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CRECIMIENTO Y REPRODUCCION DE LOS MICROORGANISMOS. Cuando las bacterias se inoculan en un medio apropiado y se incuban en las debidas condiciones, se verifica un enorme incremento de su número en un tiempo relativamente corto. Algunas especies alcanzan el máximo de población dentro de las 24 horas, aunque otras requieren un período mucho más largo de incubación. El término crecimiento, aplicado a las bacterias y otros microorganismos se refiere comúnmente a la variaciones en la producción total de células, y no a los cambios que experimentan los organismos individuales. Los más frecuente es que el material de inoculación contenga miles de organismos; de modo que por crecimiento se entiende el aumento del número de células sobre el que contenía el material original de siembra. REPRODUCCION. PROCESOS REPRODUCTORES. La modalidad más común y sin duda la más importante desde el punto de vista del ciclo normal de crecimiento en las poblaciones bacterianas, es la que se conoce como fisión binaria o fisión transversal. El resultado de este proceso reproductor es que la célula individual se divide en dos, después de formarse un tabique transversal que separa los contenidos celulares. Este es un proceso de reproducción asexual. La germinación de las endosporas bacterianas produciendo células vegetativas no es una modalidad de reproducción en el sentido de multiplicación. Cada espora da origen a una célula, de modo que este proceso no supone aumento de la población total.

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO. La modalidad predominante de reproducción bacteriana es, la fisión binaria: una célula se divide dando origen a dos nuevas células. Tomando como punto de partida una sola bacteria, el incremento de la población se hace en progresión geométrica 1 - 2 - 4 - 8 - 16 - 32, etc. El tiempo que se requiere para que la célula se divida o sea, para que la población se duplique, se denomina tiempo de generación. No todas las bacterias tienen el mismo tiempo de generación; para algunas como Escherichia coli, es de 15 a 20 minutos, para otras puede ser de varias horas. Tampoco es igual el tiempo de generación para una bacteria determinada en todas las condiciones. La cantidad y la calidad de los elementos nutritivos disponibles en el medio y las condiciones físicas ambientales predominantes dan lugar a variaciones en el tiempo de generación. Microorganismo

Bacillus subtilis Clostridium botulinum Escherichia coli Shigella dysenteriae Pseudomona aureaginosa Mycobacterium tuberculosis Salmonella typhimirium Staphylococcus aureus

Medio

Temperatura (C)

Medio complejo Caldo glucosa Caldo Leche Caldo lactosa

36 37 37 37 37

Tiempo de generación (min) 35 35 17 23 34

Medio sintético

37

792

Caldo soya tripticaseína Caldo glucosa

37 32

24 32

Cuando el desarrollo del proceso de reproducción es uniformemente constante, puede determinarse matemáticamente el tiempo de generación y el número de generaciones, y en otros aspectos, analizar cuantitativamente el incremento del crecimiento. El procedimiento que se emplea con más frecuencia es inocular el medio con un número conocido de células, dejar que las bacterias crezcan en condiciones óptimas, y después, determinar la población final. Los datos experimentales necesarios para calcular el tiempo de generación son:

1. número de bacterias presentes al comienzo del experimento. 2. número de bacterias presentes al final de un intervalo de tiempo y 3. el intervalo de tiempo. El tiempo de generación de una población bacteriana puede ser expresado matemáticamente como sigue: g = t - to / (log 2 N - log No) donde g es el tiempo de generación y N y No representan la concentración de células a los tiempos t y to , respectivamente. En microbiología, las poblaciones son generalmente graficadas como logaritmos de base 10. La conversión de la ecuación a logaritmos de base 10 da como resultado la siguiente ecuación: g = 0.301 (t - to) / (log 10 N - log 10 No) Usando esta ecuación, el tiempo de generación de un cultivo puede ser determinado si se conoce la concentración de células del cultivo a dos diferentes tiempos de incubación. Por ejemplo, el tiempo de generación de un cultivo conteniendo 103 células/ml en el tiempo to y 107 células/ ml 7 horas mas tarde podría ser calculado como sigue: g = 0.301 (t - to) / (log 10 N - log 10 No) g = 0.301 (7 - 0) /(log 10 107- log 10 103) g = 0.301 (7) / (7 - 3) g = 2.107 / (7 - 3) g = 2.107 / 4 g = 0.527 horas, ó 31.6 minutos Debido a que las bacterias crecen exponencialmente (al menos para una parte de su crecimiento), las curvas de crecimiento bacteriano son graficadas en papel semilogarítmico (logaritmo del número de masa de bacteria contra tiempo) en lugar de una escala aritmética.

CURVA DE CRECIMIENTO DE LA POBLACION BACTERIANA. Cuando después de inocular un medio nuevo con un número determinado de células, se determina la población bacteriana intermitentemente durante el período de incubación de 24 horas (más o menos) y se presente en una gráfica de correlación de los logaritmos de los números de células en función del tiempo, se obtiene una curva como se muestra a continuación:

En esta puede apreciarse que existe una período inicial en el que parece no haber crecimiento, seguido de un crecimiento rápido, después una nivelación o estacionamiento y, finalmente, un descenso de la población viable. Entre cada una de estas fases existe un periódo de transición (parte curva). 1. Fase retardada o fase lag. La adición del material de inoculación a un medio nuevo no va seguida de la duplicación inmediata de la población conforme al tiempo de generación. En vez de esto, la población permanece sin cambio durante algún tiempo, Pero ello no significa que las células se encuentren en estado latente o de reposo; por el contrario, durante este período, las células individuales aumentan su tamaño sobre las dimensiones normales. Fisiológicamente, son muy activas, y sintetizan nuevo protoplasma. Las bacterias en el nuevo medio pueden ser deficitarias en enzimas o coenzimas, que han de sintetizar en primer lugar en las cantidades necesarias para el funcionamiento óptimo del mecanismo químico de la célula. Cada célula exige cierto tiempo de ajuste al ambiente físico circundante. Los organismos metabolizan, pero existe un retardo en la división celular. Al final de la fase lag, cada organismo se divide. Sin embargo, como no todos los organismos completan el período lag

simultáneamente, durante este período el incremento de población es gradual, hasta que, al final, todas las células son capaces de dividirse a intervalos regulares. 2. Fase logarítmica o exponencial. Durante este período las células se dividen con regularidad, según un régimen determinado por el tiempo de generación de cada bacteria en particular. En esta fase y en condiciones apropiadas, la velocidad de crecimiento es máxima. Durante la fase log, la población total es casi uniforme, en lo que se refiere a la composición química de las células, actividad metabólica y otros caracteres fisiológicos. 3. Fase estacionaria. La fase logarítmica del crecimiento comienza a decaer después de algunas horas, también en forma gradual, lo que se refleja en la representación gráfica por una curva de transición entre dos líneas rectas, la segunda de las cuales, es la fase estacionaria. Esta tendencia a la suspensión del crecimiento puede atribuirse a varias causas, entre ellas el agotamiento de algunos nutrimentos y, con menos frecuencia, la producción de sustancias tóxicas durante el crecimiento. La población permanece constante por algún tiempo, quizá como consecuencia de la interrupción completa de la división o del equilibrio entre las reproducciones y una proporción equivalente de mortalidad. 4. Fase descedente o de mortalidad. Después del período estacionario, las bacterias mueren a una velocidad superior a la de producción de nuevas células, dando por supuesto que todavía se reproduzcan algunas de ellas. La causa efectiva de muerte durante esta fase de cultivo depende de muchas circunstancias, y varía en cada tipo bacteriano. En general, el agotamiento de elemento nutritivos esenciales y/o la acumulación de productos (por ejemplo, ácidos) en una concentración inhibidora, son suficientes para explicar esta evolución. La transición inmediata de la fase estacionaria a la coyuntura de disminución de la población va seguida, en algunos casos, de una proporción de mortalidad que es la inversa logarítmica de la fase log. Este grado de mortalidad puede continuar durante varios días, o bien todas las células pueden morir en 2 ó 3 días, según las especies bacterianas. Algunas especies de cocos gram-negativos mueren rápidamente, en 72 horas o menos, mientras que en otros tipos de bacterias pueden persistir algunos organismos viables durante meses y aun años.

Las bacterias se pueden mantener en la fase exponencial en una curva de crecimiento a través del uso de cultivos continuos. En ellos, el volumen del cultivo y la tasa de crecimiento son mantenidos a un nivel constante por la adición de medio fresco y la remoción de una cantidad equivalente de medio utililizado y células viejas. Para conocer el número de bacterias viables en una suspensión, se utiliza el recuento en placa. La técnica involucra el crecimiento de bacterias de una suspensión, en placas de agar, la formación de colonias de células, las cuales son fácilmente vistas por el ojo humano. Las colonias que aparecen en el medio son enumeradas para determinar el número de células original en la suspensión. Algunos problemas se encuentran a menudo con bacterias que crecen en cadenas o filamentos, tales como los bacilos. Cuando éstas células no se separan, la formación de menos colonias que el número actual de células resulta erróneo. Por tal motivo, los conteos resultantes son expresados generalmente como unidades formadoras de colonia (UFC) / ml de suspensión, en lugar de células / ml. Dado que el número de bacterias en una suspensión fácilmente alcanzan 109 células/ml, es necesario hacer diluciones de la suspensión original antes de poner las bacterias en las placas de agar para reducir suficientemente el número de células por ml para poder llevar a cabo el conteo, y que las placas no estén muy esparcidas, o muy amontonadas. Idealmente, las diluciones del cultivo dan como resultado que el crecimiento en las placas de agar caiga entre 30 -300 colonias. El crecimiento inferior a 30 colonias no tiene validez estadística y en un crecimiento superior a 300 colonias pueden causar interferencia las células que estén juntas y las colonias durante el crecimiento. La dilución de bacterias de una suspensión se debe desarrollar empleando la técnica aséptica, utilizando diluyentes de agua, o soluciones salinas, dependiendo de la bacteria.

En el ejemplo que se muestra, las bacterias de una suspensión celular son diluídas en 9 ml de agua peptonada, y 0,1 ml de cada dilución es vertido en la placa de agar nutritivo. Después de incubar, solamente las placas de agar preparadas de la dilución del tubo 4 tiene entre 30 y 300 colonias. Las 35 colonias en la placa de agar representan el número de bacterias en 0,1 ml de este tubo de dilución. Así el tubo 4 contiene 350 UFC/ml (35 UFC X 0.1 ml X 10) = 350 UFC/ml, y al multiplicar ese resultado por el inverso de la dilución, esto es, 104, esto da como resultado, 3 500,000 UFC/ml o lo que es lo mismo que 3.5 X 106 UFC/ml, lo cual es el número de células que contiene la suspensión original.