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• Camila Bedoya

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA No 4 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS

OBJETIVOS.  ➢ Reconocer la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la prueba de molish. ➢ Diferenciar carbohidratos reductores de no reductores por su comportamiento frente al reactivo de Benedict. ➢ Realizar ensayos cualitativos para el reconocimiento de carbohidratos específicos.  TEORÍA RELACIONADA  Los carbohidratos son unas biomoléculas que también toman los nombres de hidratos de carbono, glúcidos, azúcares o sacáridos; aunque los dos primeros nombres, los más comunes y empleados, no son del todo precisos, ya que no se tratan estrictamente de átomos de carbono hidratados, pero los intentos por sustituir estos términos por otros más precisos no han tenido éxito. Estas moléculas están formadas por tres elementos fundamentales: el carbono, el hidrógeno y el oxígeno, este último en una proporción algo más baja. Su principal función en el organismo de los seres vivos es la de contribuir en el almacenamiento y en la obtención de energía de forma inmediata, sobre todo al cerebro y al sistema nervioso.

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Esto se cumple gracias a una enzima, la amilasa, que ayuda a descomponer esta molécula en glucosa o azúcar en sangre, que hace posible que el cuerpo utilice la energía para realizar sus funciones. PRUEBA DE MOLISH: El ácido sulfúrico concentrado hidroliza los enlaces glucosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan con α-naftol sulfonato, originando un complejo púrpura. Esta reacción es general para los carbohidratos pero algunos otros compuestos orgánicos dan también furfural con ácido sulfúrico concentrado.  PRUEBA DE BENEDICT: Es una modificación de la prueba de felhing, introducida por Benedict. En ella se usa únicamente una solución, lo cual lo hace mucho más simple con la ventaja adicional de que el reactivo es más estable que el de felhing. Esta prueba solo la dan los azucares reductores.  PRUEBA DE BARFOED: reactivo de Barfoed es débilmente ácido y solamente puede ser reducido por monosacáridos. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar los disacáridos dando así reacciones falsamente positivas. El precipitado de óxido cuproso es menos denso que en los métodos previos y se recomienda dejar el tubo en reposo hasta que el precipitado sedimente.  PRUEBA BIAL PARA PENTOSAS. Cuando se calientan las pentosas en ácido clorhídrico concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso.  PRUEBA DE SELLIWANOFF. Las cetosas deshidratan más rápidamente que las aldosas dando derivados del furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rosado; por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se está estudiando.  PRUEBA PARA SACAROSA. La sacarosa es el único disacárido común no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre. Esta es hidrolizada en solución ácida y luego se ensayan la glucosa y la fructosa resultante.  PRUEBA PARA POLISACÁRIDOS. Los polisacáridos contienen sólo un grupo reductor por varios cientos o más residuos, así que en la práctica, no son reductores. La hidrólisis ácida libera los monosacáridos constituyentes que luego son ensayados.  Por una universidad con calidad, moderna e incluyente Carrera 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 7860920 www.unicordoba.edu.co

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MATERIALES Y REACTIVOS  Estufa o calentad or  Pipetas de 5 y de 10ml  Beakers de 100 y 400ml  10 tubos de ensayo  Pinza para tubos de ensayo  Gradilla  Gotero 

Papel tornasol  Reactivo de Molish 

casa) 

Ácido sulfúrico concentrado  Reactivo de Benedict  Reactivo de Barfoed  Reactivo de Bial  Soluciones de: glucosa, galactosa, ribosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, fructosa, almidón, leche (traer de la

Solución de yodo.  Reactivo de Selliwanoff  Alcohol Amílico  Ácido clorhídrico concentrado  Hidróxido de sodio 1M 

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PROCEDIMIENTO 1. PRUEBA DE MOLISH Colocar 1ml de leche

Adicionar 5 gotas del reactivo de Molish.

Agregar 1ml de ácido sulfúrico Molish

Observar cualquier cambio de color

Añadir hasta que se formen dos capas

2. PRUEBA DE BENEDICT

Se agrega 0,5 ml Colóquelos en un baño Adicione 0.5 de solución de de agua hirviendo por 3 ml del lactosa, al segundo min. La formación de un reactivo de 0.5 ml de solución precipitado de color rojo Benedict a de glucosa y al ladrillo indica la cada tubo tercero 0.5 ml de presencia de azúcar Por una universidad con calidad, moderna e solución de reductor. incluyente sacarosa. Carrera 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 7860920 www.unicordoba.edu.co

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3. PRUEBA DE BARFOED:

Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5 ml de solución de galactosa, al segundo 0.5 ml de solución de ribosa y al tercero 0.5 ml solución de almidón

Adicione 1 ml del reactivo de Barfoed a cada tubo

Hierva por 2 min y deje reposar. La formación de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de monosacáridos

4. PRUEBA DE BIAL

Tome 3 tubos de Caliente hasta que Adicione 0.5 ml ensayo; adicione al empiece a hervir, de reactivo de primero 0.5ml de dejar enfriar Bial solución de ribosa, al segundo 0.5ml de solución de arabinosa Por y una al universidad con calidad, moderna e tercero 0.5ml de incluyente 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 soluciónCarrera de almidón. 7860920 www.unicordoba.edu.co

Agregue 1ml de ácido amílico y agite

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La aparición de una coloración azul verdosa es prueba positiva es prueba positiva para pentosas.

5. PRUEBA SELLIWANOFF

 Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de solución de fructosa, al segundo 0.5ml de solución de arabinosa y al tercero 0.5ml de solución de glucosa.

Agregue 1ml de reactivo de Selliwanoff

Caliente durante 1 min en un baño de agua hirviendo, la aparición de un color rojo o rosado es prueba positiva para cetosas.

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6. PRUEBA DE SACAROSA

A 2.5 ml de una solución de sacarosa

Agregue 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado.

Caliente durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, enfrié y agregue Hidróxido de Sodio 1M hasta que la solución sea neutra o ligeramente alcalina

(Prueba con papel tornasol), divida la solución hidrolizada en dos porciones y realice por separado las pruebas de Benedict y Selliwanoff.

7. PRUEBA DE POLISACARIDOS

Por una universidad con calidad, moderna e incluyente Añada 1 gotas de Coloque Carrera 1ml de 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 soluciónwww.unicordoba.edu.co de yodo. 7860920 solución de Observe la almidón producción de un color azul.

Caliente el tubo ¿Qué observa? Deje enfriar y observe nuevamente

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OBSERVACIONES: REACTIVOS

MUESTR A sacarosa fructosa

fehling

Millón

-

-

+

Barfoed

Tollens

lugol

+

-

-

-

+

+

-

glucosa

+

-

+

+

-

almidón

-

-

-

-

+

ANALISIS DE RESULTADOS: PRUEBA DE FEHLING

RESULTADOS

Sacarosa

La solución de azúcar reductor es la sacarosa el resultado nos indica una coloración azul determinando que esta solución es un azúcar no reductor debido a que la prueba salió negativa y que no se produjo la reducción, esto se da porque es un azúcar constituida por una molécula de glucosa y de fructosa, tiene un enlace entre el primer carbono de la glucosa y el segundo carbono de la fructosa, y no queda grupos reductores disponibles.

Fructosa

Que se dio en la glucosa, maltosa, lactosa este reactivo, reacciona principalmente con los aldehídos porque tienen un grupo carbonilo más expuesto, que le da el carácter reductor, y existe la presencia del precipitado rojo ladrillo (óxido cuproso).

glucosa almidón

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PRUEBA DE BARFOED

RESULTADOS

Sacarosa

Los disacáridos también pueden reaccionar pero de forma más lenta, el grupo aldehído perteneciente al monosacárido que se encuentra en forma hemiacetal se oxida pasando a ácido carboxílico; sabiendo que la sacarosa es un disacárido puede dar o no un resultado positivo considerando que si es positivo, entonces su proceso o reacción es lento, es decir que nos presentó un precipitado rojo característico del óxido cuproso (Cu2O).

Fructosa

La glucosa presenta el precipitado color rojo característico de esta reacción, lo que nos evidencia que es un azúcar reductor monosacárido. Al ser monosacáridos obtuvimos un resultado positivo, es decir, la presencia de un precipitado leve de color rojo de óxido cuproso

glucosa Almidón

Al ser un polisacárido esta no reacciona.

Reacción negativa

Reacción positiva

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PRUEBA DE TOLLENS

RESULTADOS

Sacarosa

No hubo ninguna reacción entre las soluciones, debido a que la sacarosa es un Azúcar NO reductor

Fructosa glucosa

El ensayo con el reactivo de Tollens es una reacción de oxidación, en la cual se identifica a las aldosas, ya que las cetosas no reaccionan. En la reacción el reactivo de Tollens se oxida totalmente, y genera el espejo de plata, ya que el ion de plata se reduce a plata elemental. Sin embargo la fructosa si reduce el reactivo de Tollens, esto se debe a que la fructosa se isomeriza fácilmente en una mezcla de aldosas (glucosa y manosa) en una disolución básica por una serie de

Almidón

No hubo ninguna reacción entre las soluciones, debido a que el almidón es un Azúcar NO reductor

Reacción positiva

PRUEBA DE LUGOL Sacarosa Fructosa glucosa Almidón

Reacción negativo

RESULTADOS El producto azul es un complejo se inclusión en la cual las moléculas de yodo entran en los espacios de la amilasa, la cual en solución se encuentra enrollada en forma de hélice, dejando suficiente espacio para acomodar las moléculas de yodo. Sirve para diferenciar el almidón de otros carbohidratos, debido a que solo el almidón da positiva esta prueba. Se utiliza esta disolución como indicador en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula de polisacárido. El lugol no reacciona con azúcares simples como la glucosa o la fructosa.

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PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1.

Escriba cada una de las reacciones en las diferentes pruebas para carbohidratos.

REACCION PRUEBA DE MOLISH

REACCION PRUEBA DE BENEDICT

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA REACCION PRUEBA DE BARFOED

REACCION PRUEBA DE BIAL

REACCION PRUEBA DE SELLIWANOFF

REACCION PRUEBA DE LA SACAROSA

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2. Explique los resultados de cada una de las pruebas realizadas? La Prueba De Molish, es una prueba que da positiva es presencia de lactosa que es un azúcar reductora, es la prueba que reduce al azúcar de la leche dando una coloración al formar el complejo. Reactivo De Benedict, Es oxidante suave capaz de oxidar al azúcar de la leche ya que este azúcar presenta al grupo carbonilo que al encontrarse libre hace que el azúcar sea reductor, esta prueba se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino a Cu+. Este Cu+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloración positiva de la reacción. Reactivo De Barfoed; Siempre dar una prueba positiva en presencia de azúcar reductores porque al formarse el óxido que precipita dando una coloración mientras que este reactivo en presencia de almidón que un polisacárido no reductor no podrá formarse al oxido cuproso dando una prueba negativa. Prueba Bial, es una prueba para identificar azucares pentosas, ya que las pentosas al reaccionar con ácido clorhídrico forma el furfural. Prueba Selliwanoff; Se usa para azúcar aldosa y cetosa que en presencia de ácidos minerales y calentándolas sufren deshidratación la cual da como resultado la formación de un anillo pentagonal de furfural que luego se condensa dando una coloración roja. Prueba Sacarosa; Es un disacárido  que carece de poder reductor esto se debe a que carece de aldehído y cetonas libres y al aplicar la prueba de Benedict y Salliwanoff están dan positivas, la hidrolisis acida hace que la glucosa y fructosa reaccionen con el reactivo de Benedict y Salliwanof. Prueba Polisacárido; reaccionan  con el yoduro de potasio dando como resultado un poli yoduro toma una coloración azulina indicando la presencia del halógeno en el almidón. 3. Explique estructuralmente, porque la maltosa es un azúcar reductor y por qué el almidón no lo sus observaciones

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Porque la maltosa es un disacárido formando por la unión de dos unidades de glucosa mediante enlace ∞14- glucosidico que hace que sea un azúcar reductor y pueda formar el compuesto alfa glucopiranocil (1,4) alfa glupopiranos y el almidón a pesar de estar formado por unidades de glucosa, forma un polímero o polisacárido formando por la mezcla de amilasa y amilopectina  que se unen mediante enlace ∞1-6 y ∞ 1,4 que al ser ramificado no deja aldehído o cetonas libres haciendo que no sea reductor por lo que la prueba es negativa.

4. Consulte las enfermedades producidas por el mal metabolismo de los carbohidratos. Las enfermedades causas por los carbohidratos están directamente relacionadas con los órganos del cuerpo que realizan el metabolismo. Las siguientes enfermedades son causas por hidratos de carbono Obesidad: se define como una acumulación anormal excesiva de grasa. Diabetes tipo 1: se observa una sobre producción de insulina debida a la destrucción auto inmune de las células B. Diabetes tipo 2: en esta el cuerpo produce insulina pero no la suficiente a la que produce la glucosa. Caries. Enfermedades cardiovasculares: impiden al corazón su normal funcionamiento. 5. Por qué la celulosa a pesar de estar formada por moléculas de glucosa es insoluble en agua. La celulosa tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas impenetrables al agua, lo que hace que sea insoluble en agua, y originando fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales. Por una universidad con calidad, moderna e incluyente Carrera 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 7860920 www.unicordoba.edu.co

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6. por qué la sacarosa es un azúcar no reductor? Consulte las posibles estructuras de las muestras problemas. No es un azúcar reductor porque no contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente mediante un enlace Oglucosídico. Por esta razón, la sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor

7. Consulte el fundamento de otras técnicas usadas para la determinación de la glucosa en el laboratorio. Se puede determinar glucosa usando el reactivo de felling por que la glucosa al tener aldehído en su estructura esta es reducida por el Cu+2  presenta en el reactivo de fehling y formara el Cu2 o que se precipita y da una coloración rojiza.

CONCLUSION Los carbohidratos al poseer en su estructura aldehídos o cetonas, presentan un comportamiento químico ligado a los grupos funcionales de estos, como por ejemplo la capacidad de oxidarse con agentes oxidantes suaves como el reactivo de fehling o de Tollens o la capacidad de formar osazonas, además esta clase de reacciones permiten diferenciar monosacáridos de disacáridos como la sacarosa. Los monosacáridos se diferencia de los disacáridos (sacarosa) por su poder reductor, poder que es otorgado por el carbono libre que posee, los monosacáridos a su vez se subdividen en aldosas y cetosas, y en pentosas o hexosas, estos fueron identificados y diferenciados mediante la prueba de Tollens, de Seliwanoff y de Bial, en las que se evidencio la velocidad de deshidratación de

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las aldosas y cetosas, y la formación de furfural o hidroximetil furfural, según provenga una pentosa o hexosa. La sacarosa al hidrolizarse libera a sus monosacáridos constituyentes: la glucosa y la fructosa, debido a esto la sacarosa presento resultados positivos en la prueba para disacáridos y en la prueba de Seliwanoff. BIBLIOGRAFIA 1. Morrison, J.Boyd, R. (1976). Química orgánica: Bioquímica. Estados Unidos 2. Morales. (2005)Reconocimiento de los monosacáridos, disacáridos y de los polisacáridos, Universidad Nacional del Callao, Lima-Perú J. Ernesto Luquet. (2010). Bioquímica: Carbohidratos, San Juan de Pasto 3. Teijón, J.Garrido, A, Villaverde, C. Blanco, M. Mendoza, C. Ramirez, J. (2005). Fundamentos de Bioquímica Estructural: Hidratos de Carbono. México, D.F. 4. Brown, L.Bursten, M. (2009). Química, La ciencia central: Carbohidratos. México, D.F. 5. Wade L.G. (2004). Química Orgánica. S.A.

Madrid, España: Pearson Educación

6. McMurry, John. Quimica organica. (2008) .CengageLearning Editores, S.A.

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