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FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

Pila de Biolixiviación 16 m. a 3300 msnm. Foto. Mario Esparza 2012.

Lixiviación Microbiana

Dr. Mario Esparza Mantilla Laboratorio de Biominería. Departamento de Acuicultura. Facultad de Recursos del Mar. Universidad de Antofagasta. Chile. Mayo, 2013

[email protected]

Contenidos del curso teórico- práctico

Unidad I: MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

Unidad III. OPERACIONES DE BIOHIDROMETALURGICA Microbiología Bioinformática

Genética Biología Molecular

BIOMINERIA

Bioprocesos

Bio-Hidrometalurgía

UNIDAD II. LIXIVIACION MICROBIANA A. ferrooxidans

A. caldus

FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

I UNIDAD

Lixiviación Microbiana

“Desde las células microbianas a la obtención industrial de metales”

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

Entrenar a los estudiantes en técnicas de muestreo, aislamiento, conteo e identificación molecular de microorganismos biolixiviantes.

CONTENIDOS: 1. Introducción a la microbiología. Los dominios de la vida. Bacterias, arqueas y eucarias. 2. Cinética de crecimiento microbiano. Parámetros de análisis. 3. Fisiología Microbiana. Metabolismo autótrofo y heterótrofo, nutrientes, demanda de oxígeno, carbono y sustratos energéticos. 4. Muestreo y aislamiento de bacterias, recuento microbiano, caracterización morfológica y cultivos sólidos y líquidos de bacterias y arqueas biolixiviantes. 5. Identificación molecular de microorganismos biolixiviantes. Análisis de ADN y marcadores genéticos asociados al metabolismo energético de metales y al metabolismo de carbono. Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

I UNIDAD

OBJETIVOS:

Clase 1

Introducción a la Microbiología

Cinética de crecimiento microbiano

Zammit y cols ( 2010).

Fisiología Microbiana

Clase 2

Muestreo y aislamiento de bacterias

Recuento y caracterización microbiana

Identificación molecular y genómica

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

I UNIDAD

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

GEOMICROBIOLOGIA MINERA

I UNIDAD

Las células microbianas digieren minerales

M2+ Fe2+

Zammit y cols ( 2010).

Fe3+ SO42- + 2H+

S° Sulfuro Metálico (MFeS2) 1. 2.

Comprender como crecen y funciona la células microbiana. Entender el rol de la célula en un ambiente extremo: pH ácido, poco sustrato, metales pesados, etc.

Laboratorio de Biominería

M2+

Bacterias Biolixiviantes 1. ¿Cómo realiza el proceso? 2. ¿Qué elementos biológicos tiene para digerir el mineral? 3. ¿Cómo evade la toxicidad del metal, mecanismos?

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Fisiología Microbiana: El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes

Zammit, C y cols (2009).

El cultivo en laboratorio debe homologar las condiciones del ambiente natural

El cultivo debe asegurar que siempre haya suministro de fuentes energéticas (Fe2+, S°, etc), fuentes de carbono ( CO2, HCO3-, Ca2CO3 ) y fuente de Nitrógeno ( sales de amonio), oxígeno (aireación). Todo debe estar a pH ácido y en agitación constante (180 RPM) para asegurar la homogenización de los nutrientes.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Fisiología Microbiana: Medio líquido 9K para A. ferrooxidans Ingredientes Nitrógeno

10X ( g/L)

1X( g/L)

150

15

5

0,5

K2HPO4

2,5

0,25

MgSO4 . 7H20

25

2,5

Ca(NO3)2

0.72

0,072

H2SO4 10N

50 ml

5

FeSO4.7H2O

330

33

S°

50

5

Na2S2O3.5H2O

50

5

(NH4)2SO4 KCI

Energía

pH: 1,6

pH: 3,5

9K+ Fe 2+

H2

pH: 3,5

Oxígeno

O2 (72%)

Aireación

Carbono

CO2 (0,036%)

Aireación

9K+ S°

9K+ S° Almacenar a 4°C.

1

Yates, J. R. & D. Holmes (1987). J. Bacteriol (169)5: 1861-1870.

Laboratorio de Biominería

2

Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Los ingredientes para la receta del medio salino 9K

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Fisiología Microbiana

Medio sólido para A. ferrooxidans El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfología de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias así como hacer análisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor información que el método de recuento en cámara bajo microscopio en donde se cuentan células muertas, células dañadas y células viables. Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Fisiología Microbiana

Medio sólido para A. ferrooxidans El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfología de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias así como hacer análisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor información que el método de recuento en cámara bajo microscopio en donde se cuentan células muertas, células dañadas y células viables. Yong-Quan Li y cols (2011). J Curr Microbiol (2010) 60:17–24.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Inhibidores del crecimiento en A. ferooxidans Compuesto

Concentración

% Inhibición

As (III)

200 ppm

70

As(V)

500 ppm

70

Fluoruro

4.7 ppm

100

Cianuro

6.2 ppm

99

Molibdato

1 mM

85

Nitrato

5.8g/l

100

Cloruro de sodio

5g/l

50

Cloruro de sodio

10g/l

90

Luz: la luz visible y la no filtrada tienen un efecto inhibitorio sobre algunas especies del genero Acidithiobacillus, pero el férrico ofrece alguna protección a los rayos visibles. Presencia de Inhibidores: en los procesos de molienda o por acción propia del agente lixiviante se liberan algunos iones que en ciertas concentraciones resultan tóxicas para las bacterias ferroxidantes afectando el desarrollo bacterial. La literatura señala que los niveles de tolerancia de las bacterias para ciertos metales es Zn+2= 15 – 72 g/l; Ni+2 =12 – 50 g/l; Cu+2 =15g/l; Ag+ =1ppb; UO2+2 = 200 – 500 mg/l, entre otros. Jo, M (2008).

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA

Técnicas microbiológicas y herramientas para aislamiento y cultivo de bacterias Muestreo y aislamiento de bacterias biolixiviantes

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Muestreo y aislamiento de bacterias acidófilas

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Aislamientos de A. ferrooxidans

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA

Zammit, C y cols (2009).

Muestreo y aislamiento de bacterias acidófilas

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA

Zammit, C y cols (2009).

Muestreo y aislamiento de bacterias acidófilas

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Recuento y caracterización microbiana – – – –

Recuento microscópico en cámara de Petroff-Hausser Determinación del número más probable Métodos basados en la reducción de colorantes por viables (azul de metileno) Recuento bacteriano basado en técnicas moleculares (PCR y qPCR)

Discusión: viable/no viable; efecto del medio cultivo MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Recuento y caracterización microbiana

Escobar, B y cols (2007). Hydrocooper.

Determinación del número más probable en placas de ELISA

Laboratorio de Biominería

Recuento por siembra por extensión

Zammit y cols ( 2009).

Escobar, B y cols (2007). Hydrocooper.

Recuento por filtración en membrana

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Recuento y caracterización microbiana Recuento en placa por siembra por incorporación o extensión (solo crecen los microorganismos cultivables).

MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Recuento y caracterización microbiana

Migración celular por preferencia del oxígeno Recuento en placa mediante diluciones seriadas MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Caracterización microbiana por tinción de Gram

Las bacterias biolixiviantes preferentemente son Gram negativas… ¿Por qué? MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Caracterización microbiana •

Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH): es una técnica de tincion de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas especificos brillen bajo el microscopio.

•

Microcolonias en DEFT: técnica de epifluorescencia directa en filtro. En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina que tiñe especificamente los acidos nucleícos). La deteccion de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopia de fluorescencia o por cualquier otro metodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son mas facilmente detectables.

•

Recuento de microcolonias al microscopio: se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formacion de microcolonias al microscopio.

•

Gotitas de agar: se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación.

Jo, M (2008).

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Recuento y caracterización microbiana

¿Las bacterias Lixiviantes son o no sensibles a los antimicrobianos? MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Preparación de inóculos de A. ferrooxidans ETAPAS UFC (bact/ml) 108

104 Tiempo(h)

Preparación de inóculo

Propagación de inóculo

500 ml

50 ml (cultivo de trabajo)

(volumen total)

104

UFC= 106 bact/ml

Laboratorio de Biominería

Proliferación de inóculo

bact/ml

5 ml (inóculo) 106 bact/ml

Fe2+ Fe3+ Potencial Redox Velocidad de crecimiento (µ)

Análisis Químico y Biológico

Los experimentos deben hacerse por triplicado

Todos los matraces deben contener al inicio del experimento 104 bact/ml

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Preparación de inóculos de A. ferrooxidans

5000 ml (volumen total)

500 ml

(volumen de

48 h

trabajo)

104 bact/ml

Lavar 2 Veces en 9K

108 bact/ml

10 000 rpm x10 min 4°C

Resuspender Pellet Celular 1,0ml de Glicerol (50%)+ 9K

Laboratorio de Biominería

Repartir 0,5 ml en dos nuevos tubos y aforar a 1.0ml con Glicerol (50%) + 9K

Cosechar Pellet Celular

Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 µl de inóculo (2,5x10 10 bact/ml) y almacenar a -20°C hasta su uso.

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Proliferación de células de A. ferrooxidans ETAPAS

Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 µl de inóculo (2,5x10 10 bact/ml) y almacenar a -20°C hasta su uso.

Laboratorio de Biominería

Resuspender o llevar al vortex por 1 min

Aforar hasta 1 ml con 9K y traspasar a matraz con 49 ml de medio a usar (9K+Fe)

Incubar por 48h a 30°C A 180 RPM

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Producción de cultivosETAPAS tipo de A. ferrooxidans

Medio de cultivo 9K

Tiempo

+ A.ferrooxidans

Fe 2+

A. ferrooxidans

Aislamiento y cultivo de bacterias Aislamiento de ADN

secuenciación

Laboratorio de Biominería

Características de colonia, forma y tamaño

Crecimiento en placa

Respaldo y producción de cultivos tipo

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES Identificación molecular y genómica Análisis mediante microarreglos (ADN chip) en bacterias lixiviantes L. ferrooxidans

.

Moreno-Paz , M. & V. Parro(2006) .Environmental Microbiology 8 (6), 1064–1073

Laboratorio de Biominería

A. ferrooxidans

Li y cols. (2011). Folia Microbiol 56:439–451

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Perspectivas de la Microbiología Minera ¿Qué hacer para que las bacterias Biolixiviantes crezcan mas rápido a nivel industrial?

Ustedes deben responder y Tarea N°1 Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA La realidad biolixiviante Los Microorganismos biolixiviantes crecen muy lento. ¿Por qué? Muchos de estos microorganismo son de interés biotecnológico en: BIOMINERIA ( quimiolitoautotrofos oxidantes del hierro o azufre) La mayoria son bacterias entre ellas destacan Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Thiobacillus Thiooxidans

Aplicación Biotecnológica

Acelerar el crecimiento

Producción de Biomasa Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Ingeniería Genética en Bacterias Lixiviantes En la industria de alimentos, la agricultura, la salud, entre otras usan organismos genéticamente modificados (Transgénicos) para potenciar la productividad de sus procesos y tener sistemas biológicos con capacidades mejoradas pero en la Industria de la Minería eso no ha ocurrido ni mucho menos se hace procesos biolixiviantes con microorganismos transgénicos

El Desafío Realizar manipulación genética y producir microorganismos transgénicos con capacidades genéticas mejoradas que permitan realizar los procesos biolixiviantes en menores tiempos que los microorganismos nativos. Los Obstáculos Poca investigación, escasa reproducibilidad experimental, no hay vectores eficientes de transferencia de material genética, escaso crecimiento de bacterias mineras en medio solido en presencia de antibióticos o marcadores de selección y Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Ingeniería Genética en Bacterias Lixiviantes

Los Virus son excelentes vectores para hacer manipulación genética bacteriana

MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Laboratorio de Biominería

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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Ingeniería Genética en Bacterias Lixiviantes Estrategias para producir bacterias transgénicas Biolixiviantes

Bacteria

Técnica

Acidiphilium sp.

electropermeabilización conjugación

Acidithiobacillus thiooxidans

conjugación

Acidithiobacillus ferrooxidans

electropermeabilización

Acidithiobacillus ferrooxidans

conjugación

Kusano y cols., (1992). J Bacteriol. 174: 6617-6623.

Laboratorio de Biominería

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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Ingeniería Genética en Bacterias Lixiviantes Los vectores conocidos de organismos acidófilos son:

Cardenas y Cols (2010). Appl Microbiol Biotechnol 88:605–620.

Laboratorio de Biominería

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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Ingeniería Genética en Bacterias Lixiviantes Las bacteria lixiviante A. ferrooxidans presentan sistema inmune

Horvath.P, y cols (2010).Science. - Josiane E. & Garneau, Marie-Ève Dupuis (2010) Nature.

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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA Biología sintética en Biominería

Construcción de la bacteria ideal para la Minería (La bacteria Top1)

Alta resistencia a los metales pesados Alta recuperación de metales

Alta producción de biomasa

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Microbiología Aplicada a la Minería

Análisis y discusión de papers

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Análisis y discusión de papers

Paper 1

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Análisis y discusión de papers Paper 2

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Análisis y discusión de papers

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Análisis y discusión de papers

Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.

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Análisis y discusión de papers

Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.

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Análisis y discusión de papers

Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.

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Análisis y discusión de papers

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Análisis y discusión de papers

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Análisis y discusión de papers

Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453

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Análisis y discusión de papers

Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453

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Análisis y discusión de papers

Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453

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Análisis y discusión de papers

Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.

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Análisis y discusión de papers

Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.

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Análisis y discusión de papers

Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.

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Análisis y discusión de papers

Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.

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Análisis y discusión de papers

Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.

Laboratorio de Biominería

Dr. Mario Esparza Mantilla

Análisis y discusión de papers

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Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.

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Análisis y discusión de papers

Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.

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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.

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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.

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Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.

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Preguntas Laboratorio de Biominería

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