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2018 “Pardeamiento enzimático”

Curso:

Practica de Bioquímica de los Alimentos Docente: Ing. María Estela Ayala Integrantes:  Jamanca Mejía Heyri  Ari Castro Miguel  Hurtado Becerra Jackelinne  Levizaca Chumbe Aracelly Universidad: UNFV-FOPCAA-EPIA

01/07/2018

PRACTICA N°5 PARDEAMIENTO ENZIMATICO I.OBJETIVOS:   

Observar la influencia de los tejidos vegetales en la producción del pardeamiento enzimático. Determinar el efecto del calor y Ph en la reacción del pardeamiento. Determinar el efecto de la adición de inhibidores en diferentes compuestos en el pardeamiento.

II.FUNDAMENTO: El pardeamiento enzimático se debe a la presencia de derivados del o-dihidroxifenol, como el catecol, el ácido cafeico, el ácido cloro génico, que están difundidos en los vegetales. Estos compuestos se oxidan en presencia de enzimas (fenolasa, polifenolasa, tirosinasa, catecolasa), dado como resultado final pigmentos pardos o melaninas. III.INTRODUCCION: Se conoce con el nombre de pardeamiento enzimático a una alteración química, aunque enzimática en sus primeras etapas, que tiene como sustratos a los compuestos fenólicos que transforman en estructuras en estructuras poliméricas poco aclaradas, por lo general con coloraciones pardas. Por su origen, apenas puede ocurrir en los alimentos de origen animal, mientras que si puede ocasionar significativos problemas de calidad en la conservación de frutas y verduras. En estos casos, las alteraciones aparecen sobre todo cuando los productos vegetales han sufrido algún daño en sus tejidos por contusiones ocasionales o bien debido a las agresiones propias de algunos tratamientos tecnológicos: trozado, extracción de zumos, deshidratación, congelación, etc. Los ejemplos de los alimentos de origen vegetal pueden ser abundantes: papas, champiñones, manzanas, melocotones, peras, plátanos, etc. No siempre la formación de estos pigmentos coloreados se ha de considerar como un fenómeno químico indeseable, puesto que existen diversos casos dentro de la tecnología de los alimentos en los que precisamente se busca esta transformación de los componentes fenólicos: procesos de maduración de dátiles, fermentación de hojas de té, secados de granos fermentados de cacao, etc. (Gutierrez, 2000) IV.MARCO TEORICO: Pardeamiento enzimático: El pardeamiento enzimático es una reacción que se busca intencionadamente en algunos procesos concretos como son la fermentación del té, la desecación de dátiles y la fermentación del cacao. Sin embargo, esta reacción es generalmente indeseable porque

origina las (R.Fennema)decoloraciones que aparecen cuando algunos tejidos se cortan, magullan, enferman, congelan o son sometidos a cualquier otra acción que cause la ruptura celular. Los sustratos de esta reacción son fenoles simples (por ej., catecol y ácido gálico), derivados del ácido cinámico (como el ácido cloro génico y la dopamina) y flavonoides (catequina y epicatequina). Características de los tejidos vegetales comestibles: La tendencia de un tejido al pardeamiento presenta grandes variaciones de un cultivar a otro, debido a diferencias en los contenidos enzimáticos y, algunas veces, en el tipo y cantidad de los sustratos fenólicos. Entre los métodos que se utilizan para evitar el desarrollo de esta reacción durante el procesado de los alimentos, pueden citarse la exclusión de oxígeno, el empleo de acidulantes, la inactivación por calor (escaldado) y el uso de inhibidores como los sulfitos. (R.Fennema) REACCIONES CON LOS POLIFENOLES Los compuestos fenólicos (como el ácido p-hidroxibenzoico, el catecol, el ácido cafeico, el gosipol y la quercetina) se encuentran en todos los tejidos vegetales. Durante la maceración de estos tejidos los compuestos fenólicos se pueden oxidar por acción del oxígeno molecular, a pH alcalino, a quinonas. Las quinonas también pueden formarse por acción de la polifenoloxidasa, que es un enzima muy común en los tejidos vegetales. Estas quinonas son muy reactivas y pueden reaccionar irreversiblemente con los grupos sulfhidrilo y amino de las proteínas. Las quinonas reaccionan mucho más rápidamente con los grupos SN y a-amino (N-terminal) que con los grupos c-amino. Además, las quinonas, compuestos de oxidación de los fenoles, pueden sufrir reacciones de condensación, dando lugar a la formación de pigmentos de color pardo, de alto peso molecular, a veces denominados taninos. Los taninos siguen siendo muy reactivos y se combinan fácilmente con los grupos SH y amino de las proteínas. La reacción entre las quinonas y los grupos amino disminuyen la digestibilidad y biodisponibilidad de la cisteína y la lisina de las proteínas. Inhibidores de PPOs (Polifenol oxidasas) Se destacan cuatro grupos: Sulfitos, agentes antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos quelantes. Los sulfitos son los compuestos más efectivos en prevenir el pardeamiento enzimático (Sapers, 1993). Aunque el mecanismo de actuación de los sulfitos para prevenir el pardeamiento no está claro, pueden provocar una inhibición directa de la enzima, como se ha observado en la inhibición de PPO de fresa por metabisulfito de sodio (WescheEbeling y Montgomery, 1983), pueden interaccionar con los intermedios evitando que estos participen en la formación de pigmentos (Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986) o pueden actuar como agentes reductores convirtiendo a las quinonas en difenoles (Valero et al., 1988).

A pesar de su efectividad en la prevención de la calidad de frutos y vegetales, estos compuestos están sujetos a restricciones debido a que provocan efectos adversos en la salud en personas sensibles. Una de las mejores alternativas al uso de los sulfitos es el ácido ascórbico (Wang et al., 2013), este compuesto es altamente efectivo en la inhibición del pardeamiento por su habilidad de reducir las quinonas producidas por la PPO a los fenoles antes de que la reacción de formación de pigmentos tenga lugar. Sin embargo, el ácido ascórbico es muy reactivo y se oxida rápidamente a ácido dehidroascórbico (DHAA), pudiendo reaccionar con otros compuestos que conllevan a cambios en la calidad de los frutos. A veces se utiliza en combinación con acidulantes, siendo el más utilizado el ácido cítrico debido a su presencia natural en tejidos. Otros inhibidores son los compuestos sulfhidrilos como mercaptoetanol, ditiotreitol y tiourea por su habilidad como agentes reductores, sin embargo, las concentraciones necesarias para prevenir el deterioro del fruto no son permitidas en alimentación. La cisteína se ha mostrado como un inhibidor fuerte de PPO en banana y manzana, siendo incluso más efectivo que el metabisulfito (Ashie et al., 1996; Richard-Forget et al., 1992b; Valero et al., 1988), sin embargo, la concentración necesaria para alcanzar altos niveles de inhibición tiene efectos negativos en el sabor de los frutos. Además, se han empleado agentes quelantes como ácidos policarboxílicos, poli fosfatos y ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA) para inactivar a la PPO. A pesar de que muchos de estos compuestos son bastante efectivos en el control del pardeamiento enzimático, a menudo su uso en alimentación está limitado por producir efectos adversos en la salud, debido a un coste efectivo o porque su acción es sólo temporal como el ácido ascórbico. Por este motivo, cada vez se recurre más a la utilización de productos naturales como las ciclodextrinas, que tienen la capacidad de incluir una amplia variedad de moléculas orgánicas e inorgánicas, incluyendo a los polifenoles (Cai et al., 1990; Bru et al., 1995), dentro de su cavidad hidrofóbica, aunque el coste es elevado. Recientemente, se han utilizado productos de la reacción de Maillard, sintetizados a partir de azúcares (pentosa, hexosa, o disacárido) y compuestos tiol como inhibidores del pardeamiento enzimático en frutos (manzana) y vegetales (champiñón y berenjena) crudos y procesados (Billaud et al., 2005). (Jaime Morante Carriel1, 2014)

V. Parte experimental Muestra -

Papa

Materiales -

Cuchillo y tabla de picar Tela de filtro (nylon) Mechero Baño María 4 tubos de ensayo 4 placas Petri

Reactivos -

Ácido cítrico al 0.1 % Ácido cítrico al 0.5 % Ácido cítrico al 1 % Bisulfito de sodio al 0.1 % Bisulfito de sodio al 0.5 % Bisulfito de sodio al 1 %

Procedimiento 1) Efecto de pardeamiento en los tejidos vegetales - Cortar la cuarta parte de la papa y cortarlas en trozos. - Desmenuzar uno de los trozos y colocarle en una placa Petri, junto al trozo entero. - Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.

Fig. 1. Efecto del pardeamiento en las muestras (desmenuzado y trozo)

-

El otro trozo dividirlo en dos, una dividirlo mediante rotura y la otra cortarla usando el cuchillo y colocarlas sobre la placa Petri. Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.

Fig. 2. Efecto de pardeamiento en las muestras. 2) Efecto del tiempo a 100 °C - Utilizando el zumo de la papa, agregando agua destilada para filtrar en la tela nylon en un vaso precipitado.

Fig. 3 Obtención del zumo de papa

Fig. 4 Colocando el zumo de papa en los tubos de ensayo -

Separar rápidamente el zumo de la papa en 3 tubos de ensayo10ml aprox..

Fig. 4 Colocando el zumo de papa en los tubos de ensayo

-

Colocar los 3 tubos de ensayo en baño María hasta 100 °C.

Fig. 5 Baño María del zumo de papa -

-

Retirar el primer tubo de ensayo después de haber transcurrido 1 minuto, retirar el segundo tubo de ensayo después de haber transcurrido 3 minutos y finalmente retirar el tercer tubo de ensayo después de haber transcurrido 5 minutos. Comparar el pardeamiento que se produce en las muestras.

-

Cortar 4 trozos de papa y colocarlos en baño María durante 1, 3 y 5 minutos.

Fig. 6 Baño María de los 4 trozos de papa 3) -

Luego colocarlos en la placa Petri y comparar el pardeamiento de las muestras. Efecto del pH Cortar 4 trozos de papa Colocar los trozos de papa en 4 placas Petri durante 5 minutos. En la primera placa Petri solo se coloca un trozo de papa. En la segunda placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de ácido cítrico al 1 %. En la tercera placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de ácido cítrico al 0.5 %. En la cuarta placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de ácido cítrico al 0.1 %. Comparar el pardeamiento de las muestras después de haber transcurrido 5min.

Fig. 7 Efecto del pardeamiento después de someterlo en solución de ácido cítrico.

4) -

Efecto del bisulfito de sodio Cortar 4 trozos de papa Colocar los trozos de papa en 4 placas Petri durante 5 minutos En la primera placa Petri solo se coloca un trozo de papa En la segunda placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de bisulfito de sodio al 1 % En la tercera placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de bisulfito de sodio al 0.5 % En la cuarta placa Petri se coloca un trozo de papa en solución de bisulfito sodio

Fig. 8 Efecto del pardeamiento después de someterlo en solución bisulfito de sodio

RESULTADOS:

EFECTO DEL PARDEAMIENTO EN LOS TEJIDOS VEGETALES

MUESTRA

TROZO 1

TROZO 2

TROZO 3

TROZO 4

PAPA

(Desmenuzado)

(Entero)

(Rotura)

(Cortado con cuchillo)

Tiempo de

5min

10 min

10 min

10 min

pardeamiento

Mantiene su Coloración

Mantiene su

Pardo negruzco

coloración

Ligero

coloración

(Presenta

(No presenta

pardeamiento

(No presenta

pardeamiento

pardeamiento

pardeamiento

Enzimático)

Enzimático)

Enzimático)

POR EFECTO DEL TIEMPO A TEMPERATURA CONSTANTE (100°C)

ZUMO DE

TUBO A

TUBO B

TUBO C

Tiempo

1 min

3 min

5 min

Coloración

Amarillo oscuro

Amarillo claro

Amarillo claro

Producto del pardeamiento

(La temperatura alta

(La temperatura alta inhibe

enzimático

inhibe el pardeamiento

el pardeamiento enzimático

enzimático )

)

PAPA

TROZOS

TROZO 1

TROZO 2

TROZO 3

TROZO 4

DE PAPA

Tiempo

2 min

3 min

4 min

5 min

Mantiene su coloración

Mantiene su

Mantiene su

Mantiene su

(La temperatura alta

coloración

coloración

coloración

(La temperatura alta

(La temperatura

(La temperatura alta

inhibe el

alta inhibe el

inhibe el

pardeamiento

pardeamiento

pardeamiento

enzimático )

enzimático )

enzimático )

Coloración inhibe el pardeamiento enzimático )

POR EFECTO DEL ACIDO CITRICO A DIFERENTES CONCENTRACIONES

TROZOS DE

TROZO 1

TROZO 2

TROZO 3

TROZO 4

SIN ACIDO

ACIDO CITRICO

ACIDO CITRICO

ACIDO CITRICO

CITRICO

AL 0.1 %

AL 0.5 %

AL 1 %

Se inhibe el

Se inhibe el

pardeamiento

pardeamiento

enzimático

enzimático

(mantiene su

(mantiene su

(mantiene su

coloración)

coloración)

coloración)

PAPA

Presento PARDEAMI

pardeamiento

ENTO

enzimático (pardo negruzco )

Se inhibe el pardeamiento enzimático

POR EFECTO DEL BISULFITO DE SODIO A DIFERENTES CONCENTRACIONES

TROZOS DE

TROZO 1

TROZO 2

TROZO 3

TROZO 4

Sin Bisulfito de

Bisulfito de Sodio

Bisulfito de Sodio

Bisulfito de Sodio

Sodio

Al 0.1%

Al 0.5%

Al 1%

Se inhibe el

Se inhibe el

pardeamiento

pardeamiento

enzimático (mantiene

enzimático

su coloración)

(mantiene su

(mantiene su

coloración)

coloración)

PAPA

Presento PARDEAMIENTO pardeamiento enzimático (pardo negruzco )

Se inhibe el pardeamiento enzimático

VII. DISCUSIONES 1. Según OWEN R. FENNEMA Introducción a la química de alimentos pág. 551 “Se inhibe las enzimas por muchas maneras entre ellas los efectos de la agitación, del cizallamiento, de las altas temperaturas, de la presión y del calor. Sin embargo, no todas ellas conducen a la inactivación «instantánea» o completa y puede haber un período inicial en el que la actividad del enzima.”  En este caso coincidimos con el autor ya que este explica las maneras para inactivar las enzimas, aunque las inactivaciones no son completas La temperatura afecta no sólo a la velocidad de activación, sino también a la estabilidad del enzima y esto hace que no cambien mucho las características distintivas del producto. 2. Según Salvador Badui Dergal 1981. Química de los Alimentos pág. 314 “Los Sulfitos son muy versátiles pues se pueden emplear como inhibidores de las reacciones de oscurecimiento. Tanto o enzimático como no enzimático. al igual que como antioxidantes, blanqueadores y antimicrobianos. En este grupo de compuestos se incluyen el anhídrido sulfuroso y los sulfitos, además de los bisulfitos y los meta bisulfitos. Al disolver en agua los sulfitos y el S02• se produce una rnezcla de los iones SO,=(sulfito) y de HSO,- (bisulfito), cuyas concentraciones dependen del pH del sistema: a pH 4.0 se encuentra la máxima cantidad de bisulfito, mientras que a pH 7.0, ambos iones están en la misma proporción“  Estamos de acuerdo con el autor pues el bisulfito actuó como un inhibidor de la polifenoloxidasa ya que al mismo tiempo de exposición dos muestras con bisulfito y la otra sin ninguna sustancia se notaron grandes diferencias puesto que la muestra con bisulfito no cambio de color significativamente a comparación de la muestra pura. 3. Según OWEN R. FENNEMA Introducción a la química de alimentos pg 587 “Se ha estimado que se pierde hasta un 50% de las frutas tropicales por pardeamiento enzimático. Esta reacción también es responsable del deterioro del color, del sabor y de la calidad nutricional en zumos y en vegetales frescos como la lechuga. Por esto, se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar métodos para el control de la actividad de la polifenoloxidasa.”  Concordamos con el autor puesto que el pardeamiento enzimático es favorable en sus inicios ya que le da un color y sabor agradable pero el exceso de este cambia y perjudica drásticamente al alimento. El ácido ascórbico, el bisulfito sódico y los compuestos tiólicos impiden el pardeamiento porque reducen el producto inicial, o-benzoquinona, impidiendo de esta manera la formación de melanina.

4. CHEFTEL (1980) Introducción a la bioquímica y tecnología de los alimento “La adición de compuestos reductores, que trasforman las quinonas en fenoles, permite retardar o impedir el pardeamiento enzimático. El compuesto más frecuentemente utilizado es el ácido ascórbico; se utiliza sobre todo para jugos de frutas y para las frutas o legumbres que se almacenan o mantienen en estado crudo”  Estamos de acuerdo con el autor, en la práctica se utilizó ácido cítrico el cual se observó que inhibe eficazmente el pardeamiento enzimático en los trozos de papa.

5. Según la revista Latinoamericana de la papa (2009). Pardeamiento enzimático: “Caracterización fenotípica, bioquímica y molecular en variedades de papas nativas en Argentina” Los cortes de papa de 10 mm de diámetro se evaluaron a los 15, 30, 45 y 60 minutos con dos repeticiones independientes. Los valores obtenidos oscilan en un rango entre 0 (marrón oscuro) y 24 (blanco). En tanto los valores elevados representan cortes de papas de colores claros o una reducción en el PE.  Coincidimos con esta práctica ya que en el caso de las rodajas de papas la coloración clara significa la inhibición del pardeamiento enzimático.

6. Según Mejía Y. 2016 Pardeamiento enzimático. Química de Alimentos. Tecnología en Química Industrial El ácido ascórbico es el más recomendado para evitar o minimizar el pardeamiento enzimático, por su carácter vitamínico inofensivo. El ácido ascórbico por sí mismo no es un inhibidor de la enzima: actúa sobre el substrato, de modo que puede adicionarse después de haberse formado las quinonas (tiene la propiedad de oxidarse a ácido dehi-hidroascórbico, reduciendo la quinona a fenol). Esto lo hace el ácido ascórbico hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascórbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que estas continúan, entonces su oxidación, hasta la formación de melanoides.

 Coincidimos con el autor ya que en la práctica se observó que el ácido cítrico evita el pardeamiento enzimático, por lo tanto, es recomendable para inhibir el pardeamiento.

VIII. CONCLUSIONES  El pardeamiento enzimático se caracteriza por su coloración pardo-negruzco formado por las melaninas.  A mayor superficie de contacto menor será el pardeamiento enzimático.  Resulta muy eficaz la inactivación de enzimas por el calor.  Los ácidos y los bisulfitos ayudan a inhibir el pardeamiento enzimático.  A mayor concentración de los ácidos o de los bisulfitos mejor será la inhibición del pardeamiento enzimático. IX. CUESTIONARIO 1. Explicar la influencia de la temperatura y pH en el pardeamiento enzimático:  Son factores que influyen en el caso que sea a mayor temperatura(100°C) y un Ph acido actúan como inhibidores del pardeamiento enzimático, así también a una temperatura ambiente favorece al pardeamiento de forma negativa en la industria, el más utilizado de los acidulantes es el ácido cítrico debido a su presencia natural en tejidos. Otros inhibidores son los compuestos sulfhidrilos. (Jaime Morante Carriel1, 2014) 2.

¿Cómo actúa el bisulfito?  Actúan como agente reductor, que previenen el pardeamiento enzimático por la reducción de o-quinonas a o-difenoles no coloreados.

3. ¿Qué compuestos participan en el pardeamiento enzimático? El pardeamiento enzimático (PE) está relacionado principalmente con la actividad de polifenol oxidasas (PPO), la cuales catalizan la oxidación de compuestos fenólicos a quinonas, con la consecuente transformación a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial. Las polifenol oxidasas (PPOs) son enzimas ubicuas que catalizan la reacción dependiente de oxígeno que transforma o-difenoles en o-quinonas. Estas quinonas son reactivas y capaces de modificar covalentemente un amplio abanico de especies nucleófilas, del interior de las células, que conduce a la formación de polímeros marrones, conocido como pardeamiento enzimático. Aunque las PPOs se han descrito en diversos tejidos de plantas como raíces, semillas, hojas y frutos, el control de este fenómeno requiere un conocimiento bioquímico del tipo de sustratos fenólicos presentes en cada planta, el nivel de compuestos reductores, el nivel de accesibilidad del O2, de la naturaleza de los diferentes compuestos oxidables y de la polimerización y degradación de las o-quinonas. El pardeamiento no enzimático consiste en la condensación de un grupo aldehído o cetona de un azúcar con un grupo amino libre para formar una base de Schiff, la cual se reorganiza para formar una cetamina estable (producto de Amadori) y finalmente se

degradan a productos reactivos que contienen grupos carbonilo. Estos grupos pueden reaccionar con grupos amino dando lugar a polímeros oscuros. (Friedman, 1997).

X. RECOMENDACIONES Preferentemente se requiere que la muestra este el menor tiempo expuesto al contacto del oxigeno, para evitar afectar en los resultados. La enzima polifenoloxidasa (en vegetales), posee un pH óptimo entre 5 – 6, a partir de esta técnica se retarda el proceso de pardeamiento llegando como consecuencia a la desnaturalización de la enzima. La disminución del pardeamiento enzimático, con respecto a la adición de una dilución de mayor concentración de bisulfito en el zumo de papa y otros alimentos se explica en la captura del oxigeno por parte de este agente, permitiendo un retraso en la oxidación de los fenoles. Con el aumento de la temperatura el grado de pardeamiento disminuye, no obstante, el exceso de sobreexposición al calor afecta a nivel físico (gelificación) en la composición del zumo de papa.

XI.REFERENCIAS  Gutierrez, J. B. (2000). Ciencia Bromatologica "Principios generales de los alimentos". Madrid-España: Diaz Santos S.A.  Jaime Morante Carriel1, A. A.-M.-S. (2014). Distribución, localización e inhibiDores De las polifenol oxiDasas en frutos y vegetales usaDos como alimento. Quito-Ecuador: .  R.Fennema, O. (s.f.). Quimica de los alimentos. Wisconsin.  Mejía Y. (2016). Pardeamiento enzimático. Química de Alimentos. Tecnología en Química Industrial.  Owen r. Fennema. “Introducción a la química de alimentos “Tercera Edición. Edit. Acribia pág. 551. 587  Salvador Badui Dergal 1986.” Química de los Alimentos”. Edit. Alhambra. México, D.F. pág. 314  Pardeamiento enzimático: “Caracterización fenotípica, bioquímica y molecular en variedades de papas nativas en Argentina” leído en file:///C:/Users/USER/Downloads/Dialnet-PardeamientoEnzimatico5512034%20(2).pdf el treinta de junio del dos mil diesciociocho.