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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA MICROBIOLOGIA II Integrantes: Sánchez Wladimir Hernández José Villacrés Sebastián David Valencia Fecha: 26 de Enero de 2015 1. TEMA: Empleo de placas Petrifilm para el análisis microbiológico de muestras de agua recolectada en la laguna artificial de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE. 2. INTRODUCCIÓN 2.1 JUSTIFICACIÓN El agua es esencial tanto para la vida de animales como de seres humanos, frecuentemente actúa como un vehículo para la transmición de microorganismo entéricos, esto acurre cuando la materia fecal alcanza fuentes de abastecimiento (Apella y Araujo, 2004). La Organización mundial de la Salud (Ayres y Mara, 1996) en sus guías para la calidad del agua establecen que el agua es apta bacteriológicamente para el consumo si no posee microorganismos patógenos de origen parasitario intestinal. La presencia de microorganismos patógenos en el agua es un riesgo que aumenta en las áreas marginales de mayor densidad poblacional o en zonas sin disponibilidad de agua potable. Los controles de la totalidad de los microorganismos hídricos resgosos para la salud, son difíciles de llevar a cabo debido a la gran variedad de bacterias patógenas, a la complejidad de los ensayos y a la presencia en baja concentración de varias especies agresivas (Apella y Araujo, 2004). Por esta razón, los análisis bacteriológicos apuntan a la búsqueda de microorganismos indicadores de contaminación fecal y se centralizan en la cuantificación de coliformes. Este grupo está integrado por enterobacterias, siendo Escherichia coli el indicador universal de contaminación fecal (Martínez, 2011).

2.2 OBJETIVOS 2.2.1 GENERAL Emplear placas petrifil para el recuento de UFC de una muestra de agua recolectada en la laguna artificial de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

2.2.2 ESPECÍFICOS  Determinar mediante la prueba de petrifilm la presencia de E.coli y coliformes en una muestra de agua

  2.3

recolectada en la laguna artificial de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

Realizar el conteo de UFC en cajas petrifilm Interpretar los resultados obtenidos de la incubación de la caja petrilm HIPÓTESIS

La muestra de agua recolectada en la laguna artificial de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE posee indicadores de contaminación fecal, detectables en placa petrifilm.

. 2.4 MARCO TEÓRICO Existe una gran dificultad para determinar la presencia de todos los organismos patógenos implicados en los procesos de contaminación ambiental. Dicha determinación conlleva varios días de análisis, costos elevados y laboratorios especializados. Frente a estas dificultades y a la necesidad de hacer una evaluación rápida y fiable de la presencia de patógenos en el agua, se ha planteado la necesidad de trabajar con organismos indicadores (Martínez,2011). Los microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a los patógenos (concentración y reacción frente a factores ambientales y barreras artificiales), pero son más rápidos, económicos y fáciles de identificar. Las placas comerciales Petrifilm, están diseñadas para el recuente de UFC, en muestras de aguas y alimentos, están conformadas por láminas delgadas con un medio de cultivo y un agente solidificante soluble en agua. Pueden también estar recubiertas por una película de polipropileno para atrapar el gas producido por algunas bacterias. Algunas poseen indicadores de pH que colorean colonias para facilitar su identificación, así como una cuadrícula para hacer el recuento de las UFC (Caballini, 2005). Entre las ventajas que presentan sobre las placas Petri tradicionales, están que ocupan menos espacio, se almacenan por más tiempo y son fáciles de manipularen el laboratorio; las placas petrifilm para el recuento de bacterias coliformes, poseen agar bilis rojo violeta, un agente gelificante soluble en agua fría, un indicador de actividad de la glucuronidasa y un indicador que facilita la enumeración de las colonias. Cerca del 97% de E. coli produce betaglucuronidasa, la que a su vez produce una precipitación azul asociada con la colonia. La película superior atrapa el gas producido por E. coli y coliformes fermentadores de lactosa. Cerca del 95% de las E. coli producen gas, representado por colonias entre azules y rojo-azules asociadas con el gas atrapado en la Placa Petrifilm EC (3M, 2006).

3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES Micropipeta de 1000ul Muestra de agua 1 Placa de Petrifilm para E.coli, Coliformes Incubadora 3.2 METODOS Para el muestreo se requirió tomar una pequeña cantidad de agua del estanque de los patos en un recipiente estéril, usando guantes para evitar contaminación cruzada, posterior a esto se debió encender el mechero y preparar el área de trabajo esterilizando y desinfectando, se tomó 1 ml de muestras con la micro pipeta de 1000µL procediendo a inocular la placa de Petrifilm en un área plana, en la que se hace que la cantidad de muestra colocada se cubra todo el Petrifilm después del cual se cubrirá la muestra con el film que es provisto en la misma prueba y se procedió a colocar en incubación por un periodo de 24 horas a 35 oC. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la muestra utilizada de agua de estanque (agua de patos de la Universidad de las fuerzas Armadas ESPE) se obtuvo los siguientes resultados en la placa petrifilm 3M para recuento de E. coli y coliformes (petrifilm EC): ocho colonias azules con gas, que representan a E.coli debido a que es capaz de crecer en medios conteniendo los nutrientes del Violeta Rojo Bilis (VRB) y producir la beta-glucuronidasa, que reacciona con un indicador (colorante) BCIG presente en la placa Petrifilm EC y que hace que la colonia sea de color azul o púrpura, 28 colonias rojas con gas que según la AOAC INTERNATIONAL y el U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) los Coliformes son bacilos Gram negativos que producen ácido y gas a partir de la lactosa durante la fermentación metabólica y en las placas Petrifilm EC producen ácido que oscurece el color del gel de rosado a rojo (Figura 1). El gas atrapado alrededor de las colonias de Coliformes indica Coliformes confirmados y la ausencia de gas puede indicar la presencia de Coliformes pero según el método 998.08 de la AOAC internacional no es confirmado, por lo que no se le debe tomar en consideración. Debido a que E.coli es un coliforme el resultado final para Coliformes confirmados es de 36 colonias.

Figura 1: Placa Petrifilm conteo E.coli, Coliformes

UFC colonias∗factordedilución =¿ mL mLplato A simple vista la muestra de agua parece contaminada por la turbidez de la misma, y calculando las UFC/mL se obtuvo 8 UFC/mL para E.coli y 36 UFC/mL de Coliformes y según la norma INEN 1108 emitida en el 2011 para el agua potable indica que el requisito microbiológico para coliformes debe ser < 1 UFC/100mL que significa que no se debe observar colonias de coliformes por lo que se concluye que la muestra de agua esta contaminada por coliformes confirmando lo observado a simple vista (Tabla 1). Tabla 1: Conteo y resultados en Petrifilm E.coli y Coliformes Característic a

Producción de gas

Numero colonias

Color rojo

No

27

Si

8

Si

28

Si

36

Color azul Color rojo Color azul

rojo

y

5. CONCLUSIONES

Microorganis mo Posibles Coliformes E.coli Coliformes confirmados Coliformes totales

UFC/mL 27 8 28 36

 

Mediante la prueba de Petrifilm se determinó la presencia de E.coli, Coliformes en muestra de agua. Por medio del conteo en placa de Petrifilm se encontró en la muestra de agua un total de 8 UFC/mL de E.coli, 28 UFC/mL de Coliformes productoras de gas y 27 UFC/mL de Coliformes no productoras de gas.

6. BIBLIOGRAFÍA AOAC INTERNATIONAL method 991.14, emitido el 17 de marzo de 2014, coliform and escherichia coli cunts in food. Resuperado el 24 de enero de 2015 de : http://www.longrunbio.com/uploads/soft/130814/1130Q4144244.pdf Apella M., y Araujo P., (2004), Microbiología del agua: Concentos básicos, Plataforma Solar de Almería, Recuperado de: https://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/02_Capi tulo_02.pdf Consultado el: 24 de enero de 2015 Ayres R. y Mara D., (1996), Analysis of Wastewater for Use in Agriculture - A Laboratory Manual of Parasitological and Bacteriological Techniques, OMS, recuperado de: http://www.who.int/water_sanitation_health/wastewater/labmanual.pdf? ua=1 , Consultado el: 24 de enero de 2015 Cavallini, E. R. (2005). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. Retrieved from https://books.google.com/books?id=vwB0fgirgN0C&pgis=1 Departamento de Microbiología 3M Espana, S.A., guía de interpretación de Placas para Recuento de E. coli y Coliformes recopilado el 22 de enero de 2015 de : http://multimedia.3m.com/mws/media/374964O/pec-interp-guidespa.pdf Martínez J., (2011), Indicadores de contaminación fecal en agua, REDIS, Recuperado de: http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/pdfs/Capitulo_20.pdf, Consultado el: 24 de enero de 2015 Norma Inen 1108, Junio de 2011 Requisitos para Agua potable recopilada el 23 de enero de 2015 de: http://isa.ec/pdf/NORMA%20INEN%201108%202011%20AGUA%20POTABLE.pdf 3M, (2006), Placas Petrifilm™ para el Recuento de E. coli/Coliformes, Recuperado de: http://jornades.uab.cat/workshopmrama/sites/jornades.uab.cat.workshopmr ama/files/Petrifilm_guias.pdf Consultado el 24 de enero de 2015.