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INSTITUTO TECNOLOGICO DE COLIMA

INGENIERIA AMBIENTAL CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION MICROBIANA: AISLAMIENTO, PURIFICACION, CLASIFICACION, IDENTIFICACION Y CONSERVACION.

Presentan: RAUL AYALA DE LA MORA DZOARA SAMANTHA BELLO MORALES EDITH ELIZABETH ROLON RICARDO LUIS FELIPE VENTURA MENDEZ

Materia: MICROBIOLOGIA

Maestro: Dr. FRANCISCO JAVIER DELGADO VIRGEN

Fecha: Villa de Álvarez, Col., a 28 de Febrero del 2013.

INTRODUCCION Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un organismo. La identificación de un MO es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de MO y del fin que se persigue en la identificación. Los pasos a seguir para una perfecta identificación bacteriana son: o

Obtener un cultivo puro

o

Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

o

Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados

en

el

aislamiento

y

cultivo

anteriores);

fotoautótrofos,

fotoheterótrofos,

quimioautótrofos, quimioheterótrofos. o

Realización de pruebas primarias (Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.

o

Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina de aminasa, etc.) .

MÉTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLÓGICOS: Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas a clasificar organismos. Bajo el microscopio pueden ser tan parecidos dificultándose su clasificación, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana.También se pueden identificar a través, de las características macroscópicas, en función del tamaño, altura de la colonia, forma, color, olor, textura y grado de adherencia al medio de cultivo. MÉTODOS BASADOS EN TINCIÓN DIFERENCIAL: Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción. Estos criterios morfológicos encabezan la primera etapa del proceso de identificación la mayor parte de la bacterias teñidas con Gram se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas.

MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS: Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. DESARROLLO 

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

AISLAMIENTO.-Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio de cultivo sólido adecuado

dispuesta

en

una

placa

de

Petri.

Para ello se toma una pequeña cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las células bacterianas. Tras la incubación en condiciones adecuadas, cada célula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas características determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc... Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie. La identificación bacteriana y la caracterización completa solo son posibles tras el aislamiento de la bacteria y la obtención de cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes (en una muestra patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.

TECNICAS DE SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA 1. Prende el mechero Fisher para crear un área estéril y así evitar que se contamine los medios de cultivo. Coloca las placas en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. 2. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 3.

Ahora, toma una placa con agar estéril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.

4.

Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías que no toque la primera.

5.

Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4. No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar.

6.

Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. SEMBRADO POR ESTRÍAS EN TUBO INCLINADO 1. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.

Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular y flamea la boca del tubo.

3. Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el área del fondo del agar realiza una estría hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4. Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapón de algodón bien firme. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 5.

Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.

SEMBRADO POR AGITACIÓN EN CALDO 1. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.

2. Ahora toma el tubo con el caldo estéril y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3. Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitación dentro del caldo, siembra el inóculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4. Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. SEMBRADO EN PICADURA EN TUBO VERTICAL 1. Esteriliza el filamento de la aguja de inoculación y toma la parte de la caja depetri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera quese enfríe la aguja de inoculación y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.

Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo.

3. Introduce la aguja con el inóculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculación en la misma dirección de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4. Lleva a incubar y observa las características del desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. Se ha desarrollado una serie de técnicas microbiológicas para aislar microorganismos y obtener cultivos puros, ellos son: •

Siembra en placas de Petri por rayado

•

Siembra en placa vertida

•

Disoluciones en serie.

LA SIEMBRA EN PLACAS DE PETRI POR RAYADO Esta técnica se basa en la separación de los microorganismos al dispersar por rayado sobre agar una muestra que los contiene. Para llevar acabo la disgregación, se recoge una porción de la muestra con un asa bacteriológica y se raya sobre una sección de una placa de Petri; Luego se repite el rayado en tres secciones más de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la sección anterior, por lo que se logra una disminución gradual en la cantidad de microorganismos. Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo recomendados; al crecer, formaran colonias separadas unas de otras en algunas de las secciones del rayado. En este paso cada punto

representa una colonia. Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos. LA SIEMBRA EN PLACA VERTIDA. En esta técnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una concentración diferente, y se valúa el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada. Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas disoluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido. Luego, se vierte la mezcla homogéneamente el contenido (el agar y el inóculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri. Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilución en la que se haya obtenido una mayor separación de las colonias. Por ultimo, de esta dilución, se toma una muestra de una de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo está puro. La confirmación de pureza se puede realizar por observación a simple vista (colonias de igual morfología), por observación microscópica o mediante pruebas bioquímicas. DILUCIONES EN SERIE. Esta técnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de interés se encuentra en mayor cantidad que los demás. Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este microorganismo; así, se logra que en alguna de las diluciones solo él aparezca. Es necesario confirmar su presencia, utilizando el método de siembra en placa de Petri por rayado.

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO. En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes en pequeña cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en cantidades mucho mayores. Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal. El medio (medio de enriquecimiento) para un cultivo de enriquecimiento suele ser liquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de un microbio particular pero no de otros. En este sentido también es un medio selectivo pero esta destinado a aumentar las cantidades muy pequeñas del microorganismo deseado hasta niveles detectables. Supóngase que se desea aislar de una muestra de suelo un microorganismo que puede crecer en presencia de fenol y que se encuentra presente en cantidades mucho más pequeñas que otras especies. Si la muestra del suelo se coloca en un medio de enriquecimiento liquido en el que el fenol es la única fuente de carbono y energía, los microorganismos que no puedan metabolizar el fenol no se desarrollaran. El medio de cultivo se incuba durante algunos días y luego se transfiere una alícuota pequeña a otro recipiente con el mismo medio. Tras una serie de pasajes la población sobreviviente estará constituida por bacterias capases de metabolizar el fenol. Entre estos pasajes se deja transcurrir cierto tiempo para que las bacterias se desarrollen en el medio; este es el estadio de enriquecimiento. Los nutrientes del inoculo original se diluyen rápidamente con los sucesivos pasajes. Cuando la última dilución se siembre en un medio solido de la misma composición solo se desarrollaran colonias de microorganismos capaces de utilizar el fenol. Un aspecto destacable de esta técnica particular es que el fenol resulta letal para la mayoría de las bacterias. AISLAMIENTO DE HONGOS La siembra se realiza con el fin de aislar o repicar los hongos para su uso inmediato o para mantenerlos viables por un tiempo corto. La siembra o aislamiento en cultivo puro consiste en dejar crecer el hongo elegido bajo condiciones en las que pueda desarrollar y esporular convenientemente. Para ello es necesario verter el medio de cultivo, dejarlo enfriar, acidificarlo –si fuera necesario– y colocar una pizca del hongo a sembrar. Se realiza por medio de una aguja o de un ansa, ya sea por un simple toque o por rayado continuo. Generalmente para la siembra se usan placas, tubos y frascos. Después de la siembra se sellan las placas, tubos y frascos, se coloca la fecha y se incuba durante el tiempo conveniente hasta que se vea que el hongo ha crecido y está esporulando. 

CLASIFICACION E IDENTIFICACION

TEMPERATURAS CARDINAES: para cada microorganismo existe una temperatura minima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una temperatura optima a la que se produce el crecimiento más rápido, y una temperatura máxima por encima de la cual no es posible el crecimiento. CLASIFICACION SEGÚN LA TEMPERATURA PSICROFILOS. Con temperaturas optimas bajas (menor a 15°).

MESOFILOS.- con temperaturas optimas moderadas (20°C a 40°C). Se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acuáticos y terrestres de latitudes templadas y tropicales. TERMOFILOS.- con altas temperaturas optimas (40°C a 70°C) HIPERTERMOFILAS. Con temperaturas optimas muy elevadas (mayores de 70°C). Son típicos de ambientes concretos extremadamente calientes como fuentes termales, géiser y fuentes hidrotermales submarinas. CLASIFICACION DEACUERDO A SU pH. ACIDOFILOS.- organismos que crecen mejor bajo pH (por debajo de 2). Ejemplo el Thiobacillus, sulfulobus, thermoplasma y ferroplasma. ALCALOFILOS.- presentan un pH óptimo de crecimiento muy elevado, a veces tan alto como pH 10. Se encuentran por lo general en hábitat muy básico como lagos sódicos y suelos muy carbonatados NEUTROFILOS.- microorganismos cuyo pH optimo para el crecimiento esta entres 6 y 8. CLASIFICACION DEACUERDO A SU CONCENTRACION DE AGUA. HALOFILOS.- los microorganismos marinos generalmente tienen una dependencia específica del ion sodio, además de tener un crecimiento optimo al valor de actividad de agua propia del agua de mar. El crecimiento de los halófilos requiere almenos algo de NaCl, pero el optimo varia con el organismo; asi, se usan los términos halófilos discretos (1-6%), y halófilos moderados (6- 15%) y los halófilos extremos (15-30%) IDENTIFICACION POR TINCIONES El método de GRAM es, sin duda, el más importante de estos métodos especiales de tinción. Se trata de un procedimiento de coloración diferencial, que tiñe unas bacterias de color purpura original, mientras otras toman el color del contracolorante, generalmente rosado. Las primeras se denominan Grampositivas, y las segundas Gram-negativas. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano Los colorantes son compuestos orgánicos y cada colorante empleado tiene una afinidad particular por sustancias celulares específicas. Por ejemplo, muchos de los colorantes comúnmente usados están cargados positivamente (Catiónicos) y se combinan fuertemente con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Como ejemplos de los

colorantes catiónicos tenemos el azul de metileno, el cristal violeta, y la safranina. Otros (por ejemplo, la eosina, la fucsina acida, el rojo congo) están cargados negativamente y se combinan con constituyentes cargados positivamente, como numerosas proteínas. Entre las sustancias empleadas para la tinción negativa tenemos la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbón coloidal) y nigrosina (colorante negro insoluble en agua). El procedimiento clásico de la coloración de Gram incluye la fijación del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por acción del alcohol. Luego de la fijación, el primer paso de la coloración de Gram es la aplicación del cristal violeta; a continuación se agrega como mordiente la solución de yodo de Gram que fija químicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloración permite distinguir los gérmenes Gram positivos de los Gram negativos. Es probable que por el mayor contenido en lípidos de las paredes celulares de las bacterias Gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Además, la presencia de un mayor número de residuos de ácido teicoíco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijación del cristal violeta. Los microorganismos Gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibióticos, envejecimiento o acción de enzimas auto líticas también permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloración. A esta altura de la coloración, los organismos Gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las Gram negativas permanecen sin teñir. El agregado de un colorante de contraste como safranina teñirá a estos microorganismos y células (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras también son Gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloración de Gram en forma variable. PROCEDIMIENTO PARA TINCIONES GRAM 1. Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solución salina fisiológica o una gota de agua. 2. Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solución salina del portaobjetos. También puede ser utilizada una aguja de inoculación estéril para tomar la muestra bacteriana. 3. Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasándolo de 4 a 5veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex).Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras. 4. También se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clínicas (exudados faríngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tinción. 5. Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua. 6. Aplicar el yodo Gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. 7. Ahora, decolorar con la solución de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague. 8. Finalmente cubrir el frotis con la solución de safranina y dejarla actuar durante1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire. 9. Coloca aceite de inmersión al frotis seco y teñido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X MORFOLOGIA BACTERIANA: A las bacterias de forma esférica u ovoide se les denomina cocos. A las bacterias con forma cilíndrica se les denomina bacilos. Algunos bacilos se curvan con forma de espiral, y se les llama entonces espirillos. Las células de muchos procariotas se mantienen juntas después de la división celular formando grupos, y estas asociaciones frecuentemente son características de diferentes organismos.

Por ejemplo: algunos cocos o bacilos pueden formar largas cadenas. En otras ocasiones, los cocos pueden formar finas capas de células, estructuras tridimensionales cubicas o agrupaciones irregulares. Varios grupos de bacterias pueden ser inmediatamente reconocidas, gracias a sus formas peculiares. Por ejemplo, las espiroquetas, que son bacterias con forma de sacacorchos, las bacterias con apéndices, que presentan protuberancias celulares en forma de largos tubos o tallos, o las bacterias filamentosas, que forman células largas y delgadas o cadenas de células. Según su forma, agrupamientos celulares, capacidad para formar esporas y reacción algunos colorantes especiales, se han dado a las bacterias más comunes nombres carentes de base científica. Se denominan cocos a todas las bacterias de forma redondeada; son casi invariables inmóviles y no esporulados. Con una sola excepción (mas adelante se mencionara) son todas GRAM-POSITIVOS, en cultivos jóvenes. Basándose en su agrupamiento celular se designan algunos cocos con nombres mas definidos. Diplococos: cocos Gram-positivos en forma de lanza, agrupados en parejas. Neisseria: cocos apareados, Gram-negativos en forma de habichuelas. Cuando los diplococos son Gram-positivos se reúnen en grupos, forman cadenas con los estreptococos, mientras que las Neisserias pueden formas paquetes pero nunca cadenas. Estreptococos: cocos en cadenas Tetracocos: cocos reunidos en cocos de cuatro elementos. Sarcinas: cocos en paquetes cúbicos regulares. Micrococos: cocos en masas racemosas irregulares. El termino estrafilococo es sinónimo. Espirilos bastoncillos espirales: son helicoidales y no ondulados. Son móviles pero carecen de esporas. Bacilos son bastoncillos rectos: Los bacilos pueden tener o no tener esporas y ser móviles o inmóviles. Los que forman esporas son generalmente Gram (+) en estado vegetativo. Las especies no esporuladas mas frecuentemente son bacilos Gram (-). Debido a la gran cantidad de variantes en este grupo, el termino bacilo debe siempre calificarse con adjetivos apropiados, por ejemplo; bacilo esporulado Gram (+); bacilo no esporulado Gram (-), inmóvil. Corinebacterias: bastoncillos Gram (+) con granulos o barras. Pertenecen a este grupo los bacilos diftericos, denominándose difteroides o pseudodiftericos, otros de morfología similar.

Todos estos microorganismo son inmóviles y carecen de endosporas, y se les incluye en este grupo, por que tienden a formas filamentos, y otros cuerpos, llamados conidias, semejantes a las esporas de los hongos tabicados. Sin embargo, los filamentos son mucho más finos que las hifas de los hongos, y los cuerpos esporuloides no son verdaderas esporas. Los tres tipos más importantes son: Actinomicetos: compuestos de filamentos finos ramificados que se fragmentan en bastoncillos cortos. Estreptomicetos: compuestos de filamentos finos ramificados provistos de cadenas conidias. Micobacterias: bastoncillos acido-resistentes. En este tipo es rara la formación de ramificaciones y conidias. Debido a la capsula cérea que envuelve a las células, estos microorganismo toman los colorantes con dificultad, pero una vez teñidos, no es fácil decolorarlos por tratamiento con ácidos. Espiroquetas: son formas espirales móviles que difieren de los espirilos por ser flexuosos, mas difícil de teñir y cultivar. Treponemas: son células enrolladas que forman espirales regulares.

TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO

MORFOLOGIA COLONIAL DE LAS BACTERIAS El crecimiento bacteriano en una superficie sólida presenta características de cultivo llamadas: morfología colonial. Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una sólo célula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genéticamente similares. Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfología colonial o características de cultivo: 1) Tamaño: medido en milímetros; menos de 1mm = puntiforme 2) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada 3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular, Concéntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado. 4) Propiedades ópticas: Opaca, Translúcida y Transparente y Brillante (mucoide). 5) Elevación: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada, Crateriforme. Colonias de bajo crecimiento. 6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide. 7) Pigmento: Hialino a colores blanquesinos, y de amarillos a rojos.

MORFOLOGIA DE HONGOS Los hongos pueden crecer como mohos o como levaduras. Algunas especies son dimórficas, es decir a temperatura de 37 °C (temperatura corporal) son capaces de crecer como levaduras, y a 25°C (temperatura ambiente) se desarrollan como mohos.

MOHOS Microscópicamente. Los mohos son organismos multicelulares, forman túbulos cilíndricos y ramificados denominados hifas, poseen un diámetro de 2 a 10 µm y crecen por extensión en longitud desde el extremo de un filamento, así se forma una masa de hifas entrelazadas denominada micelio. En algunas especies de hongos las hifas están divididas en células por tabiques o septos que se forman con intervalos regulares durante el crecimiento filamentoso; cada tabique posee un poro septal que permite la continuidad citoplasmática entre una célula y otra del filamento. Otros especies carecen de tabiques septales por lo que se denominan hongos cenocíticos. En estas condiciones las hifas que penetran en el sustrato cumplen funciones de sostén y de absorción de nutrientes por lo que se denominan hifas vegetativas o de sustrato. Los filamentos del micelio que se proyectan por encima de la superficie del sustrato hacia el aire, constituyen hifas aéreas o reproductoras ya que contienen las estructuras reproductoras del hongo llamadas conidias o esporas. Macroscópicamente. Los mohos se desarrollan en el laboratorio sobre la superficie de sustratos o medios de cultivo, formando colonias aéreas, de aspecto algodonoso, vellosas o pulvurulentas y de color variable. LEVADURAS Microscópicamente. Las levaduras son organismos unicelulares, de forma esférica o elipsoidal, y tamaño variable de 3 a 15 µm de diámetro. Macroscópicamente. Las levaduras crecen en los medios de cultivo sólidos formando colonias opacas, de aspecto pastoso, color cremoso aunque algunas especies son característicamente pigmentadas.

IDENIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS CATALASA

Prueba en portaobjetos: 1. Con una aguja de punción o un aplicador de madera con la punta aguzada transferir células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos. 2. Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución al 30%con agua destilada). Se recomienda no añadir el organismo al reactivo (invirtiendo el orden), especialmente si se utilizan agujas o asas que contienen hiero, ya que se pueden producir resultados falsos positivos. Prueba en tubos o placas de agar: 1. Diluir 1:10 el peróxido de hidrógeno al 30% en agua destilada para obtener una solución al 3%. 2.

Añadir unas gotas (aproximadamente 1 ml) del peróxido de hidrógeno al 3%directamente sobre la superficie del desarrollo de una placa o pico de agar.

INTERPRETACIÓN: La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reacción positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30segundos no se consideran una prueba positiva. COAGULASA Prueba en portaobjetos (coagulasa fija): 1. Coloca una gota de agua destilada o solución salina fisiológica estéril sobre un portaobjetos. 2. Emulsionar suavemente una suspensión del organismo en estudio en la gota de agua utilizando un asa o una varilla. 3. Coloca una gota del plasma junto a la gota de la suspensión bacteriana. Mezclarlas bien. 4. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. INTERPRETACIÓN: Una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20segundos por la aparición de un precipitado granular o la formación de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 o 3minutos. Esta prueba solo se considera presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de S. aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. Prueba en tubos (coagulasa libre): 1. Colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estéril. 2. Añadir 0.5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 horas en caldo del organismo por investigar (caldo BHI). 3. Mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.

4. Colocar el tubo en un baño de agua a 37°C. Observar la formación de un coagulo visible. INTERPRETACIÓN: La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. La reacción se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coagulo o gel permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positivas pueden producir un coagulo en 1 a4 horas; por lo tanto, se recomienda observar el tubo a intervalos de 30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba. Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas que disuelven el coagulo recién formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a intervalos frecuentes. Otras cepas de S. aureus pueden producir sólo suficiente coagulasa como para dar una reacción positiva tardía luego de 18 a 24horas de incubación; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas, deben observarse después de las 18 a 24 horas de incubación. INDOL Es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácidopirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente útil para diferenciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo Klebsiella- Enterobacter (la mayoría negativos).La prueba de indol está basada en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un medio rico en triptófano. En la práctica se emplean medios combinados tales como sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indol-nitrato. Prueba de Indol 1. Inocular caldo triptófano (u otro medio con indol) con el organismo en estudio e incubar a 3537°C. 2. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adición de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. INTERPRETACIÓN: El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo (o en la capa de cloroformo) segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva PRUEBA DEL ROJO DE METILO Es cuantitativa para la producción de ácido y requiere organismos positivos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa, por la vía de la fermentación ácida mixta. Dado que son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de ácidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la fase inicial de la incubación, sólo se

consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener este pH bajo luego de una incubación prolongada (48 a 72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. PRUEBA DEL CITRATO 1. Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estría en el pico de agar citrato de Simmons. Incubar a 35°C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACIÓN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. PRUEBA DE LACTOSA Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-). 

CONSERVACION

CONGELACION La congelación bacteriana es un método físico químico que permite conservar microorganismos viables por un tiempo sin sufrir cambios genotípicos. En este proceso se involucra el agua como microambiente y es ella la que cambia su estado de líquido a sólido; de otro lado, la bacteria inmersa en este medio debe adaptarse a las condiciones de este nuevo ambiente, transformar la velocidad de su metabolismo, conservar su viabilidad y evitar que los cristales de hielo formados por el cambio de temperatura del agua le ocasione algún daño.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas. Las células congeladas, preparadas adecuadamente pueden permanecer viables durante mucho tiempo (al menos varias décadas) Cuando se enfría rápidamente un alimento muchas de las bacterias mesófilas que normalmente resistirían la temperatura de refrigeración, mueren como consecuencia del «choque de frío». Esto es más frecuente en Gram-negativas que en Gram-positivas. La congelación detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son más sensibles que las bacterias y mueren. . Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes: 1. Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. 2. Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene poner las células a 37ºC. 3. Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de -195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de -140ºC. 4. Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

LIOFILIZACION Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muy cómodo. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que influyen en la congelación, a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación. Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son: 1.

Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.

2.

Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.

3.

Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de 50ºC.

4.

Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial.

5.

Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.

6.

Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.

CONSERVACION POR SUSPENSIÓN EN AGUA DESTILADA O EN AGUA DE MAR ESTERIL Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo, etc.

CONCLUSION Es frecuente encontrar que una técnica de preservación resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, eso dependerá de las características fenotípicas y genotipicas especiales que cada uno de ellos posee. A pesar de que cada MO en ocasiones suele parecerse ya sea, en forma, tamaño o tipo de tinción sabemos que a través de diferentes tipos de pruebas podemos identificarlos. Por otra parte gracias a la morfología de las colonias de bacterias se pueden conocer el tipo de bacterias que se están cultivado, ya que, todas son originadas de una sola célula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias. También podemos agregar que en cualquier tipo de ambiente se encuentran microorganismos con características especiales que solo ellos poseen, y dependiendo de la temperatura podemos determinar que MO puede tratarse. Otra cosa importante es que gracias a la conservación de los MO hoy en día podemos guardarlos por unos cuantos años, alargando así su tiempo de vida, sin afectar su estructura, ni sus características que lo definen. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos, ya que, como se menciono anteriormente todo dependerá de las características y propiedades que cada microorganismo posea.

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Michael T. Madigan, Jonh M. Martinko, Jack Parker (2004), Biología de los Microorganismos (10ª edición), España: Prentice-Hall.