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PROPAGACIÓN DE PLANTAS

“AVANCES DE INVESTIGACIÓN EN PROPAGACIÓN IN VITRO EN FRUTALES”

INTEGRANTES:  RAFAEL DIAZ, MARCOS VIDELMO  VASQUEZ VASQUEZ, YONI DOCENTE: Dr. SEMINARIO CUNYA, Juan Francisco

Diciembre, del 2018

INDICE RESUMEN ……………………………………………………………………………….........1 INTRODUCCION ………………………………………………………………………..........2 OBJETIVOS ……………………………………………………………………………..........3 ASPECTOS GENERALES Y ESPECIFICOS ……………………………………….........3 CAPITULO I ……………………………………………………………………….............4 1. CLONACION DE PLANTAS …………………………………………………............4 2. VARIACION SOMOCLONAL Y SELECCIÓN IN VITRO …………………............5 3. TECNICAS DE CULTIVO IN VITRO …………......................................................5 3.1 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DIRECTA …………………………………….6 3.2 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA INDIRECTA …………..................................6 3.3 ORGANOGÉNESIS DIRECTA ……………………………………....................6 3.4 ORGANOGÉNESIS INDIRECTA ……………………………………................6 3.5 SIEMBRA DE MERISTEMOS ………………………………….........................7 3.6 MICROPROPAGACION ………………………………………………………….7 4. POLINIZACION Y FERTILIZACION IN VITRO …………………………….............8 5. CONDICIONES DE UN CULTIVO IN VITRO ………………………………............9 5.1 ESTERILIDAD …………………………………………………………….............9 5.2 TEMPERATURA ………………………………………………………….............9 5.3 HUMEDAD RELATIVA …………………………………………………..............9 5.4 CICLO DE LUZ ………………………………………………………….............10 5.5 pH …………………………………………………………………………............10 6. MEDIOS DE CULTIVO PARA VEGETALES ………………………………..........10 7. ORGANISACION DEL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR …………….10 8. FACTORES

NECESARIOS

PARA

EL

CULTIVO

DE

TEJIDOS

VEGETALES.......................................................................................................12 9. TECNICAS IN VITRO APLICADAS AL FITOMEJORAMIENTO ……………….13 9.1 CULTIVO DE ANTERAS .............................................................................13 9.2 CULTIVO DE TALLOS ................................................................................14 9.3 CULTIVO DE OVULOS ...............................................................................15 9.4 CULTIVO DE CALLOS ................................................................................17 9.5 CULTIVO DE EMBRIONES .........................................................................17 9.6 CULTIVO DE MERISTEMOS ......................................................................18 10. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS CULTIVOS IN VITRO ………...........22 11. DIFERENCIAS ENTRE UM CULTIVO IN VITRO Y UN CULTIVO IN VIVO …23 12. USOS DE LOS CULTIVOS IN VITRO DE VEGETALES …………..................23

CAPITULO II ………………………………………………………………………..........24 1) CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS APICALES DE PAPAYA (Carica papaya), (CASO EN PERU) ..............................................................................24 2) PROPAGACION IN VITRO DE CAMU CAMU (Myrciaria dubia), (CASO EN PERU) ................................................................................................................32 3) PROPAGACION IN VITRO DE PIÑA (Ananas comosus), (CASO EN PERU).................................................................................................................38 4) CULTIVO IN VITRO DE SEMILLAS DE NARANJA AGRIA (Citrus aurantium), (CASO EN MEXICO) .........................................................................................45 5) PROPAGACION IN VITRO DE DURASNO (Prunus persica) A PARTIR DE YEMAS AXILARES, (CASO EN PERU) ............................................................48 6) PROPAGACION IN VITRO DE LIMA ACIDA (Citrus aurantiifolia) A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES, (CASO EN HONDURAS) ..................................58 7) REGENERACION IN VITRO DE PLANTAS DE NARANJA DULCE (Citrus sinensis)

A

PARTIR

DE

COTILEDONES,

(CASO

EN

ARGENTINA)......................................................................................................65 CONCLUCIONES………………………………………………………………………........69 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………………............70

RESUMEN Las especies frutales tienen unas características que la separan de las demás especies cultivadas. Están formadas por plantas perennes que son propagadas vegetativamente. Muchas tienen polinización cruzada por ser auto incompatibles y son altamente heterocigóticas, siendo algunas especies híbridos interespecíficos y poliploides complejos, por lo que se propagan vegetativamente para evitar que la recombinación genética, inevitable en los cruzamientos sexuales, desestabilicen las combinaciones de caracteres obtenidos mediante la selección. La mayoría de las variedades frutales ha sido cultivada desde el Neolítico, siento transformadas por selección continua, alejándose considerablemente de las características de sus progenitores. Las deficiencias inherentes en estos genotipos, seleccionados por determinados caracteres como la calidad del fruto, en detrimento de los restantes, han sido resueltas en muchos casos mediante el desarrollo de técnicas culturales como el uso de porta injertos, el control de insectos o enfermedades con pesticidas químicos, la utilización de reguladores de crecimiento, o las técnicas de recolección y postcosecha. Muchas especies frutales tienen unos recursos genéticos muy reducidos como resultado de una selección muy intensa, combinada con la fijación de genotipos singulares por propagación clonal durante los 10,000 años y realizada por los fruticultores a partir de las poblaciones naturales. El presente trabajo, consta de dos capítulos, en el primero se dará un alcance teórico sobre todo lo que se refiere a cultivos in vitro (definición, cuidados, forma de propagar, etc.) y en el segundo capitulo hablaremos sobre algunos avances conocidos hasta hoy sobre cultivos in vitro en frutales.

PALABRAS CLAVE: Planta perenne, polinización cruzada, heterocigóticas, poliploides complejos, recombinación genética.

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INTRODUCCION La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc.), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones.

El uso de la micropropagación, permite introducir rápidamente productos nuevos con una serie de ventajas tales como una mejor sanidad y pureza genética lo que la ha convertido en una técnica muy utilizada en la agricultura en especial en la propagación masiva de plantas ornamentales y frutales. La estrategia para obtener un producto vegetal in vitro óptimo, depende de lograr un sistema que permita la selección de material en campo con excelentes condiciones agronómicas y, posteriormente, desarrollar un protocolo de laboratorio que en cada una de sus fases introducción, multiplicación, enraizamiento y endurecimiento, conduzca a producir material vegetal de excelente calidad sanitaria, genética y fisiológica.

La propagación de plantas leñosas a través del cultivo de tejidos, ha sido lograda en varias especies de frutales y forestales cultivadas con el propósito de multiplicar genotipos de interés. El cultivo in vitro es utilizado cada vez más, para la propagación de especies vegetales con el fin de aumentar el número de individuos, superar problemas de fertilidad y de biología reproductiva, así como proporcionar material para su reintroducción en la naturaleza y contribuir a la conservación de la diversidad a mediano y largo plazo. La mayoría de las tecnologías actuales de propagación in vitro, utilizan como base las sales de Murashige y Skoog y diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento, propias de la especie objeto de investigación.

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OBJETIVOS 

Adquirir los conocimientos teóricos que fundamentan el uso de cultivo in vitro en la producción de frutales.



Conocer las diferentes técnicas de cultivo in vitro.



Analizar si es conveniente propagar cultivos in vitro con diferentes fines (comercial).

ASPECTOS GENERALES Y ESPECIFICOS La regeneración de plantas a partir de cultivos de células somáticas in vitro es una de las herramientas básicas de la biotecnología. Es usada para la manipulación genética, la selección, la variación soma clonal, el cultivo de protoplastos, el cultivo de anteras, la recombinación del ADN y la regeneración de plantas transformadas, o transgénicas. Debido al incremento de la población mundial, en los últimos años se ha acentuado el interés por la biotecnología vegetal con el propósito de producir alimentos, mejorar cultivares, adaptarlos a diferentes condiciones climáticas y edafológicas y obtener metabolitos de interés comercial (Pérez Ponce, 1998). En este contexto, el cultivo de tejidos vegetales ha merecido especial atención debido a que comprende un grupo heterogéneo de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos o células en un medio de composición química definida e incubados en condiciones ambientales controladas (Roca & Mroginski, 1991; Pérez Ponce, 1998). En micro propagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo “in vitro”. El cultivo es una herramienta para el mejoramiento ya que se producen plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales, esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a estímulos adecuados. Así las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que reciban.

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CAPITULO I

1. CLONACIÓN DE PLANTAS La clonación en plantas se consigue sobre todo mediante la manipulación de cultivos celulares. La principal técnica empleada es la micropropagación o propagación vegetativa in vitro, la cual permite clonar en corto tiempo un gran número de especies. Este procedimiento se utiliza para la selección y producción de plantas en grandes cantidades, así como para la investigación en biología vegetal.

Se consigue mediante la obtención de unos fragmentos o explantes de la planta madre. Los explantes se colocan en un medio de cultivo adecuado y produce un callo (masa de células sin diferenciar); los callos pueden dividirse en multitud de fragmentos o incluso hacerse una suspensión de células. En el momento que se desee, se cambian las concentraciones de hormonas auxina y citoquinina, esto hace que se diferencien las células de los callos con lo que originarán plantas enteras. Esta técnica puede ser muy útil para la conservación de especies y variedades en peligro de extinción, así como para hacer más rentables la producción de flores o de metabolitos secundarios (perfumes, pigmentos, etc.)

Figura 1: ilustración sobre micropropagación de una planta madre. Fuente: Wikipedia.

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2. VARIACION SOMOCLONAL Y SELECCIÓN IN VITRO La selección in vitro es posible debido a que las células de las plantas en los medios de cultivo son genéticamente variables. Los tejidos de los callos, plántulas o plantas derivadas de cultivos in vitro no son necesariamente idénticos al explante usado para el cultivo. La variación en las células y tejidos cultivados es llamada variación soma clonal; tal variación no se limita solo a la primera generación regenerada, sino que se transmite también a la progenie de la misma. El cultivo de células es considerado como un medio para seleccionar preferentemente líneas de células con una mutación. El agente para la selección de los medios culturales es elegido en base a observaciones sobre los efectos específicos sobre otros organismos y plantas. Las pruebas bioquímicas tales como los ensayos in vitro de inhibición de enzimas y la medida de los niveles de metabolitos en respuesta a los agentes selectivos, determinan el éxito o el fracaso del agente selectivo. Las plantas regeneradas a partir de líneas de células seleccionadas en muchos casos expresaron el nuevo carácter a nivel de toda la planta, dando mayor valor agronómico para ese carácter particular. Usando un agente selectivo específico para seleccionar preferentemente una línea determinada de células, puede ser posible reducir el número de plantas que participan en todo el proceso de selección (Smith, Duncan y Bhaskaran, 1993). Lorz (1989) comentó que muchas de las variaciones soma clonales no tienen mayor valor para el mejoramiento de las plantas y por otro lado Phillips, Somers y Hibberd (1988), Anderson y Georgeson (1989), Smith, Duncan y Bhaskaran (1993) y Somers y Hibberd (1994) han dado ejemplos de caracteres útiles mejorados por medio de la selección in vitro. La selección para resistencia al tizón sureño de la hoja, para tolerancia a los herbicidas y para un mayor contenido de triptófano son ejemplos de selecciones exitosas obtenidas a partir de cultivos in vitro. 3. TÉCNICAS DE CULTIVOS IN VITRO Dentro del cultivo in vitro de especies vegetales existen muchas técnicas que permiten lograr el objetivo de cultivar exitosamente un explante, aunque esta consecución dependerá del tipo de planta que se desee propagar de acuerdo a su morfología.

En el campo investigativo, la principal utilidad de los cultivos vegetales se centra en presentar una forma de mantener y controlar las condiciones en que estas plantas pueden desarrollarse, como se ha demostrado en algunos estudios recientes con cultivos foto autotróficos de células vegetales en suspensión; además

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de controlar condiciones como la temperatura, también se puede calcular el tiempo de velocidad en que estas plantas pueden llegar a crecer mediado por un tipo de hormonas específicas (que puedan mejorar su desarrollo de manera in vitro). Otras variables que se pueden controlar son la viabilidad de los explantes y el estrés a los que pueden llegar a ser sometidos por medio del control de luz que estos deben recibir. Estas herramientas permitirán al investigador controlar de manera directa las características que pueden llegar a necesitar en el momento de evaluar las condiciones y el estado en que se requiere la planta para la investigación. Se conocen 6 tipos de técnicas de cultivo vegetal dentro de las cuales hay:

3.1 Embriogénesis somática directa: En este tipo de propagación, lo que se busca es obtener un nuevo organismo a partir de un embrión vegetal, que puede llegar a ser extraído de cualquier tipo de semilla dicotiledónea. La idea de realizar una embriogénesis directa consiste en aumentar la proliferación de las células madre contenidas en el embrión vegetal. Como lo han descrito algunos estudios relacionados con la especie Azadirachta indica A. Juss.

3.2 Embriogénesis somática indirecta: en este tipo de propagación in vitro, usualmente se emplea la siembra de semillas que puedan generar un nuevo individuo, se busca aumentar el proceso de crecimiento vegetal de las semillas y del embrión por medio de la aplicación de algunos reguladores de crecimiento, este método ha sido efectivo para algunos explantes del género Saccharum spp.

3.3 Organogénesis directa: consiste en la obtención de un nuevo individuo a partir de la siembra de un órgano vegetal, que en este caso puede llegar a ser extraído de un vástago, una hoja e incluso una raíz que presente las características fenotípicamente estables para llevar a cabo su propagación, algunos cultivos de la especie Jatropha curcas l. han demostrado la capacidad que esta técnica posee.

3.4 Organogénesis indirecta: se realiza a partir de la siembra de un tejido vegetal que pueda ser capaz de generar la producción de células meristemáticas, en este caso, lo que se busca es aumentar el número de células vegetales presentes en el medio y que, por medio de estas, puedan generar, un nuevo órgano vegetal que continúe con el proceso de crecimiento.

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Como se ha empleado para la propagación de algunos tejidos vegetales de la especie Heliconia collinsiana.

3.5 Siembra de meristemos: es la mejor técnica de propagación vegetal in vitro, ya que no involucra ningún tipo de desinfección que exponga al explante, en este caso, es la célula meristemática propiamente dicha la que es sembrada en el medio de cultivo, la dificultad de esta técnica depende del tipo de método que se emplee durante la extracción del meristemo, ya que es la parte más importante a la hora realizar dicho procedimiento. Es una técnica que por involucrar directamente a las células vegetales altamente totipotenciales no requiere ningún tipo de desinfección debido a que estas células se encuentran totalmente aisladas y, por ende, 100% libres de agentes patógenos que puedan dificultar la siembra. Algunos cultivos de piña han empelado el uso de esta técnica gracias a la calidad y eficacia que presenta según la morfología que posee esta planta, así como también ha sido de gran impacto en algunas especies de café. Este procedimiento logra abarcar un gran número de utilidades para la conservación y preservación de especies vegetales. Es una de las técnicas más útiles para ser aplicada en la crio preservación de especies vegetales gracias a la manipulación y viabilidad con la que es posible controlar el desarrollo de los tejidos vegetales, esto ha sido demostrado en algunos estudios referentes a la preservación de algunas plántulas de cedro.

3.6 Micropropagación: consiste en la propagación de plántulas in vitro, es un método que únicamente requiere de un banco de germoplasma previo para su realización. Todas y cada una de estas técnicas pueden ser utilizadas para llevar a cabo la siembra de tejidos vegetales de la mayor parte de las especies vegetales. Estas a su vez, deben cumplir, si lo requieren, de un tipo de adaptación que permita continuar el proceso de crecimiento desde una fase in vitro hasta una fase ex vitro, para que con ello se pueda culminar el proceso de crecimiento natural de los explantes. Algunos estudios implicados en la preservación de tejidos vegetales de frailejones resultaron útiles para la correcta propagación y conservación de esta especie vegetal en peligro de extinción.

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La importancia de la micropropagación está basada en las siguientes ventajas: 

Permite la obtención de plantas de alto registro fitosanitario, ya que al someter al tejido vegetal a este sistema de cultivo se eliminan totalmente las enfermedades de tipo bacteriano y fúngico y en algunas ocasiones las de tipo viral.



Las plantas obtenidas por este sistema son réplicas exactas entre sí y fieles copias de la planta progenitora.



El número de individuos obtenidos por este método es muy superior al obtenido por cualquier otro método de propagación, por unidad de propágulo.



En algunas ocasiones es posible acortar los tiempos de producción de plantas.



Permite tener en espacios relativamente pequeños con un gran número de plantas.



Facilita el almacenaje y transporte de plantas reales o potenciales.



Elimina los problemas de largas cuarentenas a que son sometidas las plantas en las fronteras cuando se trata de introducirlas de un país a otro.

Debido a lo sofisticado de la técnica, la micropropagación es restringida y aplicada solo en laboratorios de investigación o en grandes empresas que cuentan con recursos para el mantenimiento del proceso y hacerlo costeable económicamente, lo cual es un hecho debido a la gran cantidad de plantas que por esta vía se obtienen. Es justificable el método solo en plantas con reproducción natural difícil, plantas en peligro de extinción, plantas con características importantes únicas como las transgénicas y plantas de uso ornamental con valor unitario elevado.

4. POLINIZACION Y FERTILIZACION IN VITRO La técnica de fertilización o polinización ovular in vitro fue desarrollada por Kanta et al. En 1962, quienes demostraron que en algunas especies de papaveráceas los granos de polen tenían la capacidad de germinar in vitro directamente sobre los óvulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polínico alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilización, con la consiguiente formación de semilla normal en el mismo medio de cultivo.

Esta técnica desarrollada en Papaver

somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus

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caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum.

Bajo el nombre de «polinización in vitro» se suele englobar a varias técnicas que, si bien poseen puntos en común, difieren en otros. 5. CONDICIONES DE UN CULTIVO IN VITRO Existen múltiples condiciones que el explante (tejido u órgano vegetal) requerirá para poder desarrollarse a lo largo del periodo de siembra, cada una de ellas permitirá que los cultivos vegetales puedan crecer de una mejorar manera, sin mencionar el hecho de que estas plantas crecerán en un ambiente diferente al que normalmente se desarrollarían. Dentro de las condiciones encontramos:

5.1 Esterilidad: El cultivo de las especies vegetales in vitro debe mantenerse altamente desinfectado y libre de agentes patógenos, en lo posible, las condiciones tienen que ser óptimas para evitar que los cultivos puedan contaminarse, por lo que regularmente debe realizarse una desinfección minuciosa dentro del laboratorio al igual que un monitoreo del ambiente que permita conocer la cantidad de UFCs (unidades formadoras de colonias) tanto bacterianas como fúngicas que puedan existir en las diferentes áreas. Algunos estudios han creado modelos que permiten lograr una correcta desinfección de las plantas antes de su propagación, como es el caso de la estandarización realizada por Lozano G., y colaboradores para la especie Aspidosperma polynerum.

5.2 Temperatura. La temperatura ideal para el crecimiento de cultivos vegetales por lo general puede oscilar entre los 25 - 30ºC, ideal para que el crecimiento de estos tejidos se pueda dar. Como lo demuestran algunos estudios en los que se cultivaron las especies Populus tremula y Swietenia macrophylla, dada la especificidad que estas plantas requieren

5.3 Humedad relativa. Los cultivos vegetales in vitro necesitan una humedad relativa entre el 50% y el 80 % frente al ambiente, para que la planta pueda desarrollarse. Según el tipo de características que requiera la planta la humedad puede variar, algunos estudios muestran como la albahaca requiere una

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humedad relativa entre el 70% y el 80%, mientras que, para otros tipos de cultivos, como en el caso del café, la humedad relativa varía entre el 50% y 60%.

5.4 Ciclo de luz. Usualmente las plántulas crecidas in vitro deben permanecer durante 18 horas en un ciclo de luz constante y 6 horas de oscuridad para que puedan realizar el intercambio de luz necesario para su crecimiento, como, por ejemplo, en el caso del cultivo de la albahaca se emplea principalmente un fotoperiodo de luz como el que se mencionó antes, al igual que el recomendado por la Organización de las Naciones Unidas.

5.5 pH. Debe oscilar entre 5.6 y 5.8 para evitar estrés durante su cultivo. Por ejemplo, los cultivos de caña de azúcar requieren un pH menor, debido a que de forma natural crecen en ambientes más ácidos. 6. MEDIOS DE CULTIVO PARA VEGETALES Sin lugar a dudas uno de los medios de cultivo más recomendado para la siembra de tejidos vegetales a nivel investigativo es el medio Murashige and Skoog (MS) dada la facilidad y poca especificidad que el medio Posee; sin embargo, existen otro tipo de medios de cultivo que varían sus concentraciones de macro y micro nutrientes dada la especificidad que el explante requiere para poder desarrollarse, por lo que puede darse el caso de observar una diferencia en el crecimiento y desarrollo vegetal de acuerdo al tipo de medio que sea empleado, además de que se ha encontrado que algunos de estos medios pueden generar que los explantes desarrollen metabolitos secundarios específicos, según las concentraciones que cada medio presente de estos nutrientes esenciales; así pues, algunos de los medios más empelados a nivel investigativo pueden llegar a ser: el medio Gamborg (G5), el medio White (W), el medio kudson modificado (Km), el medio Mitra (M), el medio Lloyd and McCown (LM), etc., que de acuerdo a las condiciones que la planta requiera, podrán ser de utilidad, según las características específicas que la planta requiera para su crecimiento. 7. ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR Es importante tener en cuenta la organización que el laboratorio de tejidos vegetales deberá tener para su correcta operación, dada la complejidad de los procedimientos que deberán llevarse a cabo dentro del mismo. Conocer la estructura mínima que se requiere para un correcto funcionamiento puede

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garantizar el éxito de estas operaciones (ver figura 4). Este deberá tener como mínimo:  Un área de crecimiento  Un área para la preparación de medios de cultivos  Un área de descarte  Un área para la siembra de tejidos vegetales  Un área destina para el material del vidrio del laboratorio  Un área para el almacenamiento de los reactivos, de esta manera es posible garantizar un correcto funcionamiento por parte del laboratorio para la siembra de tejidos vegetales.  Cuarto de crecimiento o de incubación vegetal

Figura 4: Esquema de un laboratorio de cultivos vegetales in vitro. Fuente: Alcántara Cortes JS.

Para que la planta pueda crecer de manera natural dentro del laboratorio, debe tener a su alcance diferentes factores ambientes claves para su crecimiento. Por esto, la planta debe permanecer en un lugar específico en el que se le puedan suministrar las condiciones favorables, por ello, debe crearse un lugar permanente

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(fitotrones) en el que la planta pueda permanecer y desarrollarse de manera continua. 8. FACTORES NECESARIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES La siembra de cultivos vegetales está sujeta a una serie de parámetros y normas para que se pueda dar un buen crecimiento de la planta, debido a que son muchos los factores que influyen en el momento de realizar el cultivo in vitro de los explantes, es importante tener en cuenta, en primer lugar, el sitio en el que se lleve a cabo la siembra. El objetivo principal de la siembra es producir un explante libre de patógenos y que además de ello, tenga las características fenotípicas que se requieren para su posterior utilización. Es indispensable desinfectar todos los implementos incluyendo el laboratorio, previamente antes de llevar a cabo la siembra.

Finalmente, se deben establecer una serie de protocolos que especifiquen la desinfección del material vegetal, ya que se debe adaptar el tejido u órgano en cuestión (que se encuentra en un ambiente natural) a las condiciones de asepsia que se requieren para su establecimiento de manera in vitro, algunos estudios han demostrado diferentes tipos de desinfección específica; cómo se puede observar en el caso de la especie Aspidosperma polyneurom y Zephyranthes.

Lo ideal de la siembra de cultivos vegetales es promover la totipotencialidad de las células no diferenciadas, este procedimiento es posible gracias a la preparación específica de un medio de cultivo que contenga los macronutrientes (N, P, K, S, Ca, Mg, Si) y micronutrientes (Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, B, Na) necesarios para el desarrollo de la planta, según algunos de los estudios que se realizaron para la propagación de especies vegetales del género Solanum, se pudo observar la importancia de emplear la concentración adecuada de estos elementos, teniendo en cuenta el tipo de regulación que la planta requiere según los diferentes reguladores de crecimiento que existen, como lo pueden llegar a ser las auxinas (AIA,AIB) , las citoquininas (BAP, KIN) y las giberelinas (GA3); estos compuestos son importantes a la hora de buscar establecer un protocolo para la preparación del medio de cultivo como se ha realizado en algunos estudios para la propagación de la especie Ugnie molinae turcz, puesto que de ello dependerá el éxito del crecimiento de las plántulas in vitro. Así pues, algunos estudios que involucraron algunas especies vegetales pertenecientes a las especies Gossypium barbadense L, Allium sativum L, Tabebuia billbergii y Ananas comosus, han demostrado la alta

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especificidad que cada medio de cultivo requiere según el tipo de técnica y especie que se desee propagar. Es importante tener en cuenta el tipo de técnica que se emplee durante la siembra según la morfología de la planta que se desee propagar, puesto que hay diferentes técnicas de cultivo in vitro y se requieren en algunos casos, mayor experticia en la manipulación. 9. TECNICAS IN VITRO APLICADOS AL FITOMEJORAMIENTO. El mejoramiento genético vegetal o fitomejoramiento tradicional ha sido aplicado en forma empírica por los agricultores desde que este se hizo sedentario, existen diferentes técnicas: Cultivo de anteras, óvulos, meristemos, tallos, callos, ápices, embriones, entre otros. 9.1 CULTIVO DE ANTERAS El cultivo de anteras (CA) es una técnica por medio de la cual es posible producir líneas homocigotas a partir de poblaciones segregantes, mediante el doblamiento cromosómico del polen haploide y la regeneración de plantas en un ciclo de cultivo in vitro. En contraste por los métodos estándar de fitomejoramiento normalmente se requieren seis generaciones de autofecundación para alcanzar la completa homocigosis en plantas autógamas.

Figura 2: ilustración sobre el desarrollo del cultivo de anteras. Fuente: Parés-Martínez, J.

Desarrollo del cultivo de anteras Se desarrolla en dos etapas principales: A. Inducción de microcallos B. Regeneración de plantas

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9.2 CULTIVO DE TALLOS El cultivo in vitro de tejidos vegetales consiste en incubar un trozo de tejido, una célula o una planta en condiciones estériles dentro de un contenedor con un medio nutritivo en forma de gel y que contiene azúcares, nutrientes minerales, vitaminas y hormonas vegetales.

Figura 3: cultivo in vitro de tallos. Fuente: Wikipedia.

El proceso comienza con el establecimiento del cultivo, para lo cual debe esterilizarse el explante o trozo de tejido a cultivar. Cuando se ha logrado que el tejido crezca y prolifere, es importante contar con la combinación y concentración de hormonas adecuadas para lograr la propagación de brotes.

Cada brote deberá ser luego sometido a un proceso de enraizamiento, induciendo la producción de raíces en la base del tallo. Una vez que contamos con una planta completa, con raíz, tallo y hojas, debemos aclimatarla paulatinamente a las condiciones de campo o de invernadero, donde normalmente hay una mayor radiación lumínica, menor humedad relativa del aire, un ambiente lleno de microorganismos y temperaturas más bajas que en el laboratorio. En suma, la planta deberá comenzar a funcionar por sí misma y a autoabastecerse con el proceso de fotosíntesis. La producción de plantas mediante micropropagación tiene un amplio uso comercial debido a que posee varias ventajas. Como se realiza en un laboratorio, bajo condiciones controladas, no depende de las condiciones climáticas o de las estaciones. Utiliza un espacio reducido con el potencial de generar miles de plantas en un corto tiempo. Puesto que se trata de un tipo de propagación vegetativa, las características genéticas de las plantas resultantes se mantienen y todas las

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plantas serán genéticamente iguales. Por último, al realizarse en condiciones asépticas, la sanidad (o ausencia de patógenos en los tejidos de la planta) es controlada adecuadamente. 9.3 CULTIVO DE OVULOS El cultivo de óvulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulación del material es difícil. El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente hidratada, que puede ser dañada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecación durante el proceso.

Pese a las dificultades de la técnica, en algunos cruzamientos interespecíficos como los realizados en papa, algodón y Hevea brasilienses, se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados.

El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los óvulos de una planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta técnica es relativamente fácil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy buenas.

El cultivo de óvulos es una técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo, como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de zigotos y pro embriones.

El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría.

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Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.

El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que, como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.

A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos.

Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidos, son las siguientes:

Polinización estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo y polinización in vitro del estigma. Este tipo de fertilización no requiere ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo. Se realiza satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.

Polinización placentaria in vitro: En este método se aíslan los óvulos con un trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de forma que los óvulos queden expuestos. De esta forma, se simplifican tanto el medio

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nutritivo como la manipulación necesaria para el aislamiento de los óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos, así como un menor choque hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado. Esta técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.

En el caso de plantas que sufren aborto de embriones en estadios tempranos del desarrollo y en aquellos cruces en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario, es necesario rescatar los óvulos recién fecundados o incluso fecundarlos in vitro.

Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).

9.4 CULTIVO DE CALLOS Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser sólido o líquido.

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también pro embriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión. A partir de entonces se desarrolla normalmente. 9.5 CULTIVO DE EMBRIONES Tras la fecundación empieza la fase de cultivo de embriones. Esta etapa suele durar de 2 a 5 días, aunque no normal es que los embriones sean implantados una vez transcurridos 3 días. Tras el periodo de 3 días el embrión ya cuenta con 6 u 8 células.

Para cultivos más largos de 3 días el medio en el que se desarrollan los embriones ha de ser más complejo y debe de contener vitaminas, metales, aminoácidos y otros nutrientes para que el embrión se desarrolle adecuadamente.

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Si se opta por el cultivo hasta el día 5, cuando el embrión es implantado ya se ha transformado en un blastocito y tiene de 12 a 16 células. Esta opción suele ser elegida cuando han fallado implantaciones anteriores y de este modo puede observarse mejor y durante más tiempo crecimiento de los embriones.

En la actualidad se siguen uno de tres métodos posibles para el cultivo de los embriones, en los que el factor variable es medio o medios de cultivo utilizado:

Simples: Es utilizado un único medio, y el cultivo dura 2 o 3 días. Complejos: Para cultivos superiores a 3 días, y se utilizan para los días 4 y 5. Secuenciales: Se usan 3 medios diferentes para cubrir tres fases, la preparación, el crecimiento hasta el 3er día, y la fase final en la que el embrión llega hasta estadio de blastocito, que ocurre por lo general el día 5. También suele ser utilizado el periodo de 5 o 6 días para realizar una mejor o más detallada selección de embriones.

Fases del cultivo de embriones Se utiliza mucho en manzano. 1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea. 2. Se coge el embrión de la semilla. 3. Se inocula en el tubo. 4.

A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.

5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación. 9.6 CULTIVO DE MERISTEMOS Técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito de inducir la diferenciación de células y tejidos en plantas completas, mediante la utilización de medios de cultivos adecuados. En multitud de especies cuyo método de propagación habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagación es por semilla, se encuentran problemas de contaminación por diversos microorganismos, que los métodos tradicionales de desinfección utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos químicos agresivos, esto conlleva una serie de pérdidas económicas por pérdidas de producción, de calidad de fruto y hasta de

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cosechas completas. Incluso utilizando técnicas de cultivo in vitro es a veces imposible

eliminar

a

determinados

organismos

patógenos,

como

virus,

micoplasmas, bacterias y hongos endógenos, algunos de los cuales se transmiten incluso vía semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibióticos, bactericidas y antivíricos añadidos a los medios de cultivo.

Fases del cultivo de meristemos 1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm). 2. Siembra en el medio del tubo. 3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos. 4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio). 5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc. 6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero. 7. Plantación en el campo.

Tamaño de los meristemos El tamaño óptimo del meristemo es entre 0.2-1mm, pero realmente el utilizado está en dependencia de los objetivos que se persigan con propagación comercial. Si el objetivo es la obtención de plantas libres de enfermedades sistémicas es necesario, la utilización de meristemos, pero si por el contrario solamente se requiere de la multiplicación y no hay peligro de diseminación de enfermedades o se parte de plantas sanas, se pueden utilizar ápices de mayor tamaño con un mayor porcentaje de regeneración.

Aislamiento y siembra de los meristemos El reconocimiento de la zona meristemática varía entre especies, por tanto, se requiere de estudios preliminares que revelen su ubicación y manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar su extracción. Existen meristemos muy fáciles de localizar, como son los expuestos, tal es el caso de la papa; en otros cultivos pueden estar más internamente protegidos y se necesita separar mayor cantidad de pequeñas hojas, para encontrar la zona meristemática. Este es el caso de bulbos, ya sean de ajo (Allium sativum L.), cebolla (Allium cepa L.) o en el caso de tubérculos o cormelos de (Xanthosoma sp.).

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La disección aséptica del meristemo es un proceso delicado y requiere de muchas horas de práctica; se realiza con el apoyo de un microscopio estereoscópico, desprendiendo los foliolos que rodean el punto de crecimiento, hasta que solo queda el ápice con algunos primordios foliares, para su posterior transferencia a medios de cultivo de establecimiento. La eficiencia del cultivo de meristemos, como método de saneamiento a patógenos, está determinada por los siguientes factores:



Origen y edad del explante inicial La selección de un adecuado explante inicial determina mejores resultados en la regeneración o formación de plantas in vitro. La sección de tejido utilizada varía en dependencia de las características morfológicas de las diferentes especies, como regla general, se toman las yemas del tallo principal y de los brotes axilares de las plantas.

Las principales causas de pérdidas están dadas por la muerte de los meristemos, ocasionada por daños en el momento de la extracción, y por la formación de plantas no definidas con crecimiento en rosetas.



Tamaño del explante inicial El tamaño de los meristemos es directamente proporcional a su regeneración y crecimiento posterior in vitro. En caña de azúcar, plátanos y bananos, a pesar de emplearse ápices meristemáticos, de mayor tamaño, la principal causa de bajos índices de establecimiento está dada por la necrosis de los tejidos, producto de la oxidación fenólica.

De forma general el riesgo de aparición de patógenos en los tejidos vegetales aumenta con el incremento del tamaño de los explantes iniciales. La ubicación de los patógenos en los tejidos es determinante en la elección del tamaño a utilizar, por ejemplo, el (PLRV) es un virus confinado al floema y puede ser eliminado cuando se extraen meristemos de mayor tamaño.



Características genotípicas Existe una marcada influencia del genotipo en el éxito del cultivo de meristemos donde los porcentajes de establecimiento varían entre especies, variedades y clones. Independientemente de la influencia del origen del

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explante, del tamaño de los meristemos y del genotipo, la eficiencia del cultivo de meristemos como método de saneamiento, depende de las condiciones de crecimiento según los requerimientos de las diferentes especies, la habilidad del operador para efectuar dicha escisión y la utilización de medios de cultivo con adecuado balance hormonal que favorezca la regeneración de los ápices meristemáticos.



Influencia del medio de cultivo Es importante señalar que, aunque el balance hormonal utilizado está en dependencia del genotipo que se trabaje, para el éxito del empleo del cultivo de meristemos como método de saneamiento este factor debe tenerse muy en cuenta.

En el cultivo de meristemos no existe ningún medio de cultivo universal, sin embargo, los medios basales propuestos por Murashige & Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus componentes, han sido los que con más frecuencia se han utilizado. Un balance adecuado entre auxina y citoquinina en el medio de cultivo es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos.

Ventajas 

Los meristemos son genéticamente estables y resultan el tejido idóneo para la iniciación de programas de propagación in vitro.



El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminación de algunos virus por escape, puesto que los tejidos meristemáticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las células están infestadas.



Este método resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patógenos.



Los progresos alcanzados en su aplicación han hecho posible propagar gran número de especies de importancia económica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener clones limpios de patógenos a partir de plantas sistémicamente infectadas.

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Limitaciones 

El éxito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneración,

tamaños

pequeños

(0.1-0.2mm)

crecen

lentamente

disminuyendo la eficiencia del método. 

La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensión a diferentes variedades y especies.

En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicación de patógenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razón es frecuentemente combinado con otros métodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y generalización. En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), es frecuentemente utilizado con éxito en la multiplicación in vitro de yuca, boniato y malanga, con el objetivo de obtener explantes libres de patógenos. 10.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS CULTIVOS IN VITRO

Ventajas que ofrece el cultivo in vitro: 

Es uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para erradicar patógenos.



Propagación clonal masiva de plantas libres de enfermedades en corto tiempo.



Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento de germoplasma en campo.



Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del año.



Facilita el intercambio de material genético.



Reduce el riesgo de pérdidas genéticas al evitar la mezcla del material por cruzamiento.

Desventajas que ofrece el cultivo in vitro: 

Requiere de personal especializado.



Requiere de, infraestructura y equipamiento.



Los productos químicos son de elevado costo.

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11.

DIFERENCIAS ENTRE UN CULTIVO IN VITRO Y UN CULTIVO IN VIVO

La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo):

in vitro • No realiza fotosíntesis • Crecimiento en condiciones controladas • Crecimiento en condiciones de asepsia • Alta humedad relativa • Estomas no funcionales • Ausencia de pelos radiculares • Ausencia de cera en la cutícula

in vivo • Realiza fotosíntesis • Crecimiento en condiciones no controladas • Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente • Humedad relativa variable • Estomas funcionales • Presencia de pelos radiculares • Presencia de cera en la cutícula

12.

USOS DE LOS CULTIVOS IN VITRO DE VEGETALES

El cultivo de tejidos vegetales in vitro en el campo investigativo puede ayudar a cumplir múltiples objetivos específicos: el primero, es la posibilidad de estudiar los metabolitos secundarios presentes en diferentes especies vegetales capaces de ser usados en la creación de nuevos antibióticos o fármacos que puedan contribuir al tratamiento de enfermedades, como se ha sugerido en algunas investigaciones que mencionan la posibilidad de extraer algunos metabolitos secundarios por medio de técnicas de purificación y extracción, como los estudios realizados con Annona muricata y Whiteringia coccoloboides en el modelo de C. elegans. Otro objetivo es la manipulación de especies vegetales agrícolas para el mejoramiento de la calidad en el ámbito de la industria, como en el caso del plátano bocadillo, el cual para la industria colombiana presenta una gran utilidad a nivel comercial en el ámbito biotecnológico, esta especie se ha podido cultivar de una manera mucho más controlada. También, ha permitido evaluar las relaciones

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simbiontes que realizan con los microorganismos presentes en ellas. Otras investigaciones como en el caso de la papa y su relación con el crecimiento de Petrobacterium atrosepticum, ha sugerido que ésta realiza una interacción entre la raíz y un tipo específico de compuestos bioquímicos que secreta la planta para su mutuo desarrollo. Además, la implementación de fitohormonas específicas permite obtener un mejor crecimiento de las plantas en comparación a su crecimiento tradicional.

Figura 5. Esquema que muestra las utilidades de la propagación de tejidos vegetales in vitro. Fuente. Autores.

CAPITULO II En este capítulo, hablaremos sobre algunos casos de frutales estudiados a nivel mundial tanto con fines de mercado o con fines de experimento o investigación. 1) CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS APICALES DE PAPAYA (Carica papaya.), (CASO EN PERU) En el Perú, la papaya (Carica papaya) es una especie importante en la economía del poblador amazónico debido a su fruta de alto rendimiento y valor nutritivo. Su cultivo presenta una serie de ventajas como calidad de su fruto, desarrollo vegetativo corto y la cosecha semanal luego de haber iniciado la producción, permitiendo el rápido retorno del capital invertido. Según Carbajal y Remuzgo (2007), en los últimos diez años la Amazonía Peruana se ha constituido en el

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principal productor y abastecedor de papaya al mercado de Lima e involucra a más del 35% de los agricultores en las distintas etapas de la cadena productiva.

El Instituto de Investigación de la Amazonía Peruana (IIAP) viene trabajando en el programa de mejoramiento genético de la papaya, teniendo como objetivos principales mejorar la calidad del fruto, incrementar el rendimiento y desarrollar variedades tolerantes a enfermedades limitativas al cultivo (Carbajal & Remuzgo 2007); así se ha logrado obtener la variedad PTM-331. Existen diversas formas de propagar la papaya, sin embargo, desde el punto de vista comercial, el uso de semilla sexual es el más generalizado (Franciosi 1992) a pesar de las dificultades que se presentan al obtenerse plantas de diferente sexo y que a veces las plantas resultantes no reproducen exactamente las características de la planta originaria (Ibar 1979). La propagación vegetativa por medio de estacas o injertos no brindan los efectos deseados, las primeras son de lento desarrollo y las segundas degeneran y no mantienen las características (Posada 2005).

Una forma de obtener plantas libres de patógenos es a través del cultivo in vitro de meristemos que se fundamenta en el hecho de que la distribución de los microorganismos (virus, bacterias y micoplasmas) en los tejidos de la planta no es uniforme y su concentración tiende a disminuir progresivamente hacia el ápice del tallo (Jiménez 1998). Con el estudio de los procesos que ocurren en el cultivo de tejidos de la papaya se han desarrollado técnicas de micropropagación por organogénesis (Alvarado 1992, Baca 2002, Gallardo et al. 2002) y embriogénesis somática (Jimenez 1999, Ascencio et al. 2008) pero en ninguno de estos casos se trabajó con la variedad PTM-331.

El desarrollo de una metodología de micropropagación a partir de meristemos apicales es importante para conocer el comportamiento in vitro de esta variedad y apoyar la multiplicación de plantas élite de sexo femenino seleccionadas en campo por sus características fenotípicas especiales; además se puede realizar una cuidadosa selección del material genético, manejar grandes volúmenes de plántulas en espacios reducidos y mantener un stock de plantas libres de enfermedades. Este trabajo tuvo como objetivo determinar los requerimientos nutricionales y hormonales de Carica papaya var. PTM-331 en los medios de cultivo durante las fases de establecimiento de meristemos apicales, multiplicación y enraizamiento de las plántulas.

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MATERIALES Y METODOS. El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de la Estación Experimental DONOSO del Instituto Nacional de Innovación Agraria del Perú. Los meristemos fueron extraídos de yemas apicales obtenidas de plantas de 45 días provenientes de invernadero. Para la desinfección, los explantes fueron lavados con abundante agua y jabón y luego fueron transportados a la cámara de flujo laminar en donde fueron sumergidos en alcohol 70% durante 30 segundos y enjuagados tres veces con agua destilada estéril, luego fueron sumergidos en hipoclorito de sodio 1% durante 10 minutos y enjuagados tres veces con agua destilada estéril.

Fase de establecimiento de meristemos. Luego de desinfectar las yemas apicales, con la ayuda de un microscopio estereoscopio se realizó la disección de meristemos. Los explantes vegetales se colocaron sobre una placa Petri (148 x 120 mm), se sujetaron con pinzas y con ayuda del bisturí se eliminaron los primordios foliares hasta dejar el meristemo descubierto. Después se realizó un corte en la base del meristemo y se introdujo al tubo de ensayo que contenía el medio de cultivo.

Con la finalidad de obtener el medio de cultivo adecuado que nos permita la diferenciación de los meristemos se formularon diversos tratamientos considerando los resultados obtenidos por Alvarado (1992) y Baca (2002), empleando el medio de cultivo basal Murashige y Skoog (MS-1962) con diferentes concentraciones de BAP, ANA, AIA, AG3 y adenina (Tabla 1). El pH del medio de cultivo fue ajustado a 5,6. Se realizaron evaluaciones cada 7 días y la evaluación final se realizó 49 días después de la siembra.

Fase de multiplicación. Para determinar el medio de cultivo más adecuado para la multiplicación de las plántulas, los tratamientos planteados consistieron en medio de cultivo base MS con diferentes concentraciones de BAP, KIN, ANA, AIA, AG3 y adenina (Tabla 2). Se realizaron evaluaciones cada 7 días y la evaluación final se realizó 35 días después de la siembra.

Fase de enraizamiento. Para determinar el medio de cultivo adecuado para el enraizamiento de las plántulas se formularon diversos tratamientos empleando el medio base MS con diferentes concentraciones de IBA, BAP, ANA y adenina (Tabla 3). La evaluación se realizó 21 días después de la siembra.

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RESULTADOS

Fase de establecimiento. En el 2002, Baca determinó que el explante más adecuado para el establecimiento in vitro de papaya eran los meristemos.

No se observó contaminación en la introducción in vitro de meristemos apicales de papaya. El uso de alcohol (70%) durante 30 segundos y NaOCl (1%) durante 10 minutos resultó ser muy efectivo en la desinfección de explantes, pero es muy importante considerar que la introducción de meristemos se hizo a partir de plántulas provenientes de invernadero. En la Tabla 4 se observa el porcentaje de meristemos diferenciados a los 49 días, las variaciones encontradas entre los distintos tratamientos se debieron básicamente a la manipulación de las yemas apicales durante la disección de los meristemos.

El análisis de los resultados a los 49 días después de la siembra nos indica que el tratamiento TR6 presenta mayor altura de plántula y mayor número de brotes (Tabla 4), estos datos nos indican que la combinación de los reguladores de crecimiento empleados en TR6 son óptimos para el establecimiento in vitro de meristemos apicales de papaya var. PTM-331.

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Figura 1. Plántulas provenientes de TA2, después de 35 días de siembra.

* Medias con diferentes letras en la misma columna difieren para p