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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

DILUCION DE MUESTRAS AMBIENTALES .NUMERACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES EN UNA MUESTRA AMBIENTAL TERCER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

CUETO YUPA JOSE VENTO

20151384G

ZANABRIA PISCO JAMIL ANGEL

20161379F

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú 06 de abril de 2017

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental

INDICE

Tabla de contenido I.Resumen……………………………………………………………………………… ………………………………………3 II.Introducción III.Objetivos

4 5

IV.Marco teórico 5 V.Procedimiento experimental VI.Resultados

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VII.Discusion de resultados 13 VIII.Concluciones

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IX.Recomendacion

14

X.Fuentes de informacion

14

XI.Anexos 15 XII.Apendice

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I.

RESUMEN

En esta experiencia de laboratorio diluiremos la muestra de pescado

por

medio del agua peptonada, seguido de un posterior recuento en placas Petri para lo cual sembraremos el inóculo de muestra de pescado ya diluido a diferentes concentraciones en los tubos de ensayo por dos métodos de siembra: difusión y diseminación con el propósito de poder hacer el recuento de colonias por medio de estos dos métodos mencionados. Se usaron dos métodos: El primero fue el recuento en placa por siembra en profundidad o difusión que consistía en diluir a diferentes concentraciones la muestra de dilución de pescado (10-1, 10-2, 10-3 ,10-4 y 10-5) en 5 tubos de ensayo de 9ml de agua peptonada. una vez ya tenido estas concentraciones se precedió a sacar 1ml de cada tubo

y colocarlas en cajas Petri, donde finalmente agregamos el

agar plate count y se procedio a incubarlos y taparlos con papel kraft . El segundo método fue el recuento en placa de siembra por diseminación que consistió también en diluir a diferentes concentraciones la muestra diluida de pescado (10-1, 10-2, 10-3 ,10-4 y 10-5) en 5 tubos de ensayo de 9ml de agua peptonada, una vez ya tenido estas concentraciones se procedio a agregar agar plate count en las cajas Petri y luego se le agrego 1ml de cada tubo .se tapó con papel kraft y se procedio a incubarlos. Los resultados encontrados luego de dos días fue el crecimiento de colonias y se tuvo que contar en las cajas Petri cuantas habían crecido en los dos métodos usados para el recuento en placas.

II.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos,

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental especialmente

en

aquellos

que

favorecen

de

algún

modo

su

sobrevivencia o desarrollo. Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”, según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos

pueden

multiplicarse

en

los

alimentos.

Como

consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos. Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s). Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos. En esta práctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus características, algunos pueden requerir modificaciones o métodos específicos pero, en todos los casos donde

sea

posible,

se

recomienda

apegarse

a

estas

guías

y

modificarlas únicamente cuando sea necesario. Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el número de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra.

III.

OBJETIVOS



Enumerar los microorganismos presentes.

 

Valorar la importancia de la toma de muestra. Reconocer la importancia de la identificación y conservación de la toma de muestras. Aplicar la técnica de preparación y dilución de muestras ambientales. Aprender la técnica para enumerar los microorganismos heterótrofos. Aprender sobre el recuentro en placa y el recuentro por diseminación.

  

IV.

MARCO TEÓRICO

Microorganismo Un microbio, también llamado microorganismo, es un ser vivo, o un sistema biológico, que solo puede visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la microbiología. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia de las plantas y los animales, una organización biológica elemental. El concepto de microorganismo es operativo y carece de cualquier implicación taxonómica o filogenética dado que engloba organismos unicelulares y pluricelulares no relacionados evolutivamente entre sí, tanto procariotas (como las bacterias), como eucariotas (como los protozoos), una parte de las algas y los

hongos,

e

incluso

entidades

biológicas

acelulares

de

tamaño

ultramicroscópico, como los virus o los priones. Estos últimos generalmente no son considerados seres vivos y por lo tanto no son microorganismos en sentido

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental estricto; no obstante, también están incluidos en el campo de estudio de la microbiología.

Tipos de microbios Virus Los

virus

son

sistemas

biológicos

que

presentan

incluso

tamaños

ultramicroscópicos (los más pequeños y los de tamaños medianos solo se pueden observar mediante microscopio electrónico), los cuales pueden causar infecciones y solo se reproducen en células huésped. Los virus fuera de células huésped están en forma inactiva. Los virus constan de una cubierta protectora proteica o cápside que rodea el material genético. Su forma puede ser espiral, esférica o como células pequeñas, de tamaño entre 10 y 300 nm. Al tener un tamaño menor que las bacterias, pueden pasar filtros que permiten la retención de las mismas. Al contrario que las bacterias y los protozoos parásitos, los virus contienen un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN). No se pueden reproducir por sí solos, sino que necesitan de la maquinaria metabólica de la célula huésped para asegurar que su información genética pasa a la siguiente generación.

Microorganismos procariotas Las bacterias y las arqueas son microorganismos procariontes de forma esférica (cocos), de bastón recto (bacilos) o curvado (vibrios), o espirales (espirilos). Pueden existir como organismos individuales, formando cadenas, pares, tétradas, masas irregulares, etc. Las bacterias son una de las formas de vida más abundantes en la tierra. Tienen una longitud entre 0,4 y 14 μm. Consecuentemente solo se pueden ver mediante microscopio. Las bacterias se reproducen mediante la multiplicación del ADN, y división en dos células independientes; en circunstancias normales este proceso dura entre 30 y 60 minutos. Cuando las condiciones del medio son desfavorables, cuando cambia la temperatura o disminuye la cantidad de los nutrientes, determinadas bacterias

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental forman endosporas como mecanismo de defensa, caracterizadas por presentar una capa protectora resistente al calor, a la desecación, a la radiación y a la trituración mecánica y que protege la bacteria de manera muy eficiente. De esta manera, pueden soportar temperaturas elevadas, periodos de sequía, heladas, etc. Cuando las condiciones del medio mejoran, se desarrolla una nueva bacteria que continúa el crecimiento y la multiplicación.

Microorganismos eucariotas Se denomina eucariotas a todas las células que tienen su material hereditario (su información genética) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular. Hay tres tipos de microorganismos eucariotas, los protozoos (heterótrofos y sin pared celular), las algas microscópicas (autótrofos y con pared celular de celulosa) y los hongos microscópicos (heterótrofos y con pared celular de quitina).

Hongos El reino Fungi incluye una variedad de especies macroscópicas que en absoluto encajan en la definición de microorganismo, pero también forma microscópica, como las levaduras, que son campo de estudio de la microbiología. Además, numerosos hongos producen enfermedades infecciosas en animales y plantas y tienen un gran interés sanitario y agropecuario. NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar el material que posee. Las células utilizan elementos químicos que provienen del medio ambiente para transformarlos en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía. Esta energía se obtiene del medio ambiente. Las células pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energía: luz, compuestos orgánicos o compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera energía y a este proceso se le

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anabólicas y catabólicas es el metabolismo.

A) NUTRIENTES Los nutrientes que requiere una célula para su crecimiento se pueden clasificar en los siguientes grupos: 1.- Macronutrientes: carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. 2.- Micronutrientes: fósforo, potasio, azufre, magnesio. 3.- Vitaminas y hormonas 4.- Elementos traza: zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto. B) MACRONUTRIENTES Carbono: Todos los organismos necesitan carbono en alguna de sus formas. El carbono

forma

el

esqueleto

de

los

tres

más

importantes

nutrientes

(carbohidratos, lípidos y proteínas) que se utilizan para la obtención de energía, así como material celular. Los microorganismos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono se llaman heterótrofos y aquellos que utilizan el CO2 como fuente de carbono se llaman autótrofos. Hidrógeno y Oxígeno. El hidrógeno y oxígeno forman parte de muchos compuestos orgánicos. Se encuentran en el H2O, como componentes de nutrientes y en la atmósfera. Además, el O2 se utiliza en la respiración aeróbica como aceptor terminal de electrones. Nitrógeno. Todos los organismos requieren nitrógeno. El nitrógeno es metabolizado y entra a formar parte de las proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Las fuentes de nitrógeno que pueden ser utilizadas por diferentes organismos incluyen el N2 atmosférico en algunos procariotas, otros utilizan compuestos inorgánicos como nitratos, nitritos o sales de amonio, mientras que otros requieren compuestos nitrogenados orgánicos como son los aminoácidos o péptidos.

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C) MICRONUTRIENTES Fósforo: El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y ATP; también forma parte de los fosfolípidos y polímeros de la pared celular. El fósforo se suministra normalmente como fosfato inorgánico; alternativamente se puede utilizar fosfato orgánico como son los glicerofosfatos y fosfolípidos. Potasio: El ión potasio actúa como coenzima y probablemente como catión en la estructura de RNA y otras estructuras aniónicas celulares. Azufre: El azufre es necesario para la biosíntesis de los aminoácidos cisteína, cistina y metionina. También forma parte de coenzimas como biotina, coenzima A y ferredoxina. El azufre se suministra en forma inorgánica como sulfato u orgánica como cistina, cisteina y metionina. Magnesio: Se utiliza como cofactor de reacciones enzimáticas donde actúa el ATP. D) VITAMINAS Y HORMONAS Las vitaminas se clasifican en dos grupos, hidrosolubles y liposolubles. Dentro de éstas últimas la vitamina A, D y E no son necesarias para el crecimiento de las bacterias. Todas las vitaminas hidrosolubles, excepto el ácido ascórbico, son necesarias para el crecimiento de bacterias. La mayor parte de las vitaminas hidrosolubles son componentes de coenzimas. En los medios indefinidos se utiliza como fuente de vitaminas el extracto de levaduras.

Metabolismo microbiano El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en función de estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental determinar su papel ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales. A) Metabolismo heterótrofo La mayoría de los microorganismos son heterótrofos (o más exactamente quimiorganoheterótrofos), con compuestos orgánicos como fuentes de carbono y de energía. Los microorganismos heterótrofos viven de los alimentos que roban a anfitriones vivos (como comensales o parásitos) o de la materia orgánica muerta de todo tipo (saprófagos). Este metabolismo microbiano constituye el principal factor de descomposición de todos los organismos después de muerte. Muchos microorganismos eucariontes son heterótrofos por depredación o parasitismo, características también encontradas en algunas bacterias tales como Bdellovibrio (un parásito intracelular de otras bacterias, causando la muerte de sus víctimas) y algunas Myxobacteria tales como Myxococcus (depredadora de otras bacterias a las que mata y succiona mediante la cooperación de enjambres de numerosas células). B) metabolismo específicos Metilotrofía: La metilotrofía se refiere a la capacidad de un organismo para utilizar compuestos C1 como fuentes de energía. Estos compuestos incluyen el metanol, metilaminas, formaldehído y metanoato. Varios otros sustratos menos comunes que carecen de enlaces carbono-carbono también se pueden utilizar para el metabolismo. Ejemplos de metilotrofos son las bacterias Methylomonas y Methylobacter. La metanotrofía es un tipo específico de metilotrofía que puede usar también metano (CH4) como fuente del carbono. El metano es oxidado secuencialmente a metanol (CH3OH), formaldehído (CH2O), metanoato (HCOO-) y finalmente a dióxido de carbono usando inicialmente la enzima metano-monooxigenasa. Sintrofía: La sintrofía, en el contexto del metabolismo microbiano, se refiere a la colaboración de varias especies para realizar una reacción química que, de otra forma, sería desfavorable energéticamente. El ejemplo mejor estudiado de este proceso es la oxidación de los productos fermentantes finales (tales como acetato, etanol y buriato) por organismos tales como Syntrophomonas. Aisladamente, la oxidación de butirato a acetato e hidrógeno es energéticamente desfavorable. Sin embargo, cuando un metanógeno hidrogenotrofo está presente, el uso del gas de hidrógeno bajará perceptiblemente la concentración del hidrógeno (a 10-5 atmósferas) y desplazará el equilibrio de la reacción de la oxidación del butirato. La energía libre disponible de la metanogénesis baja

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental desde -131 kJ/mol en condiciones estándares a -17 kJ/mol a una presión de hidrógeno de 10-5 atmósferas. Éste es un ejemplo de transferencia de hidrógeno entre especies. De esta manera, las fuentes de energía de bajo rendimiento de carbono pueden ser utilizadas por un consorcio de organismos que realizarán la degradación adicional y eventual mineralización de estos compuestos.

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a) Materiales, medios de cultivo y equipos

         

Mechero de bunsen Balanza licuadora Cuchillo, pinza, tijeras, cucharas, espátula estéril pipetas bacteriológicas de 10ml y 1ml con divisiones de 0.1ml Refrigeradora a 25°C Estufa de desecación Espátula de drigalsky Agar plate count Agua peptonada b) Metodología.

 recuento en placa por siembra en profundidad o difusión

  

pesar de 10 gr de muestra de pescado licuar el pescado con agua peptonada repartir 9ml de agua peptonada en 5 tubos de ensayo con



la pipeta esterilizada de la solución de peptona de 90ml enumerar los tubos con los siguientes rótulos (10-1, 10-2, 10-3 ,10-4 y 10-5) que serán sus concentraciones



respectivas. colocar 1ml de la dilución que se encuentra en la licuadora al primer tubo (10-1), de esta sacar 1ml y colocarla en el

11

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental segundo tubo (10-2), y así sucesivamente hasta llegar al quinto tubo (10-5). Al hacer estos procesos se deberá tener en cuenta condiciones de esterilidad para esto se hará uso 

de calor seco del mechero. Sacar 1ml con pipetas esterilizadas de cada muestra de



tubo y colocarlas en sus respectivas cajas Petri Se agrega el agar plate count a cada caja Petri usada



teniendo en cuenta que no debemos contaminarlo. Aparte en una caja Petri se colocará 1ml de agua peptonada con el agar plate count para comprobar que no



haya contaminantes en el medio de cultivo. Envolver con papel kraft y ponerlos a la incubadora a 37°c

 Recuento en placa de siembra por extensión en superficie o diseminación   

pesar de 10 gr de muestra de pescado licuar el pescado con agua peptonada repartir 9ml de agua peptonada en 5 tubos de ensayo con



la pipeta esterilizada de la solución de peptona de 90ml enumerar los tubos con los siguientes rótulos (10-1, 10-2, 10-3 ,10-4 y 10-5) que serán sus concentraciones



respectivas. colocar 1ml de la dilución que se encuentra en la licuadora al primer tubo (10-1), de esta sacar 1ml y colocarla en el segundo tubo (10-2), y así sucesivamente hasta llegar al quinto tubo (10-5). Al hacer estos procesos se deberá tener en cuenta condiciones de esterilidad para esto se hará uso



de calor seco del mechero. Colocar el agar plate count a cada caja Petri que se



utilizara Sacar 1ml con pipetas esterilizadas de cada muestra de tubo y colocarlas en sus respectivas cajas Petri, luego con



el asa de drigalsky se comienza a diseminar. Envolver con papel kraft y ponerlos a la incubadora a 37°c

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VI.

RESULTADOS Cantidad de colonias

Concentraciones diluidas

Método 1

Método 2

10-1

135

Incontable

10-2

266

224

10-3

33

116

10-4

87

14

10-5

VII.



3

DISCUSION DE RESULTADOS

No se pudo ver una efectividad en el conteo de placas debido a que hubo contaminación

en

algunas,

es

decir

hubo

el

crecimiento

de

microorganismos extraños.

VIII.



CONCLUSIONES

Es casi incontable el número de colonias en concentraciones de 10-1, 10-2 debido a altas concentraciones

13

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental 

Se puede contar colonias en concentraciones 10-3 10-4 y 10-5 debido a la poca concentración que se tiene de la muestra .

IX.



RECOMENDACIONES

Esterilizar el Asa de Kolle a fuego incandescente previa inoculación de las bacterias.

 Colocar los algodones a los matraces y a los tubos de ensayo al momento de llevarlos a la autoclave. 

Siempre rotular los tubos de ensayo y las placas Petri para así evitar confusiones con los materiales al momento del desarrollo del laboratorio.

X.



FUENTES DE INFORMACIÓN

Camacho, A., M.Giles , A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O. Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM ,México.



López Tevés, Leonor; Torres, Carola ,2006, Trabajo Práctico Nº 5 Estudio cuantitativo de bacterias Microbiología General- Carrera Farmacia. Argentina



Baker,F.J. , y Breach,M.R.1990.Manual de técnicas de Microbiologia Medica .Editorial Acribia .Zaragoza , España



Pelczar ,M. ,y Chan ,E.C.S.1984. Elementos de la microbiología .Editorial Macgraw Hill, Mexico

XI.

ANEXOS

foto n°1: placas Petri sacados de la incubadora para iniciar el conteo

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Foto n°2: sacando 1ml de muestra diluida de pescado

XII.

APENDICE

15

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental 



DIAGRAMA DE FLUJO

DATOS

ORIGINALES Y OBSERVACIONES

Carne de pescado Agua peptona da

Gramos 10 gr …………….

16

Mililitros …………….. 90 l

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA Facultad de Ingeniería Ambiental 

PROCEDIMIENTO CÁLCULO Para calcular el recuento en placas solo se procedió a contar las colonias en cada caja Petri a simple vista y si no se puede ver a simple vista se tuvo que emplear el contador de colonias para el recuento.

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