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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA LABORATORIO DE FISIOLOGIA ANIMAL PRACTICA II. TECNICAS PARASITOLOGICAS

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4. TECNICAS PARASITOLOGICAS EN VETERINARIA 4.1 INTRODUCCION El diagnóstico de enfermedades parasitarias es fundamental para detectar las parasitosis dentro de las explotaciones ya que la mayoría de ellas pasan desapercibidas para el productor y veterinarios, pero para lograr un buen diagnóstico es indispensable la adecuada recolección y conservación de las muestras así como las técnicas a utilizar en nuestro estudio. Existe una variedad de técnicas que se utilizan según el agente parasitario que se desea buscar, por lo que se deben conocer las ventajas y desventajas de cada una para solicitarlas e interpretarlas en forma adecuada. Las técnicas directas se basan en el diagnóstico morfológico de los distintos estadios de los parásitos.

4.2 OBJETIVO: Conocer y aplicar diferentes técnicas coproparasitologicas utilizadas en el diagnóstico de las parasitosis gastrointestinales, identificando distintas formas de protozoos (trofozoíitos , quistes, ooquistes), helmintos (proglótidas, huevos, adultos, larvas).

4.3 REACTIVOS, MATERIALES, EQUIPOS: • • • • • • • • • • • • • • • • •

Heces frescas de diversas especies Vasos de plástico, Tubos para centrífuga Colador de malla fina, Asas calibradas Portaobjetos, Cubreobjetos. Gradillas Servilletas de papel Cronómetro Hisopos, Probeta graduada Pipetas Pasteur Vasos de precipitado 100 ml Pinzas Gasas Tubos de ensayo

•

Instrumento para mezclar (varilla de vidrio, espátula, baja lenguas) • Embudo • Solución de Lugol • Solución salina fisiológica • Fluido de flotación (la solución a escoger dependerá de la especie que se espera esté presente y la disponibilidad de reactivos): Solución saturada de sal Solución saturada de azúcar ( con formol al 40%) • Microscopios • Cámaras de Mc. Master, • Centrífuga. • Estufa

4.4 TECNICAS DE ESTUDIO CUALITATIVAS: Son aquellas que revelan solamente la presencia de elementos parasitarios, se caracterizan por lo rápido de su ejecución y por su sensibilidad. En algunos casos son complementados con estudios cuantitativos. Macroscópicamente pueden observarse en la materia fecal proglótides de cestodos, adultos de nematodos (Ascaridios, Estrongílidos) o larvas de Gasterofílidos en equinos. Este tipo de hallazgos es muy frecuente y la búsqueda debe ser rutinaria. El estudio microscópico directo de pequeñas muestras es útil para detectar protozoarios cuyas formas vegetativas no resisten los métodos de conservación (Giardia, Tritrichomonas, Ameba), o

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deben observarse a partir del moco o secreción. Los Coccidios pueden detectarse por observación de improntas de mucosa o del moco presente en la materia fecal. Para facilitar el diagnóstico es preciso en la mayoría de los casos concentrar los huevos, quistes u ooquistes presentes en la materia fecal, para lo cual se emplean técnicas de: flotación, sedimentación o filtración.

4.4.1 FROTIS DIRECTO FECAL: 4.4.1.1 FUNDAMENTO: Proporciona un método rápido y simple pero relativamente insensible para demostrar una infección por parasitos e identificar los huevos y larvas presentes. Los quistes, huevos y larvas pueden ser identificados en un frotis delgado de heces en un portaobjetos. 4.4.1.2 PROCEDIMIENTO: a) Hacer un frotis con una pequeña cantidad de heces sobre un portaobjetos limpio. b) Mezclar con una gota de solución salina y lugol. c) Colocar un cubreobjetos sobre el frotis. d) El material fecal no deberá estar muy concentrado en el centro del cubreobjetos, más bien deberá estar uniformemente distribuido de tal modo que deje pasar la iluminación del microscopio. Incorrecto! Correcto

e) Examinar el frotis empezando en una esquina moviendo el portaobjetos hasta llegar a la esquina opuesta. f) Hacer el movimiento de reversa traslapando el campo y continuando hasta que el frotis ha sido examinado en su totalidad.

4.4.1.3 LIMITACIONES: • El frotis solo muestra la presencia de quistes, huevos o larvas de helmintos y permite la identificación de especies o grupos presentes. • El método es relativamente insensible y dependiente de que el número de parasitos en la muestra sea alto. • Puede ser difícil observar o identificar los parasitos debido a que pueden estar parcial o completamente cubiertos por los detritos.

4.4.2 TÉCNICAS DE FLOTACIÓN (con solución saturada) 4.4.2.1 FUNDAMENTO: Consiste en dispersar una suspensión de material fecal en solución de mayor densidad que los quistes y huevos de parásitos, la diferencia en la gravedad específica hace que estos se eleven a la superficie. Cuando los huevos permanecen demasiado tiempo en la solución de concentración, pueden deformarse. Esta técnica es recomendada para la identificación de quistes de protozoarios y huevos de helmintos, ya que son capaces de flotar en pesos específicos de 1,000 a 1,200. Los huevos de tremátodos son mucho más pesados, por tanto solo flotarán en líquidos con pesos específicos superiores a los 1,300.

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Es un método útil en estudios preliminares para establecer qué grupos de parásitos están presentes. Los huevos son separados del material fecal y concentrados por un fluido de flotación con una gravedad específica apropiada. 4.4.2.2 PROCEDIMIENTO: a) Colocar con una cuchara 2 g de muestra de heces aproximadamente y colocarla en un vaso de plástico o Beacker. b) Agregar 15 – 20 mL de agua destilada y diluir la muestra. c) Mezclar perfectamente la muestra con una cuchara o espátula. d) Colar la suspensión. e) Agregar parte de la muestra ya colada a un tubo para centrifuga, marcar el nivel del tubo de centrifuga e identificación de la muestra f) Balancear la centrifuga con otro tubo con igual cantidad de agua y centrifugar a 2500 r.p.m. durante 3 minutos, decantar el sobrenadante. g) Llenar a nivel con la solución saturada de azúcar y agitar con una varilla de vidrio. h) Centrifugar nuevamente la muestra a 2500 r.p.m. durante 3- 5 minutos i) Terminada la centrifugación transferir los tubos problema a la gradilla, evitando agitarlos. Dejar reposar. j) Tomar una gota de la superficie con el asa parasitológica y colocarla en la laminilla, agregar una gota de solución de lugol parasitológico, colocando a su vez un cubre objetos. También puede hacerse colocando antes de la centrifugación un cubreobjetos en la parte superior del tubo y después del centrifugado, retirar cuidadosamente el cubreobjetos del tubo de ensayo junto con la gota de fluido adherida a este. Colocar el cubre objetos sobre un portaobjetos limpio. k) Observar al microscopio óptico (10x), anotando las observaciones del preparado. NOTA. En la técnica de concentración por flotación puede cambiar el uso de las soluciones utilizadas: Solución Saturada de Glucosa o Solución Saturada de Cloruro de Sodio y agregarle formol para prevenir la formación de hongos.

4.4.3 TECNICA DE BAERMAN 4.4.3.1 FUNDAMENTO: La técnica de Baermann se basa en la migración activa o movimiento de las larvas. Las heces son suspendidas en agua. Las larvas se mueven hacia el agua. Se hunden hacia el fondo, donde pueden ser colectadas para su identificación. No existe un equipo estándar para esta técnica. Cada laboratorio adapta su propio procedimiento y equipo.

4.4.3.2 PROCEDIMIENTO: a) Tomar un embudo y ajustar un pedazo corto de tubo en el cuello. Cerrar el tubo con el clip. b) Sujetar el embudo a una base sencilla. Si se requiere procesar más de una muestra al mismo tiempo usar una gradilla con agujeros para colocar varios embudos.

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c) Colocar aproximadamente 5-10 ggramos de materia fecal sobre una doble capa de gasa. d) Formar una bolsa conteniendo el material fecal juntando las cuatro esquinas de la gasa y moldeándola alrededor del material fecal. Cerrar con hilo o nailon la bolsa hecha. e) Atar la varilla o barra de metal con el hilo de tal manera que la bolsa pueda ser suspendida. f) Colocar la bolsa que contiene el material fecal en el embudo. Cortar el exceso de gasa. g) Llenar el embudo con agua tibia. Asegurarse de que el material fecal quede sumergido. h) Dejar reposar en el aparato por 24 horas. i) Drenar unos cuantos mililitros de fluido por el cuello del embudo hacia un tubo de ensayo. j) Después dejar sedimentar por lo menos durante 30 minutos o si se dispone de una centrífuga, el fluido puede ser drenado en un tubo de centrífuga y centrifugar a 1000 rpm por 2 minutos. k) Usar una pipeta Pasteur para transferir una gota pequeña de fluido de sedimento a un portaobjetos. Añadir una gota de yodo para fijar la larva y colocar cuidadosamente un cubreobjetos sobre la gota. l) Examinar en un microscopio compuesto con un aumento de 10x. Identificación de larvas: Cualquier nematodo de vida libre se coloreará de café oscuro muy rápidamente mientras que las larvas de especies parásitas se colorearán muy lentamente debido a que la vaina larvaria protege el cuerpo. Los nematodos de vida libre se ven de color marrón oscuro en yodo y pueden ser distinguidos por la presencia de un doble esófago en forma de bulbo (rhabditiforme).

4.5 TECNICAS DE ESTUDIO CUANTITATIVAS: 4.5.1 TÉCNICA DE MC MASTER 4.5.1.1 FUNDAMENTO: Las técnicas cuantitativas permiten determinar la cantidad de huevos u ooquistes que son eliminados con la materia fecal. La sensibilidad depende de la dilución de la materia fecal y del tamaño de las cámaras de conteo utilizadas. El resultado expresa el número de huevos u ooquistes por gramo de heces, HPG u OPG respectivamente. Se emplea la cámara de Mc Master (modificada por Roberts y O' Sullivan) que consta de 4 celdas de 1 x 2 cm de lado y 2,5 mm de espesor. Cada celda tiene 0,5 ml y el conjunto 2 ml. La cara inferior de la tapa que cubre la cámara está dividida en franjas, cuyo ancho es abarcado por el campo de un microscopio común cuando se enfoca con el objetivo de 10X.

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4.5.1.2 PROCEDIMIENTO: a) Colocar, en un envase de tapa hermética, 3 g de materia fecal y 60 ml de solución saturada de NaCl 8 (o cualquier fluido de flotación). b) Mezclar o agitar para disolver las heces. c) Colar recogiendo la suspensión en otro envase. d) Dejar reposar sólo unos segundos para que floten las burbujas mayores. e) Tomar rápidamente una muestra con pipeta. f) Cargar las celdas de la cámara. g) Esperar 3 minutos para que los huevos asciendan hasta la tapa de la cámara, y queden todos en el mismo plano de foco. Es importante dejar reposar la cámara para permitir que los huevos floten hacia la superficie y que los detritos se vayan al fondo de la cámara. h) Observar al microscopio con objetivo 10X. i) Contar el número de huevos dentro de la rejilla de cada cámara, ignorando aquellos fuera de los cuadros.

Cálculo del HPG: 60 ml de solución......3 g de heces 2 ml de solución.........2x3/60 = 0,1 g de heces El número de huevos contados en 2 ml corresponden a 0,1 g de heces, por lo tanto en un gramo habrá 10 veces más. El índice por el que se debe multiplicar el número de huevos totales es 10. En la materia fecal de ovinos normalmente se encuentra mayor cantidad de huevos en un volumen menor de heces, entonces debe usarse una dilución de 1 g en 50 ml de solución de NaCl. La misma relación de dilución puede aplicarse en equinos, porque los recuentos generalmente son elevados. En el cálculo de ooquistes, suelen usarse diluciones aún mayores. Nota: La eliminación de huevos a partir de la reinfección y luego de un tratamiento precisa que transcurra el período prepatente, que es diferente entre especies. La presencia de huevos antes de ese tiempo tendrá que ver con fallas en la desparasitación, desinhibición de larvas o resistencia a las drogas. Por otra parte, cuando se usan productos con acción prolongada, al período de

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protección conferido debe agregarse el lapso de prepatencia para volver a detectar huevos en las heces. 4.5.1.3 INTERPRETACIÓN DEL HPG El valor del HPG puede estar influido por diferentes factores: Cuando se interpretan los resultados de McMaster, se debe recordar que una variedad de factores puede influir en la ocurrencia, reconocimiento y número de huevos de helmintos hallados en una muestra fecal. En particular, el número de huevos no es necesariamente indicativo del número de gusanos presentes. Las razones para esto incluyen: o Los huevo son producidos solamente por gusanos hembras, adultas, fértiles (o hermafroditas) y por tanto, podrán estar ausentes en infecciones con parásitos inmaduros a de un solo sexo o La producción diaria de huevos por hembras fértiles está influenciada por factores fisiológicos del hospedero tales como estrés o lactación (incremento) o inmunidad (decremento) o La quimioterapia también puede afectar la producción de huevos e.g. corticosteroides (incremento) o dosis sub-letales de antihelmínticos (decremento) o Algunos alimentos y piensos pueden tener un efecto similar e.g. forrajes ricos en taninos (decremento) o La concentración de huevos (por gramo de heces) está influenciada por el volumen diario de heces producido por el hospedero, la tasa de pasaje de la ingesta a través del intestino, y la distribución de los huevos en la masa fecal o Algunos tipos de huevos son más pesados que otros y podrían no flotar bien en soluciones de baja gravedad específica (e.g. Fasciola) o Algunos huevos de diferentes especies son indistinguibles (particularmente trichostrongílidos y strongílidos). Esto complica la interpretación clínica debido a que algunas especies (e.g. Haemonchus) producen muchos más huevos por día que otras (e.g. Ostertagia).

BIBLIOGRAFIA Vignau, et al. Parasitología Práctica y Modelos de Enfermedades Parasitarias en los animales domésticos. Argentina. 2005.