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CUADERNO TEÓRICO UNIDAD TEMÁTICA IV Modo de operación de biorreactores

Cátedra: Biotecnología de los Alimentos Carrera Ingeniería en Alimentos Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Universidad Nacional de Misiones (UNaM)

- María Alicia Martos -

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EDITORIAL UNIVERSITARIA

San Luis 1870 Posadas - Misiones – Tel-Fax: (03752) 428601 Correos electrónicos: [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] Página web: www.editorial.unam.edu.ar

Colección: Cuadernos de Cátedra Coordinación de la edición: Claudio Oscar Zalazar

ISBN 978-950-579-212-2 Impreso en Argentina

©Editorial Universitaria Martos, Maria Alicia Modo de operación de biorreactores. - 1a ed. - Posadas : EDUNaM Editorial Universitaria de la Universidad Nacional de Misiones, 2011. Internet. ISBN 978-950-579-212-2 1. Biotecnología. 2. Microbiología. 3. Enseñanza Superior. I. Título CDD 576.16 Fecha de catalogación: 25/08/2011

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ÍNDICE 1. Cultivo Batch ..............................................................................................................6 1.1. Curva de crecimiento microbiano .............................................................................6 1.1.1. Fase lag o fase de latencia ...............................................................................7 1.1.2. Fase de crecimiento exponencial .....................................................................8 1.1.3. Fase de desaceleración ....................................................................................8 1.1.4. Fase estacionaria (crecimiento no balanceado) ..............................................8 1.1.5. Fase de declinación o muerte............................................................................9 1.2. Balances de materia en un biorreactor .......................................................................9 1.2.1. Balance para biomasa ....................................................................................10 1.2.2. Balance de sustrato .........................................................................................15 1.2.3. Balance de producto .......................................................................................17 1.3. Tiempo total para un ciclo de reacción en discontinuo ...........................................17 1.4. Productividad en cultivo batch ................................................................................18 1.5. Desventajas del cultivo Batch ..................................................................................20 1.6. Problemas de aplicación ..........................................................................................21 2. Cultivo continuo ........................................................................................................25 2.1. Balance de materia en el reactor ..............................................................................26 2.1.1. Balance de biomasa ........................................................................................27 2.1.2. Balance de Sustrato ........................................................................................28 2.1.3. Balance de producto .......................................................................................35 2.2. Determinación de las constantes cinéticas (ks, ms) y rendimiento .........................36 2.2.1. Medición de ks y μm .......................................................................................36 2.2. 2. Medición del coeficiente de mantenimiento (ms ) y rendimiento verdadero..37 2.3. Rendimiento experimental en cultivo continuo .......................................................38 2.4. Productividad en cultivo continuo............................................................................38 2.5. Comparación productividad en cultivo batch vs continuo .......................................39 2.6. Ventajas y desventajas del cultivo continuo.............................................................40 2.7. Diferencias entre cultivo discontinuo y continuo .....................................................41 2.8. Algunas aplicaciones del cultivo continuo ...............................................................41 2.9. Problemas de aplicación ...........................................................................................42

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3. Cultivo discontinuo alimentado (Batch Alimentado) .............................................46 3.1. Balance de materia en el reactor ..............................................................................46 3.1.1. Balance de Sustrato ........................................................................................48 3.1.2. Balance para biomasa ....................................................................................49 3.2. Diseño de un cultivo batch alimentado ...................................................................51 3.3. Variación de μ durante el cultivo batch alimentado ...............................................52 3.4. Aplicaciones cultivo batch alimentado ....................................................................54 3.5. Problemas de aplicación ..........................................................................................56 4. Bibliografía.................................................................................................................58

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Martos, María Alicia Ingeniero Químico. Fac. de Cs. Ex. Qcas. y Nat.. UNaM. 1986. Magister en Tecnología de los Alimentos. Fac. de Cs. Ex. Qcas. y Nat. UNaM. 2003. Alumna del Doctorado Regional en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Carrera de Postgrado en Red de Universidades Nacionales, Facultad de Agroindustrias, Universidad Nacional del Nordeste (tesis en ejecución). Profesor Adjunto, dedicación exclusiva. Cátedras: Biotecnología de los Alimentos (carrera Ingeniería en Alimentos), Ingeniería Bioquímica y Biotecnología (carrera Ingeniería Química), Fac. .de Cs. Ex..Qcas. y Nat. UNaM. Colaboración en el dictado de temas teóricos correspondientes al curso Química de los Alimentos. Maestría en Tecnología de los Alimentos. Fac. de Cs. Ex. Qcas. y Nat. UNaM. Miembro del Consejo Departamental del Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Investigadora Categoría III. Directora Proyectos relacionados a la producción y aplicación de enzimas pécticas por microorganismos autóctonos. Autora de diversos trabajos presentados a Congresos y otros publicados en revistas nacionales o extranjeras. Directora y co-directora de diversas tesis de posgrado (maestría) y de grado, finalizadas y en ejecución.

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1. CULTIVO BATCH El reactor es el corazón de cualquier proceso de fermentación o conversión enzimática. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control de pH, etc. Existen tres modos principales de operación de los biorreactores: discontinuo (batch), semicontinuo (batch alimentado) y continuo. Un proceso discontinuo opera en un sistema cerrado. Toda la materia se añade al sistema al principio del proceso, el proceso se cierra y los productos se recogen únicamente cuando el proceso ha finalizado. Un proceso semicontinuo permite la entrada o salida de masa pero no ambas. Un proceso continuo permite la entrada y la salida de materia, si las velocidades de entrada y de salida son iguales, el proceso continuo puede operar indefinidamente. Mediante los correspondientes balances de materia es posible conocer las concentraciones finales de sustrato, producto y biomasa y el tiempo requerido para la conversión. El cultivo discontinuo o cultivo batch es el método de cultivo más simple, consiste en un recipiente cerrado en el que no existe aporte de nutrientes ni egreso de productos. El sustrato se añade al comienzo del proceso y los productos son retirados solo al finalizar el mismo. El coste de operación de un reactor discontinuo depende del tiempo necesario para alcanzar la concentración de producto o el nivel de conversión de sustrato deseado. Es por lo tanto importante poder determinar el tiempo para finalizar las reacciones en un reactor discontinuo. En un cultivo batch el microorganismo, cuando se siembra en un medio de cultivo adecuado, crece hasta que se agota un nutriente esencial (sustrato limitante) o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. 1.1. Curva de crecimiento microbiano La evolución del cultivo con el tiempo sigue una curva típica denominada “curva de crecimiento microbiano”. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases (Fig. 1.1): fase lag o fase de latencia, fase de crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.

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Figura 1.1: Curva de crecimiento microbiano 1.1.1. Fase lag o fase de latencia El crecimiento del microorganismo no comienza inmediatamente después de la inoculación del medio de cultivo, necesita un período de adaptación a las condiciones de cultivo, denominado fase lag o fase de latencia. Durante este período no hay división celular pero sí aumento de la masa individual de los microorganismos. La duración de esta etapa depende de la cantidad inicial de inóculo, edad y estado fisiológico de las células. La duración de la fase de latencia depende especialmente del cultivo previo y de la edad del inóculo. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria de crecimiento, las células tienen que alcanzar las nuevas condiciones de crecimiento mediante la síntesis de RNA, ribosomas y enzimas. Si la FCE del medio de cultivo son distintas de las del cultivo previo, la adaptación a las nuevas condiciones se halla, generalmente, ligada a una síntesis “de novo” de enzimas que no eran necesarias en el otro cultivo y que por lo tanto no habían sido sintetizadas. La formación de esas enzimas nuevas es inducida por el nuevo sustrato. En los procesos comerciales es conveniente reducir la fase de latencia tanto como sea posible no solo para evitar la pérdida de tiempo sino también porque se consumen nutrientes para para mantener el cultivo viable en dicho período previo al crecimiento. El tiempo de la fase de latencia puede reducirse usando un inóculo relativamente grande (3-10%) de un cultivo en fase exponencial que haya sido preparado en el mismo medio (o similar) que el utilizado para la fermentación. Para acortar la fase lag, el inóculo debe ser tomado de la fase logarítmica y ser transferido a condiciones lo mas semejante posibles a las que se encontraba.

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1.1.2. Fase de crecimiento exponencial (crecimiento balanceado) Finalizada la fase lag, la concentración de biomasa (x) comienza a aumentar en forma lenta y luego más rápidamente, hasta llegar a una etapa en la cual las células crecen a una velocidad específica máxima y constante (m). Esta etapa se denomina fase logarítmica o fase exponencial y representa el mayor potencial reproductivo de la célula. En esta etapa se tiene un crecimiento balanceado: todos los componentes de las células crecen con la misma velocidad y la composición media de las mismas permanece constante. Al final de esta fase se alcanza la máxima concentración microbiana ( xf = xmax). La fase exponencial o logarítmica de crecimiento se caracteriza por la constancia de la velocidad de división que es una medida específica de cada especie. 1.1.3. Fase de desaceleración Luego de la fase exponencial hay un rápido período de desaceleración causada por el agotamiento de algún nutriente (el sustrato limitante) o por acumulación de inhibidores y por lo tanto  disminuye y tiende a 0. Es una zona muy corta y abrupta si solo hay glucosa como FCE. Pero es suave y larga en medios complejos que tienen peptona, extractos, además de la fuente de carbono. 1.1.4. Fase estacionaria (crecimiento no balanceado) Los componentes de las células no crecen con la misma velocidad y la composición media se modifica. El estrés producido por la falta de nutrientes o por la existencia de subproductos o toxinas inhibidoras generan un medio hostil e induce una reestructuración de las células para adaptarse a las nuevas condiciones. En la fase estacionaria aún pueden utilizarse los productos de reserva., sólo las células muy sensibles mueren instantáneamente. Mientras las células puedan seguir obteniendo la energía necesaria para su mantenimiento, permanecerán viables durante un período relativamente largo. Las células aún son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibióticos, hormonas). Puede ocurrir: 

La concentración másica de células (X) es constante pero baja el número de células viables.

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

X baja por lisis de células. Puede aparecer un segundo período de crecimiento, los productos de lisis o las células muertas constituyen un sustrato alternativo (crecimiento críptico).



X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulación celular produciendo metabolitos secundarios.

1.1.5. Fase de declinación o muerte En esta última etapa, la concentración celular disminuye como resultado de la escasez de reservas de energía o por autolisis. Al igual que el crecimiento, la muerte de las células es constante y en un gráfico semilogarítmico esta fase se representa a través de una línea recta. 1.2. Balances de materia en un biorreactor Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor:

F1 Ci2

F2 Ci2

Ci, V

 velocidad  Veloc.  Veloc.  Veloc.  Veloc.                acumulación   Entrada   Salida   Form.  Cons.  d (VC i )  F1  C i1  F2  C i  V  r fi  V  rci dt

(ec.1.1)

Siendo: V: volumen del cultivo F1: caudal de alimentación F2: caudal de salida Ci1: concentración del componente i en la alimentación. Ci: concentración componente i a la salida (hipótesis mezclado perfecto: Ci2 = Ci rfi: velocidad de formación del componente i rci: velocidad de consumo del componente i

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Considerando que en un cultivo batch los caudales de entrada (F1) y salida (F2) son nulos y por lo tanto V se mantiene constante en el tiempo la ecuación 1 se reduce a:

dCi  r fi  rci dt

(ec.1.2)

Para un determinado sustrato o producto la velocidad volumétrica de consumo o formación del producto será: dC i  r fi dt

dC i   rci dt

o

Si se grafica la disminución de la concentración de un determinado sustrato en función del tiempo de reacción, la velocidad volumétrica se puede calcular como la pendiente en cada instante. A partir de la ecuación general (ec.1.2), se harán balances para biomasa, sustrato y producto. 1.2.1. Balance para biomasa Aplicando la ec. 1.2 a la biomasa se obtiene:

dX  rx dt

(ec.1.3)

Siendo: rx: velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h). En un cultivo batch se puede medir la velocidad de crecimiento a los distintos tiempos, midiendo en cada punto la pendiente (Fig. 1.2). x

t Figura 1.2: representación de la concentración de biomasa (x) en función del tiempo

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La ecuación 1.3 se puede escribir de la siguiente manera, recordando que rx = . X:

rx 

dX X dt

(ec.1.4)

Siendo: dX : velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h) dt µ: velocidad específica de crecimiento (representa la velocidad de crecimiento por unidad de biomasa. (seg-1). X: biomasa (gcel.secas/l) Recordando la ec de Monod y reemplazando en la ec. 1.4 se obtiene: :

rx 

dX S  m X dt ks  S

(ec. 1.5)

µm = velocidad específica de crecimiento máxima ks = constante de saturación, da una idea de la afinidad del microorganismo por el sustrato (a menor ks, mayor afinidad). Al principio del cultivo batch (fase de crecimiento logarítmico o exponencial), todos los nutrientes son saturantes, aún el sustrato limitante, (S >> ks) y el microorganismo crecerá a m máximo y constante. En este período, la velocidad de crecimiento es independiente de los nutrientes, el microorganismo crecerá a m máximo y constante y resulta en una cinética de primer orden:

rx 

dX  m  X dt

(ec.1.6)

Integrando la ec. 1.6 y suponiendo que a t = 0, X =X0 se obtiene: ln X  ln X 0   m  t

(ec.1.7)

Esta fase se denomina fase crecimiento logarítmico porque si se grafica el logaritmo de la concentración de células (x) frente al tiempo (ec. 1.7) se obtiene una línea recta 11

cuya pendiente es µm (la velocidad específica máxima de crecimiento) y ordenada al origen ln Xo. Por lo tanto durante la fase logarítmica, la velocidad de crecimiento (rx)

puede

describirse por una ecuación de primer orden (ec.1.6), considerando que en esta fase el sustrato limitante está en exceso y la velocidad específica de crecimiento es constante y máxima en las condiciones que se opera se denomina entonces µmax = velocidad específica de crecimiento máxima. La ec. 1.7 se puede expresar como: X f  X o  e  m t

(ec.1.8)

Por ello a esta fase se la denomina fase logarítmica o exponencial. Por lo tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta exponencialmente y también lo hace rx, reemplazando la ec. 1.8 en la ec. 1.6 se obtiene: rx   m  X 0  e  m t

(ec.1.9)

Si antes de la fase exponencial se presenta fase lag, se debe corregir la ec. 1.7, lo que consiste en restarle el tiempo transcurrido hasta que comienza efectivamente el crecimiento (tlag), correspondiente al período lag. ln X  ln X 0   m  (t  t lag )

(ec.1.10)

Normalmente esta fase no es deseable ya que significa una pérdida de tiempo, por lo que usualmente se trata de minimizarla. Una forma de lograrlo consiste en hacer crecer el inóculo en un medio de cultivo igual al que se va a emplear posteriormente y además transferirlo cuando las células se encuentren en plena fase exponencial. A partir de la ec. 1.7 se puede determinar el tiempo de duplicación (o tiempo de generación), que es el tiempo necesario para que la biomasa se duplique, considerando para t = td y X= 2 X0 se obtiene:

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ln 2 X 0  ln X 0   m  t d  t d 

ln 2

m

(ec.1.11)

Es decir que td es inversamente proporcional a la velocidad con que crece, cuanto más rápido crece (> m), menor será el tiempo que tarda en duplicarse. En la Tabla 1.1 se presentan valores de μm y td para diferentes organismos. Tabla 1.1: velocidades de crecimiento de microorganismos y células Cultivo

μm

Bacterias Levaduras

y

Tiempo de duplicación (h)

0,6 – 1,4

0,5-1,15

hongos 0,2 – 0,6

1,15-3,0

filamentosos Células animales

0,01 -0,04

17-70

Células vegetales

0,0007-0,03

23-100

¿Que tan constante es el μm? Un microorganismo crecerá a un

μm

en un determinado medio de cultivo y

condiciones de cultivo (pH, Temp., etc.), si se le cambia el medio de cultivo, el sustrato limitante, o las condiciones de cultivo cambiará el μm. A medida que el cultivo transcurre, s disminuye (y por lo tanto rx), se está en la fase de desaceleración. Esta fase es muy corta y abrupta en medios definidos, si solo hay una FCE, pero es suave y larga en medio complejos que tienen peptona, extractos, etc., además de la FCE. Finalmente S = 0 (fase estacionaria) y rx = 0. No se acumulan más células en el reactor y se está en la fase estacionaria. En este momento se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el batch (fase estacionaria). En la gráfica de la ec. de Monod (Fig.1.3) se observan dos zonas: a) Zona A-B: que corresponde a la fase de crecimiento exponencial, con sustrato en exceso (s>> ks) y un crecimiento con  = m (cultivo irrestricto). b) Zona B-C: que se presenta cuando s se va agotando y esta en el orden de ks, la velocidad de crecimiento depende de la concentración externa del sustrato limitante, en esta zona juega la ecuación completa de Monod. Esta zona corresponde a la fase de

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desaceleración de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase exponencial al inicio de la estacionaria. C µ

B

A

µ

Zona de sustrato saturante

s Figura 1.3: efecto de la concentración de sustrato limitante en la velocidad específica de crecimiento.

Puesto que ks es muy inferior a la concentración de sustrato de partida, en un cultivo batch, s permanece > 10 ks durante la mayor parte del período del cultivo. Esto explica porque  permanece constante e igual a µm en los cultivos discontinuos hasta que el medio está prácticamente agotado de sustrato. Cuando finalmente s se sitúa por debajo de 10 ks, la transición desde la fase de crecimiento logarítmico a la estacionaria puede ser muy brusca ya que el bajo nivel de sustrato remanente se consume rápidamente debido al gran número de células presentes. La medición de m a partir de datos de reactor discontinuo es relativamente sencillo. Si todos los nutrientes están en exceso, la velocidad específica de crecimiento durante la fase de crecimiento exponencial es igual a la máxima velocidad específica de crecimiento. La concentración final de biomasa xf, se puede calcular si se conoce el rendimiento Yx/s

Yx / s 

Yx / s 

X S

(g biomasa formada/g sustrato consumido)

X f  Xo S0  S f

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Si S es limitante Sf = 0, por lo tanto:

Yx / s 

X f  Xo S0

Conociendo el valor de Yx/s se puede calcular la concentración final de biomasa.

X f  X 0  Yx / s  S 0

Para obtener la máxima concentración de biomasa se debe tratar de a) minimizar la fase de latencia, utilizando inóculo activo (en la fase logarítmica) (5 al 10 %), proveniente de un medio de cultivo de composición similar que el del medio para la fermentación, b) aumentar la velocidad en la fase logarítmica, utilizando un medio de cultivo y condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento del microorganismo, c) maximizar la extensión de la fase logarítmica, utilizando una cepa de alta tolerancia hacia los metabolitos formados y con elevada afinidad hacia el sustrato (bajo valor de ks).

Validez de la ley de crecimiento exponencial La ley de crecimiento exponencial es válida siempre que tanto las condiciones ambientales como la constitución de la biomasa sean constantes. El crecimiento de hongos filamentosos muestran divergencia de la ley de crecimiento exponencial o bien porque forman pellets en los que la biomasa no está homogéneamente dispersada en el medio de cultivo o porque el suministro de oxígeno se vuelve limitante del crecimiento.

1.2.2. Balance de sustrato Apliquemos la ec. 1.2 al sustrato limitante del crecimiento en un fermentador discontinuo. Considerando que el sustrato en un cultivo batch no entra ni sale del reactor y no se genera por lo que rf = 0, la velocidad volumétrica de utilización de sustrato será:

dS  rs dt

(ec.1.12)

La expresión para rs dependerá tanto de si se forma producto extracelular en el cultivo como de la relación existente entre la síntesis de producto la generación de energía en la célula. 15

Si no hay formación de producto o este está asociado al metabolismo energético el consumo de sustrato viene expresado por la ecuación de Pirt :

rs 

r dS  x  ms  X dt Yx/ s

Recordando que rx = .x, se obtiene:

rs 

dS   X   ms  X dt Yx/ s

En fase logarítmica  = m y X = Xo . em.t por lo tanto:  dS   m   m s   X 0  e  m t dt  Yx/ s 

(ec.1.13)

Integrando esta expresión con la condición t=0, S = S0 y considerando mantenimiento despreciable:

S  S0 





X0  e  m t  1 Y x/s

(ec.1.14)

Esta ecuación permite calcular la concentración de sustrato residual (S) al tiempo t, siempre que el proceso esté dentro de la fase logarítmica. A medida que el cultivo transcurre, S disminuye según la ec.1.14, hasta que llega a la condición en que S es comparable a ks, entrando en la fase de desaceleración y finalmente S = 0 en la fase estacionaria. El tiempo de cultivo necesario para alcanzar una determinada conversión de sustrato se obtiene de la integración de la ec. 1.14:

    S0  S f 1   ln 1  tc    m  1 m     s   X 0    Yx / s  m  

(ec.1.15)

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Si se desprecian los requerimientos de mantenimiento celular:

tc 

 Y  ln 1  x / s S 0  S f  xo m   1

(ec.1.16)

1.2.3. Balance de producto Aplicando la ec. 1.2 al producto y considerando que en un cultivo batch el producto no entra ni sale del reactor y no se consume por lo que rc = 0, se obtiene:

dP  rp dt

(ec.1.17)

Recordando que para todo tipo de producto rp = qp . X, donde qp es la velocidad específica de formación de producto:

dP  rp  q p  X dt

(ec.1.18)

En la fase de crecimiento logarítmico, X viene dado por X = Xo . em.t, reemplazando en la ec. 1.18 se obtiene:

dP  q p  X 0  e  m t dt

(ec.119)

Si qp es constante la ec. 1.19 puede integrarse con la condición inicial P = P0 a t = 0, obteniéndose una expresión que permitiría calcular el tiempo de cultivo en discontinuo en función de la concentración de producto final:

tp 

   ln 1  m  Pf  P0   m  x0 q p  1

(ec.1.20)

1.3. Tiempo total para un ciclo de reacción en discontinuo

En la práctica en los procesos discontinuos, además del tiempo del proceso fermentativo (tb), existen largos períodos improductivos, como: El tiempo necesario para recoger el contenido del reactor (thv).

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Tiempo para limpiar, esterilizar y preparar de nuevo el fermentador para la siguiente operación (tp). Para un cultivo celular se tiene además un tiempo de adaptación o fase lag (tl), tras la inoculación durante el cual no existe crecimiento ni formación de producto Por lo tanto el tiempo no productivo total (tnpt) será (Fig. 1.4): tnpt = thv

+

tp

+

tl

El tiempo total de que dura el cultivo en un reactor discontinuo tT será: tT = tnpt + tb

Figura 1.4: Tiempos de preparación, adaptación, reacción y recolección en la operación de un fermentador discontinuo.

1.4. Productividad en cultivo batch

La productividad de biomasa (o producto) de un proceso fermentativo puede describirse como la cantidad de biomasa (o producto) obtenida por unidad de tiempo: P = Concentración producto/tiempo de fermentación (g/l.h) Para calcular la economía de un proceso se deben considerar varios aspectos: el tiempo de producción (de fermentación), tiempo de limpieza y acondicionamiento del fermentador, tiempo de esterilización, etc. Stanbury y Whitaker (1984) definieron la productividad de un cultivo batch (Pb) mediante la expresión:

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Pb 

X tT

(g/l.h)

(ec. 1.21)

Siendo: tT: Tiempo total que dura el cultivo en un reactor discontinuo = tnpt + tb tnpt : Tiempo no productivo total. tb: Tiempo del proceso fermentativo (tiempo en que el microorganismo crece a µm). En la Figura 1.5, la pendiente de la curva de producción de biomasa (o formación de producto) al final de la fase exponencial, es una medida de la productividad máxima y al final de la fase estacionaria, indica la productividad total. Que el proceso termine al tiempo de la productividad máxima o mas tarde, depende de los costes de operación, que incluyen la energía, costes de mano de obra, capacidad del sistema. En fermentaciones a tiempos cortos, (8-70 h), el tiempo para la puesta a punto es significativo mientras que en fermentaciones largas, (< 3 días) el tiempo de puesta a punto es menos crucial.

Figura 1.5: Productividad total y productividad máxima

El tiempo del proceso, durante la fase exponencial se obtiene despejando tb de la ec. 1.7:

tb 

1

m

 ln

X X0

(ec.1.22)

Además ΔX se puede obtener a partir del rendimiento:

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X  Yx / s  S R

(ec.1.23)

Reemplazando en la ec. 1.21 se obtiene la ecuación que permite determinar la productividad en un cultivo batch:

Pb 

Yx / s  S R   m xf ln   m  t npt x0

(ec.1.24)

1.5. Desventajas del cultivo Batch 

Dificultad de controlar el μ, excepto variando la composición del medio o las condiciones de proceso.



Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del medio o toxicidad de nutrientes.



Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir oxígeno.



Tiempos muertos entre procesos que disminuye la productividad.

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1.6. Problemas de aplicación 1. Una población de levaduras crece en un medio limitado por glucosa partiendo de una

concentración inicial de este sustrato de 22 g/l. Se logra una concentración de biomasa de 5,67 g/l quedando remanentes 4,36 g/l de glucosa. ¿Cuál es el rendimiento alcanzado?. Considere X0 = 0,2 g/l. 2. a) Calcule la cantidad de biomasa obtenida al disminuir la velocidad de crecimiento

al 95% de m, en un cultivo de Saccharomyces cerevisiae que crece en un medio conteniendo glucosa como sustrato limitante. ( X0 = 0, S0 = 20 g/l, ks = 25 mg/l, Yx/s = 0,5). b) Sabiendo que ks = 4 mg/l y S0 = 20 g/l, calcule el porcentaje de sustrato residual. Compare con el punto anterior.

3. La velocidad específica máxima de un microorganismo desarrollado aeróbicamente

en cultivo batch es de 0,327 h-1. Suponiendo que el período de latencia es despreciable, calcule la concentración de biomasa seca que se obtiene a las 12 h de proceso, partiendo de una concentración de 0,2 g/l de células secas. 4. La concentración celular en un cultivo puro de bacterias alcanza su valor máximo de

6,67 g/l en 6 h. La velocidad máxima de crecimiento es de 0,432 h-1. Calcule la concentración inicial de biomasa. 5. En un experimento de laboratorio se inocularon diferentes medios de cultivos con una

suspensión de una bacteria aerobia facultativa (Escherichia coli). El medio sintético empleado en todos los casos contiene la misma concentración de sales y fuente nitrogenada. Las diferencias entre los mismos se observa en la siguiente tabla:

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Medio de cultivo A

Glucosa inicial (g/l) 5

PH (constante Volumen de medio en durante el cultivo) erlenm. de 500 ml 7 100

B

10

7

100

C

10

3

100

D

10

7

300

Los resultados obtenidos se indican en el siguiente gráfico:

Ln x

Tiempo Indique a qué tratamientos de la tabla le corresponden cada una de las curvas obtenidas. Justifique sus respuestas. 6. Un microorganismo crece aeróbicamente en cultivo batch, utilizando glucosa como

sustrato limitante: a) ¿Qué concentración de glucosa debería agregar al medio de cultivo si desea obtener una concentración de biomasa final de 3,29 g/l (x0 = 0,16 g/l), suponiendo que trabaja con rendimiento máximo teórico. b) Sabiendo que el valor de m es de 0,35 cuanto tiempo debería operar el reactor. c) ¿Si se duplicara la concentración de glucosa inicial que efecto tendría en la curva de crecimiento microbiano?. 7. Un microorganismo aerobio crece en un medio limitado por glucosa. Sabiendo que su

tiempo de duplicación es de 1,98 h y considerando despreciable el período de latencia: a) ¿Cuánto tiempo debe operar el fermentador para obtener una concentración de biomasa seca de 3,29 g/l. (Xo = 0,2 g/l). b) ¿Qué concentración de sustrato limitante habría que agregar al medio, sabiendo que su rendimiento (Yx/s) = 0,45. 22

8. La velocidad de consumo de sustrato en un cultivo bacteriano está representada,

según Pirt, por medio de la siguiente ecuación: rS 

rX  mS  x YX / S

Se hace crecer un microorganismo para obtener biomasa, utilizando metanol como FCE y NH3 como FN. El rendimiento verdadero (y´x/s) es de 0,5 c-molx/c-mols siendo ms de 0,05 c-mols/c-molx.h. Calcular el rendimiento celular cuando el microorganismo crece a dos condiciones:  de 0,05 h-1 y 1 h-1. Explique brevemente los resultados obtenidos. 9. Un microorganismo crece aeróbicamente en cultivo batch, utilizando metanol como

FCE y amonio como FN. a) ¿Cuánto tiempo debe operar el reactor para obtener una concentración final de biomasa de 3,5 g/l?. Considere despreciable el período de latencia. b) ¿Qué concentración de sustrato debería agregar al medio de cultivo sabiendo que el rendimiento verdadero (y`x/s) es de 0,5 c-mol x/c-mol s, y el coeficiente de mantenimiento (ms) es de 0,04 c-mols/c-molx.h. Datos: X0 = 0,16 g/l, m = 0,35 h-1 10. Se cultivó un microorganismo aerobio estricto en erlenmeyers agitados, en

condiciones óptimas de pH, y temperatura, utilizando un medio de cultivo a base de glucosa. Los valores obtenidos durante la fase de crecimiento exponencial del cultvio fueron los siguientes: Tiempo (h)

X (g/l)

0

1

Glucosa residual (g/l) 40

2

1,1

39,2

4

1,4

36

6

2,8

29,7

8

5,6

17,3

10

11,2

16

Considere que no hubo fase lag y calcule: El valor de max.

23

El rendimiento experimental de biomasa. ¿Qué concentración de glucosa agregaría al medio de cultivo si desea obtener una concentración de biomasa final de 25 g/l? ¿En cuánto tiempo se fermentarán esa cantidad de glucosa? Si se variara el pH del medio de cultivo, ¿cómo influiría en la curva de crecimiento microbiano? 11. Un cultivo de levadura de composición standard en batch, transcurre

exponencialmente a un max = 0,45 h-1, usando glucosa como fuente de energía y amonio como fuente de nitrógeno. La energía de mantenimiento ms es de 0,012 c-mol s/c-mol x . h y su rendimiento verdadero (y´x/s) 0,55 c-molx/cmol s. ¿Cuál será el Yx/s real del proceso? ¿En cuánto tiempo se fermentarán 100 g/l de glucosa?

24

2. CULTIVO CONTINUO

Un cultivo continuo es esencialmente un sistema en el que se alimenta en forma continua el reactor con medio fresco y del cuál se retira en forma continua medio de cultivo agotado, junto con el (o los) productos de reacción (Fig.2.1) .

Figura 2.1: Biorreactor continuo

El cultivo continuo opera con bajas concentraciones de nutriente limitante, es decir en la zona de cultivos restrictos, zona en la cual la velocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de dicho nutriente. Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F y por un rebalse se mantiene el volumen constante. El líquido que sale del biorreactor a un caudal F, tendrá células y la concentración de nutrientes será menor que en el caudal de entrada debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos. Los parámetros de operación característicos en los reactores continuos son: a) La velocidad de dilución: D; b) El tiempo de retención:. tR. La velocidad de dilución D, se define como la relación entre el caudal de alimentación, F y el volumen de cultivo, V (D = F/V). Siendo: D: velocidad de dilución (h-1) = nº de volúmenes de medio que pasan a través del reactor por hora.

25

El tiempo de retención está relacionado con D de la siguiente manera: tR 

1 D

El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de tiempo, así un valor de D=0,25 h-1 indica que en una hora se renovó un 25 % del volumen de cultivo. En un cultivo continuo se considera que se alcanza el estado estacionario cuando han pasado por lo menos 4-5 tiempos de retención (tR = 1/D). 2.1. Balance de materia en el reactor

Para un componente cualquiera del cultivo (Ci), incluida la biomasa) se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor, considerando que el mismo está bien mezclado y la corriente de producto posee la misma composición que el líquido dentro del reactor.

 velocidad  Veloc.  Veloc.  Veloc.  Veloc.                 acumulación   Entrada   Salida   Form.   Cons. 

d (VC i )  F1  C i1  F2  C i  V  r fi  V  rci dt

(ec. 2.1)

Siendo: V: volumen del cultivo F1: caudal de alimentación

26

F2: caudal de salida Ci1: concentración del componente i en la alimentación. Ci: concentración componente i a la salida (hipótesis mezclado perfecto: Ci2=Ci) rfi: velocidad de formación del componente i rci: velocidad de consumo del componente i A partir de la ecuación general (ec. 2.1), se harán balances para biomasa, sustrato y producto. 2.1.1. Balance de biomasa Aplicando la ec. 2.1 a la biomasa y considerando que ingresa medio fresco sin células y no hay consumo de células en el reactor, se obtiene:

V

d(X )  0  F  X  V  rx  0 dt

(ec. 2.2)

Siendo: X: biomasa (gcel.seca/l) rx: velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h) F: caudal de alimentación = caudal de salida Cuando se alcanza el estado estacionario, las concentraciones dentro del biorreactor permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero la ecuación anterior y dividiendo por V resulta: 

F  X  rx  0 V

Teniendo en cuenta que rx = µ.x, se obtiene:

  X  D X Por lo tanto:

D

(ec. 2.3)

27

Es decir que la velocidad específica de crecimiento microbiano tiene que ser igual a la velocidad de dilución. La ec. 2.3, expresa que la velocidad específica de crecimiento se puede controlar ajustando la velocidad de dilución (D) o sea variando el caudal F. 2.1.2. Balance de Sustrato Aplicando la ec. 2.1 a cualquier componente que ingrese, se obtiene:

V

dS  FS R  FS  0  Vrs dt

Dividiendo por V (volumen de medio) e igualando a 0 la ecuación anterior (estado estacionario) se obtiene:

rs  D  S R  S 

(ec. 2.4)

Donde: SR : concentración del sust. limitante en la alimentación (reservorio). S : concentración de sust. limitante en el reactor, en estado estacionario.

A partir de esta ecuación se puede medir la velocidad de consumo de cualquier nutriente del medio de cultivo.

Determinación de la concentración de biomasa en el reactor

Considerando que S es la FCE y no hay formación de producto o este está asociado al proceso de producción de energía, rs vendrá dado por la ecuación de Pirt:

rS 

rX  ms  X YX / S

Reemplazando rs en la ec. 2.4, se obtiene:

D  S R  S  

rx ~  ms  X YX / S  X ~ D  S R  S    ms  X YX / S

Además en estado estacionario μ = D

28

 D X ~ D  S R  S    ms  X Y X / S  Despejando X :





  D  SR  S X  Yx/ s  D  m s  Yx/ s

(ec. 2.5)

Y´x/s : rendimiento verdadero = constante La ec. 2.5 nos dice como va a variar la concentración de células dentro del reactor en función de D. El tiempo desaparece como variable porque se está en estado estacionario. Si el mantenimiento fuese despreciable (ms=0), la ec. 2.5 se transforma en:



  X  Yx / s  S R  S



(ec. 2.6)

Si S es el sustrato limitante, estará relacionado con µ por la ec. de Monod:

  D  m 

S ks  S

Reemplazando en la ec. 2.6 se obtiene una expresión para la concentración de células en estado estacionario en términos de D y de los parámetros cinéticos:

  D  ks   X  Yx / s   S R   m  D  

(ec. 2.7)

Esta ecuación es válida cuando no es necesario el mantenimiento y no existe síntesis de producto o este está directamente asociado al metabolismo energético. La concentración de biomasa en el reactor (ec.2.7), en estado estacionario, dependerá de D y de SR, si SR aumenta, la concentración de biomasa en el reactor aumentará.

Determinación de la concentración del sustrato limitante en el reactor

Si S es el sustrato limitante, esta relacionado con  a través de la ecuación de Monod y en estado estacionario será:

29

  D ks  S

m  S

Porque es una imposición del sistema que  sea siempre igual a D en estado estacionario.

~ Despejando S :  D  ks S m  D

(ec. 2.8)

Esta ecuación expresa la concentración de sustrato limitante en el reactor en estado estacionario. Es decir que la concentración del sustrato limitante en el reactor varía en función de D, pero no depende de la concentración de sustrato a la entrada (SR). De manera que tanto la concentración de sustrato y la concentración de células dentro del reactor en estado estacionario, quedan expresados en función de la velocidad de dilución (D).

Gráfico de X y S en función de D

Para saber que ocurre en un cultivo continuo, se debe hacer una gráfica de la concentración celular y el sustrato limitante en función de D, que es la única variable que se tiene y se puede modificar a voluntad (Fig. 2.2).

Figura 2.2: Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentración de sustrato (S), la concentración de células (X), tiempo de duplicación (td) y productividad (D.X).

30

Como se observa en la Figura 2.2, a medida que D aumenta, S aumenta al principio lentamente y mas rápido después y la concentración de biomasa dentro del reactor disminuye. Cuando las velocidades de dilución son altas, el organismo no puede crecer lo suficientemente rápido como para compensar la velocidad con la que son arrastradas por la corriente de salida y se produce el “lavado” del cultivo. La concentración del sustrato en el reactor aumenta, hasta alcanzar el valor que tiene en a la entrada (SR) por eso el  gráfico de la FCE termina bruscamente en SR y X se hace cero en el reactor. El valor de D al cual ocurre el “lavado” o “wash out” se conoce como velocidad de dilución crítica (Dc). Es decir que a la velocidad de dilución crítica (Dc) ocurren dos cosas:  1. La concentración de células en el reactor ( X ) se hace cero.  2. La concentración de sustrato en el reactor ( S ) es igual al de la alimentación (SR)  ~ Durante el lavado (Dc) será: X = 0 y por lo tanto S = SR , esto es así porque a Dc, no habrán células en el reactor y por lo tanto no se consumirá sustrato. De la ecuación de Monod el valor de Dc será:

DC  .m 

SR KS  SR

Como generalmente Ks m las células serán arrastradas por la corriente de salida a una velocidad mayor de la que son capaces de multiplicarse, produciéndose el lavado. Por lo tanto se toma como criterio de trabajo: D < m Explicación de la primera parte de la curva

Para valores de μ bajos, comparables a ms, la curva X vs D, puede presentar diferentes formas (bajar, permanecer constante o aumentar), en base al tipo de sustrato limitante utilizado (Fig. 2.3).

31

Zona de µ comparable con ms

3 2 1

D ~ Figura 2.3: Grafico de X vs D a valores de D bajos.

Curva 1

En un cultivo continuo, cuando el sustrato limitante es la FCE, a medida que el microorganismo crece mas lento (bajos valores de μ), la concentración de biomasa en estado estacionario disminuye. La curva de X~ vs D (Fig. 2.3) disminuye según la ec. 2.5, vista anteriormente:





  D  SR  S X  Yx/ s  D  m s  Yx/ s

(ec. 2.5)

 De la ec. 2.5 se observa que cuando D  0  X  0 . Para explicar este hecho Pirt introdujo el concepto de mantenimiento celular explicado anteriormente. Recordando la ec. de Pirt:

rs 

rx  ms  X Yx/ s

Dividiendo por X se obtiene la velocidad específica de consumo de sustrato (qs): qs 

 Yx/ s

 ms

Expresando la ec. de Pirt en función de los rendimientos:

32

1 Yx / s



m 1  s  Yx/ s

A partir de las ecuaciones anteriores, se puede observar que cuando los microorganismos crecen a valores de μ (D) muy bajos, comienza a pesar el término de mantenimiento (ms). Es decir que la poca cantidad de sustrato (FCE) se consume principalmente para mantenimiento (que representa un gasto energético para mantener la viabilidad de las células) y no está disponible para la biosíntesis y crecimiento celular y por lo tanto la población se va lavando. El rendimiento experimental (Yx/s) disminuye, se aleja del rendimiento máximo teórico. Curva 2

Si el cultivo no está limitado por la FCE, pero está limitado en otro compuesto como nitrógeno, como el nitrógeno no está asociado al mantenimiento celular el valor de X vendrá dado por la ec. 2.6 (sin mantenimiento):



  X  Yx / N  S R  S



(ec. 2.6)

A velocidades de alimentación bajas, es decir D

0, en estado estacionario se

consume casi todo el sustrato, por lo que de la ec. 2.6 para biomasa resulta:  X  Yx / N  S R ~ Es decir que cuando D tiende a cero, X no tiende a cero, sino que adquiere un valor

igual a Yx/s. SR, y por lo tanto X será independiente del valor de D. Curva 3

Cuando el microorganismo crece a muy baja velocidad de dilución y no está limitado por la FCE, puede acumular polisacáridos y por lo tanto la curva sube. Si el cultivo está por ejemplo limitado en nitrógeno, habrá en el medio un exceso de la FCE y si este es un azúcar (glucosa, fructosa, etc.) la célula puede tender a acumular polisacáridos y por lo tanto el peso de cada célula aumentará y dará un rendimiento mayor.

33

 ~ Variación de S y X con SR

A partir de la ecuación de Monod se obtuvo una expresión para determinar la concentración de sustrato limitante dentro del reactor (ec. 2.8):  D  ks S m  D

(ec. 2.8)

Esta ecuación implica que la concentración del sustrato limitante en el reactor varía en función de D, pero no depende de la concentración de sustrato a la entrada (SR). Si se duplicara la concentración de sustrato limitante en la alimentación (SR), el valor ~ de S seguirá siendo el mismo. Una vez que se fija el valor de D, queda fijo el valor ~ de S (Fig. 2.4).   D  SR  S De las ecuaciones 2.5 y 2.6: (ec. 2.5) X  Yx/ s  D  m s  Yx/ s





  X  Yx / s  S R  S





(ec. 2.6)

La densidad celular en el reactor se controla por la cantidad de nutriente limitante. Si la concentración de éste (SR) en el reservorio aumenta, dejando constante la velocidad de dilución, la densidad celular aumentaría aunque la velocidad de crecimiento seguiría siendo la misma (Fig. 2.4).

~ ~ Por lo tanto: si D se mantiene constante y varia SR, variará X pero S se mantendrá constante.

Figura 2.4: Grafico de biomasa, sustrato en función de la velocidad de dilución a diferentes concentraciones de sustrato limitante en el reservorio.

34

2.1.3. Balance de producto

A partir del balance general en el reactor (ec. 2.1) se plantea el balance para un determinado producto:

V

dP   F .P  V  rp dt

Siendo: P: concentración del producto (g/l) rp: velocidad de formación de producto En estado estacionario se obtendrá:  rP  D  P Despejando P , se obtiene una expresión para la concentración de producto en estado estacionario en función de la concentración de biomasa:

P

qp  X D

(ec. 2.9)

La expresión de qp depende del tipo de producto formado. Si qp es conocido, la concentración de producto en el reactor puede calcularse a partir de la ec. 2.9. Recordando las ecuaciones cinéticas para productos asociados al crecimiento:

qp 

 y´x / p

 mp

Reemplazando en la ecuación 2.9 se obtiene:    X PD   mp  X y x / p

35

   mp  X X P  y x / p D

(ec. 2.10)

Para productos finales del metabolismo energético, cuya formación está asociada al crecimiento y al mantenimiento, la concentración de producto variará con D. Cuando D = 0, la formación de producto se debe a la contribución no asociada al crecimiento. 2.2. Determinación de las constantes cinéticas (ks, ms) y rendimiento

2.2.1. Medición de ks y μm

Puesto que los valores de ks en un cultivo celular son generalmente muy bajos, la determinación precisa de este parámetro a partir de datos de un reactor discontinuo (batch) es bastante difícil. Una mejor estimación de ks puede realizarse utilizando un cultivo continuo. En un cultivo continuo, en estado estacionario se tenía que µ = D. Si el crecimiento se puede modelar utilizando la cinética de Monod, se tendrá:

D

m  S Ks  S

(ec. 2.11)

Siendo S : concentración de sustrato limitante en el reactor en estado estacionario (g/l).

Ks: constante de saturación (g/l), μm. la velocidad específica máxima de crecimiento (tiempo-1). A partir de datos experimentales de S a distintos valores de D, obtenidos en el reactor en estado estacionario, se pueden calcular los parámetros ks y μm de la siguiente manera: Haciendo la inversa de la ecuación 2.11 se obtiene la ecuación linealizada de Lineweaver-Burk. 1 Ks 1 1    D m S m

(ec. 2.12)

36

De la representación gráfica de 1/D en función de 1/S, se pueden calcular los valores de μm y Ks a partir de la pendiente y ordenada al origen. 2.2. 2. Medición del coeficiente de mantenimiento (ms ) y rendimiento verdadero

Los cultivos continuos son también útiles para la determinación de rendimientos y coeficientes de mantenimiento en cultivos celulares. De la ec. de Pirt

rS 

X Y X / S

 ms  X

En estado estacionario: μ = D, por lo tanto:

rS 

D X  ms  X Y X / S

qS 

D  ms YX / S

Dividiendo por X:

(ec. 2.13)

Del balance de sustrato en cultivo continuo (ec. 2.4): rs  D  S R  S 

Se obtiene: qs 

rS D  S R  S   X X

(ec. 2.14)

Procedimiento de cálculo: ~ 1. Por cada valor de D y SR fijos, se determinan S y X y se calcula qs por la ec. 2.14.

2. Se realiza la siguiente tabla: D D1 D2 D3

qS qS1 qS2 qS3

37

3. Se traza la recta qS = f (D) (ec. 2.14). De la pendiente y ordenada al origen se calcula Y`x/s y qS respectivamente. 2.3. Rendimiento experimental en cultivo continuo

En un cultivo continuo con alimentación estéril, el rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s), se obtiene de la siguiente manera:

Yx / s 

X SR  S

(ec. 2.15)

Yx/s depende de la concentración de sustrato y de la velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0. 2.4. Productividad en cultivo continuo

En el cultivo continuo, la productividad de biomasa Pc (g/l.h) (en estado estacionario) se obtiene del producto del factor de dilución por la concentración de células  X  D (g/l.h). Recordando que el valor de X, está dado por la ec. 2.7 (cuando no hay formación de productos o este está asociado al metabolismo energético y las necesidades de mantenimiento son despreciables), por lo tanto:  K D  ~  Pc  XD  Y X / S  D   S R  s  m  D  

(ec. 2.16)

Graficando Pc en función de la velocidad de dilución, D, se obtiene una curva como se muestra en la Figura 2.2, la que presenta una productividad máxima a una determinada velocidad de dilución (Dopt). Derivando D.X (ec.2.16) con respecto a D e igualando a cero se obtiene una expresión para calcular el valor de Dopt que proporciona la máxima productividad:  ks  Dopt.   m  1   ks  S R  

(ec. 2.17)

38

Por ser KS > ks , se obtiene la ec. para la productividad máxima: Pc m  Dopt  X opt   m  Yx / s  S R

(ec. 2.19)

Es decir que la productividad volumétrica máxima es función de la µm del microorganismo, de Yx/s y de SR. La productividad de los productos relacionados con el crecimiento se puede describir de la siguiente manera: Pr  D  P Siendo P la concentración de producto en estado estacionario (g/l). 2.5. Comparación productividad en cultivo batch vs continuo

La productividad en cultivo continuo está dado por: Pc m  D  X opt   m  Yx / s  S R

39

En el estado estacionario, si el quimiosato opera al o cerca del Dopt, la productividad permanecerá a un valor constante y máximo durante la totalidad de la fermentación. La productividad de un cultivo batch (en términos de biomasa formada), se puede expresar mediante la siguiente ecuación definida anteriormente:

Pb 

Yx / s  S R   m xf ln   m  t npt x0

La relación entre la productividad en cultivo continuo y batch será: Xf Pc  ln   m  t npt Pb X0

Suponiendo tnpt = 0, y considerando que en la práctica

Xf X0

 10

La productividad en continuo será > 2,3 en batch: Pc  2,3Pb

En la práctica el tiempo no productivo total (tnpt) es de horas, lo que hace aún mayor la diferencia señalada. 2.6. Ventajas y desventajas del cultivo continuo

Ventajas

Los sistemas de cultivo continuo ofrecen las siguientes ventajas respecto a los cultivos en batch: 

Permite seleccionar a voluntad la velocidad específica de crecimiento y mantener a la población bacteriana creciendo a una dada velocidad en forma indefinida y constante.



Permite examinar el efecto de cambios en los parámetros físicos o químicos sobre el crecimiento y la formación del producto a una tasa de crecimiento constante.



Permite la determinación de las constantes cinéticas, energía de mantenimiento y rendimientos.



Resulta mas productivo que el cultivo batch.

40



Se lo puede operar en forma automática para obtener una producción de calidad constante.

Desventajas 

La mayor complejidad y costo de los equipos.



Como el tiempo que demanda la operación de los equipos de cultvio continuo es mayor que el de los cultivos en batch, existe un mayor riesgo de contaminación y de que se produzcan mutaciones en las cepas bacterianas en estudio.



El crecimiento de organismos filamentosos es difícil debido a la viscosidad y naturaleza heterogénea del cultivo que evita el crecimiento en régimen permanente.

El control de la contaminación es un problema que atañe al diseño del fermentador, a su construcción y operación. 2.7. Diferencias entre cultivo discontinuo y continuo 

El cultivo continuo opera bajo condiciones de estado de equilibrio (las concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes).



El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de sustratos mientras que el cultivo batch, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso de sustrato.



La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo está controlada por la velocidad de dilución (y por ello bajo el control del operador) y su valor es siempre menor que μm.. Por el contrario, la velocidad específica de crecimiento en la fase exponencial de un cultivo batch, alcanzará el μm correspondiente a las condiciones que prevalezcan en el cultivo.

2.8. Algunas aplicaciones del cultivo continuo 

Producción de algunas proteínas.



Tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean microorganismos o enzimas inmovilizadas.



Producción de etanol.



Producción de productos asociados al crecimiento, especialmente en gran escala (por ejemplo, ácido láctico).

41

2.9. Problemas de aplicación 1. Se desea producir levadura de panadería en un biorreactor continuo de 40.000 lt, en

el estado estacionario, para las siguientes condiciones: F = 2.000lt/h

mS = 0,05h-1

SR = 50g/lt

kS = 0,2g/lt.

YX/S= 0,50

m = 0,4

Y`X/S = 0,55 Calcular: 

La concentración residual del sustrato limitante(g/lt).



La concentración de biomasa a la salida (g/lt).



La productividad del biorreactor (g/lt.h)

2. Un microorganismo crece en un biorreactor de tanque agitado de 5.000 litros de

capacidad (volumen del medio de cultivo), observándose los siguientes parámetros en el estado estacionario: F = 1.000 lt/h KS = 0,1 g/lt μm = 0,45 h-1 YX/S = 0,5 SR = 15 g/lt mS = 0 (despreciable) Calcular: Concentración de sustrato residual Concentración de biomasa a la salida del biorreactor Productividad Velocidad de dilución critica Velocidad de dilución para productividad máxima (Dmáx) Representar en un gráfico semi-cuantitativo S,X, y XD vs D e indique los puntos Dc, Dm y μm

42

3. Se cultiva una bacteria aeróbica mediante cultivo continuo, a una velocidad de

dilución de 0,302 h-1. El medio de alimentación contiene: glicerol:10,2 g/l; urea: 2,9 g/l; sales y factores de crecimiento. El cultivo se agita y airea a razón de 0,7 VVM (laire/lmedio.min) medidos a 26 ºC y 1 atm. La composición de gases a la entrada es: CO2= 0; O2 = 20,96 % La composición de gases a la salida es: CO2= 1,3 %; O2 = 19,2 % En estado estacionario se obtuvieron los siguientes valores: Peso seco de células = 5,9 g/l Glicerol = 0,5 g/L Urea = 1,6 g/l Calcular: Velocidad de crecimiento microbiano. Velocidad de consumo de glicerol, urea y oxígeno. Velocidad de producción de CO2. Rendimiento en base al glicerol (Yx/s) y oxígeno (Yx/o). qglicerol, qo2, qco2. 4. Se desarrolla una bacteria en un biorreactor continuo para la producción de SCP,

observándose los siguientes parámetros: V = 2.000 lt SR = 90 g/lt µmáx = 0,45 h-1 KS = 0,5 g/lt YX/S = 0,5 g biomasa/g sustrato mS = 0 Costo sustrato = 1 $/Kg Valor producto = 3 $/Kg (Despreciar mS) Calcular, cuál de los regímenes que se indican a continuación generaría mayor beneficio económico, expresado en $/hora.

43

D = 0,38 h-1 D = 0,40 h-1 D = 0,43 h-1 Sacar conclusiones Nota: Beneficio= Ventas de producto – Costo de Materia Prima. 5. Una bacteria crece en sistema continuo con glicerol (sustrato limitante, C3 H8 O3) y

amonio como FN a una velocidad de dilución de 0,2 h-1. El cultivo se agita a 600 rpm. SR es 4,0 g/l, el volumen de cultivo de 500ml y ro2=0,0149 mol o2/l.h. Calcular: a) Caudal de alimentación (F) b) Productividad volumétrica y total de biomasa. c) Yx/s, rs c) Determine aplicando balances de grado de reducción si hay formación de producto (se supone que los datos son correctos) Datos: X= 1,9 g/l S= 0,014g/l Glicerol C3 H8 O3 Biomasa Standard ro2= 0,0145 mol / lts h. 6. Determinación experimental de KS y µmáx de la ecuación de Monod.

Una bacteria se desarrolla en un biorreactor continuo simple. Los valores de las concentraciones del sustrato limitante (S), en el estado estacionario, para distintos valores de la velocidad de dilación (D) están representados en Tabla 1.1. Determinar los parámetros cinéticos, KS y µmáx de la ecuación de Monod, aplicando los modelos de linealización de: Linewearver – Burk.

44

D (1/h) 0,375 0,35 0,325 0,3 0,275 0,25 0,225 0,2 0,175 0,15 0,125 0,1

S (g/lt) 3,75 1,75 1,08 0,75 0,60 0,42 0,32 0,25 0,18 0,15 0,10 0,08

7. Se opera un cultivo continuo con una cepa de Penicillum crysogenum productora

de penicilina a un D= 0,015 h-1. La concentración de micelio estacionaria es de 1,4 g/l y la velocidad específica de consumo de glucosa (qs)por el micelio de 0,134 g glucosa/g micelio.h Calcular: Qué proporción de sustrato se destina a crecimiento, mantenimiento y producción de penicilina. ¿Cuál es la concentración en estado estacionario de la penicilina? Datos: Y’X/S = 0,45gx/gs mS = 0,08gS/gx.h Yp/s = 0,0024 gpenicilina/gs

45

3. CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO)

La fermentación se puede llevar a cabo en sistemas tipo batch, batch alimentado o cultivo continuo.

Sin embargo el cultivo continuo no es muy recurrido para la

producción ya que gran número degeneraciones que transcurren en el mismo hace que sea proclive a la contaminación y a la aparición de mutaciones espontáneas con el consiguiente cambio en la cepa de producción. Los procesos batch son simples y robustos pero el hecho de que los microorganismos crezcan a μm durante buena parte del cultivo batch, hace que el consumo de oxígeno sea alto cuando la concentración celular deseada es alta, tal como ocurre en los procesos en los cuáles el producto a obtener está asociado al crecimiento celular. La transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a la fase líquida representa generalmente un reto en los cultivos microbianos. Además, la única forma de obtener una alta concentración de biomasa es a partir de un medio con una alta concentración de sustrato, hecho que puede generar problemas de inhibición y/o alteraciones en el medio de cultivo durante el proceso de esterilización. Además algunos microorganismos presentan metabolismo de sobreflujo en el cuál, cuando

crece

a

velocidades

específicas

elevadas,

posee

un

metabolismo

respirofermentativo en el que genera producto (etanol) a pesar de poseer suficiente cantidad de oxígeno. Las altas velocidades de crecimiento inducen el efecto Crabtree. Para subsanar estos inconvenientes se elige generalmente el sistema de cultivo en batch alimentado, ya que la alimentación restricta de glucosa permite que las células crezcan a una alta densidad con metabolismo respiratorio manteniendo una baja velocidad específica de crecimiento. El término cultivo batch alimentado se refiere a un cultivo batch al cual se alimenta continuamente con medio de cultivo fresco o con alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. Por lo tanto, el objetivo de un cultivo batch alimentado es controlar la velocidad de crecimiento mediante la velocidad de alimentación del sustrato limitante. 3.1. Balance de materia en el reactor

Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor:

46

F(t) S R(t)

Vf, X f VR = Vf- V0 V0 , X0, S 0

RESERVORIO

BOMBA BIORREACTOR

 velocidad  Veloc.  Veloc.  Veloc.  Veloc.                 acumulación   Entrada   Salida   Form.   Cons.  d (VC i )  F1  C i1  F2  C i  V  r fi  V  rci dt

(ec. 3.1)

Siendo: V: volumen del cultivo F1: caudal de alimentación F2: caudal de salida Ci1: concentración del componente i en la alimentación. Ci: concentración componente i a la salida (hipótesis mezclado perfecto: Ci2=Ci) rfi: velocidad de formación del componente i rci: velocidad de consumo del componente i Considerando que en un cultivo batch alimentado (BA) el caudal de salida es nulo y por lo tanto V varía con el tiempo, la ecuación 3.1 se reduce a:

d (VCi )  F  Ci1  V  r fi  V  rci dt

(ec. 3.2)

Para comenzar un cultivo BA tenemos que tener células en el reactor, por lo tanto primero se debe hacer un batch y cuando las células entran en fase estacionaria se 47

comienza a alimentar. Por lo tanto, al inicio de un cultivo BA tendremos: V0, X0 y S0 (condiciones finales del cultivo batch), S0 será aproximadamente igual a 0. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o constante. 3.1.1. Balance de Sustrato

A partir de la ec, 3.2, haciendo balance para el sustrato limitante (S) se obtiene: d (V  S )  F  S R  V .rS dt

(ec. 3.3)

 Acumulación   Su min istro   Consumo  Recordando que el consumo de sustrato viene dado por la ec. de Pirt (cuando no hay formación de producto o este está asociado al crecimiento): rs 

rx  ms  x Yx/ s

Considerando mantenimiento despreciable y reemplazando en la ec. 3.3, se obtiene: V  rx d (V  S )  F  SR  dt YX / S

´ d (V  S ) V   X  F  SR  dt YX / S

(ec. 3.4)

En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en batch o en cultivos continuos. Por lo tanto la expresión 3.4 quedará:

S

d (V ) dS V  X V   F  SR  dt dt YX / S

(ec. 3.5)

Si se desea controlar , la velocidad de alimentación debe ser tal que en todo momento la concentración de sustrato limitante (S) en el reactor sea prácticamente cero (zona de 48

cultivo restricto), no puede ser saturante (recordar Monod). Si S  0 , dS/dt =0 (esto significa que el sustrato es consumido totalmente y no se acumulará sustrato limitante en el reactor). Por lo tanto igualando a cero la ec. 3.5, se obtiene:

F  SR 

V   X YX / S

(ec. 3.6)

Siendo X: la concentración de biomasa (g/l). Yx/s :el factor de rendimiento de biomasa (g de biomasa/ g de FCE). SR: es la concentración de la FCE en el medio de alimentación (g/l). F: es el flujo de alimentación (l/h). V: es el volumen de medio (l). μ: es la velocidad específica de crecimiento microbiano (h-1). Esta ecuación indica que la velocidad de producción de biomasa se acomoda a la velocidad de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse “externamente”, modificando F y/o SR. Si la velocidad de entrada de nutrientes (F.SR) es igual o mayor que la velocidad de consumo, las células crecerán a m. Si la velocidad de entrada de nutrientes es menor que la velocidad de consumo, las células crecerán a una velocidad , que será menor que max. 3.1.2. Balance para biomasa

A partir de la ec, 3.2, haciendo balance para biomasa (X) se obtiene: d (VX )  V  rx  V    X dt

(ec. 3.7)

Reemplazando la ec.3.7 en la ec. 3.4: d (V  S ) 1 d (VX )  F  SR   0 dt Yx / s dt

49

Igualando a cero por los mismos motivos que se expresó anteriormente, se obtiene:

F  S R  Yx / s 

d (VX ) dt

(ec. 3.8)

La que indica que la velocidad de acumulación de biomasa depende de la velocidad de alimentación de sustrato. Integrando la ec. 3.8, para las condiciones iniciales y finales del cultivo por lote alimentado resulta:

.



X ,V

X 0 ,Vo

d VX  Y x / sF  S R   dt t

0

X  V  X 0  V0  Yx / s  F  S R  t

(ec. 3.9)

Siendo: X0: concentración inicial de biomasa en el cultivo BA que corresponde a la concentración final del cultivo en la etapa batch. Xf : concentración final de biomasa V0: volumen del medio de cultivo al inicio del proceso de alimentación (corresponde al volumen de trabajo en la etapa batch). Vf: volumen del medio de cultivo al final del proceso de alimentación La ecuación 3.9 es la ecuación de una linea recta que indica como se acumula la biomasa con el tiempo. Tiempo del proceso

En un cultivo batch alimentado, V no es constante sino que varía con el tiempo. La variación del volumen con el tiempo del proceso será: dV  F1  F2 dt

Como F2 es cero se obtiene:

50

dV F dt

(ec. 3.10)

El caudal F, se puede mantener constante o puede ser variable. Si F = constante, integrando la ec. 3.10 se obtiene: V f  V0  F  t f

(ec. 3.11)

Despejando tf de la ec. 3.11 se obtiene una ecuación que permite determinar el tiempo del proceso: tf 

V f  V0 F

(ec. 3.12)

Determinación de SR

Reemplazando F. t de la ecuación 3.11 en la ecuación 3.9 y despejando SR se obtiene:

SR 

X f  V f  X 0  V0 Yx / s  (V f  V0 )

(ec. 3.13)

Siendo: S R  (V f  V0 ) = gramos de sustrato consumidos

La ec. 3.13 permite calcular la concentración de sustrato limitante en el reservorio.

3.2. Diseño de un cultivo batch alimentado

Para poder diseñar un cultivo BA, se deben determinar los valores de F y SR. Para iniciar un cultivo BA y evitar que se acumule sustrato, a partir de la ec. 3.6, se deberá cumplir la siguiente condición (para t =0, inicio de la alimentación):

F  SR 

 0  V0  X 0 YX / S

(ec. 3.14)

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La ec. 3.14 asegura que no se acumulará sustrato en el reactor porque se le está dando al cultivo, menos de su capacidad de consumo. Cabe destacar que si F.SR fuera mayor que la velocidad de consumo de sustrato, habrá una acumulación de sustrato en el medio y el crecimiento no sería limitado. Despejando F se obtiene el caudal de alimentación:

F

 0  V0  X 0 YX / S  S R

(ec. 3.15)

Los valores de V0 y X0 corresponden a los valores finales del cultivo batch, el valor de μ0 se lo elige a voluntad siempre que sea menor a μm. El valor de SR, se obtiene de la ec. 13. Las ecuaciones 3.13 y 3.15 son denominadas ecuaciones de diseño de un sistema de cultivo por lote alimentado. Para diseñar un batch alimentado: 1. Conocemos X0 y V0 (fin del cultivo batch e inicio del batch alimentado) 2. Fijamos a voluntad Vf y Xf. 3. Fijamos a voluntad 0 (siempre que sea < a m) 4. Se calcula SR de la ec. 3.13 5. Se calcula F de la ec. 3.15. Al obtener valores de SR y F, se ha diseñado una alimentación para el cultivo en batch alimentado. 3.3. Variación de μ durante el cultivo batch alimentado

Para saber como ira variando μ en el transcurso del proceso desde el valor de μ0 (seleccionado arbitrariamente), se parte de la ec. 3.7 del balance de biomasa y se despeja μ:



1 d (VX ) X  V dt

(ec. 3.16)

Reemplazando la ec. 3.8 en la ec. 3.16 se obtiene:



1  F  S R  Yx / s X V

(ec. 3.17)

52

Reemplazando X.V (ec. 3.9) resulta:



Yx / s  F  S R X 0  V0  Yx / s  F  S R  t

(ec. 3.18)

Es decir que μ, disminuye con el tiempo durante el transcurso del proceso fermentativo. En la Figura 3.1 se representa la evolución de X.V y S en un cultivo batch alimentado, en función del tiempo del proceso.

S0 ' X.V = X0.V0 + F.SR.YX/S.t µ < µ max

X0.V0

XV µ = µmax

X0 '.V0'

S0 = 0 BATCH

t = t0

BATCH ALIMENTADO

t

Figura 3.1: evolución de X.V y S en un cultivo batch y batch alimentado, en función del tiempo del proceso.

El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como SR sean constantes. Teniendo en cuenta el mantenimiento celular Si el sustrato limitante es la fuente de carbono y energía, se debe utilizar para rs la ec. de Pirt y a partir de allí realizar los balances correspondientes de manera de obtener una expresión para X.V en el que esté incluido el término de mantenimiento.

X .V 

FS R  FS R   X oVo  ms  ms

  msYx / s t e 

(ec. 3.19)

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Si se tiene en cuenta el mantenimiento la ecuación que representa la variación de X.V con el tiempo comienza a disminuir. Esto se debe a que llega un momento que toda la FCE se utiliza para mantenimiento, por ello la concentración de biomasa disminuye (Fig. 3.2). . X.V ms = 0 ms > 0

X.V X0 .V0

t0

t

Figura 3.2: evolución de X.V y S en un cultivo batch alimentado, en función del tiempo del proceso.

3.4. Aplicaciones cultivo batch alimentado

A través de los sistemas de cultivos continuos o batch alimentados, se alimenta el cultivo con un componente que tenga un efecto crítico en el control de la fermentación. La principal ventaja de ir añadiendo un componente del medio de a poco en vez de incorporar su totalidad al principio es que el nutriente puede mantenerse a muy bajas concentraciones durante la fermentación. Un nivel bajo de un nutriente (pero que se está reponiendo constantemente) permite: 

Mantener al cultivo dentro de los límites de capacidad de aireación del fermentador.



Eliminar los efectos represores de los componentes del medio (fuentes de carbono, de

nitrógeno o fosfatos). 

Evitar los efectos tóxicos de un componente esencial del medio.

El método de cultivo mas ampliamente utilizado a escala industrial es el batch alimentado que permite al tecnólogo un considerable control del proceso sin que se presenten las dificultades inherentes de los sistemas de cultivo continuo.

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El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

55

3.5. Problemas de aplicación 1. Se quiere producir levadura de panadería en un fermentador Fed-batch, con

alimentación constante de 400 l/h. El medio contiene 120 g/l de glucosa y demás nutrientes. La etapa de crecimiento limitado (BA) se inicia con las siguientes condiciones: Xo = 12 g/l Vo = 10.000 l Yx/s = 0,5 g/g µm = 0,45 h-1 SR = 120 g/l F = 400 l/h = constante ms se considera despreciable Si el sistema debe operar hasta completar un Vf de 38.800 l. Calcular: a) Tiempo del proceso, b) Concentración final de biomasa (Xf), c) Velocidad específica inicial (µo) y Velocidad específica final (µf) 2. Un microorganismo se desarrolla en un fermentador Fed-batch con alimentación

constante, en la etapa de crecimiento limitado las condiciones iniciales son las siguientes: Xo = 12 g/l Vo = 5.000 l Yx/s = 0,5 g/g µm = 0,45 h-1 F = 400 l/h = contante ms se considera despreciable Si el biorreactor se operó por 96 h. Calcular: a) Vf , b) SR, c) Xf 3. Se quiere diseñar un TP de BA. Si las condiciones operativas deberían ser las

siguientes: Vo = 2 l Vol de alimentación: 2 l Tiempo de Alimentación: 6 h SR = cte. 56

F l/h = constante 

Calcular la concentración del sustrato limitante en la alimentación.



Que valor tendrá la velocidad específica de crecimiento a las 3 h de alimentación.

Parámetros del Batch: Yx/s = 0,45 g/g µm = 0,40 h-1 Xo = 7 g/l S=0 Considere que no existe formación de producto y ms despreciable. 4. Se realizó un cultivo batch alimentado, para lo cual un biorreactor con un volumen

inicial de 10 l de un medio compuesto por glucosa, (NH4)2SO4 y sales minerales fue sembrado con un inóculo de 0,2 g/l permaneciendo en etapa de batch durante 12 h, momento en el cual la concentración de glucosa se hizo cero. En ese instante se inició la alimentación, agregando un total de 2250 g de glucosa a caudal constante y demás constituyentes del medio. Si se alcanzó un total de 1234,2 g de biomasa: 

Cuál fue la concentración inicial de glucosa y la mínima de (NH4)2SO4 del medio

empleado en la etapa de batch?. 

¿Cuántos moles de oxígeno se consumieron en cada etapa?.

Datos: µm = 0,40 h-1 - Vf = 30 l Considerar que el microorganismo empleado presenta tiempo lag de 2 h, composición standard y que el Yx/s se mantuvo constante en ambas etapas.

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4. BIBLIOGRAFÍA Aiba, S. A. Humphrey, N.Millis. Biochemical Engineering. Second Edition, Academic Press, 1973. Bailey, J. E.; Ollis D. F. Biochemical Engineering Fundamentals.. McGraw-Hill, segunda edición, 1986. Bu`lock, J.; Kristiansen, B. Biotecnología Básica. Editorial Acribia. 1991. Crueger, W.; Crueger A. Biotecnología: Manual de microbiología industrial. Editorial Acribia, 1993. Doran, P. M. Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. Editorial Acribia S.A. Zaragosa, España, 1995 (Traducido 1998). Ertola R. J.; Yantorno O.; Mignone C. Microbiología Industrial. Organización de los Estados Americanos (OEA). Washington DC., 1994. Madigan, M.T.; Martinko J.M.; Parker, J. Brock. Biología de los microorganismos. Décima edición. Pearson Educación, S.A., Madrid, 2004. Murray Moo - Young . Comprehensive Biotechnology . The Principles , Applications and Regulations of Biotechnology in Industry , Agriculture and Medicine . Pergamon Press .New York , 1983 . Pirt J. Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell Scientific Publications, 1975. Scraag, A. Biotecnología para ingenieros: Sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Noriega Editores, 1996. Trevan M.D.; Boffey, S., Goulding H.K., Stanbury, P. Biotecnología: Principios Biológicos.. Editorial Acribia. Zaragoza,. 1991. Voguet, C; Cavalitto, S.; Mignone, C. Apuntes Curso de Posgrado: Aspectos Tecnológicos del Cultivo de Microorganismos y Células Eucariotas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI). Octubre 2005. Ward O.P. Biotecnología de la fermentación. Acribia. Zaragoza, 1991.

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