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UNIVERSIDAD DE COLIMA Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias

ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE CORIZA INFECCIOSA AVIAR EN AVES DE POSTURA COMERCIAL PROVENIENTES DE LA REGION DE LOS ALTOS DE JALISCO, DURANTE EL PERIODO 1998-2001

TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS PRESENTA J. ALEJANDRO GARCIA FLORES MVZ.EPA DIRECTOR: Ph.D. ARIEL ORTIZ MUÑIZ

ASESOR Ph.D. PATRICK BLACKALL

Tecomán Colima. Marzo del 2000.

1

INDICE Páginas Resumen

1

Introducción

2

Planteamiento del problema

6

Hipótesis

7

Objetivos

8

Material y Métodos

9

Resultados

14

Discusión

23

Conclusión

30

Anexo

32

Bibliografía

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Dedicatoria A mi Sra. Madre: Gracias por haberme apoyado en los momentos difíciles, admiró tu tenacidad y esfuerzo. Tu amor fue lo que me motivó a seguir estudiando y finalizar con el presente trabajo.

A mi Esposa Luz : Gracias por comprenderme y orientarme en los momentos difíciles, la finalización del presente estudio, se debió al amor que existe entre nosotros. Recuerda que nos entierren juntos. A mis Hijos Haik, Dimitri, Lesly y Tehui: Por haber cedido parte de su tiempo en mi formación profesional, mi reconocimiento y amor, además son mi principal motivación y mi energía para mi actividad diaria. A mis Hermanos y Sobrinos: Por los buenos momentos que hemos vivido, y por el amor que nos han inculcado. A mi Universidad: Por haberme cedido un espacio en sus aulas y permitirme tener una formación profesional adecuada, además de haberme enseñado a amar sus colores.

PORQUE SOY DE SANGRE AZUL Y DE PIEL DORADA POR SIEMPRE LO SERE.

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Agradecimientos

Dr. Patrick Blackal. Por ser mi guía y maestro en el estudio de microbiología, además de su amistad.

Dr. Ariel Ortíz M. Por su confianza, orientación y amistad Sr. Ignacio Castillo A. Por apoyarme en mi formación profesional y por darme la oportunidad de contribuir al desarrollo del grupo VITEP.

MVZ. Héctor Johnson G. Por creer en mi, y por ser parte importante en mi desarrollo profesional, además de haberme enseñado la palabra del SEÑOR.

A mi apreciable jurado. Por haberme orientado en el manejo de la investigación. A los colegas y amigos que contribuyeron para la realización del presente, a todos ellos mi agradecimiento.

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Resumen Durante 17 meses que comprende el periodo 19982000, se analizaron 45 muestras avícolas de la región de los Altos de Jalisco México, con manifestaciones clínicas de Coriza Infecciosa Aviar, aislándose e identificándose por pruebas bioquímicas, serológicas y de biología molecular (PCR y ERIC-PCR), 39 cepas de Haemophilus paragallinarum . Con el esquema de Page, se identificó al serovar C en 18 ocasiones (46.1), el B en 12 (30.7%) y A en 9 casos (23%) El otro sistema de clasificación serologica es el de Kume, en donde se encontró en 18 casos al serovar C2, al B1 en 12 (30.7%) y A2 en 7 casos. Dos cepas de Haemophilus paragallinarum del serovar A, no mostraron títulos superiores a 1:40 con antisueros absorbidos para los cuatro serovares de A, por lo cual se considera que estas dos cepas pueden ser nuevos serovares del serogrupo A. Se identificaron por primera vez en México dos cepas de Haemophilus paragallinarum NAD independientes, una corresponde al serovar C (AZUL y ORO) y la otra al B (PUMA), este serovar no ha sido reportado en la literatura cientifíca, por lo cual se considera como primera aparición a nivel mundial.Estas cepas se caracterizaron y se compararon con las cepas de referencia de Sudáfrica, mediante las pruebas de biología molecular PCR y ERICPCR. Para el control de la Coriza Infecciosa Aviar, el uso de bacterinas que incluyan cepas regionales de Haemophilus paragallinarum serotipificadas, sería una medida acertada para controlar la enfermedad.

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INTRODUCCION La coriza infecciosa es una enfermedad infectocontagiosa de distribución mundial, que afecta en forma aguda las vías respiratorias de las aves y es importante en la especie Gallus gallus debido a las considerables perdidas económicas que provoca, estas se basan en el incremento de la selección de pollo de engorda y a la disminución en la producción de huevo (10-40%) en reproductoras y ponedoras, particularmente en granjas multiedades (13). El agente causal de la infección de coriza infecciosa es la bacteria Haemophilus paragallinarum (Hp), esta se agrupa como Gram negativo que tiene requerimientos in vitro de nicotin adenin dinucleotido (NAD) o factor V, recientemente se han observado que algunas cepas de Haemophilus paragallinarum (Hp) aisladas en Sudáfrica ya no requieren de este factor, conociéndoseles como factor V independiente, estas bacterias se consideran una mutación de las cepas típicas de Haemophilus a través de algún plasmido (43) y es común que se encuentren en zonas avícolas muy densamente pobladas (3, 4, 17, 23, 24, 25, 35, 36, 40). El sistema de serotipificación mas ampliamente usado es el esquema de Page (37), el cual agrupa tres serovares ( A, B y C), algunos reportes han puesto en duda la validez del serovar B de Page, sugiriendo que los miembros de este serovar son realmente variantes de los serovares A y C (48), sin embargo recientemente se ha demostrado que serovar B de Page es un verdadero serovar y que con excepción de la cepa de referencia 0222, los aislamientos del serovar B son completamente patógenos (57), además de que existe poca protección cruzada entre ellos (9, 44, 45, 46, 59) El esquema de serotipificacion de Kume es otro sistema alternativo del esquema de Page (29). Este reconoce tres serogrupos los cuales recientemente han sido demostrádo que corresponden a los serovares A, B y C de Page (9), actualmente se reconocen 9 serovares de Kume (10, 21, 28, 32). La enfermedad se caracteriza por producir conjuntivitis, sinusitis, inflamación periorbital y secreción nasal, siendo común las complicaciones con microorganismos gram negativos independientes de NAD, los cuales facilitan la magnitud de las lesiones a todo el aparato respiratorio y a otros órganos internos, en estas situaciones se observa una enfermedad más severa, denominada coriza complicada, que puede ocasionar mortalidades (13). Por lo general la enfermedad provoca cuadros agudos con estados febriles que determinan la pérdida de apetito y, como consecuencia de esto se produce bajas en la producción que acompañan al proceso y pueden tardar hasta cuatro semanas en recuperarse. En los brotes complicados, estas bajas de producción pueden prolongarse durante mayor tiempo (20).

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Las aves que se recuperan de la infección natural de coriza infecciosa poseen varios grados de inmunidad. Ha sido demostrado que inmunidad homóloga se desarrolla tan rápido como en dos semanas después de iniciada la exposición (42) a demostrado que como resultado de una infección hay inmunidad homóloga, así como también algún grado de inmunidad heterologa que ofrece cruzamiento a los serovares de Page. En consideración a la literatura en el grado de protección cruzada de los serovares conferida por bacterias las cuales utilizan la célula completa, hay dos problemas que pueden confundir la interpretación de resultados, primeramente estudios diversos han definido protección en diferentes formas, algunos investigadores han evaluado protección solo en términos de presencia o ausencia de signos clínicos, ausencia de moco en los senos y la ausencia del organismo en los senos después del desafío, la última definición es más confiable que la simple ausencia de signos clínicos (15, 41) Investigadores quienes han usado bacterias a partir de cultivo de tejidos o a base de yema de embrión de pollo han reportado algún grado de protección cruzada entre los serovares de Page . En contraste bacterias basadas en crecimiento del antígeno en caldo han demostrado proporcionar poca protección cruzada de los serovares de Page (14,33). La explicación de la diferencia entre bacterias a base de yema y la de caldo en términos de protección cruzada de los serovars, esto parece probable que al antígeno producido en yema debe parecerse más a la composición natural de la bacteria en el ave, que el antígeno elaborado en caldo. De hecho las bacterias desarrolladas en yema proporcionan algún grado de protección de serovars, esto no debería ser tomado como una amplia recomendación para usar este tipo de bacterina, diversos estudios han demostrado que las bacterias a base de caldo son más efectivas que las de yema en términos de protección homóloga (8). La presencia de coriza infecciosa en la República Mexicana se remonta a los años 60, en donde al igual que en otros países, el uso de bacterinas era limitado, de esa fecha a la actual se ha mejorado en el uso de biológicos, pasando desde las “exposiciones controladas”, que a decir verdad nunca han sido controladas hasta el uso de bacterinas a base de yema de embrión de pollo. En los últimos años la mayoría de las bacterinas comerciales usadas en las aves de las principales regiones avícolas del país habían controlado la enfermedad, a pesar de que la mayoría de las granjas cuentan con multiedades, además el ciclo productivo de las aves se ha prolongado más de lo acostumbrado aunado al crecimiento avícola que se esta observando, todo lo anterior, además de otras situaciones tanto de manejo, higiénicas y climáticas ha propiciado la aparición de cepas de Hp antigénicamente diferentes a las ya conocidas, lo anterior se ha reflejado en el hecho de que la presentación de Coriza Infecciosa Aviar sea permanente en aves inmunizadas con las principales bacterinas comerciales tanto Nacionales como Internacionales de coriza infecciosa disponibles ahora en México han sucumbido a la presencia de Haemophilus paragallinarum Referente al estado de Jalisco, es de mencionar que este cuenta con una población avícola de 35 millones de aves de postura comercial, esto significa el 23% del

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total de la población avícola Nacional , 20 millones de pollo de engorda , 100,000 reproductoras ligeras y 50,000 reproductoras pesadas. Los 35 millones de aves postura comercial, se encuentran basicamente en la zona de los Altos de Jalisco, que según la división política del Estado de Jalisco está integrada por 19 municipios: Acatic, Arandas, Encarnación de Díaz, Jalostotitlán, Jesús María, Lagos de Moreno, Ojuelos de Jalisco, San Diego de Alejandría, San Julián, San Miguel el Alto, Tepatitlán, Teocaltiche, San Juan de los Lagos, La Unión de San Antonio; Villa Hidalgo, Villa Obregón, Valle de Guadalupe, Yahualica y Zapotlanejo. La denominación de los Altos se debe a su mayor altitud, de 1750 a 2100 metros sobre el nivel del mar, en contraste con la región media (Lago de Chapala y sus alrededores) y la costa. Abarca una superficie de 15,053 km2 y representa el 19.1% de la superficie del Estado de Jalisco. En la actualidad el estado de Jalisco es el principal productor de huevo a nivel Nacional ya que participa con el 33% de la producción de la República (52). Dentro de la región de los Altos, los municipios de Tepatitlán y San Juan de los Lagos, sobresalen del resto por concentrar el 80% de la población total del Estado de Jalisco. Tepatitlán cuenta con una superficie de 100 Km2, en donde alberga, además de población humana a 20 millones de aves de postura comercial, alrededor de 3,200,000 de pollitas en crianza, y cerca de 3,500,000 aves en crianza y estas pertenecen a 27 empresas avícolas. El crecimiento de la población avícola en la región de los Altos de Jalisco data desde los años 60, en donde de esa fecha se incremento el censo avícola debido a los subsidios que había en ese entonces por el gobierno Federal, además de la tenacidad, y dedicación de los avicultores en sus granjas, aunado a que sanitariamente todavía no se presentaban tantas enfermedades infectocontagiosas como es estos tiempos. El crecimiento se ha dado en forma poco planificada por parte de los avicultores, ya que en ese entonces no consideraban la opinión técnica de un especialista en avicultura, tampoco estaban reglamentadas las disposiciones sanitarias ni la regulación territorial por parte del gobierno Federal. Esta situación a provocado que existan granjas de diferentes propietarios y de distintas edades a una distancia muy cercana, compartiendo entre estas sus enfermedades, la distribución de las granjas da la impresión de que es una sola granja, pero la realidad es de que gran parte de las empresas tienen un calendario de vacunación distinto, además de que manejan diferentes laboratorios de producción de biológicos, y no existe una estratificación en el manejo zootecnico de las aves, ya que se pueden encontrar granjas de crianza cerca de una de postura o granjas de postura con aves al inicio de la postura y otras al final del ciclo, o en otros casos la misma empresa tiene sus crianzas lejos de sus posturas, pero a un lado de sus crianzas existen granjas de postura de otro avicultor, se hace referencia a lo anterior ya que esto a llevado a la aparición de enfermedades infectocontagiosas (Síndrome de baja postura, Bronquitis infecciosa, Influenza aviar, Anemia infecciosa aviar, Marek, Laringotraqueítis entre otras) las cuales han sido difícil de controlar y erradicar (52). La presencia de la enfermedad de Coriza infecciosa aviar en esta región data desde los años 60´, y de esta fecha a la actual se ha complicado su control debido a las

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situaciones sanitarias antes mencionadas, ya que como todo organismo viviente este a tenido una tendencia a la modificación de su genética, y esto se observa con la poca efectividad de las bacterinas comerciales así como la aparición de Hp atípicos, los cuales ya no requieren el factor V de crecimiento, obviamente esto ha dificultando el control de la enfermedad en esta región avícola. La frecuencia y magnitud de los brotes de coriza infecciosa en las aves de este región, propicio que se realizará una investigación epizootiológico, en donde se incluía el aislamiento de las cepas así como la serotificación, para su posterior selección de estas cepas regionales que pudieran ser empleadas en la producción de inmunógenos específicos contra la coriza.

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Planteamiento del Problema La presencia de coriza infecciosa aviar en las aves de la República Mexicana data de los años 60´s, en donde en ese entonces la enfermedad se empezó a controlar con el uso de bacterinas a base de yema, además era una practica muy común el exponer a las aves a la presencia del Haemophilus paragallinarum, para que las aves desarrollaran la enfermedad, el objetivo de lo anterior era que las aves desarrollaran una inmunidad sólida, y esta les durara durante la producción, conllevando con esto a evitar perdidas económicas durante la producción, observando bajas de producción que oscilan entre un 2% al 40%. En los siguientes años se desarrollaron bacterinas las cuales hacían crecer al microorganismo en medios de cultivo artificiales agregando como adyuvante gel de hidróxido de aluminio, la mayoría de las bacterinas comerciales contienen los 3 serovars reconocidos por Page ( A, B y C ), la enfermedad había sido controlada con el uso de estas bacterinas, pero a partir de los 90´s empezó a resurgir la enfermedad en las principales zonas avícolas del País con la misma intensidad que antes, a pesar de que en la mayoría de las granjas se aplican como mínimo dos bacterinas y en la mayoría tres, estas se aplican previo a que las aves entren a producción, lo anterior a motivado a que se realicé un estudio microbiológico de la enfermedad de coriza infecciosa aviar en la región de los Altos de Jalisco.

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Hipotésis Las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Coriza infecciosa, así como la disminución en la producción de huevo , serán más manifiestas en las aves que son expuestas a serovares de Hp direntes al que contienen las bacterinas comerciales.

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Objetivo General: Aislar, identificar y serotipificar los Haemophilus paragallinarum provenientes de aves afectadas por Coriza infecciosa aviar en la región de los Altos de Jalisco.

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Material y Métodos Aves Se remitieron aves que presentaban la fase inicial de la enfermedad de Coriza infecciosa aviar y estas no recibieron ningún tratamiento antimicrobiano, estas aves procedían del Estado de Jalisco, siendo una zona avícola importante del país. Las aves provenientes de granjas de la región de los Altos de Jalisco se remitierón al Laboratorio de diagnostico llamado LIPEPSA el cual esta acreditado en las campañas zoosanitarias por la Secretaria de Agricultura y Ganadería. Se recopiló información de los brotes lo que incluye la ubicación de la granja, edad de las aves, estirpe, mortalidad, morbilidad, % de producción, duración del brote, # de animales existentes en la granja, signos clínicos y calendario de vacunación. Los datos antes mencionados se registraran en una base de datos. Las aves se sacrificaron mediante dislocación cervical, realizando la examinacion postmortem de órganos internos, anotando las alteraciones patológicas. Las cabezas fueron removidas para el aislamiento bacteriano.

Aislamiento e identificación bacteriana Las cabezas de las aves fueron flameadas para evitar contaminación alguna, para posteriormente hacer una incisión facial y con ello exponer los senos infraorbitarios, en este sitio es donde el Hp se reproduce en mayor cantidad, razón por la cual se introdujo un hisopo de algodón el cual estuvo impregnado con medio de cultivo, para posteriormente hacer el estriado en los siguientes medios de cultivo sólido : gelosa sangre 10% de sangre desfibrinada de borrego con y sin nodriza de Staphylococcus aureus, agar chocolate suplementado con 1% suero de ave mas 25 microgramos de NADH/ml, agar infusión cerebro y corazón, y agar Mc conkey. Las placas fueron incubadas durante 48 h, a una temperatura de 370 grados y con una atmósfera del 5% de bióxido de carbono, transcurrido este tiempo se seleccionaron las bacterias que presentaron el fenómeno de satelitismo y catalasa negativo, estas se resembraron en medios de cultivo sólido para purificarlas (tres subcultivos) y hacerlas crecer en forma masiva (3). Pruebas de caracterización El inoculó de todas las pruebas de caracterización fue preparado en placas de agar infusión cerebro corazón suplementado, e incubadas por dos días a 370C, bajo una atmosfera microaerofilica, excepto para las pruebas enzimáticas, las cuales fueron incubadas en condiciones aeróbicas. Todas las muestras fueron incubadas por 48h, a excepción de la fermentación de carbohidratos que se incubaron hasta por 7 días.

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La actividad de catalasa se realizó en medio liquido con crecimiento de hp, al cual se le agregó peróxido de hidrógeno al 3%, la formación de burbujas en forma inmediata fue indicativo de la presencia de esta enzima. La prueba de oxidasa fue desarrollada por el método de Kovac’s (18) Se inoculó una colonia bacteriana por cada prueba bioquímica, las cuales incluyen: Gram, catalasa, oxidasa, sim, galactosa, glucosa, lactosa, manitol, mannosa, sorbitol, sucrosa, xylosa, arabinosa, trealosa y maltosa ( 26, 49, 50). Fermentación de carbohidratos La fermentación de carbohidratos fue desarrollada usando una modificación del método de Blackall (5). El medio usado fue TM/SN sin glucosa y almidón (TMF), este fue suplementado con 0.004% de rojo de fenol, 25 μg NADH/ML, 1% (vol:vol) suero inactivado de pollo, y 2% del apropiado carbohidrato (3). Los tubos fueron incubados con la tapa floja en atmósfera microaerofilica, tubos sin inocular fueron anaranjados, mientras que tubos inoculados fueron amarillos (fermentación de carbohidratos) o ligeramente rojos (no fermentación de carbohidratos). Todas las cepas fueron examinadas usando el método de replica en placa descrito por Blackall.(5). Serotipificación -Medio de cultivo TM/SN se uso para el crecimiento general en los aislamientos de Hp TMB que es la versión en caldo de TM/SN fue usado para la producción de antígeno. La incubación se realizó en condiciones microaerofilicas para las placas conteniendo agar y en condiciones aeróbicas para el medio líquido (16).

-Glóbulos rojos fijados Los glóbulos rojos fijados (GRF) fueron preparados por la modificación de la técnica de Bing et al. Glóbulos de ave fueron colectados en solución Alsevers y lavados tres veces con 0.15 M NaCl. Un porcentaje de glutaraldehído a partir de una solución stock al 25% fue diluido con solución de Na3PO4 (pH8.2) (1 volumen) y 0.15 M NaCl (9 volúmenes) en agua destilada (5 volúmenes). Al 1 o 2% de glóbulos rojos de ave GRA, se le adicionó una solución al 1% de glutaraldehído e incubándose a 4oC por 30 min con movimientos ocasionales. Las células fijadas fueron centrifugadas a 400 x g y lavadas cinco veces con 0.15 M NaCl y cinco con agua destilada. Las células fueron suspendidas al 30% de concentración en agua destilada conteniendo 1:10,000 de thimerosal y almacenadas en pequeños volúmenes a 4oC (2).

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-Obtención de antígeno - Método físico Las colonias bacterinas de Haemophilus paragallinarum se crecieron en forma masiva en medios de cultivo liquido (TM/SN) durante toda la noche, posterior a la incubación las bacterias fueron centrifugadas a 4000 g, durante 15 minutos, el pellet fue lavado con PBS(pH 7.4) y resuspendido en PBS conteniendo 0.01% de thimerosal, el pellet bacteriano fue almacenado durante tres días a 4C antes de su análisis (9). - Método químico Posterior a que el antígeno fue lavado se le agregó 15 ml de una solución de tiocianato de potasio y solución salina conteniendo 0.5 M KSCN y 0.425 M NaCl (pH 6.3). La suspensión fue ajustada a una densidad óptica de 1.6 a 650 nm, agitando por 2 h a 4oC, sonificandose (30, 60% pulsaciones de salida, 120W; Ultrasonic modelo W373). Finalmente el antígeno fue lavado tres veces con PBS conteniendo 0.001% de thimerosal, suspendiendo en 5 ml de PBS con thimerosal y almacenando el antígeno a 4oC (9, 22)

-Método enzimático Cuando la actividad hemaglutinante no pudo ser detectada por el simple lavado de las células bacterianas, estas se trataron con hialuronidasa, usando la modificación del método de yamaguchi et al. A 200 μl de células bacterianas fueron centrifugadas y resuspendidas en PBS (pH 6.0) conteniendo 100 unidades de hialuronidasa/ml a una densidad óptica equivalente al tubo No. 3 de McFarland. La suspension fue mantenida a 370 C por 2 h y lavada dos veces en PBS (pH 7.4), y las células bacterianas fueron resuspendidas en 200 μl de PBS (pH 7.4) conteniendo 0.01% ( peso/vol) de thimerosal (29).

Antisueros para el esquema de hemaglutinación Antisueros para las cepas de referencia fueron elaborados en conejos por la técnica descrita por Kume et al. Los conejos fueron desangrados una semana después de la última inoculación (29). Prueba de hemaglutinación Los títulos de hemaglutinación del antígeno fue determinado con 50-μl de volumen usando el método de microdilución. Diluciones dobles del antígeno fueron hechas con PBS (pH 7.2) conteniendo 0.1% (peso/vol) sueroalbumina de bovino y

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0.001% (peso/vol) de gelatina. GRF al 0.5% fueron agregados a cada pozo, y las placas fueron incubadas por 1 h a temperatura ambiente. El titulo de la hemaglutinación fue la dilución mayor de antígeno causando aglutinación de GRF en glutaraldehído (37). Prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación para el esquema de Page y Kume En una microplaca de 96 pozos con capacidad para 500 microliltros cada uno , se depositaron 50 microlitros de cada antisuero A, B, y C, realizándose diluciones dobles hasta llegar a la dilucion 1:512, en cada dilucion se adicionó 50 microlitros del antígeno preparado a partir de la cepa aislada de Hp, el cual contiene 4 unidades hemoaglutinantes, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, transcurrido este tiempo, se adicionó a cada pozo 50 microlitros de glóbulos rojos de ave fijados al 0.5%, las placas se incubaron a temperatura ambiente, la lectura se realizó transcurridos 40 minutos. Se considera positivo a determinado serovar cuando el antisuero se une a las hemaglutininas del Hp y los glóbulos rojos de ave fijados se depositan en el fondo del pozo formando un botón, las muestras negativas formaran un halo de hemoaglutinacion en el fondo del pozo (1, 11, 12, 51, 56). Absorción de antisueros El antisuero de conejo fue absorbido con hemaglutininas de las cepas de referencia, para producir reactivo monoespecificos. Cinco volumen de antígeno conteniendo 64 unidades hemaglutinantes fue centrifugado y suspendido en 1 volumen de una dilución de antisuero 1:40 en PBS con albumina-gelatina. La suspensión fue agitada a temperatura ambiente por 2 h y entonces a 4oC toda la noche. Después de la centrifugación, el antisuero absorbido fue removido, y el título HI para homologo y heterelogo antígeno fue determinado. Antisuero fue absorbido hasta tres veces, hasta que todas las reacciones con heterologos antígeno fue removido. Finalmente, todos los antisueros fueron absorbidos con cinco volúmenes de GRF en glutaraldehído y fueron almacenados a –20oC como una dilución 1:40 de antisuero absorbido (55). ERIC-PCR PCR fue llevado a cabo en volúmenes de 50 μl. La reacción mezclada consistió de 10 nM Tris-Hcl (pH 8.3), 50 mM KCL, 2 mM MgCl2, 0.01% (peso/vol) gelatina, 200 μl de dATP, dGTP, dTTP y dCTP, 0.4 μl de cada primer y 1.25 U de Taq polimerasa. La apropiada cantidad de DNA template (10-200 ng) fue agregado. El MgCl2 y la concentración de los primers fue determinada por optimización de experimentos. La amplificación fue desarrollada usando Hybaid OmniGene thermal cycler (Hybaid, Middlesex, U.K) en el cual las muestras fueron desnaturalizadas a 980 C por 2.5 min antes Taq y aceite mineral fue agregado. Las condiciones de reacción consistio en 25 ciclos de 940 C por 1 min, 650 C por 1 min, y 720 C por 2 min seguido por un ciclo final de 940 C por 1 min, 650 C por 1 min, y 720 C por 10 min. El producto del PCR fue detectado por corridas de 10 μl de la muestra en 0.7% en gel de agarosa conteniendo ethidium bromide por 30 min a 80 V y la visualización fue bajo luz UV (19, 34, 53, 54).

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Laboratorios de trabajo 1.- Laboratorio de Patología Aviar (LIPEPSA). Av. Avicultores S/N Tepatitlán, Jalisco México. 2.- Laboratorio en Investigación Animal. Yeronpilly, Brisbane, Australia.

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Resultados Aves Durante el período 1998 –2000 se recibieron en el Laboratorio de Patología Aviar (LIPEPSA) 45 casos clínicos en donde se remitieron aves con signología de la enfermedad de Coriza Infecciosa Aviar (Cuadro 1).

Cuadro 1

Total de casos clínicos de Coriza Infecciosa Aviar, por año Periodo Casos

98 7

99 24

00 14

Total 45

El año en donde se recibieron más casos clínicos para aislamiento de Coriza Infecciosa Aviar fue en 1999 con un total de 24 y 1998 tuvo el menor numero con 7 (Cuadro1). 1998 En este año se analizaron un total de 7 parvadas aviares, de las cuales seis resultaron positivas al aislamiento de Hp , lo cual corresponde a un 15.38% del total de los aislamiento durante los 17 meses que duró la investigación (Cuadro1) y un caso negativo. Además fue el año en donde se recibieron menos muestras para intentar el aislamiento de Hp en comparación a los otros años (Cuadro 2). 1999 Se recibieron 24 casos clínicos sospechosos de la enfermedad de Coriza Infecciosa Aviar , de los cuales 19 fueron positivos al aislamiento (48.71 % del total de aislamientos, durante los tres años de investigación) y 5 negativos (Cuadro 2). En este año se recibieron el mayor número de casos para aislamiento de Hp en comparación a los otros años (Cuadro2).

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Cuadro 2

No. de parvadas estudiadas para aislamiento de Haemophilus paragallinarum , y su porcentaje de casos positivos y negativos No. Parvadas enviadas, por periodo 1998 1999 2000 Total

+ 6 19 14 39

No. parvadas % Neg 85.7 1 79.1 5 100 0 86.6 6

% 14.3 20.9 0 13.4

En los primeros cinco meses del año es donde se observa el mayor numero de asilamientos positivos a Hp en comparación al resto de los meses y a los otros años en estudio (Gráfica 1).

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Gráfica 1

4

Aislamientos de Hpg

3 Número

2 1 0 E F M AM J J A S O N D Meses 1998

1999

2000

2000 14 casos clínicos se recibieron en este año, siendo todos positivos (35.89% del total de aislamientos, durante los tres años de investigación), como se muestra en el cuadro 2

Aislamiento e identificación bacteriana La técnica diagnóstica así como el sitio seleccionado (senos infraorbitarios) para la búsqueda de Hp en las aves remitidas durante la investigación y que presentaban manifestaciones clínicas de coriza Infecciosa Aviar, fue la adecuada ya que de 45 casos clínicos emitidos durante los 17 meses, el agente etiológico se aislaron en 39 ocasiones lo que significó un (86.6%).

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Pruebas de caracterización La mayoría de la cepas de Haemophilus paragallinarum presentaron las características metabólicas de la bacteria, cuando estas se inocularon en pruebas bioquímicas, la excepción fue en la dependencia del NAD. Dos cepas de Hp no requirieron de este factor para su crecimiento (Cuadro 3).

Cuadro 3 Pruebas de caracterización de Haemophilus paragallinarum No.Hp

Catalasa

39

39 positivos

Requerimiento Oxidasa NADH Positiv Negati os. vos. Positivos. Negativos 35 4 37 2

Fermentación de carbohidratos El método de placa resultó confiable sin presentar algún error en su lectura, y los patrones de fermentación de carbohidratos que presentan los Hp fueron los que reporta la literatura, la excepción la presentó el serovar B de Haemophilus paragallinarum para el carbohidrato sucrosa, en donde se debería observar acidez en los patrones de fermentación (Cuadro 4).

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Cuadro 4 Fermentación de carbohidratos por serovar de Haemophilus paragallinarum

Carbohidrato Galactosa Glucosa Maltosa Lactosa Manitol Sorbitol Sucrosa Trehalosa Xylosa

A Pos. 0 9 9 0 9 8 9 0 0

B Neg. 9 0 0 9 0 1 0 9 9

Pos. 0 12 12 0 12 12 0 0 0

C Neg. 12 0 0 12 0 0 12 12 12

Pos. 0 18 18 0 18 18 18 0 0

Neg. 18 0 0 18 0 0 0 18 18

Obtención de antígeno La mayoría de las cepas de Hp que se identificaron durante la investigación aglutinaron glóbulos rojos de ave fijados en glutaraldehído al 0.5% mediante el proceso físico, solamente dos requirieron del tratamiento enzimático y estas correspondieron al serovar A de Hp (Cuadro 5).

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Cuadro 5 Métodos para la obtención de antígenos de Haemophilus paragallinarum Serovar Hpg Físico Químico Enzimático A 7 2* 2 B 12 S/T S/T C 18 S/T S/T • No se obtuvo actividad hemaglutinante por este medio. • S/T= Sin tratamiento. Prueba de hemaglutinación Las 39 cepas de Haemophilus paragallinarum , fueron primeramente serotipificadas por el esquema de Page, en donde se encontró que la mayoría correspondió al serovar C con un total de 18, lo que corresponde a un 46.1%, seguido del serovar B con 12, equivalente a un 30.7% y por último al serovar A con 9 aislamientos, correspondiéndole un 23% (Cuadro 6)

Cuadro 6 Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el esquema de Page, durante el periodo 1998-2000 A + 9

B % 23

+ 12

C % 30.7

+ 18

Total % 46.1

+ 39

% 100

23

Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el esquema de Kume De los 39 aislamientos de Haemophilus paragallinarum 18 correspondieron al serovar C2, 12 al serovar B1 y 7 al serovar A2, dos aislamientos de Hp pudieron serotipificar en los 4 serovares del serogrupo A (Cuadro 7).

Cuadro 7 Serotipificación de Haemophilus paragallinarum mediante el esquema de Kume, durante el periodo 1998-2000 A1 A2 A3 A4 B1 C1 C2 0 7 0 0 12 0 18 NI: No identificadas, posible nuevo serovar

C3 0

C4 0

NI 2

24

PCR Los 39 aislamientos de Haemophilus paragallinarum tuvieron el mismo peso molecular, apreciándose la misma banda de identidad (0.5 KD), que las cepas de referencia, cuando estas se observaron en un gel de electrofóresis (Fig. 1)

Figura 1 Comportamiento de las cepas de Haemophilus paragallinarum provenientes de México, con el uso de PCR

La flecha indica la banda la cual tiene el peso molecular que corresponde a Hpg, observandose que todos los aislamientos Mexicanos de Hpg estan en esa banda.

25

EIRC-PCR Las dos cepas de Hp que no requirieron del factor NAD para su crecimiento fueron comparadas entre ellas, de igual manera con las cepas provenientes de Sudáfrica, las cuales tampoco requieren de NAD para su crecimiento. Las cepas nacionales mostraron diferentes pesos moleculares entre ellas, observándose diferentes bandas de identidad en el gel de electroforesis, de igual manera fue muy clara la diferencia en las bandas de identidad entre las cepas de Hp de ambos países (Fig 2 ).

Figura 2 Comportamiento de las cepas NAD independiente de Haemophilus paragallinarum provenientes de México y Sudáfrica, mediante la prueba de ERIC-PCR.

Columna 1, Marcador., 2, cepa Puma (B1), 3, cepa AZUL y ORO (C2) 4., cepa Sudáfrica A, 5., cepa Sudáfrica C. La flecha indica la banda en donde existe diferencia entre las cepas.

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DISCUSION Se consideró que los 39 aislamientos de Hp que se identificaron de los 45 casos trabajados durante los 17 meses correspondientes al periodo 1998-2000, y que provenían de aves de diferentes edades las cuales manifestaban signos clínicos característicos de Coriza Infecciosa Aviar, fue un porcentaje alto (86.6), y que el hecho de no poder aislar el Hp de seis casos sospechosos, pudo deberse a que las aves pudieron haber venido con tratamiento antimicrobiano, la cronicidad de la enfermedad permite que las bacterias saprofitas crezcan más rápido que Hp y por ende este microrganismo es sobrepasado y con ello se dificulta su aislamiento o que las manifestaciones clínicas correspondieran a otro agente o agentes infecciosos como Pneumovirus en asociación con Staphylococcus aureus u Ornitobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum y synoviae, Bronquitis infecciosa entre otros. Por tanto se considera que la técnica de aislamiento así como el sitio elegido para la toma de muestras fue el indicado (senos infraorbitarios), aunque se ha reportado que Hp también se ha podido aislar de órganos internos, a raíz de esta información se ha sugerido que cuando se intente el aislamiento de Hp se consideré órganos internos para su aislamiento ya que esta información servirá para conocer la conducta del microorganismo (patogenia) (3). La razón por la cual el año de 1999 tuvo el mayor número de aislamientos de Hp en comparación a los otros dos años, se debió a que en este año se muestreo durante más meses (ocho en total), a diferencia del año 98 en donde solo se trabajó en cuatro meses y en el 2000 en cinco meses. El mayor número de aislamientos de Hp que se identificaron en los primeros cinco meses del año, durante el periodo de tres años que duró el estudio, en comparación al resto de los meses, se debió a que en estos meses se intensificó la búsqueda de casos sospechosos de Coriza Infecciosa Aviar , además es de recordar que en los primeros meses del año (Enero, Febrero, Marzo) la temperatura es inferior al resto de los meses, lo que facilita la penetración y replicación del microorganismo en las células huésped del ave, ya que el frío provoca que los cilios de la tráquea queden inmovilizados en forma temporal , lo cual permite el acceso de la bacteria, al igual que los movimientos del aire el cual facilita la difusión del microorganismo de una parvada a otra o de una granja a otra, y como se menciono la región de los Altos de Jalisco, alberga a 35 millones de aves de postura comercial en un circunferencia de 100 Km a la redonda, lo cual da la impresión de que existe en esa región una mega granja con megaproblemas (20). Después de 17 meses de estudio se encontró que la edad de las aves en donde se aisló con más frecuencia Hp fue entre 16 y 30 semanas (Cuadro 8), que en teoría a esta edad es cuando las aves deben estar mejor protegidas contra las manifestaciones clínicas de la enfermedad y las bajas de producción, ya que mínimo a esta edad ya recibieron dos bacterinas de Coriza Infecciosa Aviar ya sea en aceite o en gel de hidróxido de aluminio, y en algunos casos hasta 3 bacterinas, la mayoría contiene los tres serovares de Hp y solo un laboratorio vende su biológico con dos serovares (A y C), (anexo 1),

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esta empresa argumenta que estos dos serovares protegen contra el serovar B, los resultados en el campo demuestran que no existe protección cruzada.(49, 58).

Cuadro 8 Serogrupos de Haemophilus paragallinarum por semanas de edad Serovar 6 – 10 A 3 B 0 C 1 NT* 0 NT* No tipificables

11-20 7 1 2 0

21- 35 6 2 4 2

36 – 60 1 0 1 0

Otra de las posibles causas de la presentación de Coriza Infecciosa Aviar en esta edad , es el hecho de que las aves se crían y se desarrollan en ambientes mejor controlados sanitariamente en comparación a las posturas (anexo 1, en donde se observa que solo un Hp se aíslo de aves de 6 semanas de edad), ya que en muchos casos las aves que provienen de los desarrollos y son alojadas en las casetas de postura, sufren de inmediato un desafío severo por parte de Hp , ya que cuando llegan a la granja, aquí ya existen aves de diferentes edades las cuales han presentado la enfermedad de Coriza Infecciosa Aviar (granjas multiedades) (13). La presentación de Coriza Infecciosa Aviar a esta edad es de importancia económica, ya que las aves de postura comercial alcanzan su máxima producción a las 26 semanas de edad (Hy-line) , y algunas parvadas vuelven a recuperar sus parámetros de producción de dos a tres semanas posterior al brote, lo anterior depende de la morbilidad con la que afecta a las aves y la oportunidad en el tratamiento antimicrobiano Estos resultados son similares a los que describen los investigadores argentinos (46), en donde mencionan que en su país la Coriza Infecciosa Aviar se ha venido presentando en aves inmunizadas y en granjas multiedades, ellos consideran que existe poca protección cruzada entre las cepas que se usan para la producción de biológicos y las cepas de desafío (44, 45, 49,50). El hecho de aislar un solo Hp en aves de 6 semanas de edad (anexo 1), se correlaciona a que en esta edad las aves son criadas en ambientes más limpios, por lo tanto no existe exposición temprana al Hp , ya que muchas crianzas están alejadas de las posturas, creemos que esta es la principal razón para que se presenten escasos casos clínicos en esta edad, ya que solo algunas empresas empiezan a inmunizar contra Coriza

28

Infecciosa Aviar a la edad de 4 semanas, por lo tanto a la edad de 6 semanas de edad (que es cuando se aisló Hp ), en teoría todavía el ave no desarrolla por completo la respuesta inmune hacia la bacterina de Coriza Infecciosa Aviar , no existiendo una protección total (6, 8, 27, 30, 31). Referente a las pruebas de caracterización, lo más sobresaliente fue la dependencia del NAD, ya que las cepas típicas de Hp requieren este factor para su crecimiento, y en este estudio se identificaron dos cepas de Haemophilus paragallinarum que no requieren de este factor (Haemophilus NAD independientes), una de ellas corresponde al serovar B (cepa PUMA) no reportada en la literatura cientifíca mundial, y la otra es el serovar C (AZUL y ORO), ya que los investigadores de Sudafrica (Braggs et., al) han reportado la presencia de estas bacterias en aves de postura comercial y en pollo de engorda, pero los serovares que han identificado son A y C, no el B (cepa PUMA), además reportan que estos serovares atípicos no dan reacción cruzada con los serovares típicos de Hp lo cual provoca fallas en la vacunación, por consiguiente es difícil el controlar Coriza Infecciosa Aviar en parvadas aviares que son inmunizadas con bacterinas que contienen las cepas de referencia de Hp (17, 39, 40). Es de mencionar que estas cepas de Hp atípicas (NAD independientes) que se identificaron en este estudio provenían de una parvada que había recibido dos bacterinas en emulsión utilizando aceite como adyuvante, las cuales contenían cepas de referencia de Hp que incluían los tres serovares (A, B, C) y que fueron elaboradas por un Laboratorio de producción de biologicos transnacional (anexo 1), la última aplicación fue a las 16 semanas de edad, y el primer brote de Coriza Infecciosa Aviar en esta parvada se presento a la edad de 24 semanas, observándose un 10% en el descenso de la producción, el serovar de Page que se identificó en está ocasión fue el B, referente a este serovar los investigadores japoneses (Yamaguchi et.,al) mencionan que este es el serovar más difícil de controlar en una parvada, ya que entre las cepas de este mismo serovar existe poca protección cruzada lo cual dificulta el control de la enfermedad con bacterinas que contienen cepas internacionales y no regionales, está característica se presume que se da en la conformación de la hemaglutinina, esta pudiera ser la explicación por la cual la parvada que recibió dos bacterinas y que contenía el serovar B presentó manifestaciones clínicas características de Hp. Está misma parvada volvió a presentar manifestaciones clínicas de Coriza Infecciosa Aviar a la edad de 48 semanas, 24 semanas posterior al primer brote de Coriza Infecciosa Aviar , en esta ocasión el descenso en la producción de huevos fue de 15%, es de mencionar que la virulencia en este brote fue más severo que el que se observó en los otros 38 casos clínicos, ya que en ellos no hubo mortalidad debido a Hp , pero en este caso se observó mortalidad de1% , Lo sobresaliente en esta ocasión fue el aislamiento e identificación de dos serovares en el mismo brote uno correspondió al B (cepa PUMA) y el otro al C (AZUL y ORO), ambos NAD independientes. No es muy común que en un brote de Coriza Infecciosa Aviar se aíslen dos serovares distintos, esto posiblemente se debe a que la morfología macroscópica y microscopica son similares, conllevando con ello a que en el Laboratorio de diagnóstico se dificulte la identificación de diferentes serovares en la misma muestra clínica. La recurrencia en las

29

manifestaciones clinicas de Coriza Infecciosa Aviar en esta parvada se debio posiblemente a que no existe reacción cruzada con estos Hp atípicos (NAD independientes) con los tipìcos, lo anterior debe ser demostrado en experimentos de Laboratorios tal como lo demostró el Dr. Braggs (17), lo cual resulta en fallas en la vacunación, aunque la literatura menciona que dos semanas después de que existe un brote por Coriza Infecciosa Aviar las aves generan anticuerpos neutralizantes, lo que les permite enfrentar desafíos posteriores a la bacteria , esto se refiere a los Haemophilus paragallinarum típicos, el serovar B también es la excepción en este caso. Esta es la explicación por lo cual estas aves volvieron a sufrir de la Coriza Infecciosa Aviar y con mortalidad. La razón por la cual los Hp que se identificaron en esta parvada se volvieron atípicos, ya que como se menciono párrafos atrás, el primer brote en esta parvada fue provocado por el serovar B típico, se desconoce con certeza, los autores de Sudáfrica (Braggs) consideran que se debe a una mutación genética o algún plásmido (17, 39, 40, 43). Es de mencionar que si el serovar B típico de Hp es difícil de controlar en las parvadas avícolas, como lo mencionan los investigadores argentinos (44), los cuales observaron que parvadas aviares que habían sido inmunizadas con bacterinas de Coriza Infecciosa Aviar de diferentes laboratorios de producción y que contenían los tres serovares, seguían presentando manifestaciones clínicas características de Coriza Infecciosa Aviar y con bajas en la producción de huevos (44, 45). Reportando por primera vez que Hp la aislaron de órganos internos (hígado, pulmón, líquido sinovial). El serovar B NAD independiente representa más dificultad que el serovar típico de Hp , manifestándose como un desafío para la avicultura y un grán reto para el control de la enfermedad. (45, 49, 50). Los resultados en el patrón de fermentación de carbohidratos para Hp , indican un comportamiento metabólico normal de las bacterias en estudio. Es de mencionar que la literatura describe que los carbohidratos son importantes para que el Hp se adhiera a la célula huésped, permitiendo con ello su adherencia y replicación. Además el método de placa utilizado, confirmó que es un método confiable (Blackall) (5). Referente a la exposición de la hemaglutinina por parte de Hp mediante diferentes tratamientos (físico, químico y enzimático), se encontró los mismos resultados por Blackall et al. En donde describen que la mayoría de los Hp expondrán sus hemaglutininas mediante procesos físicos (frio). En este estudio se observó que el 94.8% de las cepas expusieron sus hemaglutininas por este medio (físico). Dos cepas de Hp no expusieron sus hemaglutininas mediante el uso de tiocianato de potasio y sonificación (químico), estas mismas cepas se trataron mediante proceso enzimático, obteniendo resultados positivos, este hallazgo es normal encontrarlo en las cepas de Hp, ya que algunas hemaglutininas son muy cortas y si la cápsula no es removida por completo, las hemaglutininas que emergen de la membrana celular no podrán ser identificadas mediante el uso de glóbulos rojos fijados en glutaraldehído. Definitivamente con el uso del proceso enzimático (hialuronidasa) es el más efectivo para la exposición de las hemaglutininas ya que este remueve por completo la cápsula dejando al descubierto a las hemaglutininas, el inconveniente es el costo de la enzima,

30

esta es la razón por la cual solo se utiliza en algunas cepas de Hp , afortunadamente la mayoría de las cepas hemaglutinan mediante el proceso físico (7). La serotipificación de Hp mediante el esquema de Page, fue el primer método descrito para la clasificación y este se basa en la aglutinación de la bacteria, el cual utiliza como indicador glóbulos rojos de ave fijados en glutaraldehído. Esta es la prueba que la mayoría de los laboratorios de diagnóstico en el mundo emplean para clasificar a los Hp , ya que es sensible y de rápida ejecucción (37). El más reciente método para serotipificar los Hp es el descrito por Kume, el cual utiliza antisueros absorbidos para la identificación , esta es una técnica poco trabajada en los laboratorios del mundo, ya que requiere de mucho tiempo para su desarrollo. Existe una correlación entre los serovares de Page y Kume, este último subdivide a los Hp , en base a la neutralización de las hemaglutininas con antisueros que son absorbidos con diferentes serovares de Hp , de ahí que con este método surgan nuevos serovares, como fue la última modificación que sufrió la clasificación del esquema de Kume , en donde se agregó un nuevo serovar el cual se identificó en Australia (10). Este esquema permite que se identifiquen serovares de Hp, de localización continental, como es el caso del serovar C3 de aparición solo en Sudáfrica y del serovar C4 en Australia (10, 39). Actualmente se reconocen 9 serovares de Haemophilus paragallinarum mediante el esquema de Kume, los cuales son A1, A2, A3, A4 , B1, C1, C2, C3 y C4. (9). En este estudio y utilizando el esquema de Kume, se identificaron dos cepas de Hp que corresponden al serogrupo A de Page, y que mostraron escasa reacción serologica cuando fueron enfrentadas con antisueros absorbidos de los serovares A1, A2, A3 y A4 , presumiendo con esto que estas dos cepas de Hp son candidatas a nuevos serovares del serogrupo A, con la posible alteración en la clasificación de las cepas de Hp mediante el esquema de Kume. Esto requiere de estudios posteriores. El serovar de Hp más frecuente que se identificó mediante el esquema de Kume fue el C2 (46.6%), la cepa de referencia de este serovar es Modesto, la mayoría de los laboratorios de producción de biológicos incluyen esta cepa. Una de las posibles causas de que se aisle con frecuencia este serovar (C2), a pesar de que las bacterinas la incluyen, se puede deber al manejo de la semilla madre por parte de los laboratorios de producción, ya que esta cepa tiene años de su aislamiento y con el tiempo puede modificar su estructura y sus determinantes antigénicos, por lo anterior los investigadores que tienen más trabajos en Coriza Infecciosa Aviar , como lo es el Dr. Patrick Blackall (Australia) y Robert Braggs (Sudáfrica), recomiendan el empleo de cepas regionales serotipicadas en la producción de la bacteria de Coriza Infecciosa Aviar . Otras causas pueden deberse a fallas en la vacunación y a exposiciones tempranas de las aves al organismo (granjas multiedades) (38, 47 ). Este serovar (C2) no se ha modificado en esta región de los Altos de Jalisco desde el año 1998 al 2000 (Cuadro 9),. a diferencia de lo encontrado por Braggs et al.(17), en donde observaron que los serovares de C, se han estado sustituyendo por

31

otros con el tiempo (ejemplo C2 por C3), lo cual propicio que los brotes de Coriza Infecciosa Aviar en Sudáfrica se siguieran presentando, razón por la cual, los laboratorios de producción de biológicos de ese país tuvieran que sustituir las cepas de referencia por cepas tipificadas regionales, obteniendo resultados satisfactorios (40).

Cuadro 9 Serovares de Haemophilus paragallinarum por años Serovar A2 B1 C2

98 2 2 2

99 5 6 8

00 2 4 8

Total 9 12 18

El segundo serovar de Hp que se identificó mediante este esquema fue el B1 (30.7%), este serovar como se menciono en párrafos anteriores, es el que presenta moderada reacción cruzada entre los integrantes del mismo serovar, lo cual dificulta su control en las granjas avícolas, además es más agresivo en la presentación de las manifestaciones clínicas de la enfermedad y en las bajas de producción en comparación al resto de los otros dos serovars (A y C). La recomendación para el control de este serovar en aves, es realizar pruebas de protección cruzada con los aislamientos de este serovar, además de incluir cepas regionales en la bacterina en vez de referencia (56, 58). La Prueba de Reacción de la Polimerasa (PCR), que se les practicó a los 39 aislamientos de Hp , mostraron estar en la banda de los 0.5KD la cual corresponde a las cepas de Hp. Esta técnica también identificó a las dos cepas de Hp que fueron NAD independiente, todas las cepas de Hp fueron primeramente identificadas por pruebas bioquímicas y serologicas. (fig 1). PCR demostró ser una herramienta de biología molecular útil y rápida, en la identificación de Hp , ya que con esta técnica se puede identificar al microorganismo en 6h, a diferencia de los métodos convencionales los cuales requieren de 1 a 2 semanas (53, 54). La prueba de biología molecular denominada ERIC-PCR, es una técnica útil para estudios epidemiológicos , ya que permite conocer el comportamiento de los Hp en cierta regiones avícolas o granjas, mediante la separación de ciertas proteínas las cuales tienen un conocido peso molecular (0.5KD) y tienen un patrón de comportamiento conocido en un gel de electroforesis, esto permite comparar si los patrones electrofóreticos de Haemophilus paragallinarum son iguales o diferentes. Las dos cepas de Haemophilus paragallinarum atípicas que no requirieron de la presencia de NAD para su crecimiento fueron comparadas entre si, una de ellas del serovar B (PUMA) y la otra del serovar C (AZUL y ORO), presentaron una sola diferencia entre sus pesos moleculares, lo cual las hace diferentes, de igual manera se

32

compararon con las cepas de Hp provenientes de Sudáfrica, las cuales también son NAD independientes y que corresponden a los serovares A y C, observando una diferencia significativa en los pesos moleculares en las cepas de Haemophilus paragallinarum de México y Sudáfrica (fig. 2), por lo tanto no existe ninguna conexión genética entre ambas cepas, y se desconoce cual pudó ser el origen para la presentación por vez primera en México de este tipo de Hp atípicos.

33

CONCLUSIONES. 1.- De 45 casos sospechosos de Coriza Infecciosa Aviar , se aislaron e identificaron 39 cepas de Haemophilus paragallinarum durante los 17 meses de muestreo y que abarca el periodo de 1998-2000. 2.- El año de 1999 fue en donde se aislaron e identificaron más cepas de Hp en comparación a los otros periodos. 3.- Los meses de Enero a Mayo, durante los 17 meses que duro el estudio, fue en donde hubo más aislamientos de Haemophilus paragallinarum . 4.- La edad de las aves en donde se aíslo con más frecuencia Hp durante el estudio, comprendido la edad de 16 a 30 semanas 5.-Se aislaron dos cepas de Hp atipicos que no requieren la presencia de NAD para su crecimiento .( serovar B (PUMA) y C (AZUL y ORO)., en aves de postura comercial en la misma granja y en el mismo brote en el región de los Altos de Jalisco 6.-La cepa de Hp PUMA, la cual corresponde al serovar B, es la primera vez que se reporta en el MUNDO. 7.- El serovar B de Hp fue el que presentó en aves de postura comercial la más significativa baja de producción y mortalidad, en comparación con los otros dos serovares. 8.- Los patrones en la fermentación de carbohidratos que se encontraron en este estudio, son los característicos de Hp. 9.- El método físico (frío) fue el mejor para que los Haemophilus paragallinarum en estudio manifestarán sus hemaglutininas en comparación a los otros medios de extracción de la cápsula.. 10.- Mediante el esquema de Page se identificaron los tres serovares (A, B, C) en aves de postura comercial en la región de los Altos de Jalisco. 11.- Los serovares A2, B1 y C2 fueron identificados mediante el esquemas de Kume en aves de postura comercial. 12.- El serovar C2 fue el que se identificó con más frecuencia (46.6%) en aves de postura comercial, durante el periodo de 1998-2000. 13.- Dos cepas del serovar A, mostraron una reacción débil a los antisueros absorbidos con el serogrupo A, cuando se utilizó el esquema de Kume, por lo que se consideran como posibles nuevos serovares del serogrupo A.

34

14.- Mediante la prueba de biología molecular ERIC-PCR, se demostró que las cepas de Hp NAD independientes aisladas en México, y que corresponden al serovar B (PUMA) y serovar C (AZUL y ORO), no guardan ninguna relación genética con las cepas de Hp NAD independientes que provienen de Sudáfrica.

35

Anexo 1 Datos epidemiologicos de los aislamientos de Haemophilus paragallinarum

Aislamientos Fecha Aislamiento Serotipo identificado Edad

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Sep, Sep, 98 Nov,98 Nov,98 Nov,98 Dic,98 Ene,99 Ene,99 Ene 99 Ene ,99 98 A A B C C B C C C B

Feb, 99

9 19 Sem 24Sem 6 Sem. 12 Sem 32 Sem 22 Sem 26 Sem 8 Sem 25 Sem Sem. 40 % 25% 50% 70% 40% 40% 60% 70% 20% 40% 0 0 1% 0 0 0.2% 0 0.3% 0 0 0 0 15% 0 0 8% 17% 30% 0 10%

11 Sem

Morbilidad Mortalidad Disminución producción Duración 3 2 Sem. brote Sem. # Bacteri2 2 nizacion. Lab.Nac. o Nac Nac Trasnac. Emulsión y/o Gel Gel Gel # Serotipos en 3 2 bacterina

3 Sem 3 Trasn

1.3 Sem 0

B

25% 0 0

3 Sem

3 Sem

2 Sem

2 Sem

2 Sem

3 Sem

2 Sem

2

3

3

2

1

3

2

Trasn

Nac

Trasn

Nac

Trans

Nac

Aceite

Aceite

Gel

Gel

Aceite

Gel

3

3

2

3

3

3

Ningu- Trasn no Aceite Ningu- Aceite no 3 3

36

Datos epidemiologicos de los aislamientos de Haemophilus paragallinarum Aislamientos 12 13 14 Fecha Mar.99 Mar.99 Mar.99 Aislamiento Serotipo A A C identificado Edad 22 sem 16 18 . Sem Sem Morbilidad 20% 10% 65% Mortalidad 0 0 0.3% Disminución 10% 0 0 producción Duración 2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. brote # Bacteri3 2 3 nizacion. Lab.Nac. o Nac. Nac. Trans. Trasnac. Emulsión y/o Gel Aceite Gel Gel # Serotipos 3 3 2 en bacterina

15 16 17 18 Mar.99 Abr.99 Abr.99 May.99

19 May.99

20 May.99

21 Jul.99

22 Jul.99

C

C

B

A

C

B

C

A

11 Sem 10% 0 0

24 Sem 5% 0 0.5%

32 Sem 75% 0.2% 30%

24 Sem

27 Sem

48 Sem

32 Sem

17 Sem

10% 0 3%

15% 0 5%

25% 0 8%

10% 0 5%

30% 0 0

2 Sem.

3 Sem.

3 Sem.

2 Sem.

3 Sem.

2 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 1

3

3

3

3

2

3

2

Trans.

Nac.

Nac.

Nac.

Trans.

Nac.

Trans.

Trans.

Gel

GelAceite 3

Aceite

GelAceite 3

Gel

GelGel- Aceite Aceite Aceite 3 3 3

3

3

2

37

Datos epidemiologicos de los aislamientos de Haemophilus paragallinarum Aislamientos Fecha Aislamiento Serotipo identificado Edad Morbilidad Mortalidad Disminución producción Duración brote # Bacterinizacion. Lab.Nac. o Trasnac. Emulsión y/o Gel # Serotipos en bacterina

23 24 Jul.99 Jul.99

25 Dic, 99

26 Ene,00

27 Ene, 00

28 Feb, 00

29 Feb, 00

30 Feb, 00

B

B

C

C

B

A

B

20 Sem 10% 0 0

11 Sem 10% 0 0

25 Sem 5% 0 2%

36 Sem 2% 0 5%

52 Sem 15% 0 10%

15 Sem 8% 0 0

33 Sem 5% 0 5%

2 Sem. 2 Sem.

3 Sem.

2 Sem.

3Sem.

4 Sem.

2 Sem.

2 Sem.

1

3

1

3

2

3

2

2

Nac

Nac

Trasn.

Trasn.

Trasn.

Nac.

Nac.

Trasn

Gel

AceiteGel 3

Gel

Aceite

Gel

Aceite

Gel

Aceite

2

3

2

3

3

3

A 9 Sem. 25% 0 0

3

Datos epidemiologicos de los aislamientos de Haemophilus paragallinarum Aislamientos 31 Fecha Mar.00 Aislamiento Serotipo C identificado Edad 19 Sem. Morbilidad 15% Mortalidad 0 Disminución 0 producción Duración 2 Sem. brote # Bacteri2 nizacion. Lab.Nac. o Trasc Trasnac. Emulsión y/o Gel Gel # Serotipos 2 en bacterina

32 Mar. 00

33 Abri.00

34 Abri.00

35 Abri. 00

36 37 May. 00 May. 00

C

C

C

C

C

25 Sem 10% 0 0

41 Sem 5% 0 0

22 Sem 5% 0 2%

36 Sem 2% 0 5%

62 Sem 10% 0 10%

11 Sem 33 Sem 22 Sem 25% 45% 8% 0 0 0 0 5% 5%

2 Sem.

3 Sem.

2 Sem.

3Sem.

4 Sem.

2 Sem.

3 Sem.

2 Sem

3

2

3

2

3

1

2

3

Nac

Trasn.

Trasn.

Trasn.

Nac.

Nac.

Trasn

Nac.

AceiteGel 3

Gel

Aceite

Gel

Aceite

Gel

Aceite

Gel-Ac.

2

3

2

3

3

3

3

B

38 May. 00 B

39 May.00 A

1

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