• Author / Uploaded
• Andres Delgado Torres

Citation preview

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN AREQUIPA FACULTAD DE INGENIERIA CIVIL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA SANITARIA

CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS Docente: Dr. Frey Francisco Romero Vargas Estudiante: Delgado Torres, Andres Marcelo Semestre: III AREQUIPA – PERÚ 2020

Practica N°4 y 5 Objetivo:   

Identificar las propiedades de las proteínas que intervienen en la alteración de la estructura terciaria de las proteínas. Comprenderá el efecto de la desnaturalización de la proteína soluble y la pérdida de esa solubilidad. Identificará los agentes externos que provocan la desnaturalización de una proteína en relación a algunas propiedades químicas de las mismas.

Introducción: Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y combinaciones que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el número posible de proteínas es realmente muy grande. Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de energía, etc. Muchas proteínas son lábiles y fácilmente modificables por una serie de agentes: variaciones del pH, radiaciones ultravioleta, calentamiento en solución acuosa, solventes orgánicos, etc., que determinan cambios dentro de su molécula (alteraciones de la disposición de las cadenas peptídicas) y modificaciones en sus propiedades, constituyendo la llamada “desnaturalización”. Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de proteínas para su caracterización y cuantificación posterior. 1. PRECIPITACION DE PROTEINAS Un precipitado es el sólido que se produce en una disolución por efecto de difusión o de una reacción química o bioquímica. A este proceso se le llama precipitación. Dicha reacción puede ocurrir cuando una sustancia insoluble se forma en la disolución debido a una reacción química o a que la disolución ha sido sobresaturada por algún compuesto, esto es, que no acepta más soluto y que al no poder ser disuelto, dicho soluto forma el precipitado. 1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son menos solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas ajustando el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína. 1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las proteínas. Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacción proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.

1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos, como etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así disminuyen la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de otro modo puede ocurrir desnaturalización. 1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico, pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación probablemente se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre. Este tipo de precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que se le lleva a la proteína. 1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio, plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos iones algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar sulfuros. 2. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace peptídico causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la desnaturalización disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace disulfuro, agitación, radiación y urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades para cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible. Algunas veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la urea, a proteína nativa es restaurada.

Metodología: Experimental – Visual.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO N°1.DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE LA CASEINA. FUNDAMENTO El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga neta de todos los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual a cero. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de los electrolitos presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos; pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa es mínimo o nulo. Como las cargas del mismo signo se rechazan, en estas condiciones algunas moléculas pueden formar agregados en lugar de rechazarse. Pero a ambos lados del punto isoeléctrico, todas las moléculas tienen una carga neta positiva o negativa; estas moléculas se rechazan, y es mínima la tendencia a la agregación y precipitación. Por tanto, en general, el pH coincide con la solubilidad mínima de las proteínas. Los solventes orgánicos como el etanol, también causan precipitación de proteínas de un proceso que puede ser atribuido generalmente a la acción deshidratante. Cada proteína tiene un determinado punto isoeléctrico (Tabla 1) que puede ser determinado aprovechando algunas propiedades de las proteínas que están comprometidas, utilizando por lo general efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas. Algunas proteínas, como la caseína de la leche son fácilmente precipitables, ajustando el pH de la solución a su pI, por lo cual este procedimiento se describe como “precipitación isoeléctrica” Tabla 1. proteínas

Punto

Isoeléctrico

PROTEÍNA Ovoalbúmina Tiroglobulina Caseína Gelatina Seroalbúmi na (humana ) Fibrinógeno Seroglobulinas Homoglobuli na (caballo) Mioglobina

de

pI 4.6 4.6 4.7 4.7 4.8

5.5 6.4 – 7.2 6.9 7.0

algunas

(caballo)

MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N Ácido acético 1 N Ácido acético 0.1 N Ácido acético 0.01 N NaOH al 10% METODO DE TRABAJO Preparar el siguiente sistema de tubos: Tubo Nº Agua destilada

1 8.3 8

2 7.1 5

3 8. 75

Ac. Acético 0.01 N

0.6 2

1.7 5

-

Ac. Acético 0.1 N

-

-

0. 25

Ac. Acético 1.0 N

-

-

-

1. 0

1. 0

1. 0

Caseína 1%

4 8 . 5 -

5 8 . 0 -

6 7 . 0 -

7 5 . 0 -

8 1 . 0 -

9 7 . 4 -

0 . 5 -

1 . 0 -

2 . 0

4 . 0

8 . 0

-

1 . 0

1 . 0

1 . 0

1 . 0

1 . 6 1 . 0

1 . 0

DATOS EXPERIMENTALES Agitar los tubos antes y después de agregar la solución de caseína. Haga el cálculo del pH teórico para cada uno de los tubos. Anote los resultados, marcando la falta de turbidez con 0, los grados de la misma con signos + (emplee hasta ++++ con la máxima turbidez), según corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos y 20 minutos, anote los cambios. Seguidamente calentar los tubos en baño maría a 37 °C y anote sus apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe los cambios.

Tubo Nº

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH teórico Turbidez inmediata Turbidez a los 10 min Turbidez a los 20 min Turbidez y precipitado después de calentar NaOH 0.1 N

9.7 -

9.9 -

5.8 + ++ ++

4.85 ++ +++ +++

4.76 ++++ ++++ ++++

4.7 ++ +++ ++++

4.2 +++ +++ ++++

3.75 ++ ++ +++

-

-

+

++++

+++







-

-

-

-

precip

precip

precip

precip

precip

-

3.4 -

itado

itado

itado

itado

itado

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN:

 Tubo N°1 Su concentración de H+: 109.7= 5011872336 log=9.7  Tubo N°2 Su concentración de H+: 109.9= 794328347 log=9.9  Tubo N°3 Su concentración de H+: 105.8=630957.344 log= 5.8  Tubo N°4 Su concentración de H+: 104.85=70794.578 log= 4.85  Tubo N°5 Su concentración de H+: 109.5=3162277660 log= 4.76  Tubo N°6 Su concentración de H+: 104.7= 50118.723 log= 4.7  Tubo N°7 Su concentración de H+: 104.2= 15848.932 log= 4.2  Tubo N°8 Su concentración de H+: 103.75= 5623.413 log= 3.75  Tubo N°9 Su concentración de H+: 103.4= 2511.886 log= 3.4 Conclusiones: Pudimos comprobar que lo tubo 6 fue el único que alcanzó su punto isoelectronico por que existe una concentración de iones de hidrogeno o un pH en el cual, la proteína no tiene ninguna carga eléctrica y como no hay carga entonces esta no interactúa con el medio y se vuelve insoluble. También pudimos darnos cuenta que el punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. A diferencia y esta de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor.

EXPERIMENTO N° 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS FUNDAMENTO

Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se altera se dice que la proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a la ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo que hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula, ocurriendo la precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos solubles. Esta solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de albúmina de huevo al 1% Ácido acético Ácido clorhídrico Nitrato de plata Nitrato de potasio METODO DE TRABAJO a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH: En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado, al tubo 2 agregue 10 gotas de ácido acético glacial y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tu bo 1 Albúmina + HCl 2 Albúmina + CH3COOH 3 Albúmina + Agua destilada

Observaci ón Turbio

Prueba de Biuret Morado claro

Turbio

Morado

Turbio ligero

Azul

b) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados: En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata, al tubo 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo.

DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tu bo 1 Albúmina + Nitrato de plata

Observación Transparente

2 Albúmina + Nitrato de potasio 3 Albúmina + Agua destilada

Prueba de Biuret Morado

Turbio

Morado

Turbio ligero

Azul claro

c) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura: En un tubo de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina. Lleve el tubo al calor (llama de mechero). Luego realice la prueba de Biuret. DATOS EXPERIMENTALES Anote sus observaciones. Tubo 1 Albúmina + Calor

Observaci ón Turbio ligero

Prueba de Biuret Violeta

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN:

 Cuando obtenemos un precipitado hay un cambio de estado físico en la proteína, cuando coagula hay un cambio irreversible de la estructura química de la proteína.

 La desnaturalización de proteínas se da por cambios bruscos del medio donde esta se encuentra. Los factores tales como temperatura, pH, sales, ácidos minerales fuertes y metales pesados afectan las interacciones de la estructura terciaria de la proteína de manera reversible o irreversible disminuyendo así la solubilidad de la misma.

EXPERIMENTO N° 3. PRECIPITACION POR SALES DE METALES PESADOS E IONES NEGATIVOS. FUNDAMENTO Las proteínas pueden ser precipitadas de una solución con varios iones positivos o negativos. Los iones positivos comúnmente usados son aquellos de metales pesados, tales como el zinc, cadmio, mercurio, fierro, cobre y plomo. Estos iones precipitan las proteínas de soluciones alcalinas, porque a este pH la proteína está disociada como proteína (anión), la cual se combina con los iones metálicos positivos para dar un precipitado insoluble de proteinato de metal. Estos iones metálicos pueden ser removidos del proteinato de metal por acidificación, lo cual convierte a la proteína negativa en proteína positiva. Los iones negativos (aniones) más usados son el tungstato, fosfotungstato, tricloroacetato, picrato, tanato, ferrocianato y sulfosalicilato. Estos precipitan proteínas de soluciones ácidas, es decir, cuando la proteína está carada positivamente (catión), formando sales de proteínas. Muchas de estas sales son insolubles y son la base de los métodos de desproteinización. MATERIAL Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Solución de caseína al 1% Solución de ovoalbúmina al 1% Cloruro de mercurio al 5% Acetato de plomo al 10% Ácido acético al 5% Ferrocianuro de potasio al 10% Ac. Tricloroacético al 10%

METODO DE TRABAJO Preparar el siguiente sistema de tubos: TUBO N°

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Caseína 0.5%

2 . 0 -

2 . 0 -

2 . 0 -

2 . 0 -

2 . 0 -

-

-

-

-

1 0 -

0 . 5 -

-

-

-

-

2 . 0 -

2 . 0 -

2 . 0 -

2 . 0 -

0 . 5

-

-

-

2 . 0 0 . 5 -

-

-

-

-

-

-

0 . 5 -

-

-

0 . 5 -

-

-

-

0 . 5 -

-

0 . 5

-

-

-

0 . 5 -

Ovoalmúmina 1% Cloruro de mercurio 5% Acetato de plomo 10% Ac. Acético 5%

-

-

Ferrocianuro de potasio 10%

-

-

0 . 5 -

Ac. Tricloroacético 10%

-

-

-

0 . 5

DATOS EXPERIMENTALES Anote los resultados en la tabla. Luego a los tubo 3, 4, 7 y 9 agregue NaOH 10% gota a gota y observe los resultados. Caseína Cloruro de mercurio Acetato de plomo Ferrocianuro de potasio Ac. Acético Ac. Tricloroacético

Precipitación Precipitación Precipitación Precipitación Precipitación

Ovoalmúmina Precipitación Precipitación Precipitación Precipitación Precipitación

NaOH Sal Sal Sal Turbio Turbio

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN:

Las proteínas pueden precipitarse de soluciones por diversos iones positivos o negativos. Los iones positivos de uso más común para precipitar proteínas son los metales pesados. Estos iones precipitan proteínas de soluciones a pH superior al isoeléctrico de cada proteína, porque a este pH la proteína está disociada como proteína negativa que se combina con el ion metálico positivo para dar un precipitado insoluble de proteínato del metal. Lo que sucede en este caso es que el metal pesado (en este caso y como resultado + fue Plomo), formo interacciones químicas con las partes apolares de la molécula protéica, formando ahora sales de metal pesado, las cuales precipitarán. El pH del medio afecta la solubilidad de las proteínas, pues cuando es igual al punto isoeléctrico de la proteína, ésta pierde su carga eléctrica neta y con ello su solubilidad, llegando a precipitar en algunos casos. La presencia de solventes orgánicos como la acetona, etanol etc., afecta también la solubilidad de las proteínas, porque en su presencia disminuye la capacidad de los solventes acuosos para separar y solubilizar a los grupos cargados de las proteínas. Un indicador cuantitativo de la polaridad de un

disolvente es su constante dieléctrica, la cual es muy elevada al tratarse del disolvente universal, pero en este experimento, el alcohol disminuyo considerablemente esa constante, por lo cual favoreció aún más su precipitación.

EXPERIMENTO N° 4. ESTIMACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTEINAS. DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BIURET FUNDAMENTO Este método colorimétrico es una prueba confiable para determinar la concentración de proteínas, pero requiere cantidades relativamente grandes de proteínas. El reactivo de Biuret es sulfato de cobre diluido en una solución alcalina. Los compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos para dar un complejo que tiene un característico color púrpura o violáceo. No está demás recalcar, que la proteínas dan un color violeta intenso, las proteosas y peptonas (que son productos de la hidrólisis de las proteínas solubles en agua y no coagulables por el calor) dan color rosado intenso y los péptidos dan un color rosado claro. La gelatina da un color azul, y; de los aminoácidos, la histidina es el único que da positiva la reacción de biuret. MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Gradillas Espectrofotómetro Estándar de proteínas (Albúmina de suero Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N NaOH 1 N Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio en 500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%. Completar a 1000 ml con agua destilada PROCEDIMENTO a) Determinación cualitativa de proteínas. Para realizar la prueba se toman 2 ml

de la solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Si la prueba es positiva se desarrollará un color violeta. b) Curva Estándar para proteínas. A una cantidad de proteína en un rango

comprendido entre 2 a 10 mg se le adiciona NaOH para obtener un volumen final de 1.0 ml. Luego se le agrega 4.0 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en el fotocolorímetro frente a un blanco apropiado (1.0 ml de NaOH más 4.0 ml de Biuret). Anote sus resultados. Determinar el factor de calibración.

DATOS EXPERIMENTALES Tu bo N Bl 1 2 3 4 5

[Proteí na] mg/m l 2 4 6 8 10

A b

F c

Para obtener la curva de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia en las ordenadas y la concentración de proteína en las abscisas. c) Determinación cuantitativa de proteínas. Se toma 1.0 ml de suero diluido

10 veces (1:10). Se añade 4.0 ml del reactivo de Biuret, se agita y se deja en reposo durante 30 minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en espectrofotómetro a 540 nm frente a un blanco apropiado. Determinar la cantidad de proteína en mg/ml teniendo en cuenta el factor de calibración determinado anteriormente. RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA GENERAL: 1. Peña Díaz, A. Arroyo, B. Gómez, A. Tapia, R. Gómez, C. (2004). Bioquímica (2ª Ed.). México, D.F.: Limusa. [Google] 2. Costa da Silva, J. Pinho, S. C. (2013) Viability of the microencapsulation of a casein hydrolysate in lipid microparticles of cupuacu butter and stearic acid. International Journal of Food Studies, 2, 48–59.  [ResearchGate][PDF] 3. Gonzalez-Jordan, A. Thomar, P. Nicolai, T. Dittmer, J. (2015). The effect of pH on the structure and phosphate mobility of casein micelles in aqueous solution, Food Hydrocolloids, 51, 88-94 DOI 4. Food-Info, Pontificia Univ. Católica de Valparaíso. (26 Jul 2001). Proteínas de Leche. 5. Universidad Pablo de Olavide. Servidor FTP  o Práctica 3 – Extracción de la caseína y determinación del punto isoeléctrico. [PDF] 6. Nelson, D. L. Cox, M, M. (2015) Lehninger Principios de Bioquímica (6ª Ed.). España, Barcelona: Ediciones Omega. Pág. 78, 90 – 91 7. Donald Voet, Judith G. Voet (2006) Bioquímica (3ª Ed.). España, Barcelona: Editorial Médica Panamericana. Pág. 140 – 141 [Google]