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INTEGRANTES: • • • •

Joel Cornejo Zegarra Erick Challco Montiel Israel Castillo Loza Jhon Layme Laura

DOCENTE: Rosalía Callohuari Quispe CURSO: Bioquímica Pesquera GRUPO: martes 11-12:40

TACNA- PERÚ 2022

CINETICA ENZIMATICA I INTRODUCCIÓN Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que modifican las velocidades de las reacciones químicas dentro del organismo, esta acción se conoce como “BIOCATÁLISIS". La actividad de una enzima es bastante ESPECÍFICA es decir que solo catalizará una o unas cuantas reacciones. Algunas enzimas dependen para su actividad solamente de su estructura proteica, en cambio otras, dependen además, de estructuras no proteicas o cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico (Fe3+,Mg2+, etc), o una molécula orgánica llamada coenzima (NAD, FAD, etc). En la presente práctica estudiaremos cuatro factores que regulan la actividad enzimática: • Temperatura • PH • Concentración de sustrato • Concentración de la enzima Para ello utilizaremos como modelo la acción hidrolítica de la pepsina sobre las proteínas (albúmina de huevo). La ovoalbúmina es una proteína globular presente en la clara del huevo a elevadas concentraciones. Esta proteína es en su estado natural mide 13 x 3 nm y está constituida por 584 residuos de aminoácidos agrupados en una sola cadena y con un “PM de 64000 y un PI de 4.6”. La ovoalbúmina debe ser desnaturalizada previamente para su uso; esto se consigue sometiendo al huevo a ebullición se extrae la clara y se licua con agua destilada y esta solución se filtra a través de una gasa. Obteniéndose así una solución turbia y su aclaración será producto de la degradación de la ovoalbúmina por la pepsina. La pepsina es una enzima proteolítica, secretada por las células principales del estómago, al estado de zimógeno o proenzima pepsinógeno) MATERIALES ✓ Muestra Huevo de gallina ✓ Reactivos Solución de ovoalbúmina Ácido clorhídrico 1 N Carbonato de sodio al 10% Agua Pepsina al 1 %

Papel indicador de PH Hielo. ✓ Equipo y Otros Baño María Termómetro Fotocolorímetro Gradilla y cocina Material de vidrio necesario

METODOLOGIA Experimento Nº 1: Efecto del PH ✓ Fundamento: La actividad de una enzima es máxima a un determinado PH; por debajo o por encima de éste la actividad disminuye. ✓ Procedimiento: Preparar cinco tubos enumerados de acuerdo a la tabla adjunta:

REACTIVOS

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 (mL) (mL) (mL) Sol. de ovoalbúmina 2.5 2.5 2.5 HCI 1 N 1.0 0.25 Agua destilada 0.75 1.0 Na2CO3 • Llevar los 5 tubos a baño María y preincubarlos por 5 minutos. • Luego añadir a cada tubo 1.5 ml de una solución de pepsina al 1 %

Tubo 4 (mL) 2.5 0.75 0.25

Tubo 5 (mL) 2.5 1.0

•

Continuar la incubación de los 5 tubos a 37°C.

✓ Resultados • Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla:

Valor de pH Turbidez (*) Actividad(**)

Tubo 1 1 ++ 1/2 -

Tubo 2 2 + 1

Tubo 3 7 +++ 1/3

Tubo 4 9 ++++ 1/4

Tubo 5 13 ++++ 1/4

(*) Expresado por medio de cruces, más turbidez más cruces. (**) Expresado como el inverso del número de cruces. Experimento Nº 2: Efecto de la temperatura ✓ Fundamento: Una reacción enzimática se ve favorecida por el aumento gradual de la temperatura; las moléculas de la reacción adquieren progresivamente una mayor energía cinética favoreciendo su interacción. Este aumento sólo es hasta cierto límite ya que a partir de él se ve afectada la estructura de la enzima. ✓ Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: REACTIVOS Sol. de ovoalbúmina HCI 1 N Agua destilada T °C de incubación • • •

Tubo 1 (mL) 2.5 0.25 1.75 0°C

Tubo 2 (mL) 2.5 0.25 1.75 20°C

Tubo 3 (mL) 2.5 0.25 1.75 37°C

Tubo 4 (mL) 2.5 0.25 1.75 60°C

Tubo 5 (mL) 2.5 0.25 1.75 90°C

Llevar los 5 tubos a sus respectivas temperaturas de incubación por 5 minutos. Luego añadir a cada tubo 0.5 ml de solución de pepsina al 1 %. Para el caso del tubo 5 agregar pepsina hervida. Continuar la incubación de los 5 tubos por 5 minutos en sus respectivas temperaturas

✓ Resultados • Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Temperatura de incubación (°C) 0 20 37 60 90 Turbidez (*) ++++ ++ + +++ ++++ Actividad(**) 1/4 1/3 1 1/3 1/4 (*) Expresado por medio de cruces, más turbidez más cruces. (**) Expresado como el inverso del número de cruces. Experimento Nº 3: Efecto de la concentración de la enzima ✓ Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: REACTIVOS Sol. de ovoalbúmina HCI 1 N Agua destilada Pepsina 1%

Tubo 1 (mL) 2.5 0.25 2.25 -

Tubo 2 (mL) 2.5 0.25 2.00 0.25

Tubo 3 (mL) 2.5 0.25 1.75 0.50

Tubo 4 (mL) 2.5 0.25 1.25 1.00

Tubo 5 (mL) 2.5 0.25 0.75 1.50

Mezclar bien cada tubo y llevarlos a baño María, a 37°C por 5 minutos. ✓ Resultados Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Enzima (*) 0 0.05 0.1 0.2 Turbidez +++++ ++++ ++ + Actividad 0 1/4 1/2 1 (*)Calcule teóricamente la concentración de la enzima (mg%)

Tubo 5 0.3 + 1

Experimento Nº 4: Efecto de la concentración del sustrato ✓ Fundamento: Al aumentar la concentración de sustrato, manteniendo fija la concentración de la enzima, se produce al comienzo un incremento en la velocidad de la reacción y luego una estabilización (saturación por el sustrato) y la velocidad en que no existe ya incremento se llama velocidad máxima. ✓ Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: REACTIVOS

Tubo 1 (mL) 1.00 0.25 3.50

Tubo 2 (mL) 1.50 0.25 3.00

Tubo 3 (mL) 2.00 0.25 2.50

Tubo 4 (mL) 2.50 0.25 2.00

Tubo 5 (mL) 3.00 0.25 1.50

Sol. de ovoalbúmina 1% HCI 1 N Agua destilada • Mezclar bien cada tubo. • Realice una primera lectura al fotocolorímetro de todos los tubos utilizando filtro azul. • Llevarlos a incubación a 37°C por 5 minutos. • Cumplido el tiempo de incubación agregue a cada tubo 0.25 ml de pepsina al 1% • De inmediato vuelva a incubar a 37°C por 5 minutos más. • Cumplido este segundo tiempo de incubación realice una nueva lectura al fotocolorímetro de cada uno de los tubos. ✓ Resultados Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla: Tubo 1 0,2 0.209 0.017

Tubo 2 0,3 0.623 0.060

Tubo 3 0,4 0.774 0.083

Tubo 4 0,5 0.979 0.110

Tubo 5 0,6 1 0.248

Sustrato Absorbancia inicial Absorbancia final 0.192 0.563 0.691 0.869 0.752 Actividad Enzimática (**) (*) Calcule teóricamente la concentración del sustrato para cada tubo asumiendo que la concentración de la albúmina utilizada es aproximadamente 1% (* *) Se obtienen restando a la absorbancia inicial la absorbancia final de cada tubo.

CUESTIONARIO

1 º. ¿Cuál es el PH óptimo encontrado para la actividad de la pepsina? El pH encontrado para la pepsina es de 1,5 a 2,2para tener actividad óptima, y este medio lo proporciona el ácido clorhídrico (HCI). Y en los tubos que mas se acercan el valor del pH es el tubo 1 y tubo 2. 2º. ¿Cómo será la actividad de la pepsina al PH del jugo gástrico? Explique La pepsina (EC 3.4.2.3, ver Figura 1) es una enzima inespecífica que inicia la digestión de las proteínas, siendo esta la principal enzima del jugo gástrico. La pepsina necesita un medio ácido (pH de 1,5 a 2,2) para tener actividad óptima, y este medio lo proporciona el ácido clorhídrico (HCI), secretado también por las glándulas gástricas. Las glándulas gástricas contienen principalmente cuatro tipos de células: oxínticas, zimógenas, mucosas, endocrinas (D, G, enterocromafines, entre otras). Las glándulas fúndicas y del cuerpo contienen los cuatro tipos; las glándulas cardíacas y pilóricas contienen por lo general solo dos. Las células oxínticas, que se encuentran en las glándulas fúndicas y del cuerpo, producen ácido clorhídrico a partir de cloruro de sodio, agua y anhídrido carbónico.El ácido clorhídrico es segregado en los ‘canales intracelulares’, donde no dañan a las células mismas.

3º. Calcule teóricamente el PH para el tubo en dónde se observa la mayor turbidez. Los tubos que tienen la mayor turbidez es el tubo 4 y el tubo 5. Tubo 1

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Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 4 Los reactivos que hay en este tuvo son: 2.5 de sol. De ovoalbúmina, 0.75 de agua destilada y 0.25 de carbonato de sodio (Na2CO3). Haciendo la mezcla sale una turbidez fuerte.

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Tubo 5 Los reactivos que hay en este tuvo son: 2.5 de sol. De ovoalbúmina y 1.0 de carbonato de sodio (Na2CO3). Haciendo la mezcla sale una turbidez intensa.

4º. ¿A qué temperatura la pepsina tiene mayor actividad para este sustrato? Tiene mayor actividad catalítica a la temperatura de 4 y 37° C.

5°. ¿Qué es un zimógeno? Cite al menos 4 ejemplos. El zimógeno es un precursor enzimático inactivo que quiere decir que no cataliza ninguna reacción como hacen las enzimas. •

Quimotripsinógeno. (es una glicoproteína heterogénea compuesta por 452 residuos de aminoácidos • Pepsinógeno. (es una proenzima, precursora de la pepsina) • Angiotensinógeno.

6º. ¿Cómo define Ud. Velocidad de una reacción enzimática? Es el mecanismo de acción de un enzima, el rol que cumple en el metabolismo, y la regulación de su actividad por inhibidores naturales, fármacos, venenos u otro tipo de sustancias, esta es directamente proporcional a la concentración del sustrato, hasta cierto punto.

Como se ve en este dibujo, cuando la concentración del sustrato es baja, una parte de las moléculas enzimáticas tienen su sitio activo libre. Si aumentamos la cantidad de sustrato, estos sitios activos libres se unirán a él, acelerando la velocidad de la reacción.

7º. Con el valor de Vmax calcule el Km tanto gráfica como teóricamente (para esto último la ecuación de Michaelis-Menten y saque un promedio con los resultados para cada tubo).

Hallar el valor de Vmax y Km tanto con la fórmula de Michaelis-Menten Km.

TUBO 1 2 3 4 5

ensayo en laboratorio con 5 tubos de ensayo sustrato[S]Mm V.Inicial V°(mM/s) promedio 1.00 0.192 0.384 1.50 0.563 1.26675 2.00 0.691 1.7275 2.50 0.869 2.38975 3.00 0.752 2.256

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