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MÉTODO DE PATCH-CLAMP

Es una técnica electrofisiológica para medir corriente eléctrica que pasa a través de la membrana en un canal sencillo en células. La técnica de patch clamp (desarrollada por Nher y Sakmann) usa un micropipeta de vidrio de diámetro suave con una abertura de aproximadamente 1um. La eficiencia de esta técnica requiere que la membrana esté libre, es decir, separada de otras células, libre de tejido conjuntivo, de restos celulares, etc, para que de esta forma, la pipeta se pueda adherir de una manera eficiente a la membrana celular. Las pipetas son preparadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato y confeccionadas a través de un puller, el cual es programado para dividir el capilar en dos, generando así en el sector de la división, finísimas puntas, las que más tarde serán refinadas con calor para suavizar el contorno, lo que también permitirá una mejor adhesión del vidrio a la membrana. Esto contrasta con microelectrodos nítidos que se usan con frecuencia en otras técnicas electrofisiológicas. La pipeta se llena con una solución que depende del estudio específico o la técnica de patch clamp usada. Un electrodo de metal en contacto con esta solución conduce cambios eléctricos a un amplificador de voltaje. Este está presionado contra la membrana celular y se aplica succión para absorber la membrana dentro de la pipeta con el eléctrodo para formar un sello eléctricamente apretado de “giga-ohm”. En el patch clamp un solo electrodo se usa para hacer el patch clamp de la membrana celular habilitando el mantener el voltaje en un nivel constante mientras que se graban los cambios de corriente. En forma similar, la corriente en la célula puede ser anclada a la corriente y grabar los cambios de voltaje. Hay algunas variantes de la técnica de patch clamp que se pueden realizar incluyendo, por ejemplo: 

Patch Clamp Planar: en lugar de pipetas de vidrio, se usa una superficie plana puncionada con pequeños hoyos.

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Patch “cell Attached” (Célula-pegada): el electrodo se mantiene sellado a la membrana celular mientras que la solución en la pipeta se altera (por ejemplo, por la adición de drogas) y se graba la actividad de los cambios resultantes.

Presionando la pipeta de Patch sobre la superficie limpia

de una célula se le aplica una succión suave, pudiendo lograr de esta manera un sello en el orden de los 6Ω. En estas condiciones se pueden aplicar diferentes estímulos a la fracción de membrana desde el interior de la pipeta y medir las respuestas de los canales aislados.

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Patch “inside out” (De adentro hacia fuera): Donde el área “succionada” de la membrana se desprende de la célula y se expone a la superficie intracelular de la membrana – la que en cambio se puede exponer a varios medios conteniendo, por ejemplo, varios ligantes intracelulares.

Una vez establecido el sello, en vez de aplicar estímulos inmediatamente se puede separar la fracción de membrana sellada y exponer la abertura inferior de los canales.

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Patch “whole cell” (De célula completa): Donde se incrementa la succión rompe la membrana y brinda acceso del electrodo al ambiente intracelular por un periodo de tiempo corto, el ambiente intracelular es diluido por los contenidos de la pipeta.

Se rompe la fracción de membrana sin destruir el sello para exponer de esta manera el interior de la célula o del organelo.

Existe otra configuración llamada “Outside Out” (Del exterior hacia afuera) que es equivalente a la célula completa en el sentido de que el interior de la membrana queda expuesto al contenido en la pipeta y el exterior de la misma es expuesta al medio exterior. Las diferentes configuraciones del patch clamp, faculta al investigador a:  Estudiar los canales iónicos en diferentes niveles, por ejemplo, se puede tanto utilizar la técnica de whole cell (célula completa) para analizar la actividad de todos los canales de la célula como realizar registros de canal único.  Manipular fácilmente la composición tanto del medio extracelular como del intracelular durante un registro.

Dentro de sus aplicaciones la técnica es usada para estudiar células excitables, por ejemplo, aquellas que producen una pequeña corriente eléctrica cuando se estimulan. Estas incluyen principalmente células nerviosas y fibras musculares.

CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO: Cualquier aplicación de electrofisiología incluyendo el patch clamp coloca una gran demanda en la configuración del microscopio en términos de estabilidad, supresión de vibración, aislamiento de interferencia eléctrica, espacio para manipuladores y acceso al espécimen. La estación de trabajo de fisiología FN1 de Nikon, ha sido diseñada especialmente para cubrir las demandas de electrofisiología con manipulación eficiente y un ruido mínimo. En el diseño del FN1, Nikon ha minimizado el ruido eléctrico usando iluminación de fibra para llevar luz al sistema desde fuera de la jaula y conectando pines a tierra en todas las partes principales del microscopio. La vibración se minimiza con la rígida construcción y se reduce el temblor cuando se gira el portaobjetivos y aumentos. La forma simple y delgada con forma de I en el cuerpo

brinda más espacio de trabajo y un mejor acceso alrededor del microscopio para posicionar los manipuladores y otros periféricos. El condensador, sub-platina y torreta se pueden remover por completo del cuerpo del FN1 para obtener más espacio libre, dependiendo del experimento. Además, la altura de la platina fija puede cambiarse fácil y rápidamente por el usuario. Los objetivos de inmersión en agua están aislado de la transmisión eléctrica y térmica. El objetivo 16x tiene un amplio ángulo de aproximación de 45° y una distancia de trabajo de 3.0mm para un acceso fácil y una observación mejorada. La combinación del objetivo 16x (con gran A. N.) en combinación con un cambiador de aumentos intermedio permite a los usuarios realizar experimentos de patch clamp sin cambiar el objetivo. El FN1 puede ser usado en combinación con el sistema confocal C1. Con el eje z motorizado (opcional) y el software mejorado del C1, los usuarios pueden realizar análisis de imágenes, reconstrucción 3D de rebanadas, y puede obtener imágenes 3D y datos electrofisiología alternativos desde el mismo espécimen. Los usuarios pueden cambiar rápidamente entre la iluminación IR y DIC-IR para asegurar el reconocimiento preciso de las micro aguja y mejorar el contraste flexible. El microscopio también permite a los usuarios selecciona la longitud de onda IR específica para cada tipo de espécimen: 700-750nm para imágenes de alto contraste de especimenes delgados con estructuras finas. 800-900nm para imágenes de alto contraste de especimenes gruesos con estructuras profundas. Oblicua IR descentrada que brinda contraste flexible desde varios ángulos. La fijación suelta de membrana se diferencia ya que usa un sello suelto en lugar de un gigacello hermético usando en la técnica convencional .Una ventaja del sello suelto es que la pipeta que se usa puede ser movida repetitivamente de la membrana luego de la grabación y aun así la membrana permanecerá intacta. Este método permite repetir mediciones en varios lugares de la célula sin destruir la integridad de la membrana. Por otro lado un gran desventaja es que la resistencia entre la pipeta y la membrana es reducida grandemente, permitiendo a la corriente filtrase a través del sello. Este filtrado puede ser corregido, pero de todos modos este método ofrece la oportunidad de comparar y constatar grabaciones hechas desde diferentes áreas en la célula de interés.

FOSFATO DE PIRIDOXAL.

La característica definitiva de la catálisis por la transaminasa es la participación coenzimática del fosfato de piridoxal, llamado en ocasiones coenzima de los aminoácidos. Aunque el tema es por ahora su papel en las reacciones de transaminación, esta coenzima también participa en otros tipos de transformaciones de aminoácidos, como la descarboxilación y la racemización (Laminoácido ↔D-aminoácido). El fosfato de piridoxal representa la forma metabólicamente activa de la vitamina B6 llamada piridoxal, que es una piridina sustituida. La oxidación de un grupo hidroximetílico (-CH2OH) a un grupo aldehído, y la fosforilación del segundo, producen fosfato de piridoxal. El sitio activo del fosfato de piridoxal reside en el grupo aldehído, el cual puede reaccionar con los grupos amino libres (por ejemplo, en aminoácidos) para formar un enlace imínico básico de Schiff (꞊C=N-). De hecho, antes de reaccionar con un aminoácido, el fosfato de piridoxal se une de modo covalente a la enzima mediante ese único enlace, alterando el grupo ԑ-amino de un residuo de lisina en la cadena polipetídica. La primera fase de una reacción implica la formación del derivado aldehídico del fosfato de piridoxal (PirP), el cual reacciona luego con el grupo amínico del sustrato del aminoácido para formar una nueva base de Schiff entre la coenzima y este sustrato. Sea una transaminación, una descarboxilación o una racemización, el destino subsecuente del complejo ternario durante el resto de la reacción es controlado por la especificidad catalítica del sitio activo de la enzima. Los fenómenos que describen a la transaminasa se esquematizarán más adelante. El mecanismo propuesto consta de dos fases. Primero, el aminoácido (sustrato 1) se convierte en un α-cetoácido por reordenamiento del enlace imínico, a lo que sigue una hidrólisis para formar el α-cetoácido (producto 1). Nótese que el grupo amino permanece con el conjugado enzima-coenzima como fosfato de piridoxamina. La segunda fase (justo el inverso de la primera) comienza con la formación de una base de Schiff a partir del α-cetoácido aceptor (sustrato 2); luego se forma el aminoácido correspondiente (producto 2). La reacción es un ejemplo de mecanismo tipo ping pong.

REFERENCIAS. Bioquímica, las bases moleculares de la estructura y función celular. Albert L. Lehninger. Ediciones Omega Barcelona. 2da edición.

REFERENCIAS.

 Tesis: Canales iónicos y fotocorrientes en plantas vasculares. Universidad de Colima. Sandoval Álvarez Leandro. Centro universitario de investigacions Biomédicas. Pag. 26-30.  Patch Clamp. Recuperado http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_patch_clamp.htm

de:

 La técnica de Patch Clamp. Recuperado http://acercandolabiofisica.blogspot.mx/2009/10/la-tecnica-del-patchclamp.html

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