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Miércoles 19 de septiembre de 2007

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Radicales Libres Dr. Alberto Alape Girón. Transcrita por Rodolfo Ureña Villalobos. Aparte de la clase el profesor nos dice que tomemos en cuenta para estudiar el capítulo 24 de Marks y el capítulo 13 de Marcelo Hermes-Lima y a su vez contestar los objetivos planteados. ¿Qué son los Radicales Libres? Un radical libre es una especie química que contiene orbitales con uno o más electrones desapareados, tienden a ser reactivos, a ser oxidantes, tienen necesidad de completar sus electrones oxidando otras moléculas. Entonces mediante reacciones de transferencia de electrones los radicales libres pueden dar origen a especies altamente reactivas y oxidantes. No todos los radicales libres son igualmente reactivos ni oxidantes. ¿Cuál es la diferencia entre Radicales Libres y Especies Reactivas de Oxígeno (ROS)? El término especies reactivas de oxígeno es más amplio, incluye algunas especies que no son radicales, como el peróxido de hidrógeno, el peróxido de hidrógeno en los orbitales externos no tiene electrones libres, por lo tanto no es un radical, ni el oxígeno singulete es un radical; el ión superóxido si es un radical y el oxígeno es un biradical, porque tiene dos electrones libres, sin embargo el oxígeno no es altamente reactivo, porque sus electrones tienen el mismo spin. El anión superóxido es relativamente oxidante, el peróxido de hidrógeno no es un radical y el radical hidroxilo si es un radical, no tiene cargas negativas, pero tiene el puntito que representa el electrón desapareado, si es altamente reactivo. Metabolismo de los radicales libres de oxígeno: ¿Dónde se producen los radicales libres en la célula (en condiciones normales)? En la mitocondria, porque es donde se lleva a cabo la respiración celular, entonces el oxígeno es el aceptor final de la cadena respiratoria del electrón, convirtiéndose en agua, sin embargo la cadena respiratoria tiene algunos puntos de goteo, en donde pueden escapar lo electrones y reaccionar con el oxígeno que hay en el ambiente y convertirlo en anión superóxido. Ese anión superóxido no pasa libremente a través de la membrana mitocondrial, pero pasa a través de canales aniónicos de manera inespecífica, entre un 3 y un 5% del oxígeno que consume la célula se convierte en anión superóxido, eso es un montón y como sabemos los radicales libres pueden reaccionar con macromoléculas celulares con ADN, proteínas, lípidos y de hecho, los radicales que se producen durante el metabolismo celular son la principal causa de mutaciones, en el caso de la mitocondria es muy importante, porque el ADN mitocondrial está expuesto a un ambiente en el que se está produciendo radicales, en el caso del ADN genómico el hecho de que el ADN esté empacado con histonas, confiere cierta protección, el ADN mitocondrial está más expuesto, entonces es más susceptible a sufrir daño por reacciones de oxidación que el ADN genómico. Dentro de la mitocondria la célula tiene una enzima que se llama la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD), catalizando la reacción de anión superóxido en peróxido de hidrógeno, muy parecida a la SOD que tienen las bacterias, el peróxido de hidrógeno no es una especie altamente reactiva, pero es muy peligrosa porque puede pasar a través de la membrana y es capaz de convertirse en el radical hidroxilo. Pero la mitocondria tiene mecanismos enzimáticos para convertir el H2O2 en H2O y O2.

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 2 de 9 Sigamos el anión superóxido, que puede ser producido en la mitocondria, pero no es la única fuente de anión superóxido en la célula, también las enzimas xantina oxidasas (involucradas en el metabolismo de bases púricas y pirimídicas), como subproducto pueden producir anión superóxido, en condiciones de restricción metabólica los niveles de ATP disminuyen: ATP

ADP

AMP

Hipoxantina

Entonces si los niveles de ATP disminuyen dramáticamente, los niveles de ADP aumentan un poco (según la ley de acción de masas), la xantina oxidasa está dezplazada hacia la producción de hipoxantina, en condiciones de restricción metabólica la xantina oxidasa está trabajando bastante por que la degradación de bases nitrogenadas está activada, entonces en isquemia/reperfusión la xantina oxidasa juega un papel importante en la producción de radicales libres. La NADPH oxidasa (fagocitosis; fagocitos profesionales: neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans), entonces cuando uno hace un hemograma en un paciente con infección ve un aumento de células de la línea mieloide, neutrofilia y leucocitosis, entonces lo que está pasando es que la infección de alguna manera está estimulando la proliferación de las células fagocíticas. Entonces el material fagocitado va a dar al lisosoma y en los lisosomas hay un pH básico, y se activan las NADPH oxidasas. Estas enzimas NADPH o relacionadas están en todas las células del organismo. La NADPH oxidasa es una enzima que está en la membrana, anclada en la membrana de los fagolisosomas, y que convierte el oxígeno en anión superóxido utilizando NADPH como cofactor. Eso significa que las células normalmente pueden producir anión superóxido, no solamente como un paso en la cadena respiratoria, sino como un subproducto por la xantina oxidasa y la NADPH oxidasa. Hay otras enzimas que producen anión superóxido como el citocromo P450 del retículo endoplásmico, que es un sistema que participa en el metabolismo de muchos xenobióticos, de muchas drogas y es un sistema polimorfo, entonces hay personas que tienen un sistema de degradación de drogas más fuerte que otros y hay personas que ciertas drogas son extremadamente tóxicas, se activan radicales libres que producen necrosis hepática como respuesta a una droga. En el citoplasma hay una superóxido dismutasa (SOD) diferente a la de la mitocondria que se llama SOD dependiente de cobre que cataliza la misma reacción, la conversión de anión superóxido en peróxido de hidrógeno, además en las células están los peroxisomas en donde se llevan a cabo reacciones de oxidación como la oxidación de ácidos grasos de cadenas muy largas y hay mucha catalasa, la catalasa produce peróxido de hidrógeno. Entonces el peróxido de hidrógeno puede provenir de la reacción catalizada por la superóxido dismutasa, o de los procesos oxidativos que ocurren en los peroxisomas y al igual que la mitocondria que tiene mecanismos para degradar el peróxido de hidrógeno en el citoplasma también están catalasas que convierten el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, y hay unas enzimas que se llaman glutatión peroxidasas (GPX) que hacen lo mismo (H2O2  H2O + O2), pero las GPX necesitan de cofactor al glutatión reducido, entonces el glutatión reducido se oxida y cuando está oxidado se reduce por unas enzimas que se llaman glutatión reductasas. El problema con el peróxido de hidrógeno es que atraviesa la membrana y en presencia de Fe2+ o Cu1+, y produce radical hidroxilo oxidándolos a Fe3+ o Cu2+. En algunas células como las células fagocíticas además de la NADPH oxidasa también participa en la degradación de los organismos fagocitados unas enzimas que se llaman mieloperoxidasas (MPO), que son enzimas exclusivas de células de la línea mieloide, están en los gránulos azurófilos, de los neutrófilos, las MPO catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete. Entonces no solamente existen las ROS, sino que también existen las especies reactivas de nitrógeno (RNS), las RNS derivan del óxido nítrico (ON), la principal función del ON es la vasodilatación, es producido por la óxido nítrico sintasa, es la molécula comunicadora entre las células endoteliales y las células del músculo liso de las paredes de los vasos. El ON es una molécula, un ejemplo clásico de un radical libre que tiene una función fisiológica fundamental. El ON se degrada en mili o nanosegundos, dura muy poco. El ON puede reaccionar con oxígeno y generar otras especies reactivas como el dióxido de nitrógeno, con anión superóxido

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 3 de 9 puede generar dióxido de nitrógeno que es otro malo de la película. El radical hidroxilo, el dióxido de nitrógeno y el peroxinitrito son las especies reactivas más oxidantes. En el organismo se están produciendo radicales libres constantemente a través de diferentes mecanismos enzimáticos directa o indirectamente. Sin embargo hay una serie de agentes externos que pueden estimular o favorecer directa o indirectamente la producción de radicales libres, muchas drogas, muchos fármacos, ciertos alimentos, ciertos tipos de radiación, entonces el organismo tiene que manejar todos los radicales libres. En esta figura se observan todas las fuentes de radicales libres, estas vías están en todas las células. En la respiración celular hay varios puntos en los cuales se puede generar anión superóxido, el principal punto es a nivel de las ubiquinonas, en algunos casos el anión superóxido va a quedar en la matriz mitocondrial y en otros casos en el espacio intermembrana principalmente a nivel de complejo 3. Y en algunas células especializadas se puede producir peróxido de hidrógeno a nivel de la membrana externa. Si les digo monoamino oxidasa (MAO), dopamina, Parkinson, la MAO participa en la vía de producción de dopamina y el exceso en la producción de radicales libres en las neuronas producen la enfermedad de Parkinson (deja de tarea leer eso en el cap. 24 porque lo va a preguntar). Entonces la mitocondria es una fuente importante de radicales libres, la xantina oxidasa funciona en la fase terminal del metabolismo de las bases púricas, en donde se puede producir anión superóxido como subproducto, y esta vía es importante cuando los niveles de AMP aumentaban como en condiciones de hipoxia. Las óxido nítrico sintasas producen ON como molécula final, la ON sintasa es una enzima dimérica, son hemoproteínas, utilizan varios cofactores como el NADPH, convierten la arginina en citrulina y producen ON, estas enzimas para poder actuar necesitan dimerizarse. Como coenzimas necesita FAD, FMN. Existen 3 isoformas de ON sintasa, la ONS endotelial, la neuronal y la inducible (que se encuentra principalmente en macrófagos, se inducen en procesos infecciosos-inflamatorios), son proteínas homólogas, tienen un 50% de identidad en las secuencias, son producto de diferentes genes, tienen diferentes localizaciones, se regulan de manera diferente, tienen propiedades diferentes, y hay mucho interés en el desarrollo de inhibidores del ON, unos se parecen al sustrato, otros inhiben la dimerización, y otras se parecen a algunos de los cofactores. Funciones de los radicales libres: El ON producido por las células endoteliales regula la dilatación del músculo liso, a través de la guanilato ciclasa. El ON es una molécula multifuncional, activa diferentes vías y oxida diferentes moléculas como la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno puede dar origen al anión peroxinitrito, puede reaccionar para dar dióxido de nitrógeno, dependiendo de las cantidades de ON en un momento dado puede tener efectos contraproducentes; y el mejor ejemplo de ello es la SOD dependiente de Mn, que es la enzima que defiende a la mitocondria del anión superóxido, es muy susceptible a ser oxidada por el peroxinitrito. Entonces el ON en exceso puede afectar el funcionamiento de la cadena respiratoria y puede afectar la capacidad de defensa de la mitocondria, contra los radicales libres. El ON tiene 2 caras: la buena (vasodilatación) y la mala (puede afectar el funcionamiento de la cadena respiratoria, llevando hasta a muerte celular). Las células fagocíticas activadas producen radicales libres, en la que se activa el estallido respiratorio, se empiezan a consumir 20 veces más oxígeno del que se consume normalmente, en la membrana de los fagolisosomas, por la NADPH oxidasa, entonces ésta cuando se fagocita una bacteria, en la membrana de los

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 4 de 9 fagolisosomas está la proteína gp91 que es parte de la NADPH oxidasa, la cual es un complejo que se ensambla, entonces el estímulo que se produce por la entrada de una bacteria, se activan varias proteínas por transducción de señales, y estas proteínas que están en el citosol se ensamblan, se pegan en la membrana y esto va a consumir oxígeno y lo va convertir en anión superóxido. Entonces los radicales libres ayudan a digerir los organismos fagocitados en los fagolisosomas, y también favorecen la respuesta inflamatoria, esta producción de radicales libres cuando se da la entrada de un agente patogénico va a estimular la producción de citoquinas que van a favorecer la adhesión de moléculas de las células endoteliales, y van a favorecer la salida de células inflamatorias al sitio de infección. Y entonces producidas en cantidades moderadas ayudan a tener una buena respuesta inflamatoria y que se elimine el organismo patógeno. Esta es la estructura de la gp91 (NOX2), que es la proteína catalíticamente activa, tiene una región transmembrana y estos dominios que unen al FAD. En los últimos años se ha visto que no solamente está presente en células fagocíticas sino que hay análogos, como NOX1, NOX3, NOX4, y otras que se llaman NOX5, que tienen la misma estructura pero con un dominio adicional y las que se llaman DUOX que tienen otro dominio adicional. La NOX2 está en células fagocíticas, la NOX1 presente en músculo liso, NOX3 en riñón, NOX4 en riñón, NOX5 en bazo, en diferentes tejidos. Entonces hay un NADPH oxidasa en células no fagocíticas, y tienen que ver con control de la división celular, activando la vía de la MAPK, entonces los radicales libres juegan un papel importante en el control de la proliferación celular. Resulta que los radicales libres pueden producir angiogénesis (que es la formación de nuevos vasos, importante en cáncer), entonces en el control de la angiogénesis también tienen que ver los radicales libres. La sobreexpresión de algunas NADPH oxidasas ha sido involucrada en algunos procesos fisiopatológicos como la ateroesclerosis, en cáncer resulta que en ciertos tipos de cáncer parece que se da la oxidación de algunas de estas NADPH oxidasas. Daño oxidativo causado por los radicales libres: Ahora vamos a ver la parte “oscura” de los radicales libres, el daño que pueden causar a las macromoléculas celulares. Algunos radicales libres como son especies altamente reactivas pueden dañar ADN, son la principal causa de mutación en condiciones normales, se estima que ocurren como 10000 daños al ADN en cada célula diariamente, y los mecanismos de reparación reparan la mayoría de los daños. Alimentos con actividad antioxidante son las frutas, verduras, y hay ciertas comidas/bebidas especialmente ricas en antioxidantes como el tomate, el brócoli, aceite de oliva, el vino rojo (por su alto contenido de polifenoles), el noni (consumido en exceso puede ser hepatotóxico); es importante consumir cierta cantidad de antioxidantes para prevenir enfermedades como la aterosclerosis. Los radicales libres que se producen diariamente poco a poco van echando a perder las macromoléculas celulares, van deteriorando las células, contribuyendo a su envejecimiento. Puede modificar las bases, causar ruptura de la actividad proteica, puede reaccionar con los lípidos con los ácidos grasos insaturados de la membrana y causar daño en la membrana, puede oxidar las proteínas y causar carboxilación de las proteínas, inactivar la proteína, alterar la estructura tridimensional. En el ADN alteran las bases púricas o pirimídicas dependiendo del tipo de radical libre se van a producir diferentes tipos de daños que van a cambiar el apareamiento de las bases, de manera que se producen mutaciones, también los RL también activan señales que llevan a la expresión de las proteínas involucradas en la reparación del ADN, entonces la inmensa mayoría del daño al ADN es reparado. En el caso de los lípidos, el blanco del daño oxidativo son los ácidos grasos insaturados y se afectan las instauraciones y afectan la disposición de los ácidos grasos y eso puede alterar la permeabilidad de la membrana.

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Sin embargo, si vemos en un pastel cuales son los tipos de moléculas más dañados por el daño oxidativo, la mayor son las proteínas las cuales pueden oxidarse en diferentes residuos (principalmente cisteína, metionina, tirosina), afectando la estructura tridimensional de la proteína y la función de la proteína. Cuando hay daño a membrana hay enzimas como la glutatión peroxidasa que se mete a la membrana y puede reparar los lípidos peroxidados, pero las proteínas no se reparan, el destino de las proteínas oxidadas son los proteosomas, y ahí se degradan.

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Defensas antioxidantes de las células: ¿Cómo se defienden las células del daño oxidativo? Tiene que haber un equilibrio entre la cantidad de RL que se forman y las defensas antioxidantes, y ¿Cuáles son esas defensas antioxidantes? Son tres categorías: Las enzimas que tienen actividad antioxidante, como la superóxido dismutasa, la catalasa, la glutatión peroxidasa que van a reducir los radicales libres y hay otras enzimas que ayudan a que esas funciones se den, que son enzimas de soporte como la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (que es importante en la regeneración del glutatión). La otra categoría son los scavengers, aclaradores, o barredores de radicales libres de bajo peso molecular, moléculas (pequeñitas) que son capaces de reaccionar con los radicales libres e inactivarlos y aquí papel preponderante el glutatión (tripéptido), principal aclarador de radicales libres que tiene el organismo. En algunos casos serían los productos de desecho como el ácido úrico, que tiene actividad antioxidante, hay otros antioxidantes que vienen de la dieta como los tocoferoles, los carotenoides y el ácido ascórbico. Otro mecanismo para reducir el daño oxidativo es aumentando la capacidad de quelar los metales que contribuyen a la generación del radical hidroxilo, como quelantes del hierro. Entonces en las enzimas con actividad antioxidante directa tenemos la superóxido dismutasa y tres categorías de enzimas que tienen actividad sobre el peróxido de hidrógeno, la catalasa, la GPX y las peroxirredoxinas, vamos a hablar de cada una de ellas: Las superóxido dismutasas, en el organismo humano hay dos tipos dependientes de Cu y Zn, la SOD1 está en el citoplasma y en muchos de los lisosomas y la SOD3 que tiene la misma estructura pero es una proteína secretada que puede estar en el plasma, en la linfa, en el líquido cefalorraquídeo. También está la SOD dependiente de Mn, que está en la mitocondria, se parece a la de las bacterias, y tienen una estructura completamente diferente, aunque catalizan la misma reacción (se originaron por evolución convergente) y se llama SOD2. La catalasa cataliza la misma reacción, son enzimas tetraméricas. Antes de hablar de la glutatión peroxidasa vamos a hablar del glutatión, el glutatión es un barredor de radicales libres, porque reacciona con un radical libre, lo reduce y él se oxida, es un tripéptido que tiene una cisteína, y su grupo sulfhidrilo es el que se oxida cuando se reduce, y es el aclarador de radicales libres con mayor concentración intracelular. El glutatión tiene su grupo sulfhidrilo en estado reducido y cuando se oxida forma un puente disulfuro. Se vuelve a reducir por la glutatión reductasa, la cual es una enzima importante para mantener los niveles de glutatión para que la célula pueda manejar los niveles de radicales libres. Esta Glutatión reductasa requiere de NADPH como cofactor, la vía de las pentosas es la principal fuente de NADPH en las células, entonces la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa es una enzima de soporte porque tiene la NADPH que se necesita para mantener los niveles de glutatión.

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 6 de 9 El glutatión viene de dos vías, hay una vía de síntesis de novo, también hay una vía de recuperación. Uno podría medir cómo anda el status oxidativo de un individuo midiendo los niveles de glutatión. Hay dos enzimas que utilizan el glutatión como cofactor, la glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión transferasa (GST). Las GPx utilizan el glutatión como cofactor, por ejemplo para reducir el H 2O2. Las GST inactivan ciertos radicales libres metiéndoles una molécula de glutatión. Las GPx son selenoproteínas, se ubican en la mitocondria, en el citosol, catalizan la producción de peróxido de hidrógeno u otros peróxidos orgánicos a agua y tiene 4 isoformas. La GPx-1 reduce el peróxido de hidrógeno a agua, y las otras las leyó de la tabla… La GPx-1 actúa sobre el peróxido dehidrógeno, la GPx-4 específicamente sobre lípidos peroxidados. Y finalmente las peroxirredoxinas catalizan la reducción de diferentes RL, reducciones del H 2O2, también pueden reducir peroxinitrito. Tiene una eficiencia catalítica muy baja, se localiza en el citosol, en la mitocondria, en los peroxisomas. Estrés Oxidativo: ¿Qué es estrés oxidativo? Es cuando hay un desequilibrio en la cantidad de RL por un exceso de radicales o por una disminución en la capacidad antioxidante, entonces el estrés oxidativo es un desbalance entre antioxidantes y oxidantes a favor de los oxidantes. Dependiendo de la dosis y la duración de la exposición a ciertos radicales libres se pueden activar respuestas de supervivencia o se puede causar la muerte celular, ese desbalance puede ser transitorio o puede ser mucho. Los RL o el estrés oxidativo en dosis bajas puede favorecer la proliferación celular, si ese desbalance es temporal y es moderado puede ser benéfico, porque estimula que la célula se divida. Si es intermedia la dosis puede causar arresto en el crecimiento, senescencia. Y si es muy grande puede causar muerte celular tanto por necrosis como por apoptosis. Eso se debe a que hay varias vías de transducción de señales que son susceptibles al estrés oxidativo, hay factores de crecimiento, y de transducción. Dependiendo del desbalance de RL así será la respuesta de sobrevida o de muerte celular. Una vía clásica que se activa por estrés oxidativo es la vía de NFκB, asociada con inflamación, respuesta inmune, es un factor de transcripción (proteína que se une al ADN y que controla la transcripción de genes). En este caso la regulación es por proteolisis, NFκB es una proteína dimérica, se localiza en el citoplasma, tiene una señal de señalización nuclear y está secuestrada por IκB, el cual es un inhibidor que mantiene a NFκB en el citoplasma para que no pueda entrar al núcleo a activar la transducción de los genes que NFκB activa. Entonces cuando hay RL o estímulos que activan la vía de transducción de NFκB, IκB es fosforilada por una quinasa y al fosforilarse esa proteína es degradada. Entonces si el inhibidor es degradado, NFκB es liberado y se mete al núcleo, y activa la transducción. ¿Qué genes controlan los NFκB? Los NFκB controlan genes que producen citoquinas, proteínas de adhesión y otros mediadores de la respuesta inflamatoria. NFκB en condiciones óptimas se activa y contribuye a que los leucocitos salgan y se produzca la respuesta inflamatoria. ¿Qué es el choque séptico? Es un fallo multiorgánico, un colapso hemodinámico, se produce por un estímulo inespecífico de la respuesta inmune, por polisacáridos de las bacterias gram negativas. Cuando hay un sobreestímulo del sistema inmune y hay una activación generalizada de procesos inflamatorios como NFκB, y puede llevar a una respuesta descontrolada. NFκB sobreactivado puede ser parte de la patología. Los RL pueden activar una respuesta protectora peor cuando son producidos en exceso pueden producir daño a las macromoléculas celulares, pueden peroxidar lípidos, pueden dañar proteínas, pueden dañar el ADN. Y las mitocondrias son un blanco importante del daño celular causado por el estrés oxidativo, porque al oxidarse y dañarse las proteínas de la cadena respiratoria y al funcionar inadecuadamente van a producir más

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 7 de 9 radicales libres y se forma un circulo vicioso en el cual al dañarse la mitocondria hay un problema en la producción de ATP, porque la cadena respiratoria no está funcionando bien pero se está produciendo más radicales libres. Los lisosomas son un blanco muy importante del daño causado por el estrés oxidativo porque el hierro es un metal muy importante, porque hay muchas proteínas que lo tienen formando parte de su estructura, entonces la célula está captando Fe constantemente para sus procesos de síntesis, pero el Fe2+ porque el Fe3+ favorece la producción del radical hidroxilo, entonces el Fe se mantiene quelado por compuestos orgánicos como ciertos aminoácidos que quelan Fe y por proteínas quelantes de Fe. El hecho es que ella es degradada en los lisosomas, en donde el pH es ácido, este Fe es transportado por proteínas transportadoras, cuando sale al citoplasma es captado por proteínas que lo mantienen quelado, pero en el lisosoma cuando se libera de la transferrina hay cierta cantidad de Fe libre que puede contribuir a la reacción de Femto y por lo tanto el H2O2 producido en las mitocondrias o en el citoplasma puede atravesar la membrana de los lisosomas y aquí convertirse en radical hidroxilo, dañar la membrana lisosomal y dañar proteínas lisosomales, favorecer la salida de enzimas lisosomales al citoplasma. Los lisosomas son el lugar de la célula en donde se encuentran mayores concentraciones de Fe libre. Por ejemplo, cuando hay salida de proteasas lisosomales al citoplasma se ha descubierto que tienen señales que pueden producir apoptosis. En algunos casos los RL actúan como mediadores de la muerte por apoptosis, por ejemplo a través de éste mecanismo. En otros casos cuando el daño oxidativo es muy grande, como cuando se da en proteínas transportadoras de membrana o canales iónicos el estrés oxidativo puede causar necrosis o también el daño exagerado a los lisosomas causan ruptura lisosomal puede también causar muerte por necrosis. Las caspasas como ustedes recordarán son enzimas que participan en procesos apoptóticos son cistein-proteasas (tienen un grupo cisteína en el sitio activo), un residuo de cisteína que es vital para su función y la cisteína es susceptible a sufrir daño oxidativo. Entonces en algunos casos una célula que se está muriendo por apoptosis o que se va a morir por apoptosis es expuesta a estrés oxidativo, puede inactivar las caspasas y hacer que la célula se muera por necrosis. Entonces dependiendo de la magnitud del daño oxidativo se va a llevar a muerte por apoptosis o muerte por necrosis. ¿Cómo se evalúa experimentalmente el estrés oxidativo? Se puede medir indirectamente los lípidos peroxidados, las proteínas oxidadas o se puede medir los productos de esas reacciones de oxidación como la 8 hidroxi desoxiguanosina (8-OHdG), que es un producto que se genera cuando hay daño a ciertas bases, entonces una posibilidad por marcadores de estrés oxidativo, las macromoléculas oxidadas. Otra posibilidad es medir las defensas antioxidantes, porque si en un tejido hay estrés oxidativo los niveles de glutatión van a estar bajos, porque el glutatión reducido se consume. En algunos casos por ejemplo en respuesta al daño oxidativo las células sintetizan más catalasa o más SOD, entonces se pueden medir las enzimas antioxidantes y frecuentemente los niveles de enzimas antioxidantes suben. Hay unos métodos para medir los RL pero son muy complicados y son técnicas que tienen poco uso in vivo, son muy difíciles, entonces usualmente el estrés oxidativo se determina indirectamente midiendo marcadores de daño oxidativo como aumento de proteínas oxidadas, aumento en lípidos oxidados, aumento de ADN dañado, disminución de glutatión o aumento de enzimas antioxidantes. En cortes histológicos uno puede medir proteínas carboniladas con métodos de inmunohistoquímica.

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 8 de 9 Estrés oxidativo en algunas patologías: Los RL se involucran en diversas patologías, como la diabetes, los diabéticos es la neuropatía diabética, la microangiopatía diabética, mucho del daño se debe a estrés oxidativo, enfermedades infecciosas como el VIH, en el Helicobacter pylori (cáncer gástrico), es una bacteria que infecta la mucosa gástrica y produce daño oxidativo a la mucosa gástrica. En pneumonía, en enfermedades neurodegenerativas, Parkinson, Alzheimer, en varios tipos de cáncer. Y la enfermedad aterosclerótica y el daño causado por isquemia. Siempre hemos hablado de isquemia/reperfusión, en la oclusión de un vaso hay una región central, un core en donde las células dependiendo de la duración de la isquemia; hay tejidos más susceptibles a la isquemia que otros, por ejemplo el SNC las neuronas son altamente susceptibles a la isquemia y mueren rápidamente en términos de minutos si no reciben reperfusión, hay otros tejidos como el músculo esquelético que resiste más porque puede generar ATP por otros mecanismos y compensar la falta de oxígeno; entonces la región central va a morir en su mayoría por necrosis, dependiendo del tipo de tejido, de la duración del proceso, pero también se activan mecanismos endógenos para deshacer ese trombo. Entonces si el paciente llega ven a ver cómo se disuelve el trombo para que se reperfuda el tejido porque si el tejido continúa sin irrigación termina muriéndose, claro hay mecanismos colaterales. Cuando se reperfunde el tejido es bueno, pero a la vez es malo porque los niveles de ATP están bajos porque mantener los niveles de glutatión reducido cuesta energía, si no hay ATP lo que pasa es que el nivel de glutatión reducido disminuye cuando viene el oxígeno se empieza a producir anión superóxido pero no hay glutatión para mantener el balance entre oxidantes y antioxidantes. Hay varios factores que van a determinar la sobrevida de los tejidos en isquemia/reperfusión: 1. Tipo de tejido, 2. duración de la isquemia. Hay estudios que demuestran que si antes de la reperfusión la sangre del paciente se carga con moléculas antioxidantes cuando entra la sangre en tejido isquémico va a haber menor daño oxidativo. Pero no es cualquier antioxidante. La idea es que cuando un tejido está sometido a isquemia se reperfunde y uno mide la producción de RL, se ve que el pico de RL es después de la reperfusión, se reactiva el metabolismo mitocondrial, la respiración celular pero las enzimas antioxidantes están bajas por lo que la producción de RL aumenta y si uno mide la cantidad de LDH liberada, también se puede medir el daño al miocardio midiendo los niveles plasmáticos de creatina quinasa. Y si uno mide muerte celular se da cuenta que la muerte celular va detrás de la reperfusión, entonces el estrés oxidativo que ocurre después de la reperfusión es el causante de la muerte celular y eventualmente se podría prevenir. Animales transgénicos: alterado genéticamente en células embrionarias, en el cual se le pone un plásmido con un promotor para que produzca una proteína. Animales knock-out: son los que les quita un pedazo a un gen normal, entonces ese plásmido se le mete a la célula y el animal va a carecer de un gen. Entonces se ha demostrado que el exceso de radicales libres juega un papel importante en el daño tisular causado por isquemia/reperfusión, y a raíz de esto se están llevando a cabo estudios clínicos. Antioxidantes con potencial uso en isquemia/reperfusión: Inhibidores de enzimas productoras de RL, por ejemplo inhibidores de xantina oxidasa, inhibidores de ON sintasa. Sustancias que mimetizan la actividad de enzimas antioxidantes, como por ejemplo, miméticos de la peróxido dismutasa. Compuestos orgánicos pequeños que catalizan la reacción y conversión de superóxido en peróxido de hidrógeno. Sustancias que aclaran ciertos radicales, por ejemplo unas que reaccionan con anión superóxido, o que reaccionan con radical hidroxilo. Un antioxidante que si ha funcionado muy bien es la Edaravona, es un aclarador de radical hidroxilo, es relativamente liposoluble, puede atravesar la membrana, en células en cultivo previene la muerte causada por ROS

Miércoles 19 de septiembre de 2007 Página 9 de 9 y en animales de experimentación se vió que disminuye el daño causado por isquemia/repercusión en miocardio y SNC. El profesor comenta los artículos… Estudios de doble ciego es que el paciente no sabe lo que le están dando ni el médico sabe lo que está dando ya sea placebo o Edaravona en este caso. A todos los pacientes se les da el tratamiento estándar, lo que pasa es que a unos se les da la droga de experimentación, no es que a algunos no se les hace nada. Conclusiones de los artículos: La edaravona es eficaz para el tratamiento del daño causado por la reperfusión en pacientes con infarto cerebral agudo, si se administra a una dosis 30 mg. dos veces diarias por 14 días después del infarto. Los pacientes que reciben edaravona muestran menor daño neurológico que los pacientes que recibieron placebo, especialmente si se atienden en menos de 24 horas después del infarto. La edaravona es eficaz para el tratamiento del daño causado por la reperfusión en pacientes con infarto agudo del miocardio. Los pacientes que reciben edaravona antes de la reperfusión sufren menor daño, a juzgar por los menores niveles plasmáticos de CK, y su función cardiaca se recupera mejor que en los pacientes de los grupos control. En pacientes con infarto agudo del miocardio la administración de edaravona reduce significativamente el daño oxidativo y la incidencia de eventos cardiovasculares secundarios en los tres años posteriores al infarto. Como conclusiones generales: Los radicales libres juegan un papel importante en varios procesos fisiológicos (como la inflamación y el control del tono vascular). El estudio del papel de los radicales libres en varios procesos fisiológicos está abriendo la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas con antioxidantes en diversas enfermedades.