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BIOLOGÍA DE ANIMALES III Semestre 2015-2 8-04-15

FECUNDACION IN VITRO Karla Paola García Cruz; Carlos Andrés Gil Gómez; Sandibel Martìnez.

Introducción Introducción El proceso de fertilización es, en términos generales, el contacto entre el óvulo (celula reproductora o gameto con información genética proveniente del progenitor femenino) y el espermatozoide (gameto con información genética de origen masculino). Al encontrarse estas dos células haploides, pasan por procesos de reconocimiento específicos para cada especie (Gao et al, 1986) y empiezan un proceso de fusión con el que integran la información de ambas partes, se reactiva el metabolismo de síntesis de proteinas y se lleva a cabo la proliferación celular. Al momento de su descubrimiento, se pensaba que los espermatozoides eran animales parasíticos que vivían en el semen, fue hasta bastante tiempo después que se determinó que cumplen un papel importante en los procesos reproductivos de las especies, un investigador llamado Hertwig buscaba un organismo apropiado para realizar observaciones y de esta forma llegó al erizo de mar Toxopneustes lividus, que tenía la gran ventaja de ser altamente común en la zona en la que trabajaba y tener gametos transparentes que facilitaban su observación (Gilbert, Por la propia naturaleza del proceso, el proceso de fertilización es exclusivo de especies con una diferenciación sexual y con la capacidad de formar gametos haploides, el proceso ofrece ventajas como la recombinación genética que proporciona una mayor variación intraespecífica aunque también tiene desventajas como un gasto adicional de energía en los procesos de encontrar pareja, partiendo de estos principios, algunos autores han sugerido que la reproducción sexual es una característica excepcional debido a que favorece la sobrevivencia de grupo y no la individual, para la cual puede llegar a ser una desventaja (Fisher en Smith, 1968). Los principales objetivos de la reproducción sexual son el reproductivo (la generación de un nuevo individuo) y esta variación genética producto de la recombinación, se tiene todo un proceso de reconocimiento e intercambio químico entre los gametos. La fertilización externa se refiere al proceso a través del cual los individuos de una especie liberan sus gametos al medio, los cuales suelen ser medios acuáticos, para que se encuentren fuera de los organismos y empiecen el desarrollo de las crías dentro de este medio, suele asociarse este método de reproducción con una mayor producción de gametos, lo cual incrementa la probabilidad de que se encuentren los gametos en toda la extensión del volúmen del medio. La fertilización externa es considerado como un carácter plesiomórfico en grupos con especies con ambos tipos de fertilización, sin embargo, a través de estudios de características asociadas a

reproducción interna, como es el caso de aletas asociadas a la fijación de las parejas, se ha observado que existen grupos que han pasado de fertilización externa a interna para volver a realizar un cambio similar en sentido inverso (Long, 2015). La regulación de los procesos de gametogénesis en organismos de fertilización externa han sido considerados como resultado de una respuesta a componentes climáticos como es el clima y ciclos anuales, por lo mismo, se reconoce una estacionalidad de la época reproductiva para estas especies. Algunas de las características que ayudan a reconocer estos periodos son un incremento en el tamaño de las gónadas, en conjunto con la liberación de gametos al medio (Bronstein, 2014). Para el caso específico de nuestro estudio, la almeja chocolata (Megapitaria squalida) es el bivalvo más abundante en el noroeste de México y es posible encontrarla desde Baja California Sur hasta Perú. Análisis cuantitativos de la proporción de individuos han determinado que la población se compone de una cantidad más o menos igual de individuos masculinos que femeninos, sin embargo, para lograr la identificación de los sexos de los individuos se suele requerir el análisis de los tejidos de las gónadas. Dada su amplia distribución, las condiciones climáticas a las que se tienen que adaptar son ampliamente variables, lo que lleva a que el análisis para zonas específicas es necesario si se desean determinar apropiadamente la época de reproducción y de gametogénesis. Bibliografía Arellano-Martínez, M., Quiñones-Arreola, M. F. Ceballos-Vázquez, P., Villalejo-Fuerte, M. Reproductive pattern of the squalid callista Megapitaria squalida from northwestern Mexico. Journal of Shellfish Research. 2006. 25(3): 829-855. Bronstein, O., Loya, Y. Photoperiod, temperature, and food availability as drivers of the annual reproductive cycle of the sea urchin Echinometra sp. From the Gulf of Aqaba (Red Sea). Springer. 2014. United States. Gao, B., Klein, L. E., Britten, R. J., Davidson, E. H. Sequence of mRNA coding for bindin, a species-specific sea urchin sperm protein required for fertilization. Developmental Biology. 1986. United States. 83: 8634-8638. Long, J. A., Mark-Kurik, E., Johanson, Z., Lee, M. S. Y., Young, G. C., Min, Z., Ahlberg, P. E., Newman, M., Jones, R., Blaauwen, J., Choo, B., Trinajstic, K. Copulation in antiarch placoderms and the origin of gnathostome internal fertilization. Nature. 2015. United States. 517: 196-199. Smith, J. M. Evolution in sexual and asexual populations. The American Naturalist. 1968. England. 102(927)

El objetivo general de esta práctica fue obtener tanto ovocitos como espermatozoides de las gónadas de almejas chocolatas (Megapitaria squalida), para con ellos poder hacer posteriormente la inseminación artificial in vitro.

Los objetivos particulares fueron: 1) Conocer la anatomía de las almejas para poder localizar las gónadas. 2) Conocer las diferencias morfológicas de los gametos (ovocitos y espermatozoides). 3) Desarrollar una técnica de obtención de gametos. 4) Elaborar preparaciones con los ovocitos y espermatozoides obtenidos para que se lleve a cabo la fecundación in vitro. 5) Observar las diferencias morfológicas que se llevan a cabo en el cigoto después de la fecundación. Justificación Los procedimientos de la fecundación in vitro (FIV) en los animales están dirigidos principalmente a poder desarrollar nuevas tecnologías para ampliar los conocimientos sobre los procesos involucrados en el complejo fenómeno de la reproducción así como implementar biotecnologías en los animales domésticos, de importancia comercial y especies silvestres para mejorar la eficiencia reproductiva y genética de dichas especies. Hipótesis Al realizar las preparaciones de ovocitos y espermatozoides, si se lleva cabo la fecundación in vitro, entonces se podrá observar en dichas preparaciones la presencia de cigotos los cuales presentaran diferencias morfológicas en comparación con el ovocito no fecundado, como puede ser la presencia de la membrana de fecundación y la división celular (mitosis). Metodología Material biológico: Se obtuvieron 6 almejas chocolatas de un restaurante un día antes y se les mantuvo en agua de acuario. Posteriormente se escogieron dos de ellas, se abrieron con ayuda de un bisturí y se ejerció presión para lograr su apertura. Una vez abiertas, se identificó la gónada. Una vez identificada la gónada de las dos almejas, cada una se extrajo en una caja Petri y se maceraron para identificar los gametos masculinos y femeninos en el microscopio de luz. Para la fecundación in vitro se tomó una gota de cada una de las cajas Petri y se mezclaron en un portaobjetos para verlo al microscopio de luz. En una caja Petri aparte se mezcló el macerado de la gónada del macho y hembra y también se observaron al microscopio. Posteriormente se esperó a observar la fecundación.

Fig.1 Diagrama de fecundación invitro

García Cruz Karla Paola Resultados Dentro de las seis almejas chocolatas con las que se contaba, se logró separar a una hembra y un macho, para obtener los gametos se abrió a las almejas y se extrajeron las gónadas (Figura 1) las cuales se maceraron (Figura 2), de las gónadas maceradas se hicieron preparaciones para observarlas al microscopio óptico a 40x (Figura 3) y así poder diferenciar a los gametos (ovocitos y espermatozoides). Una vez identificados, se elaboraron preparaciones con los ovocitos y espermatozoides para que se llevara a cabo la fecundación in vitro, en estas preparaciones se observó que efectivamente en algunos ovocitos se llevó a cabo la fecundación in vitro y se pudo observar tanto la capa hialina alrededor del huevo así como la membrana de fecundación e incluso en algunos casos el inicio de la división celular la cual originaria posteriormente al cigoto de dos células (Figura 4).

Figura 1: Se muestran las almejas abiertas: (A) hembra y (A-1) macho. Tambien se señalan las gónadas (G) de un color café-verdoso.

Figura 2: Macerado de las gónadas en cajas Petri: (A) hembra y (A-1) macho, se puede distinguir un cambio en el color del macerado, en el caso de la hembra es más obscuro.

Figura 3: Preparaciones realizadas con los macerados: (A) hembra; se muestran los ovocitos con un tamaño considerable, (A-1) macho; se muestran los espermatoziodes de menor tamaño que los ovocitos y redondos.

Figura 4: Preparaciones de ovocitos y espermatozoides, en los cuales se llevo a cabo la fecundacion in vitro en algunos ovocitos: (A) cigoto a 40x; en el cual se puede observar la capa hialina que cubre la superficie del huevo, asi como la membrana de fecundacion, (A-1) cigotos a 10x; en los cuales se observa tambien la capa hialina e incluso en algunos de ellos se observa una forma de “pera” que dara paso a la division celular.

Discusion: Primeramente podemos distinguir que la reproduccion en las almejas es anisogàmica, ya que los gametos son distintos, ambos son redondos pero los espermatozoides son de menor tamaño que los ovocitos. Si bien el proceso de la fecundacion en las almejas chocolatas (Megapitaria squalida) no es bien conocido, se puede comparar dicho proceso con el ya estudiado en otros organismos marinos con fecundacion externa como es el caso del erizo de mar. Podemos decir que si se llevo a cabo la fecundacion in vitro ya que se observo la presencia de la membrana de fertilizacion y la capa hialina rodeando al huevo. En los erizos de mar: una vez que los espermatozoides se unen a la zona pelucida tiene lugar la reaccion acrosomica en la cual las enzimas acrosomicas abren una via de penetracion que permite que el espermatozoide se una a la membrana plasmatica del ovocito para fecundarlo, poco despues de la fecundacion se produce la reaccion cortical en la cual la entrada del espermatozoide en la la membrana plasmatica va acompañada de la fusion de granulos corticales con la membrana plasmatica del ovulo, estos granulos liberan su contenido y una enzima liberada destruye los receptores de los espermatozoides situados en la capa vitelina, posteriormente la capa vitelina se separa del ovulo y las proteinas procedentes de los granulos corticales se asocian con la membrana vitelina transformandola en una cubierta protectora llamada membrana de fecundacion. Al mismo tiempo otro material coloidal procedente de los granulos corticales va cubriendo la superficie del huevo y forma una membrana transparente llamada capa hialina (Epel,1978). Si bien no pudimos observar todos estos procesos involucrados en la formacion de la membrana de fecundacion y la capa hialina devido a que se dan de manera rapida, si se observaron ambas estructuras en los cigotos obtenidos en las preparaciones de ovocitos y espermatozoides. Otra cosa que se pudo observar en las preparaciones fue la forma de “pera” del ovulo, esta forma se debe a que se estaba llebando a cabo la division celular (mitosis), para dar lugar a un cigoto de dos celulas y asi susesivamente (proceso de segmentacion). Sin embargo no se pudo seguir observando la division hasta que se completara y se formaran las dos celulas.

Conclusion: A pesar de la importancia comercial de la almeja chocolata (Megapitaria squalida), se conoce muy poco sobre su biología, y casi nada sobre su reproducción, su fecundacion es externa propia de animales acuáticos, en la cual los individuos lanzan al agua sus gametos.

Mediante los procedimientos de la fecundación in vitro (FIV) se puede obtener mayor conocimiento sobre el proceso de la fecundación en este caso en las almejas chocolatas. La FIV también es una herramienta importante en el mejoramiento de la eficiencia reproductiva de los organismos de importancia comercial u otras especies. En el presente trabajo se pudo realizar la fecundacion in vitro de dichas almejas, mediante la realizacion de preparaciones con ovocitos y espermatozoides obtenidos de las gónadas de un macho y un hembra, se observaron las diferencias morfológicas del ovulo despues de la fecundacion por el espermatozoide asi como el inicio del proceso de segmentacion en la cual hay una serie de divisiones mitoticas.

Referencia: El proceso de la fecundacion. David Epel. Investigacion y Ciencia,1978. No. 16:62-73.

RESULTADOS Una vez que se abrieron las almejas, al tener las gónadas muy parecidas, se tuvieron que observar al microscopio algunas muestras para verificar la presencia de gametos masculinos y femeninos respectivamente. Se observó que una de las almejas (hembra) tenía una gónada de color verde pastoso y oscuro, mientras que la otra (macho) presentaba una coloración café más clara.

Fig.1. Gónadas de (Megapitaria squalida).A. Almeja Hembra. B. Almeja macho.

En el macerado de las gónadas se observa que la coloración de los macerados es ligeramente diferente, ya que el macerado de la hembra es de coloración más oscura que la del macho.

Fig.2. Macerado de (Megapitaria squalida).A. Almeja Hembra. B. Almeja macho.

Una vez observados los gametos al microscopio de luz, se pudieron identificar por el tamaño, forma y cantidad. En el caso de los femeninos, están en menor cantidad, pero son más grandes y ovales que los masculinos, pues estos son menos grandes pero en proporción, son más.

Fig.3. Gametos de (Megapitaria squalida).A. Algunos gametos femeninos están enmarcados. B. Gametos masculinos (algunos enmarcados)

Fig.4. Ovocitos de (Megapitaria squalida) el contorno color rosa muestra a un cigoto, pues comienza la primera división, teniendo forma de pera o chichón. Los contornos en azul, representan la capa de fecundación que se forma alrededor del óvulo una vez que el espermatozoide penetra al ovocito.

Fig.5. óvulo fecundado de (Megapitaria squalida) el contorno color blanco muestra la membrana vitelina.

Fig.6. Acercamiento del óvulo de (Megapitaria squalida) a 40x. Óvulo fecundado mostrando capa hialina y membrana de fecundación (remarcado en gris)

Fig.7. Acercamiento del óvulo de (Megapitaria squalida) a 40x. Cigoto listo para la segmentación en su primera división

DISCUSIÓN El proceso de fecundación es un proceso muy complejo, como se pudo observar en la práctica. En el caso de nuestro equipo, usamos almejas. El usar este modelo biológico, resultó de gran conveniencia porque la extracción de gónadas de estos animales es de suma facilidad y además, liberan un elevado número de gametos de los cuales, hay mayor probabilidad de que lleguen a interactuar en el agua marina y generen nueva descendencia, lo que los hace ideales para

estudiar el proceso de la fecundación. En nuestro caso, usamos agua de acuario, y a los gametos femeninos solo se les agregó cierta cantidad de espermatozoos. Aunque es cierto que el proceso es fácil, el conocer que a las almejas debíamos mantenerlas en las condiciones favorables para llevar acabo la práctica, fue de gran ayuda, ya que debimos de mantenerlas en una condición parecida a su medio ambiente, a los gametos después de extraer las gónadas debimos de tenerlos en agua salina, ya que al ser organismos de vida acuática, si no se mantenían en ese estado, en el caso de las almejas, podrían haber muerto y los gametos, sufrir un choque osmótico. En cuanto al proceso de fecundación solo se alcanzó a observar cuando el espermatozoide había ingresado al óvulo, pero si conocemos la teoría, al lograr el espermatozoide hacer eso, significa que tuvo que liberar enzimas digestivas que le permitieran perforar las capas que cubren al óvulo para llegar hasta el, y lo más impresionante, en un tiempo relativamente corto. En el caso de la almeja, se sabe que presentan fecundación externa y que la liberación de los gametos al medio es un evento crítico, ya que los gametos son viables por un corto periodo de tiempo, por lo que el éxito de la fertilización puede depender del grado de sincronía de los individuos durante el desove (Himmelman 1981). En nuestro caso, si fue posible observar la fecundación. Se pudo ver la membrana de fecundación, que como menciona la bibliografía consultada, es una cubierta protectora que es formada por proteínas procedentes de los gránulos corticales que se asocian con la membrana vitelina ya desunida (que se distancia de la superficie del huevo por entrada de agua) y la capa hialina, procedente de los gránulos que cubre la superficie del huevo formando una membrana transparente. Se sabe que una vez que los gametos fusionan sus núcleos, se forma el cigoto y comienza la segmentación por mitosis, que suponemos, son los óvulos en forma de pera que observamos. Conclusión Se logró nuestro objetivo, el poder realizar la fecundación in vitro. Aunque este proceso de cierta manera nos resultó sencillo, el conocer previamente las condiciones que se requerían para lograrlo fueron de gran utilidad para que tuviéramos éxito. Cabe mencionar también que debido a la falta de tiempo, no se pudo observar el proceso completo de segmentación, pero si se observaron indicios de este. Por tanto, la fecundación es un proceso complejo, que requiere de bastante gasto de energía por parte de los organismos para que este proceso se lleve a cabo y de cierta manera, lograr la permanencia de la especie. El utilizar animales invertebrados, en nuestro caso almejas, es ideal para el estudio sobre la fecundación, porque al liberar muchos gametos, hay mayor probabilidad de encontrar algún óvulo fecundado, y satisfactoriamente se puede decir que lo observamos.

Epel D. 1978. El proceso de la fecundación.Investigación y Ciencia. N°.16:62-73.

Romo P. 2010. ESTRATEGIA REPRODUCTIVA DE Megapitaria squalida (SOWERBY, 1835) EN DOS ZONAS DE BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO. Centro interdisciplinario en Ciencias Marinas. Instituto politécnico Nacional (IPN). La Paz, Baja California Sur.