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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Unidad Santo Tomas Departamento de Microbiología Laboratorio de Genética Microbiana “Aislamiento y caracterización de DNA” Profesores QBP. Ilse Citlalli Calvo Villarreal M.E. Margarita Pineda López Dra. Martha Elena Esteva García Dr. José Antonio Ibarra García Sección: 1 Equipo: 03 Esquivel Rojas Gustavo Gallardo Sánchez Daniela Salgado Sandoval Luis Manuel

Objetivos     

Aislar DNA cromosómico de Escherichia coli W3350 a partir de un cultivo bacteriano en caldo Luria Calcular la concentración y pureza de del DNA obtenido Elaborar el espectro de absorción del DNA de Escherichia coli W3350 Elaborar y analizar la curva de desnaturalización de DNA Emplear el programa bioinformático DNAMAN para determinar la influencia de diferentes parámetros sobre la desnaturalización de oligodesoxirribonucleótidos

Introducción Los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por monómeros llamados nucleótidos. Por tanto el DNA es un polinucleótido. Un nucleótido se compone de tres unidades: un azúcar de cinco átomos de carbono (pentosa), desoxirribosa en el DNA, una base nitrogenada y una molécula de fosfato. Las bases nitrogenadas presentes en el DNA pertenecen a dos clases. Las bases púricas, adenina y guanina, contienen dos anillos heterocíclicos, mientras que las bases pirimidínicas, timina y citosina, contienen un único anillo heterocíclico de seis elementos. Los nucleótidos están formados por una base nitrogenada unida a un azúcar pentosa por enlace glicosídico entre el átomo de carbono 1 del azúcar y un átomo de nitrógeno de la base, el marcado como 1 en una base pirimidínica o el 9 en una base púrica. Una base nitrogenada unida al azúcar, sin el fosfato, se denomina nucleósido. Los nucleótidos son, por tanto, nucleósidos con uno o más fosfatos. El esqueleto de un ácido nucleico es un polímero en el que alternan moléculas de azúcar y de fosfato. Los polinucleótidos contienen nucleótidos que están unidos covalentemente por medio de fosfato entre el carbono conocido como 3´de un azúcar y el carbono 5´de otro azúcar adyacente. Esta unión se denomina enlace fosfodiéster porque una molécula de fosfato se une por enlace éster a dos azúcares. La secuencia de nucleótidos en una molécula de DNA se denomina estructura primaria. Como hemos dicho, la secuencia de bases en un DNA lleva información y codifica la secuencia de aminoácidos en las proteínas o codifica RNA específicos ribosómicos o de transferencia. En el genoma de las células el DNA se presenta en forma de doble cadena. Cada cromosoma contiene dos cadenas y cada una de ellas está formada por miles o millones de nucleótidos unidos por enlace fosfodiéster. Las cadenas se asocian entre sí mediante puentes de hidrógeno que se establecen entre os nucleótidos de una y otra cadena. Cuando las bases púricas y pirimidínicas de cada cadena se sitúan adyacentes se forman dichos puentes de hidrógeno. Los enlaces más estables de este tipo ocurren cuando la guanina forma enlace con la citosina y cuando la adenina lo forma con la timina. El apareamiento específico de adenina con timina y de guanina con citosina significa que las dos cadenas son complementarias en su secuencia de bases; es decir, cuando en una cadena aparece guanina, en la otra aparece citosina y lo mismo ocurre con timina y adenina. En el aislamiento de los ácidos nucleicos debe tenerse en cuenta lo siguiente: 1.- Debe romperse eficientemente la pared y membrana celular para facilitar la extracción del ácido nucleico deseado. 2.- Se debe trabajar en condiciones que inhiban las nucleas (enzimas degradativas) liberadas durante el proceso de lisis celular.

El método para aislar DNA, involucra el rompimiento de la pared y la membrana celular, inhibición de las nucleasas, precipitación de DNA impuro, disociación de proteínas del DNA y re precipitación del DNA ya purificado.

Resultados Tabla No 1. Concentración y pureza de DNA cromosómico de Escherichia coli W3350 Equipo

As230

As260

As280

1 2 3 4 5 6

28.107 6.895 11.771 16.025 14.520 10.910

53.026 15.191 25.454 46.137 31.624 22.757

27.113 7.347 12.183 23.351 15.260 11.327

Concentración Pureza C=As260nm/ P= (Aexb) As260nm/As280nm [=]µg/mL

2356.7111 675.1555 1131.2888 2050.5333 1405.5111 1011.4222

1.9557 2.0676 2.0893 1.5475 2.0723 2.0090

Los resultados anteriores, se obtuvieron de la siguiente manera Ejemplo (equipo 3) C=As260nm/ (Aexb) C= 25.454/(22500x1)= 1.1312x10-3 g/mL 1g = 1x106 µg 1.1312x10-3 g = X X= 1131.2888 µg/mL P=As260nm/As280nm P= 25.454/12.183 P= 2.0893 C= 1 Unidad de As260nm DNA 2 cadenas = 50µg/mL DNA 2 cadenas C= 25.454 unidades = Y Y= 1272.7 µg/mL P= As260nm/As230nm P= 25.454/11.771 P= 2.1624

Concentración Pureza 1 Unidad de P= As260nm DNA 2 As260nm/As230nm cadenas = 50µg/mL DNA 2 cadenas

2651.3 759.55 1272.7 2306.85 1581.2 1137.85

1.8865 2.2031 2.1624 2.8791 2.1779 2.0858

Absorbancia

Tabla No 2. Absorbancias a diferentes longitudes de onda del DNA cromosómico de Escherichia coli W3350 Equipo

1

2

3

4

5

6

Longitud de onda 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

28.107 28.107 33.087 47.566 53.026 42.033 27.113 11.618 2.267 0.588 0.359

6.895 6.895 9.537 13.913 15.191 11.935 7.347 3.057 0.587 0.143 0.158

12.575 11.771 16.025 23.058 25.454 19.859 12.183 4.097 0.978 0.228 0.152

21.951 16.025 28.476 41.342 46.137 36.3337 23.351 9.889 1.841 0.377 0.270

16.944 14.520 19.717 28.498 31.624 24.726 15.260 6.348 1.173 0.245 0.185

10.910 10.910 14.949 20.857 22.757 17.827 11.327 4.917 1.029 0.239 0.253

Tabla No. 3 Absorbancias a diferentes longitudes de onda para DNA de Escherichia coli.

28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Longitud de onda

220

240

260

280

300

320

340

Longitud de onda nm

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

A

12.575 11.771 16.025 23.058 25.454 19.859 12.183 4.097 0.978 0.228 0.152

Figura 1. Espectro de absorción del DNA de Escherichia coli W3350 (Equipo 3)

Oligodesoxirribonucleótidos diseñados 1. Influencia del contenido de GC

Oligo No.1: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C)

5'-CGT AGT CAT GAT CGT ACG TAC GTA AAG TCT GAT GCA ACG T-3' 3'-GCA TCA GTA CTA GCA TGC ATG CAT TTC AGA CTA CGT TGC A-5' 40 65.7 75.9

Oligo No. 2: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C)

5'-ACG TAC TAG CTC GAT CGA TCG ATT ACG ATC GCT ACG ACG A-3 ' 3´-TGC ATG ATC GAG CTA GCT AGC TAA TGC TAG CGA TGC TGC T -5´ 40 67.9 79.2

Oligo No. 3: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C)

5'-TAC GGC TAT CGA TAT AGC TAT CGA TAT ATC GCG CTA TCG A -3 ' 3´-ATG CCG ATA GCT ATA TCG ATA GCT ATA TAG CGC GAT AGC T -5´ 40 66.9 77.3

2. Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos Oligo No.1: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C) Coeficiente de extinción molar.

Oligo No. 2: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C) Coeficiente de extinción molar.

Oligo No. 3: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C) Coeficiente de extinción molar.

5'- CCC CCC CCC CAA AAG GGG TTT TAA AAG GTT TTT TAA GGG G -3 ' 3'- GGG GGG GGG GTT TTC CCC AAA ATT TTC CAA AAA ATT CCC C -5 ' 40 50 % 67.5 ºC 380700 L / (mol · cm)

5'- CCC CCG GGG GAA AAA TTT TTA AAA ATT TTT GGG GGC CCC C -3 ' 3´-GGG GGC CCC CTT TTT AAA AAT TTT TAA AAA CCC CCG GGG G-5´ 40 50 % 68.3 ºC 376800 L / (mol · cm)

5'- AAA AAT TTT TGG GGG CCC CCG GGG GCC CCC AAA AAT TTT T-3 ' 3´- TTT TTA AAA ACC CCC GGG GGC CCC CGG GGG TTT TTA AAA A -5´ 40 50 % 70.1 ºC 376300 L / (mol · cm)

3. Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos Oligo No.1: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C)

5'-GC TAG CTA-3' 3'- CG ATC GAT-5' 8 50 17.9

Oligo No.2: 5'-GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TAG CTA GCT AGC TA-3' Secuencia Complemento 3'-CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG ATC GAT CGA TCG AT-5' Longitud 54 %G+C 50 TM (°C) 71.5

Oligo No.3: Secuencia Complemento Longitud %G+C TM (°C)

5'GCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTA3' 3'CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGAT5'

79 50 74.2

Discusión Para esta práctica, los resultados a evaluar son la concentración y la pureza del DNA obtenido a partir de una cepa de Escherichia coli. Se determinó concentración y pureza por dos métodos, los cuales teóricamente deberían llevar a un mismo resultado, pero en la práctica esto no se cumple por varios aspectos que a continuación se describen: Determinación de concentración para DNA. Para este cálculo se utilizaron dos métodos 𝐴 (260 𝑛𝑚) 𝐴 (260 𝑛𝑚) Relacion 1 u A(260nm) 50 µg/mL DNA Formula (𝐶 = (𝑎𝑒)(𝑏) = (22500)(𝑐𝑚)) Ambos métodos derivan de la Ley de Bouger-Beer, pero la más eficiente para el análisis realizado con las muestras obtenidas por los alumnos es utilizando la formula, ya que toma en cuenta el paso de luz de la celda donde se incidió el haz de luz, además esta fórmula engloba a cualquier tipo de DNA, ya sea monocatenario o bicatenario, y con pureza variable; caso contrario con la relación matemática, que forzosamente necesita DNA de doble cadena y que sea de alta pureza, es decir que contenga un mínimo de proteína no interferente y de ser posible que no esté presente en la determinación, además de contemplar un solo paso de haz de luz, que se vuelve despreciable. Por tanto el valor de concentración utilizando esta relación será más elevado que utilizando la formula si lo aplicamos a nuestra muestra, ya que asume que el DNA obtenido es puro y no es fragmentado, lo

cual no sabemos. Para saber que nuestro DNA está intacto, es decir con las dos cadenas unidas, este DNA desnudo debería ser reinsertado en una bacteria y calcular el porcentaje de expresión del DNA, y así determinar si este material genético es de doble cadena, sin embargo esto no es de nuestro interés por el momento, solo queremos saber si está presente nuestro DNA y en qué cantidad. Estadísticamente hablando, una prueba de hipótesis para la diferencia de medias de ambos métodos arroja una región de rechazo por debajo de -2.3060 o por arriba de +2.3060, el estadístico de prueba se encuentra entre los valores intermedios de este intervalo (0.4070), por lo tanto no hay diferencia significativa que indique una diferencia entre ambos métodos, con lo que pudiera decirse que es indistinto utilizar un método u otro, sin embargo con base en la experiencia realizada y los resultados obtenidos podemos decidir que el utilizar la fórmula es el mejor método para la muestra obtenida, ya que no es un estándar de alta pureza y no se sabe si está en su forma nativa, o en su forma desnaturalizada. Determinación de pureza para DNA. Para determinar la pureza del DNA se realizó un cociente: 𝐴 (260𝑛𝑚) 𝐴 (260𝑛𝑚) 𝑃= 𝑃= 𝐴 (280 𝑛𝑚) 𝐴 (230 𝑛𝑚) Este cociente , uno para cada método para determinar concentración, relaciona dos características fundamentales de las proteínas, uno es el enlace peptídico, que al estar en resonancia absorben energía, y por otra parte los aminoácidos con anillos aromáticos activados, los cuales tiene pares de electrones en resonancia que estabilizan la carga del anillo. Se esperaría que ambos cocientes dieran una relación de absorbancia ≥1.8, lo cual indicaría que el DNA obtenido es apto para seguir trabajándolo, sin embargo notamos que en la experimentación estos resultados difieren de lo esperado, sin embargo tomando en cuenta las características antes mencionadas, la cantidad de aminoácidos aromáticos presentes en una proteína es menor a la cantidad de enlaces peptídicos que esta pueda tener, el enlace peptídico es constante, en cambio los anillos aromáticos activados pueden o no estar presentes, por ello es más confiable la relación A (260nm)/ A(280nm), que A (260nm)/ A(230nm). Estadísticamente, realizando una prueba de hipótesis para la diferencia de medias de ambos métodos con un nivel de confianza del 95% se encuentra que no existe diferencia significativa para ambos procedimientos, ya que el estadístico de prueba arroja un resultado de 0.7120, el cual se encuentra entre los límites de la región de rechazo que son menores a -2.306 y mayores a 2.306, lo cual indica que ambos procedimientos son aceptables a la hora de determinar pureza. En cuanto se refiere al método de aislamiento de DNA, se tiene paso críticos donde puede haber ruptura de la doble cadena, así como la presencia de contaminantes que alteran la concentración y la pureza del DNA. La ruptura celular, uno de los pasos más importantes a la hora de la de la purificación de DNA, ya que los medio habituales como sonicación, molienda y mezcla pueden ocasionar la ruptura de la cadena de DNA en pequeños fragmentos (Surzycki, 2003). En el laboratorio se emplearon métodos químicos para el aislamiento y caracterización de DNA; los principales compuestos empleados para la lisis fueron enzimas como la lisozima, y algunos detergentes como el SDS. Este último tiene un impacto importante al desestabilizar las membranas celulares, mientras las enzimas como la lisozima hidroliza la petidoglicana de la pared celular; una mala resuspencion del paquete celular no permite una buena lisis celular obteniendo cantidades mínimas de DNA. Otro de los factores que también pueden influir en la calidad del DNA es el lavado que se le hace a los paquetes celulares ya que estos pudieran tener células lisadas o enzimas que pudieran degradar el DNA como las DNAsas y RNAsas. La utilización de compuestos quelantes como lo es el EDTA nos permite “atrapar” iones divalentes como el magnesio (Mg++), que son cofactores de algunas enzimas que rompen la doble cadena del DNA. La adición de sales como el cloruro de sodio, también juega un papel importante a la hora de la

extracción del DNA, posiblemente este sea uno de los factores, por lo cual la cantidad de DNA extraído fue menor en el equipo tres comparado con los equipos uno y cuatro respectivamente, debiéndose a que una menor cantidad de sales no permite una buena interacción con los grupos fosfatos de las cadenas, ocasionando que la molécula no se pliegue así misma de forma eficiente y por ende se tendría una menor cantidad de DNA precipitado. Según Velázquez et al, 2014 la adición de Sodio o sales de amonio reduce las fuerza repulsivas entre las cadenas y permite que el DNA se pliegue sobre sí mismo. La eliminación de proteínas es el segundo paso para este proceso de purificación una vez que las células han sido lisadas, se emplean en este caso soluciones orgánicas, que pueden desnaturalizar las proteínas existentes producto de la lisis celular. Estos compuestos son el fenol, cloroformo y alcoholes (alcohol isoamílico); el fenol al intercalarse en el núcleo hidrofóbico de las proteínas permite que su configuración cambie, ocasionando la pronta desnaturalización de la proteína (método de Kirby) y la utilización de solventes orgánicos como el cloroformo-alcohol isoamílico es para disolver compuestos apolares como lípidos, proteínas, y/ o compuestos orgánicos de la células bacterianas (Escherichia coli cepa W3350). La formación de dos fases a la hora de la extracción de DNA es otro de los pasos críticos ya que al no tomar adecuadamente la fase acuosa donde se encuentra el DNA, se puede extraer de la fase orgánica proteínas y otros componentes de contaminación. Posiblemente una menor cantidad del DNA en el equipo 3, 5 y 6 se debe a la mala extracción de la fase acuosa, dejando un pequeño volumen que posiblemente pudiera tener una cantidad significativa de DNA. La precipitación del DNA con etanol al 70 % pudiera de una forma influir en la cantidad obtenida de DNA en los equipos 3, 5 y 6, comparado con el 1 y 4 que tuvieron mayor cantidad; al estar utilizando etanol al 70% nos permite eliminar la sales presentes en el medio y precipitar la cadena de DNA, pero en el método se emplea el doble de volumen que se obtiene para poder precipitar el DNA, a lo cual se empleó alcohol ismo milico para poder precipitarlo. Un mal manejo de la técnica de la extracción de DNA puede fragmentar la molécula, teniendo alteraciones en la cuantificación de la misma.

Conclusiones    

Se aisló DNA cromosómico de Escherichia coli cepa W3350, de alto peso molecular. Se demostró la influencia de los reactivos en la concentración y purificación del DNA cromosómico. La influencia de algunas características del DNA fueron determinadas mediante el programa DNAMAN. El DNA aislado fue leído en un espectro , realizando un espectro de absorción el cual corresponde con el espectro teórico, donde el pico máximo de absorbancia es a 260 nm.

Bibliografía   

Madigan M., Martinko J., Dunlap P., Clark D., (2009), Brock “Biología de los microorganismos”, Pearson Addison Wesley, Duodécima Edición, Pp. 63 y 64 Cox Nelson, (2009), Lehninger “Principios de Bioquimica”, Omega, Quinta Edicon, Pp. 27-30 Velázquez LPA, Martínez MdCA, Romero AC. Extracción y purificación de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos. 2014:1 Surzycki. S. 2003. Human Molecular Biology. Blackwell Science. Main Street, Malden, MA, 5018, EE.UU. Pp. 3-11