.8 mL) mL 10 mL

= 8.24 µg/mL

µg )(0.4 mL) mL 10 mL

= 4.12 µg/mL

C2= 8.24 µg/mL V2=10 mL C1 = 103 µg/mL V1= 0.4 mL

(103 C 2=

C2= 4.12 µg/mL V2=10 mL

RESULTADOS Conversión de concentraciones (De µg a M) 20.6 µg 1g 1 mol 1000mL mol x x x =1.143 x 10−4 6 mL 180.6 g 1 L L 1 x 10 µg

16 .48 µg 1g 1mol 1000 mL mol x x x =9.14 x 10−5 6 mL 1L L 1 x 10 µg 180.6 g 12.36 µg 1g 1 mol 1000 mL mol x x x =6.86 x 10−5 6 mL 180.6 g 1 L L 1 x 10 µg 8.24 µg 1g 1 mol 1000 mL mol x x x =4.573 x 10−5 6 mL 1L L 1 x 10 µg 180.6 g 4 .12 µg 1g 1 mol 1000 mL −5 mol x x x =2.28 x 10 6 mL 180.6 g 1 L L 1 x 10 µg

Cálculos de absorbancia teóricos de mayor a menor concentración (20 µg/mL-4 µg/mL)

)(

−4 L A= 6890 1.143 x 10 mol cm−1

(

mol L

) (1 cm )=0.629

)(

mol L

) ( 1 cm )=0.472

−5 L A= 6890 6.86 x 10 −1 mol cm

(

)(

−5 L A= 6890 4.573 x 10 −1 mol cm

( (

A= 6890

) ( 1 cm )=0.787

)(

−5 L A= 6890 9.14 x 10 mol cm−1

(

mol L

)(

−5 L 2.28 x 10 −1 mol cm

mol L

mol L

) ( 1 cm )=0.314

) ( 1 cm )=0.157

Resultados de las mediciones en el espectrofotómetro UV-Vis Concentración (µg/mL) 4.12

210 nm 0.307

225 nm 0.172

230 nm 0.154

4.12

0.278

0.16

0.151

4.12

0.277

0.144

0.131

8.24

0.512

0.379

0.352

8.24

0.498

0.349

0.324

8.24

0.495

0.345

0.323

10.3

0.547

0.474

0.44

12.36

0.652

0.548

0.526

12.36

0.647

0.543

0.523

12.36

0.66

0.55

0.532

16.48

0.716

0.676

0.639

16.48

0.754

0.702

0.666

16.48

0.744

0.741

0.706

20.6

0.864

0.89

0.853

20.6

0.883

0.962

0.922

20.6

0.862

0.882

0.847

Tabla promedio de la medición de las absorbancias y coeficiente de correlación Concentración (µg/mL)

Longitudes de onda (λ) 210 nm

225 nm

230 nm

4.12 µg/Ml

0.287

0.158

0.145

8.24 µg/mL

0.501

0.357

0.333

12.36 µg/mL

0.653

0.547

0.527

16.48 µg/mL

0.738

0.706

0.670

20.6 µg/mL

0.869

0.911

0.874

0.986

0.999

0.998

r

CURVA DE CALIBRACIÓN DEL ÁCIDO ACETILSALICÍLICO A DIFERENTES λmax 1 0.9 0.8 0.7 210 nm 225 nm 230 nm

0.6 ABSORBANCIA 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 4.12

8.24

12.36

16.48

20.6

CONCENTRACIÓN (µg/mL)

CURVA DE CALIBRACIÓN DEL ÁCIDO ACETILSALICÍLICO A 225 nm

225 nm

1 0.9 0.8 0.7 0.6 ABSORBANCIA 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 4.12

8.24

12.36

16.48

CONCENTRACIÓN (µg/mL)

COEFICIENTE DE ABSORTIVIDA MOLAR

20.6

0.474 A ε= mol = = 8291.061 (5.7171 x 10−5 )(1 cm) Cl L

L mol

cm-1

Ecuación de la recta para absorbancia a 225 nm: y=0.0450 x +(−0.0207) COEFICIENTE DE ABSORTIVIDAD AL 1% 0.474 A ε= µg = = 0.0474 (10 )(1 cm) Cl mL

µg mL

cm-1

CONCLUSIÓN Debido a las limitaciones de algunos reactivo como el metanol y para tener un mejor ahorro del mismo la primera solución indicada no se realizó como en el protocolo, se tomó una vía alterna, a partir de la segunda solución se prepararon todas las disoluciones y concentraciones planteadas. De igual manera al momento de pesar el AAS se tuvo que realizar un ajuste a las concentraciones y por efectos del disolvente las mismas tuvieron que ser duplicadas para poder evitar la absorción del disolvente y nos diera un resultado de absorbancia erróneo. Con lo que respecta al análisis espectrofotométrico Uv-Vis calculando el coeficiente de correlación podemos concluir que nuestra prueba se encuentra dentro de los límites permisibles de acuerdo a la r= 0.999, esta es aproximada a uno por lo tanto la linealidad de nuestro análisis es aceptable. La longitud de onda, λ, reportada en bibliografía nos indicaba que se encontraba L L en 210 nm con un E= 5980 cm-1 y 230 nm E=6890 cm-1, por esto mol mol decidimos hacer una lectura a tres λ distintas, en donde el aparato nos dio una L mejor linealidad en 225 nm con un E= 8291.06 cm-1. mol

BIBLIOGRAFÍA Applied Analitic, espectrofotometría, 2010

Arévalo h.; 2006. Evaluación de un método por espectroscopia Uv-vis para la detección de contaminantes orgánicos en agua. Trabajo de graduación [tesis].san Carlos: universidad de san Carlos Guatemala. Facultad de ingeniería. Barajas G. 2011. Propuesta de mejora utilizando diseño de experimentos en el desarrollo de técnicas analíticas en un laboratorio farmacéutico. Propuesta de un programa de divulgación [tesis].CD de México: Instituto Politécnico Nacional. Facultad de ingeniería industrial. Caballero R. 2011. Espectrofotometría. Universidad del valle de México, químico farmacéutico biotecnología, monterrey. Curso de Química Analítica 2007. Consultado en: http://www.cin.edu.uy/bqa/pdf/Parcial%202%20QA2007.pdf [Fecha 28 de mayo de 2015] Elmer B.; 2010. Estandarización de la técnica espectrofotométrica (Uv-vis) para la cuantificación de antraquinonas presentes en productos a base de aloe vera. Requisito final para optar al título de tecnólogo en Química [tesis].Pereira: universidad tecnológica de Pereira. Facultad de química. Grisales C.; 2013. Espectrofotometría. Laboratorio de espectrofotometría. Universidad de Antioquia, Medellín. Nieves D.; 2011. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Departamento de bioquímica [tesis]. Córdoba: Universidad de Rabanales. Facultad de Medicina. Téllez O. espectrofotometría. Laboratorio de equilibrio y cinetica.2008

CUESTIONARIO: 1.- ¿Que disolvente utilizó para hacer la cuantificación? Se utilizó metanol ya que es el disolvente que presenta el menor número de onda en la absorción. 2.- ¿Cuál fue la longitud de onda que usted seleccionó?, explique su decisión. La longitud de onda que seleccionamos fue de 225 nm, porque nos dio una mejor linealidad de r=0.999, además que el espectrofotómetro nos mostró una λmax de 225 nm.

3.- ¿Qué tipo de celda usó y porque? Usamos celdas de cuarzo, las celdas de cuarzo no interfieren con la cuantificación porque no absorben las longitudes de onda del UV y el UV.-vis. 4.- Escriba los intervalos de concentración de las disoluciones estándar empleadas en la curva patrón, para la Longitudes de onda de máxima absorción y sus Absorbancias respectivas. La longitud de onda fue de 210, 225 y 230 nm, porque a estas longitudes de onda, el disolvente no afecta a la cuantificación del analito (no hay interferencias). Ya que si elegimos las longitudes de ultravioleta lejano de 10 a 200 nm presenta el inconveniente que el oxígeno atmosférico absorbe en esa región. Además de que el disolvente utilizado (metanol) absorbe en el espectro en longitudes de onda de 205 a 210 nm

Concentración (µg/mL)

Longitudes de onda (λ) 210 nm

225 nm

230 nm

4.12 µg/mL

0.287

0.158

0.145

8.24 µg/mL

0.501

0.357

0.333

12.36 µg/mL

0.653

0.547

0.527

16.48 µg/mL

0.738

0.706

0.670

20.6 µg/mL

0.869

0.911

0.874

5.- Relacione la estructura molecular con la longitud de onda, y el coeficiente de absorción El efecto fotoeléctrico, que se entiende que un haz de luz es un flujo de partículas de energía llamada fotones. Cada una de estas partículas posee una energía que está relacionada con la frecuencia de la luz mediante la ecuación: E=hv En donde h es la constante de Planck. La luz de una cierta frecuencia está asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad de energía. Es la cantidad de energía que posee un fotón la que determina si una especie molecular absorberá o emitirá la luz de la longitud de onda correspondiente.

Además una molécula posee energía interna que son: la molécula puede rotar en varios ejes y poseer una cierta cantidad d energía rotacional. Los átomos o grupos de átomos que están en la molécula pueden vibrar. Y por último una molécula posee energía electrónica, la cual es el potencial asociado con la distribución de las cargas eléctricas negativas en los núcleos de los átomos con carga positiva. La absorbancia es directamente proporcional al coeficiente de absortividad por la concentración y la longitud del paso óptico (Ley de Lambert- Beer) A=εCl 6.- Identifique los grupos cromóforos y auxocromos La absorción de radiación UV o UV-vis proviene de la excitación de los electrones enlazantes, y las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies de estudio. Los grupos cromóforos son los que tienen enlaces conjugados como los grupos carbonilos, nitrilos, azidas en general los grupos que tengan dobles enlaces. Los auxocromos no absorben longitudes de onda pero si producen una interferencia con respecto al analito. 7.-Identifique las transiciones electrónicas Transiciones: σ - σ*. Un electrón de una molécula en un orbital σ enlazante es excitado al correspondiente orbital antienlazado σ*. Respecto a otras posibles transiciones, la energía necesaria para provocar una transición σ - σ* es grande y corresponde a radiaciones de frecuencias en la región del UV de vacío. Transiciones: n - σ*. Los compuestos saturados que contienen átomos con pares de electrones no enlazantes son capaces de dar transiciones n - σ*. Estas transiciones requieren menos energía que los tipo σ - σ* y pueden producirse por radiación de la región entre 150 y 250 nm, apareciendo la mayoría de los picos de absorción por debajo de los 250 nm. Transiciones: n – π* y π – π*. La espectroscopia de absorción a compuestos orgánicos se basa en transiciones de electrones n o π al estado excitado π*, ya que la energía que se requieren para estos procesos conducen a picos en una región espectral de 200 a 700 nm. Ambas transiciones requieren la presencia de un grupo funcional que suministre los orbitales. Π.

6.-Como afectaría un cambio del solvente Este puede aumentar el grado de conjugación de y efectuar un desplazamiento batocrómico, por lo tanto la estabilización de los estados excitados producida por el disolvente es mayor en solutos con fuerte interacción núcleo-substituyente.