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Microbiología del petróleo y sus derivados Brenda Valderrama y Juan Téllez-Sosa, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, AP 510-3, Cuernavaca, Mor. 62250 México.

Introducción La industria del petróleo es característica de nuestra época. Cada año se extraen cerca de un millón de toneladas de petróleo de yacimientos subterráneos, algunos de ellos en mar abierto. La mayor parte se utiliza como combustible en forma de gasolina, diesel, turbosina, etc., y junto con algunas fracciones volátiles (metano, propano y butano) son nuestra principal fuente de energía, tanto industrial como doméstica. Alrededor de 15% del petróleo es utilizado como insumo para la síntesis de otros compuestos, principalmente plásticos, un grupo heterogéneo que incluye poli alquenos (como el polietileno, poli butileno, polipropileno), poli estirenos y cloruro de polivinilo (PVC). El resto del petróleo, las fracciones más pesadas y menos valiosas llamados asfaltenos, se utilizan como pavimento. Químicamente, el petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos, es decir, de compuestos ricos en carbono e hidrógeno, aunque contiene otros elementos minoritarios como azufre, oxígeno y nitrógeno, así como trazas de metales. Es compleja porque dada la capacidad del átomo de carbono de formar cuatro enlaces con otros átomos de carbono, se pueden organizar como cadenas o como ciclos (Tabla 1) . Las cadenas se conocen como compuestos alifáticos, y consisten en sucesiones de átomos de carbono unidos entre sí por enlaces sencillos (alcanos), dobles (alquenos) o triples (alquinos) mientras que el resto de las valencias son ocupadas por hidrógenos. Los alcanos son la familia más numerosa en el petróleo crudo y se conocen como parafinas, pueden ser lineales o ramificados y su longitud varía de 1 a 40 carbonos, aunque se ha logrado detectar cadenas de 60 carbonos. Los alquenos son conocidos como olefinas y son una fuente valiosa de reactantes para la industria sintética. Los ciclos pueden ser saturados, donde varios carbonos se unen entre sí por medio de enlaces sencillos, ó pueden ser aromáticos, donde algunos carbonos del ciclo están unidos por enlaces dobles. Los ciclos saturados se conocen como ciclo-alcanos, ciclo-parafinas o naftenos y son un componente minoritario del petróleo crudo. Los compuestos aromáticos son derivados del benceno, un anillo de seis carbonos unidos 1

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por tres enlaces sencillos y tres enlaces dobles alternados. Los anillos pueden encontrarse fusionados entre ellos o sustituidos con cadenas alifáticas. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs) ó poli núcleo-aromáticos comprenden del 10 al 25% del petróleo crudo y son las fracciones más pesadas (Tabla 1). Para la industria petroquímica, la propiedad física del petróleo más importante es la temperatura de ebullición ya que sus componentes suelen ser separados por destilación mediante el incremento de la temperatura en etapas. Como pueden observar en la Tabla I las moléculas más pequeñas son volátiles a temperatura ambiente y conforme aumenta su masa molecular lo hace también su punto de ebullición. Una vez separadas a temperaturas específicas, cada fracción es sometida a diferentes procesos de purificación, dependiendo el uso al que estén destinadas. El contenido de azufre y de metales pesados afecta el valor del petróleo crudo y de sus fracciones, ya que los procesos de remoción son costosos (ver más adelante). México es un país exportador de petróleo, tenemos importantes yacimientos en explotación en las zonas del Golfo de México y en el Istmo de Tehuantepec y otros más en reserva. Desde la expropiación de 1936, el petróleo existente bajo el suelo de nuestro país no puede pertenecer a particulares, sino que es administrado por el gobierno federal a través de la compañía paraestatal Petróleos Mexicanos (http://www.pemex.com). Las divisas obtenidas por la venta de petróleo crudo y sus derivados son la principal fuente de ingresos para nuestro país. La producción y el consumo de petróleo son de vital importancia en las relaciones internacionales y ha sido frecuentemente un factor decisivo en la determinación de políticas exteriores. La posición de un país en el sistema depende en su capacidad de producción relacionada con su consumo. Para cualquier país, la presencia o ausencia de yacimientos de petróleo dentro de sus fronteras ha sido de considerables consecuencias en su economía, siendo uno de los factores determinantes entre ser un país rico ó un país pobre. Existen numerosos estudios sobre la composición y el procesamiento del petróleo por lo que en este capítulo nos limitaremos a revisar aquellos aspectos donde se han utilizado microorganismos, ya sea en la producción y en la depuración del petróleo, o posteriormente en la descontaminación por degradación. Este último tema es especialmente importante para nuestra generación, ya que el uso masivo de derivados del petróleo ha incrementado la concentración de compuestos xenobióticos en la biosfera. Por xenobiótico entendemos aquellos compuestos que no 2

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provienen de los ecosistemas y por lo tanto, no existen actividades enzimáticas capaces de utilizarlos eficientemente. En algunos casos, los xenobióticos no son biodegradables, es decir que no son utilizados por microorganismos, sino que se van acumulando en la superficie del planeta. Ejemplo de esto son las toneladas de plaguicidas e insecticidas que se aplican cada año. Si sumamos el petróleo derramado durante la extracción o el transporte, veremos que uno de los mayores retos en los próximos años será la generación de tecnología para su eliminación. Origen biológico del petróleo Para comenzar, ¿de dónde proviene el petróleo? Los combustibles fósiles, como el petróleo ó el carbón de mina, reciben este nombre por provenir de estratos geológicos de origen orgánico formados hace millones de años. Se cree que el petróleo proviene de grandes cantidades de plantas y animales marinos cuyos restos fueron cubiertos por sedimentos y formaron depósitos subterráneos. El material biológico que dió origen a los depósitos de petróleo se encuentra fuertemente degradado, por lo que no es fácil inferir los primeros pasos de su conversión. Sin embargo, existen otros tipos de yacimientos de hidrocarburos similares al petróleo conocidos como rocas sedimentarias químicas, a las cuáles pertenecen la turba, el lignito pardo, el lignito y el carbón o la hulla, y su estudio ha permitido elucubrar sobre las primeras etapas en la conversión de restos orgánicos en hidrocarburos. Las sustancias ricas en hidrocarburos producidas por destilación de estos materiales son los kerogenos. El kerogeno se define como un complejo de materia vegetal y animal diagenéticamente transformada en el estado sólido y de origen sapropélico (Figura 1). El material de partida para los kerogenos son las plantas como los equisetos, los licopodios, los juncos, las cañas, los arbustos, los musgos pantanosos, entre otros. Se cree que las plantas crecieron en pantanos y lagos de agua dulce, los cuales se inundaron ocasionalmente por mares llanos en un clima subtropical hasta tropical. Con la ausencia de aguas subterráneas circulantes la descomposición normal de los restos vegetales, que se basa en la presencia de oxígeno, termina enseguida bajo la cobertura de sedimentos y de otros restos vegetales y se forman gases como el dióxido de carbono y el metano. A través de largos periodos de tiempo (millones de años), estos restos pasaron por dos etapas de degradación, una biológica y otra abiótica. Se piensa que en la primera etapa, los microorganismos 3

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anaeróbicos convirtieron los restos orgánicos en algo parecido al kerogeno actual. Durante la fase abiótica siguiente, las altas presiones y el calor cambian los sedimentos a rocas sedimentarias y el kerogeno a petróleo. Esta conversión parece haber sido catalizada por metales y por las mismas arcillas de los estratos. Gracias a la acumulación de gases (metano principalmente) que funcionan como propulsor, las pozas subterráneas de petróleo se movilizan hacia los poros y fracturas de las rocas y eventualmente afloran de manera espontánea a ras de suelo. Desde el punto de vista microbiológico, la identificación de los microorganismos participantes en la formación del kerogeno es todo un reto, ya que se trata de partículas microscópicas que existieron hace millones de años y cuyos remanentes se encuentran enterrados a cientos de metros de profundidad. Sin embargo, se ha logrado identificar algunas especies microbianas viables asociadas a depósitos de petróleo en explotación mediante herramientas moleculares, aunque no es posible asegurar que provienen del yacimiento y no de contaminación con especies contemporáneas (63, 64, 102). Una alternativa novedosa ha sido la búsqueda de microfósiles asociados a yacimientos de kerogeno. Bajo condiciones muy especiales se ha podido identificar algunos de estos microfósiles como miembros de los grupos cianobacterias y protozoarios (http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artoct99/kamast5.html). Como una alternativa, se ha intentado la identificación de cierto tipo de moléculas orgánicas que sólo pueden provenir de organismos vivos, ya sean procariotes o eucariotes. Estos fósiles moleculares se conocen como “bioindicadores” y son derivados de los lípidos celulares y de membranas. Un estudio de este tipo ha sido aplicado a un yacimiento de kerogeno en Australia y permitió establecer que los tres grandes grupos de seres vivos, eubacterias, arqueobacterias y eucariotes, ya existían hace 3,800 millones de años y que son participantes potenciales en la fase biológica de la formación del petróleo (http://cas.bellarmine.edu/tietjen/Evolution/archean_molecular_fossils_an d_th.htm). Procesos microbianos en la industria petrolera La industria del petróleo es eminentemente química, es más, es la industria química por excelencia. La abundancia y el relativo bajo precio del petróleo han generado una intrincada red de industrias dedicadas a la refinación, depuramiento y utilización de prácticamente todas las fracciones del petróleo desde hace más de un siglo. A pesar de esta 4

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tendencia, nuestra generación comienza a ver cambios significativos en esta industria, ya que se estima que la explotación mundial de crudo decaerá irreversiblemente cerca del 2020 (97). Esta condición impondrá, eventualmente, la generación de nuevas técnicas de exploración y, alternativamente, de la explotación de yacimientos alternativos. Adicionalmente, y en respuesta a la presión ejercida por la opinión pública, la industria petroquímica se verá en la necesidad de renovar sus procesos para ajustarse a criterios más estrictos de eficiencia y limpieza (97). Es bajo estas circunstancias que los microbiologos podemos tener una participación relevante en la nueva industria petrolera. A continuación revisaremos algunos de los procesos donde se han utilizado microorganismos o derivados de ellos como alternativa a los métodos tradicionales. Extracción de yacimientos. Bajo circunstancias ideales, el petróleo surge espontáneamente de un pozo en el subsuelo. Sin embargo, aunque en muchas ocasiones se utilizan bombas para acelerar la extracción, solo se recupera un tercio del volumen del yacimiento, aproximadamente. Se ha implementado una variedad de métodos físicos para poder acceder al petróleo remanente en estos yacimientos secundarios, por ejemplo la inyección de gases o de agua caliente a alta presión para impulsar el petróleo hacia la superficie. Ninguno de estos métodos permite recuperar la totalidad del volumen del yacimiento y ha sido necesario generar nuevas tecnologías para poder explotar lo que se conoce como yacimientos terciarios. Entre estas estrategias se encuentran la adición de solventes, surfactantes y polímeros (86). En particular, un polímero producido por Xanthomonas campestris conocido como goma de xantana, ha sido extensivamente usado debido a sus excelentes propiedades fisicoquímicas, que incluyen una sustancial viscosidad, aún a bajas concentraciones, combinada con una alta fluidez, lo que le permite pasar libremente a través de pequeños poros. La goma de xantana es un heteropolisacárido ramificado cuya cadena principal está formada por residuos de glucosa unidos linealmente mediante enlaces b1_4. La cadena ramificada es un trisacárido formado por glucosa, manosa y ácido glucurónico (Figura 2). La demanda mundial por goma de xantana supera las 25,000 toneladas anuales. La producción de éste polímero a estos niveles ha generado grandes retos tanto a nivel microbiológico como de ingeniería de bioprocesos (36). Desde el punto de vista microbiológico,

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mencionaremos tres de los aspectos que han sido más estudiados con la finalidad de incrementar la productividad del proceso. Xanthomonas campestris es una bacteria fitopatógena que infecta principalmente a plantas de la familia Cruciferae. Con la intención de obtener aislados con mejor capacidad natural de producción se realizó un monitoreo exhaustivo de variedades de Xanthomonas tanto de colecciones públicas cómo de aislados de calabazas, coliflores, zanahorias y nueces de castilla infectadas. Estas cepas fueron sometidas a pruebas bioquímicas, de producción de polímero bajo condiciones definidas, así como a evaluaciones de infectividad. No se encontró correlación aparente entre las características fenotípicas de los aislados con la capacidad de producir el polímero, a excepción de la virulencia, lo que sugiere un papel importante para el polímero dentro del proceso infeccioso. Otra alternativa para la recuperación de yacimientos terciarios es la aplicación directa (in situ) de microorganismos en un proceso conocido como MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery). El fundamento de éste proceso es que el crecimiento microbiano sobre la superficie de las rocas del depósito promueva el desalojo del petróleo, ya sea directamente por desplazamiento físico o indirectamente mediante la producción de metabolitos gaseosos ó surfactantes. Estos últimos provienen de la oxidación de parafinas hasta ácidos grasos, los cuáles actúan como detergentes. Antes de iniciar cada proyecto de MEOR se deben analizar muestras del agua coproducida por el yacimiento. A partir de los resultados de éste análisis, se decidirá la composición de la mezcla nutritiva que se adicionará y que suele consistir en nitratos, fosfatos y sulfatos e inclusive un carbohidrato fermentable. Debido a que las condiciones a las que se encuentran sometidos los microorganismos distan de ser óptimas, no basta con inocular los yacimientos, sino que se deben proveer las condiciones adecuadas para la proliferación celular, especialmente el oxígeno disuelto. Otros factores difíciles de controlar a cientos de metros de profundidad, como la salinidad, el pH, la temperatura así como un bajo potencial redox pueden resultar limitantes en extremo (75). El costo operacional de esta metodología va de $2.00 a $4.00 dólares americanos de incremento por barril de petróleo proporcion. Finalmente, además de los pozos profundos, existen otros tipos de depósitos de hidrocarburos, las llamadas tierras y pizarras bituminosas, que contienen cantidades variables de materia orgánica (20% a 60%) en forma de bitumen y kerogeno, embebidas en formaciones rocosas sedimentarias más o menos compactas. La extracción de hidrocarburos a 6

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partir de estos materiales se lleva a cabo mediante métodos térmicos, resultando en un proceso caro y poco eficiente. Bajo estas circunstancias, la utilización de métodos microbiológicos, por ejemplo para la producción de surfactantes in situ, pudiera generar alternativas económicamente significativas (17). Depuración de combustibles. Debido a su origen biológico, el petróleo preserva no solamente el carbono y el hidrógeno de la biomasa original en forma de los hidrocarburos que ya observamos en la Figura 1, sino también otros elementos, como el azufre y el nitrógeno e inclusive una variedad de metales de transición, como hierro, vanadio, níquel, etc. El azufre y el nitrógeno se encuentran incorporados como heteroátomos en una variedad de compuestos, pudiendo representar alrededor del 5% de la masa en algunos depósitos (Figura 3). Al quemarse como combustible, el azufre contenido en el diesel se convierte en óxidos de azufre que se liberan a la atmósfera. En presencia de agua, los óxidos gaseosos se convierten en ácidos, que se disuelven y se precipitan junto con el agua de lluvia. Este proceso se conoce como lluvia ácida y es frecuente en las ciudades con gran carga vehicular. Actualmente las lluvias ácidas han disminuido notablemente, gracias a que las normas sobre el contenido máximo de azufre en combustibles se rigidizan cada vez más desde finales de los años 60s. La implementación de estas normas requirió que se desarrollaran una serie de métodos para la depuración del azufre en las fracciones dedicadas a combustibles. El más común de estos métodos es la hidrodesulfuración catalítica, que consiste en la conversión del azufre orgánico en sulfuro de hidrógeno usando altas temperaturas y presiones de hidrógeno molecular. El oneroso costo de la hidrodesulfuración catalítica, debido principalmente al alto consumo de hidrógeno y al envenenamiento de los catalizadores por metales pesados, aunado a una limitación intrínseca de reducir los niveles de azufre por debajo de 500 ppm (partes por millón), muy por arriba de las 15 ppm requeridas por la norma, ha ocasionado que se busquen nuevas alternativas. El azufre es un elemento esencial para la vida. Aunque el azufre inorgánico es la fuente predilecta de azufre para la mayor parte de los microorganismos, en su ausencia, una variedad de compuestos organoazufrados pueden ser metabolizados para proveer el indispensable elemento. Este hecho es el principio básico de uno de las más interesantes aplicaciones de la microbiología en la industria del petróleo, la biodesulfuración. 7

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El caso mejor estudiado de biodesulfuración oxidativa es la utilización de dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre por Rhodococcus sp. El DBT y sus derivados alquilados son los organoazufrados más abundantes en el diesel primario y se han establecido como compuestos modelo para este tipo de estudios. La cepa IGTS8 de Rhododoccus erythropolis se ha destacado por su capacidad para remover selectivamente el azufre del DBT sin degradar el esqueleto carbonado y es la base del proceso comercial propuesto por la compañía norteamericana Energy Biosystems Corporation (37, 65). Esta cepa es el prototipo de microorganismo biodesulfurador, sin embargo, existen aislados de otros géneros que comparten estas características. La cepa GTIS10 de Mycobacterium phlei presenta la misma vía degradatoria que la cepa IGTS8, con la ventaja adicional que es moderadamente termófilo, por lo que la fermentación puede llevarse a cabo a 50°C, mejorando la solubilidad del diesel en agua (35, 55). Se han reportado aislados de Gordona cepa CYKS1 (80) y de Nocardia sp. cepa CYKS2 (21) capaces de crecer en DBT como única fuente de azufre. En México, investigadores del Instituto Mexicano del Petróleo han aislado cepas de Rhodococcus de sitios contaminados con petróleo en México capaces de desulfurar muestras de diesel (18). La vía de degradación del DBT en la cepa IGTS8 involucra a las monooxigenasas dependientes de FMNH2 (flavin mononucleotido reducido) DszC/DszA. DszC convierte el azufre del DBT en sulfóxido y subsecuentemente en sulfona (DBTO2). La sulfona es convertida por DszA en 2-hidroxibifenil-2-sulfinato (HBFS), el cual es modificado por DszB, una desulfinasa, a 2-hidroxibifenil (2HBF) y sulfato, que puede ser asimilado como fuente de azufre. El FMNH2 no está unido covalentemente a la monooxigenasa sino que es reemplazado cada ciclo catalítico por DszD, una FMNH2-oxidoreductasa dependiente de NADH específica (Figura 4). Este proceso es típicamente capaz de reducir más de la mitad del contenido de azufre en diesel, por lo que se considera como una importante alternativa a la hidrodesulfuración catalítica. Sin embargo, existen dos importantes inconvenientes para la incorporación de éste proceso a nivel industrial. La primera es que, dado de que el diesel no es soluble en agua, deben mezclarse grandes cantidades del cultivo bacteriano con porciones del combustible a tratar. Debido a los grandes volúmenes de diesel que se requiere procesar, el mezclado de los fermentadores se vuelve un factor limitante. La segunda es el tiempo requerido para este proceso, demasiado lento para los flujos habituales en 8

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una refinería. Una fermentación típica requiere de por lo menos siete días para reducir el 60% del contenido de azufre del diesel (18). Como alternativa a las limitaciones intrínsecas de una fermentación, se podría pensar en purificar las enzimas de la vía para usarlas como catalizadores. Muchas enzimas pueden llevar a cabo reacciones en presencia de solventes orgánicos, trabajar a altas temperaturas, son reutilizables y además pueden ser altamente específicas o, por lo contrario, ser promiscuas, dependiendo del caso. Por todas estas razones constituyen un frente alternativo a muchos procesos industriales, inclusive en la industria petrolera (100). En este caso particular, el obstáculo infranqueable para la generación de un catalizador enzimático, es la necesidad de un cofactor regenerable para la actividad de DszAC. Mientras que la adición del FMN reducido de manera exógena es impensable por razones de costo, la actividad in vitro de la FMNreductasa específica es muy baja, ya que ésta misma requiere de la regeneración de NADH. Por todas estas razones, y a pesar de lo exitosa que pueda ser la biodesulfuración a nivel de planta piloto, es posible que no se consolide como proceso a nivel de refinería. La opción actual es la utilización de otras actividades enzimáticas, que no requieran de la regeneración de cofactores, como base de los catalizadores. En particular, se ha demostrado que la enzima cloroperoxidasa del hongo Caldariomyces fumago puede oxidar selectivamente el azufre de los organoazufrados del diesel, los cuáles pueden ser removidos eficientemente de la mezcla mediante una destilación convencional (5) Biosíntesis microbiana de hidrocarburos El petróleo es uno de los recursos naturales no renovables más importantes, no solo porque es considerado como la fuente energética por excelencia, sino que también porque algunos de sus derivados se utilizan en numerosos procesos de síntesis. Desafortunadamente, la gran demanda energética en todo el mundo ha propiciado la explotación masiva de los yacimientos de petróleo, lo cual, además de provocar que nuestro ambiente se deteriore progresivamente, y lógicamente, se contempla que en un futuro este importante recurso comience a escasear. Por esta razón, resulta prioritaria la búsqueda de fuentes alternativas de energía, preferentemente renovables, cuya generación tenga un bajo impacto ambiental. En este sentido, la biotecnología ha jugado un papel muy importante, particularmente con aquellos estudios enfocados a la 9

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conversión biológica de la biomasa para generar distintos compuestos energéticos tales como el metano, el etanol y el hidrógeno (67). Desde el punto de vista biotecnológico, los lípidos que se acumulan de manera natural en algunas plantas y microalgas tienen potencial como combustibles alternativos. Estos compuestos pueden ser extraídos y transesterificados para generar substitutos de diesel conocidos como biodiesel. Alternativamente, la hidrogenación de la biomasa de microalgas para producir hidrocarburos (50). Se pude recuperar sustancias aceitosas vía la liquefacción de la biomasa de algunas algas a través de reacciones realizadas en condiciones de alta presión y temperatura (57, 66). Los hidrocarburos, componentes esenciales del petróleo, suelen utilizarse en sistemas de combustión rutinarios. La microalga verde Botrycoccus braunii ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de producir y acumular elevadas concentraciones de lípidos altamente saturados, es decir, de hidrocarburos. Se ha reportado que de manera natural, algunas variedades B. braunii son capaces de acumular arriba del 86% de su peso seco en hidrocarburos. B. braunii es una microalga planctónica de aguas dulces de distribución mundial que pertenece al grupo de las Chlorococcales. Estudios de microscopía electrónica han definido que una fracción pequeña de los hidrocarburos producidos por B. braunii son mantenidos en el citoplasma en pequeños cuerpos (vesículas) y que la mayor parte (95%) son secretados a las capas externas de la pared celular formando las llamadas vainas trilaminares. A la fecha se han descrito tres variedades distintas de B. braunii (A, B y L), cada una de estas es capaz de producir, independientemente de la fase y condiciones de cultivo, principalmente solo un tipo de hidrocarburo. Las cepas de la variedad A producen hidrocarburos de cadena larga (entre 25 y 31 carbonos), principalmente alcadienos y alcatrienos. El contenido de estos hidrocarburos en las distintas cepas de la variedad A fluctúa entre el 15 y el 61% del peso seco. Las cepas de la variedad B generan principalmente isoprenoides cíclicos, normalmente ramificados y altamente insaturados, denominados botriococenos, cuya formula general es CnH2n-10 (donde n= 30-37). En estas algas, el contenido de hidrocarburos varía ente el 24 y el 86% del peso seco. Las cepas de la variedad L sintetizan casi exclusivamente un tetraterpenoide de 40 carbonos llamado licopadieno y conforman únicamente entre el 2 y el 8% del peso seco (para una revisión sobre este tema consultar (98) ). Algunos reportes describen que la ruta biosintética por la cual B. braunii produce estos hidrocarburos es similar a la ruta que se presentan en plantas 10

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superiores, es decir, los alcanos son sintetizados por la elongación de ácido palmítico, vía la adición de unidades acetil y descarboxilaciones subsecuentes (16, 93). El rompimiento catalítico (Cracking) de los hidrocarburos generados por B. braunii produjo una fracción del 67% de gasolina, 15% de diesel y 15% de turbosina (39). Sin embargo, a la fecha restan por realizarse estudios enfocados al uso de los hidrocarburos producidos por B. braunii en distintos procesos de síntesis. Finalmente, no obstante la estupenda capacidad de B. braunii para sintetizar hidrocarburos, su potencial biotecnológico esta limitado principalmente por su baja velocidad de crecimiento y su prolongados tiempos de duplicación. Existen muy pocos estudios acerca de la producción de hidrocarburos por bacterias. Recientemente se aisló de una planta de tratamiento de aguas residuales en Osaka, Japón, una bacteria halotolerante capaz de producir y excretar altas cantidades de hidrocarburos (47). La secuencia de ADN de su genes para la partícula 16S ribosomal permitió identificar a este aislado como Vibrio furnissi. Esta bacteria es capaz de excretar al medio hasta un 120% del peso seco de hidrocarburos cuando se encuentra en fase de crecimiento preestacionaria. Esta fracción está compuesta básicamente de alcanos alifáticos de 15 a 24 carbones (71). En términos generales se desconocen las rutas biosintéticas de estos hidrocarburos. Finalmente, los estudios enfocados a la producción de hidrocarburos basados en microorganismos como V. furnissi o B. braunii, representan un reto biotecnológico sumamente atractivo y cuyo potencial para la generación de hidrocarburos, para uso como combustible o en procesos de síntesis. El petróleo y los problemas ambientales La utilización masiva de combustibles fósiles ha provocado cambios sustanciales en el clima. De manera natural, el clima del planeta está determinado por el equilibrio entre la fracción de la energía solar absorbida por la superficie y la restante, que es mandada de vuelta al espacio. El clima se balancea en función de cuanta de ésta energía se almacena en la atmósfera al calentar a algunos de los componentes gaseosos. Existe un grupo de gases conocidos como invernadero que comprende al bióxido de carbono, al bióxido nitroso, al metano, los clorofluoro-carbones, otros compuestos halogenados y al vapor de agua. Estos gases absorben la radiación reflejada provocando el caliento global de la 11

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atmósfera baja y cambiando dramáticamente el clima del planeta. Los gases invernadero provienen tanto de fuentes naturales como antropogénicas, entre las cuáles se encuentra la utilización de combustibles fósiles. Nuestro planeta contiene alrededor de 1.5 x 1012 millones de toneladas de carbono y alrededor de 15% de éste se encuentra en yacimientos subterráneos. Hemos extraído una pequeña parte (menos del 0.4% de todo el carbono del planeta) para usarlo como combustible, sin embargo cada año estamos incorporando 2,800 millones de toneladas de bióxido de carbono a las 76,000 millones de toneladas existentes en nuestra atmósfera. La acumulación de bióxido de carbono provoca actualmente una incremento de 1% adicional al calor generado por las radiaciones solares y sigue aumentando. Sólo existe una vía para incorporar el bióxido de carbono atmosférico a otras formas de menor impacto ambiental y es a través de la fotosíntesis, un proceso exclusivo de las plantas y algunas bacterias. Como podemos ver en la Figura 5, la mayor parte de la fotosíntesis se lleva a cabo en el mar, donde se asimilan 2,500 millones de toneladas de carbono al año, mientras que en la tierra se incorporan 500 millones de toneladas de carbono al año. La contaminación de los mares y la tala inmoderada de los bosques, especialmente en las zonas tropicales, reduce nuestras reservas de fotosíntesis y agrava el problema. Adicionalmente a los cambios climáticos globales, el uso masivo del petróleo como fuente de energía y como materia prima, ha generado el fenómeno de la contaminación ambiental, desconocido hasta hace 50 años. La contaminación ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza real a la salud pública, así como la extinción de gran cantidad de especies vegetales y animales. Esta condición reta a nuestra sociedad para buscar medidas efectivas que remedien los efectos negativos del avance tecnológico (12). Una medida que ha tenido un éxito significativo es la aplicación de técnicas de biorremediación. Como un ejemplo bien documentado al respecto, recomendamos la revisión de un caso de contaminación accidental por petróleo crudo en la costa de Japón recientemente publicado que se remedia con una preparación microbiana (43, 95, 96). La biorremediación utiliza generalmente microorganismos (bacterias, hongos, levaduras y algas), y recientemente han comenzado a utilizarse plantas superiores para algunas aplicaciones. Aunque nuevos enfoques en la biorremediación han surgido basados en la biología molecular y la ingeniería de bioprocesos, la biorremediación clásica continúa siendo el enfoque favorito para procesar desechos biológicos y evitar la propagación de bacterias patógenas (6, 11, 12

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41, 60). La biorremediación también juega un papel cada vez más importante en la concentración de metales y en la recuperación de materiales radioactivos (15, 81). Algunos microorganismos pueden degradar de manera natural compuestos orgánicos y esta capacidad se explota para facilitar la degradación de contaminantes y para operaciones de limpieza de desechos in situ. La aplicación de ensayos de monitoreo sencillos y de alta resolución ha permitido identificar aquellas especies capaces de degradar contaminantes mientras que el uso de sondas génicas específicas permite determinar la abundancia relativa de estos microorganismos (83). El uso de novedosas técnicas y herramientas para la biorremediación in situ, en bio-filtros y en bio-reactores ha contribuido al rápido crecimiento de este campo. La biorremediación ha demostrado ser un complemento costeable y benéfico para ser usado en combinación con métodos químicos y físicos tradicionales como el composteo, la incineración y la extracción con solventes, en el tratamiento de desechos y en la descontaminación del medio ambiente. De las diferentes fracciones del petróleo, los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs) son los de mayor toxicidad y al mismo tiempo los más recalcitrantes a los métodos convencionales de remediación. Los HPAs son un grupo de compuestos aromáticos conteniendo dos o más anillos bencénicos fusionados en arreglos angulares, lineales o agrupados (Figura 3) , contaminantes ubicuos que se forman naturalmente en el curso de algunas reacciones geológicas incluyendo la fosilización de plantas o antropogénicamente en relación a las industrias del petróleo, de la producción de gas y de la preservación de madera. Los HPAs de bajo peso molecular son susceptibles de biorremediación, sin embargo, los de alto peso molecular son recalcitrantes a la degradación biológica (19, 70, 106). Las tasas de degradación de HPAs son variables y no dependen solamente de su estructura, sino también de los parámetros fisicoquímicos del sitio, así como del número y variedad de microorganismos presentes (101). Las variables más importantes que limitan la biorremediación de HPAs de alto peso molecular son la transferencia de masa, las heterogeneidades espaciales y las pérdidas abióticas. Dada la baja solubilidad de estos compuestos en agua, una de las estrategias para la biorremediación en suelo es la adición de surfactantes, naturales o sintéticos, que solubilicen a los HPAs y aumenten su biodisponibilidad (4, 7, 27, 78, 85, 86). Una variación interesante es la identificación de organismos que degraden tanto los compuestos contaminantes como los surfactantes, de manera de 13

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no acumular otros compuestos xenobióticos al suelo (32). Es importante considerar que los productos de degradación de los HPAs no son necesariamente menos tóxico que las moléculas parentales, por lo que es imprescindible incorporar procedimientos de monitoreo de toxicidad en las diferentes etapas de la biorremediación. Biorremediación de compuestos recalcitrantes. El desarrollo de químicos sintéticos derivados del petróleo provee muchos materiales extremadamente útiles, tales como plásticos, pesticidas, aislantes, refrigerantes y retardantes de flama. Muchos de estos materiales nunca habían existido en la naturaleza y por lo tanto los microorganismos no poseen enzimas para degradarlos. De aquí que se consideren no biodegradables o recalcitrantes. Los términos no son completamente precisos sin embargo, ya que ahora se sabe que muchos compuestos clasificados como recalcitrantes son degradados lentamente en el suelo o en medios acuosos. Ejemplos de tales compuestos tóxicos que han causado desastres ecológicos incluyen al DDT (diclorofeniltricloroetano), los bifenilos policlorados y el pentaclorofenol (1, 2, 52). Los compuestos recalcitrantes no sirven usualmente como fuentes de carbón ó de energía para el crecimiento microbiano. Si acaso se degradan, es mediante un proceso de cometabolismo, durante el cual otros compuestos son utilizados como fuente de energía (el cometabolito) con la degradación lateral del compuesto blanco. La degradación completa (mineralización) de moléculas orgánicas relativamente complejas a bióxido de carbono o metano requiere el esfuerzo concertado de bacterias de diferentes grupos, por ejemplo, de las fermentativas hidrolíticas (eubacterias, p. ej. Chlorobium), las acetogénicas (eubacterias, p. ej. Desulfovibrio y Desulfomatuculum) y las metanogénicas (arqueobacterias, p. ej. Methanosaeta y Methanospirillum). Debido a su condición de asociaciones sintróficas (Figura 6) , el aislamiento de cultivos puros a partir de los consorcios metanogénicos es difícil y ha ocasionado errores en la clasificación taxonómica de sus elementos. El estudio de la diversidad microbiana y las dinámicas de sus poblaciones en consorcios biodegradadores está creciendo notablemente en el área de la ecología microbiana (texto adicional ecología microbiana). El interés en esta área ha sido catalizado por el rápido avance de métodos de ecología molecular ya que a través de su uso se tiene una mejor perspectiva de la composición de comunidades microbianas no cultivables. De hecho, se está ha vuelto factible definir las causas de los cambios temporales en la salud de un ecosistema alterado basándose en la 14

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estructura de su población. En particular, el estudio de comunidades microbianas que toman parte en la biodegradación in situ de hidrocarburos ha sido un reto para los microbiólogos. La razón de esto es que la mayor parte de las especies (~90 a 99%) que componen las comunidades degradadoras no son cultivables. La estimación de biomarcadores lipídicos, específicamente fosfolípidos, junto con técnicas de identificación basadas en la secuencia de la subunidad 16S de los ribosomas es una poderosa combinación de técnicas para la elucidación de la ecología microbiana de comunidades biorremediadoras. El uso de estas técnicas provee una apreciación clara de varias características importantes de las comunidades microbianas, específicamente la biomasa viable, la estructura de la comunidad y el estado nutricional o la presencia de respuestas a estrés en bacterias Gram-negativas (48). Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminados tienden a ser dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/o de sobrevivir a los compuestos tóxicos (62). Como resultado, estas comunidades son menos diversas que aquellos sistemas de referencia no contaminados, aunque la diversidad también puede estar influenciada por la complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo que las poblaciones han estado expuestas (44, 105). Sin embargo, cuando las bacterias Gram-negativas dominan el sistema (como es frecuente en el caso de ambientes contaminados con hidrocarburos), el conocimiento derivado de los biomarcadores lipídicos se limita al estado nutricional o fisiológico de la comunidad bacteriana más que a su diversidad. A pesar de la relativamente larga historia de investigación en la biorremediación de derrames de petróleo, ésta continúa siendo una disciplina esencialmente empírica y muchos de los factores biológicos que controlan los procesos no han sido adecuadamente comprendidos. Por ejemplo, la adición de nutrientes es una práctica ampliamente aceptada en la limpieza de derrames aunque es escaso el conocimiento de sus efectos durante el progreso de la biorremediación Existen evidencias experimentales que indican que los niveles de nutrientes, y su concentración relativa con respecto a los contaminantes, influencian la composición de las poblaciones de microorganismos degradadores, lo cual a su vez afecta la tasa de degradación de los contaminantes (74). Características de los microorganismos biodegradadores. Como puede observarse en la Tabla 2 existe una gran variedad de microorganismos identificados en la degradación de compuestos derivados del petróleo. Interesantemente, casi todos son eubacterias, 15

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aunque en algunos casos se encontraron arqueobacterias y eucariotes. Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que permiten la oxidación más ó menos específicas de algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralización, sino que basta una oxidación para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad (99). Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos noconvencionales es Rhodococcus, un grupo único consistente en microorganismos que presentan una gran diversidad metabólica, particularmente hacia la utilización de compuestos hidrofóbicos tales como hidrocarburos, fenoles clorados, esteroides, lignina, carbón y petróleo. Algunas cepas de Rhodococcus han sido utilizadas en aplicaciones industriales y ambientales, incluyendo la producción de ácido acrílico y acrilamida, conversiones de esteroides y biorremediación de hidrocarburos clorados y fenoles. Estos microorganismos presentan una notable capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos halogenados y numerosos compuestos aromáticos, incluyendo algunos sustituidos por halógenos, así como hidrocarburos policíclicos aromáticos (31, 104). Las bacterias del género Rhododoccus poseen una gran variedad de vías metabólicas para la degradación y modificación de compuestos aromáticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos así como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan también la vía del 3-oxoadipato. La tolerancia de éstas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia de un sistema de represión catabólica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas para los tratamientos de biorremediación. Algunas cepas producen poli-3hidroxialcanoatos, otras acumulan metales pesados y otras son fuente de enzimas útiles como la fenilalanina deshidrogenasa y endoglucosidasas. Otras aplicaciones potenciales de los Rhodococos incluyen la biodesulfuración de combustibles, la deshalogenación de emisiones gaseosas y la construcción de biosensores (29, 31, 37, 104). En este punto quizá estés preguntándote cómo adquirieron los microorganismos la capacidad de degradar compuestos que a los que nunca habían estado expuestos. Para entenderlo hay que tener en consideración que para cualquier organismo (inclusive para los humanos) lo más importante es reproducirse y perpetuar sus genes, por lo que 16

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cualquier condición ambiental o nutricional que reduzca su probabilidad de reproducirse despertará una reacción inmediata a nivel metabólico y en segunda instancia a nivel genético. Algunas de las estrategias que se han observado en respuestas de este tipo de retos son: 1.-Reclutamiento. Cuando un organismo se encuentra ante una condición ambiental completamente desconocida de manera abrupta sólo puede utilizar lo que ya tiene. Es decir, que puede explotar alguna actividad enzimática existente para degradar un compuesto nuevo y sobrevivir al reto. Ejemplo de esto es la utilización de enzimas dedicadas a la degradación de lignína (un componente de la corteza de los árboles) para degradar HPAs por algunos hongos (8, 9). 2.Transferencia horizontal. Sabemos que es común entre bacterias la incorporación de material genético de organismos similares por medio de mecanismos celulares de transferencia (conjugación), pero también pueden incorporarlo de organismos distantes e inclusive completamente diferentes por medio de virus (transducción) o directamente del medio (transformación) (24) (Animación 1 ). El material genético incorporado puede integrarse al de la bacteria, enriqueciendo su repertorio metabólico con nuevas funciones, incluyendo aquellas que le permitan degradar compuestos xenobióticos. Un ejemplo de esto es la transferencia en suelo de los genes para degradar fenol entre diferentes especies de Pseudomonas (73). Estrategias recombinantes. Muchos contaminantes ambientales son degradados eficientemente por microorganismos, sin embargo otros persisten y constituyen un riesgo severo a la salud pública. En algunas instancias, la persistencia es una consecuencia del inadecuado potencial catabólico de los microorganismos disponibles. La tecnología del ADN recombinante (ADNrc), aunado a un sólido conocimiento de vías catabólicas y de fisiología microbiana, capacita el desarrollo experimental de actividades catabólicas nuevas o mejoradas sobre esos contaminantes (22, 23, 51, 53, 94). Aunque una gran variedad de microorganismos capaces de degradar xenobióticos tóxicos altamente estables han sido identificados, todavía muchos contaminantes persisten en el ambiente. Avances recientes en el campo de la tecnología del ADNrc han proporcionado soluciones a estos problemas. Clásicamente, uno de los factores limitantes en la biorremediación de sitos contaminados ha sido la baja tasa de degradación. Mediante el uso de métodos de ADNrc es posible extender el rango de los sustratos que un organismo puede utilizar y la tasa de 17

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consumo, inclusive se puede ampliar la capacidad de un microorganismo para degradar un grupo predeterminado de xenobióticos. Dado que los procesos biotecnológicos están basados en actividades naturales de microorganismos, y sólo constituyen variaciones en el tratamiento convencional de deshechos, son aceptados públicamente. Esta es un área donde la ingeniería genética puede hacer importantes aportaciones al manipular los genes catabólicos. A diferencia de las bacterias utilizadas en el trabajo de laboratorio, los organismos genéticamente modificados destinados a ser liberados al medio ambiente como agentes biorremediadores deben ser capaces de expresar su fenotipo bajo el control de señales externas presentes en el medio al cual van a incorporarse. Esta es una diferencia significativa con respecto a otros procesos biotecnológicos (por ejemplo un bioreactor) en el cual las condiciones de trabajo pueden establecerse a voluntad del operador. En el campo, las condiciones de operación se determinan por el ambiente externo. El principal problema es, por lo tanto, como programar fisiológica y regulatoriamente a las bacterias modificadas genéticamente (BMG) para expresar el fenotipo deseado al nivel y en el momento preciso, bajo circunstancias fisicoquímicas sobre las cuales no se tiene control. Este reto ha motivado el desarrollo de una nueva generación de sistemas de expresión de amplio rango específicamente diseñados para bacterias, particularmente Pseudomonas, pero también para otros organismos Gram-negativos (25). Impacto ecológico de la liberación al medio ambiente de microorganismos modificados genéticamente. La transferencia horizontal de genes entre bacterias ha sido ampliamente demostrada bajo condiciones naturales (Animación 1). En estos casos, el material genético es transferido entre bacterias mediante los procesos de transformación, transducción o conjugación (24). En muchas ocasiones los genes que codifican para enzimas involucradas en la degradación de contaminantes se localizan en moléculas extracromosomales llamadas plásmidos. El entendimiento de las dinámicas de transferencia horizontal es imprescindible para comprender la evolución y la ecología de plásmidos, así como para la evaluación de riesgos, o sea, del impacto ecológico de la liberación intencional de bacterias naturales o recombinantes para usos agronómicos o de biorremediación. Este impacto ecológico depende de cómo el nuevo material genético sea expresado en el organismo receptor y en cómo operen los procesos de selección natural en los receptores. Aunque existe la posibilidad de transferencia genética entre todos los 18

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miembros de una comunidad bacteriana, se ha encontrado que existe una clara delimitación entre las especies que efectivamente reciben y expresan una nueva capacidad metabólica siempre en función de sus propias características (68). El uso extensivo de plásmidos con determinantes de resistencia a antibióticos podría tener consecuencias en la transferencia horizontal de esta resistencia acoplado a presiones selectivas impuestas por el uso (y el mal uso) de antibióticos en medicina y en ganadería. Por ejemplo, uno de los microorganismos mas usados en biorremediación es Pseudomonas aeruginosa, bacteria que presenta una serie muy interesante de actividades naturales sobre xenobióticos (73). Lamentablemente, también es conocida por ser un patógeno oportunista en humanos y causante de complicaciones graves en personas inmuno-suprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis quística. Por estas razones existe mucho interés en el estudio de las relaciones filogenéticas entre aislados clínicos y ambientales. Recientemente se demostró que la única diferencia aparente entre estos dos grupos es la presencia de un plásmido que correlaciona con la capacidad de degradar gasolina y aunque no se demostró que las cepas ambientales fueran infecciosas, es una llamada de atención sobre las posibles consecuencias de liberar sin control bacterias recombinantes en el medio ambiente (33). B u r k h o l d e r i a es otro género bacteriano utilizado para biorremediación de herbicidas y pesticidas recalcitrantes y también es usado para proteger cultivos contra hongos. Igual que Pseudomonas, ha sido identificado como patógeno oportunista en humanos, particularmente en pacientes con fibrosis quística. Debido a su genoma extremadamente flexible, Burkholderia cepacia tiene una gran capacidad de mutación y adaptación. Es inherentemente resistente a múltiples antibióticos y ésta capacidad es altamente transmisible entre especies. Por todas estas razones, la selección de cepas “seguras” para su uso ambiental no es posible por el momento y su uso en la agricultura también debe ser cauteloso (42). Una respuesta muy ingeniosa a este conflicto es la construcción de plásmidos “suicidas”, que sólo puedan propagarse en la cepa receptora original y que no puedan ser transferidos. Usando sofisticados sistemas genéticos se han implementado estas funciones “suicidas” en los plásmidos de tal manera que no sean susceptibles de inactivación por proceso celulares naturales, como recombinación, pérdida o inactivación por inserción (58).

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Enfoques genómicos para la microbiología ambiental Mucho de la historia de la microbiología se ha basado en técnicas de cultivo axénico. Aunque esta estrategia ha llevado a descubrimientos notables, ahora sabemos que la historia está incompleta debido a la enorme cantidad de evidencia indicando la existencia de numerosos organismos no cultivables. Se han desarrollado novedosos métodos que permiten el análisis de muestras de material genético aislado directamente de suelo y el uso de técnicas de amplificación-clonación ha permitido identificar una gran cantidad de nuevos microorganismos dándonos una nueva perspectiva de la biodiversidad real de diferentes ecosistemas (89, 103). Con la finalidad de explotar el repertorio de actividades catalíticas de organismos no utilizados tradicionalmente, se ha desarrollado una nueva estrategia conocida como bioprospección. Esta estrategia no se limita a microorganismos, sino que cualquier miembro de un ecosistema puede ser analizado con modernas herramientas moleculares para detectar nuevas capacidades metabólicas. Con respecto a microorganismos, no solo se han explorado ecosistemas convencionales como suelo y agua, sino que los más espectaculares descubrimientos han surgido del estudio de ecosistemas extremos, como el subsuelo en los polos, cráteres de volcanes, manantiales sulfurosos, etc. Colectivamente, los genomas de la microbiota total contenida en la naturaleza, denominado metagenoma, representan mucho más información genética de la contenida en el subgrupo cultivable. Dada la profunda utilidad e importancia de los microorganismos para todos los sistemas biológicos, se requieren nuevos métodos para acceder a la riqueza de información contenida en el metagenoma. Una estrategia exitosa propuesta por el grupo dirigido por Jo Handelsman a este respecto, ha sido la clonación de fragmentos grandes de ADN aislado directamente de los microbios de muestras ambientales (84). La aplicación de esta estrategia permitirá no solo una evaluación más realista de la biodiversidad microbiana en diferentes ambientes, sino la recuperación de un sinfín de nuevas actividades, o de actividades ya conocidas con nuevas propiedades. Adicionalmente al enfoque de búsqueda de diversidad, se esta llevando a cabo un esfuerzo muy interesante para el análisis computacional de algunos genomas secuenciados completamente que permitan la predicción de reacciones aisladas o de vías bioquímicas 20

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completas involucradas en la degradación de xenobióticos. Hasta el momento, el grupo dirigido por Lynda Ellis tiene identificadas más de 100 vías metabólicas, 650 reacciones, 600 compuestos y 400 enzimas participantes en la degradación de contaminantes. Toda esta información está disponible en la base de datos sobre Biocatálisis y Biodegradación de la Universidad de Minnesota (http://www.labmed.umn.edu/umbbd/) fundada en 1995 (30). Conclusiones Aunque existían indicios de la complejidad microbiana, no es sino hasta recientemente que estamos adquiriendo conciencia de la enorme cantidad de recursos bioquímicos que están esperando ser descubiertos. Las principales firmas biotecnológicas están invirtiendo grandes cantidades a la búsqueda de nuevas actividades enzimáticas que puedan ser aplicadas a productos existentes o que inspiren nuevas formulaciones. Existe la consideración general de que muchos de los procesos industriales que se implementarán en los próximos 50 años tendrán su fundamento en recursos biotecnológicos: deberán ser eficientes, limpios y auto sustentables. Los métodos tradicionales de procesamiento del petróleo también se enriquecerán con la generación de nuevas biotecnologías.

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