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• Marco Stom Rodriguez

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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Ingeniería Bioquímica

Departamento de Microbiología

Laboratorio de Bioquímica Microbiana

Practica No. 4 “Determinación de la actividad de la Formiato Deshidrogenasa-Nitrato reductasa en E. coli”

Nombres: Rodriguez Carreón Marco Antonio San Agustin Crescencio Diana Laura Soto Rangel David Israel Vera Salazar Angélica

5IM2 Equipo: 8

Sección: 2

Profesoras:

ASPECTO

VALOR

Hipótesis Objetivo Resultados finales (tabla o grafica) Discusión de resultados Conclusiones Bibliografía Total

0.2 PUNTOS 0.2 PUNTOS 0.2 PUNTOS 0.5 PUNTOS 0.3PUNTOS 0.1PUNTOS 5.0 PUNTOS

CALIFICACIÓN

Entrega: 8 de oviembre de 2017

HIPÓTESIS. Si la síntesis de la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en Escherichia coli aumenta mayormente en condiciones anaerobias que en aerobias entonces, habrá una mayor actividad enzimática en condiciones anaerobias. Si la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa de Escherichia coli requieren de oligoelementos como cofactores entonces en presencia de ellos habrá mayor actividad enzimática. OBJETIVOS: General:  Determinar la actividad enzimática de la Formiato Deshidrogenasa (FoDH), Nitrato Reductasa (NR) y del complejo Formiato Deshidrogenasa Nitrato Reductasa (FoDHNR) de extracto de células de Escherichia coli nativa.

Específico:  En base a las diferentes condiciones de cultivo verificar la reducción de nitrato a nitrito en el proceso de respiración celular de extracto de células de Escherichia coli nativa.  Observar el carácter inducible de este proceso respiratorio en condiciones anaeróbicas y aerobias en presencia o ausencia de Nitrato. RESULTADOS

Cuadro 1. Contenido de proteínas y las actividades enzimáticas. Contenido de Proteínas y actividades enzimáticas mg proteína / ml extracto Actividad específica de FoDhasa (∆Aλ600nm/min/mg proteína) Actividad específica de NRasa (nmol NO2/min/mg proteína) Actividad específica del complejo (nmol NO2/min/mg proteína)

Extracto de células de E. coli nativa crecidas en condiciones: Anaeróbicas Aeróbicas 1 sin NO3 + 2 con NO3 + 3 sin NO3 + sin 4 con NO3 + oligoelementos oligoelementos oligoelementos oligoelementos 26.93 23.98 25.22 17.82 0.3865 0.6050 0.0444 0.7676 50.12

651.54

273.71

383.83

69.6

115.97

3.82

378.94

DISCUSIÓN DE RESULTADOS La primera columna muestra la cantidad de proteína que es un indicador de crecimiento microbiano y nos ayuda a brindar proporcionalidad todas las actividades obtenidas. Primeramente, comparando las actividades específicas del complejo en los cuatro diferentes extractos de celulares notamos que la actividad del complejo es mayor en el extracto lo cual no es posible debido a que si el microorganismo tiene oxígeno disponible para respirar utilizará otra cadena de transporte de electrones más óptima. Seguirá llevando a cabo la actividad catalítica del complejo formiato deshidrogenasa, pero en menor medida. Además, éste cuarto extracto no fue inducido para generar los componentes del complejo por lo que sólo los tiene en concentraciones basales, debe presentar una actividad menor. Por ello, lo consideramos como dato dudoso por extracto contaminado. Con la consideración anterior, la actividad más alta se da en el extracto 2,cuando el microorganismo tiene tanto el nitrato como los oligoelementos, trabaja en condiciones óptimas. En éste caso tanto la FoDhasa como la NRasa presentan sus mayores actividades y observamos que la actividad de la FoDhasa es casi 1100 veces menor que la de la NRasa. Al compararlo con el extracto uno que no tiene nitrato observamos que el cambio en las actividades de ambos aparatos no es proporcional. La FoDhasa presenta una disminución de actividad del 36.11% mientras que la NRasa reduce su actividad en un 92.3%. El 7.7% restante de la actividad es debida a las cantidades basales de la nitrato reductasa. Por lo que también podemos decir que crecer E. Coli en un medio adicionado con nitrito aumenta la síntesis del complejo formiato deshidrogenasa 12 veces. Al quitar los oligoelementos, extracto 3, observamos que la actividad de la formiato deshifrogensa es la que disminuye, 13. 62 veces para ser exacto. Mientras que la NRasa disminuye solo 2.38 veces. Se sabe que la molécula de nitrato se une al sitio activo por medio del ion de molibdeno en estado de oxidación +6. La transferencia de electrones al sitio activo ocurre sólo en la etapa de la transferencia de protoneselectrones, donde la especie Mo(V) desempeña un papel importante en la catálisis. Ientras que para su mecanismo de reacción la FoDhasa necesita tanto Mo como Selenio en forma de aminoacido, además aminoácidos como cisteína y metionina. Al no tener Selenio ni Molibdeno la actividad de la FoDhasa disminuye más que la de la NRasa.

CONCLUSIONES

 Todo el complejo formiato deshidrogenasa se sintetiza junto por un gen polisistrónico.  Los oligoelementos son parte vital para llevar a cabo.  Experimentalmente el complejo trabaja mejor en condiciones aerobias  El extracto adicionado con nitritos y oligoelementos es el que presenta mayor actividad del complejo.

Bibliografía  Revista de sanidad e higiene pública, Secretaría del congreso nacional de salud, Volumen 34, España, 1960  Fundamentos de Bioquimica, Juli Peretó, Universitat de València, pp 376 pages, España, 2017