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Práctica

3 Fraccionamiento Celular Objetivos  Entrenar al estudiante en técnicas de ruptura y separación celular con el objeto de obtener partes celulares aisladas para su posterior estudio.

La célula eucariota es un sistema altamente organizado con organelas que cumplen funciones específicas. Para poder estudiar cada una de sus partes, es necesario separar los componentes celulares y en ello se utiliza la técnica de fraccionamiento subcelular, que consiste en dos componentes comunes independientemente del tipo de tejido o célula: I. La disgregación o ruptura de la membrana y/o pared celular. Existen varios métodos de ruptura, entre los que se encuentran la sonicación y la homogeneización. II. La separación cada fracción según criterios como tamaño, masa y densidad, aplicando técnicas de centrifugación o por columnas de exclusión. Un elemento importante a considerar corresponde a las características químicas del medio líquido en donde se realizará el fraccionamiento. Para la ruptura celular se debe utilizar una solución con pH y contenido de sales apropiado, que mantengan el sistema tan intacto como sea posible, ya que los iones que lo componen influyen en la estructura de los orgánulos que se deseen obtener. La ruptura de las células produce una mezcla, denominada homogeneizado. Seguidamente se procede a centrifugar diferencialmente el homogeneizado con el objeto de separar sus partes. También es posible realizar gradientes de densidad para separar componentes celulares, en el mismo tubo. 1

Biología Celular. Práctica 3. Fraccionamiento Celular

Introducción Una de las principales características de las células eucariontes, es que muchos de sus procesos metabólicos se realizan en compartimientos denominados orgánulos como son: el núcleo, los retículos endoplásmicos rugoso y liso, el aparato de Golgi, la mitocondria, los cloroplastos, las vacuolas, los lisosomas, peroxisomas, entre otros. En este sentido los orgánulos tienen dos elementos comunes, el primero es que están compuestos por una o dos membranas, las cuales tienen diferentes propiedades fisicoquímicas y la segunda es la presencia de proteínas, ácidos nucleicos, azúcares y otros metabolitos en su interior. Las características moleculares, bioquímicas y formas de los diferentes orgánulos que componen a los organismos unicelulares o pluricelulares, han permitido su aislamiento y purificación a través de una metodología denominada “Fraccionamiento Subcelular o también conocido como Fraccionamiento Celular”, la cual es definida como una serie de técnicas y procedimientos que permiten separar y purificar un orgánulo especifico de las células para su estudio. Los orgánulos a pesar de tener moléculas comunes, difieren entre ellos gracias a la organización y las propiedades celulares de cada uno, las cuales determinan la forma y función de cada orgánulo en la célula. Por ejemplo, el núcleo, la mitocondria y los cloroplastos son los únicos orgánulos que tienen en común dos membranas, ácidos nucleicos y proteínas similares, pero la diferencia entre ellos es la organización de sus membranas y los procesos metabólicos que en ellos se realizan. A saber, en los tres ocurre la duplicación del ADN y la transcripción, entre otros, pero algunas enzimas son exclusivas de la mitocondria, además la biosíntesis del ATP. Mientras que en el cloroplasto otras enzimas efectúan la fotosíntesis. El aislamiento de orgánulos es uno de los elementos claves para el desarrollo de la Bilogía Celular y de otras áreas biológicas. Por ello desde un principio, para lograr el avance de los estudios científicos enfocados a las células, fue necesario el establecer un procedimiento que permitiera tener cualquier orgánulo puro, manteniendo su integridad celular y que pudiese continuar la realización de sus procesos celulares. La solución a lo anterior fue la centrifugación; la cual consiste en la separación de partículas en una solución por medio de la fuerza centrífuga. El principio técnico se sustenta en que cada uno de los orgánulos de una célula tiene diferente forma, densidad y peso, por lo tanto, cada orgánulo tiene un patrón de separación específico en función del solvente en donde se realice la centrifugación. La separación por centrifugación se basa en las diferencias de tamaño y densidad. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF) en unidades de gravedad (g). La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (X) y el (rpm), se puede determinar el RCF a partir de la ecuación: RCF = (1.19*10-5)*(rpm)*(2X) Donde X se toma como la distancia (en cm), desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga. En la actualidad, se conocen cuatro tipos de centrifugación cuyos desarrollos se sustentan en la densidad de los orgánulos y/o partículas además de la concentración y tipo de solución en las que se encuentran suspendidas, siendo estas:

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 Centrifugación diferencial. También denominada centrifugación preparativa. Ella tiene fundamento en la densidad de los orgánulos y de las partículas. Por ello los orgánulos y partículas con densidades similares sedimentan en el mismo punto. El homogeneizado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. La primera centrifugación es a 600 g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” o sedimento contiene el núcleo, células intactas y tejido. La siguiente separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el precipitado o “pellet” nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrífuga centrifugándose a 10000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial; este último contiene mitocondrias y microcuerpos.  Centrifugación zonal. La separación de las partículas ocurre por diferencias en la velocidad de sedimentación debido a las distintas masas de los orgánulos y partículas que componen la muestra de estudio. Para ello se requiere un gradiente de densidad y por lo tanto al colocar la muestra en la parte superior del gradiente y al aplicar una velocidad constante, los orgánulos y las partículas se moverán a distinta velocidad en las diferentes partes del gradiente por su masa.  Centrifugación isopícnica. En ella se emplean medios de diferente densidad para la separación de los orgánulos y las partículas que poseen el mismo coeficiente de sedimentación.  Ultracentrifugación. Se sustenta en gradientes continuos o discontinuos y una de sus características son las altas velocidades que emplea para la separación de orgánulos o partículas. Para la generación de cualquiera de estas formas de centrifugación se han desarrollado diferentes tipos de centrífugas las cuales pueden ser de una velocidad baja, alta y ultracentrifugación. Su identificación está en función de la capacidad de generar la fuerza centrífuga para realizar la separación de los orgánulos o partículas. Además, se requiere de un rotor el cual es un aditamento en donde se coloca la muestra y es la parte de la centrífuga donde se realiza el giro que generará la fuerza centrífuga. Objetivo Entrenar al estudiante en técnicas de ruptura y separación celular con el objeto de obtener partes celulares aisladas para su posterior estudio. Actividades previas que debe realizar el estudiante Preparar los siguientes conceptos: sonicación, homogeneizador (funcionamiento y aplicaciones), homogeneizado (características), centrifugación (principios, tipos y aplicaciones), calidad del fraccionamiento (¿De qué depende?), citometría de flujo (aplicaciones), colorante 2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) (aplicaciones), Buffer TES y Tris-HCl (composición).

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Materiales y Métodos Material disponible en el laboratorio  2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) al 0.01% (p/v)  Agua destilada a 4ºC  Buffer TES  H2SO4 al 30%  Perhidrol  Molibdato de amonio 2,5% p/v  SDS al 10% v/v  Solución de NaCl al 0.9% p/v  Solución tampón de maceración (buffer Tris-HCl 40 mM)  Soluciones de sacarosa a las siguientes concentraciones (p/v): 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% y 5%

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Espectrofotómetro Centrífugadoras Cilindro graduado de 100 mL Émbolo Licuadora Mortero con mazo Pipetas de vidrio Tijeras. Tubos de centrífuga de 15 mL, de poliestireno y fondo cónico  Tubos de centrífuga de 2 mL fondo cónico  Colorantes Sudán IV al 2%, Azul de Metileno al 2% y Eosina al 2%

Material que debe traer el estudiante  Cámara fotográfica (opcional, se puede emplear para sustituir la esquematización de las observaciones).  Gasa.  Muestras frescas de espinacas o albahaca (compradas la noche anterior a la práctica).  Hígado y corazón de res Obtención de los homogenatos Material animal Pese 4 gramos de hígado o corazón, corte y macere con el mazo del mortero hasta formar una papilla. Trasvase a un homogenizador de tejidos y recoja los restos en el mortero con solución tampón (buffer) TES. Efectúe 8-10 pases con el émbolo. Filtre a través de una gasa y complete a 20 mL con el buffer TES. Reserve a 4ºC hasta su uso. Material vegetal Pese 24 gramos de hojas de espinacas o albahaca, colóquelos en la licuadora (usada como homogenizador de tejidos), y agregue 45 mL de buffer Tris-HCl 40 mM (solución tampón de maceración, BM). Filtre a través de una gasa y complete a 50 mL con el buffer BM. Reserve a 4ºC hasta su uso. Gradiente discontinuo de densidad Tome seis tubos de centrífuga de 15 mL, previamente identificados para la muestra animal (3 de ellos), y para la muestra vegetal (los otros 3), y añádale a cada uno 1 mL de solución de sacarosa de cada una de las siguientes concentraciones (p/v), en el mismo orden: 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% y 20%. Para que el gradiente sea adecuado a los propósitos de la práctica, hay que trabajar con las soluciones muy frías, depositar cada capa lentamente sobre la anterior, para evitar que se mezclen, y utilizar una pipeta de vidrio distinta para cada solución. Sobre la última capa se depositará la muestra biológica, que consiste en 1 mL del homogeneizado de hojas de espinaca o albahaca, o de hígado de rata, preparados previamente. Cuando los tubos estén listos y balanceados, realice lo siguiente: a. Una pareja de tubos con muestra animal y con muestra vegetal, se dejará por 24 h a 4ºC. b. Otra pareja de tubos con muestra animal y con muestra vegetal, se centrifugará con rotor de ángulo fijo a 10000 rpm por 30 minutos. c. La última pareja de tubos, se centrifugará con rotor basculante a 14000 rpm por 45 minutos.

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Al finalizar la centrifugación observe y compare la disposición del homogeneizado en todos los tubos. Centrifugación diferencial Tome 2 mL del homogenato de la muestra animal y centrifugue a 5000 rpm durante 5 min. Separe el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P1. Vuelva a centrifugar el sobrenadante obtenido a 10000 rpm durante 10 min. Separe nuevamente el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P2. Centrifugue el sobrenadante obtenido de la centrifugación anterior a 14000 rpm durante 15 min. Separe el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P3. Disuelva los precipitados P1, P2, y P3 con NaCl 0.9 % p/v hasta 1.5 mL. Realice el mismo procedimiento para la muestra de tejido vegetal, pero identificando los precipitados como E1, E2, y E3. Compare los tubos y anote sus observaciones. En ambos casos (vegetal y animal) realice las siguientes pruebas para evaluar la calidad del fraccionamiento: Determinación de la cantidad de DNA Tome 100 μL de las soluciones de P1, P2, P3, E1, E2 y E3, y coloque cada una en tubos de 2 mL, previamente identificados. Agregue a cada tubo 50 μL de SDS 10% v/v y agite. Añada 650 μL de NaCl 0.9% p/v y resuspenda. Mida la absorbancia del sobrenadante de las soluciones a una longitud de onda de 260 nm. Determinación de fosfato Una vez determinada la absorbancia a 260 nm a los sobrenadantes de las soluciones P1, P2, P3, E1, E2 y E3, trasvase 0,5 mL de cada una de esas soluciones a tubos de ensayo. Agregue 0,5 mL de H2SO4 30% v/v. Caliente vigorosamente sobre un mechero. Observe el oscurecimiento de la solución y adicione de 1 a 2 gotas de perhidrol. Continúe calentando hasta que la solución se torne incolora. Adicione de 1 a 2 gotas de molibdato de amonio 2,5% p/v. Observe si el volumen en los tubos es uniforme y la coloración amarilla que se produce (fosfomolibdato de amonio). Anote la intensidad de color en cada tubo. Presencia de transporte de electrones En las fracciones vegetales, agregando el colorante 2,6 dicloro fenol indo fenol (DCFIF). Tome 500 μL de las soluciones E1, E2 y E3, coloque en tubos, y anote la coloración inicial. Luego agregue 50 μL de colorante DCFIF. Nuevamente, anote la coloración obtenida al añadir el DCFIF. Deje actuar el colorante durante 24 horas y observe la coloración final en los tubos. Componentes celulares Aislamiento de núcleo Tome 10 mL del homogeneizado y centrifugue a 600 g por 10 min. Retire el sobrenadante (colóquelo en otro tubo) y mantenga la pastilla que contiene los núcleos, que debe resuspender en 5 ml de sacarosa al 5%. Coloque 3 ml de la fracción anterior en la parte superior del gradiente de sacarosa 80:30:10. Centrifugue a 500 g por 15 min. Por medio de una pipeta retire cuidadosamente cada una de las bandas que se formaron en el gradiente de sacarosa y colóquelas cada una en tubos Eppendorf de 1.5 ml. Adicione 1 ml de amortiguador fosfato correspondiente a las fracciones obtenidas y mezcle gentilmente. Centrifugue por 5 min a 1000 gravedades. Retire el sobrenadante y adicione 5 ml de amortiguador fosfatos y repita la centrifugación 3 veces más. Resuspenda la pastilla en 1000 μL de amortiguador fosfato.

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Coloque en cuatro tubos Eppendorf 400 μL de las soluciones: Azul de Metileno, Eosina, Hematoxilina y Sudán IV, y adicione a cada colorante 200 μL de los núcleos resuspendidos y mezcle gentilmente por 30 segundos. Incube las mezclas por 5 min a 40°C. De cada tinción realice un frotis de 30 μL en el cubre objetos y fije la muestra por calor. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitado con agua desionizada para retirar el exceso de colorante y observe sus muestras en el microscopio. Aislamiento de mitocondrias Coloque 3 mL del sobrenadante anterior en la parte superior del gradiente de sacarosa 30, 25, 20, 15, 10 en una proporción 1:1:1:2:2 y centrifugue a 3500 g por 45 min. Retire cuidadosamente el sobre nadante, recupere la fracción de las mitocondrias y resuspenda en 5mL de sacarosa 10%, seguidamente centrifugue la fracción a 3500 g durante 10 min, repita 3 veces más. Resuspenda la pastilla en 1000 μL de amortiguador fosfato. Coloque 200 μL de las mitocondrias en cuatro tubos Eppendorf y afore con 400 μL de amortiguador fosfatos. Adicione 200 μL de los colorantes Sudán IV, Azul de Metileno y Eosina y mezcle suavemente por 30 segundos. Incube las mezclas por 5 min a 50°C. De cada tinción realice un frotis de 50 μL en el cubre objetos y fije la muestra por calor. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitado con agua desionizada para retirar el exceso de colorante y observe sus muestras en el microscopio. Aislamiento de cloroplastos Tome 10 mL del homogeneizado y centrifugue a 1000 g por 5 min. Retire el sobrenadante y mantenga la pastilla que contiene los cloroplastos y los núcleos. Resuspenda en 5 mL de sacarosa al 5% y centrifugue a 200 g por 5 min. Retire el sobrenadante que contiene los cloroplastos. Coloque 3 ml en la parte superior del gradiente de sacarosa 60, 40, 20, 15, 10 y centrifugue a 500 g por 15 min. Por medio de una micropipeta retire cuidadosamente cada una de las bandas que se formaron en el gradiente de sacarosa y colóquelas en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Adicione 1 mL de amortiguador fosfato a las fracciones obtenidas y mezcle gentilmente. Centrifugue por cinco min a 3200 g, retire el sobrenadante, resuspenda el precipitado con 1 mL de amortiguador fosfato, y repita la centrifugación 3 veces más. Coloque en tubos Eppendorf 200 μL de: Azul de Metileno, Eosina y Sudán IV. Adicione a cada colorante 200 μL de las fracciones resuspendidas y mezcle gentilmente por 30 segundos. Incube las mezclas por 5 min a 40ºC. De cada tinción realice un frotis de 30 μL en el cubreobjetos y fije la muestra por calor. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitado con agua desionizada para retirar el exceso de colorante y observe sus muestras en el microscopio.

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Resultados Determinación de la cantidad de DNA Homogenato Absorbancia Homogenato Animal (260 nm) Vegetal P1

E1

P2

E2

P3

E3

Absorbancia (260 nm)

Observaciones:

Determinación de fosfato Homogenato Observaciones Animal P1 P2 P3

Homogenato Vegetal E1 E2 E3

Observaciones

Presencia de transporte de electrones Antes de añadir DCFIF

Coloración Luego de añadir DCFIF (0 h)

Luego de añadir DCFIF (24 h)

E1 E2 E3

Referencias Bibliográficas Alberts A., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter (2006). Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Garland Science. USA. Cvjetkovic A, Lötvall J, Lässer C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2014 Mar 25;3. Karp, G. (2010). Biología Celular y Molecular. 6ª ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. España. Lodish H., A Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M. Scott, S. Zipursky & J. Darnell (2005). Molecular Cell Biology. 5th ed. W. H. Freeman & Co. USA.

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