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NORMA CHILENA OFICIAL
NCh2043.Of1998
Aguas - Método de determinación simultánea de bacterias coliformes totales y Escherichia coli mediante la técnica del sustrato cromogénico
Preámbulo El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos. La norma NCh2043 ha sido preparada por la División de Normas del Instituto Nacional de Normalización, en base al documento técnico elaborado por ESSEL S.A. y ARQUIMED S.A. y en su estudio participaron los organismos y las personas naturales siguientes: A & A TECNOLAB S.A. Aguas Cordillera S.A. AQUA, Calidad del Agua Ltda. ARQUIMED S.A. Biohídrica Ltda. Centro de Estudios, Medición y Certificación de Calidad, CESMEC Ltda. Comisión Nacional del Medio Ambiente, CONAMA Corthorn Quality Chile Empresa de Obras Sanitarias de Valparaíso, ESVAL S.A. Empresa de Servicios Sanitarios de Coquimbo, ESSCO S.A. Empresa de Servicios Sanitarios El Libertador, ESSEL S.A. Instituto Nacional de Normalización, INN Instituto de Salud Pública, ISP
Jeannette Jofré R. Elizabeth Echeverría O. Fabiola Valenzuela G. Alejandra Bruna A. Davor Cotoras T. Pabla Viedma Olga Ureta B. Pamela Zenteno Ana María Iturrieta L. Augusto Palma C. Ruth Mercado H. Eduardo Alarcón M. Ramona Villalón D. Mónica Insunza B.
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NCh2043 Ministerio de Obras Públicas, Dirección General de Aguas MR Laboratorio Ltda. Superintendencia de Servicios Sanitarios, SISS Del Villar, Marcela González S., Ada
Rosa Sandoval L. Manuel Ruiz M. Christian Maurer G. Marcela Del Villar Ada González S.
Esta norma es una homologación del método 9223 Chromogenic substrate coliform test del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater AWWA-WEF-APHA, 19th edition 1995, siendo equivalente al mismo, con desviaciones menores en aspectos de forma. Los anexos A y B forman parte del cuerpo de la norma. Esta norma ha sido aprobada por el Consejo del Instituto Nacional de Normalización, en sesión efectuada el 26 de Agosto de 1998. Esta norma ha sido declarada Norma Chilena Oficial de la República por Decreto N°2566 de fecha 11 de Diciembre de 1998, del Ministerio de Obras Públicas, publicado en el Diario Oficial N°36.260 del 11 de Enero de 1999.
II
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NORMA CHILENA OFICIAL
NCh2043.Of1998
Aguas - Método de determinación simultánea de bacterias coliformes totales y Escherichia coli mediante la técnica del sustrato cromogénico
1 Alcance y campo de aplicación 1.1 Esta norma establece la determinación simultánea de bacterias coliformes totales y E. coli en agua, mediante la técnica del sustrato cromogénico. 1.2 Esta norma se aplica al agua potable y a aguas naturales. 1.3 Esta norma no es aplicable para confirmar resultados presuntivos de otras técnicas analíticas de determinación de coliformes totales.
2 Referencias NCh426/2
Agua grado reactivo para análisis – Especificaciones - Parte 2: Análisis físico-químico y microbiológico de agua potable, aguas crudas y aguas residuales.
3 Principio del método 3.1 El método se basa en el uso de un sustrato específico hidrolizable, para la detección simultánea de enzimas presentes en las bacterias del grupo coliforme total y en particular en el tipo Escherichia coli. 3.2 En la técnica del sustrato cromogénico, la enzima β-D galactosidasa presente enlas bacterias del grupo coliformes totales hidroliza un sustrato específico (β-D galactopiranósido con una marca cromogénica), produciendo cambio de color en la muestra por liberación del cromógeno, cuando es incubada a 35ºC ± 0,5ºC durante 24 h o el tiempo que sea especificado por la formulación.
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NCh2043 3.3 Por su parte, la enzima β-D-glucoronidasa presente en la bacteria Escherichia coli, hidroliza un sustrato específico como el 4-metilumbeliferil β-D glucorónido (MUG), liberando el cromógeno respectivo y produciendo fluorescencia en la muestra, cuando es incubada a 35ºC ± 0,5ºC durante 24 h o el tiempo que sea especificado por la formulación. La fluorescencia es detectada a una longitud de onda de 366 nm, empleando una lampara ultravioleta con una fuente de 6 Watt. 3.4 Los resultados obtenidos son confirmativos y no requieren etapas posteriores de verificación.
4 Definiciones Para efectos de esta norma se aplican las siguientes definiciones. 4.1 bacterias coliformes totales: comprende todos los bacilos Gram negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que poseen actividad β-D-galactosidasa y son capaces de metabolizar el sustrato cromogénico definido, resultando la liberación del cromógeno. 4.2 bacteria Escherichia coli: forma parte de las bacterias coliformes totales que poseen actividad β-D glucoronidasa y son capaces de metabolizar el sustrato fluorogénico 4-metil umbeliferil β-D-glucorónido (MUG), obteniéndose la liberación del fluorógeno. 4.3 técnica de tubos múltiples: método cuantitativo para estimar la concentración de bacterias presentes en la muestra de agua, mediante la inoculación de una serie de volúmenes en concentraciones decimales decrecientes de la muestra, en un medio de cultivo adecuado, los cuales se incuban en condiciones de tiempo y temperatura determinados. 4.4 Autoridad Competente: la designada por las leyes y reglamentos vigentes para estos efectos.
5 Reactivos y materiales Todos los reactivos y materiales deben ser de calidad para análisis. 5.1 Agua para análisis estéril, Clase 4 Exenta de sustancias tóxicas o nutrientes que pueden influir en el desarrollo o supervivencia de microorganismos (ver NCh426/2). 5.2 Comparador Patrón comparador de color y de fluorescencia a 366 nm, para distinguir por comparación los resultados dudosos.
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NCh2043
5.3 Medio basal, en porcentaje masa/volumen Sulfato de amonio
5,0
Sulfato de manganeso
0,0005
Sulfato de zinc
0,0005
Sulfato de magnesio
0,1
Cloruro de sodio
10,0
Cloruro de calcio
0,05
Sulfito de sodio
0,04
Amfotericina β
0,001
Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
0,5
4-Metilumbeliferil-β-D-glucurónido
0,075
Buffer Hepes, constituido por: - Cloruro de sodio -
Acido N-2-(hidroxietil-1 piperazina) etano sulfónico
Inhibidores1)
5,3 6,9 c.s.p.2)
NOTA – Pueden emplearse otras formulaciones del medio basal, debidamente validadas.
6 Equipos e instrumentos 6.1 Estufa de cultivo (incubadora), regulable a 35ºC ± 0,5ºC. 6.2 Horno de esterilización, regulable a 170ºC ± 10ºC. 6.3 Pipetas bacteriológicas, de 1 ml; 5 ml y 10 ml, con graduaciones de 0,1 ml, estériles. 6.4 Recipientes para pipetas, cilíndricos o rectangulares, de aluminio o acero inoxidable, u otro material no corrosivo y resistente al calor, provisto de tapa; o envolturas de papel Kraft. No deben usarse recipientes de cobre o de aleaciones de éste.
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)
2
)
Mezcla de varios productos químicos incluyendo antibióticos, capaces de suprimir los microorganismos para los cuales no está diseñado el método. Capacidad suficiente para
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NCh2043
6.5 Tubos de cultivo, de 20 mm x 150 mm y de 16 mm x 150 mm, u otro envase de cultivo, para cuantificación mediante tubos múltiples. 6.6 Frascos de muestreo, estériles, de 150 ml ó 200 ml 6.7 Sellador apropiado (en el caso de emplear bandejas plásticas de cuantificación). 6.8 Bandejas estériles, plásticas, de cuantificación, para recuento bajo o alto. 6.9 Lámpara Ultra Violeta, de longitud de onda 366 nm y 6 Watt de potencia. 6.10 Otro material de uso habitual en el laboratorio
7 Procedimiento 7.1 Determinación de cloro residual libre Para definir si la muestra tiene cloro o no en el momento del muestreo y establecer la serie de diluciones para la cuantificación, se debe determinar el contenido de cloro residual libre, al momento del muestreo. El método a usar es el indicado en el Manual de análisis físico-químicos de agua potable de la Superintendencia de Servicios Sanitarios. Se permite el uso de colorímetros digitales o discos comparadores por el método DPD previamente contrastados con el método estándar (4 500 – Cl F del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th Edition, 1995).
7.2 Ensayo presencia/ausencia (P/A) 7.2.1 Tomar exactamente 100 ml de muestra en un envase estéril (6.6). 7.2.2 Agregar el contenido de medio basal para 100 ml, agitar vigorosamente e incubar a 35ºC ± 0,5ºC. 7.2.3 Al cabo de 24 h, comparar el contenido del envase con el patrón comparador (5.2). Si no se observa el cambio de color especificado para el cromógeno, el análisis es negativo para coliformes totales. Registrar como resultado negativo. 7.2.4 Si la muestra tiene un color de intensidad mayor o igual a la del patrón comparador, queda confirmada la presencia de coliformes totales. Registrar como resultado positivo. En los envases positivos determinar fluorescencia irradiando con luz UV (6.9); si se observa fluorescencia, registrar como resultado positivo para E. coli. 7.2.5 Si una muestra ha cambiado de color al cabo de la incubación de 24 h, pero la intensidad del color es levemente menor que la del patrón comparador (5.2) o indefinible, incubar 4 h adicionales hasta completar 28 h como máximo, a 35ºC ± 0,5ºC. Proceder de la misma forma con la prueba de fluorescencia.
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NCh2043
7.2.6 Si la muestra contiene coliformes, el color se intensificará constituyendo un ensayo positivo. Si el color no se intensifica, la muestra debe considerarse como negativa. Registrar las muestras positivas para coliformes totales y las positivas para E. coli.
7.3 Ensayo de cuantificación 7.3.1 Método de tubos múltiples (NMP) 7.3.1.1 Preparar la cantidad apropiada de medio agregando por cada 100 ml de agua para análisis estéril, la cantidad especificada de medio basal y agitar vigorosamente hasta disolver completamente. Distribuir la solución en la serie de tubos a utilizar para el análisis. 7.3.1.2 Inocular con la muestra los tubos que contienen el medio de cultivo, usando los volúmenes y las series que se indican en tabla Nº 1, de acuerdo con las diluciones que se requieran; ver anexo A. 7.3.1.3 Agitar vigorosamente cada tubo e incubar a 35ºC ± 0,5ºC. 7.3.1.4 Al cabo de 24 h, comparar cada tubo inoculado con el patrón comparador (5.2). Si no se observa el cambio de color especificado, el análisis es negativo para coliformes totales. 7.3.1.5 Si hay tubos con un color de intensidad mayor o igual a la del patrón comparador, queda confirmada la presencia de coliformes totales. Registrar el número total de tubos positivos. Determinar fluorescencia de los tubos positivos irradiando con luz UV (6.9). Si hay tubos que tengan fluorescencia mayor o igual a la del patrón comparador, confirmar la muestra como positiva para E. coli y registrar el número de tubos positivos. 7.3.1.6 Si algún tubo ha cambiado de color al cabo de la incubación de 24 h, pero la intensidad del color es levemente menor que la del patrón comparador o indefinible, incubar 4 h adicionales hasta completar 28 h como máximo, a 35ºC ± 0,5ºC. Si los tubos contienen coliformes, el color se intensificará constituyendo un ensayo positivo. Si el color no se intensifica, los tubos deben considerarse como negativos. Registrar el número total de tubos positivos. Proceder de la misma forma con la prueba de fluorescencia, para confirmar la presencia de E. coli. 7.3.1.7 Si la muestra de agua originalmente presenta coloración, preparar un blanco de control sin el medio basal. 7.3.2 Método de bandeja de cuantificación 7.3.2.1 Tomar exactamente 100 ml de muestra en un frasco estéril (6.6), agregar el contenido de medio basal especificado para 100 ml y agitar vigorosamente.
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7.3.2.2 Introducir el contenido dentro de la bandeja estéril de cuantificación dependiendo de la concentración esperada de coliformes totales y sellar (6.7). 7.3.2.3 Incubar a 35ºC ± 0,5ºC; al cabo de 24 h, comparar cada una de las celdas de reacción de la bandeja con el patrón comparador. Si no se observa el cambio de color especificado, el análisis es negativo para coliformes totales. 7.3.2.4 Si la celda tiene un color de intensidad mayor o igual a la del patrón comparador queda confirmada la presencia de coliformes totales. Registrar el número de celdas positivas. Determinar fluorescencia de las celdas positivas irradiando con luz UV (6.9). Si alguna celda tiene fluorescencia mayor o igual a la del patrón comparador, confirmar la muestra como positiva para E. coli. Registrar el número de celdas positivas. 7.3.2.5 Si alguna celda ha cambiado de color al cabo de la incubación de 24 h, pero la intensidad del color es levemente menor que la del patrón comparador o indefinible, incubar 4 h adicionales hasta completar 28 h como máximo, a 35ºC ± 0,5ºC. Si las celdas contienen coliformes, el color se intensificará constituyendo un ensayo positivo. Si el color no se intensifica, la celda debe considerarse como negativa. Registrar el número total de celdas positivas. Proceder de la misma forma con la prueba de fluorescencia, para confirmar la presencia de E. coli. 7.3.3 Puede emplearse otro ensayo de cuantificación, debidamente validado ante la Autoridad Competente.
8 Expresión de resultados 8.1 Ensayo presencia/ausencia (P/A) 8.1.1 Si el resultado es positivo en este ensayo expresar como: Presencia (P) de coliformes totales y/o E. coli en 100 ml. 8.1.2 Si el resultado es negativo en este ensayo expresar como: Ausencia (A) de coliformes totales y/o E. coli en 100 ml.
8.2 Ensayo de cuantificación - Método tubos múltiples 8.2.1 Determinar un código de 3 cifras con la combinación de tubos positivos y negativos obtenidos en cada dilución. 8.2.2 Con el código establecido, entrar a la tabla Nº 1, y leer directamente el número más probable de bacterias coliformes por 100 ml, en la columna correspondiente al número de tubos inoculados en cada dilución (ver anexo A).
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NCh2043 8.2.3 Realizar la misma operación para obtener los resultados de E. coli. 8.2.4 Expresar el resultado como NMP por 100 ml.
8.3 Ensayo de cuantificación - Método de bandeja de cuantificación 8.3.1 Determinar el número de celdas positivas para coliformes totales. 8.3.2 Con este número entrar a la tabla correspondiente (ver anexo B como ejemplo) y leer directamente el número más probable de coliformes totales por 100 ml. 8.3.3 Realizar la misma operación para obtener los resultados de E. coli. 8.3.4 Expresar el resultado como NMP por 100 ml.
9 Interferencias Los métodos enzimáticos presentan menor vulnerabilidad a interferencias por altos recuentos de bacterias heterotróficas, en comparación con los métodos tradicionales. Cuando se desconozca la calidad microbiológica de las aguas a analizar, se recomienda realizar ensayos previos de recuento heterotrófico, ya que se han descrito interferencias cuando hay presencia de altas concentraciones de bacterias con actividad β-D glucoronidasa o β-D galactosidasa, no pertenecientes al grupo coliformes. Tal es el caso de especies de los géneros Aeromonas y Pseudomonas, que pueden producir resultados falsos positivos, cuando están en altas concentraciones. NOTA – Para mayores antecedentes ver sección 9223 A, en el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater AWWA-WEF-APHA, 19 th edition 1995.
10 Informe En el informe se debe indicar como mínimo: a) identificación de la muestra; b) número de horas transcurridas entre la toma de muestra y el ensayo; c) contenido de cloro residual libre; d) referencia al método; e) resultados obtenidos; f) cualquier particularidad del ensayo que sea opcional, o no esté considerada en esta norma y que afecte los resultados.
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NCh2043
Anexo A
(Normativo) Tabla 1 - Tabla para el cálculo del número más probable (NMP), para series de 5 tubos con inóculos de 10, 1 y 0,1 ml Combinación de tubos positivos
NMP 100 ml
0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0