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• Rosana Reyes

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Antecedentes Brasil tiene la mayor población de ganado comercial del mundo, con más de 190 millones de animales criados tanto para productos lácteos como para carne [1]. Las razas bovinas que actualmente se crían en Brasil pueden clasificarse en dos grupos, según su origen, como exóticas o criollas. El grupo de razas exóticas incluye las importadas en los últimos 50 a 100 años, tanto cebuina como taurina, que actualmente constituyen el grueso de las poblaciones intensivamente manejadas. La fuerte selección direccional ha venido dando forma a estas poblaciones bovinas en Brasil en los últimos 40 años principalmente a través del uso intensivo de un pequeño número de padres de élite en inseminación artificial, así como procedimientos de transferencia de embriones. A pesar del gran número de censos de algunas de las razas más eminentes, como la cebuina Nellore, Gyr y sus híbridos taurinos, el tamaño efectivo de la población se ha reducido considerablemente, aunque todavía no se dispone de estimaciones firmes. Hace unos años, Georges y Andersson [2] estimaron una población efectiva de casi 1.000 habitantes para una población animal de 10 millones de Holstein en los Estados Unidos. Es razonable pensar que, con el aumento de la accesibilidad a las prácticas de reproducción asistida, en la actualidad se observa una situación similar en todas las razas de bovinos sometidas a una gestión intensiva en el Brasil. Asimismo la mayoría de los países europeos y los EE.UU., el rápido crecimiento de estas razas comercialmente orgullosamente ha sucedido a expensas del segundo grupo de razas localmente adaptadas, genéticamente heterogéneas. Este grupo de razas criollas, también denominadas razas autóctonas, locales o naturalizadas, incluye las procedentes de las primeras poblaciones ganaderas introducidas por los conquistadores europeos hacia 1500. Mientras que todos los demás países sudamericanos recibieron sólo razas españolas, debido a su peculiar origen colonial Brasil fue el único que recibió razas portuguesas [3]. Selección natural actuando en ambientes notablemente variables en todo el país, junto con los eventos recurrentes de la mezcla de razas de raza llevó al desarrollo de razas criollas adaptadas a una amplia gama de entornos con niveles excepcionales de variabilidad fenotípica y una mejor adecuación a las condiciones locales. En las regiones del noreste la raza Curraleiro arised y luego se trasladó a los estados centrales de Minas Gerais y Goías. En las regiones del sureste las razas Junqueira y Franqueiro se desarrollaron junto con el Caracu y Mocho Nacional. En el Sur apareció la raza Criolo Lageano y en la región Pantanal la raza Pantaneiro. Mientras que el conocimiento histórico se ha acumulado en las razas criollas brasileñas [4-8], muy poco se sabe en su composición genética. Algunos estudios han analizado la variación de secuencia en las regiones hipervariables del mtDNA y mostraron, como era de esperar, que ambos haplotipos de taurina africanos y europeos están presentes en las razas criollas americanas, lo que es consistente

con los registros históricos. Algunos informes describen estudios preliminares del polimorfismo genómico de algunas razas de ganado criollo brasileño, basados en marcadores RAPD de bajo contenido informativo que no permiten realizar análisis comparativos a través de estudios independientes [11,12]. Se necesita un estudio más sistemático y de mayor alcance basado en el "lenguaje común" de los marcadores de microsatélites para entender la diversidad genética de las razas bovinas brasileñas con su peculiar origen histórico y su actual estado de peligro. En el contexto de las Directrices para el Desarrollo de Planes Nacionales de Manejo de Recursos Genéticos Animales de Granja [13], la FAO propuso un programa integrado para el manejo global de los recursos genéticos bovinos utilizando un conjunto común de marcadores de microsatélites de referencia. Los estudios de las relaciones genéticas entre razas de bovinos utilizando una herramienta de medición común no sólo proporcionan información útil y comparable sobre la evolución de las razas hasta la fase actual, sino que también proporcionan datos para un desarrollo científico de planes de conservación asistidos por marcadores [14,15]. En los últimos años una serie de estudios han reportado la caracterización de razas de ganado vacuno en todo el mundo [16-23]. En esos estudios se han utilizado progresivamente conjuntos comunes de marcadores de microsatélites, lo que ha facilitado la realización de estudios comparativos de la diversidad y las relaciones y la consolidación y el análisis de grandes conjuntos de datos para múltiples aplicaciones de cría, evolución y conservación.

A raíz del proyecto propuesto para los recursos genéticos animales por la FAO (Modad - Measurement of Domestic Animal Diversity)[13], el objetivo de este estudio era evaluar los niveles de diversidad genética, relaciones filogenéticas y patrones de introgresión taurina/cebuina y mezcla entre diez razas de ganado criado en Brasil. Se midió la diversidad en un conjunto de 22 microsatélites recomendados internacionalmente, tanto por la FAO como por ISAG (Sociedad Internacional de Genética Animal) para dilucidar la relación genética de un total de 915 animales pertenecientes a cinco razas de ganado criollo (Pantaneiro - PAN, Curraleiro - CUR, Criolo Lageano - CRL, Mocho Nacional - MON, y Caracu - CAR) tanto entre ellos y en comparación con las razas taurinas europeas especializadas (Holstein - HOL y Jersey - JER) así como tres razas cebuinas principales criados en Brasil (Nellore - NEL, Gyr - GYR y Guzerat - GUZ).

Resultados Marcadores microsatelitales

Se analizó un total de 915 animales que representaban diez razas brasileñas (Tabla 1). Todos los marcadores de microsatélites mostraron alto contenido de polimorfismo en todas las razas. Se detectaron 278 alelos en todos los loci de los 915 animales analizados. El archivo adicional 1 lista todas las estimaciones de frecuencia de alelo para cada microsatélite en cada raza. Los datos se enviarán a la base de datos sobre la diversidad del ganado[25]. El número medio de alelos por locus fue de 13,2 (entre 8 en INRA63 y 23 en TGLA122). En el cuadro 2 se resumen las estadísticas descriptivas específicas del locus para los 22 marcadores de microsatélites, consolidando los datos entre razas para cada subespecie de Bos (taurina y cebuina) y para ambas subespecies juntas. Las heterocigosidades de locus esperadas en ambas subespecies y todas las razas combinadas fueron nominalmente mayores que la heterocigosidad observada para todos los loci. La única excepción se observó en el locus ETH3 en el grupo de razas zebuinas, aunque no resultó en un exceso estadísticamente significativo de heterocigotos. En el grupo de razas taurinas sólo loci INRA63 y HEL1 y en el grupo zebuino sólo loci INRA35, INRA37, CSSM66, SPS115, TGLA227, INRA23, ETH3 y BM1824 se encontraron para estar en HWE. Todos los demás loci mostraron desviaciones de HWE. Cuando todas las razas combinadas fueron analizadas todos los loci desviados de HWE (Tabla 2). Las estimaciones globales de loci de endogamia mostraron que en ambos grupos de subespecies y el conjunto consolidado existe una reducción significativa de la heterocigosidad debido tanto a la endogamia poblacional (FIS) como a la diferenciación de razas estimada bajo el modelo infinitesimal (FST) y el modelo de mutación gradual (RST). Una estimación más alta de la endogamia dentro de la subespecie se observó para la zebuina (0.113) en comparación con la taurina (0.074), aunque el tamaño de la muestra más grande de taurina podría ser en parte responsable de esta diferencia. Sin embargo, cuando se llevó a cabo un análisis de muestras ecualizadas de 292 animales por subespecie, los resultados fueron los mismos. La contribución de los marcadores microsatelitales para la diferenciación de razas se estimó por la importancia de las estadísticas FST. El número de loci que contribuyó a la diferenciación de razas varió entre las dos subespecies con un mayor número de taurina en comparación con zebuina. Entre las razas taurinas sólo loci ILSTS5 y HEL5 no contribuyó a la diferenciación de raza. Los otros veinte loci tenían un FST significativo con INRA63, INRA5, CSSM33, ETH10 y TGLA227 como los cinco loci con los valores nominales más altos con INRA5 con el valor más alto en 0.102 (Tabla 2). En el grupo zebuino, por otro lado, sólo ocho marcadores contribuyeron a la diferenciación de razas con una significativa estadística de FST. Estos fueron INRA35, INRA37, ILSTS5, INRA5, CSSM66, CSSM33, CSSM9 y ETH152 con el mayor valor significativo de FST en 0,054 para INRA5. Curiosamente, el FST nominalmente más alto se estimó para el locus ETH10 sin embargo, no se consideró significativo por la rejilla de la navaja. Los valores estimados de

diferenciación debido a la deriva genética bajo el modelo de mutación gradual (RST) fueron en general más pronunciados que por las estadísticas de FST en valores absolutos. Las estimaciones de loci globales de FST y RST fueron similares en ambos grupos de subespecies sin embargo RST fue mucho mayor que FST cuando todas las razas juntas fueron analizadas. El déficit global de heterocigosidad cuando todas las razas de ambas subespecies fueron combinadas ascendió a 0.176 y la diferenciación global entre todas las razas fue estimada por FST en 0.098 y en 0.1861 por RST. La mayor parte de esta diferenciación es probable debido a la bien conocida y marcada diferencia genética subespecies aunque la variación genética entre razas de la misma subespecie también es significativa (ver abajo). Diversidad genética dentro de las razas Las medidas de diversidad para cada raza mostraron un número medio notablemente similar de alelos por locus fluctuando alrededor de 8,5. (Tabla 3). Las razas criollas CRL y PAN fueron las poblaciones más diversas con la mayor riqueza alélica media superior a 9.0. CAR tenía un poco menos de 8 alelos por locus y era la raza con la menor riqueza alélica. Entre las razas zebuinas (NEL, GYR, GUZ) el número promedio de alelos fue muy similar, alrededor de 8.7 mientras que las dos razas taurinas domesticadas fueron menos diversas con un número promedio más pequeño de alelos ligeramente por encima de 8.0. Aunque JER tiene un tamaño de muestra más pequeño que las otras razas esta diferencia no generó una reducción notable del número de alelo medio cuando se analizó una rejilla igualada de 50 animales por raza. La heterozigocidad promedio observada y esperada osciló entre 0,6316 y 0,7409 y 0,7151 y 0,7839 respectivamente. En todas las razas observados los valores de heterocigosidad eran nominalmente más pequeños que los esperados. De los 220 marcadores por raza HWE pruebas, 43 fueron significativos, muy por encima de la esperada 5%. En todas las razas, al menos un marcador microsatelital se desvió de las expectativas de HWE. La MON fue la raza donde se observaron y se esperaba heterozigocidades fueron las más cercanas y donde la desviación observada es menor que el número esperado por casualidad (5% de 22 = 1,1). En todas las demás razas, el número de loci marcadores desviados no puede ser contabilizado sólo por casualidad. Las tres razas zebuinas mostraron varios loci desviados de HWE. En el lado taurino tanto las razas comerciales HOL y JER, sino también el PAN criollo y CUR mostraron números similares de loci desviados significativamente. Los valores más altos de FIS se observaron para JER seguido de cerca por las tres razas de cebuina GYR, GUZ y NEL y la taurina CUR. La proporción media de alelos compartidos entre los animales dentro de las razas eran similares para todas las razas aunque PAN, MON y CRL tenían valores más bajos consistentes con sus heterozigosities más altos observados. Variación genética y relación entre razas

El fraccionamiento de la variación genética a diferentes niveles resultó en pequeño pero significativo (p < 0,001) entre las proporciones de raza de la variación en todas las estructuras probadas (Tabla 4). Entre las cinco razas criollas locales la variación fue la más baja, estimada en 4.43% más cercana al valor encontrado entre las tres razas zebuinas, en 4.96%. Como era de esperar, la mayor proporción de variación entre grupos, casi el 17%, se estimó cuando sólo se compararon las dos razas taurinas especializadas (HOL y JER) con las tres razas zebuinas. Cuando todas las razas fueron analizadas juntas, casi 12% de la variación se encontró entre razas. Las estimaciones de la diferenciación genética de pares basadas en el modelo infinitesimal (FST) fueron todas significativas después de las correcciones de Bonferroni (p < 0,01), indicando que todas las razas pueden ser consideradas como entidades genéticamente independientes. Se estimaron diferentes medidas de distancia genética, pero todas mostraron una correlación muy alta, por lo que sólo se informó de la distancia Nei, DA (Tabla 5). Como era de esperar, se observaron las mayores distancias genéticas entre las razas taurina y zebuina, como entre JER y NEL (0,3820). Se observaron pequeñas distancias en pares entre las tres razas zebuinas. Entre las razas criollas locales se observaron las distancias más bajas entre PAN y CUR (0,0841). CAR está genéticamente más cerca de MON (0.099) que a su vez está más cerca de CRL (0.0861). Entre las razas criollas CRL y PAN fueron las más cercanas a la raza zebuina NEL lo que sugiere una mayor frecuencia de introgresión de genes indicine en estas dos razas (0.2101 y 0.2320 respectivamente). La reconstrucción filogenética a partir de un agrupamiento UPGMA basado en la matriz de distancia DA dio lugar a un árbol con valores de bootstrap más altos que por el método Neighbor Joining y consistente con la información histórica y morfológica conocida (Figura 1a). La topología del árbol fue confirmada por los valores relativamente altos del bootstrap. Cuatro razas criollas locales CRL, CUR, PAN e MON se agruparon más cerca, con las otras tres razas taurinas uniéndose en ramas separadas, JER y HOL más cerca. GYR, GUZ y NEL formaron un cúmulo bien separado con GYR y GUZ más cerca. Un análisis de Neighbor-Net corrobora aún más esta imagen, dando una mejor visión de la posición intermedia de las razas criollas entre las razas puramente taurinas y zebuinas, y mostrando una mayor proximidad de las razas PAN y CRL con el grupo zebuino en comparación con las otras razas criollas (Figura 1b). Un dendrogram individualanimal-basado vecino-unión construido a partir de las estimaciones de las distancias compartidas alelo entre todos los 915 individuos muestra que la mayoría de los animales dentro de cada raza ensamblado de cerca en ramas discretas, pero algunas excepciones fueron observadas (Figura 2). Las razas taurina y zebuina fueron claramente segregadas en dos ramas discretas. Sin embargo, mientras que la taurina razas HOL, CAR y JER formado subramas casi compacto con pocos individuos de estas razas fuera de lugar en otros grupos de

raza, Una alta frecuencia de animales fuera de lugar se observó entre las razas criollas y especialmente cuando se mira a las tres razas zebuinas particularmente así entre el GYR y GUZ. El análisis de la estructura utilizando un enfoque bayesiano se realizó con un número creciente de poblaciones inferidas. El agrupamiento basado en modelos a k = 2 resultó en la agrupación de las dos principales subespecies con indicaciones de introgresión génica en ambas direcciones. Con k = 3, las razas criollas locales agrupadas formando un racimo. Es posible notar apareamientos direccionales de las razas exóticas en los genomas locales. Basado en los valores de Q, la k más probable encontrada fue k = 10. El diagrama muestra claramente que la mezcla se ha producido entre las razas criollas locales confirmando indicaciones previas del dendrograma animal-individual basado en distancias compartidas alelo (Figura 3). Discusión Hasta donde sabemos, este es el informe más completo sobre la estructura genética y diversidad de las razas bovinas en Brasil, el país con la mayor población mundial de ganado comercial y una peculiar composición mixta de ambas taurinas, Cebuinas y razas híbridas. Los datos de genotipo recogidos muestran que se mantienen cantidades significativas de variación genética en las poblaciones locales de ganado vacuno. Las razas criollas CRL, CUR, MON y PAN mostraron una riqueza alélica claramente mayor que ambas razas especializadas y todavía nominalmente mayor que las razas cebuinas (Tabla 3) muy probablemente resultado de la presión de selección suave y un patrón más liberal de manejo del rebaño. Excepción a esta tendencia es el comportamiento de la raza criolla CAR, la que tiene la menor riqueza alélica y baja heterocigosidad observada consistente con su historia única de cría selectiva. Nuestros resultados son consistentes con las observaciones de Liron et al. [23] al analizar un grupo de diez razas en Argentina y Bolivia que incluyeron razas criollas, taurinas y zebuinas. Diversidad de microsatélites El número medio total de alelos observados en cada locus, que consolida los datos de las diez razas, está por encima de las estimaciones encontradas en otros estudios [21,22,26-29]. Este número mayor puede explicarse por los tamaños de muestra relativamente mayores analizados para las varias razas. Alelos raros, con frecuencias inferiores al 5% se observaron en todas las razas en casi todos los locus (archivo adicional 1). Las estimaciones de tales frecuencias por debajo del umbral sugerido por la regla general de 5/2n (donde n = número de individuos)[30] que corresponde a ~5/200 = 2.5% para la mayoría de las razas se deben ver con precaución. Varios marcadores mostraron un déficit significativo de heterocigotos debido a la endogamia intrapoblacional en ambas subespecies y en el análisis combinado. Este resultado se ha observado comúnmente en encuestas de razas

bovinas en otros países [21,23,27]. La aparición de alelos nulos y errores de genotipado también podría llevar a la deficiencia de heterocigotos. Sin embargo, considerando que las estimaciones del déficit de heterocigotos para el mismo locus marcador variaban por subespecies y que el conjunto de microsatélites utilizados se ha recomendado cuidadosamente y se ha utilizado ampliamente para estudios de diversidad en todo el mundo [31] esta explicación es improbable. Variación genética dentro y entre razas El déficit global de heterocigotos (FIT) en la muestra de 915 animales estudiados fue relativamente alto, superior a las estimaciones de otros estudios en los que participaron razas locales de origen taurino y zebuino [23,29,32]. Sin embargo es importante tener en cuenta que en este estudio se analizaron razas taurinas criollas en conjunto con razas taurinas especializadas y cebuinas así inflar deliberadamente el valor de FST. La reducción global observada de la heterocigosidad se debe, por tanto, en proporciones casi equivalentes a la endogamia intrapoblacional (FIS = 0,086) y a la deriva genética entre las diez razas (FST = 0,098). Todas las razas mostraron una reducción significativa en la heterocigosidad debido a apareamientos no aleatorios dentro de las poblaciones (Tabla 3). Las tres razas de cebuina, JER y CUR tuvieron los coeficientes de endogamia más altos y significativos dentro de la población (FIS). Este resultado refleja muy probablemente el manejo reproductivo más intenso que las razas cebuinas y JER han sido sometidos, con el uso de un número relativamente pequeño de toros de alto valor como donantes de semen en prácticas de reproducción asistida. Dos razas criollas, CAR y MON mostraron los coeficientes más bajos de endogamia entre las diez razas. Estas dos razas han sido objeto de esfuerzos concertados para conservarlas. La raza MON se recuperó de un número muy pequeño de animales mediante apareamientos dirigidos acoplados a procedimientos de transferencia de embriones [7]. Además CAR es fenotípicamente muy similar a MON, la única diferencia es la presencia de cuernos en CAR. La extracción de cuernos de los animales de CAR y apareamientos con MON ha llevado a absorber el cruce de la raza MON por CAR. Como el tamaño efectivo de la población de MON es todavía muy pequeño, el entendimiento es que esta absorción de raza irreversible, aunque resulta en una uniformización de las dos razas, debería ser finalmente positivo desde el punto de vista práctico, ya que los alelos potencialmente útiles se conservarán en las poblaciones más grandes de la RCA. Tal posición también ha sido defendida como no necesariamente indeseable cuando constituye una parte integral de la evolución de una raza. Entre las cinco razas criollas se detectó la mayor endogamia en CUR. Esto se esperaba ya que el número de toros disponibles para esta raza es muy limitado. Las actuales acciones de conservación de esta raza han incluido el intercambio de toros entre las pocas propiedades que crían estos animales, así como la expansión del muestreo de germoplasma y la crioconservación [3].

La diferenciación genética significativa fue observada entre las diez razas estimadas tanto por FST = 0.098 y RST = 0.1861 (Tabla 2). Se han estimado valores similares de FST entre razas africanas taurinas y zebuinas (FST = 0,06) [29]; 0,112 entre siete razas europeas taurinas [17]; 0,035 entre razas belgas taurinas [33]; 0,107 en un grupo de razas europeas septentrionales [28]; alrededor de 0,07 en razas ibéricas y francesas [28] [19,32] y 0,089 entre portugueses taurinos locales [22]. En un estudio similar al nuestro, cuando se analizó un grupo de razas taurinas y zebuinas criollas de Argentina y Bolivia, la diferenciación se estimó en FST = 0,088 y RST = 0,144 [23]. Las estimaciones mucho más altas de la diferenciación por el RST en comparación con FST sugieren que las diferencias entre razas implican no sólo las frecuencias de alelo sino también las diferencias de tamaño de alelo debido al comportamiento mutacional de los microsatélites. La importancia y los valores de las estimaciones globales de FST entre las diez razas para los 22 microsatélites son indicadores útiles de marcadores que podrían ser herramientas poderosas para la diferenciación de razas. Diferenciación de razas que pertenecen a diferentes subespecies, taurina o indicina, es una tarea relativamente trivial como varios marcadores con un significativo FST podría diagnosticar fácilmente la raza más probable, así como las proporciones de zebuina y taurina genomas. Dentro de cada subespecie sin embargo sería más difícil. En taurina, por ejemplo, de los veinte marcadores que contribuyen significativamente a las diferencias entre razas, los marcadores INRA63, INRA5, CSSM33, ETH10 y TGLA227, los cinco primeros clasificados por los valores FST, podrían ser probados para este propósito. En zebuina, sólo ocho marcadores mostraron una significativa FST, y todos de muy bajo valor, por lo que la diferenciación de razas en esta subespecie podría exigir otros tipos de marcadores como polimorfismos de nucleótidos individuales cuidadosamente seleccionados y validados ancestralmente informativo. Tanto las estimaciones de FST como las de RST en los grupos de taurina y cebuina tomados por separado mostraron una menor diferenciación entre las tres razas cebuinas en comparación con el grupo taurino. La posible explicación reside en la forma en que estos dos grupos fueron introducidos y se gestionan actualmente en Brasil. En ese momento no se practicó ninguna segregación específica de razas y todos los animales procedentes de las Indias se clasificaron genéricamente como Zebu [6]. Además, las decenas de millones de animales cebuinos existentes en la actualidad han resultado en su mayor parte de la absorción de cruzamientos entre toros indicinos y presas locales. Muy raramente, si es que existen, rebaños genéticamente puros disponibles, que descienden directamente de animales importados de ambos sexos y son totalmente inmunes al flujo del gen taurino [34]. Por último, sólo en 1938 se describieron y aplicaron las normas raciales para las razas cebuinas. Hasta entonces, todas las razas estaban registradas en un único libro genealógico de la raza Zebu [35].

Cuatro de las cinco razas criollas CRL, CUR, MON y PAN mostraron una mayor riqueza alélica que todas las otras razas. Liron et al. observaron el mismo patrón comparativo de variación genética. La introducción de animales taurinos en el continente americano fue uno de los últimos movimientos de dispersión de bovinos en el mundo. La población fundadora de las actuales razas criollas locales era un pequeño grupo de animales ibéricos que se enfrentaban a una presión selectiva significativa debido al clima tropical y a tensiones bióticas y a una casi extinción debido a la introducción de razas más productivas [7]. Sin embargo, una fuerza evolutiva opuesta fue la mezcla con razas de orígenes geográficos muy diversos [3]. La dispersión de estas poblaciones a distintas regiones después de las migraciones humanas, junto con las condiciones ambientales muy diversas que se encuentran en un país continental, presión selectiva direccional muy suave e hibridaciones de razas recurrentes, muy probablemente han dado forma al estado actual de la diversidad genética de estas razas. Además, en los últimos años, también se ha producido la introgresión de las razas zebuinas. Sólo la raza CAR contrastó a esta imagen mostrando una reducción observada heterocigosidad y riqueza alélica (Tabla 3). Esta es la única raza criolla que tiene una historia de selección artificial y el declive de esta raza en los años 60 y 70 también podría haber contribuido a esta reducción de la variación genética. Relación genética entre razas y conservación La partición de la variación genética de una AMOVA también reveló que la mayor cantidad de variación siempre se encontró entre los individuos dentro de las razas, independientemente de las diferentes estructuras probadas (Tabla 4). La máxima diferenciación se encontró al comparar la cebuina con razas taurinas especializadas. Se ha visto un patrón muy similar de división de la varianza en varios otros estudios de razas bovinas [19,22,23] donde el 90% o más de la variación está contenida dentro de las razas. Sin embargo, Liron et al. [23] encontraron que sólo el 1% de la variación se debió a diferencias entre razas criollas argentinas y bolivianas, menores que el 4% que encontramos entre las razas criollas brasileñas. Aunque no se puede hacer una prueba comparativa formal para determinar la importancia de estas estimaciones, el valor nominalmente más alto podría resultar de dos características distintivas de las razas criollas brasileñas. En primer lugar, Brasil fue el único país de América del Sur que recibió razas taurinas portuguesas [3] que han demostrado tener tanto un linaje evolutivo europeo como africano representados por los grupos cóncavo marrón y convexo rojo [22]. En segundo lugar, como se mostrará más adelante, algunas de estas razas locales brasileñas han experimentado una mayor introgresión de genes zebuinos. Sería interesante realizar un extenso análisis conjunto de las razas locales de varios países de América del Sur junto con todas las razas ibéricas para reconstruir una imagen de toda la región de los patrones de variación genética.

Una comparación de microsatélite autosómico, haplogrupos mtDNA y haplotipos de microsatélite Y-cromosoma ha demostrado que para las razas criollas bolivianas y argentinas ha tenido lugar la introgresión masculina mediada por cebuinas [23,36]. El patrón esperado para Brasil sería una proporción aún mayor del genoma ancestral zebuino en las razas taurinas criollas a medida que uno se mueve hacia el norte, consistente con la introducción y uso de animales zebuinos para una mejor adaptación a los climas tropicales. Tal tendencia fue detectada en nuestro estudio para todas las razas criollas analizadas, y particularmente para CRL y PAN que mostraron las distancias genéticas interraciales más pequeñas en relación a las tres razas zebuinas (Tabla 5), y del análisis de ESTRUCTURA, mejor visto con k = 3 (Figura 3). Varios animales de CRL y PAN mostraron una cantidad discernible de genoma de cebuina y la proximidad de estas dos razas con el grupo de cebuina se observó claramente en el gráfico de Neighbor-Net. Los datos históricos recogidos en los lugares donde se tomaron muestras de estos animales indican la presencia de machos de Nellore o de sus híbridos en los rebaños. En CUR y MON la introgresión zebuina fue menos pronunciada y casi ninguna para los animales CAR consistente con la historia de una gestión de cría más sistemática y segregada de CAR como una raza taurina. Dentro de la rama zebuina, las razas GYR y GUZ están más cerca y en el dendrograma de un solo animal los animales de estas dos razas se entremezclan, en consonancia con la proximidad geográfica de su centro de origen en la India. El análisis STRUCTURE fue capaz de diferenciar estas dos razas, sin embargo un número de animales mostraron ascendencia mixta. Ibeagha-Awemu et al. [29] al analizar un conjunto más grande de razas de cebuinas africanas señaló, de hecho, que el modelo-El enfoque de agrupamiento basado implementado por el programa STRUCTURE no puede efectivamente discriminar a individuos con genotipos muy estrechamente relacionados o niveles muy bajos de diferenciación a su raza legítima sin información previa de la población. Ha habido mucha controversia y se han propuesto varios enfoques para evaluar las prioridades de conservación sobre la base de marcadores moleculares [19,37]. En este estudio no se intentó definir la prioridad de conservación. Todas las razas criollas brasileñas son objetivos importantes y viables para la conservación [3]. Son genéticamente únicos y muestran rasgos peculiares que merecen esfuerzos de conservación. Por ejemplo, los animales CUR son pequeños, de bajo peso, muy adaptados a las regiones semiáridas de Brasil y capaces de sobrevivir en condiciones muy duras con poca comida y agua, mostrando una marcada resistencia a varios parásitos y alta fecundidad. Conclusión Este estudio reporta un estudio integral de la estructura genética y diversidad de razas bovinas en Brasil. El análisis genético mostró que una cantidad significativa de variación genética se mantiene en las poblaciones locales de ganado vacuno y todas las razas estudiadas podrían ser consideradas como entidades genéticas

distintas. Cuatro de las cinco razas criollas brasileñas mostraron una riqueza alelica notablemente mayor que todas las otras razas más probable como resultado de una combinación de selección natural en diversas condiciones ambientales, presión selectiva artificial leve e hibridaciones de razas recurrentes, incluida la introgresión de razas cebuinas. Los datos genéticos corroboran los registros históricos en que indican que los patrones variables de mezcla de razas han ocurrido desde tiempos coloniales que conforman el estado genético actual de las razas locales. Las razas criollas brasileñas constituyen un importante y diverso reservorio de diversidad genética para la cría de bovinos y objetivos viables para la conservación, ya que presentan rasgos peculiares de naturaleza fenotípica y cultural. Como han señalado varios autores, hay que tener en cuenta muchos otros aspectos, además de la cantidad y la distribución de la diversidad genética, al abordar las estrategias de conservación de las especies ganaderas. Los aspectos históricos, culturales y tradicionales relativos al uso de determinadas razas son cuestiones pertinentes. Además no hay que olvidar el hecho de que la selección direccional practicada por el hombre ha moldeado los genomas animales de maneras inesperadas favoreciendo alelos o complejos de genes para los cuales los marcadores neutros sustitutivos utilizados en las encuestas de diversidad no son necesariamente plenamente representativos. Métodos Animales Se analizaron diez razas bovinas brasileñas, con un total de 915 animales. Las razas estudiadas pueden clasificarse en tres grupos: a) razas taurinas criollas (Caracu - CAR; Criolo Lageano - CRL; Curraleiro - CUR; Mocho Nacional - MON y Pantaneiro - PAN); b) razas taurinas europeas (Holstein - HOL y Jer - ZEBUINE) y brasileñas (Nellore - NEL; Gyr - GYR y Guzerat - GUZ) (Cuadro 1). Para las razas donde la información pedigrí estaba disponible, individuos no relacionados por lo menos tres generaciones fueron seleccionados. El ADN genómico total se extrajo mediante un procedimiento de salazón de rutina [42]. Este estudio siguió los aspectos jurídicos y las normas con las que Embrapa está comprometida y ha sido aprobado por el Comité de Ética de Embrapa Recursos Genéticos y Biotecnología. Además, cumplía los requisitos legales establecidos por el Consejo de Gestión del Patrimonio Genético - CGEN del Ministerio de Medio Ambiente de Brasil. Tipificación de marcadores de microsatélites Veintidós microsatélites fueron amplificados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en cinco sistemas multiplex diferentes donde el cebador delantero de cada microsatélite fue etiquetado con fluorocromos de 6-FAM, HEX o NED según el rango de tamaño del alelo esperado. Varios de estos microsatélites han sido utilizados habitualmente por otros grupos de todo el mundo, lo que ha hecho posible el análisis comparativo o la consolidación de conjuntos de datos en el futuro. Los sistemas multiplex utilizados fueron: un 7-plex compuesto por

marcadores INRA35, INRA37, HEL9, HEL5, INRA63, ILSTS5, ETH152 (temperatura de recocido Ta = 56 C); un 2-plex de marcadores CSM9, CSSM33; un 5-plex de marcadores BM2113, ETH10, SPS115, TGLA122, ETH225 (Ta = 61 C) y un 5-plex de marcadores TGLA227, TGLA53, INRA23, ETH3, BM1824 (Ta = 61 C). El microsatélite CSSM66 se amplificó solo (Ta = 61 ºC) y el producto PCR se inyectó junto con los marcadores HEL1 e INRA5 antes de la electroforesis. Solo los marcadores CSSM9 [43] y CSSM33 [44] no se incluyeron en los recomendados para estudios de diversidad de la población bovina por el programa Modad de la FAO para el Manejo de los Recursos Genéticos Animales de Granja. Las referencias y secuencias iniciales de los microsatélites utilizados están disponibles en la base de datos sobre la diversidad bovina [25]. Los productos amplificados por PCR fueron electroinyectados en un analizador genético ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) y los datos recogidos bajo filtro virtual D usando Genescan 2.0 y Genotyper 2.1 (Applied Biosystems) para declarar alelos. Para calibrar alelos se utilizó un patrón de tamaño interno etiquetado con ROX [45]. Los genotipos de ocho loci recomendados por ISAG (BM2113, ETH10, SPS115, TGLA122, ETH225 TGLA227, INRA23, BM1824) se calibraron utilizando muestras de referencia genotipadas en la prueba de comparación ISAG 20052006 (D. Tapagratglia pers. comm.). El software Allelobin se utilizó para clasificar los tamaños observados de los alelos del microsatélite en alelos discretos representativos utilizando el algoritmo de minimización de mínimos cuadrados de Idury y Cardon [46]. Análisis de datos Las frecuencias de alelos se calcularon por conteo directo. Se estimaron parámetros de diversidad de locus para todos los marcadores microsatelitales de todas las razas utilizando el software Cervus [47], incluyendo: heterocigosidad observada (Ho), heterocigosidad esperada (He) y contenido de información polimórfica (PIC) Las estadísticas F de Wright para cada locus se calcularon utilizando el método de Weir y Cockerman [48] utilizando FSTAT [49]. Se obtuvo una prueba de significancia en las estimaciones de las estadísticas F de Wright (FIT, FIS y FST) para cada locus microsatelital mediante la construcción de intervalos de confianza del 95% y 99% basados en las desviaciones estándar estimadas por jackknifing en poblaciones usando FSTAT. Se utilizó una prueba exacta para determinar desviaciones de las proporciones de Hardy-Weinberg y deficiencia de heterocigosidad utilizando el paquete de software GENEPOP [50]. El método de la cadena Markov [51] se utilizó para estimar valores P exactos no sesgados. Las estimaciones de la variabilidad genética para cada raza (He, Ho con su error estándar asociado) se calcularon utilizando el Excel Microsatellite Toolkit [52]. Se utilizó el software FSTAT para calcular la riqueza alélica (AR) estandarizada para la variación en el tamaño de la muestra. La diferenciación de razas fue estimada por las estadísticas F de Wright (FIT, FIS y FST) y el valor indicativo P fue ajustado por un procedimiento Bonferroni utilizando el mismo

paquete de software [49]. Utilizando información de raza se formaron diferentes grupos basados en su origen (taurina zebuine) e información previa (raza criolla especializada). Con estas definiciones, se realizó un análisis jerárquico de la varianza utilizando un enfoque de análisis de varianza molecular (AMOVA) implementado en el paquete ARLEQUIN [53]. Las distancias genéticas entre razas fueron estimadas por DA [54] usando DISPAN [55]. La distancia tradicional de Reynold (FST) fue calculada usando FSTAT. Las estadísticas logarítmicas de probabilidad G [56] se utilizaron para estimar los valores P y la significación de pares se estableció tras una corrección estándar de Bonferroni [49]. También se estimó RST [57] utilizando el programa Microsat. La correlación del momento del producto (r) y la estadística de la prueba de Mantel se calcularon para comparaciones de pares de matrices de distancia. Un árbol UPGMA (Método de Grupo de Par No Ponderado con Media Aritmética) y un árbol de unión del vecino fueron construidos basados en distancias DA usando el paquete Dispan. Los valores de bootstrap se calcularon sobre 1.000 replicas. Adicionalmente se construyó un gráfico Neighbor-Net [58] basado en distancias DA con el programa Splitstree4 [59]. Las distancias genéticas en pares entre todos los animales individuales se calcularon mediante el logaritmo de las proporciones de alelos compartidos (Dps) [60], utilizando Microsat [61]. El método de agrupamiento [62] se utilizó para construir un árbol basado en la matriz de distancia genética utilizando el paquete Phylip [63] y el archivo resultante se introdujo en Treeexplorer [64] para encontrar una representación gráfica adecuada. Sobre la base de los genotipos en los 22 loci marcadores, los animales individuales se agruparon en un número determinado de poblaciones y se asignaron probabilísticamente a los grupos inferidos con un enfoque bayesiano implementado por el software STRUCTURE [65]. Las pruebas se realizaron sobre la base de un modelo de mezcla en el que las frecuencias alélicas se correlacionaron aplicando un período de combustión de 50.000 y 500.000 iteraciones para la recopilación de datos. De dos a quince grupos inferidos se realizaron con tres carreras independientes cada uno. Los resultados se introdujeron en el programa DISTRUCT [66] para proporcionar una visualización gráfica.