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PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA ______________________________________________________________________ UROCULTIVO

Martin Arrieta1, Carmen Rangel1 Estudiantes de IV semestre de Medicina

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Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina Sincelejo, Sucre, Colombia Agosto-2011

RESUMEN La infección urinaria está provocada por la invasión de microorganismos en el tracto urinario. Puede producirse por dos vías diferentes: por el extremo inferior de las vías urinarias (abertura en la punta del pene o de la uretra, según se trate de un hombre o de una mujer), que es el caso más frecuente; o bien a través del flujo sanguíneo, en cuyo caso la infección afecta directamente a los riñones. Las infecciones de las vías urinarias más habituales son las producidas por bacterias, aunque también pueden presentarse a causa de virus, hongos o parásitos. De muchas de ellas es responsable la bacteria llamada Escherichia coli, que normalmente vive en el intestino. Infección de orina o del tracto urinario son expresiones que engloban diferentes enfermedades infecciosas (producidas por un microorganismo o germen) y que afectan a cualquier parte del sistema urinario (riñón, uréteres, vejiga urinaria o uretra). Palabras clave: Urocultivo, orina, infecciones urinarias, Agar.

1. PROPÓSITO Con la práctica realizada en el laboratorio de microbiología de urocultivo se busca:

 Establecer las condiciones de toma de muestra requerida para el análisis microbiológico de una muestra de orina.

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 Realizar un urocultivo teniendo en cuenta los microorganismos de importancia como causantes de infección urinaria.  Determinar la sensibilidad de la bacteria aislada a los diferentes antimicrobianos.  Identificar las posibles causas de error en el proceso.

2. MARCO TEÓRICO La infección urinaria es la más común de todas las infecciones bacterianas. Abarca una variedad de cuadros clínicos cuyas manifestaciones dependerán de los mecanismos de defensa de quien la padece y del grado de agresividad y cantidad de bacterias que causa la infección. La mayoría de las bacterias responsables de esta patología provienen del intestino grueso y entran en la vejiga en forma ascendente luego de haberse instalado inicialmente en la uretra, es decir, colonizan la zona uretral y periuretral. El aparato urinario posee mecanismos de defensa frente a la agresión de bacterias a través del flujo constante de orina que actúa por arrastre, por la presencia de receptores presentes en las células de la mucosa urinaria que son capaces de atrapar a las bacterias y por la acción de

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sustancias o moléculas bactericidas (destruyen a las bacterias) en la orina. El examen de orina es el más antiguo de los exámenes de laboratorio. Ya se practicaba hace siglos cuando se pretendía adivinar los misterios de la enfermedad examinando el líquido amarillo. Hoy el análisis de orina es el arte de la tira reactiva diagnóstica de inmersión. A pesar de su utilidad, el análisis de orina es el ejemplo de la tecnología poco prestigiosa y relegada en el laboratorio, pero con cuidado y atención es uno de los exámenes de Laboratorio más valioso si se ejecuta con habilidad, experiencia y atención constante. Para que los resultados tengan todo el valor posible, el clínico debe conocer bien cada prueba y saber que existe un sin número de factores que pueden afectar los resultados. Además es responsabilidad del Clínico participar con la información sobre las condiciones de recolección de la muestra y acompañar la solicitud de laboratorio con la información clínica pertinente.

Análisis de orina

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Al igual que la sangre, de la que deriva, la orina puede utilizarse fácilmente para realizar análisis biológicos. Refleja, a la vez, el compartimiento sanguíneo y la función renal, y proporciona información sobre eventuales enfermedades de las vías urinarias. Algunos análisis sólo requieren una muestra de orina, mientras que otros exigen recogerla durante 24 horas o, en ocasiones, durante varios días seguidos. Examen citobacteriológico de la orina (sedimento y urocultivo). Su objetivo es analizar el número de células (glóbulos rojos y blancos) presentes en la orina. En caso de hemorragia de las vías urinarias (hematuria), el número de glóbulos rojos en la orina aumenta rápidamente. En caso de infección urinaria (cistitis), el número de glóbulos blancos en la orina puede ser importante. La orina se deja en cultivo algunos días, para aislar los microorganismos y para conocer la sensibilidad a los antibióticos (antibiograma). La recolección de orina para un urocultivo tiene exigencias mayores que para un análisis simple. Se deben utilizar envases estériles para evitar la contaminación de la muestra. El urocultivo se realiza mediante la siembra de una pequeña cantidad de orina homogeneizada, lo que permite la cuantificación de las eventuales bacterias presentes. Las bacterias se contabilizan utilizando el criterio de «UFC/ml», porque de acuerdo a esta técnica se considera que cada bacteria en la muestra diluida dará origen a una colonia. El

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conteo de las mismas se efectúa luego de un período de incubación de 24 horas a 37º C, para permitir la multiplicación bacteriana. En el análisis químico de orina se describe la presencia de: •

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Interpretación de la apariencia y color de la orina, pueden aparecer diversas variaciones, orina clara, turbia, amarilla clara, marilla oscura, roja, verde, azul,etc.) Presencia de bilirrubina en orina Presencia de glucosa en orina Hemoglobina en orina Cetonas en orina Nitritos en orina Medición del pH Proteínas en orina Densidad de la orina Urobilinógeno en orina

Preparación en Fresco En este tipo de prparación podemos ver: Tipos de crostales de diferentes campos. Si aparecen con relativa frecuencia, podría ser indicativo de cálculos renales o afecciones de la parte superior de sistema excretor. Cristales de urea: morfología cuadrada Cristales de oxalato: morfología en sobre. Cristales de fosfato: morfología en ataúd Resto de epitelios en forme de masas irregulares o células en descamación del epitelio excretor. Estas células tienen la morfología d un “huevo frito”,

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desgarbadas e irregulares. Cuando se presentan en gran cantidad, puede ser indicativo de infección. Detección de bacteriuria en el sedimento: presencia de bacterias en la Orina. Piuíia: Presencia de Leucocitos: hay que tener en cuenta el número de polimorfonucleares y, dentro de estos, los neutrófilos por campo de visión. Desde que sea 10 -12 ya hay piuría manifiesta. Hematuría: medimos la presencia de glóbulos rojos en la Orina. En este examne también podemos medir el pH, Ver el aspecto de la orina. Microbiología E. coli continúa siendo la especie más frecuentemente aislada en las infecciones urinarias a cualquier edad, incluidos los ancianos. Sin embargo, en estos últimos aumenta la frecuencia de ITU producida por gérmenes distintos, como Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter, Serratia, Providencia, Morganella morganii, Staphylococcus coagulasa negativo, Streptococcus del grupo B, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa Candida. Según la procedencia del paciente, el espectro de especies aisladas varía. En pacientes procedentes de la comunidad E. coli y Staphylococcus coagulasa negativo son más frecuentemente aislados. Proteus mirabilis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, K. stuartii son más frecuentes en instituciones que en la comunidad, aunque E. coli continúa siendo el organismo más común en mujeres. En

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unidades hospitalarias agudas son más frecuentemente identificados patógenos nosocomiales, como P. aeruginosa, Enterococcus spp, Candida spp y enterobacterias no E. coli. En ancianos aumenta la frecuencia de infecciones polimicrobianas y, a menudo, producidas por gérmenes resistentes a los antibióticos convencionales. 3. MATERIALES • Asas bacteriológicos • Medios de cultivo: Agar Mac Conkey, EMB, Sangre • Solución salina 0.9%. • Coloración de Gram. • Muestra de Orina • Cubre y Portaobjetos

4. PROCEDIMIENTO Una vez obtenida la muestra homogeneizó en dos partes:

se

Una parte de la muestra se centrifugó y se destinó para el examen en fresco y posteriormente se realizó una tinción, la otra parte de la muestra se utilizó para realizar el urocultivo en las placas. Para la preparación en fresco; ponemos una gota en la superficie de un porta y cubrimos con un cubre, esto se puede observar al microscopio con objetivo de 40X y con poca luz.

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Para el cultivo, se realizó el método de asa calibrada para hacer la estimación cuantitativa de microorganismos, el cual consistió en sembrar una placa con medio Agar MacConkey y otra con medio Agar sangre y otro en EMB en una muestra de orina, sin someterse a centrifugación, se empleó una asa de platino calibrada (4 mm de diámetro) Para realizar este procedimiento primero se mezcló la muestra de orina durante 3 minutos evitando que se derramara. Luego se tomó el inóculo con el asa calibrada. Seguidamente se depositó la cantidad de muestra tomada en el centro del Agar y a partir de ahí se trazó una línea recta de extremo a extremo de la caja. Posteriormente con la misma asa y sin tomar más muestra ni esterilizar el asa se realizó una estriación en zig- zag de manera que se intercepto la línea central de lado a lado.

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el microscopio y las colonias que crecieron en los diferentes medios de cultivo. Como hemos visto, la siembra del cultivo debe realizarse a partir de una muestra sin centrifugar con un asa calibrada, lo que nos va a permitir una estimación semicuantitaiva del desarrollo microbiano, además como dato informativo debemos tener en cuenta que cerca del 70-80% de urocultivos enviados a laboratorio son negativos, cerca del 90% de las bacterias aisladas son enterobacterias, y de los gram positivos, la mayoría de los microorganismos aislados son Enterococcus y Staphylococcus. En el examen fresco de la muestra de orina al microscopio se observó a un aumento de 40X, leucocito entre 1-3, hematíes 5-7, bacterias abundantes y células epiteliales entre 0-2. Fig.1

Después se incubó las siembras a 37º C durante 36 horas, para finalmente proceder a contar el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada contiene 0.01 ml de orina.

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS Luego de realizar el procedimiento descrito anteriormente, procedemos a observar los datos recogidos del urocultivo que incluye la observación en

Fig.1. Examen al microscopio Es importante recordar que los leucocitos están presentes en infecciones,

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pielonefritis y enfermedades autoinmunes, y que estos en caso de infección pueden encontrarse hasta más de 20 días de haberse eliminado la infección, por lo que es importante saber si el paciente tuvo algún cuadro anterior a la muestra de orina. Otro indicio importante son los eritrocitos que nos indican si existe un sangrado de las vías urinarias, y dependiendo la forma de estos puede ubicarse en que parte del tracto urinario ha ocurrido el sangrado (vías altas o bajas), y el tipo de patología que se encuentra, además las células epiteliales cuando son muchas en el campo se sospecha de una infección, pero cuando son escasas se dice que es normal, porque estas células se renuevan constantemente. Luego al observar los medios de cultivos (Agar sangre, EMB y McConkey) pudimos establecer que en todos los cultivos se dio el crecimiento de colonias de microorganismos importantes en las infecciones urinarias. En el cultivo EMB, que es un medio selectivo para buscar microorganismos no exigentes de tipo Bacilos Gram negativos, los cuales son los principales tipos de bacterias implicados en infecciones de este tipo, aquí la muestra problema creció debido a que se le prestaron todas las condiciones necesarias para que las bacterias crecieron, ya que este medio permite diferenciar entre los organismos capaces de utilizar la lactosa y la sacarosa, y aquellos que son incapaces de

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hacerlo, muchas E. coli que crecen en este medio presentan un brillo metalico característico que es el observado en el cultivo, lo que nos permite diferenciarlas de Candida spp, que crecen como unas colonias puntiformes de color rosa, otros Enterococcus spp, crecen en este medio en forma de colonias puntiformes y transparentes mientras que las Acinetobacter spp y otras bacterias oxidativas presentan un color azu. Estas características de observan en la imagen 2.

Fig. 2 Cultivo en medio Agar EMB, positivo para colonias de E. coli. En el cultivo de Agar sangre, que se caracteriza por ser un medio rico en nutrientes e ideal para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias que nutricionalmente son muy estrictas en sus requerimientos se observó crecimiento de colonias (Fig.3) de color blanco con más de 75.000 UFC sin hemólisis del medio, este medio se presta para que muchas bacterias crescan debido a que contiene miocardio y peptona, y un balance electrolítico que mantiene una presión

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osmótica adecuada para que las bacterias puedan dividirse.

Fig. 3 Cultivo Agar sangre con crecimiento de colonias bacterianas de color blanquecino. Por último en el cultivo de Mac Conkey, que es utilizado para buscar la presencia de bacilos gram negativos de fácil crecimiento, ya sean aerobios o anaerobios facultativos, el cultivo contiene peptonas que aportan todos los nutrientes necesarios que exigen este tipo de microorganismos, además de sales biliares y cristal violeta, al ser un medio de cultivo selectivo es ideal para buscar la presencia de microorganismos importantes en infecciones urinarias, en aquellos microorganismos que no son capaces de fermentar la lactosa crecen, pero sus colonias serán de color incoloro, en el caso actual, las colonias crecieron de color blanquecino (fig.4), lo que nos indica que el microorganismo es capaz de fermentar la lactosa, lo cual coincide con una E. coli, que junto con el resultado del agar EMB y su brillo metalico característico, sumado con la epidemiologia regional, se puede decir

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casi con total seguridad que se trata de una E. coli.

Fig. 4 Colonias de color blanquecino sobre medio Mac Conkey. Además del urocultivo también es importante realizar pruebas químicas y físicas a la muestra de orina, lo que nos ayudara a establecer con más precisión el tipo de infección que sufre el paciente. 6. CAUSAS DE ERROR  Al exponer la muestra al medio sin la adecuada manipulación puede contaminar la muestra.

 Al no inocular bien la muestra podemos obtener pruebas negativas cuando en realidad son positivas si no que el procedimiento de sembrado no fue el correcto.

 Que la muestra de orina no haya sido recogida con las medidas necesarias y se haya contaminado con otros agentes bacterianos externos.

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Bacteriuria asintomática 7.CUESTIONARIO Procedimiento para la realización de Urocultivos Método de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminación, se realiza de la siguiente manera: •

Se homogeneiza la mediante agitación.

muestra

•

Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiológico, estériles.

•

Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilución al 1:100.

•

Se deposita 1 ml. de cada dilución en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vacía un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45°. Mediante rotación suave, se favorece la distribución homogénea de la siembra.

•

Se incuban todas las siembras a 37° durante 24 a 48 horas.

Para calcular el número de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas éstas, basta multiplicar su número por la dilución respectiva para obtener la cuenta total.

Presencia de bacterias en la orina en ausencia de síntomas clínicos. Bacteriuria significativa (en mujeres, dos muestras consecutivas con más de 100.000 UFC/ml; en varones, una sola muestra con más de 100.000 UFC/ml; en portadores de sonda urinaria, una sola muestra con más de 100 UFC/ml) con o sin piuria en ausencia de síntomas urinarios. La incidencia de bacteriuria asintomática aumenta con la edad, y es más común en ancianos con limitaciones funcionales. Aparece en un 20-50% de ancianos institucionalizados no portadores de sonda vesical y en un 100% de los pacientes sondados. La presencia de piuria no siempre es indicativo de infección. Por ejemplo, en pacientes institucionalizados, el 90% de los pacientes con bacteriuria asintomática tienen piuria, y un 30% de los que no tienen bacteriuria asintomática también la tienen. Factores de riesgo de bacteriuria asintomática: — Vejiga neurógena y otras patologías neurológicas. — Diabetes mellitus. — Estancia prolongada en residencia. — Patologías obstructivas como HBP en el varón. — Cambios hormonales en la mujer. — Macroalbuminuria. — IMC (índice de masa corporal) bajo. — Historia de ITU en el año anterior. — Incontinencia esfinteriana. — Instrumentación del tracto urinario.

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E. coli es el germen más frecuentemente aislado y parece que las cepas obtenidas de pacientes con bacteriuria asintomática tendrían menos factores de virulencia que las aisladas de pacientes con ITU sintomática.

Los cultivos en cajas de Petri nos permiten cuantificarlas las colonias y así determinar si hay un número considerable de infecciones.

La bacteriuria asintomática sólo habría que tratarla en pacientes que van a ser sometidos a procedimientos instrumentales genitourinarios. No se recomienda su tratamiento al realizar un sondaje urinario. La presencia de bacteriuria asintomática en ancianos, incluidos los diabéticos, no predice la aparición de ITU sintomática ni un aumento de mortalidad. El tratamiento de la bacteriuria asintomática no reduce el riesgo de desarrollar una infección sintomática en el futuro, y sí contribuye a un aumento de las resistencias a antimicrobianos.

El principal agente causante de infecciones urinarias es la Escherichia Coli, esta se puede tratar empíricamente con Nitrofurantoína.

La prevención se realiza corrigiendo los factores predisponentes: anomalías genitourinarias, evitando sondajes urinarios prolongados o usando sistemas de drenaje cerrado en los sondajes cortos.

8.CONCLUSIONES La práctica de urocultivo es uno de los métodos de diagnóstico más utilizados en medicina debido a que brinda gran información acerca de las infecciones urinarias los cuales le permiten al clínico evaluar las características del agente y el posible tratamiento mediante la realización de un antibiograma.

9.REFERENCIAS • Microbiología médica, P.R. 6ta Ed. Elsevier 2009

Murray

Analisis de Orina [en línea] [Citado el 27 de noviembre de 2011] Disponible en: http://www.tuotromedico.com/temas/ analisis_de_orina.htm# •

Enfermedades: Infección urinario o cistitis [en línea] [Citado el 27 de noviembre de 2011] Disponible en: http://www.dmedicina.com/enfermed ades/ginecologicas/infeccionurinaria-1 •

Manejo de las infecciones urinarias comunitarias del adulto (IUC) [en línea] [Citado el 27 de noviembre de 2011] Disponible en: http://www.infecto.edu.uy/terapeutic a/guiaatb/iu.htm#anchor24453 •

• Lindsay E. Nicolle, MD, Asymptomatic bacteriuria. When to screen and when to treat, Infect Dis Clin N Am 17 (2003) 367–394

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• INFECCIÓN URINARIA. Manuel Antón Jiménez. Raquel Esteban Sáiz. Raquel Ortés Gómez. • Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg 18° Ed. 2006

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