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PRÁCTICA 2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE INMUNOSEROLOGÍA 1. INTRODUCCION: Esta práctica de laboratorio está diseñada con el propósito de reforzar los conceptos referentes a la preparación de soluciones y diluciones y de que el estudiante adquiera la habilidad y destreza en los cálculos de concentración de las soluciones que resultan a partir de mezclas y diluciones de otras soluciones. Además, el estudiante aprenderá a determinar si los métodos de diagnóstico laboratorial que emplearan en la rutina diaria realmente son eficientes en relación al diagnóstico o descarte de una determinada enfermedad. 2. OBJETIVOS: Realizar los cálculos de preparación de los reactivos que se emplearan durante las prácticas de la asignatura. 3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS: •

Pizarra, presentación en Power Point.

4. PROCEDIMIENTO Discusión, planteamiento y resolución de ejercicios prácticos en base al siguiente temario. 4.1. Soluciones Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más substancias, que pueden separarse por métodos físicos en sus diversas substancias componentes. En una solución, aquella substancia que se encuentra en mayor proporción se conoce como “solvente” y las demás como “solutos”. Las soluciones verdaderas difieren de las suspensiones y de los sistemas coloidales, fundamentalmente en el tamaño de partícula del soluto o de la fase dispersa y en las propiedades que derivan de dicha diferencia. En general, las soluciones verdaderas en fase líquida, no desprenden soluto por decantación ni tienen la propiedad de dispersar la luz. Aunque existen soluciones sólidas como las amalgamas y las aleaciones o gaseosas como el aire, en lo que respecta al medio ambiente y a la vida diaria, las soluciones más frecuentes son las soluciones en fase líquida, y dentro de ellas, las soluciones acuosas. Algunos ejemplos de soluciones acuosas pueden encontrarse en las aguas de consumo, las aguas residuales domésticas, los vertimientos

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líquidos industriales y en general, en las aguas residuales procedentes de cualquier actividad antrópica. La solubilidad de los solutos gaseosos en el agua, (oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, metano, sulfuro de hidrógeno, etc.), es directamente proporcional a la presión e inversamente proporcional a la temperatura. A diferencia de esta ley general, la solubilidad de los solutos sólidos en el agua no puede describirse con tanta rigurosidad como en el caso de los gases; sin embargo, en la mayoría de los casos se observa que la solubilidad de un sólido en el agua aumenta con la temperatura; La solubilidad del sólido también suele ser mayor, cuanto menor es el pH del medio. Las propiedades de las soluciones pueden clasificarse en dos categorías: Aquellas que dependen exclusivamente de la concentración de partículas en solución, independientemente de su naturaleza, (Propiedades Coligativas o Colectivas) y aquellas que dependen fundamentalmente de la naturaleza de las partículas del soluto, más que de la cantidad, (Propiedades No-Colectivas). Las propiedades No-Coligativas de las soluciones permiten clasificar los diferentes solutos y sus soluciones, como substancias o soluciones electrolíticas y no electrolíticas. Las propiedades coligativas de las soluciones dan origen a fenómenos como la ósmosis y la reducción de la presión de vapor del agua. 4.2. El Proceso de Disolución Cuando un cubo de azúcar o de cualquier substancia hidrosoluble se introduce en un vaso lleno de agua, se observa que al cabo de un corto tiempo este se desvanece sin dejar rastro alguno de su presencia en el fondo del vaso. Esta aparente desaparición del soluto indica que la disolución es un proceso espontáneo de dispersión molecular del soluto en el solvente o en todo caso, a una escala muy pequeña. Asumiendo la disolución como un proceso de dispersión molecular, es claro que esta implica entonces la ruptura de los enlaces intermoleculares presentes en el soluto y la generación de enlaces entre las moléculas del solvente y las moléculas del soluto. Este proceso se conoce como “solvatación”. De forma general, la ruptura de los enlaces intermoleculares en el soluto es un proceso que consume energía mientras que la formación de nuevos enlaces Soluto--Solvente, es un proceso que libera energía. Cuando una substancia hidrosoluble se sumerge en el agua la disolución se da espontáneamente, debido a que el proceso de disolución conduce a un aumento en la entropía del sistema. Cuando la energía requerida para romper los enlaces intermoleculares del soluto es mayor que la energía liberada en la solvatación, el sistema en su conjunto absorbe el excedente energético de los alrededores, hecho que se manifiesta mediante una reducción de la temperatura. Cuando la

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energía requerida para romper los enlaces intermoleculares del soluto es menor que la energía liberada en la solvatación, el sistema en su conjunto cede el excedente energético a los alrededores y este hecho se manifiesta mediante un aumento en la temperatura del sistema. Adicionalmente, para el proceso de disolución, es necesario que exista afinidad o semejanza entre las moléculas del solvente y las moléculas del soluto. Esta condición se resume en el adagio químico de que “lo semejante disuelve a lo semejante”. Así, las substancias fuertemente polares como el agua, disuelven solutos polares como el alcohol, las sales, los ácidos y las bases. A su vez, los solventes no polares como el hexano, disuelven solutos no polares como las grasas. 4.3. La Solubilidad Todas las substancias difieren ampliamente en el grado de solubilidad frente a un solvente específico. Con el fin de poder comparar la capacidad que tiene un determinado solvente para disolver una determinada cantidad de soluto, se emplea la propiedad fisicoquímica llamada Solubilidad. Esta, se define como la concentración de saturación de un soluto en un solvente, a una temperatura dada. Los valores de solubilidad en agua para diferentes solutos inorgánicos, se expresan generalmente en tablas, en términos de constantes conocidas como “Constantes del Producto de Solubilidad, KPS. 4.4. Expresión de la Concentración de una Solución Existen varias formas de expresar la concentración de una solución, esto es, la proporción de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de “soluciones diluidas, concentradas, saturadas o sobresaturadas”, para referirse a soluciones que contienen muy “poco, mucho, el máximo o más del máximo”, de la cantidad máxima de soluto que el agua puede contener a una determinada temperatura. Así por ejemplo, una solución de ácido clorhídrico cuya concentración sea de aproximadamente el 1 %, podría ser una solución diluida. Una solución al 10 % podría ser una solución concentrada. Una solución al 35 % podría ser una solución saturada y una solución al 38 % una solución sobresaturada. Téngase en cuenta que la cantidad máxima de HCl que puede disolver a 20 °C es del orden del 35,5%. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las descripciones cualitativas de la proporción de soluto a solvente en una solución, no son suficientes y es necesario entonces, precisar matemáticamente esta proporción. Aunque existen diversas formas de expresar matemáticamente la proporción de soluto a solvente dentro de una solución, las de uso más extendido suelen ser Molaridad, el Porcentaje Peso a Volumen, el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Millón. 4.5. Molaridad La molaridad es por excelencia, la mejor forma de expresar la concentración de una solución en trabajos de química, física, biología o ingeniería. La Molaridad es por definición, el número de

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moles de soluto que se hallan contenidos en un litro de solución y se representa por M. Así, por ejemplo, una solución 0,01 M es una solución que contiene 0,01 moles de soluto en cada litro de solución. Una solución 2,0 molar es una solución que contiene 2,0 moles de soluto por cada litro de solución. La molaridad, además de ser una forma de expresión de la concentración de amplia aceptación, también es una forma práctica para referirse a ella, cuando se trata de prepararla en el laboratorio. Así por ejemplo, se pueden pesar fácilmente 0,01 moles de CaCO3 y disolverlos después en un matraz de un litro, para preparar una solución 0,01 M de CaCO3. 4.6. Porcentaje Peso a Peso El porcentaje Peso a Peso es una relación que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 gramos de solución. Esta forma de expresar la concentración implica al momento de preparar la solución, pesar separadamente el soluto y el solvente; aunque este procedimiento facilita la comprensión de la concentración y hasta cierto punto su preparación, la aplicación de estas soluciones en el laboratorio se dificulta debido a que obliga a conocer también, la densidad de la solución. Si a esto se le suma el hecho de que los volúmenes de soluto y solvente, generalmente no son aditivos en las soluciones, las dificultades empeoran. La expresión porcentual peso a peso en las soluciones se conserva particularmente, para las soluciones acuosas de los ácidos y de las bases cuya presentación como reactivo, viene disuelta en agua: el HCl, el HF, el HBr, el HNO3, el H2SO4, el H3PO4, el CH3COOH y el NH3. Para facilitar el manejo de estas soluciones, la concentración peso a peso de la solución se acompaña con su densidad a 20 ºC. 4.7. Porcentaje Peso a Volumen El porcentaje Peso a Volumen es una relación que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 mililitros de solución. Esta forma de expresar la concentración de una solución facilita enormemente su preparación y aplicación. Desafortunadamente, el porcentaje peso a volumen suele ser una unidad muy grande para muchos fines analíticos. Generalmente cuando se expresa la concentración de una solución en términos porcentuales, casi siempre la expresión se refiere al porcentaje peso a volumen. 4.8. Partes por Millón La expresión porcentual o molar para referirse a la concentración de una solución, se aplica generalmente a las soluciones en las cuales la proporción de soluto a solvente es relativamente alta, proporción que generalmente se halla en la escala de las “Partes por Mil”. Sin embargo, existen muchas substancias cuya concentración normal en el agua es mucho menor que las partes

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por mil. Es en estos casos cuando la expresión en términos de las Partes por Millón o ppm, se hace necesaria. Las Partes por Millón son una relación que expresa las partes de soluto que se hallan contenidas en un millón de partes de solución. Así, las partes por millón son equivalentes a los gramos de soluto por metro cúbico de solución, a los gramos de soluto por tonelada de solución o a los miligramos de soluto por kilogramo de solución. Ahora, como esta forma de expresar la concentración de una solución se utiliza particularmente para soluciones diluidas y como un kilogramo de agua equivale a un litro en términos de volumen, generalmente las partes por millón se aproximan a los miligramos por litro. Las partes por millón son la forma como se expresa normalmente la concentración de substancias como hierro, manganeso, sulfatos, nitratos, grasas y aceites y metales pesados en el agua. Para algunas substancias aún menos frecuentes en el agua, tales como los hidrocarburos aromáticos, los fenoles los pesticidas, el mercurio, el plomo, etc., las ppm resultan ser una unidad aún muy grande. En estos casos se emplean las partes por billón y de ser necesario, las partes por trillón. 4.9. Preparación de Soluciones Uno de los problemas que con mayor frecuencia se deben resolver en un laboratorio, lo constituye el acondicionamiento de la concentración de las soluciones a las necesidades específicas de los diferentes usos; con frecuencia, la concentración de las soluciones de partida dista mucho de ser la requerida en las soluciones de trabajo. Así por ejemplo, las soluciones de trabajo de los ácidos clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico y acético, se preparan normalmente por dilución de soluciones concentradas. Por otra parte, en trabajos ambientales por ejemplo, el análisis de una muestra puede requerir de un proceso de dilución, como parte de la preparación de la muestra. Todos estos procesos de dilución emplean cálculos que es preciso conocer para poder realizar. 4.10. Análisis Volumétrico En el análisis volumétrico se determina la concentración de una solución cuya concentración se desconoce, midiendo el volumen que se requiere de ella para reaccionar con un volumen fijo de una solución cuya concentración es perfectamente conocida. El proceso de adición de un volumen medido de la solución de concentración conocida para que reaccione con el soluto contenido en un volumen fijo de la solución de concentración desconocida se conoce como “Valoración Volumétrica”. La solución de concentración conocida se conoce como Solución Patrón y la de concentración desconocida como Solución Problema. El punto en el cual la cantidad del soluto contenido en un volumen fijo de Solución Patrón, equivale químicamente a la cantidad de soluto contenido en un volumen fijo de la Solución Problema, se conoce como Punto de Equivalencia o

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Punto Estequiométrico. Las valoraciones volumétricas se realizan en montajes como el indicado en la figura y los puntos de equivalencia se determinan mediante el uso de indicadores. El reactivo que se adiciona desde la bureta se conoce como “Agente Titulante” y la substancia que reacciona con él y que se halla presente en la solución problema se conoce como “Agente Titulado”. De esta forma, un “Indicador” es una substancia que reacciona con el agente titulante pero cuya constante deformación es menor que la correspondiente al producto de la reacción entre el agente titulante y el agente titulado. Como ya se dijo antes, en el punto final de una valoración volumétrica la cantidad del agente titulado debe ser igual a la cantidad del agente titulante o lo que es lo mismo, en el punto final de una valoración, las concentraciones de los solutos reaccionantes deben ser equivalentes. Por tal razón: Hecho este que se resume generalmente mediante la ecuación, V1 x C1 = V2 x C2. Y puesto que la concentración puede expresarse en términos de Molaridad o Normalidad, entonces se particulariza a V1 x M1 = V2 x M2 o V1 x N1 = V2 x N2. 4.11. Diluciones Considérese el caso de una muestra de agua de mar a la que se le desea medir su concentración de cloruro, calcio y magnesio. Ya que la concentración de estos iones en el agua de mar es demasiado alta como para poder realizar la medición directamente, normalmente se procede a diluir la muestra, antes de realizar la medición propiamente dicha. Supóngase entonces que se toman 25 mL de la muestra original en un matraz aforado, y se diluyen a 250 mL con agua destilada, (Solución A). Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora 10 mL de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua destilada hasta 250 mL, (Solución B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en ella las concentraciones para calcio, magnesio y cloruro son respectivamente 15, 45 y 85 ppm, ¿cuál será entonces la concentración de estos elementos en la muestra original? Si se toman 10 mL de la solución A y se diluyen a un volumen de 250 mL con agua destilada, todas las substancias que se hallaban disueltas en A, estarán ahora en la solución B, 25 veces más diluidas. En general, en las operaciones de dilución, el volumen final al cual se lleva una dilución, dividido por el tamaño de la alícuota, se conoce como el “Factor de Dilución”. El factor de dilución es entonces, el número por el cual se debe multiplicar la concentración de un soluto en una Dilución, para reproducir la concentración de la muestra original. Así, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución A, será igual a 250 mL / 25 mL = 10. A su vez, el factor de dilución para pasar de la Solución A a la Solución B, sería igual a 250 mL / 10 mL = 25. Por lo tanto, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución B, será

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igual a 10 X 25 = 250. Esto significa que la concentración en la muestra original es 250 veces mayor que la concentración en la solución B, donde se realizaron las mediciones. Si bien las diluciones de las soluciones son operaciones muy comunes en los laboratorios, en algunas ocasiones se hace necesario realizar el proceso inverso, es decir las concentraciones. Así, por ejemplo, el análisis de una muestra de agua lluvia exige concentrar la muestra, por cuanto las concentraciones de las substancias de interés son tan bajas que escapan de los métodos convencionales de análisis. El procedimiento para realizar los cálculos es similar pero contrario al de las diluciones. 4.12. Mezclas de Soluciones Otra de las operaciones frecuentes en un laboratorio es la determinación de la concentración de una solución que ha sido preparada por mezcla de diferentes volúmenes de diversas soluciones. Considérese por ejemplo que se desea conocer la concentración de azúcar y cloruro de sodio de un coctel que ha sido preparado por combinación de 100 mL de gaseosa, 200 mL de cerveza y 700 mL de agua, sabiendo que la gaseosa contiene 2 g/L de cloruro de sodio y 10 g/L azúcar, (C6H12O6), mientras que la cerveza contiene 1 gramo de cloruro de sodio por litro y 2 g/L de azúcar. La concentración de una mezcla de soluciones se puede calcular fácilmente a partir de las cantidades de soluto contenidas en cada una de las alícuotas, sumándolas y refiriéndolas al volumen total de la mezcla o nueva solución, es decir, a la suma de los volúmenes de cada una de las soluciones que componen la mezcla. Como puede verse, resulta muy práctico realizar este tipo de tablas para calcular la concentración de una mezcla de soluciones. Es evidente entonces que la composición de la mezcla será, de 1,4 g/L en azúcar y 0,4 g/L en cloruro de sodio. 4.13. Pruebas (test) diagnósticas Como personal de salud no tardamos en reconocer que nuestras pruebas y procedimientos no son perfectos y tratamos de hacer lo posible para que nos brinden la máxima probabilidad de identificar quienes son sanos y quienes son enfermos. Las pruebas de diagnóstico nos permiten interrelacionar la probabilidad de cuatro resultados posibles, dos correctos y dos incorrectos. 4.14. Pruebas discriminatorias Son aquellas cuyo objetivo es la detección temprana en el curso de la enfermedad posibilitando el tratamiento más eficaz y una mejor sobrevida de un determinado paciente. Reglas para la selección de las pruebas: que la morbilidad y la mortalidad sea de tal importancia que justifique el esfuerzo, conocer que la intervención temprana reduce su repercusión, que sean dirigidas a la población de alto riesgo, que sean de la máxima sensibilidad y especificidad, que no

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impliquen riesgos o ellos sean mínimos, que los estudios posteriores sean aceptables, que exista y sea posible un tratamiento eficaz o un resultado de laboratorio de alta eficacia 4.15. Relación entre sensibilidad y especificidad Existe una relación que debemos conocer entre la sensibilidad y especificidad. Solo muy pocas pruebas nos brindan al mismo tiempo altos valores de sensibilidad y especificidad, el hecho habitual es que la sensibilidad y la especificidad se modifiquen en relación inversa. Esto es más evidente cuando la probabilidad de enfermedad depende del nivel de variables fisiológicas y del punto de corte es decir aquel que se toma en consideración para que la prueba cambie de negativa a positiva. Tenemos que elegir aquellas pruebas que nos brinden la mínima posibilidad de falsos positivos y falsos negativos, ellas se expresan dos maneras, como la razón de máxima verosimilitud (RMV) o como las curvas de características operador receptor (ROC). La RMV nos ofrece dos posibilidades: RMV Positiva = sensibilidad /1-especificidad. (Se aceptan valores elevados como confiables). RMV Negativa= 1-sensibilidad /especificidad. (Se aceptan valores menores como confiables) Existe un listado de RVM de las pruebas clínicas. Las curvas ROC: para construir una curva ROC se traza un sistema de coordenadas cartesianas, en la ordenada la sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) y en la abscisa 1- especificidad (tasa de falsos positivos). Se representa así gráficamente el valor diagnóstico de las pruebas. Fijamos un punto en una variable y decidimos que a partir del mismo existe una determinada patología, ese punto denominado de corte y se lo puede obtener a través de estudios descriptivos o prospectivos. Una prueba perfecta seria aquella que se eleva verticalmente hacia el ángulo superior izquierdo y la que tiene un trayecto diagonal es considerada como inútil. Es un método valioso para comparar pruebas alternativas de un mismo diagnóstico, a mayor área bajo la curva podemos decir que mejor es la prueba. Se debe tener siempre en cuenta las diferencias que establecidas en los pacientes en los cuales se aplican las pruebas, ya que no todos están en las mismas etapas evolutivas de la enfermedad y las diferencias individuales. ¿Qué pruebas usar?

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Para una determinada enfermedad que tipo de prueba debemos usar? pruebas de alta especificidad o alta sensibilidad? ¿Qué nos permiten las pruebas sensibles y qué las especificas? Preferir determinadas características de las pruebas tienen que ver con los propósitos que cada uno considere como los más adecuados, si se pretende "detectar" enfermedad se utilizaran pruebas de alta sensibilidad, de bajo costo, rápidas incruentas y baratas, si se quiere confirmar enfermedad usaremos pruebas de alta especificidad y sensibilidad. La seriedad del pronóstico necesita pruebas de alta especificidad, es decir aquellas que tengan muy pocos falsos positivos, esto se hace más notorio cuando un falso positivo puede traer importantes perjuicios a los pacientes. Las enfermedades de gravedad implícita que puedan ser tratadas exitosamente, aun cuando sean de baja prevalencia deberán recibir nuestra máxima de atención.

En este contexto se utilizan dos índices para evaluar la calidad de la prueba diagnóstica: 1. Sensibilidad, es la proporción de verdaderos positivos identificados por la prueba del total de enfermos. 2. Especificidad, es la proporción de verdaderos negativos identificados por la prueba del total de sanos. Aunque éstos son dos índices de calidad de la prueba, en la práctica clínica las preguntas a las que interesa responder son: si un sujeto ha resultado positivo, ¿cuál es la probabilidad de que esté verdaderamente enfermo? P(E+/T+), o por el contrario, si el sujeto resultó negativo en la prueba ¿cuál es la probabilidad de que realmente esté sano? P(E-/T-). Estas dos probabilidades se pueden calcular aplicando el teorema de Bayes, siempre que sepamos la probabilidad de que el sujeto esté enfermo antes de realizar la prueba, que se conoce como probabilidad pre-prueba. Si no tenemos ninguna información adicional sobre el sujeto, dicha probabilidad será la prevalencia de la patología en la población, aplicable sólo en el caso de programas de cribado o "screening" sobre la

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población general, ya que en la práctica habitual los sujetos candidatos a una prueba diagnóstica lo son por las sospechas deducidas de la anamnesis o por una sintomatología previa, y por tanto la probabilidad de que padezcan la enfermedad bajo sospecha será superior a la prevalencia de ésta en la población general. Si llamamos P a la probabilidad pre-prueba de padecer la enfermedad, S a la sensibilidad de la prueba y E a su especificidad, tenemos las siguientes fórmulas para calcular la probabilidad postprueba de que el sujeto esté enfermo cuando resultó positivo o de que esté sano cuando resultó negativo:

Donde la probabilidad condicional la hemos representado de la forma habitual con el símbolo /. Así Pr(E+/T+) significa suceso E+ (enfermo) condicionado a que haya ocurrido el suceso T+ (resultado + en la prueba). Si calculamos estas probabilidades únicamente con los datos de nuestra tabla, la primera de ellas P(E+/T+) corresponde a la proporción de sujetos que verdaderamente tienen la enfermedad, de entre los que dieron positivo, y se conoce como valor predictivo positivo VP+ Igualmente podemos calcular en la tabla la proporción de sujetos verdaderamente sanos sobre el total de los que dieron negativo, valor predictivo negativo VP5. CUESTIONARIO: Determinar: 1.- Sensibilidad, 2.-Especificidad, 3.- Valor predictivo, positivo 4.- Valor predictivo -negativo, y 5.Eficiencia aparente de una técnica, en una población de 4500 animales de experimentación donde de acuerdo con la técnica de referencia (100% fiabilidad), donde de los 2500 verdaderos enfermos han sido detectados como positivos 1750 y el resto como sanos, y de los 2000 verdaderos sanos 1800 han sido detectados como tales y el resto como enfermos. 6.- ¿Que indicadores estadísticos se podrían utilizar para evaluar datos apareados? 7.- Defina las formulas de molaridad, molalidad, normalidad, densidad, concentración peso.

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8. Considérese el caso de una muestra de agua rica en iones a la que se le desea medir su concentración de Aluminio, Hierro y Cloro. Ya que se tiene antecedentes de que la concentración de estos iones en la muestra es muy alta como para realizar la medición directamente, debemos diluir la muestra, antes de realizar la medición propiamente dicha. Supóngase entonces que se toman 25 ml de la muestra original en un matraz aforado y se diluyen a 250 mL con agua destilada, (Solución A). Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora 10 mL de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua destilada a 250 mL, (Solución B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en ella las concentraciones para aluminio, hierro y cloro son respectivamente 15, 45 y 85 ppm, ¿Cuál será entonces la concentración de estos elementos en la muestra original? Usted ha estandarizado una prueba de ELISA, está trabajando con 96 micropozos y estos deben ser lavados con 250 uL del Tampón de lavados, 9. ¿Qué cantidad de tampón necesitaría para realizar 6 lavados a cada uno de los pocillos?. Al volumen final obtenido añada otros 6 ml de tampón para que este, esté en exceso. 10. Usted estandarizó su prueba de ELISA tiene alícuotas del tampón de lavados diluidas a un título (1/100), pero para realizar sus lavados usted necesita que este a un (1/320). ¿Qué volumen de la dilución (1/100) debe tomar para preparar en volumen final “X” que halló en la pregunta 9) y que este tenga a su vez una dilución final de (1/320). 11. Prepare un litro una solución de PBS que contenga: (137 mM de NaCl; 2 mM de KCl; 10 mM de Na2HPO4; 10 mM de KH2PO4) 12. El azul de Evans al 0,4% es el colorante de contraste para las pruebas de IFI. Prepare 200 ml de esta solución (diluyente =PBS) 13. Para determinar anticuerpos anti-mitocondriales por ELISA se requiere hacer la dilución de la muestra 1:21 para un volumen de 200 uL, que volumen de muestra utilizaría?. 14. Para determinar anticuerpos anti-nucleares por inmunofluorescencia indirecta se requiere hacer diluciones seriadas de la muestra problema 1:40, 1:80 y 1:160, realice estas diluciones para un volumen final de 300 uL por tubo.

15. Para determinar anticuerpos anti-papiloma virus se requiere utilizar el conjugado fluorescente (IgG anti humana-FITC) a titulo final 1/120 (solución de trabajo). A partir de una solución stock 1/10, preparar el volumen necesario de la solución de trabajo para 30 uL por pozo en una placa de 10 pozos.

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PRÁCTICA 3 AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR 1. FUNDAMENTO TEORICO Se han descrito diferentes métodos para separar leucocitos de eritrocitos entre ellos los métodos basados en gradiente de densidad, reseteo, lana de nylon, selección positiva, selección negativa entre otros. La separación de linfocitos de sangre periférica por centrifugación diferencial en un gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque, es una técnica rápida con una pureza superior al 90% y una viabilidad de prácticamente el 100% (95 – 100%). Las células obtenidas por este método se denominan PBMC (peripheral blood mononuclear cells) esta técnica fue descrita inicialmente por Boyum, también se usa para aislar linfocitos de otros fluidos de tejidos disociados. Cuando se aíslan células mononucleares de sangre periférica es conveniente hacerlo a partir de la interfase plasma-paquete globular (buffy-coat) permite enriquecer los leucocitos de la sangre de 8 a 10 veces. Con esta técnica también pueden recuperarse los polimorfonucleares (PMN) que se obtienen sobre la fracción de eritrocitos. Para ello deben lisarse los eritrocitos con cloruro de amonio. Los PMN (1,085 – 1,090 g/dl) obtenidos deben ser resuspendidos y lavados en el medio deseado (RPMI-SFB 10%). La sangre de algunos individuos puede tener características especiales, por ejemplo en pacientes con artritis reumatoide u otras enfermedades inflamatorias, se observa plaquetas y monocitos que tienden a agregarse. También, a veces, los eritrocitos pueden contaminar las capas de células mononucleares, por cambios en la densidad de eritrocitos, (cambio del potencial Z de la membrana) induciendo a la formación uniones de células formando una red que atrapa los leucocitos. En estos casos es necesario depletar los eritrocitos (con dextrán al 5%) para permitir un plasma rico en leucocitos. Los linfocitos son, junto con los monocitos, las células de menor densidad (< 1,077 g/dl), por ello utilizando gradiente de densidad se los puede separar y aislar. En la mayoría de las técnicas de inmunología celular se aíslan linfocitos de bazo, macrófagos del peritoneo, el humanos la mayor fuente para obtener linfocitos y monocitos es la sangre periférica a través de la punción venosa. Los monocitos pueden ser aislados o enriquecidos a partir de sangre periférica y de otros fluidos mediante centrifugación diferencial a baja fuerza gravitatoria, obteniendo como resultado eritrocitos y polimorfonucleares en el pellet y en el sobrenadante los linfocitos, monocitos y plaquetas. Posteriormente para separar los monocitos de linfocitos, se incuban en una caja Petri o una caja de cultivo celular por 1 a 2 horas a 37°C y 5% CO2. Los monocitos se adhieren en la placa y forman una monocapa que luego será separada por tripsinización o verseneización. En este sistema los linfocitos pueden ser obtenidos antes de la tripzinización puesto que ellos representan las células no adherentes. Otra técnica no muy utilizada para la separación de monocitos de linfocitos es la capacidad fagocítica de los monocitos, por lo que se incuban las células sanguíneas

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con hierro coloidal y posteriormente se acerca el tubo a un imán (es método de separación es similar al descrito para las perlas magnéticas y selección positiva). Muchos experimentos requieren que previamente se valore la viabilidad de las células a utilizar, con el fin de corregir los valores obtenidos en un simple recuento de células. La membrana plasmática de las células vivas no permite el paso de sustancias que no sean electrolitos, mientras que las células que no mantienen la integridad de su membrana las dejan pasar y se colorean. Este fenómeno se utiliza para distinguir células vivas de células muertas. Existen muchos marcadores que se pueden utilizar, por ejemplo el azul de tripán PM 960 KDa, la nigrosina o la eosina, etc. 2. OBJETIVOS: Al finalizar la práctica, el alumno debe ser capaz de: formar un gradiente de densidad, aislar linfocitos y distinguir las células vivas de las muertas 3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS -

Sangre heparinizada Azul de tripan Micropipetas Cámara de Neubauer PBS celular

- Ficoll - Hypaque - RPMI 1640 (opcional) - Tubos Falcon de 15 mL - Pipetas Pasteur

4. PROCEDIMIENTO 4.1. AISLAMIENTO DE CELULAS MONONUCLEARES TOTALES. 1.- Tomar10 mL de sangre en un tubo que contenga como anticuoagulante heparina sódica (1000 U/mL). 2.- Centrifugar a 1100 r.p.m. por 10 min. 3.- Tomar 2 a 3 ml de la interfase plasma/paquete globular y pasar a otro tubo colector, luego agregar 3 volúmenes de Buffer PBS celular y mezclar bien. 4.- La sangre diluida se deberá pasar a un tubo cónico de plástico de 15 ml (tubo Falcon) que contenga 3 ml de Ficoll-Hypaque (densidad 1.077) o LSM (comercial). 5.- Centrifugar a 1500 r.p.m. por 20 minutos. (Desactivar el freno de La centrifugadora) 6.- Después de la centrifugación se toma con una pipeta Pasteur la interfase en la que se encuentran los leucocitos mononucleares (2 a 3 mL) y se lo transfiere a otro tubo plástico cónico de 15 ml. Y se le agrega de 4 a 5 volúmenes de PBS celular. 7.- Centrifugar las células obtenidas a 1100 r.p.m. por 10 min., luego, desechar el sobrenadante. 8.- Se resuspende el botón celular que contiene a los linfocitos en 10 ml de PBS celular y se procede como en el paso 7. Se repite el lavado una vez más. 9.-Las células obtenidas se pasan a un tubo Eppendor de 1,5 ml y se resuspende en 1 mL de RPMI 1640 o PBS celular, para hacer un ajuste de concentración celular.

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4.2. AJUSTE DE CONCENTRACION CELULAR 1.- Se resuspenden suavemente las células con ayuda de una pipeta Pasteur o por agitación suave. En otro tubo se hace una dilución volumen/volumen de las células diluidas y el colorante vital azul tripán (azul tripán al 0,4% en PBS), para finalmente cargar en una cámara de Neubauer y hacer el recuento de las células mononucleares y se determina el porcentaje de viabilidad 2.- Se hace el recuento en los retículos empleados para glóbulos rojos tomando en cuenta los factores de dilución. 3.- Con la concentración inicial de células se debe realizar el ajuste celular utilizando la siguiente fórmula: Vf = (Vi * Ci)/Cf Cf (concentración final). Vi (volumen inicial)

Ci (concentración inicial) Vf (volumen final)

Ejemplo, a partir de los siguientes datos practique el ajuste celular: a) Usted ha obtenido una concentración celular de 3,2 x 106 células/ml en un volumen total de 500 l. La concentración ideal para que usted realice su trabajo es de 2,5x106 células/ml. b) Usted ha obtenido una concentración celular de 1,7 x 106 células/ml en un volumen total de 2200 l. La concentración ideal para que usted realice su trabajo es de 2,5x106 células/ml. 5. CUESTIONARIO 1.- ¿Explique en qué consiste el aislamiento de células por selección positiva y selección negativa con perlas inmunomagnéticas? 2.- ¿Por qué los linfocitos B y no así los linfocitos T se quedan adheridos a la lana de nylon cuando se separan estos tipos celulares por el método de aislamiento celular por columna de lana de nylon? 3.- ¿En qué consiste el aislamiento celular por el método de Percoll, a que densidades usted separaría linfocitos T, monocitos, neutrófilos, eosinófilos? 4.- ¿Qué CD’s característicos de los linfocitos T y linfocitos B recomendaría usted marcar con anticuerpo monoclonal para aislar por separado estos dos tipos celulares? 5.- ¿Qué aplicaciones podría tener el aislamiento de un determinado tipo celular en el campo del diagnóstico clínico y en el campo de la investigación? 6.- Mediante cálculos demuestre por qué cuando usted realizó el ajuste de concentración celular tuvo de multiplicar por el factor 105 7.- ¿Qué tipo de sustancias son el Percoll y el Ficoll?