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• Yelsin Denis Fabian Ambrosio

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Coloración HematoxilinaEosina

INTEGRANTES CORONADO CUSI STEFANIA FABIAN AMBROSIO YELSIN DAVILA DAVILA JORDAN EVANGELISTA REQUEJO CLAUDIA FRANCIA REYES YOLANDA GONZALES BARRON ROCIO

MATERIALES  LAMINA HISTOLOGICA EN BLANCO  BATERIA DE COLORACION H-E  BALSAMO DE CANADA  LAMINILLA CUBREOBJETOS  CAJA PORTALAMINA  LAPIZ CON BORRADOR  GUANTES QUIRURJICOS  PAPEL HIGIENICO  CRONOMETRO  CAMPO DE TRABAJO

En la batería de coloración H-E se pudo observar : • Se puede observar tres baterías la primera la cual estaba conformada por

LA SEGUNDA BATERIA ESTA CONFORMADA POR: HEMATOXILINA

A. CARBONATADA

EOSINA E

A. ACIDO A

La tercera batería esta conformada por: ALCOHOL 96 %

A. ABSOLUTO 2

A. ABSOLUTO 3

XILOL 1

Introducir las láminas portaobjetos en el xilol 1 durante 10 minutos

Introducir las láminas portaobjetos en el xilol 2 durante 10 minutos

Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 1

Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 2

Realizar 10 inmersiones en alcohol absoluto 3

AGUA DE CAÑO Lavar con agua corriente ( de caño)

COLORACIÓN Procedimiento en práctica

En este primer paso, procedemos a colorear como hematoxilina de Harris durante un tiempo de 15 minutos. Esta coloración va actuar a nivel nuclear.

Procedemos al lavado en agua corriente.

En la imagen observamos como se torna de un color entre morado y rosado aunque aún no muy notorio.

Como se visualiza en la imagen procedemos a introducir las muestras en agua carbonatada, nos aseguramos de que estén totalmente sumergidas, luego tomamos un tiempo de 3 minutos. Esta tiene la propiedad de intensificar el color ( auxocroma).

Procedemos a lavar una sola vez, a diferencia de la anterior ( 3 veces) , notamos que la coloración es más notoria, gracias a la propiedad ya mencionada.

Por último procedemos a sumergirlo completamente en eosina durante un tiempo de 3 minutos, la cual actúa como colorante citoplasmático de contraste o de fondo.

Finalizando lavamos en agua corriente tres veces hasta lograr quitar el colorante sobrante.

Podemos observar ya la muestra un poco más notoria, luego de ser introducida en las tres sustancias ya mencionadas.

DESHIDRATACIÓN Hacer 10 inmersiones con las laminas de porta objetos en el alcohol al 96%

DESHIDRATACIÓN Observamos que el colorante le falta intensificar la coloración y exceso

DIAFANIZACIÓN Introducir las laminas porta objeto en el XIOL 1 durante 5 minutos

DIAFANIZACIÓN Observamos que las estructuras están definidas y coloreas , el exceso del colorante esta desaparecido.

DIAFANIZACIÓN  Dejar secar para eliminar el exceso de xilol

Montaje: • Montar con bálsamo de Canadá:

• Luego con un lápiz que tenga borrador, presionamos sobre el cubreobjetos de adentro hacia afuera .

Secar: • Dejar la lámina histológica por 24 horas

La tinción hematoxilina y eosina es el método mas popular de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica. El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura,como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

La Eosina es un colorante ácido (predomina densidad de carga negativa), por lo cual se asocia y colorea a estructuras catiónicas del citoplasma y matriz extracelular, tales como: filamentos citoplasmáticos (como los de células musculares); membranas intracelulares; y fibras extracelulares (por sus aminoácidos básicos ionizados). La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante básico, por lo cual se asocia y colorea estructuras aniónicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o carboxilos ionizados): •Heterocromatina y nucléolos

•RNA ribosomal •Matriz extracelular (por los sulfato de los GAG)

RESULTADOS Núcleo celular: Azul Citoplasma: Rosa Musculatura: Rojo , rosa o fucsia Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado Fibrina: Rosa

Sangre: células sanguíneas Especie: humano (Homo sapiens; mamíferos) Técnica: Hematoxilina-eosina en frotis sanguíneo.

La Hematoxilina, es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum L., conocida también con el nombre de palo de Campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hemateína. Tal como se obtiene de la planta e incluso luego de sufrir el proceso de oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe combinarse con iones metálicos, especialmente las sales de hierro (III) o aluminio (II), que actúan como mordientes. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos.

La eosina Y (C20H8Br4O5, tetrabromofluoresceína, CI 45380, CI 45386), comúnmente conocida como eosina amarilla.

La eosina B (C20H8Br2N2O9, dibromodinitrofluoresceína, CI 45400), también conocida como eritrosina B azulada.

Estructura molecular del xilol

CARACTERÍSTICAS DE LA HEMATOXILINA De acuerdo al procedimiento de tinción puede ser progresiva (intensifica la coloración) y regresiva (eliminación del exceso) 

Se obtiene de forma natural (plantas)



Para ser un colorante maduro pasa por un proceso de oxidación



Utilización para coloración de muestras



Utilización para la industria textil



Presenta propiedades semejantes a las anilinas básicas



Es un colorante directo



Los agentes oxidantes naturales: el aire (varios meses de exposición)



Los agentes artificiales puede ser: oxido de mercurio, permanganato de potasio, bicromato de potasio, etc.



En las tinciones histológicas tiñe los componentes ácidos dando un color violeta

CARACTERISTICAS DE LA EOSINA

El nombre “Eosina” proviene de aurora (naranja). Presenta auto fluorescencia espontánea

Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas. Las eosinas son xantenos ácidos ó colorantes de ftaleína.

Las más comunes son:  Eosina amarilla, es la más usada.  Eosina B (azul).  Floxina.  Eritrocina (está halogenada con iodo en lugar de bromo).  Zafranina.  Rosa de Bengala. Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo).

CARACTERISTICAS DE LA EOSINA

 Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol. Se puede usar un acentuador del color (por ejem. ácido acético al 0.2 % ó ácido tánico). Da una buena coloración citoplasmática ó de fondo.

Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

CARACTERISTICAS DEL XILOL o XILENO Químicamente denominado dimetilbenceno, es un anillo de benceno con dos grupos metilo unidos a él, presentando tres isoformas, en las que la posición de los dos grupos metilo varia en el anillo de benceno.

El Xilol solo es soluble en alcohol al 100% Se utiliza también como solvente y diluyente. El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula. El líquido diafanizador de uso más frecuente es el xilol

CARACTERISTICAS DEL XILOL o XILENO La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los tejidos los vuelven transparentes. Es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este líquido más de 3 horas.

Se llama aclaración, ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios linfáticos, pues los hace demasiado quebradizos, para estos órganos es mejor utilizar cloroformo. Para el procesamiento de muestras, se sumergieron los tejidos en soluciones de xilol I y II durante 15 minutos cada una.

CARACTERISTICAS DEL METANOL

El metanol (estructura química CH3OH), es un líquido incoloro, volátil, inflamable, con olor leve a alcohol en estado puro. Se le emplea con frecuencia para fijar frotis desecados: SANGRE. MEDULA OSEA. GANGLIO. BAZO. LIQUIDOS DE PUNCION.

Altera morfológicamente a los lípidos.

Como fijador de emergencia vale, pero tiene grandes inconvenientes: no fija la cromatina, produce retracción, no tiene efecto mordiente y produce fenómenos de desplazamientos. (sustitución de hidratos de carbono).

CARACTERISTICA DE ETANOL Líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor agradable. Como fijador único utilizaremos alcohol a unas concentraciones entre el 70 y 90% y se obtiene cogiendo de 70−90 ml de alcohol puro y se lleva hasta 100 con agua destilada. La fijación mas potente va a corresponder a las soluciones más concentradas pero a altas concentraciones la capa externa del tejido se endurece en exceso, lo que impide la penetración del fijador a la parte interna de la pieza. El tiempo de fijación correspondiente a una pieza de 5mm de espesor es dos a cuatro horas renovando unas 3 veces el líquido. Es un fijador que preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas titulares, fija los pigmentos y se emplea en las extensiones citológicas

CARACTERISTICAS DEL ETANOL

Como altera escasamente la estructura antigénica de los tejidos es un buen agente fijador para inmunohistoquímica. Entre las ventajas del alcohol están:  Fijan y deshidratan al mismo tiempo Posee una gran velocidad de penetración Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno lo que unido a la anterior propiedad aporta extraordinariamente el tiempo de fijación es un notable agente bactericida y por tanto un buen conservante No fija adecuadamente la cromatina porque disuelve los ácidos nucleícos y además disuelve parcialmente los lípidos. Endurece y contrae excesivamente los tejidos. Prepara mas la tinción porque carece de efecto mordiente

A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua que extrae de los tejidos por lo cual pierde actividad progresivamente