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CINÉTICA ENZIMÁTICA

Dra. Maria Mercedes Soberón Lozano

Concepto - Cinética

Estudia: • Las velocidades de reacción enzimática. • Mecanismos de reacción de enzimas.

¿Cómo se “visualiza” la acción catalítica de una enzima ? Concentración de sustrato que desaparece por unidad de tiempo.

Concentración de producto que se forma por unidad de tiempo.

¿Cómo se expresa la velocidad enzimática?

Unidad de actividad enzimática (U) Cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto.

Sistema Internacional de Unidades (SI) katal (kat): Cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo.

1 katal = 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, por lo que se utilizan submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat), o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Hipótesis que intentaron explicar el mecanismo de acción de las enzimas (1) Condición equilibrio rápido

Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)

Hipótesis que intentaron explicar el mecanismo de acción de las enzimas

(2) Condición estado estacionario

George E. Briggs y John B. S Haldane (1925) John B. S Haldane

Mecanismo cinético E+S

k1

E-S

kcat

E+P

k-1 k1, k-1 y kcat constantes cinéticas individuales de cada proceso. También denominadas constantes microscópicas de velocidad.

Hipótesis Michaelis-Menten (Condición equilibrio rápido) k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E (1)

Deducción Ec. (1):

- Complejo E-S piedra angular de la cinética enzimática. - Complejo E-S en equilibrio rápido con respecto a E y S (kcat < k -1)

Hipótesis Michaelis-Menten (Condición equilibrio rápido) k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

Velocidad de reacción (v) v = kcat E-S kcat = constante catalítica de velocidad

k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

(1)

Pasos para resolver esquema (1): - Constante de disociación aparente (Ks):

[E][S] k-1 Ks = ---------- = ------[ES] k1

Velocidad de reacción (2) v = kcat [E-S]

Et = E + [E-S],

Conc. de S >> Et

Dividiendo ec (2) entre ec (3) (Et) : v kcat [E-S] ---- = -------------- (4) Et [E] + [E-S]

(3)

Hipótesis Michaelis-Menten Pero, kcat [Et] = Vmax Ks = Km Reordenando la ec. 4, se llega a la ec.

Michaelis- Menten: v

S

----------- = -----------

Vmax

Ks + S

ó

S Vmax

v = -------------Ks + S

Limitaciones de la Ec. Michaelis-Menten  Válida mayormente para sistemas enzimáticos uni-reactivos sencillos.

Para reacciones enzimáticas con más de un complejo E-S, el significado REAL y EXACTO de Km y Vmax cambia.

E +S

k1

k-1

(E-S

k2 k-2

E-S1

k3 k-3

E-P)

kcat

P + E

Hipótesis de Briggs-Haldane (Condición estado estacionario)

E +S

k1 k-1

(E-S1

k2 k-2

E-S2

k3 k-3

kcat

E-P)

E-S Como siempre, v = kcat [E-S]

P+ E

k1

E +S

k-1

kcat

E-S

P + E

E-S permanece constante: Vel. de formación E-S = Vel. de desaparición E-S k1[E][S] = k-1[E-S] + kcat[E-S] Reordenando: k1[E][S] = (k-1 + kcat) [E-S]

(5)

Despejando E-S de ec (5): E S E-S = -----------------k-1 + k cat /k1 k-1

------------

k1

+

kcat

------------

k1

kcat

Ks + -----------k1

Km = Ks + kcat/k1

Km > Ks

Hipótesis de Briggs-Haldane (Condición estado estacionario)

v

S

----------- = -----------

Vmax

Km + S

ó

S Vmax

v = -------------Km + S

E+S

k1

kcat E-S  P + E

k-1

Cuando kcat Km  v = kcat Et

En la práctica...... Gráfica Michaelis-Menten ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

v

Gráfica de Lineweaver-Burk 1/v = Km/Vm x 1/[S] + 1/Vm Pendiente de línea

¿Por qué determinar Km?  Establece el valor aprox. de concentración de sustrato en la célula.  Identificación de isoenzimas

 Regulación a nivel de enzimas por cambios en Km, inducidos por ligandos.

¿Por qué determinar Km? Conociendo Km podemos “in vitro” trabajar la enzima en condiciones de [S] > Km Cuando [S] >100 Km  Vmax, valor que permite conocer la [E]total presente en el sistema de reacción.

¿Por qué determinar Km? Si kcat >Km).  Varía de una enzima a otra.  Si mecanismo de reacción es de dos o más pasos, Vm será SIEMPRE equivalente a kcat[Et].  Permite calcular la [E]total presente en la reacción.

Significado de kcat Constante de velocidad de primer orden. Denominada también “número de recambios” (turnover number), cantidad máxima de moléculas (S, P) transformadas / tiempo, por molécula de enzima o por número de sitios activos.

Valor kcat de Algunas Enzimas

Enzima Catalasa

Sustrato H2O2

Kcat (s-1) 40 000 000

Anhidrasa carbónica

HCO3 -

400 000

Acetilcolinoesterasa

Acetilcolina

14 000

Benzilpenicilina

2 000

Β-Lactamasa Fumarasa

Fumarato

800

Eficiencia catalítica de algunas enzimas

Enzima

Sustrato

Kcat/Km (M-1 S-1)

Acetilcolinoesterasa

Acetilcolina

1.6 x 108

CO2

8.3 x 107

Anhidrasa carbónica

HCO3-

1.5 x 107

Catalasa

H2O2

4 x 107

Crotonasa

Crotonil-CoA

2.8 x 108

Fumarato

1.6 x 108

Malato

3.6 x 107

Fumarasa

Características Disminuir o bloquear la velocidad de reacción, uniéndose a la enzima. Son específicos. Alteran grupos importantes para la función catalítica, o Alteran ligeramente conformación de la enzima sin llegar a desnaturalizarla.

Aplicaciones  Identifica aminoácidos presentes en el sitio catalítico de la enzima y su probable rol en catálisis.

 Fundamento de fármacos antivíricos, antibacterianos y antitumorales

Tipos Inhibición 1. Inhibición Permanente Unión irreversible por enlaces covalentes, provocando modificación química de grupos en centros de fijación y sitio activo de la enzima.

Inhibición permanente del gas sarín

Gas sarín Compuesto organofosforado que inhibe la actividad de ACETILCOLINESTERASA

Los organofosforados forman un éster estable con el OH de la SER del centro activo de la enzima y la reacción no prospera; la enzima queda bloqueada e inactiva.

2. Inhibición reversible Tipos: Competitiva Acompetitiva No competitiva

Inhibición Competitiva I y S compiten por sitio catalítico. Análogo o derivado no metabolizable del verdadero sustrato. Actúa sólo aumentando  el Km (Km app) para S.

Vm permanece inalterable

Ks

k3

E + S E-S E + P + I kI EI

Fluorouracil

FdUMP

UMP

5, 10-metilen tetrahidrofolato

dTMP Timidilato sintasa

DNA

7, 8 dihidrofolato

Ácido fólico

NADPH + H+ Serina hidroximetil transferasa

Glicina

Dihidrofolato reductasa

Tetrahidrofolato Serina

Metotrexato NADP+ Inhibición

Acción Bioquímica de Agentes Quimioterapéuticos

8 7

Las posiciones 7 y 8 llevan hidrógeno formando el DIHIDROFOLATO

1968 Introducción en mercado de BACTRIM (combinación de trimetoprim-sulfametoxasol). Trimetoprim (TMP) y sulfametoxazol (SMX) actúan de forma sinérgica. Trimetoprim inhibe de forma competitiva la dihidrofolato reductasa.

TMP-SMX inhibe 50,000 veces más la dihidrofolato reductasa bacteriana que la de los mamíferos

Inhibición No Competitiva I se une tanto a la enzima Ks k3 como al complejo E-S. E + S  E-S  E + P Km no se altera (KI = Km ). + + Vm varía. Disminuye a medida que aumenta [I]. I I I, podría impedir la   conformación de centro EI + S  ESI catalítico. Ks No puede ser superada aumentando [S].

Inhibición Acompetitiva I sólo se une al complejo E-S. I no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio. No se puede superar la inhibición aumentando la [S]. Km es más pequeño (aparente afinidad)

Ks k3 E + S  E-S  E + P + I kI  ESI

¿Entendieron la cinética de las enzimas?