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• Mary Suarez

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Análisis'Instrumental' Cromatogra2a'

Historia

1903: usó columnas de adsorción para separar pigmentos vegetales Fase móvil Pigmentos vegetales Fig.1

Tswett (1872-1919)

Chroma: color Graphein: escribir

Fase estacionaria

CROMATOGRAFÍA

3

CROMATOGRAFÍA

Separación de los componentes de una mezcla (muestra), disueltos en una fase móvil a medida que se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase estacionaria

Clasificación

• Según la disposición de la fase estacionaria: – Cromatografía plana:

• Cromatografía en capa fina • Cromatografía en papel

– Cromatografía en columna • Cromatografía de líquidos • Cromatografía de gases • Cromatografía de fluídos supercríticos

• Según el tipo de fase móvil: • Cromatografía de líquidos (LC)

En columna o en superficie plana

• Cromatografía de gases (GC) • Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

En columna

9

CROMATOGRAFÍA PLANA Papel

Cromatografía en papel

Fase estacionaria

Cromatografía en capa fina

Adsorbente sobre soporte Gel de sílice, poliamida….

Lámina de vidrio, de plástico o metálica Tapadera

METODOLOGÍA DE TRABAJO Papel

Frente de fase móvil

Fase móvil

1

2

3

4

5

Fig.1

Sistemas cromatográficos

Clasificación

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA Método

Técnica

Fase estacionaria

Tipo de equilibrio

LC

Reparto

Líquido adsorbido sobre un sólido

Distribución entre líquidos inmiscibles

Adsorción

Sólido

Adsorción

Intercambio iónico

Resina de Intercambio Iónico

Intercambio iónico

Exclusión por tamaños

polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.

Distribución/Exclusión

Gas-líquido

Líquido adsorbido sobre un sólido

Distribución entre gas y líquido

Gas-sólido

Sólido

Adsorción

Especies orgánicas enlazadas a superficie sólida

Distribución entre fluido supercrítico y superficie enlazada

GC

SFC

18

Los mecanismos de separación cromatográficos • Adsorción • Repartición • Intercambio iónico • Exclusión dimensional • Afinidad • Quelación (complejos)

Las técnicas cromatográficas se clasifican en base a cual es el mecanismo principal de la separación

El proceso cromatográfico

Fase móvil

Muestra (A+B)

B A

Fase estacionaria

B B

A

B

Señal analítica

Detector

Tiempo, min

t0

t1

t2

t3

t4

t5

A

t0

t1

t2

t3

t6

B t4

t5

t6 37

CROMATOGRAFIA* •  Con* la* primera* introducción* de* fase* móvil* nueva,* el* eluyente' (la* parte* de* la* muestra* contenida* en* la* fase* móvil)*avanza*hacia*abajo*por*la*columna,*donde*Cene* lugar*un*reparto'o'distribución'entre*la*fase*móvil*y*la* fase* estacionaria* (Cempo* t1).* El* reparto* o* distribución* entre* la* fase* móvil* fresca* y* la* fase* estacionaria* se* efectúa*de*manera*simultánea*en*el*siCo*de*la*muestra* original.*A*medida*que*la*fase*móvil*limpia*fluye*por*la* columna,* transporta* moléculas* de* soluto* hacia* abajo* de*la*columna*en*una*serie*conCnua*de*transferencias* entre* las* dos* fases.* Pero* como* el* movimiento* de* los* solutos*sólo*puede*ocurrir*en*la*fase*móvil,*la*velocidad' media* a* la* que* una* zona* de* soluto* migra* hacia* abajo* en* la* columna* depende' de' la' fracción' de' 4empo' que' per7'manece'o'reside'en'dicha'fase.**

Dilución(del(analito(* •  La*figura*ilustra*una*importante*caracterísCca*común*al* proceso*cromatográfico,*a*saber,*la*dilución*del*analito* siempre*acompaña*a*la*separación*cromatográfica.*Por* tanto,*el*tamaño*de*la*banda*original*que*conCene*los* analitos* en* la* figura* es* notablemente* más* pequeña* que*cualquiera*de*las*dos*zonas*que*llegan*al*detector,* lo* cual* significa* que* se* produce* una* importante* dilución* de* los* analitos* mientras* están* siendo* separados.*En*consecuencia,*los*detectores*empleados* para* los* analitos* separados* con* frecuencia* deben* ser* más*sensibles*que*los*que*se*requerirían*si*el*proceso* de*separación*fuera*innecesario.**

Cromatogramas(* •  Si*al*final*de*la*columna*se*coloca*un*detector*que*resT* ponde* a* la* concentración* del* soluto* y* se* registra* su* señal* en* función* del* Cempo,* o* del* volumen* de* fase* móvil*añadido,*se*obCene*una*serie*de*picos*como*se* muestra* en* la* parte* inferior* de* la* figura* .* Este* gráfico* denominado* cromatograma,* es* úCl* tanto* para* los* análisis* cualitaCvo* como* cuanCtaCvo.* La* posición* de* los*picos*en*el*eje*del*Cempo*puede*servir*para*idenCT* ficar*los*componentes*de*la*muestra;*las*áreas*bajo*los* picos*proporcionan*una*medida*cuanCtaCva*de*la*canT* Cdad*de*cada*componente.**

Mejoramiento(del(rendimiento(de(la(columna(* •  En*la*figura*se*observan*los*perfiles*de*concentración*para*las*bandas*que* conCenen* los* solutos* A* y*9:52 B* en*AMla* Page figura*765 * en* el* Cempo* t1* y* en* el* Cempo* SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 posterior* t2.2* Como* la* especie* B* es* retenida* con* más* fuerza* por* la* fase* estacionaria* que* A,* se* retrasa* durante* la* migración.* Observe* que* en* el* descenso* por* la* columna* aumenta* la* distancia* entre* las* dos* bandas.* Sin* embargo,* al* mismo* Cempo* Cene* lugar* un* ensanchamiento* de* ambas* zonas,* lo* que* disminuye* la* eficacia* de* la* columna* como* sistema* de* separación.* Aunque* el* ensanchamiento* de* banda* es* inevitable,* por* lo* común* se* pueden* encontrar* condiciones* en* las* que* ocurra* con* más* lenCtud.** **

Concentración

t1

t2 B

A B Distancia migrada

A

ambas zo na como miento d encontra titud. Po guras 26 clara dis columna Diver velocida chamien

El proceso cromatográfico

Fase móvil

Muestra (A+B)

B A

Fase estacionaria

B B

A

B

Señal analítica

Detector

Tiempo, min

t0

t1

t2

t3

t4

t5

A

t0

t1

t2

t3

t6

B t4

t5

t6 37

Por*consiguiente,*tal*como*se*muestra*en*las*figuras*,*con*frecuencia*es*posible*tener*una* clara*disCnción*de*las*especies*siempre*y*cuando*la*columna*sea*lo*suficientemente*larga.**

stintos en su migración os tiempos t1 y t2 se

se pueden lograr mejores separaciones controlando las variables que 1) incrementan la velocidad de separación de la banda y 2) disminuyen la velocidad de ensanchamiento de la banda. Estas opciones se ilustran en la figura 26.3. Las variables que influyen en la velocidad de migración relativa de las zonas de soluto a través de una fase estacionaria se tratan en la siguiente sección. En la sección 26C se consideran los factores que influyen en la velocidad de ensanchamiento de las bandas.

Mejoramiento(del(rendimiento(de(la(columna(*

notablemente más peos zonas que llegan al e produce una impormientras están siendo detectores empleados frecuencia deben ser querirían si el proceso .

Diversas* variables* químicas* y* Ysicas* influyen* en* las* velocidades* de* separación* de* las* bandas* y* en* el* ensanchamiento* de* las* mismas.* Por* 26B a*VELOCIDADES consiguiente,* menudo* DEse*MIGRACIÓN pueden*DE lograr* mejores* separaciones* LOS SOLUTOS controlando*La eficacia las* variables* que* 1)* incrementan* la* velocidad* de* de una columna cromatográfica para seca un detector que resparar dos solutos depende en parte las velocidades de* la* banda* y* de2)* disminuyen* la* velocidad* de* oluto yseparación* se registra su relativas con las que se lavan o se purifican las dos esel volumen de fase móde*velocidades la* banda.* Estas* opciones* se* ilustran* en* la* figura* pecies. Esas están determinadas por la rie de ensanchamiento* picos como se a figura 26.1. Este grásiguiente.** , es útil tanto para los

tativo. La posición de ede servir para identistra; las áreas bajo los cuantitativa de la can-

os perfiles de concentienen los solutos A y 1 y en el tiempo postetenida con más fuerza e retrasa durante la micenso por la columna os bandas. Sin embarun ensanchamiento de

Señal del detector

de la columna

a)

b)

Cromatogramas* de* dos* componentes* que*ilustran*dos*métodos*para*mejorar* la*separación:* a)*cromatograma*original*con*los*picos* traslapados;* b)* mejora* producida* por* un* aumento* en* la* separación* de* las* bandas,* y* c)* mejoramiento* por* una* disminución*de*la*anchura.**

* c) Tiempo

VELOCIDADES*DE*MIGRACIÓN*DE*LOS*SOLUTOS*

•  La*eficacia*de*una*columna*cromatográfica* para*separar*dos*solutos*depende*en*parte*de* las*velocidades*relaCvas*con*las*que*se*lavan*o* se*purifican*las*dos*especies.*Esas*velocidades* están*determinadas*por*la*magnitud*de*las* constantes*de*equilibrio*para*las*reacciones* mediante*las*cuales*los*solutos*se*distribuyen* entre*las*fases*estacionaria*y*móvil.**

El proceso cromatográfico

ENSANCHAMIENTO DE BANDAS Columna Comienzo

Fig.1

Perfil de concentración

Fig.2

Tiempo 38

26B.1 Constantes de distribución

dentro amb es posib den

Constantes dededistribución A 26B.1 menudo, los equilibrios distribución en la cromaes p tografía se expresan mediante ecuaciones sencillas que A menudo, los equilibrios de distribución en la croma26B.2 suponen la transferencia de un analito entre las fases tografíalos* se expresan mediante ecuaciones sencillas que se* •  A*estacionaria menudo,* equilibrios* de* distribución* en* la* cromatograYa* ytransferencia móvil. Entonces, para la especie A del Aunqu 26B suponen la de un analito entre las fases expresan* mediante* ecuaciones* sencillas* que* suponen* la* soluto se puede escribir: para la estacionaria y móvil. Entonces, especie A del transferencia* de* un* analito* entre* las*para fases*laestacionaria* y* móvil.* Aun medir soluto se puede escribir: Entonces,*para*la*especie*A*del*soluto*se*puede*escribir:** par Amóvil ∆ Aestacionaria cantida med ción de Aestacionaria Amóvil ∆ La constante de equilibrio Kc para la distribución de la can2 figura especie A entre las dos fases se denomina constante de ción La*constante*de*equilibrio*Kc*para*la*distribución*de*la*especie*A* cos. El La constante de equilibrio K para la distribución de la c distribución y se define como entre*las*dos*fases*se*denomina*constante*de*distribución*y*se* cie figu que especie A entre las dos fases se denomina constante de define*como* cos. muestr 1aA 2 S distribución y se define como Kc ! (26.1) cie queda 1aA 2 M mue especie 1aA 2 S Kc del ! soluto A en la fase esta(26.1) de los donde (aA)S es la actividad quep 1a 2 A M donde*(a A)S*es*la*acCvidad*del*soluto*A*en*la*fase*estacionaria*y*(a A)M*rete cionaria y (aA)M es su actividad en la fase móvil. Cuanno esp es*su*acCvidad*en*la*fase*móvil.*Cuando*las*concentraciones*son*bajas* dodonde las concentraciones son bajas osoluto cuando intervienen se deno ) es la actividad del A en la fase esta(a A S o* cuando* intervienen* especies* no* aniónicas,* los* coeficientes* de*de l especies noy (a aniónicas, los coeficientes de móvil. actividad de la ve cionaria ) es su actividad en la fase Cuanno A M acCvidad*se*acercan*a*la*unidad.**

Constantes'de'distribución'*

(véase apéndice 2) se acercan a la unidad. En estas condiciones,Constantes'de'distribución'* se sustituyen las actividades cS, por la concentración analítica molar del soluto en la fase estacionaria y por cM,se*sususCtuyen* concentración analítica en En* estas* condiciones,* las* acCvidades* cS,* por* la*molar concentración* molar* del* soluto* en* la* fase* estacionaria* y* por* cM,*la su*ecuación concentración* laanalíCca* fase móvil. Entonces, es posible escribir analíCca* molar* en* la* fase* móvil.* Entonces,* es* posible* escribir* la* ecuación* 26.1 como anterior*como** *

cS nS /VS Kc ! ! cM nM /VM

(26.2)

donde nS y nM son las cantidades de moles de analito donde*nS*y*nM*son*las*canCdades*de*moles*de*analito*en*las*dos*fases*y*VS*y* enVlas dos fases yVS y VM son los volúmenes de las dos M*son*los*volúmenes*de*las*dos*fases.*En*una*situación*ideal*la*constante*de* distribución,*a*veces*llamada*razón*o*coeficiente*de*reparto*o*distribución,* fases. En una situación ideal la constante de distribues*constante*a*lo*largo*del*amplio*intervalo*de*concentraciones*de*soluto;*es* ción, a Sveces llamada razón o coeficiente de reparto o decir,*c *es*directamente*proporcional*a*c M.** 3 es constante a lo largo del amplio inter** distribución, valo de concentraciones de soluto; es decir, cS es direc-

Constantes'de'distribución'* •  La* cromatograYa* en* la* que* se* aplica* la* ecuación* reordenada* se* denomina* cromatogra:a' lineal' y* da* como* resultado* caracterísCcas* tales* como* picos* simétricos* Cpo* Gauss* y* Cempos* de* retención* independientes*de*la*canCdad*de*analito*inyectado.* •  Observe*que*Kc'es*la*canCdad*fundamental*que*afecta* la* distribución* de* los* componentes* entre* las* fases* y,* por* tanto,* las* separaciones.* Para* una* elección* adecuada*de*la*fase*móvil,*de*la*fase*estacionaria*o*de* ambas,* la* constante* de* distribución* se* puede* manipular*dentro*de*límites.*Si*se*ajusta*el*volumen*de* una*fase,*es*posible*modificar*la*relación*molar*en*las* dos*fases.**

Tiempo'de'retención'* •  Aunque* la* constante* de* distribución* es* fundamental* para* las* separaciones*cromatográficas,*no*se*puede*medir*con*facilidad.*En* cambio,* es* facCble* medir* la* canCdad* llamada* 4empo' de' retención' que*es*una*función*de*Kc.*Para*ver*cómo*se*hace*esto*refiérase*a*la* figura*del*siguiente*slide,*que*es*un*cromatograma*sencillo*de*dos* picos.*El*pico*pequeño*de*la*izquierda*es*para*la*especie*que*no'es* retenida* por* la* columna.* A* menudo,* la* muestra* o* la* fase* móvil* conCene* una* especie* que* no* se* queda* en* la* columna* Cuando*

ocurre*así,*este*Cpo*de*especie*puede*añadirse*para*facilitar* la*idenCficación*de*los*picos.*El*Cempo*tM*necesario*para*que* la* especie* no* retenida* alcance* el* detector* en* algunas* ocasiones* se* denomina* 4empo' muerto' y* proporciona* una* medida*de*la*velocidad*promedio*de*migración*de*la*fase*móT* vil,*por*lo*que*es*un*parámetro*importante*para*idenCficar*los* picos*del*analito.**

de la derecha en la figura 26.4 es el de una especie del analito. El tiempo requerido para que esta zona llegue Tiempo'de'retención'* al Todos*los*componentes*pasan*un*Cempo*t detector después de la inyección de la muestra se M*en*la*fase*móvil.*El*pico*más* grande*de*la*derecha*en*la*figura*es*el*de*una*especie*del*analito.*El*Cempo* denomina tiempo de retención y se le simboliza con tR. requerido*para*que*esta*zona*llegue*al*detector*después*de*la*inyección*de*la* El muestra*se*denomina*Cempo*de*retención*y*se*le*simboliza*con*t analito es retenido porque pasa un tiempoR.*El*analito*es* tS en la retenido*porque*pasa*un*Cempo*t *en*la*fase*estacionaria.*Entonces,*el* S*o*t(r’)el fase estacionaria. Entonces, tiempo de retención es

_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 767

Cempo*de*retención*es*

tR ! tS " tM

(26.3) 767

26B Velocidades de migración de los solutos

FIGURA' ' Cromatograma* caracterísCco* de* La velocidad lineal promedio de la migración del soluuna* mezcla* de* dos* componentes.* El* pico* pequeño* de* la* izquierda* un* to a lo largo de la columna n (por lo regular, en representa* cm/s) es Señal del detector

tR

tM

soluto* que* está* retenido* en* la* columna,* FIGURA 26.4 no* Cromatograma característico de una

tS

mezcla de dos pico pequeño de la por* lo* que*componentes. llega* al* Eldetector* casi* de* izquierda representa un soluto que no está inmediato* después* de* empezar* la*retenido elución.* en la columna, por lo que llega al detector casi de Por*consiguiente,*su*Cempo*de*retención*tM* inmediato después de empezar la elución. Por es*casi*igual*al*Cempo*que*se*requiere*para* R consiguiente, su tiempo de retención tM es casi igual que*una*molécula*de*la*fase*móvil*pase*por* al tiempo que se requiere para que una molécula de la fase móvil pase por la columna. la*columna.**

L n! t

(26.4)

donde L es la longitud de la columna rellena. De ma* nera semejante, la velocidad lineal promedio u de las Tiempo

después de la inyección de la muestra se R denomina tiempo de retención yt se le simboliza conttRen . la El analito es retenido porque pasa un tiempo empo de retención y se le simboliza con . R S ) Elporque analitopasa es retenido porque pasa un tiempo tS en la 6.2) s retenido un tiempo tS enel latiempo fase estacionaria. Entonces, de retención es fase estacionaria. Entonces, el es tiempo de retención es naria. Entonces, el tiempo de retención tM (26.3) tR!!t t" o S" t (26.3) t alito R S(26.3) M ! t " t t R S M s dos La velocidad lineal promediodede la migración del soluLa velocidad lineal promedio la migración del soluud linealLa*velocidad*lineal*promedio*de*la*migración*del*soluto*a*lo*largo*de*la* promedio de la migración del soluibutotoa alololargo de la columna columnan n(por (por regular, en cm/s) largo deregular, la lo lo regular, en cm/s) es es columna******(por*lo*regular,*en*cm*/s)*es:* n de la columna (por lo en cm/s) es o to o LL r-terL n ! (26.4) n ! (26.4) n ! (26.4) rect RtR ctR que e dondeLLes es la la longitud de lalacolumna rellena. De madonde longitud de columna rellena. De ma- la* la longitud de la columna rellena. De madonde* L* es* la* longitud* de* la* columna* rellena.* De* manera* semejante,* afía a nera semejante, la velocidad lineal promedio u de las velocidad*lineal*promedio*u*de*las*moléculas*en*la*fase*móvil*es** ante, la velocidad lineal promedio u de las nera semejante, la velocidad lineal promedio u de las omo moléculas en la fase móvil es o la fase * móvil es en la fase móvil es nninmoléculas n-En L L u! L (26.5) u! (26.5) onde tM u ! (26.5) t M e

Tiempo'de'retención'*

tM

26B.3 Relación entre la tasa de flujo ación entre la tasa de flujo endavolumétrico y la velocidad del flujo lineal 26B.3 Relación co y la velocidad del flujoentre lineal la tasa de flujo ía de avolumétrico y de la vista velocidad del flujo lineal e disDesde el punto experimental, en la cromatoe o de vista experimental, en la cromatounto to”

26B.4 Relación entre tiempo de retención el factor d 26B.5 La y constante de distribución El factor de 26B.4 Relación entre tiempo de retención el factor Para relacionar la velocidad de migración de un soluto importante y constante de distribución con su constante de distribución, su velocidad se exprelas El velocida factor d 4 La sa como una fracción de la velocidad de ladefase lumnas. Para relacionar la velocidad de migración un móvil: soluto importante pende de la conla* suvelocidad* constantede* de distribución, velocidad se exprelasde* velocid Para* relacionar* migración* de*suun* soluto* con* su* constante* ! use*fracción "expresa* (fracción de tiempo quedeelde* volumétrico sa velocidad* comonuna de la velocidad lasoluto fase móvil: de* la* lumnas. distribución,* su* como* una* fracción* la* velocidad* fase* 4 L permanece en la fase móvil) nación móvil:** pende dada de l cualquier c * n! u " (fracción de tiempo que el soluto volumétric Sin embargo,permanece esta fracción al número promeanación cualquier eneslaigual fase móvil) dad dio de moles de soluto en la fase móvil en cualquier factor de re cualquier instante dividido entre la cantidad de moles de Sin*embargo,*esta*fracción*es*igual*al*número*promedio*de*moles*de*soluto*en*la*fase* de retenció Sin embargo, esta fracción es igual altotal número promea cualquie móvil*en*cualquier*instante*dividido*entre*la*canCdad*total*de*moles*de*soluto*en*la* soluto en la columna: dio de moles de soluto en la fase móvil en cualquier factor de r columna:** instante dividido entre la cantidad total de moles de de retenció * moles del soluto en la fase móvil soluto en " n!laucolumna: moles totales del soluto donde KA e Si se sustitu moles del soluto en la fase móvil El número n! u "total de moles de soluto en la fase móvil es moles totales del soluto donde KA igual a la concentración molar, cM, del soluto en esta Si se sustit fase multiplicada por el volumen, VM. De manera siElmilar, número total de moles de soluto en la fase móvil es la cantidad de moles del soluto en la fase esta4 En la bibliogra igual a la está concentración cMde , del soluto en esta cionaria dada por el molar, producto la concentración, se simbolizaba c fase el volumen, VMpor . Desumanera sicS, multiplicada del soluto en por la fase estacionaria volumen, la IUPAC reco milar, la cantidad de moles del soluto en la fase esta-

Relación*entre*Cempo*de*retención*y*constante* de*distribución**

K !

(26.1)

queda en la colum tM tS especie puededeaña mezcla de dos componentes. El pico pequeño demezcla la de dos componentes. El pico pequeño la está retenido izquierda soluto que está retenido delno soluto A enizquierda la faserepresenta esta- un soluto donderepresenta (aA)S es launactividad de que losno picos. El tie en la columna, por lo que llega al detector casi de en lacionaria columna, por al detector y (a es sullega actividad en lacasi fasede móvil. no retenida inmediatoCuandespués de empezar la elución. Poralcan A)lo M que su tiempo dese retención tM es casi igual inmediato de empezar elución. Por consiguiente, do las después concentraciones sonlabajas o cuando intervienen denomina tiemp al tiempo que se requiere para que una molécula de consiguiente, de retención t es casi igual M especies su notiempo aniónicas, los coeficientes de actividad de la velocidad pr Tiempo fase móvil pase por la columna. al tiempo se requiere para que unaa molécula de En la estas El*número*total*de*moles*de*soluto*en*la*fase*móvil*es** (véaseque apéndice 2) se acercan la unidad. vil, por lo que es u fasecondiciones, móvil pase por columna. las actividades c , por la conigual*a*la*concentración*molar,*cM,*del*soluto*en*esta** se la sustituyen tificar los picos d S fase*mulCplicada*por*el*volumen,*VM.*De*manera*siT** cMVM la columna. En el casoanalítica de una columna tubular abierta, 1 centración molar del soluto en lan !fase pasan u " esta! u " un tiempo tM F está relacionada con la velocidad lineal en la salida milar,*la*canCdad*de*moles*del*soluto*en*la*fase*estaT** cM VM # cSVS 1 # cSVS /cMVM cionaria y por c , su concentración analítica molar en de la derecha en l M de la comuna uo cionaria*está*dada*por*el*producto*de*la*concentración,** Al sustituir la ecuación 26.2 en esta última ecu la fase móvil. Entonces, es posible escribir la ecuación analito. El tiempo 2 V c 1 c*,*del*soluto*en*la*fase*estacionaria*por*su*volumen,*S** M uo " pr ción se obtiene una expresión para la velocidad F ! uM (26.6) oA ! n! u" !u" 26.1 como al detector despu migración del soluto en función de su constante de d VS*.*Por*tanto,** c V # c V 1 # c V /c V M M S S S S M M donde A es el área de la sección transversal del tubo tribución y de los volúmenes de las fases estacionar denomina tiempo * (pr 2). En el caso de una columna rellena, no se dispoy móvil: cS en esta nS /VSúltima Aldelsustituir la ecuación 26.2 ecua- (26.2) El analito es reten ne volumen completo de la columna para el líquiK ! ! Al*susCtuir*la*ecuación** c 1 estacionaria. nMla/Vavelocidad do, por loobtiene que la ecuación 26.6 se tiene c que modificar Mpara ción se una expresión de M fase (26. v ! u " * 1 # KcVS /VM migración del soluto de su (26.7) constante de disF ! en pr 2ufunción e en*esta*úlCma*ecuación*se*obCene*una*expresión*para*la*velocidad*de*migración*del*soluto* donde nS y nM sono las cantidades de moles devolúmenes analitose pueden calcular a partir del m Los dos tribución y de los volúmenes de las fases estacionaria en*función*de*su*constante*de*distribución*y*de*los*volúmenes*de*las*fases*estacionaria*y* donde en e eslas la fracción del volumen la columna todo por cualdos se prepara la columna. dos fases yVS ytotal VM de son los volúmenes deellas La velocidad linea móvil:* y móvil: disponible para el líquido (porosidad de la columna). fases. En una situación ideal la constante de distributo a lo largo de la c 26B.5 La velocidad de migración del soluto: Los*dos*volúmenes*se*pueden* ción, a veces llamada razón o coeficiente de reparto o 1 26B.4 Relación v entre tiempo de retención elcalcular*a*parCr*del*método*por*el* factor de retención (26.8) ! u " 3 distribución, es constante amplio intery constante de distribución 1 # KcVaS lo /VMlargo delElcual*se*prepara*la*columna.** factor de retención k es un parámetro experiment valo de concentraciones de soluto; es decir, cS es direcPara relacionar la velocidad de migración de un soluto importante que se usa con frecuencia para compar * Los dos volúmenes se pueden calcular a partir del mécon su tamente constante deproporcional distribución, su velocidad se exprea cM. La cromatografía en la que las velocidades de migración de los solutos en las c donde L es la lon 4 sa como fracción la velocidad la fase móvil: todo poruna el cual sedeprepara la de columna. lumnas. La razón por la cual k es tan útil es que no d FIGURA 26.4 Cromatogramac característico de una 1aA 2 M

Señal del detector

R

FIGURA 26.4 Cromatograma característico de una

Relación*entre*Cempo*de*retención*y*constante* de*distribución**

izquierda representa un soluto que no está retenido

El factor de retención k es unde parámetro experimental 26B.5 La velocidad migración del soluto: en la columna, por lo que llega al detector casi de un soluto importante que de se usa con frecuencia para comparar ederetención elinmediato factor retención después de empezar la elución. Por dad se exprelas velocidades de migración de los solutos las consiguiente, su tiempo deun retención tMen esexperimental casicoigual El factor de retención k es parámetro 4 a fase móvil: lumnas.alLa razón porselarequiere cual k es tanque útiluna es que no de-de la tiempo que para molécula ación de un soluto importante que se usa con frecuencia para comparar pende de la forma de la columna o de la tasa de flujo fase móvil pase por la columna. El* factor' de' retención' k' es* un* parámetro* experimental* importante* que* se* usa* con* elocidad se exprelas velocidades de migración de los una solutos en las cosolutofrecuencia* para* volumétrico. quiere decirde* quemigración* para combicomparar*Esto las* velocidades* de* los* solutos* en* las* 4 La razón por la cual k es tan útil es que no ded) de la fase móvil: naciónlumnas. dada de soluto, faseúCl* móvil y fase estacionaria columnas.La* razón* por* la* cual* k' es* tan* es* que* no* depende* de* la* forma* de* la* pende de la forma de la columna de funciona la tasa de flujo cualquier columna de cualquier forma oque columna*o*de*la*tasa*de*flujo*volumétrico.*Esto*quiere*decir*que*para*una*combinación* cMVquiere aue tubular abierta, a cualquier el promesoluto 1mismo volumétrico. Esto que para una combiM fase decir mero dada*de*soluto,*fase*móvil*y*fase*estacionaria*cualquier*columna*de*cualquier*forma* tasa de flujo de móvil dará el n!u" !u" neal en la salida móvil) nación dada de soluto, fase yA, fase c V # c V 1*el*mismo*factor*de*retención.* # cSel VS estacionaria /cMVM que*funciona*a*cualquier*tasa*de*flujo*de*fase*móvil*dará M el caso S S delmóvil en cualquier factor de retención.MEn soluto factor cualquier de cualquier forma que funciona En*el*caso*del*soluto*A,*el*factor*de*retención*k de moles de de retención kA columna se define como A*se*define*como** Al sustituir la ecuación 26.2 en esta última ecuaal número promea cualquier tasa de flujo de fase móvil dará el mismo ción se obtiene una expresión la velocidad de (26.6) KAel VScaso para móvil en cualquier factor de retención. En del soluto A, el factor kA !en función de su constante (26.9) migración del soluto de disV total de moles de M de retención k se define como móvil A nsversal del tubo tribución y de los volúmenes de las fases estacionaria ena, nodonde* se dispoo constante de distribución del soluto A. donde KA es lade* y móvil: KA* es* la* constante* distribución* del* K soluto* AVS A.* Si* se* susCtuye* la* ecuación* kA ! mna paraanterior*en*la*ecuación** el líqui- Si se sustituye la ecuación 26.9 en la 26.8 se obtiene (26.9) V M aease fase móviles a 1 quemóvil modificar * (26.8) v!u " 1 soluto 1 # K V /V constante de distribución del soluto A. donde KA es nla! oluto en* esta c S M u" (26.10) (26.7) 1 # 26.9 kA en la 26.8 se obtiene Si se sustituye la ecuación e manera sise*obCene* Los dos volúmenes se pueden calcular a partir del méen la fase móvil es la fase estatal de la columna 4 En latodo por el cual se prepara la columna. bibliografía vieja, esta constante se llamaba1factor de capacidad y del soluto en esta ncentración, n!u" (26.10) de la columna). se simbolizaba con k$. En 1993, la Comisión de 1 Nomenclatura Analítica de # kA Vsu. volumen, De manera si-

La'velocidad'de'migración'del'soluto:'el'factor' de'retención'*

M

to en la fase

la IUPAC recomendó que esta constante se denominara factor de retenesta- ción y26B.5 La velocidad de migración del soluto: que se simbolizara con k.

deal la constante de distribu-después de la inyección de la muestra se al detector to a lo largo de la columna n (por lo regular, en cm/s) es zón o coeficiente de reparto tiempo o denomina de retención y se le simboliza con tR. El analito es retenido porque pasa un tiempo 9:52 t L en AM la Page 768 te a lo largo interSKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 (26.2) del amplio n !S (26.4) fase el tiempo de retención 768 Capítulo Entonces, 26 Introducción a las separaciones cromatográficas de soluto; es decir, cS esestacionaria. directR es cles cromatografía en laPara que mostrar cómo se puede obtener kA amapartir de M. La tS " tR ! L de analito donde estM la longitud de la(26.3) columna rellena. De 2 sededenomina nes las dos cromatografía semejante, lasustituyen velocidad lineal promedio u de las 26.4 y un cromatograma, semigración las ecuaciones La velocidad linealnera promedio de la del solu768 Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográficas do características tales como e de distribumoléculas en lo faseA*a*parCr*de*un*cromatograma,*se* móvil es es n (por to aPara lo largo de la la columna regular, enobtener cm/s) Para*mostrar*cómo*se*puede*obtener*k 26.5 en ecuación 26.10: mostrar cómo sela puede kA a partir de tener un uss tiempos inde yreparto o de retención L ecuaciones 26.4 y amplio interidad desusCtuyen*las*ecuaciones************************y******************en*la*ecuación*anterior:** analito inyectado. En un cromatograma, seLmostrar sustituyen las a partir nPara ! (26.4) u ! (26.5) cómo se puede obtener kA a partir de tener una ecuad ir, cS es *directR estringe al estudio teórico de t M 1 L L

La'velocidad'de'migración'del'soluto:'el'factor' de'retención'*

un cromatograma, se sustituyen las ecuaciones 26.4 y 26.5 en la ecuación 26.10: a partir de un c afía en la que (26.11) # $ donde L es la longitud26.5 de en la columna rellena. De mala ecuación 26.10: romatografía 26B.3 Relación entre tR promedio tM lau de 1tasa % de kAflujo nera semejante, la velocidad lineal las l. Chem., 65, p. 819 las recomendaas tales 1993, como Les Ly la velocidad volumétrico del 1 flujo lineal L 1L moléculas de en la fase móvil clatura Analítica para cromatografía (26.11) # $ Se*Cene* (26.11) # $ retención inEn la secció t t 1 % k En la a el empleo del término constante de disR M A testa tM de vista 1 %experimental, kAtiene en la cromatoAl reordenar ecuación se Desde punto Rel L nyectado. En factores de sele o más antiguo “coeficiente de reparto” o u! (26.5) grafía, el flujo en la fase móvil está caracterizado por la factores dio teórico de t Al reordenar esta ecuación se tiene cuenta que ambos términos se hallan en M poder de resolu

tasa de flujo volumétrico F! (cmt3/min) en la salida de Al reordenar esta ecuación se tiene t R M Al*reordenar*esta*ecuación*se*Cene*

poder de tR ! tM 26B.3 Relación entre la tasa de flujo 26C kA #kA # (26.12) (26.12) ENSAN 19 las recomendavolumétrico y la velocidad del flujo lineal t tM Y EFIC cromatografía de tR ! tM M o constante de disLa26C eficiencia d (26.12) ken # Desde el punto de vista experimental, en laelcromatoA Tenga cuenta que tiempo que pasa en la fase esente de reparto” o tMse denomina afectada por la grafía, el flujoen en lacuenta fase móvil que estátRcaracterizado por la tacionaria, !el tM,tiempo algunas veces tiempo minos se hallan en Tenga que pasa en la fase es-ocurre a m 3 que tasa de flujo volumétrico F (cm /min) en la salida de de retención ajustado y su símbolo es t"R. La eficie columna. Ante tacionaria, t ! tM se denomina algunas veces Tenga en cuentaRque el,setiempo que pasa entRla fase es- tiempo Como muestra en la figura 26.4, y tM se obtieen afectada términos m nen con facilidad a partir del cromatograma. El facde retención ajustado y su símbolo es t" . tacionaria, t ! t , se denomina algunas veces tiempo R R M Cuando*el*factor*de*retención*es*del*orden*de*20*a*30*o*tal*vez*mayor,*los*Cempos*de*elución*son* nes por las cu tor de retención se calcula a partir de estas cantidades que ocu bajan por la co excesivamente* largos.* Lo* ideal* que* las* separaciones* se* realicen* en* condiciones* en* las* que* los* de retención ajustado y su símbolo es t" . Como sees*con muestra en la figura 26.4, t y t se obtieR de retención la ecuación 26.12. Un factor R mucho M columna factores*de*retención*para*los*solutos*de*una*mezcla*oscilen*entre*1*y*10* menor que unidad quiere decir emerge El facComo se muestra enalalapartir figura 26.4, tRque y eltMsoluto se obtie26C.1 Teoría nen con facilidad del cromatograma. de la columna en un tiempo cercano al tiempo mueren térmi cromatografí nentor con facilidad a partir del cromatograma. El facde retención se calcula partiresde to. Cuando el factor dearetención del estas orden decantidades 20 a

rafía.

E Y

cas

ponentes de interés.

bandas y cuáles ciencia de la colu Velocidades'de'migración'relaBvas:'el'factor'de' Si examina lo 26B.6 de migración relativas: ParaVelocidades mostrar cómo se puede obtener kA a partir de este capítulo y e selecBvidad'* el factor de selectividad un cromatograma, se sustituyen las ecuaciones de 26.4 elucióny se ve El factor de selectividad a de una columna para los dos nas o de error 26.5 enAlay Becuación 26.10: •  El*factor'de'selec4vidad'a*de*una*columna*para*los*dos*solutos*A*y*B*se* solutos se define como muestra en el ap define*como** error normal pu KBL 1 L (26.13) a# incertidumbre (26.11) a #KA $ vidual es la sum tR tM 1 % kA donde*K donde KB es la constante de distribución para la esincertidumbres, B*es*la*constante*de*distribución*para*la*especie*más*fuertemente*retenida* B,*y*KApecie *es*la*constante*para*la*especie*A*menos*retenida,*o*que*es*eluida*o*lavada* más fuertemente retenida B, y se KA tiene es la constante tables, cada una Al reordenar esta ecuación con*más*rapidez.*De*acuerdo*con*esta*definición,*α*siempre*es*mayor*que*la*unidad.** de ser positiva o para la especie A menos retenida, o que es eluida o la* forma caracterís vada con más rapidez. De acuerdo con esta definición, ! t t R M gráfica se atribu a siempre es mayor que lakunidad. Al*susCtuir*la*ecuación** (26.12) # A tener ecuación que su vez a al * movimientos Aluna sustituir la ecuación 26.9permite y la análoga el so-determinar tM a para medida que desc a partir dela un cromatograma luto B en ecuación 26.13 se obtieneexperimental: una relación ense supon tre el factor de selectividad los dos que solutos y susen laanálisis Tenga en cuenta que elpara tiempo pasa fase es1tR 2 B ! tM gosta de modo factores de retención: Se**obCene* (26.15) tacionaria, tR ! tM,ase#denomina algunas vecesfactor tiempo limitante 1t 2 ! t kB R A M banda que eluye de retención ajustado y su símbolo es(26.14) t"R. a# los anchos A muestra cómo se utilizan En la sección 26D.2 kse losde la

Como se muestra en la figura 26.4, t y t se obtie-

Respuesta del detector

Parámetros fundamentales

CH4

Octano

No identificado

Nonano

Tiempo Inyección

tr´ = tr - tm Tiempo de retención: Tiempo que transcurre desde el momento de la inyección de la muestra hasta la aparición de la máxima concentración del compuesto eluido

la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto, representa la interacción del soluto con la fase estacionaria y tiene el nombre de tiempo de retención corregido tr’

4. Parámetros fundamentales

describe las velocidades de migración de los analitos en las columnas

Factor de retención (k)

k

tr

tm tm

k 1: Los máximos de los picos cromatográficos están separados

Volumen de retención ( Vr)

Vr

t r ur

relación entre los factores de retención de los dos picos de interés, apareciendo en el numerador el factor de retención de la especie más fuertemente retenida y en el denominador el de la especie que eluye con más rapidez

es el volumen de fase móvil necesario para eluir a un soluto determinado de la columna

ur : velocidad de flujo de la fase móvil

Teoría'cinéBca'de'la'cromatogra2a* •  La* teoría' ciné4ca' de' la' cromatogra:a' explica* las* formas*y*anchos*de*las*bandas*de*elución*en*términos* cuanCtaCvos* con* base* en* un* mecanismo* de* avance* aleatorio*para*la*migración*de*moléculas*a*través*de*la* columna.* •  El* ensanchamiento* de* una* zona* aumenta* a* medida* que* desciende* por* la* columna* porque* ha* habido* más* Cempo* para* que* haya* dispersión.* Entonces,* el* enT* sanchamiento* de* la* zona* está* relacionado* de* manera* directa*con*el*Cempo*de*residencia*en*la*columna*y*de* manera* inversa* con* la* velocidad* de* flujo* de* la* fase* móvil.**

Teoría'cinéBca'de'la'cromatogra2a* SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 769

26C Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna

Es ilustrativo considerar una sola molécula de soComo* se* puede* ver* en* la* figura* 26.5,* algunos* luto mientras pasa por miles de transferencias entre las picos* cromatográficos* son* no* ideales* fases estacionaria y móvil durante la elución. Ely* tiempo de residencia en cualquiera de las fases es muy irrepresentan*deformación'hacia'la'cola'o*hacia'el' gular. La transferencia de una fase a otra requiere energía y la molécula la debe tomar de los alrededores. frente.* En* el* primer* caso* la* cola* del* pico,* que* Por consiguiente, el tiempo de residencia en una fase dada aen* vecesel* es momentáneo después de alguna transaparece* a* la* derecha* cromatograma,* se* ferencia y relativamente largo después de otra. Realarga* y* el* frente*cuerde se*queacorta* el descenso bruscamente.* por la columna ocurre sólo mientras la molécula está en la fase móvil. Por tanto, Cuando* la* deformación* es*viajan hacia* el* gracias frente* ciertas partículas con rapidez a su inclusión accidental en la fase móvil la mayor parte del ocurre*lo*contrario.*Una*causa*común*de*estas* tiempo, mientras otras se retrasan a causa de que están fase estacionaria por un tiempo d ef o rma ci o n es* incorporadas es* u n en a*la co n s t a n t e* d e* mayor al promedio. El resultado de estos procesos aleatorios individuales es una dispersión simétrica de distribución*que*varía*con*la*concentración.*La* velocidades alrededor del valor medio, lo cual representa el comportamiento de la molécula de analito asimetría*o*deformación*del*frente*también*se* promedio. presenta* cuando* se* introduce* El ensanchamiento de unademasiada* zona aumenta a medida que desciende por la columna porque ha habido muestra* en* una* columna.* Las* distorsiones* de*el enmás tiempo para que haya dispersión. Entonces, sanchamiento de la zona está relacionado de manera este* Cpo* son* indeseables* porque* ocasionan* directa con el tiempo de residencia en la columna y de manera inversa y* con la de flujo dede* la fase separaciones* deficientes* a*velocidad Cempos* móvil. Como se puede ver en la figura 26.5, algunos picos elución*menos*reproducibles.*En*el*análisis*que* cromatográficos son no ideales y presentan deformasigue* se* supone* que* las* distorsiones* ción hacia la cola o hacia el frente. En el en* primerel* caso la cola del pico, que aparece a la derecha en el cromatofrente*y*en*la*cola*son*mínimas.** grama, se alarga y el frente se acorta bruscamente. Cuando la deformación es hacia el frente ocurre lo contrario. Una causa común de estas deformaciones es una constante de distribución que varía con la concentración. La asimetría o deformación del frente

Frente

Cola

Señal del detector

• 

769

Tiempo

FIGURA 26.5 Ilustración del frente y de la cola de los picos cromatográficos.

donde L es la longitud (por lo regular en centímetros) del relleno de la columna. La eficiencia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos N y cuanto menor es la altura H del plato. Se han encontrado enormes diferencias en las eficiencias debido a diferencias en el tipo de columna y en las fases móvil y estacionaria. Las eficiencias en términos del número de platos varían desde pocos cientos a va-

fuera simil 26C.2 A Descripción cuantitativa de la viera const eficiencia de la columna tos, distint Dos términos afines se utilizan ampliamente como platos teór medidas cuantitativas de la eficiencia de una columna tablecía el Dos*términos*afines*se*uClizan*ampliamente*como*medidas*cuanCtaCvas*de* cromatográfica: 1) la altura de plato H y 2) el número estaciona la* eficiencia* de* una* columna*teórica cromatográfica:* altura' plato' H' y*y2)* el' de platos o cantidad de platos,1)* N.la'Los dosde' están se trataba número'de'platos'o*can4dad'teórica'de'platos,*N.*Los*dos*están*relacionados* relacionados por la ecuación pas de fase por*la*ecuación** L N! (26.16) 6 A. J. P. Marti H

Descripción'cuanBtaBva'de'la'eficiencia' de'la'columna*

donde* L* es* la* longitud* (por* lo* regular* en* cenjmetros)* del* relleno* de* la* columna.*La*eficiencia*de*la*columna*cromatográfica*aumenta*cuanto*mayor* es*el*número*de*platos*N*y*cuanto*menor*es*la*altura*H*del*plato.*El*origen* de*los*términos*“altura*de*plato”*y*“canCdad*de*platos*teóricos”*proviene*de* uno* de* los* * estudios* realizado* por* MarCn* y* Synge* en* que* trataron* a* una* columna*cromatográfica*como*si*fuera*similar*a*una*columna*de*desClación* que*estuviera*consCtuida*por*numerosas*capas*angostas,*o*platos,*disCntos* pero*conCguos,*a*las*que*denominaron*platos'teóricos.* *

Descripción'cuanBtaBva'de'la'eficiencia' de'la'columna* •  La*teoría'del'plato'explica*de*manera*saCsfactoria* la*forma*gaussiana*de*los*picos*cromatográficos*y* su* velocidad* de* desplazamiento* por* la* columna.* Pero* la* teoría* se* abandonó* en* favor* de* la* teoría' de'la'velocidad,*debido*a*que*la*primera*fallaba*al* intentar*jusCficar*el*ensanchamiento*de*los*picos* de* una* manera* mecanicista.* No* obstante,* los* términos* originales* para* la* eficiencia* se* han* incorporado*a*la*teoría*de*velocidad.**

gráfico y se prolongan en movimiento constante. línea base del cromato Definición'de'altura'de'plato'* el área de este triángu ición de altura de plato SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 770 Esta* definición* de* la* eficiencia* de* la* columna* se* ilustra* 770 Capítulo 26 Introducción a las separaciones jo el pico, si éstecromatográf es ga en* la* figura* ,* donde* se* muestra* una* columna* con* un* o se muestra en la sección a1B.1 del Apéndice 1, apéndice 1 se indica qu relleno* de* L* cm* de* longitud.* Encima* de* este* esquema* 770 Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográfica chura de muestra* una curva directamente (b)* se* una*gaussiana gráfica* que*está representa* la* gaussiano se encuentra Perfil del analito en el distribución*de*las*moléculas*a*lo*largo*de*la*columna*en* onada con su desviación estándar s o su varianza extremo final del relleno dido entre más o me el* momento* en* que* el* pico* del* analito* alcanza* el* menudo se supone que las bandas cromatográfiPerfil del analito en el extremo* final* del* relleno* (es* decir,* en* el* Cempo* de* b) extremo final del relleno (L " 1s) (L # 1s) enen una forma gaussiana, lo cual es conveniente retención).*La*curva*es*gaussiana*y*la*ubicación*de*L'︎ +1σ* b) y*L7︎*1σ*se*indica*mediante*líneas*verCcales*disconCnuas.* (L " 1s) (L # 1s) definir la eficiencia de una columna en términos s ––– H = tR Observe*que*las*unidades*de*L'son*cenjmetros*y*las*de* L varianza por unidad de longitud de la columna. s σ2* son* cenjmetros* cuadrados;* entonces,* H' representa* H = ––– L L cir,una*distancia*lineal*en*cenjmetros*(ecuación*).** la altura de plato H viene dada por Distancia migrada Señal del detectorCantidad de moléculas

Cantidad de moléculas

SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 770

2

2

L

tDistancia a) Relleno migrada M * 2 a) Relleno L s * L H! (26.17) Entrada de la muestra Detector Entrada de la muestra Detector L * FIGURA 26.6 Definición de la altura de plato H ! s 2/L. FIGURA 26.6 Definición de la altura de plato H ! s /L. la longitud de la columna es la distancia desde el De*hecho,*puede*pensarse*en*la*altura*de*plato*como*la* En a)En a) la longitud de la columna es la distancia desde el definición de la eficiencia de la columna se ilustra punto de entrada hasta el detector. En b) 0 dedela lamuestra punto de entrada muestra hasta el detector. En b) longitud* de* columna* que* conCene* una* fracción* de* se muestra la distribución las moléculas moléculas se muestra la distribucióngaussiana gaussiana de de las figura 26.6a, dondeentre* se muestra una columna analito* comprendida* L' y* L' T* σ.* Debido* a* que* el* decon lade muestra. la muestra. área*de bajo*Luna* curva* de* error* limitada* por* 0 lleno cm denormal* longitud. Encima de una* este esLa teoría del plato explicade demanera manera satisfactoria la la La teoría del plato explica satisfactoria desviación* estándar* (︎±1σ)* es* de* alrededor* de* 68%* del* Tie forma gaussiana de los picos cromatográficos y su vegaussiana de los picos cromatográficos y su vea (figura unase*gráfica queforma reárea* total,*26.6b) la* altura*se de*muestra plato,* tal* como* ha* definido,* locidad de desplazamiento por la columna. Pero la FIGURApor26.7 Determina locidad de desplazamiento la columna. Pero la teoría se abandonó en favor de la teoría de la velocidad, ntaconCene*34%*del*analito.** la distribución de las moléculas a lo largo de teoría se abandonó en favor de la teoría2de la velocidad, 2

t

debido a que la primera fallaba al intentar justificar el

puntos de inflexión a los dos lados del pico cromatográfico y se prolongan para formar un triángulo con la línea base del cromatograma. Se puede demostrar que el área de este triángulo es casi 96% del área total bajo el pico, si éste es gaussiano. En la sección a1B.1 del apéndice 1 se indica que casi 96% del área bajo un pico gaussiano se encuentra dentro del intervalo comprendido entre más o menos dos desviaciones estándar

tado de equilibrio nunca se puede alcanzar con la fase por una desviación estándar ($1s) móvil en movimiento constante.

de error limitada aluación experimentalde deHHyyNN uación experimental es de alrededor de 68% del área total, la altura de pla-

La*evaluación*experimental*de*H*y*N** Definición de altura de plato

tal como se haun definido, contiene 34% característico del analito. ura 26.7 ilustra un cromatograma característico rato,26.7 ilustra Comocromatograma se muestra en la sección a1B.1 del Apéndice 1, la anchura de una curva gaussiana está directamente tiempo enlalaabscisa. abscisa. La varianza delspico pico delsosoiempo en La del del La evaluación experimental de H y N estándar relacionada convarianza su desviación o su varianza s . A menudo se supone que las bandas cromatográfique puede obtener porun un procedimiento gráueLa sesefigura puede procedimiento 26.7obtener ilustra un por cromatograma característico cas tienen una forma gaussiana, lo cual es convenientegrádefinir la eficiencia de una columna en términos con el tiene tiempo en lapara abscisa. La varianza del pico del soncillo, tieneunidades unidades de segundos al cuadrado t ncillo, de segundos al cuadrado de la varianza por unidad de longitud de la columna. luto, que se puede Es obtener pordeun procedimiento decir, la altura plato dada por grá2H2 viene lo regular, se designa como t para distinguirlot o fico regular, designa como t para distinguirlo sencillo,setiene unidades de segundos al cuadrado s H 2! (26.17) cual tiene unidades de centímetros alcuadracuadraL por lo regular, se designade como t para distinguirlo alay,cual tiene unidades centímetros al 2 definición de lacentímetros eficiencia des la columna se ilustra 0 de s desviaciones ,desviaciones la cual tieneEsta unidades de al cuadraW as dos estándar t y se relacionan s dos estándar t y s se relacionan en la figura 26.6a, donde se muestra una columna con do. Las dos desviaciones estándar t y s se relacionan 0 un relleno de L cm de longitud. Encima de este esnte Tiempo nte quema (figura 26.6b) se muestra una gráfica que remediante FIGURA 26.7 Determinación de la cantidad de platos presenta la distribución de las moléculas a lo largo de t s s la columna s en el momento en que el pico del analito N ! 16 a b . (26.18) t ! W (26.18) (26.18) tt!! L/tR L/tRR L/t 2

2

Señal del detector

R

M

R

2

donde L/tR es la velocidad lineal promedio n del soluL/t es velocidad lineal promedio del solusolutodonde*L/t centímetros por segundo (ecuación 26.4).nn del L/t lalavelocidad lineal promedio Res Ren R*es*la*velocidad*lineal*promedio**********del*soluto*en*cenjmetros*por*segundo** La figura por 26.7 una manera sencilla26.4). de detercentímetros porilustra segundo (ecuación 26.4). entímetros segundo (ecuación minar aproximadamente t y s a partir de un cromaLa*figura*26.7*ilustra*una*manera*sencilla*de*determinar*aproximadamente*τ*y*σ*a*parCr*de* figura 26.7 ilustrauna una manera sencillaen delosdeterdeterfigura 26.7 ilustra manera sencilla de tograma experimental. Se trazan las tangentes un*cromatograma*experimental.*Se*trazan*las*tangentes*en*los*puntos*de*inflexión*a*los*dos* aproximadamente ysslados partir decromatoun cromacromapuntos de inflexión a los del pico aproximadamente tt ydos aa partir de un lados*del*pico*cromatográfico*y*se*prolongan*para*formar*un*triángulo*con*la*línea*base*del* y se prolonganSe formar las un triángulo con laen los ma experimental. trazan tangentes cromatograma.*Se*puede*demostrar*que*el*área*de*este*triángulo*es*casi*96%*del*área*total* a gráfico experimental. Separa trazan las tangentes en los línea base del cromatograma. Se puede demostrar que bajo*el*pico,*si*éste*es*gaussiano** sde de inflexión losdos dos lados del pico pico cromatoinflexión aalos lados cromatoel área de este triángulo es casi 96% del del área total ba* oyyjo prolongan para formar un triángulo con la la elprolongan pico, si éste espara gaussiano. En laun sección a1B.1 del sese formar triángulo con

ción hacia la cola o hacia elEnsanchamiento frente. En el primer la y eficiencia de 26Cdonde decaso banda cromatográfi hay condiciones de equilibrio. De hec colasu delmáximo. pico, que aparece a la derecha en el cromatoTABL (!2s) de Entonces, las intersecciones que de platos Ncy 26C Ensanchamiento ban tado de nunca se puededealcanzar Ensanchamiento de banda y eficiencia la de colum grama, 26C se alarga y el frente se equilibrio acorta bruscamente. de la han encontr se indican en la figura 26.7estienen lugar a alrededor en movimiento constante. Cuando la deformaciónmóvil hacia el frente ocurre lo de máscontrario. o menosUna doscausa desviaciones estándar (!2t) res- debido a dif común de estas deformaciones TABLA 26.2deVariables que influyen en la ses móvil y !2s) de su máximo. Entonces, las intersecciones que de distribución altura de plato una constante que varía con la conTABLA 26.2 Variables qu pecto Entonces, alesmáximo yW " de 4t,Definición donde W es la magnitud de (!2s) de su máximo. las intersecciones que del número Var laocolumna. indican en la figura 26.7 tienen lugar a alrededor centración. La asimetría deformación del frente Como se muestra en la sección a1B.1 del Ap TABLA 26.2 Variables que influyen en la eficienc de la columna. Se* conoce* que* casi* 96%* del* área* bajo* un* pico* gaussiano* se* encuentra* dentro* del* máximo. Entonces, lasse intersecciones que base 26.7 del triángulo. Al asustituir esta relación en la rios cientos indican en lalafigura tienen lugar alrededor d también se presenta cuando se introduce demasiada la anchura de una curva gaussiana está dire e más ointervalo* menos dos desviaciones estándar (!2t) resdeydos* la columna. más* menos* desviaciones* estándar* (* ±2σ)* de*que su*oscilan ecuación 26.18 reordenar los términos se tiene: más oentre* dos o* desviaciones estándar (!2t) resla figura 26.7 comprendido* tienendelugar amenos alrededor muestra en una columna. Las distorsiones dedesviación este tipo estándar sVelo relacionada con su o su sima de cent ecto al máximo.* máximo yEntonces,* W " 4t, donde W es la magnitud deindican* pecto al máximo y W " 4t, donde W es la magnitud de las* intersecciones* que* se* en* 26.7* Cenen* lugar* a* 2 la* figura* son indeseables porque ocasionan separaciones defiCoe Variable Símb os dos desviaciones estándar (!2t) resVariable s LW . A menudo se supone que las bandas crom El origen base del triángulo. Alla sustituir esta relación eny alatiempos cientes de"cas elución menos reproducibles. móv base del triángulo. Al sustituir estasrelación en la (26.19) alrededor*de*más*o*menos*dos*desviaciones*estándar*(︎ ± 2τ)*respecto*al*máximo*y*W'︎ * tienen una forma gaussiana, lodad cual co dees plato mo y W " 4t, donde W es la magnitud de 4t En el análisis que sigue se supone que las distorsiones R Variable Símbolo uación4τ,* 26.18 y reordenar los términos se base* tiene:del* ecuación 26.18de* y reordenar los términos seVelocidad tiene: Coe derelación* la fase móvil Velocidad lineal de la fauh para definirlineal la esta* eficiencia de una columna en rosla* estudios donde* W' es* la* magnitud* la* triángulo.* Al* susCtuir* en* la cola son mínimas. iángulo. Al sustituir esta relación La ensustitución la en el frentedey en que trataron de la varianza unidad delalongitud deesta laD esta ecuación por de s por en laCoeficiente ecuación de difusión e Coeficiente difusión en fase ecuación*26.18*y*reordenar*los*términos*se*Cene:** LW LW fuera simila 8 y reordenar los términos móvil* Es decir, altura de plato H viene por (26.19) s "(26.19) Fac Velocidadmóvil* lineal delala fase móvil udada cm 26C.2 A Descripción cuantitativa de la s " se tiene:26.17 da: * 4t viera constite R de la columna 4tR eficiencia Coeficiente de difusión Diá 2 fase 2 Coeficiente de difusión en la fase D ** cm Coeficiente de difusión en la D s M LW tos, distinto LW estacionaria* Dos términos afines se utilizan ampliamente como H ! La*susCtución*de*esta*ecuación*por*σ*en*la*ecuación*da* La sustitución(26.19) esta ecuaciónmóvil* por sH en" la ecuación (26.20) Esp estacionaria* 2 s "de esta ecuación a sustitución por sdeen la medidas ecuación L platos teóric 16t cuantitativas de la eficiencia de una columna Factor de retención (ecu R 26.17 da: 4tR la fa tablecía el eq Factor de retención (ecuación 26.12) k cm Coeficiente de difusión en la fase D .17 da: cromatográfica: 1) la altura de plato H y 2) el número S Esta definición de la eficiencia de la columna Diámetro las partícul 2 Paradeobtener N, se sustituye lo anterior en están la ecuay estacionar LWoestacionaria* platos cantidad teórica defigura platos, N.las Lospartículas dos Diámetro de delrevestimien relleno d en la 26.6a, donde se muestra una*Au colu n de esta ecuación por sLW en2 la ecuación (26.20) H " Espesor del se trataba e 2reordena ción 26.16 y se para obtener relacionados por la ecuación 16tRFactor de Espesor (26.20) H" un relleno de L cm de longitud. Encima d del revestimiento líquido en d la fase estacionaria **En retención (ecuación 26.12) k de fase sinm pas 16tR2 2 quema (figura 26.6b) se muestra una gráfic son d fase estacionaria tLR ecuaPara obtener N, se sustituye Diámetro lo anteriorla en la cm de las partículas del relleno d 2 p N ! (26.16) *Aumenta incrementarse la s DaMlo (26.21) N " 16 a H b la distribución presenta de lasalmoléculas LW 6 A. J. P. Martin y Para Para*obtener*N,*se*susCtuye*lo*anterior*en*la*ecuación*******************y*se*reordena*para* obtener N, se sustituye lo anterior en la ecuación 26.16 y se reordena para obtener W (26.20) H" cmd Espesor del líquido en dflos **En los líquidos, la revestimiento columna en el momento en que el valores pico *Aumenta al incrementarse la temperatura y dism 2 obtener*

La*evaluación*experimental*de*H*y*N**

16tR ón 26.16 y se reordena para obtener

2 son del orden de 10 #5 cm 2 s # tRla fase estacionaria Por N tanto, N se puede calcular a partir medidas **En los líquidos,de losdos valores DM para moléculas !10 5 veces más26C grand DM2 son (26.21) " 16 a b #5 #1 2 s tiene ; en el caso de los g son del orden 10 cm se er N, se sustituye lo anterior la de ecuatR en tiempo, tRWy W; para calcular H,5 de también en la *Aumenta alDincrementarse la temperatura más grandes. y disminuir la v (26.21) N " 16 a b M son !10 veces que conocer la longitud del relleno de la columna L. e reordena para obtener W N se puede calcular a partir de dos medidas Por tanto, 26C.3 Variables ciné El en **En los estos líquidos, los valores DMson paraaproximoléculas pequeñas Tome en cuenta que cálculos sólo de tiempo, t y W; para calcular H, también se tiene R 2 la eficiencia de el caso de los gases,eficie los la v son del orden de 10 #5 cm 2 s #1; enen or tanto, N se puede a partir de dos medidas tR calcular 26C.3 Variables mados y que se supone que las formas de loscinéticas picos son que infl que conocer la longitud del relleno de la L. 5columna DM son !10 veces más grandes.El ensanchamiento N" a para b calcular H, (26.21) cidad e tiempo, tR 16 y W; también se tiene enson la aproxieficiencia de la columna de b gaussianas. W Tome en cuenta que estos cálculos sólo ocurr eficiencia de la column ue conocer la longitud mados del relleno desupone laOtro columna L.para de método evaluar de manera aproximada y que se que las formas los picos son El ensanchamiento de banda refleja u anch cidad de los procesos e puede calcular a partir de dos medidas

26C Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna

771

Variables'cinéBcas'que'influyen'en'la'eficiencia'de'la'columna'* (!2s) de su máximo. Entonces, las intersecciones que se indican en la figura 26.7 tienen lugar a alrededor de más o menos dos desviaciones estándar (!2t) respecto al máximo y W " 4t, donde W es la magnitud de la base del triángulo. Al sustituir esta relación en la ecuación 26.18 y reordenar los términos se tiene:

•  El* ensanchamiento* de* banda* r e fl e j a* u n a* p é r d i d a* d e* l a* eficiencia* de* la* columna.* Cuanto* más* lenta* es*s "la*LW velocidad* de* los* (26.19) 4t procesos* de* transferencia* de* La sustitución de esta ecuación por s en la ecuación masa* que* ocurren* mientras* un* 26.17 da: soluto*migra*por*la*columna,*más* LW (26.20) H " ancha*es*la*banda*en*salida*de*la* 16t columna.*Algunas*de*las*variables* Para obtener N, se sustituye lo anterior en la ecuación 26.16afectan* y se reordena las* para obtener que* velocidades* de* tde* masa* son* transferencia* (26.21) N " 16 a b W controladas* y* suscepCbles* de* ser* Por N se puede calcular a partir de dos medidas se*tanto,pueden* aprovechar* para* de tiempo, t y W; para calcular H, también se tiene mejorar* las* separaciones.* En*L. la* que conocer la longitud del relleno de la columna tabla* se* que da*estosuna* las* Tome en cuenta cálculoslista* sólo sonde* aproximados y que se supone que las formas de los picos son variables*más*importantes.** R

2

2 R

R

2

R

gaussianas. Otro método para evaluar de manera aproximada N, que algunos investigadores creen más confiable, es determinar W1/2, la anchura del pico a la mitad de su altura máxima. El número de platos es entonces

TABLA 26.2 Variables que influyen en la eficiencia

de la columna. Variable

Unidades habituales

Símbolo

Velocidad lineal de la fase móvil Coeficiente de difusión en la fase móvil* Coeficiente de difusión en la fase estacionaria* Factor de retención (ecuación 26.12) Diámetro de las partículas del relleno Espesor del revestimiento líquido en la fase estacionaria

u cm s #1 DM** cm 2 s #1 DS

cm 2 s #1

k dp df

sin unidades cm cm

*Aumenta al incrementarse la temperatura y disminuir la viscosidad. **En los líquidos, los valores DM para moléculas pequeñas y medianas son del orden de 10 #5 cm 2 s #1; en el caso de los gases, los valores, DM son !10 5 veces más grandes.

26C.3 Variables cinéticas que influyen en la eficiencia de la columna El ensanchamiento de banda refleja una pérdida de la eficiencia de la columna. Cuanto más lenta es la velocidad de los procesos de transferencia de masa que ocurren mientras un soluto migra por la columna, más ancha es la banda en salida de la columna. Algunas de las variables que afectan las velocidades de transferencia de masa son susceptibles de ser controladas y se

Influencia(de(la(tasa(de(flujo(de(la(fase(móvil(* 772 Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográficas

eficiencia d las col El* grado* de* ensanchamiento* de* la* banda* depende* del* Cempo* que* la* fase* móvil*con 0.005 si se comp está*en*contacto*con*la*fase*estacionaria,*lo*cual*a*su*vez*depende*de*la*tasa*de*grafía de l flujo* de* la* fase* móvil.* Por* esta* razón,* los*0.004 estudios* sobre* la* eficiencia* se* han*paraciones ambas cua realizado*casi*siempre*determinando*H'en*función*de*la*velocidad*de*la*fase*móvil.* 0.003 simultánea 0.006

H, cm

• 

Las*gráficas*para*CL*y*para*CG*que*se*muestran*en*la*figura*26.8*son*caracterísCcas* 0.002 de* los* datos* que* se* obCenen* mediante* estos* estudios.* Aunque* ambos* muestran*Teoría del 0.001 a* tasas* de* flujo* lineales* bajas,* el*En los últi un* mínimo* en* H,* o* un* máximo* en* eficiencia* fuerzo tant mínimo*para*CL*se*presenta*casi*siempre*a*tasas*de*flujo*muy*por*debajo*de*las*de* 0 nar relacio 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 772 Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográficas CG.*A*menudo,*estas*tasas*de*flujo*son*tan*bajas*que*no*se*observa*la*H'mínima* de las vari u, cm/s para*CL*en*condiciones*normales*de*operación.** tabla 26.2 s a) Cromatografía de líquidos

SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 772

0.005

H, cm

0.004 0.003 0.002

eficiencia0.12 de la columna son por lo regular superiores con las columnas de cromatografía de gases. Por tanto, 0.10 la cromatografía de gases y la cromatosi se compara grafía de líquidos, la primera es capaz de realizar se0.08 paraciones más rápidas y con mayor eficacia, aunque ambas cualidades no se den necesariamente en forma 0.06 simultánea. H, cm

0.006

0.04

Teoría del ensanchamiento de bandas

columnas. más o men matemátic de estas ec explicar la jos que cau to, una efi algunas de de gran ut rendimien La efici puede con presión

En los últimos cuarenta años se dedicó un enorme es0.02 fuerzo tanto experimental como teórico para perfeccio0 0 nar relaciones cuantitativas que describan los efectos 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 20 40 60 80 100 de las variables experimentales u, que se enlistan en la u, cm/s cm/s tabla 26.2 sobre las alturasb)de plato de diversos a) Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases tipos de columnas. Tal vez se han propuesto y aplicado, con 26.8 Efecto de la tasa de flujo de la fase móvil 0.12 Efecto*de*la*tasa*de*flujo*de*la*fase*móvil*sobre*la*altura*de*plato*para*a)*cromatograYa*de*líquidos*y* más oFIGURA menos acierto, una docena o más de expresiones sobre la altura de plato para a) cromatografía de líquidos donde H e matemáticas para calcular la altura de plato. Ninguna b)*cromatograYa*de*gases.*Observe*las*escalas*muy*diferentes*de*la*tasa*de*flujo*y*de*la*altura*de* y b) cromatografía de gases. Observe las escalas muy 0.10 velocidad de estas ecuaciones es por completo satisfactoria para diferentes de la tasa de flujo y de la altura de plato. segundo. L plato.*0.08 explicar las interacciones y los efectos físicos complelos efectos ensanchamiento de banda cromatográfico, que se ex0.001

explicar las interacciones y los efectos físicos complejos que causan el ensanchamiento de la zona y, por tanto, una eficiencia menor de la columna. Sin embargo, algunas de las ecuaciones, aunque imperfectas, fueron de gran utilidad para indicar la forma de mejorar el rendimiento de la columna. La eficiencia de las columnas cromatográficas se La*eficiencia*de*las*columnas*cromatográficas*se*puede* puede conocer de manera aproximada mediante la exconocer*de*manera*aproximada*mediante*la*expresión** 100 presión

Teoría(del(ensanchamiento(de(bandas(* •  80

B H ! A " " CSu " CMu u

(26.23)

fase móvil de líquidos donde H es la altura de plato en centímetros y u es la alas muy velocidad lineal de la fase móvil en centímetros por donde*H*es*la*altura*de*plato*en*cenjmetros*y*u*es*la*velocidad*lineal*de*la*fase*móvil*en* plato.cenjmetros* por* segundo.*La La*cantidad canCdad* A* describe* los* efectos* de* la* segundo. Aes* esun* uncoeficiente* coeficienteque* que describe S* los efectos de la trayectoria múltiple (difusión en remoo, quetrayectoria*múlCple*(difusión*en*remolino),*B*es*el*coeficiente*de*difusión*longitudinal*y*C se exy* CM* son* los* coeficientes* masa* para* las*elfases* estacionaria* y* móvil,* lino), comode* setransferencia* analiza másde* adelante, B es coeficiente d el perfil de respecCvamente*

denomina a uien planteó

as de flujo de vamente meafía de gases.

de difusión longitudinal y CS y CM son los coeficientes de transferencia de masa para las fases estacionaria y móvil, respectivamente. La ecuación 26.23 equivale a la bien conocida ecuación de van Deemter, que formularon ingenieros químicos holandeses en los años cincuenta y que, a menudo, se utiliza para expresar la

Término'de'trayectoria'múlBple'A.'* El* ensanchamiento* de* una* zona* en* la* fase* móvil* se* debe* en* parte* a* la* mulCtud* de* caminos* por* los* cuales* las* moléculas* o* los* iones* pueden* desplazarse* por* la* columna* rellena.* Como* se* muestra* en* la* figura* en* adelante,*la*longitud*de*estos*caminos*puede*diferir*de*manera*importante;* por* consiguiente,* el* Cempo* que* residen* en* la* columna* las* moléculas* de* la* misma* especie* también* es* variable.* Las* moléculas* de* soluto* alcanzan* el* extremo*de*la*columna*durante*un*intervalo*de*Cempo,*lo*cual*ocasiona*un* ensanchamiento* de* banda.* Este* efecto* de* trayectorias* múlCples,* que* se* denomina* a* veces* difusión' en' remolino,* sería* independiente* de* la* velocidad* del*solvente*si*no*fuera*compensado*en*parte*por*la*difusión*ordinaria,*lo*cual* resulta*en*moléculas*que*son*transferidas*desde*una*corriente*que*sigue*una* trayectoria*hasta*una*corriente*que*sigue*otra.*Si*la*velocidad*de*flujo*es*muy* baja,*Cene*lugar*un*gran*número*de*estas*transferencias,*y*cada*molécula*en* su* desplazamiento* descendente* por* la* columna* prueba* numerosos* caminos* de*flujo*y*gasta*en*cada*uno*un*Cempo*breve.*Por*tanto,*la*velocidad*a*la*que* cada* molécula* desciende* por* la* columna* Cende* a* aproximarse* a* la* media.* Entonces,*a*velocidades*bajas*de*la*fase*móvil,*las*moléculas*no*se*dispersan* de*manera*apreciable*por*el*efecto*de*las*trayectorias*múlCples.** *

ariable. Las de la columocasiona un trayectorias ón en remoel solvente si fusión orditransferidas ctoria hasta d de flujo es stas transfeento descencaminos de e. Por tanto, ende por la Entonces, a éculas no se fecto de las velocidades tiempo sufi-

porcional a la diferencia de concentración entre las regiones y al coeficiente de difusión DM de las especies. Este último, que es una medida de la movilidad de una sustancia en un medio, es una constante para una es-

Término'de'trayectoria'múlBple'A.'*

ecuación de van Microsoft ® Excel 4.

Dirección del flujo

A

1

2

B FIGURA 26.9 Trayectorias características de dos

moléculas durante la elución. Obsérvese que la distancia que recorre la molécula 2 es mayor que la recorrida por la molécula 1. Por tanto, la molécula 2 llegará a B después que la molécula 1.

Término'de'trayectoria'múlBple'A.'* • 

• 

• 

Sin* embargo,* con* velocidades* moderadas* o* elevadas,* no* se* dispone* de* Cempo* suficiente*para*que*se*produzca*el*promedio*por*difusión,*y*por*ello*se*observa*un* ensanchamiento*de*banda*debido*a*las*diferentes*longitudes*de*los*caminos.*Con* velocidades* suficientemente* altas,* el* efecto* de* la* difusión* en* remolino* se* vuelve* independiente*de*la*tasa*de*flujo.** Además* del* efecto* de* la* difusión* en* remolino* está* otro* que* surge* de* los* estancamientos* de* fase* móvil* en* la* cavidades* de* la* fase* estacionaria.* Por* consiguiente,* cuando* un* sólido* funciona* como* fase* estacionaria,* sus* poros* se* llenan*con*volúmenes*está4cos'de*fase*móvil.*Las*moléculas*del*soluto*Cenen*que* difundirse* entonces* a* través* de* estos* estancos* antes* de* que* la* transferencia* ocurra*entre*la*fase*móvil*que'se'desplaza'y*la*fase*estacionaria.*Esta*situación*se* aplica* no* sólo* a* fases* sólidas* estacionarias,* sino* también* a* las* fases* líT* quidas* estacionarias*inmovilizadas*en*sólidos*porosos*porque*el*líquido*inmóvil*no*suele* llenar*por*completo*los*poros.** La*presencia*de*estancos*de*fase*móvil*hace*que*los*procesos*de*intercambio*sean* lentos* y* produce* una* contribución* a* la* altura* de* plato* que* es* directamente* proporcional* a* la* velocidad* de* la* fase* móvil* e* inversamente* proporcional* al* coeficiente*de*difusión*del*soluto*en*la*fase*móvil.*Un*incremento*en*el*volumen* interno*acompaña*entonces*a*los*aumentos*en*las*dimensiones*de*las*parjculas.**

El'término'de'difusión'longitudinal'B/u.'* •  La*difusión*es*un*proceso*en*el*cual*las*especies*migran*desde*una*zona*de* un*medio*con*mayor*concentración*a*una*región*más*diluida.*La*velocidad* de* migración* es* proporcional* a* la* diferencia* de* concentración* entre* las* regiones*y*al*coeficiente'de'difusión'DM*de*las*especies.*Este*úlCmo,*que* es* una* medida* de* la* movilidad* de* una* sustancia* en* un* medio,* es* una* constante*para*una*especie*dada*igual*a*la*velocidad*de*migración*en*un* gradiente*de*concentración*unitario.** •  En*cromatograYa,*la*difusión*longitudinal*da*como*resultado*la*migración* de* un* soluto* desde* el* centro* concentrado* de* una* banda* hacia* regiones* más*diluidas*en*cualquiera*de*los*dos*lados,*es*decir,*en*dirección*del*flujo* o* en* senCdo* contrario.* La* difusión* longitudinal* es* una* causa* común* del* ensanchamiento* de* banda* en* la* cromatograYa* de* gases* porque* las* moléculas* de* gas* se* difunden* a* velocidades* relaCvamente* altas.* El* fenómeno*Cene*poca*importancia*en*la*cromatograYa*de*líquidos*porque* las*velocidades*de*difusión*son*mucho*menores.*La*magnitud*del*término* B' en* la* ecuación* anterior* está* determinada* en* gran* medida* por* el* coeficiente*de*difusión*DM*del*analito*en*la*fase*móvil,*y*es*directamente* proporcional*a*esta*constante.**

tención y selectividad (sección 26B).

Resolución'de'la'columna'*

6D.1 Resolución de la columna

a resolución Rs de una columna señala qué tan seLa*resolución'Rs*de*una*columna*señala*qué*tan*separadas*están* radas •  están dos bandas en relación con sus anchos. dos*bandas*en*relación*con*sus*anchos.*La*resolución*proporciona* a resolución proporciona una medida cuantitativa una*medida*cuanCtaCva*de*la*capacidad*de*la*columna*para* la capacidad de la columna para separar dos anaSKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 776 separar*dos*analitos.*La*importancia*de*este*término*se*ilustra*en* os. La importancia de este término se ilustra en la ura 26.12,la*figura*,*que*está*formada*por*cromatogramas*de*las*especies*A* que está formada por cromatogramas de 776 Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográficas s especiesy*B*en*tres*columnas*con*diferentes*poderes*de*resolución.*La* A y B en tres columnas con diferentes resolución*de*cada*columna*se*define*como** deres de resolución. La resolución de cada columna define como A B WA WB # 2 2

!

2¢Z WA # WB

0 SKOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 776 A

FIGURA 26.12 Separación a tres valores de

resolución distintos: R ! 2≤Z/(W # W ). Las alturas 2 3 1tR 2 B " 1tR 2 Ase 4han ajustado para que sean de los picos ! (26.24) aproximadamente iguales en todos los casos. WA # WB s

A

B

nde todos los términos del segundo miembro se deen endonde* la figura. todos* los* términos* del* segundo* miembro*se*definen*en*la*figura.*

Clase interactiva: aprenda más acerca de la resolución de las columnas. Resulta evidente a partir de la figura 26.12 que una resolución de 1.5 permite una separación esencialmente completa de A y B, y que no es así con una resolu-

B Rs = 1.0

0

776

Capítulo 26 Introducción a las separaciones cromatográficas

(tR)B (tR)A

tM 0

0

∆Z

Rs = 1.5

A

WA/2 WA Tiempo, min

B

WB/2

0

WB

Señal del detector

¢Z

Señal del detector

Rs !

Rs = 0.75

FIGURA 26.12 Separación a tres valores de 0 resolución Rs ! 2≤Z/(W WBtérminos ). Las alturas A #en Se despejadistintos: W de la ecuación 26.21 de (tR)B de ajustado que sean y Nlosy picos luegosesehan sustituye lapara expresión resultante en la aproximadamente iguales en todos los casos.

ecuación anterior para obtener

Resolución'de'la'columna'* •  Resulta*evidente*a*parCr*de*la*figura**que*una* resolución*de*1.5*permite*una*separación*esencialmenT* te*completa*de*A*y*B,*y*que*no*es*así*con*una*resoluT* ción*de*0.75.*Con*una*resolución*de*1.0,*la*zona*de*A* conCene*alrededor*de*4%*de*B,*y*la*zona*de*B*conT* Cene*una*canCdad*similar*de*A.*Con*una*resolución*de* 1.5,*el*traslape*es*del*orden*de*0.3%.*Para*una*fase*esT* tacionaria*dada,*la*resolución*puede*mejorar*si*se*alarT* ga*la*columna,*lo*que*aumenta*el*número*de*platos.* Sin*embargo,*la*adición*de*platos*teóricos*aumenta*el* Cempo*que*se*requiere*para*separar*los*componentes.**

KOOG_CAP_26_4tas 3/25/08 9:52 AM Page 777

Influencia'de'los'factores'de'retención'y' selecBvidad'en'la'resolución'*

26D Me

•  Es* conveniente* desarrollar* una* ecuación* matemáCca* que* relacione* la* resolución* de* una* columna* con* los* solutos cuyas constanteskde distribución son tan simifactores* de* retención* A' y* kB' de* dos* solutos,* el* factor* EJEMPLO lares que hacen difícil separarlas. Por consiguiente, de* AB* selecCvidad* α,* y* el* número* de* platos* N' que* cuando KA ! KB, se deduce a partir de la ecuación 26.9 Las sustancia forman*la*columna.*Se*supondrá * que*se*está*tratando* que kA ! kB ! k y a partir de la ecuación 26.13, a S 1. 16.40 y de 17 con*dos*solutos*A*y*B*cuyos*Cempos*de*retención*son* Con estas aproximaciones, las ecuaciones 26.25 y 26.26 lumna de 30. suficientemente*próximos*como*para*establecer*que** se reducen a por la colum Rs !

1N k b 1a " 12 a 4 1#k

2 2 1 1 # k N ! 16R2s a b a b a"1 k

donde k esdonde*k*es*el*promedio*de*k el promedio de kA y kB. y*k . A* B *

(26.27) (26.28)

(en la base) p tivamente. C número de p de plato; d) conseguir un rio para que un valor de R para obtener

• 

N ción está determinado por la velocidad nB del soluto d) k que se mueve con más lentitud, L según la ecuación 26.4. L nB ! Efecto'de'la'resolución'en'el'Bempo'de'retención'* Es decir, H ! c) to! 1tR 2 B N di L d) k y a no Al combinar esta expresión con la 26.10 y la 26.16 y nB ! tonces,laa 1t 2 Antes*de*considerar*con*detalle*la*importancia*de*las* R B después de reordenar se obtiene dividiend cuatro*ecuaciones*apenas*deducidas,*vale*la*pena*formular* Al combinar esta expresión con la 26.10 y la 26.16 y la otra se una*ecuación*para*una*caracterísCca*relacionada*con*el* 2 NH11 # k B después de reordenar se obtiene

1tR 2 B ! rendimiento*de*la*columna,*a*saber,*el*Cempo*necesario* u para*completar*la*separación*de*los*solutos*A*y*B.*En* NH11 # kB 2 do 1tR 2 B ! cromatograYa,*el*objeCvo*es*obteT*ner*la*más*alta* m u donde (tR)B es el tiempo necesario para que salga de la donde lo resolución*en*el*menor*Cempo*posible.*Por*desgracia,*estas* se columna el pico de B necesario cuando lapara velocidad de la fase mente, a donde (t ) es el tiempo que salga de la R B dos*metas*son*incompaCbles,*por*lo*que*se*debe*buscar*un* y móvil es u. Cuando esta ecuación se combina con la se sustitu columna el pico de B cuando la velocidad de la fase término*medio*entre*las*dos** 26.26 y se reordena, se tiene móvil es u. Cuando esta ecuación se combina con la 26.26 y se reordena, se tiene

y (Rs)2 se

1.0 1.

2 11 # k 2 3 16R2s H a B 3 1tR 2 B ! 16R2s H a a (26.29) 2b 11 # k 2 2 B u a a "b1 1kB 2 (26.29) 1tR 2 B !

u

a"1

1kB 2 2

Puesto que H es una función de u y a es una función de Puesto que H es una función de u y a es una función de k, dicha ecuación es difícil de resolver y usar, excepto k, dicha ecuación es difícil de resolver y usar, excepto cuando hacencomparaciones comparaciones varios cuando se se hacen en en las las queque varios de de los sepueden puedenanular anular cociente. losfactores factores se enen un un cociente.

N Pero

Pe

L L ! NH

Ejercicio* •  Las* sustancias* A* y* B* Cenen* Cempos* de* retención* de* 16.40* y* de* 17.63* minutos,* respecCvamente,*en*una*columna*de*30.0*cm.* Una* especie* que* no* es* retenida* pasa* por* la* columna* en* 1.30* minutos.* Las* anchuras* de* pico* (en* la* base)* para* A* y* B* son* 1.11* y* 1.21* minutos,* respecCvamente.* Calcule* a)* la* resolución* de* la* columna;* b)* el* número* de* platos*promedio*de*la*columna;*c)*la*altura*de* plato**

ncia de la pena ca relasaber, el n de los es obteposible. bles, por las dos. separael soluto ón 26.4.

conseguir una resolución de 1.5; e) el tiempo necesario para que la sustancia B eluya en la columna que da un valor de Rs de 1.5 y f ) la altura de plato necesaria para obtener una resolución de 1.5 mediante la columna original de 30.0 cm y en el tiempo que se da en un principio.

solución*

Solución

a) Por medio de la ecuación 26.24 se tiene que Rs !

2117.63 " 16.402 1.11 # 1.21

! 1.06

b) La ecuación 26.21 permite el cálculo de N: 16.40 2 17.63 2 N ! 16 a b ! 3493 and b ! 3397 y N ! 16 a 1.11 1.21

3493 # 3397 Nprom ! 3445 Nav ! 2

L 30.0 ! ! 8.7 $ 10"3 cm N 3445 d) k y a no cambian mucho al aumentar N y L. Entonces, al sustituir N1 y N2 en la ecuación 26.25 y c) H !

4. Parámetros fundamentales

Factor de resolución (Rs)

Δ Rs= wb,At + wb,B 2

constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos compuestos y se calcula como el cociente entre la distancia de los máximos de los dos picos adyacentes y el valor medio de las anchuras de los picos en la base Fig.1

Rs ≥ 1,5: separación ideal 1,5 > Rs > 1: separación aceptable Rs < 1: separación inaceptable 43

5. Aplicaciones de la cromatografía

ANÁLISIS CUALITATIVO

Señal analítica

Disolución estándar F1

CH4

Octano

Nonano

Decano

Tiempo

Señal analítica

Muestra

CH4

La muestra no contiene metano ni octano. Si los contiene será a concentraciones inferiores a los correspondientes límites de detección

Octano ¿Nonano? ¿Decano?

Tiempo

Identificación positiva: - Comparación de datos de retención - Uso de detectores en línea

45

5. Aplicaciones de la cromatografía

ANÁLISIS CUANTITATIVO

Señal analítica

Área Altura, h

Fig.1 tm

tr

Tiempo

MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO 1. Calibración con patrones 0,4

Obtención de sus cromatogramas

Área de pico, s

Preparación de disoluciones patrón

0,3

0,2

0,1

0,0 0

5

10

15

20

25

Concentración, ng ml-1

30

46

TERMINOLOGÍA • FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico) componente estático de la cromatografía • FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar • ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos • ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

TERMINOLOGÍA • CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución. Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el eluído de una columna • VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a través de la columna hasta que sale cada soluto • VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN

Cromatografía en capa fina o laminar (TLC) Revelación •Directa (por compuestos colorados) •Absorbimiento UV (254 , 366 nm) •Fluorescencia •Oxidación a presión (Ce IV; Cr VI acido sullfúrico) •Vapores de yodo •Reactivos específicos cromogénicos (es. ninidrina )

TLC bidimensional

Fronte del solvente

Eluente 1 1) Rotazione 90° 2) Eluente 2

TLC preparativa

placas 20x20 cm; espesor adsorbente 0.5, 1.0, 2.0 mm. Revelación no destructiva Recuperación de composti separados

CROMATOGRAFÍA'EN'PLACA'FINA'* Fundamento'*

La* cromatograYa* en* capa* fina* (en* inglés* thin* layer* chromatography* o* TLC)* es* una* técnica* analíCca* rápida* y* sencilla,* muy* uClizada* en* un* laboratorio*de*Química*Orgánica.** Entre*otras*cosas*permite:** T* Determinar* el* grado* de* pureza* de* un* compuesto.* Se* puede* determinar* así,* por* ejemplo,* la* efecCvidad* de* una* etapa* de* purificación.** T*Comparar*muestras.*Si*dos*muestras*corren*igual*en*placa*podrían*ser* idénCcas.*Si,*por*el*contrario,*corren*disCnto*entonces*no*son*la*misma* sustancia.** T* Realizar* el* seguimiento* de* una* reacción.* Es* posible* estudiar* cómo* desaparecen*los*reacCvos*y*cómo*aparecen*los*productos*finales*o,*lo* que*es*lo*mismo,*saber*cuándo*la*reacción*ha*acabado.**

CROMATOGRAFÍA'EN'PLACA'FINA'* •  La* muestra* a* analizar* se* deposita* cerca* de* un* extremo* de* una* lámina* de* plásCco* o* aluminio* que* previamente* ha* sido* recubierta* de* una* fina* capa*de*adsorbente*(fase*estacionaria).*Entonces,* la* lámina* se* coloca* en* una* cubeta* cerrada* que* conCene* uno* o* varios* disolventes* mezclados* (eluyente* o* fase* móvil).* A* medida* que* la* mezcla* de* disolventes* asciende* por* capilaridad* a* través* del*adsorbente,*se*produce*un*reparto*diferencial* de*los*productos*presentes*en*la*muestra*entre*el* disolvente*y*el*adsorbente.**

Adsorbentes'y'eluyentes'* •  Los*dos*adsorbentes*(fase*estacionaria)*más*ampliamente*uClizados* son* la* gel* de* sílice* (SiO2)* y* la* alúmina* (Al2O3),* ambas* de* carácter* polar.*La*alúmina*anhidra*es*el*más*acCvo*de*los*dos,*es*decir,*es*el* que* reCene* con* más* fuerza* a* los* compuestos;* por* ello* se* uCliza* para* separar* compuestos* relaCvamente* apolares* (hidrocarburos,* haluros*de*alquilo,*éteres,*aldehídos*y*cetonas).*El*gel*de*sílice,*por* el* contrario,* se* uCliza* para* separar* sustancias* más* polares* (alcoholes,*aminas,*ácidos*carboxílicos).*El*proceso*de*adsorción*se* debe* a* interacciones* intermoleculares* de* Cpo* dipoloTdipolo* o* enlaces*de*hidrógeno*entre*el*soluto*y*el*adsorbente.*El*adsorbente* debe* ser* inerte* con* las* sustancias* a* analizar* y* no* actuar* como* catalizador*en*reacciones*de*descomposición.**

Adsorbentes'y'eluyentes'* •  El* adsorbente* interacciona* con* las* sustancias* mediante* interacción* dipoloTdipolo* o* mediante* enlace* de* hidrógeno* si* lo*presentan**

Adsorbentes'y'eluyentes'* •  El*orden*de*elución*de*un*compuesto*se*incrementa*al*aumentar*la* polaridad*de*la*fase*móvil*o*eluyente.*Este*puede*ser*un*disolvente* único*o*dos*miscibles*de*disCnta*polaridad.*En*el*siguiente*recuadro* se* recoge* por* orden* creciente* de* fuerza* eluyente* los* disolventes* más*comúnmente*empleados.** Hexano*