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Ejercicios Resueltos I

Bioquímica y Biología Molecular I (Universidad de Sevilla)

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Enzimología:

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Un extracto de bacterias contiene 48 mg de proteínas por mililitro. Una alícuota de 50 µl de este extracto cataliza la producción de 3,2 µmoles de producto por minuto en un volumen estándar de incubación de 0,6 ml. Calcular: a) La actividad del enzima en U/ml de extracto; b) La actividad específica de la enzima en el extracto; c) La actividad total del enzima si tuviéramos 150 ml de extracto.

Solución: a) 64 U/ml; b) 1,33 U/mg proteína; c) 9600 U. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Disponemos de una enzima de PM 30 KDa. Calcular: a) su número de recambio si 1,5 g de enzima contenidos en alícuotas de 0,5 ml actúan sobre el sustrato específico transformándolo a una velocidad máxima de 3 moles de sustrato por minuto; b) ¿Cuál sería la actividad total de la preparación enzimática si su volumen fuera de 100 ml?; c) ¿Cuál sería la actividad específica? -1

Solución: a) 60000 min ; b) 600 U; c) 2000 U/mg proteína. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Una enzima tiene un peso molecular de 60 KDa y 6 sitios activos por molécula. La velocidad inicial de la reacción que cataliza es 12 moles de sustrato cada 2 minutos en presencia de 18 g de enzima. Calcular la actividad molecular (Kcat) por centro catalítico de la enzima. Solución: 3333 min-1.

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Una disolución de una enzima pura, de PM 50 kDa y una concentración 5 mg/ml, presenta una actividad de 12000 U/ml. Se pide: a)Expresar la actividad en kat/mg de proteína; b) Calcular Kcat; c) Calcular el ciclo catalítico. -5

-1

Solución: a) 4x10 kat/mg; b) 2000 s ; -4 c) 5x10 s.

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Se purifica una enzima a partir de un extracto crudo mediante distintas técnicas (precipitación, cromatografías de intercambio iónico, cromatografía de exclusión) con los siguientes resultados: Fracción

V (ml)

Prot (mg/ml)

A (U/ml)

I

2000

10

50

II

500

5

160

III

100

4

400

IV

50

2

700

V

10

9,1

3200

Calcular: a) Porcentaje de recuperación después de cada técnica; b) Indicar si procede seguir purificando la enzima. Solución: a) 80, 40, 35 y 32%; b) La enzima está prácticamente purificada tras el último paso (unas 350 U/mg proteína).

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V

Proteína

A

AT (U)

AE (U/mg)

Recup.

(ml)

(mg/ml)

(U/ml)

A(U/ml)xV(ml)

A(U(ml)/Prot(mg/ml)

(%)

I

2000

10

50

50 x 2000 = 100000

50/10 =5

__

II

500

5

160

160 x 500 = 80000

160/5 = 32

80

III

100

4

400

400 x 100 = 40000

400/4 = 100

40

IV

50

2

700

700 x 50 = 35000

700/2 = 350

35

V

10

9,1

3200

3200 x 10

3200/9,1

32

= 32000

= 351,6

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ENZIMOLOGÍA:

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Vo=

Vmax · [S] Km + [S]

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-3

Una enzima con una Km de 2,6x10 M se ensayó con una concentración inicial de sustrato de 0,3 M. -5 -1 La velocidad observada fue de 5,9x10 M·min . -5 Con una concentración inicial de sustrato de 2x10 M, ¿Cuál sería la concentración de producto tras 5 y 10 minutos de reacción?

-6

Solución: A los 5´: 2,25x10 M; -6 A los 10´: 4,50 x 10 M. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Ecuación de velocidad sin inhibidor Vmax · [S] Vo= Km + [S] 1/V

1/Vmax

1/[S] -1/Km

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¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación de Lineweaver-Burk cuando la recta -1

corta al eje X en –40 (mol/l) ? 1/V

1/[S]

-2

Solución: Km = 2,5 x 10 M. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Calcular la Km y la Vmax sabiendo que la recta obtenida en una representación Lineweaver-Burk corta 3 -1 al eje de ordenadas en 1/V = 5x10 (mol/min) y la pendiente de la recta es 120 min/L. 1/V

tg =

-1/km

Km Vmax

1/Vmax 1/[S]

-4

Solución: Vmax= 2x10 mol/min; -2 Km = 2,4x10 M. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Se han obtenido los siguientes resultados al estudiar los efectos del pH sobre la actividad de la fosfatasa alcalina procedente de una muestra de hueso. Determinar a qué pH tiene la enzima una afinidad mayor por el sustrato. [S] (M) 0,174 x 10-4 -4

0,267 x 10 -4 0,526 x 10 -4 1,666 x 10 4,000 x 10

-4

V (moles/min) pH 7,6 pH 9 0,034

0,074

0,047 0,075

0,085 0,098

0,128 0,167

0,114 ---

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V (moles/min) 1/V (min/moles) [S] (M)

1/[S] (M-1)

0,174 x 10-4

57471

0,034 0,074

29,4

13,5

0,267 x 10-4

37453

0,047 0,085

21,3

11,8

0,526 x 10-4

19011

0,075 0,098

13,3

10,2

1,666 x 10-4

6000

0,128 0,114

7,8

8,8

4,000 x 10-4

2500

0,167 ---

6,0

---

pH 7,6 pH 9

pH 7,6 pH 9

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35

1/V (mmoles/min)-1

pH 7,6 30

25

20

15

pH 9 10

5

-10 -9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

1/[S] (M) x 10 Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

7

4

1 / V

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35

pH 7,6 30

25

20

15

pH 9

10

5

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

1 2

3 45

6

1/[S] (M) x 10

7

4

pH 7,6:

pH 9:

y = 4,245·10-4x + 5,519

y = 9,080·10-5x + 8,343 Punto

Punto de corte en X:

de corte en X: -

-5,159/4,245·10 = -12153,12

8,343/9,080·10-5= -91883,26

Km = -1/ -12153,12 = 82,3

Km = -1/-91883,26 = 10,9

-4

M

Tiene mayor afinidad a pH 9 Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

M

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Ecuación de velocidad con inhibidor competitivo V o=

Vmax · [S]

[I]

Km’ = Km · 1 +

( )

Km’ + [S]

[Ki]

1/V

Inh.

1/Vmax

1/[S] -1/Km

-1/Km’

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Al representar por el método de los dobles inversos la cinética de la enzima fosfatasa alcalina (en una suspensión de 8 µg/ml) y en presencia de p-nitrofenil fosfato, se obtiene una recta que corta el eje de ordenadas en 1/300 min/µmol, y una pendiente de 0,05 min/L. Calcular: a) Vmax; b) Km; c) Número de recambio (PM 80 KDa).

Al ensayar en presencia de 60 µM de glicerol fosfato, y haciendo la misma representación gráfica, el punto de corte con el eje de ordenadas es el mismo, mientras que la pendiente es de 0,1 min/L; d) ¿De qué tipo de inhibidor se trata?; e) Calcular Km´, Vmax´ y Ki; f) Determinar el grado de inhibición en estas circunstancias si estamos en presencia de 45 µM de p-nitrofenil fosfato. Solución: a) 300 moles/min; b) 15 M; c) 3000 min-1; d) Competitivo; e) Km’= 30 M; Vmax’ = 300 moles/min; Ki = 60 µM; f) 20% Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Un microorganismo contiene una enzima que hidroliza la glucosa-6-sulfato. El ensayo de detección se basa en la velocidad de formación de glucosa. La enzima en un extracto libre de células -4 tiene una Km de 6,7 x 10 M y una Vmax de 300 -1 nM·min . La galactosa-6-sulfato es un inhibidor competitivo. A una concentración de glucosa-6-5 -5 fosfato 2 x 10 M y galactosa-6-sulfato 10 M, la velocidad inicial es 1,5 nM·min-1. Calcular la Ki para la galactosa-6-sulfato. -6

Solución: Ki = 1,556 x 10 M. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])

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Calcular la concentración de un inhibidor -7 competitivo (Ki= 10 M) necesaria para inhibir en un 20% la velocidad de una -4 reacción enzimática (Km = 1,6·10 M) cuando la [S] es 0.4 mM. -7

Solución: [ I ] = 0,875·10 M.

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Ecuación de velocidad con inhibidor no competitivo V V o=

Vmax’ · [S]

max

Vmax’ =

( ) [Ki]

Km + [S]

1+ Inh.

1/V 1/Vmax

1/Vmax

1/[S] -1/Km

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[I]

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La actividad de una lipasa es inhibida por un ácido. Los resultados de velocidades para diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y presencia del ácido se muestran en la tabla. ¿Qué tipo de inhibidor es? Calcular los parámetros cinéticos. V ( moles/2 min) Solución: [S] (mM)

[I] = 0

[I] = 1 mM

6,25

0,625

0,488

0,862

0,455

0,355

0,424

0,340

0,265

Inhibidor no competitivo; Km = 0,41 mM; Vmax = 0,33 moles/min; Vmax´ = 0,26 moles/min; Ki = 3,5 mM.

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V ( moles/2 min)

[S](mM)

1/[S]

1/V ( moles/min)-1

[I] = 0

[I]=1mM

1/[I] = 0

1/[I]=1mM

(mM)-1 6,25

0,16

0,625

0,488

3,2

4,098

0,862

1,16

0,455

0,355

4,396

5,634

0,424

2,36

0,340

0,265

5,634

7,55

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1/Vo ( moles/ min )-1

8

6

4

2

0 -3

-2

-1

0

1

2

1/[S] (mM)

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3

-1

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1/Vo ( moles/ min )-1

8

6

4

2

0 -3-2-10123

1/[S] (mM)-1

Sin inhibidor:

Con [I] = 1 mM:

y = 1,22·103 x + 3·106

y = 1,57·103 x + 3,835·106

Vmax= 1/3·106 = 0,33·10-6 mol/min

Vmax= 1/3,835·106 = 0,26·10-6 mol/min

Km = p·Vmax= 1,22·103 min/L · 0,33·10-6 mol/min= 0,41·10-3 mol/L = 0,41 mM

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¿Qué concentración de inhibidor no competitivo se requiere para conseguir una inhibición del 60% de una reacción enzimática, si la concentración de sustrato es 1,7 mM, la Km para el sustrato es 1 mM y - 5 la Ki para el inhibidor 2,3x10 M? ¿Cuál sería la velocidad en estas condiciones si la Vmax sin -6 inhibidor es de 2,5x10 moles/min? -5

Solución: [I] = 3,45 x 10 M; -6 Vo’ = 0,63·10 moles/min

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Ecuación de velocidad con inhibidor acompetitivo Vmax · [S]

K’=

V ’= V

Km

max

m

Vo=

[I] Km + [S]·

(

[Ki]

max

1 + [I]

)

(

[Ki]

1 + [I]

)

(

1+

1/V Inh. 1/Vmax’

1/Vmax

1/[S] -1/Km’

-1/Km

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[Ki]

)

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La Km de cierta enzima para su sustrato es 75 µM. Cuando se ensaya con una concentración inicial de sustrato de 50 mM, se observa que al cabo de 15 minutos se ha transformado el 30% de sustrato. a) Calcular la velocidad máxima de la reacción; b) Cuando se ensaya la actividad con distintas concentraciones de sustrato, en presencia de un cierto inhibidor a una concentración de 50 µM, y se representan gráficamente los resultados mediante la representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es la misma que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la ordenada en el origen aumenta al doble. ¿Qué tipo de inhibición se ha producido? Calcular la Ki. c) Calcular el grado de inhibición cuando el ensayo se hace con una concentración de sustrato de 150 µM, en presencia de 100 µM del inhibidor anterior.

Solución: a) Vmáx = 1 mmoles x min-1; b) Inhibición acompetitiva con Ki= 50 M; c) 57,1% de inhibición. Su distribución está prohibida | Descargado por Yonatan SH ([email protected])