CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LEVADURA

Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela de Ingeniería Agroindustrial CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LEVADURA. CURSO: BIO

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Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela de Ingeniería Agroindustrial CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LEVADURA.

CURSO:

BIOTECNOLOGÍA DE LOS PAI

DOCENTE:

Ing. Guillermo Linares Lujan

INTEGRANTE:

ALVARADO YUPANQUI, LUIS MIGUEL. TACANGA CARHUALLAY, DAVID GARCÍA ROSAS

CICLO:

IX Trujillo – Perú

2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO “DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA” I.

INTRODUCCIÓN

La fermentación es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidación incompleta, típico de los organismos anaeróbicos. Se realiza, pues, sin la intervención del oxígeno. El proceso de fermentación no sólo incluye la desasimilación anaeróbica como la formación de alcohol, butanol-acetona, ácido láctico, etc. sino también la producción industrial de vinagre, ácido cítrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentación.

Durante la fermentación, la energía obtenida procede, igual que en la respiración aerobia, de las reacciones de óxido-reducción habidas durante el catabolismo de la glucosa (glucólisis), pero en la fermentación las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxígeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgánico que se reduce y es el producto característico de cada fermentación.

Inóculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las bebidas alcohólicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autóctonas, las cuales están adaptadas a los medios de fermentación de cada área. Aunque se han encontrado muchos géneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisae es la principal responsable de la fermentación alcohólica, así como de la producción de la mayoría de los compuestos aromáticos. Algunos de los criterios de selección de las cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como producción de etanol, acidez y consumo de azúcares.

El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas nativas en base a su capacidad fermentativa, rendimiento y productividad.

2

Laboratorio 2: Capacidad Fermentativa- Levadura Saccharomyces Cerevisiae

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO II. 

OBJETIVOS

Evaluar y determinar la pérdida de peso y la cantidad de glucosa consumida por las soluciones de la levadura Saccharomyces cerevisiae.



Determinar el rendimiento teórico y real de la levadura durante la respiración y fermentación de ellas mismas, a diferentes concentraciones de sustrato (sacarosa).



Determinar la eficiencia de la levadura Saccharomyces cerevisae a concentraciones de 10 y 20 °Brix, utilizando como sustrato sacarosa (C12H22O11).

III.

FUNDAMENTO TEÓRICO

A. Fermentación Son cambios químicos en las sustancias orgánicas producidos por la acción de las enzimas. Esta definición general incluye prácticamente todas las reacciones químicas de importancia fisiológica. Actualmente, los científicos suelen reservar dicha denominación para la acción de ciertas enzimas específicas, llamadas fermentos, producidas por organismos diminutos tales como el moho, las bacterias y la levadura. Por ejemplo, la lactasa, un fermento producido por una bacteria que se encuentra generalmente en la leche, hace que ésta se agrie, transformando la lactosa (azúcar de la leche) en ácido láctico. El tipo de fermentación más importante es la fermentación alcohólica, en donde la acción de la cimasa segregada por la levadura convierte los azúcares simples, como la glucosa y la fructosa, en alcohol etílico y dióxido de carbono. Hay otros muchos tipos de fermentación que se producen de forma natural, como la formación de ácido butanoico cuando la mantequilla se vuelve rancia, y de ácido etanoico (acético) cuando el vino se convierte en vinagre. La fermentación es un proceso que realizan muchos microorganismos, efectuando reacciones sobre algunos compuestos orgánicos y liberando energía. Hay muchos tipos diferentes de fermentación, pero en condiciones fermentativas solamente se efectúa una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y, por consiguiente, sólo una pequeña cantidad de la energía potencial disponible se libera.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO La primera explicación bioquímica del proceso por el cual el azúcar en solución acuosa es descompuesto en alcohol y gas carbónico, en virtud de la acción de células vivas de levadura, la dio el químico francés Louis Pasteur, el cual vio que mientras descomponen el azúcar en ausencia de aire, las células de levadura viven y se propagan en el líquido en fermentación y llamó al proceso de la fermentación alcohólica “vida sin oxígeno”. La explicación de Pasteur fue modificada por Buchner, quien demostró que podía realizarse la fermentación en una solución acuosa de azúcar por el jugo obtenido prensando células muertas de levadura. Se observó, entonces, que el jugo filtrado de células de levadura que habían sido molidas con arena contenía una sustancia eficaz para descomponer los azúcares, y a esta sustancia activa o mezcla catalizadora se dio el nombre de fermento, enzima o zimasa. De acuerdo con la interpretación bioquímica hecha por Pasteur, la fermentación se conoce como la desasimilación anaeróbica de compuestos orgánicos por la acción de microorganismos u otras células o de extractos celulares; además, es un conjunto de reacciones bioquímicas a través de las cuales una sustancia orgánica se transforma en otras por acción de ciertos microorganismos (bacilos, bacterias, células de levadura), que en general van acompañadas de un desprendimiento gaseoso y de un efecto calorífico. El proceso de fermentación no sólo incluye la desasimilación anaeróbica como la formación de alcohol, butanol-acetona, ácido láctico, etc., sino también la producción industrial de vinagre, ácido cítrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentación. Análogamente, el término fermentador no sólo hace referencia a los recipientes en los cuales se realiza la fermentación con exclusión de aire, sino también a los tanques en los cuales se producen oxidaciones microbianas aeróbicas y a los tanques de propagación de levaduras y otros microorganismos en presencia del aire. Se conocen centenares de especies de levaduras, bacterias y mohos que producen alcohol, pero sólo dos o tres especies de levadura se aplican industrialmente en la producción de alcohol; su rapidez en la fermentación, su tolerancia de concentraciones elevadas de azúcar y alcohol y su rendimiento elevado de alcohol, hacen que se usen más que las otras. Algunos microorganismos ofrecen más de una aplicación industrial. Las levaduras, por ejemplo, producen alcohol y glicerol partiendo de azúcares, hacen subir la masa en la fabricación del pan y son una fuente de proteínas, vitaminas y enzimas. 4

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Todas las células están capacitadas para sintetizar ATP por el proceso de la glicólisis. Enmuchas células, si el oxígeno no está presente, el piruvato es metabolizado en un proceso llamado fermentación. La fermentación complementa a la glicólisis y hace posible producir ATP continuamente en la ausencia del oxígeno. Por la oxidación del NADH producido en la glicólisis, la fermentación regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en para producir más ATP. C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal Se puede ver que la fermentación alcohólica es desde el punto de vista energético unareacción exotérmica, se libera una cierta cantidad de energía. Un cálculo realizado sobre la reacción química muestra que el etanol resultante es casi un51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.

Figura 1. Proceso de fermentación En la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico de la gicólisis pierde un carbono en la forma de bióxido de carbono para formas acetaldehido, el cual es reducido a alcohol etílico, el NADH se convierte en NAD+ (es oxidado). Esta es la fermentación que ocurre normalmente en las levaduras. Como en la fermentación del ácido láctico, la fermentación alcohólica permite a la glicólis continuar y asegurar que el NADH regresa a su estado oxidado (NAD+). La energía neta ganada en la fermentación es de 2 moléculas/glucosa de ATP. En ambas fermentaciones (láctica y alcohólica), todo el NADH producido en la glicólisis es 5

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO consumido en la fermentación, por lo tanto no hay producción neta de NADH, y ningún NADH entra a la CTE y forma ATP. 1. Clasificación de las reacciones de fermentación según el agente

a) Fermentación microbiana. Promovidas o catalizadas por microorganismos. La reproducción de los microorganismos conlleva a que la reacción tenga un comportamiento autocatalítico siendo la concentración de los microorganismos variable. Dentro de este tipo de reacción hay 2 clases bien definidas: 

Cultivos de tejidos o macroorganismos (células vegetales y animales).



Reactores microbianos en sí (cultivo de microorganismos).

b) Reacciones enzimáticas. Catalizadas por enzimas, el agente catalítico no se reproduce y cuando se opera discontinuamente este permanece constante.

2. Clasificación de las reacciones de fermentación según el consumo de oxígeno a) Aeróbicas Aquí los microorganismos necesitan de oxígeno para poder sobrevivir. Por ejemplo la reacción de transformación de la glucosa. O2 + C6H12O6 CO2 + BIOMASA b) Anaeróbicas Aquí los microorganismos no necesitan de oxígeno para su supervivencia. Por ejemplo la reacción de transformación de la glucosa por vía glucolítica. C6H12O6 2C2H5OH + CO2 + ENERGÍA B. Fermentación alcohólica Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire, originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol, dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol 6

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico. La fermentación alcohólica se puede considerar (desde una perspectiva humana) como un proceso bioquímico para la obtención de etanol, que por otras vías se ha obtenido gracias a procedimientos químicos industriales, como por ejemplo mediante la reacción de oxidación de eteno. La finalidad de la fermentación etílica (desde una perspectiva microbiana) es la obtención de energía para la supervivencia de los organismos unicelulares anaeróbicos. Las bebidas alcohólicas se producen a partir de diferentes sustratos, dependiendo de la región geográfica y sus riquezas. Las materias primas pueden ser azúcares simples como los presentes en el jugo de uva, o de alto peso molecular, como el almidón de los granos de cebada. C. Levadura Las levaduras son los microbios que realizan la fermentación, transformando el mosto azucarado en el vino que es líquido con alcohol y sin azúcar. Las levaduras viven en nuestro ambiente y llegan a la bodega adherida a la piel de las uvas. La levadura tiene un enorme valor por su riqueza nitrogenada y vitamínica. El tamaño de la levadura oscila de tres a seis micras. Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma esférica) de un tamaño que ronda los 2 a 4 μm y que están presentes de forma natural en algunos productos como las frutas, cereales y verduras. Son lo que se denominan: organismos anaeróbicos facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno. Se puede decir que el 96% de la producción de etanol la llevan a cabo hongos microscópicos, diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomyces cerevisiae, Kluyvero mycesfragilis, Torulaspora y Zymomonasmobilis. 7

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Los microorganismos responsables de la fermentación son de tres tipos: bacterias, mohos y levaduras. Cada uno de estos microorganismos posee una característica propia sobre la fermentación que es capaz de provocar. En algunos casos son capaces de proporcionar un sabor característico al producto final (como en el caso de los vinos o cervezas). A veces estos microorganismos no actúan solos, sino que cooperan entre sí para la obtención del proceso global de fermentación. Las propias levaduras se han empleado a veces en la alimentación humana como un subproducto industrial. Cuando el medio es rico en azúcar (como puede ser el caso de las melazas o siropes), la transformación del mismo en alcohol hace que la presencia de una cierta concentración (generalmente expresada en °Brix) afecte a la supervivencia de levaduras no pudiendo realizar la fermentación en tal medio (las altas concentraciones de azúcar frenan los procesos osmóticos de las membranas de las células). Aunque hay distintos tipos de levaduras con diferentes tolerancias a las concentraciones de azúcares y de etanol, el límite suele estar en torno a los o de alcohol para las levaduras del vino, por ejemplo. Los azúcares empleados en la fermentación suelen ser: dextrosa, maltosa, sacarosa y lactosa (azúcar de la leche). Los microorganismos 'atacan' específicamente a cada una de los hidratos de carbono, siendo la maltosa la más afectada por las levaduras. Otros factores como el número de levaduras (contadas en el laboratorio, o la industria, a veces mediante cámaras de Neubauer). Algunos enzimas participan en la fermentación, como puede ser la diastasa o la invertasa. Aunque la única responsable de convertir los hidratos de carbono en etanol y dióxido de carbono es la zimasa. La zimasa es la responsable final de dirigir la reacción bioquímica que convierte la glucosa en etanol. La idea de que una sustancia albuminoide específica desarrollada en la célula de la levadura llega a producir la fermentación fue ya expuesta en el año 1858 por Moritz Traube como la teoría enzimática o fermentativa y, más tarde, ha sido defendida por Felix Hoppe-Seyler hasta llegar al descubrimiento de Eduard Buchner que llegó a hacer la fermentación sin la intervención de células y hongos de levadura. D. Glucolisis La glucólisis es la primera etapa de la fermentación, lo mismo que en la respiración celular, y al igual que ésta necesita de enzimas para su completo funcionamiento 8

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Es una de las rutas más importante por su frecuencia en los seres vivos. El metabolismo de la glucosa comienza con la glucólisis, (ciclo de Embden Meyerhof) acoplada a la ruta de las pentosas. Durante la glucólisis una molécula de glucosa rinde dos moléculas de ácido pirúvico, es decir una molécula de seis átomos de carbono se escinde en dos de tres. Se puede estructurar en 2 etapas: 1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato. Es una fase de alteración química para dejar la molécula útil para la célula. 2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y gliceraldehido. La primera fase Primera fase de la glucólisis 1. La glucosa se fosforila en el alcohol por la hexoquinasa. La hexoquinasa une el fosfato del ATP mediante un enlace fosfoéster y la transforma en Glucosa-6fosfato. La Glucosa-6-P está preparada para los procesos que continúan en la glucólisis. La fosforilación transforma 1 molécula neutra en una molécula cargada negativamente. Hace que ahora, laglucosa-6-P no pueda volver a salir por la membrana debido a su carga negativa. 2. A la célula no le gusta la forma aldosa y hace la forma cetosa (Fructosa-6-P). Es realizado por la fosfoglucosa isomerasa. 3. Implica la adquisición de un segundo fosfato que va a parar al C1 y forma la fructosa-1,6-bisfosfato. Lo realiza la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). La fructosa1,6-bisfosfato es completamente simétrica. La PFK-1 es un enzima clave en la glucólisis. 4. La fructosa-1,6-bisfosfato se parte por la mitad y da dos moléculas (dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehido-3-fosfato (G3P)). La glucólisis se da a partir del gliceraldehido-3-P. El equilibrio está desplazado hacia la dihidroxiacetona-fosfato. Sólo un 5% es Gliceraldehido-3-P. La desaparición continua de G3P transforma la DHAP en G3P. Todo acaba siendo G3P. Segunda fase de la glucólisis A partir del G3P comienzan las transformaciones que dan lugar a Piruvato (Pyr) (reacciones de oxidación).

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO 1. La primera reacción es que el enzima Gliceraldehido-3-Fosfatodeshidrogenasa oxida el grupo aldehído a ácido (gasta un NAD, que se reduce a NADH). Produce un enzima que escapaz de incorporar un fosfato al ácido carboxílico correspondiente. Se forma un éster. La fosforilación a nivel de sustrato se consigue porque hay ATP con un fosfato ya activado.

2. El 1,3-Bisfosfoglicerato cede 1 fosfato para sintetizar ATP. La reacción la cataliza la fosfoglicerato quinasa. El producto de la síntesis de ATP es el 3-fosfoglicerato. Sufre transformaciones que dan lugar a la síntesis de Piruvato. El P3 debe pasar a la posición 2.Se consigue mediante el enzima fosfogliceromutasa. La mutasa tiene un fosfato activo, que se lo da a la posición 2. En un momento hay dos fosfatos, pero luego, se lo quita de la posición 3. Todas las mutasas funcionan así. Se hace para liberar el OH en la posición 3. 3. Se produce la deshidratación del OH. Se transforma el alcohol en enol, por la enolasa. Es parecido a Piruvato, pero con enol y un fosfato. Se llama fosfoenol piruvato (PEP). Es una molécula muy inestable que se transforma en Piruvato por la Piruvato quinasa y se acopla la energía que se desprende para sintetizar ATP. ANÁLISIS ESTEQUIOMÉTRICO DE LA GLUCÓLISIS

Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

La glucólisis es una vía que transforma la glucosa en Piruvato y, a su vez, reduce 2 NAD+ del citosol a NADH y usa 2 Adp para formar 2 ATP. La célula en cuanto puede, transforma otros monosacáridos a moléculas que están en la vía de la glucólisis.

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Figura 2. Diagrama de la glucolisis Limitaciones del Proceso La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del etanol son complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de los parámetros intervinientes durante el proceso de fermentación. Algunos de ellos se deben tener en cuenta en la fermentación alcohólica industrial. En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar algunos de los más importantes como son:  Concentración de etanol resultante. Una de las principales limitaciones del proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan a producir durante la fermentación, algunos microorganismos como el Saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentración en volumen. En ingeniería bioquímica estos crecimientos se definen con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier, Moser y de la ecuación de Monod.  Acidez del substrato. El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un 11

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles óptimos de acidez durante la fermentación usualmente mediante el empleo de disoluciones tampón. Los ácidos de algunas frutas (ácido tartárico, málico) limitan a veces este proceso.  Concentración de azúcares. La concentración excesiva de hidratos de carbono en forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentración puede frenar el proceso. Las concentraciones límite dependen del tipo de azúcar así como de la levadura responsable de la fermentación. Las concentraciones de azúcares afectan a los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.  Contacto con el aire. Una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón por la que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.  La temperatura. El proceso de fermentación es exotérmico, y las levaduras tienen un régimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura óptimos, se debe entender además que las levaduras son seres mesófilos. Si se expone cualquier levadura a una temperatura cercana o superior a 55 °C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. La mayoría cumple su misión a temperaturas de 30 °C.  Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentación las cepas crecen en número debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se incremente la concentración de levaduras.

E. CICLO DE KREBS. El ciclo de Krebs se desarrolla en las mitocondrias. El ácido pirúvico formado durante la glucólisis se convierte en acetil CoA, el cual a través del ciclo de krebs se transforma en anhídrido carbónico. El paso de ácido pirúvico a acetil CoA tiene lugar en la matriz mitocondrial y es catalizado por la piruvato deshidrogenasa. El acetil CoA ahora entra en el ciclo de krebs uniéndose al ácido oxalacético para formar el ácido cítrico, por medio de una isomerasa se transforma en isocítrico, el cual por medio de una descarboxilasa da lugar al alfa-cetoglutárico, este paso supone la liberación de anhídrido carbónico y NADH.

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Figura 3. Diagrama del ciclo de krebs El proceso comienza con la oxidación del piruvato, produciendo un acetil-CoA y un CO2. El acetil-CoA reacciona con una molécula de oxalacetato (4 carbonos) para formar citrato (6 carbonos), mediante una reacción de condensación. A través de una serie de reacciones el citrato se convierte de nuevo en oxalacetato. El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. También consume 2 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+. El resultado de un ciclo es (por cada molécula de piruvato): 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH2, 2CO2 Cada molécula de glucosa produce (vía glucólisis) dos moléculas de piruvato, que a su vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molécula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2. Por cada molécula de acetil CoA se forman dos moléculas de anhídrido carbónico, una GTP, tres NADH y un FADH2, el ciclo necesita la incorporación de dos moléculas de agua.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO En el ciclo de krebs se encuentran acopladas las lanzaderas, las cuales intervienen en diferentes procesos anabólicos. De esta forma a partir del ciclo de krebs pueden formarse aminoácidos, ácidos grasos incluso glucosa (gluconeogénesis).

Figura 4.Reacciones del ciclo de krebs F. RESPIRACIÓN: La reacción química global de la respiración es la siguiente: C6 H12 O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energía (ATP) En este punto la célula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la glucólisis y dos en el ciclo de Krebs, sin embargo ha capturado electrones energéticos en 10 NADH2 y 2 FADH2. Estos transportadores depositan sus electrones en el sistema de transporte de electrones localizado en la membrana interna de la mitocondria. 14

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO La cadena respiratoria está formada por una serie de transportadores de electrones situados en la cara interna de las crestas mitocondriales y que son capaces de transferir los electrones procedentes de la oxidación del sustrato hasta el oxígeno molecular, que se reducirá formándose agua. Como resultado de esta transferencia de electrones, los transportadores se oxidan y se reducen alternativamente, liberándose una energía que en algunos casos es suficiente para fosforilar el ADP y formar una molécula de ATP. Se trata de la fosforilación oxidativa que permite ir almacenando en enlaces ricos en energía la energía contenida en las moléculasNADH2, FADH2, NADPH2, que se liberan en la glucólisis y en el ciclo de Krebs y que será más tarde fácilmente utilizada. Toda cadena respiratoria que comience por el NAD conduce a la formación de 3 ATP mientras que si comienza por el FAD produce sólo 2ATP. El rendimiento energético del NADP es similar al del NAD, así como el del GTP loes al del ATP. IV.

MATERIALES Y MÉTODOS

A. Materiales e instrumentos

Materiales  Levadura instantánea (Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae)  Agua destilada  Matraces 250 ml.  Algodón  Azúcar Equipos  Brixómetro  Balanza analítica Sartorius B. Metodología

Pesar los matraces, para sacar cálculos posteriores. Preparar dos soluciones de sacarosa al 10% y 20 % 15

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Luego de esto verter en las soluciones 0.3% de levadura, diluirla en la solución y tapar con algodón la boca de los matraces, Tomar peso y °Brix en el tiempo 0, luego tomar peso cada 24 horas, luego de siete pesadas tomar peso y °Brix para los cálculos. Encontrar la pérdida de peso y cantidad de glucosa consumida (°Brix). Determinar el rendimiento real (g etanol/g sacarosa). Calcular el rendimiento teórico y experimental de la levadura. Calcular finalmente la eficiencia de las levaduras. V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Datos preliminares de la Solución de Sacarosa a 10°Brix Solución al 10% de Sacarosa Tiempo

°Brix

Peso (g)

pH

0

9.5

810.24

7.28

1

-

797.54

3.59

2

-

782.24

3.54

3

-

759.42

3.44

4

-

751.23

3.47

5

-

747.35

3.46

6

1

745.06

3.45

Según Casas (1999), si las soluciones de sacarosa donde se va a realizar la fermentación están muy concentradas, las levaduras expuestas en ellas no fermentarán, por lo que se tendría que bajar la concentración de sólidos de la sacarosa y glucosa. En nuestra práctica esto se puede observar que nosotros trabajamos con concentración del 10 y 20% de sacarosa y glucosa y no ha concentraciones mayores ya que las levaduras no fermentarían a más de 30% de concentración. La fermentación está influenciada por varios factores como la temperatura, pH, concentración de azúcares y otras variables que influyen en el crecimiento de los microorganismos (Gómez, et al 2007). 16

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO La temperatura óptima para la formación de alcohol se estima en el rango de 32 °C a 35 °C (Navarro et al, 1986). Es por este motivo que nosotros en nuestra práctica hemos controlado el pH y el °Brix.

Tabla 2. Resultados de la Solución de Sacarosa a 10°Brix Solución de Sacarosa al 10% CO2 producido

m+n

Sacarosa Hidrolizada

65.1800 g 69.5222 g

Glucosa Producida

X+Y

73.1813 g

Respiración

X

30.0709 g

m

44.1040 g

Y

43.1105 g

n

21.0760 g

Fermentación

Etanol ( C2H5OH)

22.0340 g

Rendimiento Teórico

52.6316

(g C2H5OH /gC12H22O11) Rendimiento Experimental

31.6935

(g C2H5OH /gC12H22O11) Eficiencia (n)

60.2176

Según Jeffries (2005), a nivel industrial el contenido de alcohol producido por las levaduras debe estar entre 51% en peso y rendimiento de alcohol en la fermentación debe ser aproximadamente de 7%. En la Tabla 2, vemos que obtuvimos una eficiencia de 60.22% a 10 °Brix, por lo que vemos que no coincide con lo expuesto por el autor, por lo que podemos decir que puede deberse al tipo de levadura que utilizamos.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Tabla 3. Datos preliminares de la Solución de Sacarosa a 20°Brix Solución al 10% de Sacarosa Tiempo

°Brix

Peso (g)

pH

0

19

752.53

7.09

1

-

738.52

3.60

2

-

722.49

3.49

3

-

689.90

3.30

4

-

679.57

3.28

5

-

676.02

3.26

6

3

675.24

3.24

De acuerdo con Cañon, et al (1988); las levaduras llevan a cabo la respiración anaeróbica en presencia de oxígeno y respiración anaerobia en ausencia de oxígeno, en dicha fermentación se produce bióxido de carbono y alcohol etílico, a la vez estas levaduras para metabolizarlas se usarán varias soluciones de carbohidrato para metabolizarlas. En nuestra práctica en las tablas 1 y 3 nos demuestran que los comportamientos de la fermentación son comunes en donde la cantidad de azúcar es representada por los °Brix, los cuales vemos que van disminuyendo durante el tiempo de fermentación (96 horas), por lo que la levadura necesitará un sustrato para que pueda producir su alcohol y CO2 (carbohidratos).

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Tabla 4. Resultados de la Solución de Sacarosa a 20°Brix Solución de Sacarosa al 10% CO2 producido

m+n

Sacarosa Hidrolizada

77.2900 g 122.7235 g

Glucosa Producida

X+Y

129.1826 g

Respiración

X

16.2766 g

m

23.8723 g

Y

112.9060 g

n

55.1985 g

Fermentación

Etanol ( C2H5OH)

57.7075 g

Rendimiento Teórico

52.6316

(g C2H5OH /gC12H22O11) Rendimiento Experimental

47.0224

(g C2H5OH /gC12H22O11) Eficiencia (n)

89.3425

Según Gooding (1997), un incremento en la concentración de etanol supone un obstáculo a medida que pase la fermentación lo cual será un obstáculo para el crecimiento y desarrollo microbiano por los efectos negativos, disminuyendo su calidad y selectividad, por lo que las levaduras en un medio con alta concentración alcohólica pierden propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimas con alta concentración alcohólica. En la práctica en la obtención del etanol se realizó en 2 concentraciones de sustrato del 10 y 20% de sacarosa en lo cual en las Tablas 2, 4 y se presentan los datos obtenidos de la producción del etanol encontrados resultando que la producción de etanol mayor es en el caso de Sacarosa al 20% con un valor de 57.7075. Por lo que podemos decir que a un mayor contenido de sustratos va a implicar una mayor producción de etanol como en el caso de la sacarosa al 20% lo cual se dio en este caso.

Según Navarro (1986), la Sacchormyces cerevisae para producir etanol de sustrato del 10 y 20 % de sacarosa donde la producción máxima de etanol es de 1.496 g/L y 1.45 g/L, las cuales fueron obtenidas en 24 horas de fermentación , por lo que su rendimiento fue de 0.26 y 0.40 de etanol producido por cada gramo de substrato consumido. Estos 19

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO resultados comparándolos con lo de nuestra práctica vemos que son bajos, un indicador de rendimiento de la producción de etanol, es aquel referido al rendimiento teórico (0,52 g etanol/g sacarosa consumida) para nuestro caso estos son 31 y 47% aproximadamente, donde la mayor eficiencia lo presentan las muestras que tienen como sustrato a la sacarosa en concentración del 20% con un valor de 47.0224%.

Tabla 5. Comparación de los valores encontrados en la respiración y Fermentación Valores

Solución 10°Brix

Solución 20°Brix

C6H12O6 consumida en la fermentación

43.1105

112.906

C6H12O6 consumida en la respiración

30.0709

16.2766

CO2 producido durante la Fermentación

21.076

55.1985

CO2 producido durante la Respiración

44.104

23.8723

En la Tabla 5, se indican los resultados de la glucosa consumida durante la fermentación y respiración, el CO2 también para ambos casos. Podemos darnos cuenta que para la solución al 20% existe un mayor consumo de glucosa y una menor producción de CO2 con respecto a la solución del 10%, este resultado indica que en la solución al 20% un mayor porcentaje de la glucosa se degrado por la vía fermentativa y en menor porcentaje por la respiración aerobia en comparación a la otra solución. Esta aclaración se justifica en que por cada 180g de glucosa consumida por fermentación se generan 88g de CO 2 mientras que por respiración se producen 264g de CO2 (Suárez & Íñigo , 2004).

Tabla 6. Rendimiento y Eficiencia de la capacidad fermentativa de la levadura Variable

Solución 10°Brix

Solución 20°Brix

g Alcohol formado

22.034

57.708

Rendimiento (E)

0.3169

0.4702

Rendimiento (T)

0.5263

0.5263

Eficiencia

60.22

89.34 20

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO La levadura Saccharomyces cerevisiae permite una conversión aproximada del 85% al cabo de 32 horas y del 90% al cabo de 75 horas en la producción de etanol. Sin embargo en la práctica obtuvimos una eficiencia de 60.22% para la muestra de 10°Bx iniciales y 89.34% para la muestra de 18°Bx, esto se debe a muchos factores que limitan el proceso. La temperatura de fermentación se encuentra entre 10 y 35 °C, en este intervalo la velocidad se duplica por toda elevación de temperatura de alrededor de 10°C, para caer espectacularmente por encima de 35°C. Estos aumentos d temperatura favorecen la presencia de azúcares residuales y de un rendimiento de alcohol menor (Blouin & Peynaud, 2003). Otro factor que acondiciona el rendimiento es la concentración de azúcares ya que una excesiva concentración de hidratos de carbono en forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentración puede frenar el proceso (Suárez & Íñigo, 2004). De acuerdo con Leveaux & Bouix, 2000 una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón por la que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.

VI.

CONCLUSIONES Se determinó la glucosa consumida para ambas soluciones, siendo para la solución al 10% de sacarosa un consumo de 73.1814 g de los cuales 43.1105 g fueron consumidos por el proceso de fermentación y 30.071g por respiración. Para la solución al 20% de sacarosa el consumo de glucosa fue de 129.1826 g, siendo consumidos 112.906 g por el proceso de fermentación y 16.277g por respiración aerobia. Se determinó además el CO2 producido en ambas soluciones obteniéndose para la solución al 10% una producción de 65.18 g de CO2 del cual le corresponde 21.076 g por el proceso de fermentación y 44.104 g por respiración. Para la solución al 20% el CO2 producido fue de 79.071 g siendo la producción de CO2 de 55.20 g por el proceso de fermentación y 23.87g por respiración.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO También se determinó la cantidad de alcohol producido para ambas soluciones siendo los valores de 22.034g en la solución al 10% con un rendimiento experimental de 0.3169g OH/g Sacarosa y 57.708g en la solución al 20% de sacarosa con un rendimiento experimental de 0.4702g OH/g Sacarosa. La eficiencia de las levaduras fueron de 60.22% en la solución al 10% de sacarosa y 89.34% en la solución al 20%.

VII.

RECOMENDACIONES Tapar bien los balones para que se dé la fermentación en ausencia de oxígeno sino se producirá menos alcohol y esto influirá en el rendimiento. Es recomendable realizar un estudio para optimizar la producción de etanol, modificando las condiciones de fermentación, mediante adición del sustrato a diferentes concentraciones, suplementos nutricionales y reciclado de células y utilización de diferentes cepas que sean tolerantes al etanol. La fermentación alcohólica aparte de ser un proceso relativamente barato para la obtención de alcohol, es poco susceptible a contaminación y posee altos rendimientos. Es por ello que se recomienda buscar un sustrato más barato proveniente de algún desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa.

VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Blouin, J., & Peynaud, B. (2003). Enología práctica: conocimiento y elaboración del vino. Madrid: Mundi-Prensa Libros. CAÑÓN, G., ALDANA, O (1988). Estudio de la fermentación alcohólica por cochada empleando reactores de lecho fijo. Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero Químico, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. CASAS, E. (1999). Microorganismos responsables de alteraciones en alimentos altamente azucarados. Universidad Complutense de Madrid. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología. Madrid, España.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Gómez, S. et at; 2007. Capacidad fermentativa de cepas de Saccharomyces Cerevisiaenativas de la región productora de mezcal de Durango. XII Congreso Naci onal deBiotecnología y Bioingeniería. México. Navarro, A. et al; 1986. Producción de etanol por fermentación con alta concentración levaduras. Revista Argentina de Microbiología 18 (1): 7-11 GOODING, N. (1997). Balance de materia. Quinta edición, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. JEFFRIES, T. (2005). Ethanol fermentation on the move. Nat biothec., vol. 23, n°1. Leveaux, J., & Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Zaragoza: Editorial Acribia. NAVARRO, A. (1986). Producción de etanol por fermentación con alta concentración de levaduras. Revista Argentina de Microbiología 18 (1): 7-11. Suárez, J., & Íñigo, B. (2004). Microbiología Enológica: fundamentos de vinificación. Madrid: Ediciones Mundi-Prensa.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ANEXOS ANEXO 1. A.

Cálculos para para la solución de Sacarosa a 10°Brix

 Cálculo del peso de CO2 CO2 producido = 810.24 – 745.06 =65.18 g CO2  Cálculo del peso de sacarosa consumida 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 = (9.5(810.24) − 1(745.06))/100 = 69.5222 𝑔 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎  Cálculo del peso de glucosa consumida 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 = 69.5222 𝑔 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 ×

360 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 = 73.1813𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 342 𝑔 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎

 Respiración 𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 + 𝟔𝑶𝟔 → 𝟔𝑪𝑶𝟐 + 𝟔𝑯𝟐 𝑶 180g

264g

192g

73.1813 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ×

108g

264𝑔 𝐶𝑂2 = 107.3325𝑔 𝐶𝑂2 180𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

 Fermentación 𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 → 𝟐𝑪𝟐 𝑯𝟓 𝑶𝑯 + 𝟐𝑪𝑶𝟐 92g

180g

73.1813 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ×

73.1813 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ×

88g

88𝑔 𝐶𝑂2 = 35.7775 𝑔 𝐶𝑂2 180𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

92𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 = 37.4038 𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 180𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO  Cálculo del porcentaje de glucosa que va a la respiración 107.3325𝑔 𝐶𝑂2 × (𝐾) + 35.7775𝐶𝑂2 × (1 − 𝐾) = 65.18𝑔 𝐶𝑂2 𝐾 = 0.4109 m=44.104 ; n=21.076  Respiración 𝑋 = 73.1813 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 × 0.4109 = 𝟑𝟎. 𝟎𝟕𝟎𝟗 𝒈 𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂  Fermentación 𝑌 = 73.1813 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 × 0.5891 = 𝟒𝟑. 𝟏𝟏 𝒈 𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂 43.11 𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ×

92𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 = 𝟎. 𝟓𝟖𝟑𝟏 𝒈 𝑪𝟐 𝑯𝟓 𝑶𝑯 180𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

 Rendimiento Experimental 𝒓𝒓𝒆𝒂𝒍 =

22.034𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 𝟎. 𝟑𝟏𝟔𝟗𝒈 𝑪𝟐 𝑯𝟓 𝑶𝑯 = 69.5222𝑔 𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝒈 𝒔𝒂𝒄𝒂𝒓𝒐𝒔𝒂

 Eficiencia

𝒆=

𝒓𝒓𝒆𝒂𝒍 𝒓𝒕𝒆𝒐𝒓𝒊𝒄𝒂

0.3169𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 𝑔 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 = × 100 = 𝟔𝟎. 𝟐𝟏𝟕𝟔% 0.5263𝑔 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 𝑔 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ANEXO 2.

Figura 1. Materiales biológicos utilizados

Figura 2. Materiales biológicos utilizados

Figura 3. Soluciones de sacarosa de 10 y 20 °Brix

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