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AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2016

TRANSFORMACION DE CLOROPLASTOS FERNANDO BRAVO ALMONACID

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

-

Sumario Estructura y genética del cloroplasto Ingeniería genética en cloroplastos - Métodos de transformación - Vectores - Sistemas de selección

Ejemplos de genes expresados en cloroplastos Otras aplicaciones de la transformación de cloroplastos Transformación de cloroplastos

Referencias

Estructura y genética del cloroplasto

Transformación de cloroplastos

La teoría de la endosimbiosis explica el origen de los plástidos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Endosimbiosis secundaria

Placida dendritica

Ciertos protistas, como Placida dendritica y Elysia chlorotica, capturan plástidos de las algas y los mantienen fotosintéticamente activos durante meses.

Elysia chlorotica

A partir de los proplástidos se diferencian plástidos con funciones específicas

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Estructura del cloroplasto

núcleo

Espacio apoplástico vacuola

cloroplasto

pared

citosol

Microscopía de una célula vegetal

Microscopía de un cloroplasto

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Los genomas plastídico y nuclear de Arabidopsis thaliana contienen genes de origen bacteriano

Las líneas en verde muestran las proteínas de origen procariota. Las líneas rojas muestran el destino de las proteínas codificada en el núcleo. Los números entre paréntesis en negro indican el número total de proteínas con un determinado destino y en verde las de origen procariota.

Transformación de cloroplastos

Tomado de: Leister, Trends in Genetics, 2003.

Las proteínas plastídicas se sintetizan en el propio plástido o son importadas desde el citoplasma

Transformación de cloroplastos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Mecanismos de importación de proteínas al cloroplasto

Una vez en el interior del cloroplasto, las proteínas pueden tener tres destinos diferentes: - Estroma - Membrana tilacoidea - Lumen

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Estructura del genoma plastídico • Es un genoma circular de ~120 a 160 Kb.

• Tiene alrededor de 150 genes codificados en ambas cadenas.

• Los genes pueden clasificarse en dos grupos: - Genes involucrados en la fotosíntesis

- Genes involucrados en los procesos de replicación, transcripción y traducción

• Posee genes organizados en operones.

Tomados de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Organización de los genomas plastídicos de distintas especies vegetales

Flujo de la información genética en el cloroplasto El genoma plastídico codifica mensajeros monocistrónicos o policistrónicos.

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Los genes platídicos son transcriptos por dos tipos de polimerasas: una monomérica codificada por el genoma nuclear, y una multimérica codificada por el genoma plastídico.

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Flujo de la información genética en el cloroplasto Los ARNm generados en el cloroplasto presentan estructura con forma de horquila en el extremo 3’.

En los ARNm del cloroplasto existen secuencias reconocidas por los ribosomas que favorecen la iniciación de la traducción; este reconocimiento depende de las secuencias que flanquean al sitio de reconocimiento

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

El flujo de la información genética es regulado a distintos niveles

Transformación de cloroplastos Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

El flujo de la información genética es regulado a distintos niveles

Regulación de la síntesis proteica en el cloroplasto

Transformación de cloroplastos Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Regulación de la síntesis proteica en el cloroplasto Ambiente reductor [ADP] baja

Ambiente oxidante [ADP] alta

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Ingeniería genética en cloroplastos

Transformación de cloroplastos

El genoma plastídico se puede transformar por recombinación homóloga

ADN pt Gen A

Gen B

Gen B

Gen C

aadA

Gen D

Gen C

Vector de transformación

ADN pt transformado Transformación de cloroplastos

Gen A

Gen B

aadA

Gen C

Gen D

Métodos de transformación: biobalística

Transformación de cloroplastos

Cañón génico comercial (izquierda) y detalles del dispositivo de impulsión de los microproyectiles (abajo)

Métodos de transformación: transformación de protoplastos

Transformación de cloroplastos

Se obtiene homoplastía por sucesivas rondas de regeneración en medio de selección

Transformación de cloroplastos Tomado de: Bock, JMB, 2001.

Heteroplastía a homoplastía

Transformación de cloroplastos

La homoplastía se obtiene por sucesivas rondas de regeneración en medio de selección Primera ronda de regeneración

Control de regeneración

Control de selección

Transformación

Segunda ronda de regeneración Planta transplastómica

Especies vegetales en que se logró la transformación de plástidos Especie

Explanto utilizado y Método de transformación

Agente de selección

Lechuga

Biobalística

Espectinomicina

Tomate

Biobalística

Espectinomicina

Plantas regeneradas mediante organogénesis a partir de hojas

Tabaco Papa

Petunia Álamo

Biobalística Biobalística Biobalística Biobalística

Plantas regeneradas mediante embriogénesis

Zanahoria

Suspensión celular Biobalística

Soja

Callos embriogénicos Biobalística

Algodón Arroz

Espectinomicina Espectinomicina Espectinomicina Espectinomicina Espectinomicina

Callos friables Biobalística

Kanamicina

Callos obtenidos a partir de semillas maduras Biobalística

Estreptomicina

Espectinomicina

Especies vegetales en que se logró la transformación de plástidos Especies

Método

Resultado

Arabidopsis

Biobalística

Homoplasmía

Zanahoria

Biobalística

Transitorio

Nicotiana plumbaginifolia

Protoplastos

Transitorio y homoplasmía

Tabaco (suspensión celular)

Biobalística

Transitorio

Caléndula

Biobalística

Transitorio

Papa

Biobalística

Transitorio y homoplasmía

Pimiento

Biobalística

Transitorio

Arroz

Biobalística

Heteroplasmía

Tomate

Biobalística

Homoplasmía

Tabaco (Petit Havana, Xanthi)

Biobalística y protoplastos

Homoplasmía

Nabo

Biobalística

Heteroplasmía Adaptado de: Maliga, Ann.Rev.Plant Biol., 2004.

Diseño de vectores para la transformación de cloroplastos

Vector de clonado procariota

Diseños opcionales:

Genes selectores usados en la transformación de plástidos

Genes selectores: betaína aldehido deshidrogenasa betaína aldehido a

Control

b

1o selección

BADH

c

2o selección

espectinomicina

glicinabetaína

d

f

e

Control

1o selección

2o selección

betaína aldehido

- La actividad enzimática de BADH es dosada por formación de NADH. - Y, D, M y O representan las hojas jóvenes, en desarrollo, maduras y viejas, respectivamente.

Tomados de: :Daniell et al., Curr. Genet., 2001.

Genes selectores: aminoglicósidofosfotransferasa (aphA-6)

Selección y análisis de plantas transplastómicas resistentes a kanamicina

100 75 50 Colonias derivadas de protoplastos en distintas concentraciones de kanamicina (mg/L) .

0

Transformación de cloroplastos

25

10

0

25

Selección no estricta (5 semanas de cultivo en kanamicina 25 mg/L).

Selección estricta (5 semanas de cultivo en kanamicina 50 mg/L).

Tomado de: Huang et al., Mol. Genet. Genomics, 2002.

- Kan

200

200

Control no transgénico

Control no transgénico

plCF637

plCF637

plCF6061 Explantos luego de 4 semanas de cultivo en distintas concentraciones de kanamicina (mg/L).

plCF599 Progenie T1 creciendo en ausencia o presencia de kanamicina (mg/L).

Selección fenotípica por restauración de la pigmentación y la fotosíntesis

Brote reconstituído (verde) obtenido de hoja de DrpoA bombardeada.

Planta mutante DrpoA empleada para transformación.

Estrategia: Transformación de cloroplastos

Reconstituir el fenotipo fotosintético en plantas mutantes deficientes en fotosíntesis (DpetA, Dycf3 y DrpoA) por transformación de cloroplastos (selección fenotípica).

Tomado de: Klaus et al., The Plant Journal, 2003.

Planta DrpoA reconstituída fenotípicamente normal.

Eliminación de genes selectores por recombinación

Deleciones observadas

P1

P1 y T1: secuencias cortas repetidas directas s1: selección con espectinomicina s2: selección con glufosinato

Transformación de cloroplastos

Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.

Eliminación de genes selectores mediante el sistema cre/loxP

replicación

+

recombinación

+ recombinación

asistida por Cre

Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.

Características comparadas de los sistemas de transformación nuclear y plastídica Genomas

Número de copias Niveles de expresión Genes y expresión Efectos de posición Silenciamiento génico Transferencia horizontal Plegamiento y formación de puentes disulfuro Glicosilación

Plastídico

Nuclear

~10.000/célula

Pocas copias

Altos Entre el 2-7% (hasta 47%)

Por lo general bajos Entre 0,001-0,1%

Inserción en sitio conocido elimina este problema

Inserción al azar (expresión variable)

Operones

Monocistrónicos

No se ha reportado

TGS y PTGS afectan la expresión

Herencia materna

Sí

Correcto

Correcto (pasando por retículo endoplasmático)

NO

SI

Aplicaciones / Genes expresados

Transformación de cloroplastos

Aplicaciones biotecnológicas de la transformación de cloroplastos

La transformación de cloroplastos permite sobrexpresar y simplificar la purificación de albúmina sérica humana

Albúmina sérica humana (HSA)

- Constituye el 60% de la proteína total en el suero.

- Es la proteína intravenosa más usada para reemplazar volúmen sanguíneo en situaciones de trauma. - Actualmente es obtenida de la sangre.

- Se expresó en sistemas microbianos y en plantas transgénicas (transformación nuclear) y se obtuvieron muy bajos niveles proteicos.

- La HSA es muy susceptible a la degradación proteolítica en los sistemas recombinantes y su purificación es muy costosa. 16S

trnI

trnA

23S

Prrn

Construcciones empleadas para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum.

Prrn

Transformación de cloroplastos

aadA

ó

aadA Prrn

SD

HSA

3´psbA

HSA

P5´UTR psbA

3´psbA

Análisis de la expresión de HSA en plantas transgénicas Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos

Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos luego de exposición diferencial a la luz (pLDApsbAHSA)

Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003.

Análisis de la acumulación de HSA en cuerpos de inclusión Micrografías electrónicas de tejidos (hojas maduras) marcados con anticuerpos anti-HSA conjugados con oro. A: control no transformado B-D: hojas de plantas transformadas con pLDApsbAHSA.

A

B

A pesar de los altos niveles de expresión las plantas transgénicas mostraron un fenotipo normal. 1 y 2: plantas no transformadas. 3: pLDAsdHSA 4: pLDApsbAHSA.

Extracción de HSA de cuerpos de inclusión

66 KDa

45 KDa

pLDApsbAHSA pzrcialmente parcialmente purificado pLDApsbAHSA purificado

pLDApsbAHSA al comienzo

40 ng HSA

control

pLDApsbAHSA

pLDApsbAHSA

97 KDa 97 KDa

Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003

control

D

MM

C

500 ng HSA

Fracción Precipitado soluble solubilizado

control

Durante el proceso de solubilización

66 KDa

HSA LSU

Inmunodetección de HSA en extractos vegetales

SDS-Page revelado con plata

Producción de hormona de crecimiento humana (hGH) en cloroplastos de tabaco

Expresión de los genes quiméricos hGH en plantas transgénicas Plásmido

Localización del gen

Localización de la proteína

Wrg4747

Núcleo

Cloroplasto

Wrg4838

Cloroplasto

Cloroplasto

pMON38794

Cloroplasto

Cloroplasto

Wrg4776 pMON38755

Tomados de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.

Núcleo

Cloroplasto

Concentración de proteína expresada (% pts) ND - 0,025 a

RE

0,004 - 0,008 a

Cloroplasto

1,0 b

0,2 a

7,0 b

Producción de hormona de crecimiento humana (hGH) en cloroplastos de tabaco

Transformación de cloroplastos

Herencia materna de los transgenes plastídicos

Tomado de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.

NT: no transgénico Nt-4838: planta transplastómica expresando hGH

♀: planta receptora ♂: planta donora de polen

Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano para el control de bacterias y hongos fitopatógenos

• Péptidos antimicrobianos

- Son péptidos con estructuras a-hélice componentes del sistema de defensa innato de los animales. - Participan en el control de la flora bacteriana normal y en la defensa contra patógenos.

- Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos, células de mamíferos). - El péptido MS1-99 es un análogo de la magainina-2 secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.

• La acción de los péptidos antimicrobianos es concentracióndependiente. Los cloroplastos son un sistema atractivo para lograr altos niveles de acumulación. Construcción empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum trnI

Transformación de cloroplastos

16SrDNA

trnV

MS1-99 Prrn

Orf131 Orf70B aadA TpsbA

rps12

Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano para el control de bacterias y hongos fitopatógenos Ensayos de actividad antibacteriana in vitro de extractos vegetales sobre Pseudomonas syringae pv tabaci

Resistencia in planta a Pseudomonas syringae pv tabaci

TransgénicaT0

Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.

Se cuantificó por DO el crecimiento bacteriano T1 y T2: generaciones de plantas transgénicas 10A, 11A y 13A: líneas de plantas transgénicas.

No transformada

Se inocularon las hojas con distinto número de células de Pseudomanas syringae pv tabaci; se evaluaron los síntomas a los 5 días.

Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano para el control de bacterias y hongos fitopatógenos Ensayos in vitro de actividad antifúngica de extractos vegetales

Resistencia antifúngica in planta

No transformada

Transgénica

Se inocularon las hojas con Colletotrichum destructivum y se observó la aparición de lesiones. Las plantas controles desarrollaron lesiones entre 48-72 h post-inoculación, mientras que las transformadas no desarrollaron lesiones aún después de una semana.

Resultados:

Inhibición de conidios germinados UFC: unidades formadoras de colonias.

- 96% de inhibición de Pseudomonas syringae pv tabaci. - >95% de inhibición de las especies fúngicas - Ausencia de lesiones antracosas frente a Colletotrichum destructivum. - Ausencia de anomalías en plantas transgénicas Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.

La expresión de toxina Cry de Bacillus thurigiensis en cloroplastos confiere amplia resistencia contra insectos • Proteínas Cry de Bacillus thuringiensis - Poseen potente actividad insecticida contra insectos lepidópteros, dípteros y coleópteros.

• La transformación de cloroplastos podría ser un sistema apropiado para acumular altos niveles de la -entomotoxina Cry debido al origen procariota del gen.

Resultados:

Se obtuvieron altos niveles de expresión de la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso total soluble) asociados a una alta tasa de mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens, Helicoverpa zea y Spodoptera exigua en los ensayos de infestación. Tomado de: Kota et al., PNAS U.S.A., 1999.

La expresión del operón Cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis en cloroplastos induce la formación de cristales insecticidas Cuantificación de la proteína Cry2Aa2 por ELISA

- El gen cry2Aa2 es uno de los tres marcos abiertos de lectura del operón cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis. - El ORF2 codifica una chaperona que guía el plegamiento de Cry2Aa2. - Se expresaron policistrones conteniendo estos genes en cloroplastos para aumentar la acumulación de entomotoxina.

Cristales de Cry2Aa2 en cloroplastos

Tomado de: De Cosa et al., Nature Biotechnology, 2000.

Construcción empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum 16S

trnI

aadA

Prrn

trnA orf1 orf2

- Expresión de Cry: 45,3% de PTS (hojas maduras y hojas viejas).

cry2Aa2

Operón cry2Aa2

Resultados:

TpsbA

- Provocó una mortandad del 100% en insectos normalmente difíciles de controlar.

Transformación genética estable de cromoplastos de tomate con el gen selector aad-A Construcción empleada para transformar cloroplastos de Lycopersicum esculentum psaB

rps14

trnfM

trnG

ycf9

B

A

trnS

aadA Prrn

TpsbA

Acumulación de aadA en hojas, frutos verdes y rojos (maduros) de plantas transplastómicas de tomate Frutos

dilución

1:8

Propagación de líneas de tomate resistentes a espectinomicina D

C

Le-aadA

rojos

Le control

1:4

Le-aadA

1:2

Le control

Le-aadA

Le-aadA

verdes

Le-aadA

Le-aadA

Le control

Nt iycf9

Nt control

Hojas

Selección primaria de callos de tomate resistentes a espectinomicina

Regeneración de plantas a partir de callos transplastómicos homoplásticos

Enraizamiento de brotes de tomate transplastómicos

Tomado de: Ruf et al., Nature Biotechnology, 2001.

Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)

1

ss

22

D. extracelular 971

hEGF 53

1033 1053 1023

Tr

hEGF maduro: 6,2 Kda

D. citoplasmático

1207

N-glic.

pre-pro-hEGF (114 Kda)

•Une a un receptor tirosina-quinasa presente en casi todos los tipos celulares. •Factor mitogénico. Interviene en el desarrollo, diferencianción, reparación y protección de tejidos epiteliales.

Puentes -SH

Tratamiento de heridas y quemaduras Agente reparador en transplantes de córnea Tratamiento de úlceras gástricas y otras afecciones gastrointestinales

Construcción del vector: clonado de las secuencias flanqueantes

Sitio de inserción

Secuencias flanqueantes

Nicotiana tabacum cloroplasto 155.393 pb

Procesamiento y splicing del operon de los ARN ribosomales

Plásmidos para la transformación de cloroplastos de tabaco Sac II

Sac II

16S

Prrn

aadA

pBSWGUS (8163 pb)

trnA Sac I

trnI

Prrn

16S

RBS

Nde I

uidA

Trps16

Xba I

5’ UTR (psbA)

pBSWUTRGUS (8357 pb)

trnA Sac I

trnI

aadA 5’ UTR

Nde I

uidA

Trps16

Xba I

Análisis de las plantas: PCR

Verificación de la homoplastía por Southern blot

pBSWUTREGF

Niveles de expresión :Coomasie M

WT

Nu

R1

GUS

R3

R5

P1GUS

R1

BSA 0,1

SUBUNIDAD MAYOR RUBISCO

20 ug de proteínas totales de hojas de tabaco

1

2 ug

Virus de la fiebre aftosa

Virus de la fiebre aftosa

Caracterización molecular de las plantas VP-βGUS Northern blot

Southern blot

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