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M anual de técnicas de laboratorio en hem atología

Manual de técnicas de laboratorio en hematología 4.a edición

Joan Lluís Vives Corrons Jefe de la Unidad de Eritropatología Catedrático de Medicina Acreditado (ANECA) Centro de Diagnóstico Biomédico (CDB-IDIBAPS), Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

Josep Lluís Aguilar i Bascompte Consultor Sénior de la Unidad de Hematopatología Profesor Asociado de Hematología, Centro de Diagnóstico Biomédico (CDB-IDIBAPS), Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

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ELSEVIER MASSON

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ELSEVIER MASSON © 2014 Elsevier España, S.L. Es una publicación MASSON Travessera de Grácia, 17-21.08021 Barcelona, España Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores...). El principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» exis­ tencia de nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las ya existentes. Este libro está legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso fuera de los límites establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación y almacenaje de información. ISBN (versión impresa): 978-84-458-2147-3 ISBN (versión electrónica): 978-84-458-2522-8 Depósito legal (versión impresa): B.2.475 - 2014 Depósito legal (versión electrónica): B.2.476 - 2014 Coordinación y producción editorial: G ea

C o n s u l t o r ía E d it o r ia l , s . l .

Advertencia

La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar las dosis recomendadas, la vía y duración de la administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad del médico prescribir el tratamiento y las dosis más indicadas para cada paciente. Así mismo, la enfermera debe realizar una correcta administración a cada paciente. Ni los editores ni los directores asumen res­ ponsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades como consecuencia del contenido de esta obra. E l Editor

Coautores Josep Lluís Agu ilar i Bascom pte

Josep E Nomdedéu

Consultor Sénior, Unidad de Hematopatología, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

Jefe del Servicio de Hematología Biológica, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona

Dolors Colom er Pujol

Jefe del Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona

Consultor Sénior, Unidad de Hematopatología, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona Jo rdi Fontcuberta

Jefe de la Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de Hematología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona

Francesc Solé Ristol

Neus V illam or Casas

Consultora Sénior, Unidad de Hematopatología, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

Eduard M uñiz D íaz

Director de la División de Inmunohematología, Banc de Sang i Teixits, Barcelona

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Colaboradores V era Adem á

Rosa M ontero

Laboratori de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona

División de Inmunohematología, Banc de Sang i Teixits, Barcelona

Isabel Besson M aspla

Roser Navarro García

Bióloga exbecaria de la Fundació Privada Clinic per a la Recerca Biomédica, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

Unidad de Medicina Tropical, Centro de Asistencia Primaria de Drassanes, Barcelona

Montserrat Borrell

N ú ria Nogués

Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de Hematología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona

División de Inmunohematología, Banc de Sang i Teixits, Barcelona

Carm en Canals

Unidad de Radiofarmacia, CDIC-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona

División de Inmunohematología. Banc de Sang i Teixits, Barcelona M aribel D íaz-Ricart

Unidad de Hemostasia, Servicio de Hemoterapia y Hemostasia, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona Blanca Espinet

Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona M ar M allo

Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona M .a del M a r M añ ú Pereira

Unidad de Eritropatología, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona Carm en M artín Vega

Laboratorio de Inmunohematología, Banc de Sang i Teixits, Barcelona Eva M artínez

División de Inmunohematología, Banc de Sang i Teixits, Barcelona Jaum e M iró Balagué

Laboratori d’Análisis Clíniques, Hospital de Viladecans, Viladecans (Barcelona)

C arlos Piera Peña

A n na Puiggrós

Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona M .a Assum pció Pujades Beneit

Unidad de Eritropatología, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona Án gel Remacha

Servicio de Hematología Biológica, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona. M . Leticia Ribeiro

Directora de la Unidade de Anemias Congénitas, Centro Hospitalar de Coimbra, Portugal Josep M aría Ribera Santasusana

Servicio de Hematología Clínica, Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona M arta Salido

Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona Isabel Tirado

Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de Hematología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona

Prólogo Me enorgullezco de pertenecer a una generación de personas que hemos sido capaces de adaptarnos con eficacia y mesura al m undo digital, pero sin caer en la obsesión adictiva de las redes sociales. Personalmente empleo Internet para acceder a numerosas novedades médicas e incluso no médicas, pero me sigue em ocionando coger entre mis manos cualquier libro. Defiendo con firmeza la idea de que en el entorno editorial deberían coexistir el formato digital e impreso. Por esta razón, me alegra tener la oportunidad de escribir el prólogo a la cuarta edición de este valioso manual, al igual que pude hacerlo en las tres ocasiones precedentes. El diagnóstico hematológico se basa en dos fundamentos principales: a) un cuidadoso estudio clínico del paciente realizado mediante la anamnesis y la exploración física, y b) una detallada observación microscópica de la sangre y de la médula ósea. Por supuesto, existen, además, interesantes m étodos complementarios cuyos avances se exponen con detalle en este texto. Sin embargo, si se intentan obviar los dos fundamentos principales pueden surgir en el proceso diagnóstico errores de bulto. Se ha llegado a afirmar que sin el microscopio no existiría la hematología. El padre del microscopio óptico fue el holandés Anton van Leeuwenhoek (1632-1723). Este extraordinario personaje comenzó su carrera como aprendiz en un almacén, donde los vidrios de aumento se empleaban para contar las fibras de ropa. Después desarrolló pequeñas lentes de gran curvatura para conseguir aumentos de hasta 270 veces, el máxi­ mo conocido en aquellos tiempos. Ello le permitió construir el microscopio óptico, con el que consiguió muchos hallazgos biológicos, entre los que destaca el descubrimiento de los corpúsculos sanguíneos. El estudio de la sangre y de la médula ósea se puede realizar en el ámbito de las ciencias básicas (biología y fisiología), de los laboratorios de análisis clínicos, y en departamentos asistenciales (Medicina Interna y Pediatría). La profundización en los mecanismos de la coagulación sanguínea, en especial la trombosis, hace que la hematología pueda ser de interés para diferentes especialidades colaterales, como Neurología, Cardiología o Angiología. Finalmente, en algunos países, como España, la especialidad de Hematología asume también la hemoterapia, es decir, la obtención, almacenamiento y administración de los productos de la sangre y sus derivados. Como especialidad asistencial, la Hematología forma parte del gran tronco de la Me­ dicina Interna, puesto que se ocupa de la etiología, diagnóstico, pronóstico, tratamiento y prevención de las enfermedades de la sangre. Pero a diferencia de otras ramas de la Medicina Interna, la Hematología se ha de ejercer con gran énfasis sobre los estudios biológicos, entre los que destacan los realizados con el microscopio óptico. En más de una ocasión hemos repetido la frase: «El microscopio óptico es para el hematólogo clínico lo que es el fonendoscopio para el cardiólogo». Como queda ya referido, es muy importante que no se pretenda sustituir los estudios citológicos realizados con el micros­ copio con diversas técnicas más m odernas (citometría de flujo, citogenética y otras). Por esta razón, me parece muy acertada la idea de colocar en el centro de la portada un microscopio. Finalmente, es esencial que el citólogo y el clínico que asisten al paciente actúen de forma coordinada.

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Prólogo

En alguna ocasión anterior me atreví a pronosticar un gran éxito para esta publica­ ción. Los acontecimientos han corroborado mis predicciones, pues el hecho de contar ya con varias reimpresiones y hallarse en su cuarta edición denota la gran aceptación que está teniendo entre el público médico. Animo a los autores a que con su reconocida ilusión, sigan ofreciendo en el futuro este gran servicio a la com unidad sanitaria del ámbito hispano, consistente en la periódica actualización de su valioso manual.

C iril R ozm an

Prefacio Después de más de siete años desde la última edición de este libro, han sido muchos los avances que se han producido en el campo de la hematología diagnóstica, también conocida como hematología biológica, lo que nos ha obligado a realizar una profunda revisión y actualización de su contenido. Asimismo, la jubilación de algunos de nuestros colaboradores ha llevado a la incorporación de nuevos autores elegidos entre los mejores especialistas de cada una de las áreas del laboratorio hematológico. Una de ellas, quizá la que ha experimentado un cambio más espectacular, ha sido la biología molecular y citogenética aplicada al diagnóstico y seguimiento clínico de las hemopatías malignas. Pero la biología molecular también ha sido clave para el diagnóstico y caracterización molecular precisa de las anemias minoritarias (prevalencia < 5/10.000). Un ejemplo de ello son las talasemias y hemoglobinopatías, cuyo capítulo ha sido íntegramente actualizado, aportando los últimos métodos para su caracterización genética y m o­ lecular, imprescindibles para realizar u n consejo genético y diagnóstico prenatal. Este progreso ha seguido un curso paralelo y en gran parte promovido por el aumento de la prevalencia de estas enfermedades en nuestra población, especialmente de la anemia falciforme, como consecuencia del impacto inmigratorio de los últimos diez años. Otros aspectos novedosos son todos aquellos procedimientos diagnósticos relacionados con el análisis morfológico de las células sanguíneas y hematopoyéticas: se ha realizado una total renovación y actualización del capítulo sobre métodos para la clasificación de las hemopatías malignas, que incluye tablas y una extensa iconografía, inexistente en ediciones anteriores. El capítulo dedicado a los trastornos del hierro se ha ampliado con los procedimientos para el diagnóstico de las anemias ferropénicas refractarias al hierro (IRIDA) y otras microcitosis familiares atípicas, que cursan con exceso de hierro, y que hasta hace muy poco eran de mecanismo desconocido. Asimismo, se ha procurado reflejar, con mayor precisión, el progreso experimentado p or los sistemas de análisis celular m ediante citometría de flujo, tanto los aplicados al diagnóstico de laboratorio general (analizadores hematológicos automatizados) como al diagnóstico hematológico específico (citofluorómetros). Así, la descripción de los analizadores hematológicos automatizados, actualmente empleados por prácticamente todos los laboratorios clínicos para la obtención del hemograma y otras magnitudes hematimétricas, se ha centrado en sus diferentes sistemas de análisis, que, en los últimos años, han alcanzado una fase de plenitud. Asimismo, se ha actualizado y ampliado el capítulo sobre citofluorometría aplicada al diagnóstico hematológico y su importancia en el estudio de las hemopatías malignas y de ciertas enfermedades raras de la sangre como la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Como no puede ser de otra manera, en esta edición se han am­ pliado y puesto al día los conceptos, en constante transformación y actualización, sobre aseguramiento y control de la calidad pre- y postanalítica, estandarización, acreditación y certificación y sistemas para la evaluación externa de la calidad. Finalmente, se han renovado y actualizado en profundidad los capítulos dedicados a la inmunohematología y el diagnóstico de las citopenias inmunes, así como también al examen morfológico de hemoparásitos, tan importante en la actualidad debido al aumento de enfermedades tro­ picales como consecuencia del trasiego poblacional y el aumento de los desplazamientos a grandes distancias facilitados por el turismo low-cost.

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Prefacio

En resumen, como ya m encionábamos en ediciones anteriores, seguimos creyendo que este M anual continuará siendo útil, no solo para el especialista en hematología, sino de manera muy especial para el profesional del laboratorio clínico, a quien la des­ cripción detallada y sistematizada de las diferentes técnicas diagnósticas, con su base fisiopatológica e interpretación de resultados, facilitará su reproducción y puesta a punto. Con el paso de los años, este Manual ha demostrado también su utilidad para el médico general, ya que le introduce en el campo de la exploración directa de la sangre y m édula ósea, aspectos escasamente considerados en el currículo universitario para obtener el grado de Medicina. Los Autores

Agradecimientos Esta obra ha sido realizada en parte gracias a diversas ayudas a la investigación, es­ pecialmente del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS), del Ministerio de Educación (CAYCIT y MCyT) y de la C om unidad Europea (Health Program o f the European Union). Asimismo, queremos expresar nuestro agradecimiento a la colaboración que nos ha prestado el Dr. Josep M .a Ribera Santasusana en la descripción de aspectos morfológicos especiales de los leucocitos («Características morfológicas especiales de las células sanguíneas: el cuerpo Y», capítulo 2, pág. 57), y a las técnicos de laboratorio de eritropatología M ontserrat Corbella y Pilar Gómez por su ayuda en la preparación de algunos de los capítulos.

Indice de capítulos 1

La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes /. L. Vives Corrons

1

2

Las células sanguíneas 30 /. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte

3

Examen morfológico de las células sanguíneas J. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte

4

Métodos para el recuento manual de las células sanguíneas J. L. Vives Corrons y M.aA. Pujades

5

Métodos para el recuento automatizado de las células sanguíneas J. L. Vives Corrons

6

Hemoglobina 154 J.L. Vives Corrons y M.a A. Pujades

7

Eritrosedimentación y otras propiedades físicas J. L. Vives Corrons y C. Piera Peña

8

Métodos para el estudio de la médula ósea /. L. Aguilar i Bascompte y M. Díaz-Ricart

9

Funcionalismo granulocitario y métodos de estudio citoquímico /. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte

10

Métodos inmunológicos en hematopatología N. Villamor

11

Métodos citogenéticos en hematopatología 288 V. Adema, M. Mallo, A. Puiggrós, M. Salido, B. Espinety F. Solé

12

Métodos de biología molecular en hematopatología D. Colomer

13

Métodos para la clasificación de las hemopatías malignas /. F. Nomdedéu

14

Métodos para la clasificación y el diagnóstico de las anemias /. L. Vives Corrons

15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y el exceso de hierro M. Sánchez y J. L. Vives Corrons

16

Métodos para el diagnóstico de la anemia megaloblástica A. Remacha y J. L. Vives Corrons

17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasemias M. M. Mañú Pereira y J. L. Vives Corrons

18

Métodos para el diagnóstico de las membranopatías eritrocitarias M. L. Ribeiro, I. Besson y J. L. Vives Corrons

19

Diagnóstico de las eritroenzimopatías M.aA. Pujades y J. L. Vives Corrons

59 105 125

179

202 232

262

322 337 366 390

434 452 496

536

XV

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xvi

ín d ice de capítulos

20

Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios E. Muñiz-Díaz, N. Nogués, R. Montero y C. Canals

21

Métodos para el diagnóstico de las citopenias inmunes 623 E. Muñiz-Díaz, C. Canals, R. Montero, E. Martínez y C. Martín-Vega

22

Hemostasia y trombosis. Conceptos básicos /. Fontcuberta y M. Borrell

23

Métodos para el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos y trombofilia M. Borrell, I. Tirado y J. Fontcuberta

24

Identificación de hemoparásitos en sangre periférica R. Navarro García

25

La calidad en el laboratorio de hematología /. Miró y J. L. Vives Corrons

Indice alfabético

587

665 691

740

758

783

Incluye contenido web: • Preguntas de autoevaluación a todos los capítulos • Galería de imágenes • Galería extra de imágenes: Atlas de citología básica para el laboratorio clínico. • Vídeos (Loa Loa, Mansonella perstans, Oncocerca volvulus, Trypanosoma cruzi).

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La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes Hematocrito e índices eritrocitarios J. L. Vives Corrons

LA SANGRE. CARACTERÍSTICAS GENERAT ES La sangre es un tejido líquido que circula perm anentem ente por el sistema vascular; está formado por vasos sanguíneos de diverso calibre y en íntimo contacto con todas las células del organismo. Ello es posible gracias a las contracciones del corazón, la re­ tracción de los grandes vasos, el movimiento muscular y la fuerza de la gravedad. Gracias al sistema vascular, la sangre puede realizar importantes e imprescindibles funciones para la supervivencia de los tejidos. En ellos, el sistema vascular se ramifica y disminuye progresivamente su calibre hasta constituir lo que se denom ina «microcirculación», formada principalmente por capilares (sistema capilar) y vasos de muy pequeño calibre. Las paredes de los capilares perm iten el intercambio de agua y de sustancias diversas entre el interior del sistema vascular y los tejidos del organismo, con ello se facilita la oxigenación y el metabolismo celular (fig. 1-1). La sangre tiene dos componentes fundamentales y bien diferenciados: las células y el plasma que, junto al sistema vascular, constituyen el llamado «sistema sanguíneo». Las células constituyen aproximadamente el 45% del volumen total de la sangre, porcentaje que se conoce con el nom bre de valor hematocrito y confieren a la sangre su carácter espeso. Todas ellas derivan de una única célula progenitora presente en la médula ósea, llamada célula madre germinal o totalmente indiferenciada (stem-cell), que puede ser de tres tipos concretos muy diferentes entre sí, tanto desde el punto de vista morfológico como estructural y funcional: eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Cuando envejecen, las células de la sangre son eliminadas de la circulación por los macrófagos del sistema mononuclear fagocítico (SMF) presentes en la m édula ósea, pero también en el bazo y el hígado. Los eritrocitos son el componente celular más abundante, carecen de núcleo y organelas citoplasmáticas, y su única misión es el transporte de la hemoglobina a lo largo del sis­ tema vascular con el fin de garantizar la oxigenación de los tejidos (función respiratoria). Los leucocitos se clasifican en tres subtipos: granulocitos, linfocitos y monocitos. Todos ellos tienen una función defensiva. Los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) la llevan a cabo mediante fagocitosis o ingestión de las sustancias extrañas al organismo (formación de pus); los linfocitos, mediante un proceso de inmunidad al producir anticuerpos contra las sustancias extrañas al organismo (inmunidad humoral) o actuando directamente sobre las mismas (inmunidad celular). Los monocitos, aunque fundam entalm ente tienen una función fagocítica (sangre) y m acrofágica (tejidos), intervienen también en el proceso de inmunidad m odulando algunas de sus etapas.

2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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2

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGU RA 1-1. Esquema de la microcirculación sanguínea.

Las plaquetas son fragmentos de unas células presentes en la médula ósea llamadas megacariocitos. Tienen forma ovalada o redondeada, no tienen núcleo y son las células sanguíneas más pequeñas. Debido a su capacidad para agregarse constituyen el prim er tapón hemostático en caso de hemorragia. Contienen en su interior varias sustancias que intervienen en la coagulación de la sangre (factores de coagulación), cuya misión es prevenir la extravasación de sangre y contribuir a la coagulación sanguínea, impres­ cindible para el cese de la hemorragia. El plasma es un componente líquido transparente de color ambarino en el que se hallan suspendidas las células. Constituye, aproximadamente, un 55% del volumen total de la sangre y está formado por un 90% de agua y un 10% de sustancias sólidas que se encuentran disueltas en el agua. Entre estas destacan las siguientes: • Glúcidos (glucosa). • Lípidos (colesterol, triglicéridos, etc.). • Proteínas (albúmina, globulinas, fibrinógeno, etc.). • Electrólitos (iones sodio, potasio, calcio, cloruro, etc.). • Sustancias reguladoras (vitaminas, enzimas, hormonas). • Productos de desecho (ácido úrico, urea, creatinina, bilirrubina, etc.). Como puede apreciarse, estas sustancias son de naturaleza m uy diversa, aunque entre todas ellas destacan las proteínas que, vertidas al plasma por diferentes células de los tejidos a través de mecanismos diversos (excreción, exocitosis y recambio celular), tienen en su mayoría funciones muy concretas, como por ejemplo: catálisis (enzimas), defensa (inmunoglobulinas y complemento), transporte (transcobalamina, ceruloplasmina, transferrina), endocrina (hormonas) o hemostasia (factores de la coagulación), entre otras. El plasma contribuye, también de forma muy importante, a la regulación del pH y el transporte de gases respiratorios (oxígeno y dióxido de carbono). La sangre realiza múltiples funciones y de todas ellas, las más importantes son las siguientes: • Función respiratoria: transporta oxígeno ( 0 2) desde los pulmones hasta las células de los distintos tejidos, y el anhídrido carbónico o dióxido de carbono (C 0 2), desde estas hasta los pulm ones, donde es eliminado. Esta función es realizada en gran medida, por la hemoglobina.

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Capítulo 1

La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes

3

• Función nutritiva: vehiculiza sustancias nutritivas, absorbidas tras la digestión y procedentes de los alimentos, hasta las células que las precisan. • Función hormonal: transporta las diversas secreciones hormonales desde las glán­ dulas que las producen hasta los órganos donde actúan (órganos diana). • Función excretora: conduce los productos de desecho resultantes del catabolismo celular hasta los órganos donde son eliminados, fundamentalmente los riñones. • Función reguladora de la temperatura corporal: distribuye el calor a lo largo de todo el organismo. • Función de mantenimiento del volum en intersticial: conserva inalterado el vo­ lumen del líquido contenido en el compartimento existente entre las células de los tejidos (intersticio celular). • Función de mantenimiento del pH a 7,4: contribuye al equilibrio entre las sustancias de carácter ácido y las de carácter básico o alcalino. • Función defensiva: protege al organismo de las infecciones. Esta función es desempe­ ñada por los leucocitos y por algunas sustancias presentes en el plasma (anticuerpos y componentes del complemento). Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B. • Función hemostática: junto a las plaquetas, contribuye al cese de la hemorragia en caso de lesión vascular mediante diversas sustancias denominadas genéricamente factores de la coagulación (fibrinógeno, protrombina, etc.).

COMPONENTES DEL PLASMA. VALORES DE REFERENCIA El estudio de la bioquímica plasmática constituye hoy en día, un importante capítulo del laboratorio clínico general, y un complemento indispensable del diagnóstico. Resulta, por tanto, de gran valor conocer los límites de referencia de las sustancias presentes en el plasma, ya que constituyen un elemento de juicio para dem ostrar la presencia de determ inados trastornos del organismo o para confirm ar el diagnóstico de muchas enfermedades. Actualmente, gracias a Internet existe una oferta tan amplia sobre valores de referencia o interpretación de las variaciones de los constituyentes plasmáticos que muchas veces resulta difícil realizar la elección más adecuada o correcta. Igualmente, las referencias bibliográficas son tan extensas que la búsqueda de información útil conlleva un impor­ tante consumo de tiempo. A ello hay que añadir las recientes recomendaciones sobre term inología y unidades para la expresión de las m agnitudes biológicas realizadas por sociedades internacionales relacionadas con las ciencias del laboratorio clínico como, por ejemplo, las sociedades International Union o f Pure and Applied Biochemistry (IUPAC) e International Federation o f Clinical Chemistry (IFCC). Todos los aspectos relacionados con su variabilidad fisiológica, iatrogénica o patológica, así como las recomendaciones internacionales sobre su nom enclatura y valores de referencia pueden ser consultadas en el códex del laboratorio clínico. En la tabla 1-1 se desarrolla una lista, no exhaustiva, de las principales sustancias que se hallan en el plasma; la gran mayoría son ampliamente utilizadas para el diagnóstico clínico, motivo p or el que se conocen como pruebas generales de bioquím ica plas­ mática. En general, la m edida de su concentración se realiza a partir del suero, que es el plasma desprovisto de fibrinógeno y factores de la coagulación. El suero se obtiene de sangre coagulada y resulta más práctico que el plasma como material para el es­ tudio de la bioquímica plasmática. En la tabla se indican los valores de referencia de cada una de estas sustancias en unidades clásicas o convencionales y en unidades del sistema internacional (SI).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 1-1. Principales componentes del plasma y valores de referencia

a j-antitripsina a-fetoproteína Ácido ascórbico (vitamina C) Ácido hidroxibutírico Ácido láctico (lactato) Ácido úrico (urato) Ácidos grasos libres Adrenalina Alanina-aminotransferasa (ALT, SGPT) Albúmina Aldolasa Aldosterona (adultos sentados) Amilasa pancreática Amonio Angiotensina (ECA) Antígeno carcinoembrionario: - CEA 12-5 - CEA 15-3 - CEA 19-9 Antígeno prostético específico (PSA): - Hombres < 40 años - Hombres > 40 años - Mujeres Antitrombina III (inmunológica) Aspartato-aminotransferasa (AST, SGOT) Bicarbonato Bilirrubina: - Total - Conjugada Calcio Calcio (iónico) Calcitonina Carboxihemoglobina Carotenoides Ceruloplasmina 17-cetosteroides (orina): - Hombres - Mujeres Cinc Citrato Cloruro Cobre Colesterol: - Deseable - Límites elevados -Alto Colesterol-HDL Colesterol-LDL: - Deseable - Límites de riesgo - Alto riesgo

Unidades clásicas

Unidades internacionales

Factor de conversión

150-350 mg/dl 0-20 ng/ml 2-21 mg/dl 50 cromosomas) • Múltiples anomalías cromosómicas • Transformación con marcada basofilia: i(17)(ql0) Transformación linfoide (20% de los casos) • Evolución cromosómica en el 10-50% de los casos • Ph variante, cromosoma extra Ph, trisomía 8 , trisomía 19 • Pérdida del cromosoma Y, i(17)(ql0)

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Respecto a la LMC Ph negativa, los estudios moleculares y citogenéticos han demos­ trado que cursa con alteraciones moleculares evidentes con las técnicas de genética molecular, por lo que su prevalencia real se ha reducido al mínimo. Neoplasias mieloproliferativas Ph negativas Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) Ph negativas clásicas comprenden la trom bocitemia esencial (TE), la policitemia vera (PV) y la mielofibrosis prim aria (MFP). A diferencia de la LMC, estas neoplasias no presentan una alteración citogenética caracterís­ tica. No obstante, se ha descrito que la presencia de mutaciones adquiridas en el gen JAK2 tiene un papel relevante en el diagnóstico de estas entidades. El estudio mutacional se centra en la detección de la mutación JAK2 V617F (exón 14), que se detecta en un 95% de los casos de PV y en un 50-60% de casos de TE y MFP. Por otra parte, en un 3% de las PV se detectan mutaciones en el exón 12 del gen JAK2. Otras de las mutaciones descritas afectan a los genes MPL, TET2, ASXL1, CBL, IDH1, IDH2 e IKZF1.

Síndromes mielodisplásicos La frecuencia de detección de alteraciones cromosómicas en los síndromes mielodis­ plásicos (SMD) varía entre un 30 y un 50%, según las series presentadas. El hecho de que se observen alteraciones cromosómicas aporta la idea de que estos síndromes representan verdaderas neoplasias. Las alteraciones cromosómicas más frecuentes son: deleción del brazo largo (q) del cromosoma 5 (5 q - o del(5q)), m onosomía 7 (-7), deleción 7q (7 q - o del(7q)) y trisomía 8 (+ 8 ), todas ellas muy frecuentes en las leucemias agudas mieloides (LMA) (cuadro 11-3). La alteración citogenética 5 q - es la más frecuente. Además, es remarcable por estar asociada, en ocasiones, con una entidad clínica muy concreta, conocida como SMD con deleción aislada de 5q (clasificación de la Organización Mundial de la Salud [OMS] 2008). Las características que presentan estos pacientes son: anemia refractaria con o sin otras citopenias y/o trombocitosis y la deleción 5q aparece como única alteración citogenética. El porcentaje de blastos es inferior al 5% en médula ósea e inferior al 1% en sangre periférica y sin presencia de bastones de Auer. El térm ino «síndrome 5q—» se restringe para un subgrupo de casos con anemia macrocítica, recuento de plaquetas normal o elevado, así como hipoplasia eritroide en médula ósea. Aunque no se ha demostrado el gen responsable de la patogénesis de la del(5q), varios autores han descrito posibles genes candidatos. El más destacado es RPS14 (codifica para una subunidad ribosómica). El resultado citogenético, independientemente del subgrupo, tiene un valor pronós­ tico. Es por ello que en 1997 se describe por prim era vez un índice pronóstico conocido como International Prognostic Scoring System (IPSS), actualm ente vigente para la clasificación pronostica de los SMD. Este índice define cuatro categorías pronósticas a partir de tres variables: porcentaje de blastos en médula ósea, núm ero de citopenias y cariotipo. Este último se subdivide en tres grupos pronóstico: 1. Bueno: cariotipo normal, del(5q), del(20q), -Y como única alteración. 2. Malo: cariotipo complejo con tres o más alteraciones y alteraciones del cromo­ soma 7. 3. Intermedio: incluye el resto de alteraciones. En el año 2012 se publicó una nueva categorización pronostica citogenética que incluía cinco categorías:

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

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CUADRO 11-3. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en los síndromes mielodisplásicos

Alteraciones más frecuentes • del(5q) • -7/del(7q) •

+8

Alteraciones menos frecuentes • del(1 2 p) • i(17)(ql0)/del(17p) • del(20)(qllql3) • -Y • -13/del(13q) • del(9)(ql3q22) • idic(X)(ql3) • t( 11;16) (q23;p 13) • t(3;21)(q26;q22) • t(l;3)(p36;q21) • t(2; 11) (p21;q23) • inv(3)(q21q26) • t(6;9)(p22;q34) • der(l;7)(pll;pll) • t(3;17)(q26;q22) • t(l I;2 1 )(q2 2 ;q2 1 ) •

+21

• + lq • +11

• +13 • -18

1. Muy bueno: alteración única de del( 1lq) o -Y. 2. Bueno: cariotipo normal, alteración única de der(l;7), del(5q), del(12p), del(20q) y alteraciones dobles con del(5q). 3. Intermedio: alteraciones únicas de del(7q), + 8 , i(17q), +19, +21, otras alteraciones únicas y otras alteraciones dobles. 4. Malo: alteración única de der(3)(q21q26) o -7 , cariotipo complejo con tres alteraciones y alteraciones dobles con - 7 o del(7q). 5. Muy malo: cariotipo complejo con más de tres alteraciones. 6 . Sobre la base de la nueva categorización, se ha definido el nuevo IPSS, en el que destaca el mayor peso pronóstico del resultado citogenético.

Leucemia mieloide aguda La clasificación inicial de la leucemia mieloide aguda (LMA) por el grupo cooperativo de la FAB (francoam ericano-británico) estableció ocho categorías m orfológicas (M0-M7) (tabla 11-2), basadas en características citológicas, inmunológicas o clínicas. Posteriorm ente, se elaboró la clasificación M IC, en la que se combina la clasificación FAB con datos citogenétícos. Actualmente, esta clasificación ha sido sustituida por la clasificación de la OMS, que da gran im portancia a las alteraciones citogenéticas, que son una característica indispensable para la definición de algunas entidades. El análisis

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 11-2. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en las leucemias agudas mieloides Subtipos

Citogenética

M0-M1

5q- o -5; 7q- o -7 Ph Deleción 3p y translocación con el 3 en 3q21 o 3q26 +21 +8 t(8;21)(q22;q22) 5q- o -5; 7q- o -7 del 3p e inv(3)(q21q26) t(6;9)(p22;q34) asociado a basofilia en médula ósea Ph +8 t( 15; 17) (q22;q21) i(17)(ql0) 5q- o -5; 7q- o -7 inv(16)(pl3q22), 16q- o t con 16(q22), asociado a eosinofilia en médula ósea t(6;9)(p22;q34) t(v;ll)(v;q23) +8 Ph +4 t(9;ll)(p22;q23) [M5a] t(v;ll)(v;q23) [M5a] t(8;16)(pll;pl3), asociado a eritrofagocitosis +8 5q- o -5; 7q- o 7 —3 y t(3;v)(q21 o q26) dup(l) +8 inv(3)(q21q26) o del(3) +8 +21

M2

M3 M4

M5

M6

M7

citogenético en el mom ento del diagnóstico de una LMA se considera el factor pronós­ tico más establecido y ampliamente utilizado en la práctica clínica, siendo capaz de estratificar a los pacientes con LMA en riesgo citogenético favorable, intermedio y alto. De esta forma, la clasificación de la OMS establece cinco grandes categorías, una de ellas engloba entidades con alteraciones citogenéticas recurrentes:

Leucemia mieloide aguda con translocaciones equilibradas/inversiones • • • • • • •

LMA con t(8;21)(q22;q22); (RU NX1/RU NX1T1). LMA con inv(16)(pl3q22) o t(16;16)(pl3;q22); CBFB-MYH11. Leucemia aguda promielocítica con t(15;17)(q22;ql2); PML-RARA. LMA con t(9; 11) (p22;q23); MLLT3-MLL. LMA con t(6;9)(p22;q34); DEK-NUP214. LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1. LMA (megacarioblástica) con t(l;2 2 )(p l3 ;q l3 ); RBM15-MKL1.

Leucemia mieloide aguda con mutaciones genéticas Los genes afectados son principalm ente FLT3 y NPM1 y, de form a menos com ún, CEBPA, KIT, MLL, WW T1, NRAS, KRAS, IDH1 e IDH2.

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Capítulo 11

Métodos citogenéticos en hematopatología

299

Respecto a los cambios cromosómicos específicos, la translocación t(8;21)(q22;q22), que genera la fusión de los genes RUNX1-RUNX1T1, es el cambio más frecuente en la M2. Esta anomalía se asocia a la presencia de mieloblastos grandes en la médula ósea con signos de maduración y con bastones de Auer en el citoplasma. Es frecuente la aparición de alteraciones adicionales a la t(8;21) como la pérdida de un cromosoma sexual (X o Y) o la deleción de 9q. Este subgrupo se caracteriza por tener una buena respuesta a la terapia, largas remisiones y supervivencia relativamente larga. No obstante, formas con mutaciones en el gen K IT o expresión de CD56 se asocian a peor pronóstico. Las LMA con inv( 16) (p 13q22) o t( 16; 16) (p 13;q22) y reordenamiento CBFB/MYH11 se asocian a la M4 con eosinofilia medular (M4Eo). En general, la detección de este cambio cromosómico se relaciona con un buen pronóstico y buena respuesta a la terapia. La presencia de un cariotipo complejo o monosómico no parece empeorar el pronóstico de estos pacientes. La mayoría de las LMA promielocíticas presentan la t(15;17)(q22;ql2), aunque se ha descrito un subgrupo de casos con translocaciones variantes implicando el gen RARA (17q22). Este tipo de leucemia es sensible al tratamiento con ácido transretinoico (ATRA), lo que conlleva a que actualmente sea una entidad de buen pronóstico. La t(9;l I)(p22;q23) se ha encontrado en el 30-40% de los casos con subtipo FAB M5; la trisomía 8 es la alteración secundaria más frecuente y sin influencia en la supervivencia. La implicación de llq 2 3 es más frecuente en niños que en adultos. Esta translocación también se observa en una baja frecuencia en M4, y muy excepcionalmente en M2 con componente monocítico. Una alteración cromosómica frecuente en el grupo de las LMA es la implicación del cromosoma 3 en las bandas 3q21 y 3q26, que en estos casos se relacionan con un número de plaquetas superior al normal. Es una entidad con un comportamiento agresivo y de corta supervivencia. Los pacientes con una LMA y cariotipo normal o aquellos con alteraciones no clasificables en los grupos pronósticos constituyen lo que se conoce como grupo de riesgo citogenético intermedio. En este subgrupo de pacientes es de utilidad el empleo de marcadores moleculares específicos.

Leucemia linfoblástica aguda B En la leucemia linfoblástica aguda B (LLA-B) los estudios citogenéticos se han visto frena­ dos debido a la mala calidad de los cromosomas, los cuales aparecen muy condensados y con aspecto deshilacliado. De la misma forma que las LMA, la clasificación de las LLA-B ha evolucionado a lo largo del tiempo. Mientras que la clasificación morfológica de la FAB identificaba tres categorías (LI, L2 y L3), la nueva clasificación de la OMS 2008 ha definido nuevas entidades basándose en la presencia de alteraciones citogenéticas es­ pecíficas. Las alteraciones más frecuentes se muestran en el cuadro 11-4. La t(9;22), que implica los genes BCR y ABL, se relaciona con un pronóstico muy grave. No obstante, el tratamiento con imatinib ha aumentado la supervivencia libre de evento en estos pacientes. Respecto a las translocaciones que afectan llq 2 3 , la más frecuente es la t( 4 ;ll) (q21;q23) y se asocia a un mal pronóstico. Su incidencia es especialmente alta en niños menores de 1 año, en los cuales la incidencia llega al 50%, y se relaciona a un pronóstico m uy desfavorable. Esta translocación tam bién se ha observado en casos con células blásticas mieloides y en la LMA. O tra translocación frecuente en niños, es la t( 12;21) (p 13;q22), asociada a un pronós­ tico m uy favorable. Más del 90% de pacientes con dicha translocación alcanzan la remisión completa.

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300

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

CUADRO 11-4. Alteraciones cromosómicas en la leucemia linfoblástica aguda B

Alteraciones características de subtipos LLA-B según la OMS 2008 • t(9;22) (q34;ql 1.2); BCR-ABL1 • Reordenamiento del gen MLL: t(v;l lq23) • t(l2;2l)(pl3;q22);ETV6-RUNXl • Hiperdiploidía • Hipodiploidía • t(5;14)(q31;q32);IL3-IGH@ • t(l;19)(q23;pl3);TCF3-PBXJ Otras alteraciones en LLA-B • del(6 q) • Otras translocaciones en 14q32 • del(9p) • del(1 2 p) • t(17;19)(q22;pl3) Las alteraciones en la ploidía también han sido descritas en la LLA-B, aunque con pronóstico diferente. Mientras que las hiperdiploidías de más de 50 cromosomas tienen una buena respuesta a la terapia y el 95% sobrevive a los 30 meses del diagnóstico, las hipodiploidías presentan peor respuesta al tratamiento. La translocación t(l;1 9 )(q 2 3 ;p l3 ), m uy frecuente en la LLA, se relaciona con la presencia de blastos de inmunofenotipo pre-B. Es frecuente en niños y en adultos que suelen presentar un núm ero de leucocitos de 20-30 X 109/1. Aunque inicialmente se asociaba a mal pronóstico, los nuevos esquemas terapéuticos han permitido una mejora de la respuesta en este subgrupo de pacientes.

Síndromes linfoproliferativos crónicos Los síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC) engloban un grupo de entidades clínicas con una evolución y respuesta al tratamiento heterogénea, así como un pronós­ tico variable. Los SLPC de estirpe B representan cerca del 90% de los mismos y el resto son de estirpe T. La mayoría de los SLPC-B y una m inoría de los T se caracterizan por translocaciones cromosómicas recurrentes que se encuentran implicadas en el inicio o la progresión de los mismos, como consecuencia de la yuxtaposición del receptor de las inm unoglobulinas o el receptor T con un protooncogén de otros segmentos crom osóm icos, lo que da como resultado la desregulación del m ism o. El estudio de estos procesos es fundam ental para el diagnóstico, el establecimiento de factores pronósticos y el estudio de enfermedad m ínim a residual.

Leucemia linfática crónica En la leucemia linfática crónica (LLC) el problema principal que existe a nivel de su estudio citogenético es que los linfocitos B leucémicos responden poco a los mitógenos habitualmente usados. A pesar de esto, la utilización de distintas sustancias estimulantes de la división de estas células (PHA, mitógeno de fitolaca [PWM], lipopolisacárido de E. coli [LPS], virus de Epstein-Barr [EBV], acetato de tetraforbol éster [TPA]...) ha permiti­ do observar alteraciones cromosómicas en alrededor del 50% de los casos (cuadro 11-5). La utilización de nuevos mitógenos como el ligando de CD40 u oligonucleótidos CpG con interleucina 2, mejora el crecimiento de las células de la LLC en cultivo, permitiendo una tasa de detección de anomalías cromosómicas de hasta el 80% de los casos.

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

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CUADRO 11-5. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en la leucemia linfática crónica • +12

• • • • • • • • • • •

del(13)(ql4) del(ll)(q22q23) del(6)(q21q23) i(17)(ql0), del(17)(pl3) t(2; 14) (p 13;q32) ty del 5pl5-pl3 14q+oadd(14)(q32) t(13;14)(q22;q32) t(14;17)(q32;q23) t(14;19)(q32;ql3) del(14)(q22q24)

La afectación de la región 13ql4 (en forma de deleción o translocación) representa la alteración cromosómica más frecuente, que se detecta en el 55% de los pacientes con la técnica de hibridación in situ fluorescente en interfase (FISH). También se detectan deleciones en Ilq22-q23 (18%) y trisomía del cromosoma 12 (+12), que representa la alteración citogenética más característica de la LLC-B mediante estudios citogenéticos convencionales, aunque pasa a representar solo el 15% de los enfermos si se aplican técnicas de FISH interfásica. Las deleciones en 6q21-23 y en 17pl3 (donde se localiza el gen TP53) se detectan en menos del 10% de los pacientes afectos de LLC. Los estudios citogenéticos moleculares realizados en la LLC han demostrado que la afectación de 14q32 es mucho menos frecuente de lo que se había pensado partiendo de los estudios citogenéticos convencionales. Dicha alteración aparece en, aproximadamen­ te, el 5% de las LLC, principalmente en forma de translocación t(2;14)(pl3;q32), t(14;14) (q32;q21), t(14;17)(q32;q23), t(14;18)(q32;q21), t(14;22)(q32;ql 1) y t( 14; 19) (q32;ql3). Respecto al valor pronóstico de las alteraciones cromosómicas en la LLC, en general se observa que: • Se establecen tres grupos pronósticos según la alteración citogenética detectada por técnicas de FISH utilizando las sondas para 1lq 2 3 ,1 2 ,13ql4 y 17pl3: • Bueno: del(13)(ql4). • Intermedio: +12 y cariotipo norm al (sin alteraciones de las 4 sondas de FISH). • Malo: del(ll)(q23) y del(17)(pl3), que se asocia a progresión de la enfermedad y corta supervivencia. • Los pacientes con un cariotipo complejo (más de tres alteraciones cromosómicas) tienen un pronóstico más desfavorable que el resto. Linfomas no hodgkinianos El linfoma folicular (LF) se caracteriza citogenéticamente por la presencia de la trans­ locación t(14;18)(q32;q21) en el 80-90% de los casos. Esta translocación se asocia a una desregulación del oncogén BCL-2 en la mayoría de los casos, como consecuencia de la yuxtaposición de una de las regiones JH del gen de la cadena pesada de las in­ munoglobulinas (IGH@) en 14q32 con una región no codificadora del gen BCL-2 en 18q21. La trisomía parcial de los cromosomas 2, 3, 7,12,18 y 21 y las deleciones en los cromosomas 6 q y 17p se asocian a formas clínicas más agresivas, y estas últimas son las que presentan un factor pronóstico adverso independiente en los análisis multivariantes. La transformación histológica del LF a linfoma difuso de célula grande se asocia con

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Enfermedad

Alteración

Gen

Linfoma folicular Linfoma del manto Linfoma de Burkitt

t(14;18)(q32;q21) t(ll;14)(ql3;q32) t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(pl2;q24) t(8;22)(q24;qll) t(3;v)(q27;v) +3 t(l I;18)(q21;q21) t(l;14)(p22;q32) t( 14; 18) (q32;q21) t(3;14)(pl4;q32) del(7)(q32) +3q t(2;5)(p23;q35)

IGH@/BCL2 IGH@/CCND1 IG H@ /M YC IGK@ /M YC IGL@ /MYC BCL6

Linfoma diíuso de célula grande Linfoma marginal extranodal tipo MALT

Linfoma esplénico de la zona marginal Linfoma anaplásico de célula grande

A PI2/M ALT1 IGH@/BCL10 IGH@ /MALT1 FOXPl/IG H@

N P M /A L K

amplificaciones en lp, 6 p, 8 q y 1 2 q; así como con la translocación t( l ; 2 2 )(q 2 2 ;ql 1 ), deleciones homocigotas de 9p21 (genes CDKN2B y CDKN2A) y mutaciones de TP53 y BCL2 (tabla 11-3). El linfoma de B urkitt (LB) se caracteriza citogenéticamente p o r la presencia de la translocación t( 8 ; 14) (q24;q32) en el 80% de los casos. Otras dos alteraciones variantes, la translocación t(8;22)(q24;ql 1) y t(2;8)(pll;q24), se identifican en el 15 y el 5% de los casos, respectivamente. Estas translocaciones se asocian a una desregulación del gen M YC (8q24), como consecuencia de la fusión de este oncogén con el gen IGH@ en 14q32, o con los genes de las cadenas ligeras k (IGK@) en 22ql 1 o X (JGL@) en 2pl 1. El LB suele presentar otras alteraciones citogenéticas secundarias, como la duplicación de lq, del(6 q) y del(17p). La inactivación del gen TP53 por deleción o m utación se detecta en un 30-60% de los LB y se asocia con la progresión tumoral (v. tabla 11-3). El linfoma del manto (LM) se caracteriza citogenéticamente por la translocación t(ll;1 4 )(q l3 ;q 3 2 ) que se observa en el 70% de los casos mediante citogenética con­ vencional y en más del 95% de los casos mediante hibridación in situ fluorescente. Esta translocación es la causante de un aum ento de la expresión de la ciclina D 1 (más del 95% de los casos) como consecuencia de la desregulación del gen codificante para esta, CCND1, debido a una yuxtaposición con el gen IGH@ en 14q32. Es destacable que un 5% de los LM no presentan la t( 11; 14) ni sobreexpresión del gen CCND1. El 50% de estos casos m uestran reordenamientos del gen CCND2 (12pl3). El empleo de técnicas de hibridación in situ e hibridación genómica com parada ha perm itido detectar la presencia de aberraciones cromosómicas adicionales en la m ayoría de los casos; las más frecuentes son las pérdidas de m aterial genético en lp , 6 q, 8 p, 1lq y 13q, y ganancias en 3q, 8 q y 7p. En casos con morfología blastoide tam bién se han observado amplificaciones de los genes: M Y C en 8 q, D M I-I en lOp, C D K4en 12qy BCL-2 en 18q. Las deleciones délos cromosomas llq 2 3 y 13ql4 en el LM se detectan en un porcentaje similar a la LLC y m ucho más frecuente que en otros SLPC-B. La deleción de 17pl3 se observa generalmente en formas blásticas y se asocia a refractariedad al tratam iento y supervivencia corta. La elevada expresión de Ki67 es un factor pronóstico adverso en la evaluación de la enfermedad, así como el grado de complejidad del cariotipo. Se han observado deleciones en el cromosoma 8 p en el 83% de los LM leucemizados que sugieren la presencia de un gen relacionado con el

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

303

inicio de la enfermedad. Además, se han descrito dos formas de LM leucemizado con distinto com portam iento clínico: uno con m orfología prolinfocitoide, expresión de CD38, deleción de TP53 y amplificación de M Y C que se com portaría de form a más agresiva, y otro con morfología clásica, CD38 negativo, ausencia de alteraciones en TP53 y M Y C y evolución clínica más indolente (v. tabla 11-3). Los linfomas de la zona marginal (nodales, MALT o esplénicos) son un grupo de SLPC con características clínicas, histológicas, inmunológicas y genéticas propias. Las alteraciones citogenéticas más frecuentes asociadas a los linfomas nodales de la zona marginal son las trisomías 3,7 y 18. Las translocaciones asociadas con los linfomas de la zona marginal extranodal no se detectan. Los linfomas M A LT (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue) extranodales presentan alte­ raciones genéticas en cerca del 60% de los casos, donde la translocación t( 1 1 ; 18) (q2 1 ;q2 1 ) con la formación del gen de fusión API2/MALT1 es la alteración estructural más frecuente (30%). La expresión de este gen de fusión conduce a un incremento en la inhibición de la apoptosis. O tra alteración menos frecuente es la translocación t(l;14)(p22;q32) con des­ regulación del gen BCL-10 también implicado en el control de la apoptosis. La presencia concomitante de estas dos translocaciones se detecta en linfomas MALT avanzados. Las alteraciones genéticas más frecuentes del linfoma de la zona marginal esplénico son la trisomía 3 y las alteraciones estructurales del cromosoma 7q. Las deleciones en 7q31.3 se observan en el 40% de los casos. Se ha descrito que la ausencia de mutaciones de los genes IGHV@ junto a deleciones en 7q confieren un pronóstico clínico adverso en esta enfermedad (v. tabla 11-3). El linfoma difuso de células grandes B (LDCG-B) presenta, en más de un 30% de los casos, alteraciones de la región 3q27 que involucran el gen BCL6, que son las trans­ locaciones más comunes en esta patología. No obstante, un 20-30% de casos presentan la t( 14; 18) (q32;q21) típica de LE Además, los reordenamientos del gen M YC se observan en más del 10% de los pacientes. Se ha descrito que la presencia de dos o más de estas translocaciones en un paciente se asocia a un tipo de LDCG-B con características propias, las cuales se conocen como linfomas doble o triple hit.

Conclusión Los resultados citogenétícos son importantes porque no solo son indispensables para el diagnóstico de algunas hematopatías, sino también por su valor pronóstico. Aún existen muchas alteraciones cromosómicas que no se correlacionan con unas características clínicas determinadas. Por ello, es indispensable realizar un diagnóstico integrado con el fin de determinar la posible correlación entre el cambio cromosómico y el curso de la enfermedad. En los últimos años, la introducción de las técnicas de hibridación in situ ha re­ presentado un complemento importante para las técnicas citogenéticas convencionales. En aquellos casos en los que el índice mitótico de las células leucémicas es bajo (p. ej., en la LLC), y se quiere descartar una alteración numérica (p. ej., la trisomía 12), se puede utilizar una sonda centromérica del cromosoma que se quiere estudiar, y así se puede de­ terminar, sin la necesidad de realizar un cultivo celular ni obtener células en metafase, las copias que existen de un determinado cromosoma mediante el recuento de las señales de hibridación en los núcleos. En otros casos, si la calidad de los cromosomas y de las bandas no es satisfactoria, se pueden aplicar sondas de secuencia única o un conjunto de sondas para el «pintado» de un cromosoma en concreto, y determinar la existencia de una alteración cromosómica que mediante la citogenética convencional no se puede precisar.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Por otro lado, el desarrollo de técnicas moleculares ha introducido una nueva dimensión en el estudio y la comprensión del papel de los cambios cromosómicos en la génesis del tumor, por lo que los citogenetistas y los genetistas moleculares deben trabajar coordinados para aportar una mayor información sobre el origen y desarrollo del cáncer. La colabo­ ración entre la citogenética y la biología molecular es importante, ya que tiene el fin de determinar un mayor número de regiones genómicas que puedan ser candidatas a tener actividad oncogénica (tabla 11-4). La reciente introducción de las técnicas de secuenciación masiva del genoma está permitiendo avanzar en el conocimiento de las neoplasias hematológicas, y así definir los genes implicados en cada enfermedad y su valor pronóstico.

TABLA 11-4. Oncogenes, genes supresores de tumores y factores de crecimiento. Localización cromosómica y neoplasia asociada Oncogén

Punto de rotura

Neoplasia

RBM15 BCL10 NRAS TAL1 MPL ARNT TPM3 PBX1 BCL9 AF1 MAL IGK@ BCLUC REL ALK SF3B1 IDH1 PAX3 EVI1 BCL6 KIT AF4 TET2 NPM1 HISTH4F DEK MUM-1 MLLT4 FGFRIOP IKZF1 TCRG BCL7B ST7 TCRB EZH2 M OZ FGFR-1 ETO/MTG8 M YC

lpl3 lp22 lpl3.2 lp32 lp34 lq21 lq21.2 lq23 lq21 lq21.3 2cen-ql3 2pl2 2pl3 2pl3-12 2p23 2q33.1 2q33.3 2q35 3q26 3q27 4 q ll-q l2 4q21 4q24 5q35.1 6p22.1 6p22.3 6p25-p23 6q27 6q27 7pl3-pl 1.1 7pl5-pl4 7qll.23 7q31 7q34 7q35-q36 8pll 8p ll-p l2 8q22 8q24

PAX-5 CDKN2B

9pl3 9p21

LMAM7 t(l;22) LDCG-B, LLC, LNH MALT SMD, LMA LLA-T t(l;14) NMP LLAt(l;12) LACG LLApre-B t(l;19) LDCG-B, LLA LMA t(l;ll) L. mediastino SLPC-B Linfomast(2;14) L. mediastino LACG t(2;5) SMD NMP, SMD, LMA Rabdomiosarcoma t(2;3) SMD-LMA inv(3)(q21q26) LDCG LMA LLAt(4;ll) NMP, SMD SMD/ LMA/LACG t(2;5) LACG LMAbas. t(6;9) Linfomas, MM t(6;14) LLAt(6;ll) NMP t(6;8) NMP SLPC-T LNH Burkitt LEZM SLPC-T SMD LMA t(8;13) t(6;8), t(8;13), t(8;9), t(7;8), t(8;22) NMP LMA-M21(8;21) LB, LLA-L31(8;14) t(8;22), t(2;8) LLP t(9; 14)

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Capítulo 11

305

Métodos citogenétícos en hematopatología

TABLA 11-4. Oncogenes, genes supresores de tumores y factores de crecimiento. Localización cromosómica y neoplasia asociada (cont.) Oncogén

Punto de rotura

Neoplasia

CDKN2A AF9 JAK2 GAS1 ABL CAN HOX11 WT CCND1 API2 MLL PLZF BOB1

9p21 9p22 9p24 9q22 9q34 9q34 10q24 llp l3 llq l3 llq22 llq23 llq23 llq23

LLA, LMA-M5 t(9;ll) NMP LMA LMC, LLA, LMA LMA bas t(6;9) LLA-T T.Wilms LNH Manto LNH MALT LLA, LMA LMA M3 t(ll;17) LDCG

ATM CBL KRAS ETV6 BCL7A FIM RB FKHR FLT3 TCRA TCRD IGH@ BCL11B BCL8 PML IDH2 TLS MYH11 CBP CBFB MAF TP53 RARA BCL2 MALT1 E2A BCL3 CEBPA ASXL1 ERG IGL@ RUNX1T1

llq23 llq23.3 12pl2.1 12pl3 12q24 13ql2 13ql4 13ql4 13ql2 14qll 14qll 14q32 14q32 15qll 15q22 15q26.1 16pll 16pl3 16pl3 16q22 16q22-23 17pl3 17ql2 18q21 18q21 19pl3 19ql3 19ql3.1 20qll 21q22 22qll 22qll

BCR EWSR1 MKL1 TIMP1 MCF-2

22qll 22ql2 22ql3

LLC-B NMP LMA LLAt(12;21) LB RB, LLC Rabdomiosarcoma t(2;13) LMA, LLA SLPC-T SLPC-T SLPC-B LLA-T LDCG-B LMA con t( 15; 17) (M3) NMP, SMD, LMA LMA t(16;21) LMA con inv(16) (M4 Eo) LMA cont(8;16) (M4-M5) LMA con inv(16) (M4 Eo) MM LMA con t( 15; 17) (M3) LF t(14;18) LNH MALT LLA-B t(l;19) LNH t( 14; 19) LMA NMP LMA t(16;21) SLPC-B LMA M 2 1(8;21) LLAt(12;21) LMC, LLA, LMA t(9;22) Tumor Ewing t(l 1;22) y t(7;22) LMA con t(l;22) (M7) Xpl 1.3-11.23

Xq27

LACG, linfoma anaplásico de célula grande; LB, linfoma de Burkitt; LDCG-B, linfoma difuso de célula grande B; LEZM, linfoma esplénico de la zona marginal; LF, linfoma folicular; LLA, leucemia linfoblástica aguda; LLC, leucemia linfática crónica; LLP, linfoma linfoplasmocítico; LMA, leucemia mieloide aguda; LNH, linfoma n o hodgkiniano; RB, retinoblastoma; SLPC, síndrom e linfoproliferativo crónico; SMD, síndrome mielodisplásico.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU. FUNDAMENTO Y APLICACIONES EN NEOPLASIAS HF.MATOLÓGICAS Introducción La técnica de hibridación in situ (HIS) permite detectar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones cromosómicas, extensiones celulares, cortes de tejido y cortes ultrafinos utilizados para el estudio al microscopio. La utilización de las técnicas de HIS ha aumentado en los últimos años como complemento de las técnicas de citogenética convencional. La ventaja de la citogenética convencional radica en la visualización de todos los cromosomas, pero presenta varias limitaciones: es necesario que existan células en división y, en ocasiones, se pueden valorar pocas metafases (menos de 20). Por otra parte, los cromosomas pueden presentar unas bandas cromosómicas poco definidas, por lo que es imposible determinar el cariotipo debido a una calidad m orfológica deficiente. En este caso, no será factible la detección de alteraciones cromosómicas que afecten a regiones genéticas muy pequeñas. Para com­ plem entar las técnicas citogenéticas convencionales, actualmente disponemos de las técnicas de HIS (tabla 11-5). La base metodológica para la realización de dichas técnicas requiere de una des­ naturalización (rotura de los enlaces que unen la doble hélice del ADN) tanto del ADN de la muestra como del ADN de la sonda utilizada (que deberá ser complementario al fragmento de ADN que se desee estudiar). Posteriormente, se procede a hibridar los ADN de la muestra y de la sonda, de modo que se produzca la unión entre ambos por complementariedad de bases. El resultado de la hibridación se interpretará m icros­ cópicamente y teniendo en cuenta el tipo de sonda utilizada. Las etapas generales de la HIS se detallan en la figura 11-4. A principios de los años noventa, se introdujeron las técnicas de HIS en el laboratorio de hematología aplicadas en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de las neoplasias hematológicas. Los tipos de sondas aplicadas de forma rutinaria fueron las sondas centroméricas (que marcan toda la región centromérica), las sondas de pintado cromosómico (constituidas por una librería de sondas que abarcan todo el cromosoma) y las sondas de secuencia única (locus específico), que marcan regiones cromosómicas muy concretas (tabla 11-6). Nos referimos a ellas como sondas de HIS «convencionales» por ser de uso

TABLA 11-5. Ventajas y limitaciones de la técnica de citogenética convencional y de hibridación in situ Técnica

Ventajas

Limitaciones

Citogenética convencional

Aporta información de todos los cromosomas Bajo coste económico

Hibridación

Aplicable tanto sobre metafases como sobre núcleos en interfase Permite el análisis de un mayor número de células Mayor sensibilidad

Requiere células en división del clon neoplásico Interpretación dificultosa en caso de obtener cromosomas de mala calidad Permite el análisis de pocas células Baja sensibilidad Aporta información concreta dependiendo del tipo de sonda utilizada Alto coste económico

in situ

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Capítulo 11

Métodos citogenéticos en hematopatología

307

FIGU RA 11-4. Etapas de la técnica de hibridación in situ.

generalizado. Posteriormente, han aparecido nuevas tecnologías de HIS con el mismo fundamento y la intención de resolver las carencias de las sondas «convencionales» y aportar una mayor información en el conocimiento del cariotipo. Dichas metodologías comprenden la técnica de hibridación genómica comparada (HGC), Multicolor-FISH (M-FISH), Spectral Karyotyping (SKY) y Multibanding-FISH. Por otra parte, también existen una serie de técnicas que combinan la identificación celular con la HIS, de forma que permiten asociar una alteración cromosómica a un linaje celular concreto. Entre ellas destacan las técnicas de morfología-anticuerpo-cromosoma e hibridación in situ (MACHIS), May-Grünwald/Giemsa-hibridación in situ fluorescente (MGG-FISH) y fluorescence immunophenotyping and. interphase cytogenetics as a tool fo r investigation o f neoplasms (FICTION).

H ibridación in situ «convencional» La HIS «convencional», de aplicación más generalizada en el estudio de las neoplasias hematológicas, se basa en la utilización de tres tipos principales de sondas: sondas centroméricas, sondas de pintado cromosómico y sondas de secuencia única o también llamadas de locus específico. • Las sondas centroméricas están formadas por una secuencia repetitiva de ADN que híbrida con el ADN de la región centromérica del cromosoma. Estas permiten detectar

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 11-6. Tipos de sondas utilizadas en HIS «convencional». Visualización en metafase e interfase

Sondas centroméricas

Sondas de pintado cromosómico

I Sondas de secuencia única o de locus específico

alteraciones cromosómicas numéricas, tanto sobre metafases como sobre núcleos en interfase (citogenética interfásica). Mediante esta técnica se puede valorar la presencia o ausencia de alteraciones numéricas (monosomías o trisomías) sin la necesidad de tener células en división. • Las sondas de pintado cromosómico están formadas por una batería de sondas que en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten visualizar alteraciones citogenéticas numéricas y estructurales sobre metafases y confirm ar de forma inequívoca cariotipos con translocaciones complejas o con cromosomas marcadores. El pintado cromosómico es de gran utilidad cuando los cromosomas son de mala calidad y la citogenética convencional, sin embargo, p or sí sola, no puede resolver el cariotipo. • Las sondas de secuencia única o locus específico hibridan con el ADN de una región genómica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosómica. Con ellas es posible detectar alteraciones numéricas y estructurales, tanto en metafases como en núcleos interfásicos. Estas sondas son de gran utilidad para descartar alteraciones cromosómicas difíciles de identificar con las técnicas de bandeo convencionales, como translocaciones crípticas o microdeleciones. En la tabla 11-6 se refleja la visualización sobre metafases y núcleos en interfase de los distintos tipos de sonda aplicadas en HIS «convencional». En la tabla 11-7 se mues­ tran los tipos de sondas «convencionales» más utilizados en el estudio de neoplasias

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Capítulo 11

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Métodos citogenéticos en hematopatología

I TABLA 11-7. Sondas de HIS «convencional» más utilizadas en el estudio de neoplasias hematológicas Tipo de patología

Sondas centroméricas

Sondas de secuencia única

-7, +8

t(9;22) BCR/ABL t(8;21) AML/ETO t(15;17) PML/RARA 16pl3/inv(16) CBPB/MYH11 llq23 MLL 5q31,7q31,20ql2 4ql2 (PDGFRA), 5q33 (PDGFRB) t(9;22) BCR/ABL t(9;22) BCR/ABL llq23 MLL t(12;21) TEL/AML

LMA

SMD NMP LMC LLA

Hiperdiploidías

SLPC LLC

+12

LM LF LB LEZM LMN y LMALT

+3 +3,+18

llq23 ATM 13ql4D13S319 17pl3 TP53 t( 11; 14) IGH@/CCND1 t(14;18) IGH@/BCL2 t(8;14) IGH@/MYC 7q32,3q27 (BCL6)l7pl3(TP53) t(14;18) IGH@/MALT1, t(l 1;18) API2IMALT1, lp22 (BCL10) ALK (2p23) 17pl3, TP53 14q32 IGH@ t(4;14) FGFR3/IGH@ t(14;16) MAF/IGH@

LACG MM

Para las abreviaturas véase la tabla 11-4.

hematológicas. En la tabla 11-8 se resumen las recomendaciones respecto al número de células a analizar, los individuos controles a realizar y los niveles de corte para las sondas centroméricas, de locus específico y de pintado cromosómico.

O tras técnicas de hibridación in situ Las técnicas de Multicolor-FISH (M-FISH) o Spectral Karyotyping (SKY), Multibanding-FISH e hibridación genómica comparada (HGC) aparecieron con la intención de resolver las carencias de la HIS «convencional» y aportar una mayor información en el conocimiento del cariotipo. Las técnicas M -FISH o SKY se basan en la cohibridación de 24 sondas de pintado crom osóm ico m arcadas co m binatoriam ente con diferentes fluorocrom os sobre metafases. El resultado de la hibridación permite visualizar simultáneamente cada par cromosómico de un color diferente. Estas técnicas son m uy útiles para determ inar de form a inequívoca cariotipos complejos y crom osom as no identificables con las técnicas de bandeo (cromosomas marcadores). Esta técnica presenta una limitación en aquellas patologías con un índice proliferativo bajo debido a la necesidad de analizar células en división. Estas tecnologías no perm iten el reconocim iento de algunos puntos de ro tu ra com o aquellos asociados a deleciones, inserciones, adiciones o translocaciones de pequeño tamaño, para los cuales es necesario utilizar sondas es­ pecíficas de locus.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 11-8. R ecom endaciones respecto al núm ero de células y de c o n tro les, y respecto a los niveles de corte para las sondas centroméricas, de locus específico y de pintado crom osóm ico Número de células analizadas

Controles

Niveles de corte ( X * 3 DE)1'

Sondas centroméricas

200

10

Sondas de locus específico

200

10

Sondas de pintado cromosómico

10

No requiere

Monosomías > 10% Trisomías > 5% Deleciones > 5-6%b Ganancias > 5% Alteraciones estructurales > 1 % Mínimo dos metafases con la misma alteración

0 Prom edio ± 3 desviaciones estándar. A considerar p o r cada laboratorio. b Siempre y cuando se utilice u n control interno de la sonda.

La H G C, tam bién llam ada c o m p a r a tiv e g e n o m ic h y b r id i z a ti o n , es u n a técnica citogenética-m olecular que perm ite detectar cambios num éricos de secuencias de ADN (pérdidas, deleciones, ganancias y amplificaciones) en un tejido tum oral. Di­ cha técnica se basa en la hibridación in s itu del ADN tum oral y de un ADN control marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. Después de la hibridación, las variaciones numéricas del ADN tum oral se cuantifican mediante el coeficiente de intensidad de fluorescencia entre el ADN tum oral y el ADN normal. La HGC tiene particular interés en el análisis de cambios numéricos de secuencias de ADN en tumores sólidos y en neoplasias hematológicas de índice proliferativo bajo, ya que para la realización de la técnica no es necesaria la obtención de metafases. Asimismo, es de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos con numerosos cromosomas marcadores, dobles dim inutos y regiones de tinción homogénea. Esta técnica únicamente detecta cambios presentes en una proporción elevada de células tum orales (50%). Por otra parte, no perm ite detectar translocaciones, inversiones y otras alteraciones de tipo equilibrado que no com portan ganancias o pérdidas de material genético. A pesar de las ventajas que ofrece la HGC, su resolución es similar a las técnicas de cariotipificación (3-10 Mb), por lo que ha sido reemplazada por las técnicas de m ic ro a rrays genómicos (tabla 11-9).

Técnicas de micro arrays Un m ic r o a r r a y es una colección de moléculas dispuestas ortogonalm ente en filas y columnas sobre un soporte sólido. En función del material dispuesto en dicho soporte se pueden distinguir m ic ro a rra y s genómicos (con ADN), de expresión (con ARN), de tejido fijado en parafina (a rra y de tejido), de proteínas o de células. Existen dos tipos de m ic r o a rr a y s genómicos: de HGC y de sin g le n u c le o tid e p o ly ­ m o r p h is m (SNP). Los m ic ro a rra y s de HGC siguen el m ismo fundamento que la HGC convencional, cambiando el soporte sobre el que se realiza la hibridación. En lugar de hibridar sobre un portaobjetos se hace sobre un soporte en el que se disponen millones de sondas de secuencias de ADN correspondientes a b a cteria l a rtificia l ch ro m o so m e (BAC) u oligonucleótidos, cubriendo todo el genoma o una región concreta.

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Capítulo 11

311

Métodos citogenéticos en hematopatología

I TABLA 11-9. Ventajas e inconvenientes de las técnicas de hibridación in situ «convencionales» y nuevas Ventajas

Inconvenientes

HIS Centroamérica

No requiere células en división

HIS de locus específico HIS de pintado cromosómico

No requiere células en división

Solo informa de alteraciones numéricas Solo informa del locus que se estudia

Hibridación genómica comparada

Requiere una pequeña cantidad de ADN. No requiere células en división Permite estudiar material archivado (congelado, en parafina) Permite detectar ganancias y pérdidas de ADN en todo el genoma

Multicolor FISH-SKY

Permite obtener información de todos los cromosomas Muy útil para descifrar cariotipos complejos

Microarrays

No requiere células en división Alta resolución. Detecta alteraciones de hasta 50 kb Análisis global del genoma

genómicos

Muy útil para descifrar cariotipos complejos

Requiere células en división Solo aporta información del cromosoma concreto que se analiza Solo se detectan alteraciones citogenéticas que impliquen ganancias y pérdidas de ADN Requiere una infiltración tumoral mínima del 50% No permite cuantificación de las ganancias o pérdidas No detecta ganancias de ADN menores de 4-5 Mb ni pérdidas menores de 10-20 Mb Requiere células en división No detecta alteraciones estructurales dentro de un mismo par cromosómico No detecta alteraciones estructurales de ADN menores de 10 Mb Baja sensibilidad No detecta alteraciones equilibradas No detecta clones individuales

Actualmente, también se utilizan los microarrays de SNP que, además de detectar ganancias y pérdidas, pueden identificar pérdidas de heterocigosidad que no implican alteraciones numéricas en el genoma. Estas técnicas permiten un estudio global del genoma con una mayor resolución, de hasta 50 kb. Una de las limitaciones de los microarrays genómicos es la baja sensibilidad ya que, para identificar una alteración, se requiere que la m uestra a analizar contenga como m ínimo un 20% de células tumorales. Además, no permite detectar alteraciones equilibradas ni distinguir clones individuales (v. tabla 11-9). La aplicación de esta metodología está limitada a aquellas patologías que se caracteri­ zan por presentar alteraciones en el número de copias. Sin embargo, es una herramienta destinada a la investigación porque, aunque se ha demostrado su implicación pronostica, no está claro el valor biológico de las alteraciones detectadas.

Com binación de las técnicas de hibridación in situ con técnicas de identificación celular El diagnóstico y la clasificación de determinadas hemopatías malignas se basan en el es­ tudio morfológico, inmunológico y citoquímico de sangre periférica, de médula ósea o de ganglio linfático. Las alteraciones cromosómicas estudiadas tanto en sangre periférica

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

como en m édula ósea por técnicas de citogenética convencional y de hibridación in situ pueden aportar información para el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad. La posibilidad de combinar técnicas de identificación citológica o inmunológica y de análisis cromosómico es m uy útil para poder relacionar las alteraciones cromosómicas directamente con las células alteradas y su linaje celular. En 1984, Teerenhovi et al. describieron la técnica de morfología-anticuerpos-cromosomas (MAC) basada en la conservación de la m em brana citoplasmática de las células en metafase para su posterior identificación mediante técnicas citoquímicas y/o inmunológicas. Para poder aplicar dicha técnica es necesario realizar un cultivo de citogenética convencional para obtener metafases. En el proceso de extracción del cultivo se utiliza una solución hipotónica suave que expande la célula sin romper la membrana citoplasmática. Las preparaciones se obtienen por citocentrifugación. Mediante técnicas citoquímicas o inmunológicas se identifica el linaje celular y, posteriormente, se puede realizar la técnica de HIS convencional, asociando la presencia o ausencia de alteraciones al tipo celular estudiado. En este caso, la técnica se denomina morfología-anticuerpos-cromosomashibridación in situ (MACHIS). La utilización de estas técnicas ha quedado restringida por el hecho de que el núm ero de células analizables es escaso y el rendimiento ha sido superado por otras. Actualmente, existen principalmente dos técnicas que utilizan la citogenética inter­ fásica combinada con otros métodos para la identificación celular. Dichas técnicas son las denominadas FICTION y MGG-FISH. La técnica de FICTION se basa en la realización de estudios inmunohistoquímicos sobre preparaciones de sangre periférica o de m édula ósea (frotis o preparaciones obtenidas por citocentrifugación del material). Así, permite identificar el linaje de las células estudiadas mediante marcadores inmunológicos de superficie específicos, a la vez que se analiza el resultado de la hibridación in situ utilizando sondas específicas para la alteración cromosómica que deseemos estudiar. La técnica requiere que los anticuerpos específicos y las sondas de ADN que se utilicen estén marcados directa o indirectamente con un fluorocromo. La técnica de MGG-FISH se basa en la identificación celular a partir de una tinción de May-Grünwald/Giemsa. Se localiza el tipo celular que se quiere estudiar sobre extensiones de sangre periférica o médula ósea y se procede a aplicar la técnica de FISH con las sondas adecuadas. Posteriormente, se relocalizan las células sobre el mismo portaobjetos con la intención de valorar el resultado de FISH y poder asociar la alteración citogenética estudiada a un determinado linaje celular.

PROTOCOLOS DE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL E HIBRIDACIÓN IN SITU Citogenética convencional Se realiza la fase previa del proceso en condiciones estériles, en la cam pana de flujo laminar. Es conveniente que el flujo de aire esté un mínimo de 10 min en marcha antes de empezar a trabajar.

Cultivo Paso 1: se preparan 100 mi de medio complementado siguiendo estas proporciones: • 80 mi de medio RPMI 1640. • 17 mi de suero bovino fetal.

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Capítulo 11

313

Métodos citogenéticos en hematopatología

• 2 mi de L-glutamina. • 1 mi de penicilina/estreptomicina. El medio preparado se congela en frascos de cultivo (10 mi), y antes de poner la muestra a cultivar, se descongela el frasco colocándolo en el baño a 37 °C. Paso 2: se siembran 2 X 106 células/ml de sangre periférica, médula ósea o biopsia ganglionar en un frasco de cultivo estéril con 1 0 mi de medio complementado. La m édula ósea, u n a vez extraídos 1-2 mi, se introduce en un tubo con 5 mi de m edio RPMI 1640 y un 1% de heparina sódica. La m uestra debe tran sportarse a tem peratu ra am biente y n unca debe congelarse. U na vez recibida la m uestra, se centrifuga a 1.500 r.p.m. durante 8 min, y de la parte superior del botón celular se recogen 1-5 gotas, en función de la celularidad y del recuento de leucocitos, para su posterior cultivo. La sangre periférica se recoge en un tubo con heparina sódica o heparina litio (nunca utilizar EDTA como anticoagulante). Su transporte debe realizarse a temperatura am ­ biente o a 4 °C (si el transporte dura más de 6 h). Las muestras de ganglio deben transportarse en un frasco estéril sin ningún medio ni conservante. Una vez recibido el ganglio, se hacen cuatro improntas, de las cuales una se tiñe para observar el tipo celular que predomina. Si en la preparación teñida se observan células maduras, el cultivo se debe estimular con un mitógeno (TPA o PHA) y cultivarlo 72 h; en el caso de que predominen células inmaduras se realiza un cultivo de 24 h sin mitógenos. Para ello, se coloca en una placa de Petri estéril, con medio de cultivo RPMI 1640. Se trocea y se pincha para extraer el máximo de células. Se recoge el medio con la sus­ pensión celular para hacer el recuento celular. Si la suspensión no está limpia, se pone en un tubo de centrifuga para realizar un lavado previo. Se ajusta a dos millones de células por mililitro de medio. Paso 3: se incuba la muestra durante 24-72 h en la estufa de C 0 2 a 37 °C (tabla 11-10, para determinar condiciones de cultivo).

TABLA 11-10. Condiciones de cultivo para el estudio citogenético en función del diagnóstico. Tiempo de cultivo y tiempo de colcemid Enfermedad

Tejido

Mitógeno

Tiempo de cultivo

Tiempo de colcemid

NMP SMD LMA LLA Mieloma LCP LLC LPC Tricoleucemia LNH con expresión periférica LNH

MO MO MO MO MO SP SP SP SP SP

No No No No No Sí Sí Sí Sí Sí

24 o 48 h 24 o 48 h 24 o 48 h 24 o 48 h 24-72 h 72 h 72 h 72 h 72 h 72 h

30 min 30 min 30 min 30 min 2h 2h 2h 2h 2h 2h

Ganglio

Sí No

72 h 24 h

2h 2h

MO, m édula ósea; SP, sangre periférica. Para las abreviaturas, véase la tabla 11-4.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Normalmente, las médulas óseas se incuban durante 24 h, la sangre de pacientes con SLPC se incuba 24 h sin mitógenos o 72 h con mitógenos, y los ganglios se procesan igual que la sangre periférica. En el caso de los cultivos de sangre periférica para determ inar el cariotipo cons­ titucional, al medio de cultivo se le añade el mitógeno PHA al 0,5%. En caso de realizar el estudio citogenético de síndrom es linfoproliferativos B (SLPC-B), se realiza un cultivo de 72 h con mitógeno de células B (el más utilizado es el TPA, acetato de miristato de tetraforbol). En las muestras de pacientes con SLPC-T el mitógeno más apropiado es la PHA. En el caso del estudio de mieloma múltiple, se valora el porcentaje de células plas­ máticas. Si este es superior al 20%, se realiza un cultivo de 24 h y, en función del resultado citogenético, se valorará la posibilidad de realizar el estudio de FISH. En caso de que dicho porcentaje sea inferior al 2 0 %, se recomienda aislar mediante técnicas inm unomagnéticas la población de células plasmáticas (CD 138+) para realizar el análisis de FISH directamente de este material.

Extracción 1. En las muestras de médula ósea y cariotipo constitucional, se añaden 0,1 ml del antimitótico colcemid, se mezcla bien y se deja actuar durante 30 min en la estufa a 37 °C. En muestras de SLPC se añade el m ismo volumen de colcemid, pero se deja actuar durante 2 h. A partir de este punto ya se puede trabajar en condiciones no estériles. 2. Se transfiere el contenido del cultivo a un tubo de centrífuga y se centrifuga la muestra a 1.800 r.p.m. durante 8 min. 3. Se retira el sobrenadante con una pipeta Pasteur o por decantación, dejando el mismo volumen de sobrenadante y de botón para facilitar la resuspensión con la misma pipeta. 4. Se añade una solución de hipotónico KC1 de 0,075 M con una pipeta Pasteur, hasta unos 7 mi (el prim er mililitro gota a gota y después más rápido). Se deja actuar 30 min al baño a 37 °C. 5. Se centrifuga de nuevo, se descarta el sobrenadante y se añade el fijador Carnoy (1 ácido acético:3 metanol), gota a gota hasta unos 8 mi. 6 . Esta operación se repite de tres a siete veces, hasta que el sobrenadante sea trans­ parente y el botón celular, lo más blanco posible. En el caso de m édula ósea y ganglio con tres lavados es suficiente, y en sangre periférica es necesario un mínimo de cinco lavados.

Extensiones 1. Se seca un portaobjetos previamente guardado en el congelador con etanol o metanol, se tiran dos o tres gotas (en función de su concentración) del material fijado desde una altura aproximada de 1 m y se coloca en la placa calefactora a 45 °C para secarlo. 2. Se mira la preparación al microscopio invertido para valorar la densidad celular y la extensión de los cromosomas. Si la densidad es alta se añaden unas gotas más de fijador a la suspensión celular y se repite la extensión: si es baja se centrifuga la suspensión (10 min a 3.000 r.p.m.) y se resuspende el botón con menos cantidad de fijador. Se realizan de dos a cuatro extensiones en función de las metafases observadas al microscopio invertido.

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

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El secado de las preparaciones depende de la tem peratura y hum edad ambiental. Para solventar este problema se usa una placa calefactora a 45 °C. Si el secado ha sido correcto, las metafases observadas serán de color oscuro en el microscopio invertido. Si por el contrario, el secado ha sido demasiado rápido o demasiado lento se verán los núcleos con citoplasma y los cromosomas refringentes.

Tinción o técnica de bandas G Se envejecen las preparaciones en la estufa de desecación a 65 °C durante 24 h o sobre una placa calefactora a 100 °C durante 1 h. Dichas condiciones varían en función de las condiciones ambientales de cada laboratorio. Una vez que transcurre este tiempo ya se pueden teñir. Preparación del colorante W right 1. Se prepara una solución al 0,25% de colorante de Wright en metanol (normal­ mente se preparan 500 mi). 2. Se agita la mezcla 1 h en una botella preservada de la luz. 3. Se filtra con papel de filtro. 4. Se guarda a 37 °C durante 72 h. 5. Una vez preparado se conserva a 4 °C. Preparación del tam p ó n Sórensen • Fosfato potásico 4,539 g. • Fosfato sódico 5,938 g. • 1 . 0 0 0 mi de agua destilada. • Una vez preparado se conserva a 4 °C. Para realizar la tinción, se mezclan tres partes del tam pón Sórensen con una parte del colorante Wright. Para cada portaobjetos se necesitan 3 mi de tam pón y 1 mi de colorante. La mezcla se prepara en el mom ento de realizar la tinción y se deja actuar sobre los portaobjetos durante 2-3 min. La cantidad de mezcla que sobre se desecha, ya que el colorante W right precipita al poco rato de haberse añadido al tampón.

Análisis e interpretación del resultado Se localizan las metafases con un objetivo X10, se añade aceite de inmersión sobre el portaobjetos y se valoran las metafases con el objetivo X 1 0 0 . Se realiza el recuento de cromosomas de cada metafase y se ordenan por pares (22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales). El recuento de los cromosomas se debe realizar en un mínimo de 2 0 metafases y el de cariotipado en un m ínimo de cinco metafases.

Hibridación in situ fluorescente en interfase con sondas centroméricas y de secuencia única O btención de la m uestra Se realizan extensiones del material obtenido mediante la técnica de citogenética con­ vencional y se dejan envejecer toda la noche a temperatura ambiente o 1 h a 100 °C.

Protocolo convencional sin placa calefactora Preparación de la muestra • Se desnaturaliza la m uestra en una solución de formam ida al 70% durante 5 min a 74 °C.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• Se deshidrata en una serie de etanoles al 70, 85 y 100%, cada uno durante 1 m in a temperatura ambiente.

Preparación de la sonda • Se mezclan 7 |xl de tam pón de hibridación más 1 (jlI de sonda, más 2 (xl de agua des­ tilada a temperatura ambiente dentro de un tubo de microcentrífuga estéril cubierto con papel de aluminio. • Se centrifuga la mezcla de 1 a 3 s. • Se desnaturaliza la sonda en un baño a 74 °C durante 5 min. • Se vuelve a centrifugar la mezcla y se procede a la hibridación.

Reacción de hibridación • Se colocan 10 |xl de la mezcla sobre el portaobjetos. Se tapa con un cubreobjetos de 20 X 20 m m y se sella con pegamento. • Se coloca el portaobjetos en la cámara húm eda precalentada y se incuba a 37 °C durante toda la noche (12-24 h).

Protocolo para la realización de la técnica de FISH con sondas centrom éricas y de secuencia única (con placa calefactora program able) Preparación de la sonda y de la muestra • Se mezclan 7 (xl de tam pón de hibridación más 1 jjlI de sonda, más 2 |xl de agua des­ tilada a temperatura ambiente dentro de un tubo de microcentrífuga estéril. • Se centrifuga la mezcla de 1 a 3 s. • Se colocan 10 (jlI de la mezcla de la sonda sobre el portaobjetos. Se tapa con un cu­ breobjetos de 20 X 20 m m y se sella con pegamento.

Desnaturalización-hibridación • Se enciende la placa calefactora de hibridación. • Se selecciona el programa que se quiera utilizar. Para sondas centroméricas o de locus específico utilizaremos el programa: • Melting: 75 °C, 1 min. • Hybridization: 37 °C, 30 h. • Se asegura que la placa calefactora esté húm eda para poder mantener la humedad durante el proceso de hibridación. • Se coloca el portaobjetos, con el cubreobjetos en la parte superior, en la superficie caliente (vigüar que queden totalmente planos y en contacto con la placa). • Se espera a que el proceso de desnaturalización y posterior hibridación tenga lugar, desde 4 h a toda la noche. A partir de este punto el proceso es el mismo para ambos protocolos.

Lavados de posthibridación • Se elimina suavemente el pegamento de las preparaciones. Lavados con form am id a

• Poner el baño a 45 °C y colocar las soluciones de lavado. • 3 coplins con formamida 50%.

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Capítulo 11

Métodos citogenéticos en hematopatología

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• 1 coplin con 2 X SSC. • 1 coplin con 2 X SSC/0,1% NP-40. • Eliminar suavemente el pegamento (o parafilm) y empezar los lavados: • Realizar 3 lavados en formamida 50% durante 10 m in a 45 °C. • Realizar 1 lavado en 2 X SSC durante 10 min a 45 °C. • Realizar 1 lavado en 2 X SSC/0,1% NP-40 durante 5 m in a 45 °C. Lavados con soluciones salinas a altas tem p eratu ras • Poner el baño a 74 °C y colocar la solución de lavado de 0,4 X SSC/0,3% NP-40 (la temperatura de la solución debe ser 73 ± 1 °C). • Eliminar suavemente el pegamento (o parafilm) y empezar los lavados: • Realizar 1 lavado en 0,4 X SSC/0,3% NP-40 durante 2 m in a 74 °C (la temperatura de la solución debe ser 73 ± 1 °C). • Realizar 1 lavado en 2 X SSC/0,1% NP-40 durante 1 m in a tem peratura am ­ biente.

Contratinción • Sobre el portaobjetos todavía húmedo se colocan 10 |xl de DAPIII (contratinción) y un cubreobjetos encima. Se seca el exceso de DAPI II con un papel absorbente hasta que el cubre no se mueva. • Se guardan las preparaciones a -2 0 °C en una caja oscura y se deja reposar un mínimo de 15 min antes de la observación.

Interpretación del resultado En el caso de sondas centroméricas o de locus específico, se valoran un mínimo de 200 núcleos y se contabilizan las señales de hibridación en cada uno de ellos. Se considera la presencia de una alteración cuando el porcentaje de células alteradas sea superior al punto de corte fijado para cada sonda (v. tabla 11-9). El protocolo para realizar la técnica de pintado cromosómico es m uy similar al des­ crito en esta sección. Es recomendable utilizar el protocolo proporcionado por la casa comercial al com­ prar la sonda.

P r e p a r a c ió n d e s o lu c io n e s

20 x SSC • 175,3 g de cloruro sódico. • 88,2 g de citrato trisódico dihidratado. • 11 de agua destilada. • Ajustar el pH 6,2-6,3. • Conservar a temperatura ambiente.

2 X SSC • 50 mi de 20 X SSC. • 450 mi de agua destilada. • Conservar a temperatura ambiente o en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no se observe contaminación de la solución.

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318

2 • • • • •

X

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

SSC/0,1% NP-40

50 mi de 20 X SSC. 425 mi de agua destilada. 0,5 ml de NP-40 o Tween 20. Ajustar el pH 7-7,5 y enrasar a un volumen final de 500 mi. Conservar en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no se observe contaminación de la solución.

0,4

X

SSC/0,3% NP-40

• 10 mi de 20 X SSC. • 425 mi de agua destilada. • 1,5 mi de NP-40 o Tween 20. • Ajustar el pH 7-7,5 y enrasar a un volumen total de 500 mi. • Conservar en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no se observe contaminación de la solución.

Formamida 70% • • • • •

70 mi formamida.

20 mi H20 . 10 mi 20 X SSC. Ajustar el pH a 7,5. Conservar en nevera hasta 15 días.

Formamida 50% • • • • •

125 mi formamida. 100 mi H20 . 25 mi 20 X SSC. Ajustar el pH a 7. Conservar en nevera hasta 15 días.

Etanol 70% • 35 mi de etanol. • 15 mi de agua destilada. • Conservar durante 15 días.

Etanol 80% • 40 mi de etanol. • 10 mi de agua destilada. • Conservar durante 15 días. LEC TU R A S R EC O M E N D A D A S Algara P, Mateo MS, Sanchez-Beato M, et al. Analysis of the IgV(H) somatic mutations in splenic marginal zone lymphoma defines a group of unmutated cases with frequent 7q deletion and adverse clinical course. Blood 2002;99(4):1299-304. Armstrong SA, Look AT. Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2005;23(26):6306-15. Aukema SM, Siebert R, Schuuring E, et al. Double-hit B-cell lymphomas. Blood 2011;117(8): 2319-31.

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Capítulo 11

Métodos citogenéticos en hematopatología

319

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320

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

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Capítulo 11

Métodos citogenétícos en hematopatología

3 2 1 .e l

Autoevaluación 1. Las ventajas de la técnica de citogenética convencional aplicada al diagnóstico hematológico son: (a) Aportar información de todos los cromosomas. (b) Permitir la detección de mutaciones puntuales. (c) Aportar información en aquellas células que no son capaces de entrar en división. (d) Solo perm ite detectar alteraciones cromosómicas numéricas. (e) Las respuestas c y d son correctas. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la técnica de citogenética tiene la principal ventaja de que perm ite es­ tudiar todos los cromosomas y, por ello, se pueden detectar tanto alteraciones numéricas como estructurales, pero no perm ite detectar m utaciones puntuales. Su principal limitación es que requiere de células en división. 2. ¿Cuál de las siguientes informaciones es falsa respecto a la FISH? (a) Aporta información de la sonda que se utiliza. (b) Permite detectar alteraciones numéricas. (c) Permite detectar alteraciones estructurales. (d) Su resultado tiene valor pronóstico. (e) Las respuestas b y c son correctas. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: la técnica de FISH no tiene valor pronóstico, ya que solo detecta la alteración que se busca con la sonda aplicada. Al dar solo información de una región m uy concreta no perm ite conocer si otras regiones del genoma están afectadas. 3. ¿Cuál de las siguientes informaciones es falsa respecto a los arrays? (a) Aporta información de todo el genoma. (b) Permite detectar translocaciones. (c) Permite detectar monosomías. (d) Permite detectar trisomías. (e) No necesita células en división. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: los arrays son una herramienta con una gran resolución, pero solo pueden detectar ganancias y pérdidas de material genético, por lo que no pueden detectar alteraciones equilibradas como las translocaciones. 4. La alteración citogenética de la leucemia mieloide crónica (LMC) es la: (a) Translocación t(8;21). (b) Translocación t(3;3). (c) Translocación t(9;22). (d) Translocación t( 11; 14). (e) Translocación (15;17). Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la alteración característica de la LMC es la t(9;22), que da como resultado un cromosoma 22 de m enor tamaño, denominado cromosoma Filadelfia. 5. La alteración citogenética de la leucemia promielocítica aguda M3 es la: (a) Translocación t(8;21). (b) Translocación t(3;3). (c) Translocación t(9;22). (d) Translocación t( 11; 14). (e) Translocación (15;17). Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: la alteración característica de la leucemia aguda promilelocítica o M3 es la t(15;17), que genera la fusión de los genes PML del cromosoma 15 y RARA del cromosoma 17. 6. La citogenética estudia: (a) Los cromosomas. (b) La célula.

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321.e2

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

(c) Los tejidos. (d) Las proteínas. (e) El ADN. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la citogenética permite el estudio de los cromosomas y, para ello, es necesario tener u n tejido en división para tener metafases, que es la etapa del ciclo celular en la que se pueden visualizar los cromosomas. 7. La biología molecular estudia: (a) Los cromosomas. (b) La célula. (c) Los tejidos. (d) Las proteínas. (e) El ADN. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: la biología molecular se basa en el estudio de los ácidos nucleicos, tanto el ADN como el ARN, y es una técnica de gran utilidad para el estudio de los cambios genéticos de las neoplasias. 8. ¿Qué técnica es la más sensible entre las indicadas en los siguientes apartados? (a) PCR. (b) Citología. (c) Citogenética. (d) Inmunohistoquímica. (e) FISH. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: por orden de mayor a m enor sensibilidad: PCR > FISH > citogenéti­ ca > inmunohistoquímica > citología. 9. Indica el m ejor tejido para estudiar citogenéticamente las leucemias agudas. (a) Ganglio. (b) Médula ósea. (c) Sangre. (d) Líquido amniótico. (e) Piel. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: por orden de preferencia: m edula ósea > sangre. El resto no tienen apli­ cación. 10. Indique el mejor tejido para estudiar citogenéticamente la leucemia linfática crónica. (a) Ganglio. (b) Médula ósea. (c) Sangre. (d) Líquido amniótico. (e) Piel. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: por orden de preferencia: sangre > ganglio > m edula ósea. El resto no tienen aplicación.

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C

A

P

Í

T

U

L

O

Métodos de biología molecular en hematopatología D. Colomer

INTRODUCCIÓN Los avances de la biología molecular han contribuido en gran manera al progreso de la investigación en hematología. Su estudio ha ampliado los conocimientos de las bases mole­ culares de determinadas enfermedades hematológicas, mejorando la capacidad diagnóstica. La extracción de ácidos nucleicos se basa en la lisis celular, la inactivación de las nucleasas celulares y el aislamiento del ácido nucleico en cuestión. Es importante tener en cuenta que las nucleasas se hallan en la piel humana, por lo que se tiene que evitar el con­ tacto directo de los ácidos nucleicos con las manos. Las ADNsas son bastante inestables, pero las ARNsas son muy estables y pueden adsorber al vidrio y plástico y ser aún activas, por lo que para el aislamiento de ARN se utilizan soluciones que contienen inhibidores de estas ARNsas, como es el dietilpirocarbonato (DEPC). También es importante tener en cuenta que los metales pesados promueven la rotura de los enlaces fosfodiéster y que el EDTA es un excelente quelante de metales. Los métodos tradicionales de purificación de ácidos nucleicos son combinaciones de extracciones, precipitaciones, métodos cromatográficos, electroforesis y separaciones por afinidad. Muchos de estos métodos implican la utilización de productos tóxicos (fenol, cloroformo), y son largos y laboriosos. Para minimizar estos problemas, ya existen un gran número de productos comerciales que simplifican notablemente los métodos de separación de ácidos nucleicos.

EXTRACCIÓN DEL ADN Principio De todos los métodos para trabajar en biología molecular, el más elemental es la puri­ ficación de los ácidos nucleicos. En la actualidad, existe un gran núm ero de productos comerciales para la extracción de ADN de muestras hematológicas. En este capítulo se describe uno de los protocolos más universales y de fácil realización. Los leucocitos obtenidos de sangre periférica o de médula ósea se rompen mediante la utilización de un detergente, generalmente SDS, y proteinasa K. La proteinasa K libera el ADN nuclear al medio y digiere las proteínas asociadas a él. Posteriormente, la solución que contiene el ADN se somete a una serie de extracciones con fenol y cloroformo para la eliminación de las proteínas y se obtiene el ADN mediante precipitación con etanol.

M aterial y reactivos • Sangre total en EDTA. • Suero fisiológico.

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2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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Capítulo 12

• • • • • • • • • • •

• • • • • • •

Métodos de biología m olecular en hematopatología

323

Tris-HCl: 2 M, pH = 8. Tris-HCl: 2 M, pH = 7,5. MgCl2 lM . EDTA: 0,25 M, pH = 7. Solución madre (X10) de lisis de leucocitos (NaCl, 3 M; EDTA, 0,1 M; Tris, 0,1 M, ajustar a pH = 7,5 con NaOH al 32%). Tampón de lisis de leucocitos: 10 mi solución madre (X 10) de lisis de leucocitos y 42 g de urea en un volumen final de 100 mi. Tampón de lisis de eritrocitos (Tris-HCl, 0,01 M; pH = 7,5; MgCl2, 2,5 mM). NaCl 5 M. SDS-lauril sulfato al 20%, pH = 7,2. Urea 7 M. Solución de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1) saturada con Tris-HCl de 20 mM, pH = 8,1. Se agita durante unas 6 h, se guarda en la nevera en botella oscura y se utiliza la fase inferior. Solución de cloroformo-isoamílico (49:1) saturado con Tris-HCl de 20mM, pH = 8,1. PBS, pH = 7,2. NaCl, 0,15M. Etanol absoluto. Etanol al 70%. Tris-EDTA 1 mM (0,1 mM; pH = 8 [TE 1/0,1]). Acetato de sodio, 3 M; pH = 5,2 (ajustar el pH con ácido acético).

M é to d o La extracción del ADN se puede realizar a partir de sangre total, leucocitos (separados con dextrano T-500 o con diversas soluciones que lisan los hematíes), células mononucleares (separadas mediante Ficoll) o fracciones celulares aisladas mediante purificación magnética utilizando anticuerpos. Si se parte de sangre total será necesario lisar inicial­ mente los hematíes. 1. Se lava la sangre tres veces con suero fisiológico sin eliminar la capa de leuco­ citos (tubo de 50 mi graduado). Se guarda en un congelador a -8 0 °C hasta el momento de la extracción. 2. Se añade tam pón de lisis de eritrocitos hasta 50 mi (antes de que se haya des­ congelado). Se agita suavemente hasta que se descongele todo el paquete de eritrocitos y leucocitos. 3. Se deja el tubo en hielo durante 30 min, y se agita suavemente cada 5 min. 4. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. a 4 °C durante 10 min. 5. Se elimina el sobrenadante. En el fondo del tubo quedan los leucocitos libres de eritrocitos. 6. Se lisan las células con 0,5 mi de tam pón de lisis de leucocitos. 7. Se va añadiendo tam pón de lisis en alícuotas de 0,5 mi hasta que la suspensión sea bastante líquida. 8. Se añade SDS al 20% (0,1 m, por cada mililitro de tam pón de lisis añadido). 9. Se incuba durante 30 m in a 37 °C. 10. Se añade un volumen igual de fenol-cloroformo-isoamílico. 11. Se mezcla agitando fuertemente. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 min a 4 °C. 12. Se transfiere la fase acuosa (fase superior) a otro tubo y se hace otra extracción con fenol-cloroformo-isoamílico (volumen a volumen).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

13. Se repite la misma operación hasta que no queden proteínas en la interfase (interfase de color blanco). Normalmente son necesarias tres extracciones. 14. Se añade un volumen de cloroformo-isoamílico, se agita fuerte y se centrifuga (este proceso se repite dos veces). 15. Se coge nuevam ente la fase superior y se añaden dos volúmenes de etanol absoluto. Se mezcla suavemente para que se forme el precipitado de ADN. Se deja 30 m in a temperatura ambiente para que acabe de precipitar el ADN. 16. Se transfiere el ADN formado a un tubo Eppendorf que contiene etanol al 70% frío para lavar el ADN. 17. Se centrifuga a 14.000 r.p.m. durante 10 min. Se decanta el sobrenadante y se vuelve a centrifugar durante 5 min. Con una pipeta Pasteur se eliminan los restos de etanol. 18. Se deja secar el ADN en u n a estufa a 37 °C con el tubo E ppendorf abierto (aproximadamente 30 min). 19. Se disuelve el ADN en TE 1/0,1. La cantidad a añadir dependerá de la cantidad de ADN formado (aproximadamente 300 |xl si se ha partido de 20 mi de sangre). Se deja a temperatura ambiente durante 24 h hasta que se observe que todo el ADN está disuelto. 20. Una vez disuelto el ADN se determina la concentración mediante la lectura espectrofotométrica a 260/280 nm. El cociente 260/280 debe estar entre 1,7-2. Actualmente, se tiende a la eliminación de la utilización de fenol y se realiza una deshidratación y precipitación de las proteínas con una solución saturada de NaCl, o se utilizan diversas resinas que purifican el ADN por métodos cromatográficos. Existen también diversas técnicas para la extracción de ADN a partir de tejido congelado o fijado e incluido en parafina. En tejido parafinado, el ADN que se obtiene es de menor tamaño, y solo es útil para la realización de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa, pero ha sido de gran utilidad en los estudios moleculares de linfomas donde solo se dispone del tejido fijado e incluido en parafina. El ADN puede conservarse a 5 °C, pero para largas conservaciones es mejor su congelación. Las mejores condiciones para conservar el ADN son aquellas que contienen altas concentraciones de sales (> 1 M) y altas concentraciones de EDTA (> 10 mM) a pH = 8,5.

PREPARACIÓN DE ARN Para la obtención de ARN se realiza la lisis de las células con un detergente (Tritón X-100, SDS, Nonidet P40) en presencia de compuestos que inactivan las ARNsas como son el tiocianato de guanidina, EDTA, urea y 2-mercaptoetanol. Las ARNsas son enzi­ mas muy estables, y todos los métodos de obtención de ARN se basan en inactivarlas rápidamente. Posteriormente, existe una serie de extracciones parecidas a las utilizadas en la extracción de ADN. Para obtener ARN de mayor calidad el extracto celular se ultracentrífuga en u n gradiente de cloruro de cesio Solo el ARN es capaz de atravesar tal densidad, ya que es más denso que el ADN crom osóm ico fragm entado, p or lo que se recupera en el fondo del tubo. El ARN es inestable a tem peraturas inferiores a -7 0 °C y conviene guardarlo en soluciones libres de ARNsas. Más del 90% del ARN total de una célula corresponde a ARNr y solo el 5% a ARNm. Los ARNm de eucariotas llevan en su extremo 3' una cola constituida p o r una larga secuencia poliadenílica. Esta característica se aprovecha para su purificación m ediante cromatografía de afi­ nidad, donde el soporte lleva oligo(dT) u oligo(U), que híbrida con la cola de poli(A) de los ARNm.

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Capítulo 12

Métodos de biología m olecular en hematopatología

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En este capítulo, se describe el método clásico de extracción de ARN, aunque en la actualidad existen un gran núm ero de productos comerciales basados en este mismo procedimiento.

MATERIAL Y REACTIVOS • Solución desnaturalizante: tiocianato de guanidina, 4 M; citrato sódico, 25 mM; pH = 7; 2-mercaptoetanol, 0,1 M; laurosilsarcosina al 0,5%. • Preparación de solución stock: 47,264 g de tiocianato de guanidina; 3,3 mi de citrato sódico, 0,75 M, pH = 7; 5 mi laurosilsarcosina al 10%, y hasta 100 m i H20 destilada. • Solución de trabajo: 0,14 mi de 2-mercaptoetanol; hasta 20 mi de solución stock. Se guarda a temperatura ambiente preservado de la luz. • Fenol saturado con H20-D E PC al 0,2%. • Cloroformo/isoamílico 49/1:49 volúmenes de cloroformo y un volumen de alcohol isoamílico.

M étodo 1. Se parte de un concentrado de células. 2. Se añade 1 mi de solución desnaturalizante mediante una jeringa de 2 mi y aguja de 20 G, se aspira varias veces hasta que la solución se vuelve viscosa. 3. Se divide en dos tubos Eppendorf, 0,5 mi en cada tubo. 4. Se añade 50 |xl de acetato de sodio 2 M pH 4. 5. Se mezcla por inversión. Se añaden 200 |xl de fenol saturado y se agita vigorosamente. 6. Se añaden 100 (xl de cloroformo-isoamílico (49:1). Se agita fuerte y se deja en hielo 30 min. 7. Se centrifuga durante 20 min a 14.000 r.p.m. 8. Se forman dos fases. La fase acuosa, o fase superior, contiene el ARN y se pasa a un nuevo Eppendorf. 9. Se precipita con una cantidad igual de isopropanol al 100%. 10. Se deja a -2 0 °C durante un mínimo de 30 min o más tiempo. 11. Se centrifuga durante 15 m in a +4 °C y 14.000 r.p.m. Se descarta el sobrenadante. 12. Se forma un precipitado que es el ARN. Se resuspende en 300 |xl de solución desnaturalizante. 13. Se añade un volumen de isopropanol al 100%. 14. Se deja a -2 0 °C durante 30 min. 15. Se centrifuga durante 15 min a 4 °C. 16. Se elimina el sobrenadante. 17. Se lava el ARN con 1 mi de etanol al 75% preparado con H20-D EPC. Se deja a temperatura ambiente durante 10 min. 18. Se centrifuga durante 10 m in a 4 °C. 19. Se deja secar el precipitado de ARN durante unos 30 min a temperatura ambiente. 20. Se resuspende en 100 jxl de H 20-D EPC. Se deja en hielo entre 30-60 min. 21. Se mide la densidad óptica (DO) a 260/280 nm. El cociente 260/280 debe estar entre 1,7-2.

D eterm inación de la concentración de ácidos nucleicos La concentración de ADN y ARN se determ ina p or espectrofotom etría, basándose en la característica de que las bases púricas y pirimidínicas que componen los ácidos

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

nucleicos absorben a 260 nm. Una unidad de densidad óptica a 260 nm corresponde a una solución de ADN de doble hebra de 50 g/ml, a 40 g/ml de ARN o de ADN de una única cadena y a 20-33 g/ml de una solución de cebadores. Para saber si hay contami­ nación de proteínas se realiza la lectura de la densidad óptica a 280 nm, que es donde absorben las proteínas. Una relación 260/280 entre 1,8 y 2 indica que el ácido nucleico es óptim o para su utilización.

Cálculo de la concentración de ADN Una solución de 50 |¿g/|xl de ADN da una DO de 1. . ..

D O 260nm xdiluciónX 50

ADN(w ^ ) = ------------^

------------

Cálculo de la concentración de ARN Una solución de 40 |xg/|xl de ARN da una DO de 1. . .. DO 260 n m x dilución x 40 ARN (|ig/|il) = --------------— —--------------

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) permite la am­ plificación in vitro de un segmento de ADN. Esta técnica fue introducida por K. Mullis en 1985, y es probablemente la técnica más extendida y la que más ha revolucionado la historia de la biología molecular. La técnica de PCR es un método diseñado para producir una amplificación selectiva de una determinada secuencia de ADN a partir de dos cebadores sintéticos llamados cebadores, de unos 18-25 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Los cebadores actúan como en la síntesis in vitro de ADN. El proceso de amplificación com­ prende un conjunto de tres etapas (fig. 12-1) que se repiten a lo largo de varios ciclos que comprenden: 1. La desnaturalización de la doble hebra de ADN por calor, aplicando temperaturas de 90 a 97 °C que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y, por lo tanto, la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa sepa­ ración de las hebras de toda la muestra, esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN se desnaturaliza parcialmente este tenderá a renaturalizarse rápidamente, así se evita una eficiente hibridación de los cebadores y una posterior extensión. 2. La hibridación de los dos cebadores a sus secuencias complementarias. Esta fase se denomina también fase annealing o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado, se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60 °C para que se pueda producir la unión de los cebadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. Los cebadores se añaden en exceso al ADN que se amplifica. Estos hibridan las dos hebras opuestas del ADN que estén orientadas con sus extremos 3', de forma que la enzima ADN polimerasa pueda funcionar en la dirección La temperatura de fusión o annealing (melting temperature, Tm) depende de varios factores y es relativamente específica para cada cebador. La longitud de los cebadores y la secuencia son críticas

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Capítulo 12

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Métodos de biología m olecular en hematopatología

5 ,rT Tm —TTTrn-nr

i h it ,i n i

11

r-^

■

Desnaturalización

G en problema

Ciclo 1

Ciclo 2

Ciclo 3

236 = 68 billones de copias 22 = 4 copias 23 = 8 copias 16 copias

32 copias

FIGURA 12-1. Diagramas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A. Etapas de la PCR. B. Amplificación de la PCR.

en la designación de los parámetros de una amplificación; una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente: Tm = 4(G + C) + 2 (A + T). No obstante, cada cebador exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de hibridación específica, ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es m uy alta, no se producirá una unión completa. 3. La extensión o síntesis de ADN gracias a una ADN polimerasa. Como la des­ naturalización se produce al calentar el ADN, y los incrementos de temperatura eran perjudiciales para la ADN polim erasa, se recurrió a una derivada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, que puede sobrevivir a m uy altas tem ­ peraturas, de manera que es capaz de realizar su actividad polimerasa a 72 °C y ser resistente a las temperaturas de desnaturalización, que están alrededor de los

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

95 °C. La utilización de esta enzima y la automatización de este procedimiento con aparatos que realizan automáticamente los ciclos de desnaturalización, hi­ bridación y extensión han perm itido que este método se haya convertido en el más tradicional en biología molecular. Después de un ciclo se han sintetizado nuevas hebras de ADN que, al igual que las hebras iniciales, pueden hibridarse a los cebadores después de un nuevo proceso de desnaturalización e hibridación. Sin embargo, el segundo ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión da lugar a dos productos de una única hebra que juntos originan un producto de doble hebra que es exactamente la longitud entre los dos cebadores. Cada hebra de este producto es complementaria a uno de los dos cebadores y puede participar como cebador en los ciclos siguientes. La cantidad de producto se multiplica en cada ciclo, por lo que después de 30 ciclos se han obtenido 228 copias del primer producto amplificado (v. fig. 12-1). A continuación, se presentan los protocolos para las aplicaciones más comunes de las técnicas de PCR.

Amplificación enzim ática del ADN m ediante la reacción en cadena de la polim erasa Para la PCR en necesario mezclar el ADN que se va a amplificar, dos cebadores apropiados, la enzima Taq ADN polimerasa, los desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y un tampón. Esta mezcla se cicla muchas veces, generalmente unas 30, a diferentes temperaturas que permiten la desnaturalización, hibridación y extensión. Los productos son visualizados posteriormente en un gel que determina el producto y la especificidad. A causa de que la concentración de MgCl2 en el tampón es muy importante y puede variar la eficiencia de la reacción, es necesario optimizar esta concentración para cada par de cebadores. La reacción de PCR depende de una serie de parámetros que se detallan a continuación.

Elección de los cebadores La elección de los cebadores específicos y eficientes continúa siendo empírica. No hay reglas que aseguren la correcta elección y es el parámetro que más condiciona el éxito o fracaso de la reacción. Los siguientes puntos pueden ayudar a su diseño: • Siempre que sea posible, se escogen cebadores con una distribución de bases aleatorias con u n contenido de GC similar al de AT. • Se deben evitar secuencias con una estructura secundaria importante, especialmente en el extremo 3'. • Hay que comprobar que los cebadores no sean complementarios. En particular, se deben eludir los cebadores en que las zonas 3' sean complementarias para evitar la incidencia de dimerización. Existen disponibles en la web diversos programas para el diseño de cebadores.

Solución amortiguadora La concentración de MgCl2 puede tener un efecto im portante en la especificidad y el rendim iento de la amplificación. Las concentraciones sobre 1,5 mM acostum bran a ser óptimas con 200 |xM de cada dNTP. No obstante, en algunas situaciones pueden ser necesarias otras concentraciones de MgCl2. El exceso de iones Mg++ generalmente provocará productos de amplificación no específicos, e insuficiente M g++ reducirá el rendimiento. Algunos protocolos incluyen el 10% de dimetilsulfoxido (DMSO) para reducir la estructura secundaria del ADN que se va a amplificar.

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Capítulo 12

Métodos de biología m olecular en hematopatología

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Siempre debe utilizarse la solución amortiguadora específica que acompaña la Taqpolimerasa.

Desoxinucleótidos Es necesario utilizar entre 50-200 (jlM de cada uno de los dNTP. Unas concentraciones mayores provocarán malas incorporaciones de la polimerasa. Con esta concentración se pueden obtener de 6.5 a 25 |xg de ADN respectivamente.

Enzima ADN-polimerasa (Taq-polimerasa) La concentración óptim a viene dada por la firma comercial, aunque suele emplearse entre 1 y 4 U para cada reacción. Incrementar esta concentración puede provocar la formación de productos no específicos y reducir el rendimiento del fragmento deseado.

Parámetros de los ciclos Los parámetros característicos de una típica reacción son: • Desnaturalización: 90-97 °C. • Hibridación: 40-60 °C. • Extensión: 70-75 °C. En la mayoría de los casos una temperatura de 94 °C es suficiente para desnaturalizar las cadenas de ADN. No calentar a suficiente tem peratura puede provocar que la re­ acción no funcione, ya que las dos hebras de ADN no se han separado; por el contrario, calentar demasiado provoca que la polimerasa pierda actividad a lo largo de los ciclos. La temperatura y el tiempo de desnaturalización inicial dependerán de cada Taq-polimerasa. Hay algunas enzimas que se llaman hot-start, las cuales se estimulan por calor y necesitan tiempos más largos de la etapa de desnaturalización para que se activen. La temperatura de hibridación depende de la longitud y de la secuencia de los ceba­ dores. Una tem peratura de 55 °C puede ser un buen punto de partida para cebadores de 20 bases con un 50% de GC. Debido al exceso de concentración de los cebadores, la hibridación ocurre casi instantáneamente, por lo que son necesarios tiempos demasiado largos en el proceso de hibridación. Cebadores más pequeños pueden requerir una tem peratura de hibridación más baja (40-45 °C). El tiempo de extensión a 70-75 °C varía según la longitud del fragmento que se debe amplificar.

M ateriales y reactivos • • • • • • • •

H20 estéril. 50 mM de MgCl2. Tampón de la reacción de PCR (X 10). 2 mM mezcla de los cuatro dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). 50 |xM cebadores 1 y 2. ADN que se va a amplificar (100 ng a 1 |xg). Taq ADN polimerasa. Aparato de PCR.

M étodo de amplificación enzim ática La reacción estándar de PCR se realiza en un volumen de 25 a 50 jxl, que además del ADN que se va a amplificar contiene iones K+, Tris-HCl, iones Mg+2, 200 (xM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 pmol de cada oligonucleótido y 2,5 U Taq-polimerasa. La am plificación se realiza en u n aparato diseñado para este fin, y u n program a

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

estándar podría ser el siguiente: desnaturalización a 95 °C durante 7-10 min, seguido de 30-40 ciclos consistentes en una etapa de desnaturalización de 95 °C durante 30-60 s, la hibridación a 55 °C durante 30-60 s y la extensión a 72 °C durante 45-90 s. Por último, un proceso de extensión final de 10 m in a 72 °C. Estas condiciones son útiles para una gran variedad de reacciones, aunque es mejor seguir aquellas que se especifiquen en cada reacción concreta. En la actualidad, existen termocicladores fast que permiten realizar el proceso de amplificación de forma mucho más rápida, con ciclos inferiores a 30 s y con volúmenes inferiores. En la técnica de PCR, la Taq ADN polimerasa no puede utilizar ARN como molde, por lo que es necesario sintetizar ADNc in vitro a partir de ARN mediante una transcriptasa reversa vírica. Esta técnica se llama de retrotranscripción y PCR (RT-PCR). Mediante esta metodología es posible detectar genes humanos cuya expresión génica es muy baja y de u na forma m ucho más rápida que mediante N orthern blot, por lo que tiene una gran utilidad en oncohematología.

Reacción de retrotranscripción Existen en el mercado una gran diversidad de kits comerciales para la realización de la técnica de la retrotranscripción. A continuación, se describe el método clásico que se puede realizar con cualquier transcriptasa reversa.

Material y reactivos • Preparación de ADNc mix: • 420 (xl de H 20 DEPC. • 428 (xl de tam pón X5 (específico de la transcriptasa reversa). • 21,5 (x ld eD T T 0 ,l M. • 85,5 |xl de dNTP 25 mM. • 45 |xl de hexámeros al azar pd(N )6, 5 mg/ml. • Se hacen alícuotas de 175 |jl1 y se congelan a -2 0 °C. • Preparación dNTP 25 mM: se mezclan 50 |xl de dATP 100 mM; 50 (jlI de dCTP 100 mM; 50 |xl de dTTP 100 mM, y 50 |xl de dGTP 100 mM. • Preparación pd(N)6: se preparan a 5 jxM con H20-D EPC. • Preparación H20 DEPC: se añade el 0,1% de DEPC a H20 (1 mi en 11 de H 20 ) , se esperan 24 h y, posteriormente, se autoclava o se compra comercialmente. En el momento que se desee realizar una retrotranscripción, se saca una alícuota de 175 |xl del congelador y se añaden 12 (jlI de transcriptasa reversa (M-MLV), 200 U/|xl, y 6 |xl de un inhibidor de ARNsas (ARNsin), 40 U/|xl.

Método 1. Se coge de cada muestra 1 |xg de ARN en un volumen total de 19 jxl, que se com­ pletará con H 20-D EPC. (Estas muestras se preparan en hielo.) 2. Estas muestras se desnaturalizan en un termociclador durante 5 m in a 65 °C y se ponen inmediatamente en hielo. 3. Se añade a cada muestra 21 |xl de la mezcla del ADNc mix, al que le hemos añadido M-MLV y ARNsin. 4. Se ponen las muestras en un termociclador durante 2 h a 37 °C, durante 10 min a 65 °C para inactivar la M-MLV y el ARNsin. 5. Se guardan las muestras de ADNc a -2 0 °C o se utilizan inmediatamente para rea­ lizar la PCR.

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Capítulo 12

Métodos de biología m olecular en hematopatología

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En la actualidad, hay en el mercado transcriptasas reversas que trabajan a temperatu­ ras superiores y que tienen una gran efectividad. Uno de los protocolos estandarizados es el de utilizar 1 (xg de ARN en 9,5 |xl de H 20 y desnaturalizar durante 10 m in a 70 °C. Se pone inmediatamente en hielo y se añaden los siguientes reactivos en un volumen de 20 jjl I : tampón RT, 20 mM; Tris-HCl, 50 mM; KC1,5 mM, pH = 8,3; MgCl2 10 mM; DTT, 5 |xM pd(N )6; ARNsin, 20 U; MLV, 200 U, y dNTP, 1 mM. Posteriorm ente, se pone en un term ociclador durante 10 m in a 25 °C, 45 m in a 45 °C, 3 m in a 99 °C y se guarda a -2 0 °C.

Detección del producto amplificado Los métodos convencionales de detección del producto amplificado consisten en la separación y visualización mediante electroforesis. Los soportes más utilizados son la agarosa y la poliacrilamida: la agarosa se utiliza para la separación de fragmentos a partir de 1 0 0 pares de bases a 2 0 kb, y la poliacrilamida está recomendada para frag­ mentos más pequeños o para la separación de fragmentos de tamaños muy similares. La agarosa es un polisacárido natural, capaz de formar geles con rigidez suficiente para ser manipulados a partir del 0 ,2 %; se disuelve por calentamiento, ya que tiene un punto de fusión de 80 °C y no polimeriza hasta p o r debajo de unos 45 °C. A mayor concen­ tración de agarosa, mayor resistencia hay en el avance de la muestra, aunque esta relación no es lineal, por lo que es necesario introducir patrones de tamaño conocido en cada gel, que luego nos perm itan determ inar el tam año del ADN problema. Solo pueden compararse movilidades de moléculas de la misma forma, y los patrones deberán ser elegidos de acuerdo con las moléculas que se quieran analizar. Los diferentes fragmentos de ADN o ARN pueden ser visualizados directamente en el gel mediante tinción con brom uro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se coloca entre las bases del ADN y ARN, y cuando forma estos complejos aum enta m ucho su fluores­ cencia. En la actualidad, debido a las características mutagénicas del brom uro de etidio se utiliza como agente intercalante el silver green. De esta manera, se pueden visualizar, bajo luz ultravioleta, pequeñas cantidades de ADN y ARN. Los fragmentos de ADN más pequeños migran más rápidam ente en el gel. Una característica im portante de estos geles es su alto poder de resolución, y algunos de ellos perm iten distinguir fragmen­ tos que difieren en un solo nucleótido, aun cuando su longitud total sea de varios cientos de ellos. Recientemente, es posible la detección de los productos de amplificación en un secuenciador automático utilizando uno de los cebadores marcados con fluores­ cencia, así se obtiene una mayor resolución y se permite la separación de fragmentos de u na base (fig. 1 2 - 2 ).

ANÁLISIS DE LOS GENES DE FUSIÓN En la tabla 12-1 se describen las translocaciones más frecuentes en leucemias con sus correspondientes genes de fusión. Existen múltiples protocolos para el análisis de es­ tos genes de fusión, pero los más estandarizados han sido los diseñados por el grupo BIOMED-1. En conjunto, todos ellos se basan en la obtención de ARN a partir de las células tumorales, la realización del proceso de retrotranscripción para obtener ADNc, seguido de la realización de una PCR, si es una muestra al diagnóstico, o la realización de una PCR anidada si se está analizando una enfermedad m ínima residual. La reacción de PCR se acostumbra a realizar en un volumen final de 25 a 50 (xl, a partir de 2-3 (xl de ADNc (10-15% del producto de la retrotranscripción), 400 nm de los

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 12-1. Genes de fusión y transcritos típicos en hemopatías malignas Translocación

Gen de fusión

Transcritos

t(l;19)(q23,pl3.3)

E2A-PBX1

t(4;ll)(q21;q23)

MLL-AF4

t(8;21)(q22;q22)

R U N X-R U N X 1T 1 (AM L1-ETO ) BCR-ABL P190 BCR-ABL P210

E2A-PBX1 Variante E2A-PBX1 (+27 nucleótidos) e8e7, e8e4, e9e5, e9e4, elOeó, el0e5, el0e4, e lle 6 ,e lle 5 ,e lle 4 e5e2

t(9;22)(q34;qll.2)

t( 12,21) (p 13;q22) t(15;17)(q22;ql2)

invl6(pl3;lq22) t(16;16)(pl3.1;q22)

ETV6-RU N X1 (TEL-AM L1) PM L-RARA

CBFB-M YH11

ela2, ela3 (raro) el3a2,el4a2 b3a3 y b2a3 (raros) e5e3 Variante pérdida exón 2 (39pb) AML1 BCR1 BCR2 BCR3 Tipo A 85%, tipo D 5%, tipo E 5%, resto de casos aislados B, C, F, G, H, I, J

cebadores, 200 (jlM dNTP, el tam pón específico de la PCR, MgCl2 de 2 mM y 1 U de Taq-polimerasa en un volumen de 50 (xl. Las condiciones estándar de la PCR son: 5 min a 95 °C para la desnaturalización, y 35 ciclos que consisten en 30 s a 94 °C, 60 s a 65 °C y 60 s a 72 °C. Si es necesario realizar una segunda ronda de la PCR se realiza a partir

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Capítulo 12

333

Métodos de biología m olecular en hematopatología

de 1 |xl del producto amplificado en la primera PCR, con el m ismo volumen, reactivos y condiciones que en la primera PCR utilizando los cebadores específicos más internos para cada reacción.

ANÁLISIS DE CLONALIDAD En la mayoría de los procesos linfoproliferativos la histomorfología o citomorfología, conjuntamente con la inmunohistoquímica o la citometría de flujo, permiten discriminar entre un proceso linfoide reactivo o tumoral, pero hay un 5-10% de casos en los que su diagnóstico es complicado y el análisis de clonalidad por métodos moleculares es básico. El 90-95% de las hemopatías malignas linfoides son de estirpe B, del 5 al 7% de casos de estirpe T y menos del 2% de origen NK (tabla 12-2). El análisis de reordenamientos en las inmunoglobulinas (Igs) se utilizarán para detectar clonalidades de estirpe B y los reordenamientos en los receptores de células T (TCR) se utilizarán para detectar clonalidades de estirpe T. En las Igs, los segmentos variables (VH) contienen tres regiones (FR) y dos regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las regiones FR son muy similares entre los segmentos VH, m ientras que las regiones CDR son diferentes incluso dentro de la misma familia. Estas regiones CDR son los lugares preferidos para las hipermutaciones somáticas que tienen lugar durante la reacción de centro germinal. La región V-D-J se amplifica m ediante PCR, y se puede amplificar la región FR1 (amplificación de un fragmento de 310 a 260 pares de bases), la región FR2 (amplificación de un fragmento de 250 a 295 pares de bases) y la región FR3 (amplificación de un fragmento de 100 a 170 pares de bases). La amplificación de la región FR3 es la más utilizada en ADN obtenido de m aterial fijado e incluido en parafina, debido a que se amplifica un fragm ento de m enor tam año. Los reordenam ientos V 7 -J 7 de la cadena 7 del TCR (TCR-7 ) y los reordenam ientos V 0-J0 y D(3-J3 de la cadena (3 (TCR-pS) son los es­ tudios preferidos para el análisis de clonalidad de estirpe T. La cadena 7 se reordena en los prim eros estadios del reordenam iento T, pero tiene el inconveniente de que nos puede dar falsos positivos debido a la baja variabilidad en reordenam ientos com parado con la cadena (3. Las secuencias consenso se encuentran perfectamente descritas y estandarizadas. El estudio completo de los reordenamientos permite definir la estirpe de práctica­ mente todas las hemopatías malignas linfoides.

TABLA 12-2. Leucemias y linfomas. Estirpe celular Línea

Leucemia aguda linfoblástica (LAL): Niños (%) Adultos (%) Leucemia linfática crónica (LLC), % Linfoma no hodgkiniano (LNH): Nodal (%) Extranodal (%) Piel (%) Mieloma múltiple (%)

B

T

NK

82-96 75-80 95-97

14-18 20-25 3-5

CD22 IgS débil FMC7+/— CD20+/—, CD79b+/—, CD1 lc+, CD25+/CD38+/— (pronóstico) ZAP70+/— (pronóstico) CD10— CD 103— CD123+/— Como LLC pero FMC7++, CD20++

En raros casos de LLC CD5—se mantiene CD23 > CD22

Prolinfocítica B

Linfoma del manto

Linfomas zona marginal (incluyendo formas esplénicas con linfocitos vellosos)

Linfoma linfoplasmocítico

Linfoma folicular

Tricoleucemia

CD5+ CD22 > CD23 Igs no débil (con frecuencia \ ) FMC7+/++ CD20 +/++ CD79b+/++ CD25+/— CD38+ CD10-CD103-CD123+/— C D 5 - CD22 > CD23 FMC7++ IgS no débil CD20++ CD llc+/++ CD25+/— CD38+/— CD79b+ CD10-CD103-CD123— Ningún fenotipo característico. Parecido a LLC o linfomas de zona marginal

C D 5CD22 = CD23 FMC7+ CD20+ CD79+ CD 10+ (utilizando fluorocromos sensibles) Igs no débil CD 19 puede ser débil C D 5CD22 > > CD23 CD 11C++ CD10+/— FMC7+ CD20++ CD25+ CD 103+ CD 123+ Patrón de clonalidad característico

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Gran esplenomegalia y linfocitosis Prolinfocitos > 60% Analizar ciclina DI por inmunohistoquímica. Se han descrito alteraciones de ciclina D2yD 3 (SOX)

Alguna vez CD5+ Esplenomegalia Paraproteína Virus hepatitis C+ Síndrome seco

Infiltración por linfocitos es mayor en MO que sp. Puede ser muy difícil de distinguir de los linfomas de la zona marginal Muy rara vez CD5+. Si hay pérdida total de CD23 pensar en una transformación agresiva, sobre todo si se asocia a ganancia de CD 123

En las formas variantes el CD25 es negativo Esplenomegalia Pancitopenia Punción seca Clona puede ser pequeña en sp

Capítulo 13

359

Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas

I TABLA 13-11. Diagnóstico inmunofenotípico de los procesos SLPC-B con expresión hemoperiférica (cont.) Entidad

Inmunofenotipo

Comentarios

SLPC-B biclonales

Cualquier asociación de dos SLPC-B con mismo o diferente isotipo de IgS Fenotipos «extraños»

Al menos el 5% de todos los SLPC Pensar en SLPC típicos tratados Formas leucemizadas de linfomas difusos de células grandes o linfomas linfoblásticos (TdT nuclear) Transformaciones agresivas (Richter y similares)

Formas no clasificables

CUADRO 13-8. Características de la linfocitosis B monoclonal (MBL). Criterios • Detección de población B-monoclonal en sp definida por: • Ratio clonal K:L > 3:1 o < 0,3:1 • >25% sin Ig de superficie o expresión débil • Inmunofenotipo típico de algún SLPC-B • Población B monoclonal estable durante 3 meses Criterios de exclusión • Linfoadenopatía u organomegalias • Enfermedad autoinmune o infecciosa asociada • Recuento de linfocitos B > 5 X 109/1 • Otros rasgos clínicos de SLPC-B. No obstante puede observarse paraproteína y no excluye MBL Sub clasificación • Tipo LLC: CD5+CD23+ • Tipo LLC atípica: CD5+CD23—, CD20+, CD79b+ • Tipo no LLC: CD5—

FIGU RA 13-11. Sangre periférica de un paciente afecto de leucemia prolinfocítica T, caracterizada por la presencia de una linfocitosis absoluta en la que los linfocitos presentan esta típica imagen de replegamiento de la cromatina nuclear conocida como «núcleos convolutos» (MGG X800).

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j

360

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

CUADRO 13-9. Clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de las neoplasias T y NK maduras

Leucemias T maduras • Leucemia prolinfocítica T • Leucemia de linfocitos grandes granulares T • Procesos linfoproliferativos crónicos NK (entidad provisional) • Leucemia agresiva NK • Leucemia/linfoma de célula T en el adulto Linfomas T periféricos nodales • Linfoma T periférico, no especificado • Linfoma angioinmunoblástico T • Linfoma anaplásico de célula grande ALK+ • Linfoma anaplásico de célula grande ALK—(entidad provisional) Linfomas T extranodales • Linfoma T/NK extranodal, tipo nasal • Linfoma T asociado a enteropatía • Linfoma T hepatoesplénico • Linfoma T subcutáneo tipo paniculitis («(3) Linfomas cutáneos T • Micosis fungoide • Síndrome de Sézary • Enfermedad linfoproliferativa cutánea primaria T CD30+ • Linfoma anaplásico de célula grande primario cutáneo • Papulosis linfomatoide • Linfoma T primariamente cutáneo • Linfoma T 7 8 • Linfoma CD8 + epidermotrópico agresivo • Linfoma CD4 de células pequeñas/medianas

FOXP1 + NCG

FOXP1-CG

FIGURA 13-12. Algoritmo de Hans empleado en la investigación de los linfomas B difusos de células grandes.

ganglios regionales, con o sin compromiso de otras regiones ganglionares del mismo lado del diafragma (IIE). Los hilios pulmonares se consideran separadamente del mediastino. Se indica con un sufijo en números arábigos la cantidad de áreas comprometidas. Estadio III. Compromiso de grupos ganglionares en ambos lados del diafragma, lo cual puede estar acompañado del compromiso localizado de un órgano extralinfático asociado (III E), o del bazo (III S) o de ambos (III ES). Estadio III 1: con o sin compromiso del bazo, ganglios celíacos, portales o del hilio esplénico. Estadio I I I 2: con compromiso de ganglios paraaórticos e ilíacos.

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Capítulo 13

361

Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas

TABLA 13-12. Lesiones moleculares en linfomas difusos de célula grande B Tipo

Lesión genética

Frecuencia

Consecuencia

Vía funcional

Bcl2 (Transí) Myc (Transí) Bel (Transí)

30-40% 10% 15%

Desregulación Desregulación Desregulación

EZH2 (Mut)

22%

CREBBP/EP300 (Mut/Del) Bcl2 (Ampl) Bcló (Transí)

40%

Ganancia función Pérdida función

Inhibidor apoptosis Proliferación y crecimiento Regulador negativo respuesta daño ADN Metiltransferasa

30% 25%

Aumento exp. Desregulación

PRDM1 (Mut/Del)

25%

Pérdida función

TNFAIP3 (Mut/Del) MYD88 (Mut)

20% 29%

CD79b (Mut)

20%

CARD 11 (Mut)

9%

CREBBP/EP300 (Mut/Del) JAK2 (Ampl) PDL1, PDL2 (Ampl)

15%

Pérdida función Ganancia función Ganancia función Ganancia función Pérdida función

50% 50%

Aumento exp. Aumento exp.

Acetiltransferasa, regula bcló yp53 Inhibidor apoptosis Regulador negativo respuesta daño ADN Regulador diferenciación terminal linfomas B Regulador negativo NF-kB Activador NF-kB y JAK-STAT Activador NF-kB y BCR Activador NF-kB Acetiltransferasa, regula bcló yp53 Activador JAK-STAT Regulador respuesta inmune

Medi, linfoma B mediastínico.

CUADRO 13-10. Clasificación de los procesos linfoproliferativos postransplante (PTLD)

• Lesiones precoces • Hiperplasia plasmocítica • Proceso linfoproliferativo postransplante tipo mononucleosis infecciosa • PTLD polimorfo • PTLD monomorfo: B, T o NK • PTLD tipo Hodgkin clásico

• Estadio IV. Compromiso diseminado (multifocal), de uno o más sitios extraganglionares, con o sin ganglios asociados comprometidos, o compromiso extralinfático aislado con compromiso ganglionar no regional. A: asintomático. B: fiebre > 38 °C, sudoración nocturna o pérdida inexplicable de más del 10% del peso corporal en los 6 meses previos al diagnóstico.

NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS Obedecen a alteraciones de las células que participan en la producción de anticuerpos. Se caracterizan por la síntesis y secreción de gammaglobulina homogénea (proteína M). Las principal gammapatía monoclonal es el mieloma múltiple (MM). La etiología de estos cuadros es desconocida, aunque se ha considerado el efecto de radiaciones, tóxicos

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362

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

CUADRO 13-11. Tipos histológicos reconocidos del linfoma de Hodgkin

• • • • • •

Predominio nodular linfocítico Clásico Esclerosis nodular clásica Rico en linfocitos clásico Celularidad mixta clásica Depleción linfocitaria clásica

TABLA 13-13. Diferencias clínicas entre linfoma no hodgkiniano y Hodgkin Característica

Hodgkin

No hodgkiniano

Edad de aparición Inicio Progresión Infiltración celular linfoide Respuesta al tratamiento Fiebre

Adulto joven Ganglionar Ordenada Escasa Buena Frecuente

Adulto mayor Extraganglionar Irregular Masiva Regular Poco habitual

químicos o estímulos crónicos de las defensas como las infecciones y los síndromes inflamatorios crónicos. El componente M de la banda monoclonal característica del patrón electroforético en estos trastornos es una proteína homogénea que se caracteriza por precipitar en frío, formar fibrillas de amiloide, poseer una elevada viscosidad intrínseca y form ar com ­ plejos con otras proteínas, especialmente los factores de coagulación. En general, es una inmunoglobulina completa (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) que posee un único tipo de cadena ligera ( k o X ) , lo que le confiere u n carácter clonal. Otras veces pueden ser una única cadena pesada con una cadena ligera o una cadena ligera ( k o X) libre con o sin inmunoglobulinas completas o fragmentos de cadena pesada. La presencia de una proteína M suele ser, prácticamente siempre, un hallazgo elec­ troforético que se pone de manifiesto en la electroforesis de proteínas séricas, p or una fracción o banda, estrecha y densa, en la zona de las inmunoglobulinas (banda m ono­ clonal). Esta imagen electroforética permite establecer el diagnóstico de gammapatía m onoclonal e iniciar los estudios necesarios para establecer la diferenciación entre formas benignas (gammapatía m onoclonal de significado indeterminado) y malignas (MM, macroglobulinemia de W aldenstrom, etc.). Este estudio debe iniciarse con las determinaciones siguientes: • Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM). • Inmunoelectroforesis e inmunofijación de proteínas séricas. Sirve para identificar el tipo de cadena pesada (IgG, IgA, IgM) o cadena ligera ( k o X) implicadas en cada caso. • Electroforesis, inmunoelectroforesis e inmunofijación en orina. De utilidad para detectar proteinuria de Bence-Jones o identificación de cadenas ligeras ( k o X) libres. La forma más frecuente en la práctica clínica de gammapatía monoclonal es la llamada gammapatía monoclonal de significado indeterminado, conocida como monoclonalgammopathy o f undetermined significance (MGUS), y cuya única característica es el hallazgo

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Capítulo 13

363

Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas

TABLA 13-14. Neoplasias de células plasmáticas MGUS

Mieloma asintomático

Mieloma sintomático

Componente M en suero < 30 g/1

Componente M en suero > 30 g/1

Plasmocitosis medular < 10% o escasa plasmocitosis en muestra histopatológica

Plasmocitosis medular clonal > 10%

Sin lesiones orgánicas o tisulares atribuibles a la plasmocitosis

Sin lesiones orgánicas o tisulares atribuibles a la plasmocitosis, incluidas lesiones óseas o síntomas

Componente M en suero o en orina Plasmocitoma o células plasmáticas clónales (si por citometría ratio IF aberrante/reactivo > 9 /1 ) Lesiones orgánicas y tisulares, incluyendo lesiones óseas

MGUS, monoclonal gammopathy o f undetermined significance.

casual de una banda monoclonal al realizar la electroforesis de proteínas. La MGUS se observa en un 3% de la población de más de 70 años y, en general, no presenta evolución hacia la malignidad. Para establecer el diagnóstico de MGUS, la banda electroforética debe acompañarse de una concentración de la Ig clonal en suero inferior a 20 g/1, ausencia de proteína de Bence-Jones urinaria y un porcentaje de células plasmáticas en médula ósea inferior al 5%. La observación casual de una banda monoclonal y el diagnóstico de MGUS deben ir seguidos de un control periódico de la concentración de Ig sérica al objeto de prevenir la malignización del proceso. Un dato de mal pronóstico (probable evolución hacia MM) es la aparición de cadenas libres en orina (proteína de Bence-Jones). Por ello, en la actualidad se preconiza incluir en el estudio inicial del análisis de cadenas Ubres en suero y utilizar también este criterio para el control evolutivo de todo MGUS. El MM es la enfermedad paradigmática de este grupo que obedece a una neoplasia maligna clonal de células B m aduras (células plasm áticas), que producen grandes cantidades de un tipo de inmunoglobulina clonal (proteína M ). Es muy im portante conocer los criterios de laboratorio imprescindibles para establecer el diagnóstico de MM y diferenciarlo de otras gammapatías monoclonales, en especial de la MGUS. Las células plasmáticas se acumulan principalmente en médula ósea y hueso, y raramente en localizaciones extraóseas. La incidencia del MM oscila en alrededor de un caso por cada 100.000 habitantes y es más frecuente en varones mayores de 60 años. La expresividad clínica del MM viene dada p or el crecimiento celular y la producción de proteína M (tablas 13-14 y 13-15).

TABLA 13-15. Valoración de la repercusión orgánica de las proliferaciones de células plasmáticas Lesión

Definición

Hipercalcemia

Calcemia corregida > 0,25 mmol/1 por encima del límite de normalidad o >2,75 mmol/1 Creatinina > 173 (xmol/1 Hemoglobina < 2 g/dl del límite inferior de la normalidad o Hb < 10 g/dl Lesiones líticas u osteoporosis con fracturas por compresión Hiperviscosidad sintomática, amiloidosis Infecciones bacterianas recurrentes (más de dos episodios en 12 meses)

Insuficiencia renal Anemia Lesiones óseas Otras

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364

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGURA 13-13. Célula plasmática en sangre periférica de un paciente afecto de mieloma múltiple.

D iagnóstico del m ielom a m últiple • Hemograma. Generalmente, se aprecia una anemia moderada normocítica normocrómica arregenerativa, con eritrocitos formando pilas de moneda y una ES elevada, salvo cuando existen crioglobulinas, que la disminuyen. Los leucocitos suelen ser cuantitativamente normales, aunque normalmente se observa linfopenia. Ocasio­ nalmente, hay leucopenia, linfocitos inmaduros y/o células plasmáticas (fig. 13-13). Las plaquetas están normales. • Mielograma. Es característica la plasm ocitosis m edular con asincronía núcleocitoplasm a. Pueden tam b ién observarse inclusiones citoplasm áticas hialinas llamadas cuerpos de Russell, inclusiones nucleares, gránulos eosinofílicos y reac­ ción de PAS positiva p or acum ulación de gam m aglobulina en el núcleo, aparato de Golgi y espacio inter- e intracisternas. • Electroforesis de proteínas, inmunofijación, cuantificación de inmunoglobulinas. Las alteraciones proteicas presentes en el mieloma son la presencia de componente M en suero y/o proteína de Bence-Jones (PBJ) en la orina. La forma más frecuente de MM es IgG (del 50 al 60% de los casos), seguida del MM IgA (el 20% de los casos), IgD (del 1 al 2%). Los mielomas IgE o IgM son m y raros. En un 15% de los casos solo se observan cadena ligeras ( k o X.) en la orina. La gammapatía puede ser también biclonal (del 0,5 al 2,5%), y la IgG + IgA es la forma más frecuente. • p 2-microglobulina. Es una cadena ligera que se encuentra en los antígenos de histocompatibilidad clase I HLA A, B y C, y cuya síntesis está controlada por un gen del cromosoma 2. Está presente en casi todas las células, se libera a los fluidos corporales en pequeñas cantidades y se filtra por el riñón, se reabsorbe y cataboliza. Se eleva en el MM, pero también en síndromes linfoproliferativos, por lo que no es útil para el diagnóstico pero sí para el pronóstico y la evaluación de la respuesta al tratamiento. • Estudio radiológico óseo. El examen radiológico de elección en el MM es la radiografía ósea, especialmente la craneal. Las lesiones óseas pueden ser múltiples, localizadas en sitios de médula ósea roja, costillas, esternón, columna, clavículas, cráneo, epífisis proximales de huesos largos y pelvis. Las lesiones presentan características en saca­ bocados, redondeadas, líticas sin halo de regeneración. Son frecuentes las fracturas espontáneas.

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Capítulo 13

Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas

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CUADRO 13-12. Clasificación de procesos neoplásicos histiocíticos y de células dendríticas

• • • • • • •

Sarcoma histiocítico Histiocitosis de células de Langerhans Sarcoma de células interdigitantes dendríticas Sarcoma de células dendríticas foliculares Tumor de células fibroblásticas reticulares Tumor de células dendríticas intermedias Xantogranuloma juvenil diseminado

• Estudio defunción renal. • Citogenética. Es imprescindible estudiar las lesiones de 17p y la presencia de las trans­ locaciones t(4; 14)(p 16;q32) y la t(14;16)(q32;q23) que confieren mal pronóstico. • Inm uno fenotipo y contenido de AD N . El contenido de ADN, estudiado mediante citometría de flujo y FISH, muestra aneuploidías en el 90% de las células; del 60 al 70% son hiperploidías y del 10 al 25%, hipoploidías. El FISH detecta cambios numéricos en células de interfase, como monosomías o trisomías. El inmunofenotipo de sangre periférica o médula ósea es positivo para los antígenos CD38, CD 138, CD56+/— y negativo para CD45 y CD 19. Puede existir positividad para cadenas ligeras k o X citoplasmáticas.

PROLIFERACIONES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Son entidades poco frecuentes que afectan sobre todo a niños y jóvenes. Cursan con adenopatías, hemofagocitosis, hepatoesplenomegalia, alteraciones endocrinas y óseas. Las reacciones inmunohistoquímicas con langerina (CD207), CD la y S I00 son muy útiles para establecer el diagnóstico (cuadro 13-12).

LECTURAS RECOMENDADAS Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, et al. W HO classification o f tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC; 2008.

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Capítulo 13

Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas

3 6 5 .e l

Autoevaluación 1. Las leucemias mieloides agudas con alteraciones genéticas recurrentes reconocidas por la OMS son: (a) LMA con t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1. (b) LM Aconinv(16)(pl3.1q22) o t(16;16)(pl3.1;q22) CBFB-MYH11. (c) LMA con t(15;17)(q22;ql2) PML-RARA. (d) LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2) RPN1-EVI1. (e) Todas las anteriores y algunas que no se mencionan. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: esta categoría se amplía conforme se incrementan los conocimientos de la biología de la LMA. 2. Los marcadores de línea más frecuentemente empleados en la definición inmunofenotípica de las leucemias agudas son los que tienen más puntuación en las escalas habituales. El de mayor puntuación de los que se mencionan es: (a) CD64. (b) CD 15. (c) CD3 citoplasmático. (d) TdT. (e) CD33. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: define línea T el CD3 citoplasmático. 3. La m utación V617F de JAK2 puede encontrarse en: (a) La LMC. (b) Es diagnóstica de policitemia vera. (c) Excluye el diagnóstico de mielofibrosis. (d) Es m uy rara y solo se encuentra en casos raros de trombocitemia esencial. (e) Puede encontrarse en diferentes síndromes mieloproliferativos excepto en la LMC. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: JAK2 se encuentra m utado en diferentes tipos de SMPC. 4. El inmunofenotipo de la LLC no presenta como característica: (a) Expresión de CD5. (b) Positividad de CD23. (c) Expresión débil de inmunoglobulinas. (d) Positividad de CD 10. (e) Puede expresar ZAP70. Respuesta correcta: d. 5. Los linfomas NK: (a) Son extremadamente comunes. (b) Tienen un curso habitualmente benigno. (c) Nunca afectan a la región de la cara. (d) No expresan CD2. (e) Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: e.

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C

A

P

Í

T

U

L

O

14

Métodos para la clasificación y el diagnóstico de las anemias J. L. Vives Corrons

CONCEPTO DE ANEMIA La anemia se define como una disminución de la concentración de hemoglobina (Hb) en sangre. Invariablemente, se acompaña de un descenso del hematocrito y casi siempre, también, del número de eritrocitos. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) existe anemia cuando la Hb en sangre es inferior a 130 g/1 en el hombre y 120 g/1 en la mujer. En el niño este criterio varía según la edad, de forma que, desde los 6 meses hasta los 6 años, el límite inferior de la hemoglobina es de 110 g/1, y entre los 6 y 14 años, de 120 g/1. Al valorar una anemia, deben tenerse siempre en cuenta todas aquellas situaciones en las que pueda existir una alteración de la distribución entre los volúmenes plasmático y globular, ya que esta puede dar lugar a falsas disminuciones de la concentración de Hb (falsa anemia por hemodilución); tal y como sucede, por ejemplo, durante el embarazo (anemia fisiológica). La anemia constituye una de las causas más frecuentes de consulta general y hematológica, por lo que su diagnóstico reviste gran importancia clínica. Aunque su mecanismo fisiopatológico común es el desequilibrio entre la formación de eritrocitos por la médula ósea (eritropoyesis) y su eliminación por los macrófagos (hemólisis), el hecho de que la anemia siempre se halle asociada a un trastorno o enfermedad subyacente hace que sus causas puedan ser muy diversas. Es por ello que, en ocasiones, determinar la causa de una anemia puede ser uno de los problemas más difíciles de la patología médica. Con mucho, la causa más frecuente de anemia es la falta de hierro (anemia ferropénica), que afecta de forma especial a mujeres y niños en edad de crecimiento.

TIPOS DE ANEMIA Desde el punto de vista fisiopatológico, la anemia puede clasificarse en dos grandes grupos: 1. Anemia regenerativa. 2. Anemia arregenerativa.

Anem ia regenerativa Se caracteriza por un aumento de los precursores eritroides (eritroblastos) de la médula ósea, o regeneración eritroblástica, por efecto del estímulo de la eritropoyetina (Epo) cuya síntesis se halla aumentada por efecto de la hipoxia. Cuando no existe trastorno de la médula ósea la regeneración eritroblástica constituye el mecanismo fisiológico de res­ puesta del organismo para hacer frente al descenso de la concentración de hemoglobina. Toda regeneración eritroblástica propia de una anemia regenerativa se acompaña siempre de un aumento de reticulocitos (reticulocitosis). Existen dos causas fundamentales de

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2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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Capítulo 14

Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

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anemia regenerativa: la hemorragia (extravasación de sangre con pérdida de eritrocitos) y hemolisis (disminución de la supervivencia de los eritrocitos en la circulación). La hemo­ rragia suele ser consecuencia de una lesión vascular con extravasación o pérdida de sangre. Si es externa, es fácilmente detectable, pero si es interna a veces resulta difícil de localizar, especialmente cuando es crónica y de pequeña intensidad (enfermedad de Rendu-Osler o telangiectasia hemorrágica congénita). En el caso de hemorragia aguda e intensa existen dos fases separadas por un período de pocas horas. Inmediatamente después de la hemo­ rragia se produce una brusca disminución de la volemia, lo que significa una disminución simultánea de eritrocitos y plasma. Debido a ello durante este período inicial, el descenso de la hemoglobina es poco apreciable. Pasadas 2 o 3 h, la hemodilución con que el organis­ mo intenta compensar el descenso de la volemia produce una rápida disminución de la concentración de hemoglobina (anemia aguda), cuya intensidad dependerá del volumen de sangre perdida. La hemorragia crónica y de pequeño volumen, como sucede en ciertas enfermedades del aparato digestivo, produce una pérdida progresiva de hierro y con ello, a la larga, una anemia ferropénica. La hemólisis es la disminución del período de vida normal de los eritrocitos en la circulación. Después de salir de la médula ósea, los eritrocitos circulan por la sangre durante aproximadamente 120 días, siendo finalmente eliminados de la circulación por los macrófagos del sistema mononuclear fagocítico (SMF). Cuando los eritrocitos son eliminados precozmente de la circulación (antes de los 120 días) existe hemólisis, y si esta es suficientemente intensa aparece una anemia (anemia hemolítica). Las causas que pueden disminuir la vida de los eritrocitos en la circulación son muy diversas y su identificación es fundamental para establecer el diagnóstico de una anemia hemolítica. El método más preciso para evidenciar la destrucción acelerada de eritrocitos es la determinación de la vida media eritrocitaria, mediante un procedimiento basado en el em­ pleo de eritrocitos del propio organismo marcados con un trazador isotópico (5lCr, T 1/2) (v. capítulo 7). Las principales causas de anemia hemolítica se resumen en el cuadro 14-1.

Anem ia arregenerativa Se caracteriza p o r la incapacidad de la médula ósea para compensar el descenso de la concentración de hemoglobina mediante un aumento de la actividad eritropoyética. Puede obedecer a dos mecanismos:

CUADRO 14-1. Causas de anemia hemolítica

Causas congénitas • Defectos genéticos de la membrana eritrocitaria (o esferocitosis hereditaria y eliptocitosis congénita) • Hemoglobinopatías (talasemias y hemoglobinopatías estructurales) • Eritroenzimopatías (déficit en glucosa-6-fosfafo deshidrogenasa y piruvato cinasa) Causas adquiridas • Presencia en el plasma de anticuerpos contra la membrana eritrocitaria (anemia hemolítica postransfusional y autoinmune) • Lesión mecánica de la membrana eritrocitaria con rotura de los eritrocitos al atravesar capilares trombosados o con depósitos de fibrina (anemias hemolíticas microangiopáticas) • Alteraciones adquiridas de la membrana de mecanismo desconocido: hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

1. Mecanismo cuantitativo: eritropoyesis disminuida o ausente. 2. Mecanismo cualitativo: eritropoyesis ineficaz. La disminución o ausencia de eritropoyesis obedece generalmente a una lesión de la célula madre pluripotente o de alguna comprometida hacia la serie mieloide. Cuando la lesión se halla en la célula madre pluripotente, la afectación no se limita a los eritro­ citos, sino que se hace extensiva a las restantes células de la sangre, leucocitos, plaquetas y, eventualmente, linfocitos. La forma mejor conocida de anemia arregenerativa es la aplasia de médula ósea, caracterizada por una práctica desaparición de los progenitores y precursores hematopoyéticos, que son substituidos p o r células grasas. Aunque su forma más frecuente es adquirida y de aparición durante la edad adulta, existe una forma muy rara de origen congénito y que aparece durante el período perinatal (enfermedad de Fanconi). En cualquier caso, la aplasia de m édula ósea es una enfermedad grave que prácticamente siempre cursa con pancitopenia y requerimiento transfusional. La causa de su aparición durante la edad adulta se desconoce, aunque existen casos en los que se asocia a infecciones víricas, contacto con sustancias químico-orgánicas (tóxicos industriales, medicamentos o radiaciones ionizantes) o a enfermedades autoinmunes. La aplasia exclusiva de la serie eritropoyética se conoce como eritroblastopenia y puede tener también un origen congénito o adquirido. La eritroblastopenia se caracteriza por la práctica desaparición de los eritroblastos de la médula ósea con conservación de las res­ tantes células de la hematopoyesis. Es por ello que su manifestación clínica fundamental es la anemia. Cuando aparece durante la edad adulta suele asociarse a un timoma, mien­ tras que cuando lo hace durante el período perinatal lo más probable es que se trate de una enfermedad de Blackfan-Diamond que, por su rareza, se incluye dentro de la lista de las llamadas anemias minoritarias (www.enerca.org). La eritropoyesis ineficaz obedece a un trastorno madurativo por el cual un porcentaje elevado de eritroblastos desaparecen de la médula ósea antes de m adurar a eritrocitos. Según su mecanismo fisiopatológico, la eritropoyesis ineficaz puede obedecer a dos causas: 1. Alteraciones de la maduración del núcleo (síntesis de ADN). 2. Alteraciones de la maduración del citoplasma (síntesis de hemoglobina). Las alteraciones de la maduración nuclear obedecen a un retraso en el proceso de maduración celular por el cual se alargan las fases intermitóticas y se prolonga el tiempo necesario para terminar el proceso. Debido a ello, junto a la muerte precoz por apoptosis de un elevado porcentaje de eritroblastos, los que llegan a m adurar m uestran una im portante disminución de la supervivencia en la circulación, con lo que la suma de aborto medular y hemólisis constituye, en este caso, el mecanismo fisiopatológico de la anemia. La forma mejor conocida de este tipo de anemia es la megaloblástica debido a una carencia de factores vitamínicos de maduración nuclear: cobalamina (vitamina B12) y folato cuyas causas pueden ser diversas (cuadro 14-2). El nombre de megaloblástica proviene de la característica morfología de los eritroblastos con disociación madurativa núcleo-citoplasmática, por la que son conocidos como megaloblastos (v. capítulo 16). Pueden observarse alteraciones morfológicas similares, debidas también a u n tras­ torno de la maduración nuclear, en otras formas de anemia que no responden a dichos factores vitamínicos. Tales casos suelen ser debidos a trastornos adquiridos, generalmente de la célula madre pluripotente, por los cuales existe un defecto en los procesos de dife­ renciación y maduración de las células hematopoyéticas. En este caso, aunque la anemia sea el signo más relevante, es frecuente observar también leucopenia y plaquetopenia. Este tipo de anemias, más frecuentes en individuos de edad avanzada (>70 años), forman parte de los llamados síndromes mielodisplásicos (SMD), denominación actual de lo

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Capítulo 14

Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

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CUADRO 14-2. Causas de anemia megaloblástica

Déficit de vitamina B12 • Ingesta inadecuada (vegetarianismo estricto) • Trastornos de la absorción intestinal o malabsorción (anemia perniciosa por defecto de factor intrínseco) Déficit de ácido fólico • Ingesta inadecuada • Hiperconsumo (crecimiento, gestación y anemias hemolíticas) • Bloqueo medicamentoso de su absorción o metabolismo (terapéutica con citostáticos antagonistas del ácido fólico)

que durante muchos años se conoció como anemias refractarias, porque no responden a ningún tratamiento. Su diagnóstico generalmente es difícil, y exige la práctica de un estudio morfológico y citogenético de la m édula ósea, además de otros aspectos que son tratados ampliamente en el capítulo 13. También existen alteraciones congénitas de la maduración nuclear que forman un grupo de anemias muy raras conocidas con el nombre de anemias diseritropoyéticas congénitas. Las alteraciones de la m aduración citoplasmática obedecen prácticamente siem­ pre a defectos en la síntesis de hemoglobina, por lo que su característica común es la de una hipocromía, es decir, escaso contenido hemoglobínico intraeritrocitario. En general, esta hipocromía se acompañan también de una disminución del volumen celular o microcitosis (VCM < 82 fl). La causa más frecuente de anemia hipocroma y microcítica es la anemia por déficit de hierro o ferropénica, pero puede obedecer a otras causas diver­ sas que se resumen en el cuadro 14-3. En el área mediterránea, otra causa relativamente frecuente de anemia hipocroma y microcítica es el defecto congénito de la síntesis de cadenas globina o talasemia que se estudia ampliamente en el capítulo 17. En el diag­ nóstico diferencial de las anemias hipocromas y microcíticas debe tenerse siempre en cuenta la anemia inflamatoria o asociada a procesos inflamatorios crónicos, porque sus características hematológicas son prácticamente superponibles a la anemia ferropénica, solo que en este caso se observa un exceso de hierro no utilizado en los macrófagos de la médula ósea (fig. 14-1) en lugar de una ausencia. Ambas formas de anemia, ferropénica e inflamatoria, son tratadas ampliamente en el capítulo 15. Los trastornos congénitos o adquiridos de la síntesis del grupo hemo constituyen causas mucho más raras de anemia microcítica y/o hipocroma. Su diagnóstico está facilitado por la gran elevación de la sideremia y de la cantidad de hierro medular, tanto a nivel de las células del SMF como de los eritroblastos (sideroblastos). Como consecuencia de ello se produce un estado de sobrecarga de hierro con acumulación del mismo en el

CUADRO 14-3. Causas de alteración de la síntesis de hemoglobina

• Más frecuente: carencia de hierro (anemia ferropénica) • Otras causas • Bloqueo del hierro en el sistema mononuclear fagocítico (procesos inflamatorios crónicos) • Déficit congénito de la síntesis de globina (talasemias) • Déficit congénito/adquirido de la síntesis del grupo hemo (anemia sideroblástica)

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGURA 14-1. Imagen de un macrófago de la médula ósea obtenida mediante la tinción de Perls.

interior de las mitocondrias, que ven alterada su morfología y propiedades funcionales (sideroacresia). El diagnóstico de una anemia sideroblástica requiere la realización de un examen morfológico y tinción de Perls del aspirado medular que muestra, junto a un aumento de la serie eritropoyética (con ciertos rasgos diseritropoyéticos) y del hierro macrofágico, la presencia de un número de sideroblastos superior al normal (>70% ) en muchos de los cuales los precipitados de hemosiderina se disponen alrededor del núcleo, por lo que son conocidos como sideroblastos «en anillo» (fig. 14-2). La reciente aparición de formas hereditarias de anemia ferropénica refractarias a la administración de hierro (IRIDA de la terminología anglosajona) ha creado un nuevo y atractivo campo en el estudio de las anemias que, junto con todo lo que se acaba de mencionar, será objeto de estudio en el capítulo 15.

SISTEMÁTICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE UNA ANEMIA La anemia no es una enfermedad, sino la manifestación de una enfermedad subyacente. Por ello, en el diagnóstico de toda anemia debe tenerse siempre presente la historia clínica y los datos aportados por el examen físico del paciente; las exploraciones com­ plementarias deben incluir, por orden cronológico, un hemograma con recuento de reticulocitos, un estudio de la morfología eritrocitaria y todas aquellas pruebas necesarias para investigar su origen. Tal y como se ha mencionado en el capítulo 4, un hemograma

FIGURA 14-2. Sideroblastos «en anillo» en un paciente con síndrome mielodisplásico tipo anemia refractaria sideroblástica. Apréciense los precipitados de hemosiderina rodeando el núcleo (MGG X 1.000).

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Capítulo 14

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es el examen básico de los componentes celulares que circulan por la sangre y por ello se le conoce también como «perfil hematológico básico» (cuadro 14-4). Un hemograma estándar incluye las magnitudes siguientes: • Eritrocitos • Concentración de hemoglobina. • Concentración de eritrocitos. • Hematocrito. • índices eritrocitarios (VCM, HCM y CCM H). • Amplitud de la curva de distribución eritrocitaria (ADE o RDW). • Leucocitos • Concentración de leucocitos. • Recuento diferencial leucocitario (RDL). • Plaquetas • Concentración de plaquetas. • Tamaño plaquetario (VPM). • Amplitud de la curva de distribución de plaquetas (ADP o PDW). En caso de anemia deben añadirse siempre otras dos magnitudes: • Reticulocitos. • Examen morfológico del frotis de sangre teñido.

Concentración de hem oglobina La existencia de anemia viene definida exclusivamente por la concentración de hemo­ globina. Por ello, dada la gran trascendencia clínica que esta m edida com porta, el Comité Internacional para la Estandarización de Hematología (ICSH) y la OMS han estandarizado su procedimiento para reducir al m ínim o las posibles causas de error metodológico (v. capítulo 6). La utilización de analizadores automatizados ha permitido una determinación rápida y fiable de la concentración de hemoglobina, y también de las restantes magnitudes del hemograma, entre las que destacan los recuentos de células (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y los índices eritrocitarios (volumen corpuscular m edio [VCM], hem oglobina corpuscular media [HCM] y concentración media de hemoglobina corpuscular [CCMH]).

Volumen corpuscular m edio y otros índices eritrocitarios Independientemente de su grado de automatización, todos los analizadores automatizados suministran, de forma sistemática, el VCM. Por ello, hoy en día, cualquier laboratorio clínico puede diferenciar entre anemia microcítica (VCM < 83 fl), macrocítica (VCM > 98 fl) y normocítica (VCM entre 83 y 98 fl), lo que perm ite establecer de forma inmediata

CUADRO 14-4. Perfil hematológico básico

• Hemograma • Concentración de hemoglobina • Valor hematocrito • Recuentos celulares (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) • índices eritrocitarios: a) volumen corpuscular medio; b) hemoglobina corpuscular media, y c) concentración corpuscular media de hemoglobina • Fórmula leucocitaria y morfología de los eritrocitos • Recuento de reticulocitos

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una prim era orientación diagnóstica. Así, una anemia microcítica es probablemente ferropénica y una anemia macrocítica, probablemente megaloblástica. Cuando la anemia se acompaña de un VCM normal (anemia normocítica), el diagnóstico es más difícil ya que puede obedecer a causas muy diversas, muchas de ellas no debidas a una enfermedad de la sangre sino de otros órganos o sistemas. Por ello ante una anemia normocítica, el valor de la concentración de reticulocitos puede contribuir decisivamente a establecer la orientación diagnóstica hacia u n a anemia de carácter regenerativo (reticulocitos aumentados) o arregenerativo (reticulocitos normales o disminuidos). El VCM, com binado con otras magnitudes eritrocitarias, se ha utilizado durante m ucho tiem po como m étodo sim ple para el escrutinio de rasgo talasém ico m e­ diante el cálculo de un factor discriminante que facilite el diagnóstico diferencial con la ferropenia. Uno de los factores discriminantes más empleados es el de England y Fraser (FD), obtenido por cálculo matemático a partir de los propios parámetros suministrados por el analizador: FD = VCM - Cifra de eritrocitos - (5 x Hb) -3 ,4 Valores de VCM superiores a 98 fl son indicativos de macrocitosis, es decir, un pre­ dom inio de eritrocitos con tam año superior al norm al. La causa más frecuente de macrocitosis es la anemia megaloblástica por carencia de ácido fólico o vitamina B12. La medida sistemática del VCM ha permitido observar tam bién frecuentes macrocitosis sin anemia que obedecen a situaciones diversas no necesariamente relacionadas con un déficit de factores madurativos o la presencia de megaloblastosis. Un ejemplo de ello es la macrocitosis asociada a ciertas hepatopatías crónicas, alcoholismo o tabaquismo. La relación entre macrocitosis y alcoholismo es tan constante que la determinación del VCM se ha utilizado junto a otras pruebas biológicas, como índice de ingesta crónica de alcohol. La HCM y la CMHC son los índices eritrocitarios relacionados con la concentración de hemoglobina. De ellos, el de mayor valor práctico es la HCM, ya que la CMHC que, teóricamente debería ser el índice más preciso del contenido hemoglobínico eritrocitario, presenta casi siempre un valor normal, aun en presencia de disminuciones importantes de la concentración de hemoglobina debido a que, se obtiene por cálculo matemático a partir de la hemoglobina y del hematocrito. El empleo de analizadores que miden de forma independiente el VCM y la HCM permite, gracias a la aplicación del llamado «principio de Mié», ofrecer un valor real de la CMHC que resulta útil para el diagnóstico de ciertas anemias minoritarias de origen congénito y caracterizadas por un aumento de la HCM (hipercromía); ejemplo de ello son la esferocitosis hereditaria y la xerocitosis congénita, dos causas raras de hemolisis corpuscular e intensa anemia.

Recuento de reticulocitos Junto al hemograma, el recuento de reticulocitos es la m agnitud de mayor valor para el estudio de una anemia, ya que permite diferenciar entre mecanismo central (anemia arregenerativa) y periférico (anemia regenerativa). El resultado del recuento de reticulocitos puede expresarse en tanto por ciento, con respecto a la cifra global de eritrocitos, o en valor absoluto. En el prim er caso, es obligado realizar una corrección debido a que el porcentaje se refiere siempre a una cifra normal de eritrocitos, lo cual no se cumple prácticamente nunca en la anemia, en donde en la mayoría de los casos existe un descenso del número de eritrocitos. Sin la corrección, el porcentaje de reticulocitos queda referido a una población eritrocitaria numéricamente normal y, por tanto, su valor cuando esta se halla disminuida es siempre superior al real (v. capítulo 4).

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Capítulo 14

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Exam en m orfológico de la sangre El examen morfológico de los eritrocitos en una extensión de sangre bien realizada y teñida constituye una exploración imprescindible en el diagnóstico etiológico de toda anemia. Ello es así ya que en ciertas anemias, la observación de la morfología eritroci­ taria constituye el único procedimiento diagnóstico de valor (esferocitosis hereditaria, eliptocitosis congénita y anemia hemolítica microangiopática o mecánica). Asimismo, ante cualquier anemia de origen desconocido, resulta útil valorar la intensidad de la policromasia (índice de reticulocitosis), anisopoiquilocitosis con dacriocitosis y presencia de algún eritroblasto (metaplasia mieloide), punteado basófilo (saturnismo, talasemia) y anillos de Cabot o cuerpos de Howell-Jolly (diseritropoyesis, esplenectomía). Para interpretar las alteraciones morfológicas eritrocitarias, se puede hacer una clasificación en cuatro grandes grupos: 1. Alteraciones del tamaño. 2. Alteraciones de la forma. 3. Alteraciones del color. 4. Presencia de inclusiones.

Alteraciones del tamaño Actualmente, las alteraciones del tamaño eritrocitario se basan en los datos cuantitativos aportados por el VCM, por lo que no se requiere la observación de la extensión de sangre La medida electrónica del tamaño eritrocitario tiene el grado de exactitud y precisión que requiere el diagnóstico clínico. En caso de rasgo talasémico, el examen de la morfología eritrocitaria suele m ostrar una población de eritrocitos microcíticos que, debido a su uniformidad, podría pasar fácilmente desapercibida mediante el examen óptico conven­ cional de la extensión. Si bien es cierto que una hipocromía muy intensa como la que puede observarse en algún caso de anemia ferropénica, no suele pasar nunca inadvertida a los ojos de un observador experto, la microcitosis del rasgo talasémico, especialmente cuando es muy uniforme y afecta a casi la totalidad de la población eritrocitaria, puede resultar difícil de apreciar. En este caso, la ventaja de los analizadores automatizados sobre el ojo humano es que, al valorar individualmente el tamaño de gran número de eritrocitos, la microcitosis, cuando existe, no pasa nunca inadvertida. En ocasiones, pueden coexistir simultáneamente varias alteraciones de tamaño, lo que se denomina anisocitosis. La macrocitosis, un signo morfológico característico de la anemia megaloblástica, consiste en la presencia de macrocitos (o megalocitos), que son eritrocitos de gran tamaño y a veces ligeramente ovalados; este rasgo lo define como de origen megaloblástico (fig. 14-3). Se observan, por tanto, en la anemia megaloblástica por déficit de vitamina B12 o ácido fólico, aunque ocasionalmente pueden observarse tam bién en ciertas anem ias diseritropoyéticas acom pañando a una mielodisplasia adquirida o a un trastorno congénito. No siempre que se aprecia macrocitosis debe pensarse en megaloblastosis, ya que existen causas de macrocitosis no megaloblástica. Tal sucede en las hepatopatías crónicas y en grandes fumadores. En todos estos casos, los macrocitos son redondos, no ovales, y no suelen aparecer signos de eritropoyesis ineficaz como, por ejemplo cuerpos de Hovell-Jolly o anillos de Cabot característicos de la anemia perniciosa.

Alteraciones de la forma La alteración de la forma eritrocitaria puede obedecer a defectos hereditarios o adquiridos de la eritropoyesis (diseritropoyesis) o del eritrocito (eritropatías).

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FIGU RA 14-3. Frotis de sangre de un paciente con anemia macrocítica debida a déficit de vitamina B12 (anemia perniciosa). Muchos eritrocitos muestran un tamaño superior al normal (macrocitos) y algunos contienen inclusiones llamadas «cuerpos de Howell Jolly». Los macrocitos de mayor tamaño muestran también cierto grado de ovalocitosis, lo que es una consecuencia más del trastorno madurativo. Apréciese también un polinuclear hipersegmentado (pleocariocito) característico de las anemias carenciales de curso avanzado, muy especialmente de las secundarias a déficit de folato y vitamina B12, aunque pueden observarse también en la anemia ferropénica (MGG X800).

En la diseritropoyesis, lo que suele observarse es la coexistencia de eritrocitos con diversas formas (poiquilocitosis). Igualmente sucede con las alteraciones morfológicas adquiridas por acción de diferentes causas extraeritrocitarias (anisopoiquilocitosis). En los defectos eritrocitarios congénitos o de origen hereditario, predomina un tipo de alteración morfológica sobre cualquier otra, lo que facilita el diagnóstico. Entre estas, las más frecuentes son las siguientes: • Esferocitos. Son eritrocitos que tienen forma esférica, es decir, un diámetro inferior al norm al. No obstante, conservan el m ism o VCM que los eritrocitos norm ales (fig. 14-4). La causa más frecuente de esferocitos es la hereditaria o enfermedad de Minkowski-Chauffard, en la que existe un pequeño porcentaje de eritrocitos esféricos debido a un defecto congénito de la membrana eritrocitaria (alteración estructural de

FIGURA 14-4. Frotis de sangre de un paciente con esferocitosis hereditaria. Los esferocitos se identifican por su menor diámetro y su mayor densidad hemoglobínica. Apréciese que los esferocitos carecen de la palidez central característica de los eritrocitos maduros (MGG X800).

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FIGU RA 14-5. Frotis de sangre de un paciente doble heterocigoto con hemoglobinopatía C/p-talasemia (Hb 7,5 g/1 y VCM 67 fl). Junto a eritrocitos prácticamente desprovistos de hemoglobina (hipocromía), se observan otros cuya palidez central forma una imagen densa con una disposición que recuerda a la de una diana. A estos eritrocitos se les conoce como dianocitos o codocitos (MGG X800).

la anquirina, la banda 3 o de la proteína 4,2). La esferocitosis puede tener también un origen adquirido, como, por ejemplo, en los casos en que la membrana eritrocitaria se altera por factores extraeritrocitarios diversos tales como anticuerpos (anemia hemolítica autoinmune), toxinas bacterianas (lecitinasa del Clostridium welchii) o efectos mecánicos (anemia microangiopática) (v. capítulo 18). Codocitos. Son eritrocitos que poseen un exceso de superficie, por lo que aparece en su región central un área con mayor contenido hemoglobínico (zona densa), que se sitúa en el centro del área clara norm al. Esto explica el que se les conozca clásicamente con el nombre de eritrocitos en diana o dianocitos, y frecuentemente son observados en ciertas hemoglobinopatías, tales como la talasemia y HbC, o en la anemia ferropénica y en ciertas hepatopatías crónicas con aumento del contenido en colesterol y fosfolípidos de la m embrana eritrocitaria (fig. 14-5). Drepanocitos. Se denominan también eritrocitos falciformes por su forma caracterís­ tica, ya que, debido a un proceso de polimerización hemoglobínica, se alargan y adquieren forma de hoz o media luna. Su aparición es propia del estado homocigoto de hemoglobinopatía S y su núm ero aumenta si la sangre se expone a condiciones anaerobias o a agentes reductores (fig. 14-6).

FIGURA 14-6. Frotis de sangre de un paciente de raza negra afecto de una anemia falciforme por hemoglobinopatía S homocigota (HbS). Los eritrocitos falciformes se identifican fácilmente por su forma alargada (rígida), en semiluna o de hoz (MGG X800).

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FIGU RA 14-7. Frotis de sangre de un paciente afecto de eliptocitosis congénita (EC), en el que los eliptocitos se identifican por su forma alargada y ovalada (MGG X800).

Eliptocitos. En esta alteración morfológica, los eritrocitos son alargados u ovales (ovalocitos) y presentan un diámetro longitudinal superior al transversal, por lo que adquieren la forma de «puro habano» u ovoide (fig. 14-7). Su presencia puede ser debida a una alteración congénita de la m em brana eritrocitaria (eliptocitosis congénita), aunque también se observa de forma adquirida en el curso de la anemia megaloblástica, ferropénica o arregenerativa (mielofibrosis medular) (v. capítulo 18). Equinocitos. Son eritrocitos cuya superficie se halla repleta de prominencias cortas, tienen una base de implantación ancha y están distribuidos regularmente (eritrocitos espiculados o crenados) (fig. 14-8). La equinocitosis es un fenómeno que aparece es­ pontáneamente en sangre conservada debido a un descenso del ATP intraeritrocitario, aunque puede observarse en el curso de ciertas eritroenzimopatías de la glucólisis (déficit de piruvato cinasa) o de ciertas enfermedades no hematológicas (insuficiencia renal). Acantocitos. Son eritrocitos esferoidales que presentan prominencias superficiales alargadas y que casi siempre están distribuidas de manera irregular; su base de im­ plantación es estrecha (fig. 14-9). Característicamente, esta alteración eritrocitaria aparece en un tipo de enfermedad congénita denominada acantocitosis, en la que

FIGURA 14-8. Sangre periférica de un paciente afecto de déficit congénito de piruvato cinasa (PK) eritrocitaria. Se observan numerosos equinocitos o eritrocitos con prominencias cortas, distribuidas regularmente, y cuya base de implantación es relativamente ancha (MGG X800).

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FIGURA 14-9. Sangre periférica de un paciente con abetalipoproteinemia y acantocitosis. Los acantocitos, a diferencia de los equinocitos, son esferoidales con prominencias alargadas con base de implantación estrecha y, casi siempre, distribuidas irregularmente (MGG X800).

existe ausencia de lipoproteínas plasmáticas. Asimismo, puede observarse también en el curso de la insuficiencia hepatocelular grave (spur-cells). Dacriocitos. Reciben esta denominación los eritrocitos con forma de lágrima o de raqueta (fig. 14-10) y suelen observarse en los trastornos de la eritropoyesis (anemia megaloblástica, anemia ferropénica, talasemia) y, fundamentalmente, en la fibrosis medular o mielofibrosis. Esquistocitos. Corresponden a eritrocitos rotos o fragmentados. En general, pue­ den presentar formas muy diversas, aunque predom inan las triangulares o las que adquieren el aspecto de un casco de guerrero (fig. 14-11). Los esquistocitos suelen observarse en el curso de anemias hemolíticas de origen mecánico, anemias hemolíticas microangiopáticas o debidas a la colocación de prótesis valvulares. Estomatocitos. Son eritrocitos que en su región central clara poseen una hendidura en forma de boca (fig. 14-12). Aparecen de forma característica en una enfermedad conocida con el nombre de estomatocitosis congénita, que cursa con aumento de la permeabilidad pasiva de la membrana eritrocitaria al sodio y aumento del contenido acuoso intraeritrocitario (estomatocitosis hidratada). No obstante, pueden observarse tam bién en la esferocitosis hereditaria, en el alcoholismo y en el curso de alguna eritroenzimopatía.

FIGURA 14-10. Sangre periférica de un paciente con anemia arregenerativa debida a síndrome mieloproliferativo tipo mielofibrosis idiopática (MI) con intensa esplenomegalia. Se observan numerosos dacriocitos (eritrocitos en forma de lágrima) sugestivos de MI (MGG X800).

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FIGURA 14-11. Sangre periférica de un paciente con anemia hemolítica, acompañada de intensa plaquetopenia, e insuficiencia renal, en la que se observan numerosos eritrocitos fragmentados o esquistocitos, característicos de una hemólisis microangiopática debida a síndrome hemolítico urémico (SHU) (MGG X800).

FIGURA 14-12. Sangre periférica de un paciente afecto de estomatocitosis congénita y anemia hemolítica moderada. Los estomatocitos son eritrocitos en los que su zona clara se presenta como una hendidura en forma de boca. En realidad, los estomatocitos son eritrocitos que han perdido una de sus concavidades (unicóncavos) y que, al ser deformados por efecto de la extensión, adquieren esta forma peculiar, útil para el diagnóstico de la enfermedad (MGG X800).

El empleo del microscopio electrónico de barrido (MEB) ha permitido estudiar mejor los aspectos morfológicos de estas y otras alteraciones eritrocitarias, contribuyendo de manera fundamental al conocimiento de su fisiopatología. Excentrocitos. Son eritrocitos con distribución irregular de la hemoglobina, de forma que esta aparece como despegada de la parte interna de la m embrana y concentrada en uno de sus extremos (fig. 14-13). Morfológicamente, se caracterizan por poseer contornos parcialm ente arrugados y, en general, un tam año inferior al normal. Suelen aparecer de manera especial en el curso de ciertas anemias hemolíticas indu­ cidas por agentes oxidantes (medicamentos o sustancias químicas) y en el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa después de la ingesta de habas (favismo), caso en el que los eritrocitos son pequeños. Eritrocitos pinzados. Son eritrocitos con un estrangulamiento o pinzamiento que les confiere la forma de una «seta». Se observan de forma casi exclusiva en la esferocitosis hereditaria, donde coexisten con los esferocitos en aquellas formas debidas al déficit de banda 3 (fig. 14-14). Su presencia constituye un criterio importante para establecer el diagnóstico de EH. Eritrocitos con tendencia a formar «pilas de moneda» (fig. 14-15). Se observan cuando existe una tendencia a la aglutinación eritrocitaria, debida a la presencia de una inmunoglobulina que la favorece, como por ejemplo, un gran aumento de IgM.

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FIGU RA 14-13. Sangre periférica de un paciente con crisis de anemia hemolítica aguda después de la ingesta de habas (favismo) debido a un déficit congénito de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Obsérvense varios excentrocitos con la hemoglobina desplazada hacia uno de los extremos del eritrocito, dejando el citoplasma desprovisto de la misma (MGG X800).

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FIG U RA 14-14. Sangre periférica de un paciente con esferocitosis hereditaria (EH). Se aprecian pocos esferocitos, pero en el centro de la imagen hay un eritrocito en forma de seta o como si estuviera pinzado. La observación de este tipo de alteración morfológica es altamente sugestiva de EH por déficit de banda 3 (MGG X800).

FIGU RA 14-15. Cuando en el plasma existe un aumento importante de inmunoglobulinas, especialmente de IgM (como sucede en la macroglobulinemia de Waldenstrom), los eritrocitos tienden a agregarse dando una imagen parecida a las «pilas de monedas». Esto es lo que sucede en esta extensión de sangre perteneciente a un paciente con gammapatía monoclonal (MGG X800).

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FIGU RA 14-16. Intensa anisopoiquilocitosis en una extensión de sangre periférica de un niño con piropoiquilocitosis congénita (PPC), una forma grave de eliptocitosis congénita (EC) (MGG X800).

Es p or ello que se observa en las gammapatías monoclonales, especialmente en el mieloma múltiple y la macroglobulinemia de Waldenstrom. • A nisopoiquilocitosis. Se refiere a la presencia de eritrocitos de diferentes formas y tamaños. A bundan los dacriocitos y los equinocitos, a la vez que se observa una alteración del color con presencia de doble población eritrocitaria (fig. 14-16). Se observa en la piropoiquilocitosis congénita (PPC), una forma grave de eliptocitosis congénita (EC) de presentación neonatal con un cuadro clínico de anem ia muy intensa

Alteraciones del color Su aparición refleja alteraciones en el contenido hemoglobínico. Existe hipocromía cuando los eritrocitos se tiñen débilmente con el m étodo convencional (eritrocitos pálidos). La hipocromía es siempre la consecuencia de una disminución del contenido hemoglobínico eritrocitario, por lo que, si no existe una enfermedad que la explique, debe descartarse, en prim er lugar, la ferropenia (defecto de la síntesis del hemo) o la talasemia (defecto de la síntesis de globina) (fig. 14-17).

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La policromasia es la presencia de eritrocitos con tonalidad gris azulada. Su aparición es signo de inmadurez celular, por lo que suele observarse en casos de anemia regenerativa (reticulocitosis) o en ciertas anemias arregenerativas acompañadas de salida prematura de reticulocitos a sangre periférica (desviación reticulocitaria). Los eritrocitos policromá­ ticos se caracterizan por un relativo gran tamaño (macrocitos) y su coloración azulada, en comparación con el resto de eritrocitos, debido a su elevado contenido en ARN. La doble población o anisocromasia se refiere a la coexistencia de eritrocitos hipocromos y norm ocrom os, fenóm eno que puede observarse en la anem ia ferropénica tratada, después de que se practique una transfusión sanguínea, y en el curso evolutivo de ciertas anemias debidas a trastornos de la eritropoyesis o de maduración (v. fig. 14-16).

Presencia de inclusiones intraeritrocitarias En ocasiones, los eritrocitos pueden presentar inclusiones de naturaleza diversa de acuerdo con el origen de las mismas: • El punteado basófilo tiene el mismo significado que la policromasia y corresponde a gránulos ribosóm icos, que al form ar agregados de color azul intenso, pueden apreciarse fácilmente mediante el microscopio óptico convencional (fig. 14-18). Un eritrocito con punteado basófilo es, por tanto, u n eritrocito con elevado contenido en ARN y puede tratarse de un reticulocito. La observación de punteado basófilo se relaciona con el tiempo de secado de la preparación previa a su tinción y se debe a que el eritrocito tiene un defecto congénito o adquirido para la degradación del ARN (déficit de pirimidina-5'-nucleotidasa eritrocitaria). En el saturnismo o intoxicación por el plomo existe un déficit adquirido de esta enzima, que puede ser la causa del punteado basófilo. • La granulación azurófila corresponde a pequeñas granulaciones eritrocitarias de color violeta púrpura, que corresponden a restos de núcleo eritroblástico, producto de la cariorrexis (polvillo nuclear). En general, se observan en el curso de ciertos síndromes diseritropoyéticos congénitos y/o adquiridos. • Los anillos de Cabot corresponden probablem ente a restos de m icrotúbulos que quedan después de una mitosis anormal (fig. 14-19). Su presencia pone de manifiesto una afectación importante de la eritropoyesis. • Los cuerpos de Howell-Jolly son restos de cromatina que persisten en el interior de los eritrocitos m aduros (fig. 14-20). Generalmente, suelen observarse después de una esplenectomía o en el curso de una anemia megaloblástica, donde constituyen un signo periférico de diseritropoyesis.

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FIGU RA 14-18. Imagen característica de punteado basófilo eritrocitario en sangre periférica de un paciente con déficit congénito de pirimidina-5’-nucleotidasa (P5’N). Esta imagen es prácticamente superponible a la que se observa en el saturnismo o intoxicación por plomo (MGG X800).

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FIGURA 14-20. Cuerpos de Howell-Jolly en el interior de los eritrocitos de un paciente esplenectomizado. Constituyen restos de ADN que persisten en los eritrocitos maduros debido a una alteración de la eritropoyesis, primaria o secundaria.

Los eritrocitos nucleados son eritroblastos circulantes (fig. 14-21) y su presencia cons­ tituye un signo de intensa regeneración eritroblástica (anemia hemolítica intensa y esplenectomía) o de infiltración m edular por células malignas del propio tejido hematopoyético (leucemias) o procedentes de otros tejidos neoplásicos (metástasis medular o mieloptisis). O tra causa de eritroblastosis es la existencia de focos eritropoyéticos extramedulares (metaplasia mieloide). A veces, la presencia de eritroblastos

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circulantes se puede acompañar de la salida simultánea a sangre periférica de células inmaduras de la serie granulopoyética (síndrome leucoeritroblástico). • Los parásitos. La forma más característica de parasitosis intraeritrocitaria es el paludis­ mo o malaria, en la que, durante los accesos febriles pueden observarse los parásitos de esta enfermedad con su característica forma anillada que contiene un pequeño núcleo central. Cuando el número de formas parasitarias es reducido, se facilita su localización practicando la técnica de la gota gruesa teñida con el método de Giemsa (v. capítulo 24). El examen morfológico de los eritrocitos debe com plem entarse con el del resto de las células sanguíneas, es decir, u n examen completo de la extensión de sangre, ya que, en ocasiones, puede aportar im portante inform ación sobre el posible origen de una anemia. El examen morfológico de los leucocitos (fórmula leucocitaria) informa sobre la existencia de alteraciones cualitativas de los leucocitos, eventualmente aso­ ciadas a la anemia. Ejemplo de ello es la observación de leucocitos neutrófilos des­ granulados que puede orientar el diagnóstico hacia determinadas formas de anemia refractaria o mielodisplasia, o la de pleocariocitos o granulocitos hipersegmentados que es un indicador de anemia carencial p o r déficit de factores madurativos (ácido fólico, vitam ina B12 o hierro). También ciertas alteraciones linfocitarias como, por ejemplo, la presencia de linfocitos reactivos o virocitos sugieren la coexistencia de una enferm edad vírica o síndrom e linfoproliferativo com o posibles causas de la anemia. Igualmente, la observación de células inm aduras o de eritroblastos orienta hacia una infiltración m edular por blastos leucémicos (leucemia aguda), tejido fibroso (mielofibrosis) o células neoplásicas de diverso origen (síndrome leucoeritroblástico paraneoplásico). Sim ultáneam ente, la observación m orfológica del frotis perm ite efectuar una estimación aproximada del núm ero y las características morfológicas de las plaquetas. La im portancia diagnóstica del examen m orfológico de la sangre se ha tratado en el capítulo 4.

Estudio etiológico de la anem ia En el estudio etiológico de toda anemia es fundamental disponer de la información aportada por el estudio clínico del paciente. Solo conociendo la historia clínica y los datos de exploración física del paciente se podrá seleccionar adecuadamente la batería

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de exámenes complementarios necesarios para diseñar el protocolo diagnóstico que ha de conducir al conocimiento de la causa de la anemia. A veces esto es un proceso relativamente fácil, pero otras resulta extremadamente difícil, especialmente cuando se trata de diagnosticar la causa de anem ias poco conocidas y de baja prevalencia en nuestra población (anem ias m in o ritarias). Las anem ias m inoritarias form an parte de las enfermedades raras cuya prevalencia en Europa es inferior a 5 p or cada 10.000 habitantes. La mayoría son de origen congénito, e incluso después de realizar num erosos estudios no se llega a conocer su origen (anemias de diagnóstico difícil). A lgunas veces la dificultad diagnóstica obedece a que la anem ia tiene un origen m ultifactorial, que hace m uy difícil delim itar con precisión cuál es el mecanism o prim ario o las posibles interferencias com o posibles causas. A fortunadam ente la Com isión Europea, dentro de su Program a de Salud Pública dedicado a enferm e­ dades raras, ha cofinanciado con el Hospital Clinic de la Universidad de Barcelona un proyecto para crear una Red Europea de Referencia en Anemias M inoritarias o Raras llamada ENERCA (European Network for Rare and Congenital Anemias), cuya web de consulta es www.enerca.org. Esta página ofrece un sistema de ayuda para la orientación de una anem ia (flowchart), de form a que introduciendo el sexo y tres m agnitudes biológicas (concentración de hem oglobina, VCM y reticulocitos) se puede conocer si se padece, o no, una anemia, y en el prim er caso ofrece un diagrama de flujo que indica las pruebas que se deben realizar para conseguir u n a p rim e­ ra orientación diagnóstica. Actualmente, para iniciar el diagnóstico de toda anem ia basta con analizar con precisión los datos aportados p o r el hem ogram a estándar autom atizado, en especial la concentración de hem oglobina y el VCM. Tal y como se ha m encionado con an terioridad, la posibilidad de obtener el VCM m ediante procedim ientos autom atizados supuso, hace ya bastantes años, un hito en la his­ toria de la hematología, ya que constituye un criterio de valor extraordinario para realizar una prim era orientación etiológica de la anemia. Así, si el VCM está alterado, el diagnóstico etiológico de la anem ia puede confirm arse realizando u n a conjunto de pruebas dependiendo de si este tiene un valor inferior a 82 fl (o microcitosis) (fig. 14-22) o superior a 98 fl (o macrocitosis) (fig. 14-23). En caso de que el VCM sea normal (82 a 98 fl), se trata de una anemia normocítica y su orientación requiere la práctica de un recuento de reticulocitos para saber si es regenerativa o arregenerativa (fig. 14-24).

Anemia regenerativa Una vez descartada la hemorragia oculta, debe pensarse en un origen hemolítico. Para ello deben practicarse un conjunto de determinaciones que permitirán confirmar dicho origen (cuadro 14-5): • El aumento de la bilirrubina con predominio de la forma no conjugada, prehepática o indirecta obedece al hipercatabolismo hemoglobínico. La bilirrubina deriva de la degradación del grupo hemo y, en el plasma, es transportada por la albúmina hacia el hígado, donde se conjuga al ácido glucurónico. En la anemia hemolítica, debido al exceso de bilirrubina plasmática liberada por las células del SMF se sobrepasa la capacidad de conjugación, y aumenta su fracción no conjugada o libre (bilirrubina indirecta). • El aumento de la lactato deshidrogenasa (LDH) se debe a la hemólisis con liberación de la LDH intraeritrocitaria hacia el plasma. El origen eritrocitario de la LDH puede ponerse de manifiesto m ediante el estudio de sus isoenzimas (predominio de las fracciones LD1 y LD2).

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Capítulo 14

Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

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FIGU RA 14-22. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia microcítica (VCM < 82 fl).

La dism inución de la haptoglobina plasm ática se debe a su u n ió n a la hem o­ globina cuando esta aparece librem ente en el plasm a. La haptoglobina es una a-glucoproteína sintetizada en el hígado y cuya estructura se halla determ inada genéticamente en tres fenotipos con diferente capacidad para fijar la hemoglobina. La hemoglobina forma con la haptoglobina un complejo hemoglobina-haptoglobina, que es elim inado y degradado p o r el hígado. D ebido a ello, cuando existe gran cantidad de hemoglobina libre en el plasma (>1,5 g/1), se produce la práctica desa­ parición de la haptoglobina, ya que el hígado no puede compensar p o r neosíntesis toda la que se elimina con la formación del complejo hemoglobina-haptoglobina. La haptoglobina solo se fija a la hemoglobina y no lo hace a grupos hemo libres ni a la mioglobina. El aumento de estercobilinógeno fecal es u n índice m uy preciso de hemólisis y está directamente relacionado con el aumento de la excreción biliar de bilirrubina. Así, cuando existe hemólisis, el estercobilinógeno, al ser un derivado intestinal de la bili­ rrubina, se elimina abundantemente por las heces. La determinación de la vida media eritrocitaria (51CrTl/2) es el método más directo y específico para demostrar la existencia de hemólisis, pero debido al carácter engorroso

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGU RA 14-23. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia macrocítica (VCM > 98 fl).

de su realización, resulta difícil su aplicación sistemática. El procedim iento más empleado consiste en el mareaje de eritrocitos del paciente con cromo radioactivo (Na5IC r0 4) y seguir posteriormente la desaparición de la radiactividad mediante el análisis de muestras sanguíneas extraídas sucesivamente en el transcurso de varios días. Mediante este procedimiento se obtienen valores de vida media eritrocitaria (51CrTl/2) norm al que varían entre 25 y 35 días (v. capítulo 9). La hemólisis cursa siempre con una disminución más o menos intensa de la vida media eritrocitaria. La determinación de la vida media eritrocitaria mediante 5lCr suele acompañarse del estudio de la captación del trazador en los tejidos que intervienen en la destrucción eritrocitaria (detecciones externas). C on ello puede valorarse el grado con que cada uno de ellos (bazo y/o hígado) contribuye a la eliminación de los eritrocitos de la circulación y, por tanto, su influencia en el mecanismo fisiopatológico de la hemólisis (hipercaptación esplénica y/o hepática) (v. capítulo 8).

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Capítulo 14

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Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

RETICULOCITOS

Normales/disminuidos

Mielograma

Sangre en las heces

Hemorragia digestiva

Negativa Estudio de hemodiálisis: LDH Bilirrubina Haptoglobina

Investigar la causa

Celularidad disminuida

Biopsia medular Prueba de Coombs

Negativa

Anemia hemolítica autoinm une

Aplasia Displasia

Celularidad normal o aumentada

No evidencia de hemorragia maligna

Factores madurativos Función tiroidea Búsqueda de metástasis

O tras causas de hem ólisis

Estudio inmunohematológico completo Estudio de enzim as eritrocitarias (G6PD, PK, otras) Investigación de HPN (CD55, CD59) Estudio de hemoglobinas Prueba de la resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) Mielograma con tinción de Perls Factores madurativos (vitamina B 12 y ácido fólico) Investigación de tóxicos (cobre, plomo, entre otros)

Estudio morfológico, inm u nofen otípico, m olecular y citogenético de la médula ósea

FIGU RA 14-24. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia normocítica (VCM: 82-98 fl).

CUADRO 14-5. Alteraciones biológicas características de hemólisis • H iperbilirrubinem ia con predom inio de la fracción indirecta (no conjugada) • A um ento de la lactato deshidrogenasa sérica con predom inio de las isoenzimas LD, y LD2 • D ism inución de la h aptoglobina plasm ática o ausencia total de la m ism a • A cortam iento de la vida m edia eritrocitaria (51C rT 1/2)

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

U na vez confirm ado el origen hem olítico de la anem ia deberá establecerse una pauta diagnóstica para esclarecer su origen (v. fig. 14-7). En el cuadro 14-6, se resumen los principales procedimientos que se utilizan en la práctica clínica para una prim era orientación diagnóstica.

Anemia arregenerativa C uando la exploración clínica del enfermo y los exámenes generales de laboratorio no son suficientes p ara establecer u n a o rientación etiológica de la m ism a, debe procederse a la práctica de un aspirado m edular e incluso, si es necesario, a la de una biopsia ósea. • El aspirado m edular m ostrará los aspectos cuantitativos y cualitativos de la serie eritropoyética (aum ento o dism inución de la misma o presencia de alteraciones morfológicas de los eritroblastos) y permitirá descartar la presencia de un síndrome mieloproliferativo o linfoproliferativo, o de una metástasis neoplásica como causas de anemia. Ante la sospecha de aplasia o mielofibrosis es obligada la práctica de una biopsia ósea mediante aguja de Jamshidi o un trocar similar. En muchas ocasiones, la imagen de la biopsia ósea resulta espectacularmente distinta a la que se aprecia con el simple aspirado medular. Ello se debe a que, mientras este analiza un área muy limi­ tada de la médula ósea (a veces un foco eritroblástico o linfoide), la biopsia informa sobre una parcela amplia del hueso y permite valorar sus características anatómicas y la disposición del tejido hematopoyético entre ellas (v. capítulo 8, tabla 8-3). • El examen de la m édula ósea debe acompañarse siempre de la tinción de Perls del aspirado (azul de Prusia), ya que con ello se valora de forma muy precisa el estado de las reservas férricas del organismo (hemosiderina de los histiocitos medulares) y el hierro no hemínico de los eritroblastos (sideroblastos). La muestra obtenida del

CUADRO 14-6. Métodos para el diagnóstico etiológico de una anemia hemolítica • Análisis m inucioso de la m orfología eritrocitaria • Interés diagnóstico: esferocitosis hereditaria y eliptocitosis congénita, anem ia falciforme • Análisis m inucioso de los eritrocitos som etidos a tin ció n vital (tinción de reticulocitos) al objeto de descubrir precipitados espontáneos de hem oglobina • Interés diagnóstico: hem oglobinopatías inestables, a-talasem ia (H bH ) • Prueba d e C oom bs (directa e indirecta) • Interés diagnóstico: anem ia hem olítica auto in m u n e • Resistencia osm ótica eritrocitaria (con sangre fresca e incubada 24 h a 37 °C) • Interés diagnóstico: esferocitosis hereditaria • Estudio de hem oglobinas • Interés diagnóstico: hem oglobinopatías estructurales (HbS y H b C ), p-talasem ia • Pruebas de estabilidad m olecular de la hem oglobina • Interés diagnóstico: hem oglobinopatías inestables • D eterm inación de las enzim as eritrocitarias (G6PD y PK) • Interés diagnóstico: favismo y hem ólisis m edicam entosa, anem ia hem olítica crónica • Prueba de hem ólisis en m edio ácido (Ham -D acie) y de la sacarosa* • Interés diagnóstico: hem oglobinuria paroxística n o ctu rn a ' Actualmente en desuso y sustituida p o r la determinación de los marcadores antigénicos CD55 y CD59 en hematíes y leucocitos m ediante citofluorometría.

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Capítulo 14

Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

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aspirado medular puede también utilizarse para otros exámenes complementarios (citogenéticos, bacteriológicos, citoquímicos y ultraestructurales). Como se ha mencionado anteriormente, utilizando la información contenida en la web de ENERCA puede obtenerse de forma rápida y precisa la orientación etiológica de una anemia, aunque para ello sea siempre indispensable conocer tres magnitudes fundamentales: hemoglobina, VCM y reticulocitos. ENERCA facilita tam bién inform ación sobre las anemias en general, y ayuda al diagnóstico de aquellas en las que averiguar su origen resulta más difícil. La posibilidad de realizar consultas online y solicitudes de «segunda opinión» resulta tam bién ex­ traordinariamente útil para los pacientes, pero también para los médicos, que muchas veces desconocen este tipo de enfermedades raras.

LECTURAS RECOMENDADAS Bunn HF. Approach to the anemias. En: Goldman L, Schafer AI editors. Cecil Medicine. 24.a ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2011. Chapter 161. Hoffman R, Benz EJ, Silberstein LE, Heslop K, Weitz J, Anastasi J. Haematology. Basic Principles and Practice. Approach to Anemia in the Adult and Child. 6.a ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2013. Vives Corrons JL. Introducción al estudio de la anemia. Aspectos generales del diagnóstico. En: Sans Sabrafen J, Besses Raebel C, Vives Corrons JL editors. Hematología clínica. 5.a ed. Barcelona: Elsevier; 2006.

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Capítulo 14

Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

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Autoevaluación 1. ¿Qué es una anemia? (a) Una enfermedad grave. (b) La consecuencia de comer poco. (c) Un descenso del núm ero de hematíes. (d) Un descenso de la concentración de hemoglobina. (e) Todas las anteriores. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: la anemia se define como una disminución de la concentración de hem o­ globina (Hb) en sangre. 2. Una anemia regenerativa se caracteriza por: (a) Un aum ento del núm ero de reticulocitos. (b) Un descenso del volumen corpuscular medio. (c) Una regeneración del tejido óseo. (d) Una aumento del núm ero de eritroblastos. (e) Un aum ento de esferocitos circulantes. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: la anemia regenerativa, al contrario que la arregenerativa, se caracteriza por un aum ento de eritroblastos y, por tanto, de reticulocitos. 3. En una hemorragia, la cifra de reticulocitos: (a) Disminuye. (b) Aumenta. (c) Novaría. (d) Sufre variaciones intermitentes. (e) Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: una hemorragia produce anemia y, como consecuencia, una regeneración de la serie eritroblástica y un aumento del núm ero de reticulocitos. 4. El procedimiento más preciso para saber si existe hemólisis es: (a) La cifra de reticulocitos. (b) La concentración de hemoglobina. (c) El volumen corpuscular medio. (d) El valor de la vida m edia eritrocitaria. (e) La morfología eritrocitaria. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: todas las pruebas que se utilizan en el laboratorio clínico para diagnosticar la existencia de hemólisis son indirectas, excepto la m edida de la vida media eritrocitaria, que es la única que permite confirmarla m ediante un método directo. 5. La eritropoyesis ineficaz puede ser causa de: (a) Policitemia. (b) Poliglobulia. (c) Anemia. (d) Hemólisis. (e) Síndrome leucoeritroblástico. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la diseritropoyesis es una causa de anemia porque consiste en una muerte prem atura de los eritroblastos antes de m adurar a hematíes. 6. El dato clínico de laboratorio más característico del déficit de ácido fólico es: (a) La intensa anemia. (b) Los trastornos neurológicos. (c) La macrocitosis. (d) La policromasia. (e) La reticulocitosis.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el déficit de ácido fólico es causa de anemia megaloblástica y, por tanto, su signo clínico de laboratorio más característico es la macrocitosis o aumento del VCM. 7. Los defectos hereditarios o adquiridos de incorporación del hierro al grupo hem o suelen cursar con: (a) Anisopoiquilocitosis. (b) Hipercromía. (c) Sideroblastos en anillo. (d) Reticulocitosis. (e) Porfiria. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: los defectos de incorporación del hierro al grupo hem o producen una acumulación de hierro en el citoplasma de los eritroblastos bajo la form a de hemosiderina; son unos precipitados que rodean al núcleo como si fuera un anillo. A estos eritroblastos se les denomina «en anillo» y pueden ponerse de manifiesto mediante la tinción de Perls. La presencia de sideroblastos «en anillo» se conoce como sideroacresia. 8. En una anemia, el examen morfológico de los hematíes es fundamental para el diagnóstico de: (a) Policitemia vera. (b) Reticulocitosis. (c) Esferocitosis. (d) Mielofibrosis. (e) Aplasia medular. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: el examen morfológico de los hematíes es siempre un complemento indis­ pensable en el estudio de toda anemia, pero resulta imprescindible para el diagnóstico de ciertas enfermedades eritrocitarias como, por ejemplo, la esferocitosis hereditaria (EH), para la que la observación de esferocitos circulantes constituye la prueba diagnóstica m ás fehaciente. 9. Existe una situación clínica en la que es característica la observación de abundantes hematíes fragmentados (esquistocitos). (a) Después del trasplante de m édula ósea. (b) En la microangiopatía con hemólisis mecánica. (c) En la hemólisis de origen autoinmune. (d) En la anemia regenerativa. (e) En la aplasia medular. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la fragm entación eritrocitaria puede observarse en m uchas situaciones clínicas diversas, pero suele ser de escasa relevancia. Existe una situación clínica en la que es característica la observación de abundantes hematíes fragmentados o esquistocitos, debido a la existencia de m icroangiopatía con hemólisis mecánica: se denom ina púrpura trom bótica trombocitopénica (PTT).

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C

A

P

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Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y el exceso de hierro M. Sánchez y J. L. Vives C orrons

HIERRO EN EL ORGANISMO HUMANO El hierro (Fe) es un metal fundamental en el metabolismo celular, ya que su concentra­ ción es de 45 a 55 mg por kg de peso; entre un 60-70% forma parte de la hemoglobina y un 10% de otras hemoproteínas de gran importancia funcional: mioglobina, citocromos y ciertas enzimas como la catalasa y las peroxidasas. Del 20 al 30% restante se halla en los depósitos formando parte de la ferritina. Solo un 1% (unos 3 mg) se encuentra unido a la transferrina (TF), que es la proteína plasmática que lo transporta. Diariamente, la TF transporta unos 30 mg de hierro desde los depósitos hacia la médula ósea (eritroblas­ tos) para la síntesis de hemoglobina, cantidad idéntica a la que diariamente liberan los eritrocitos en las células del sistema mononuclear fagocítico (SMF) como consecuencia de su muerte fisiológica. Este equilibrio es fundamental para el mantenimiento de la concentración de hemoglobina en el organismo. La distribución del hierro en el organis­ mo está esquematizada en la tabla 15-1. El hierro de los alimentos se halla prácticamente siempre formando complejos con otros compuestos y es liberado en el proceso de la digestión. Su absorción tiene lugar preferentemente en el duodeno, para lo cual es imprescindible que se halle en estado reducido o ferroso. A esta reducción contribuyen otras sustancias también presentes en los alimentos como, por ejemplo, el ácido ascórbico (vitamina C), entre otros. Nor­ malmente, el intestino absorbe entre un 5 y un 10% del hierro ingerido, y el resto es eliminado por las heces. La absorción del hierro (Fe) no hemínico comporta tres etapas: 1) paso del Fe a través de la m embrana apical del enterocito; 2) paso del Fe al plasma a través de la m embrana basolateral, y 3) regulación global de estos procesos. En la prim era etapa interviene una proteína transportadora de metales divalentes (DMT1), también conocida como proteína de resistencia natural asociada a macrófagos (Nramp2), y una oxidorreductasa férrica o citocromo b duodenal (Cytb D) que reduce el hierro de la forma férrica u oxidada a su forma ferrosa o reducida. Así, en la misma superficie del enterocito, el hierro es reducido por la Cytb D e inmediatamente inter­ nalizado por la proteína transportadora DMT1. Una vez en el interior del enterocito, el hierro puede ser almacenado bajo la forma de ferritina o transportado hacia el plasma previo paso a través de la membrana basolateral. Las proteínas transportadoras DMT1 forman parte integral de la membrana apical del enterocito y realizan el transporte activo de otros cationes metálicos bivalentes además del Fe++ (Zn, M n, Co, Cd, Cu, Ni y Pb). La DMT1 posee una región IRE en posición 3' de su ARNm, por lo que es regulada a través de la concentración del hierro celular mediante el sistema regulador IRP/IRE. Así, su concentración aumenta en el estado de ferropenia y disminuye en el de sobrecarga.

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2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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Capítulo 15

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Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

TABLA 15-1. Distribución del hierro en el organismo Tipos

Distribución del hierro en el organismo

Hierro hemínico Hemoglobina Mioglobina Enzimas hemínicas

Aprox. 3 g 0,15 g 0,01 g

|

Hierro sérico Hierro de reserva

0,003 g Aprox. 1 g Aprox. 4,25 g

I f |

\

Aprox. 3,2 g

Hierro no hemínico Total de hierro del organismo

Aprox. 1,05 g

En el paso del Fe a través de la membrana basal hacia el plasma intervienen también dos proteínas: la transportadora, ferroportina 1, y la cuproproteína con actividad oxidasa, hefaestina. La ferroportina 1 (Iregl, SLC40A1 o MTP1) es una proteína integral de la m em brana basal del enterocito. La hefaestina (HEPH) es una ferroxidasa análoga a la ceruloplasmina de localización exclusivamente intestinal; su función es transformar el hierro desde su estado reducido (Fe2+) al oxidado (Fe3+), imprescindible para que pueda ser incorporado en la TF plasmática (fig. 15-1).

Luz intestinal

Transferrina

n

FIGU RA 15-1. Mecanismos reguladores de la absorción de hierro.

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F IG U R A 15 -2 .

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Acciones de la hepcidina.

Un acontecimiento clave en el metabolismo del hierro fue el descubrimiento de un pequeño péptido constituido por solo 25 aminoácidos que ejerce un papel fundamental en la regulación de los procesos que intervienen en la homeostasis del hierro. Este pép­ tido, conocido con el nombre de hepcidina (acrónimo que proviene de los términos en inglés hepatic bactericidal protein) fue descubierto en la orina humana, posee actividad bactericida/fungicida y es sintetizado por el hígado como respuesta a estímulos inflama­ torios, hipoxia (anemia) y concentración de hierro unido a la transferrina (fig. 15-2). La hepcidina ejerce un efecto regulador negativo sobre la absorción intestinal de hierro y también sobre su liberación desde los macrófagos, la placenta y otras células, al degradar la proteína transportadora ferroportina 1. Por ello, su función se ha relacionado con la regulación de los procesos de absorción y reutilización del hierro por el organismo. De este modo, un exceso de hierro aumentaría la síntesis de hepcidina, lo que disminuiría tanto la absorción intestinal como la salida de hierro de los macrófagos. Por el contrario, la ferropenia disminuiría la síntesis de hepcidina, aumentando la absorción de hierro intestinal y su liberación desde los macrófagos para poder ser utilizado en la síntesis de hemoglobina. La hepcidina constituiría, en realidad, un factor plasmático exclusivo que, de m anera simultánea, regularía tanto la absorción del hierro intestinal como su reutilización a partir de los depósitos. Por el mismo mecanismo, en los procesos

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Capítulo 15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

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FIGU RA 15-3. Esquema que muestra la saturación normal de la transferrina.

inflamatorios crónicos donde se ha demostrado un importante aumento de la síntesis de hepcidina, este péptido no solo sería el regulador fisiológico de la cinética del hierro, sino que contribuiría al mecanismo fisiopatológico de la llamada anemia asociada a procesos inflamatorios crónicos o anemia inflamatoria. En el plasma, el hierro circulante no se halla nunca en forma libre (sería muy tóxico) sino siempre unido a la TF, que es una glucoproteína transportadora de 83.000 daltons, capaz de fijar un máximo de dos átomos de hierro. La TF solo fija hierro oxidado (ión férrico) y, en condiciones fisiológicas, únicamente un 30-35% de ella se halla saturada (fig. 15-3). Mediante la TF, el hierro alcanza la médula ósea, penetra en los eritroblastos y es utilizado para la síntesis de hemoglobina. Para penetrar en los eritroblastos, la TF se une a un receptor específico o receptor de la TF (RTF1) presente en la superficie de los mismos formando un complejo TF-RTF1, de manera que su afinidad por esta unión guarda relación directa con su estado de saturación por el hierro. Una vez formado el complejo TF-RTF1, se forma una vesícula llamada siderosoma, donde los cambios de pH producen una liberación progresiva de hierro hacia el citoplasma, en el que es incor­ porado a la apoferritina para formar ferritina. Una vez liberado el hierro del complejo TF-RTF1, la vesícula se recicla hacia la superficie celular y la TF, desprovista ya de hierro, se libera hacia el plasma (fig. 15-4). Una porción del RTF1 presente en la m em brana plasmática experimenta una escisión de su región extracitoplasmáticay bajo una forma truncada pasa al plasma, dando lugar al llamado receptor soluble de la transferrina (RST). El RST puede medirse mediante técnicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo y constituye una m agnitud útil en el diagnóstico de la anemia ferropénica. Además de la médula ósea, gracias a la TF el hierro alcanza otros tejidos del organis­ mo como, por ejemplo, el músculo, el hígado y los macrófagos del SMF. Allí y por el mecanismo citado, penetra en el citoplasma celular y se deposita en forma de ferritina. En el músculo, el hierro entra a formar parte de la mioglobina y el hígado, y las células del SMF se acum ulan bajo la form a de ferritina, lo que origina el llamado hierro de los depósitos o hierro de reserva. Diariamente unos 30 mg de hierro son liberados de los depósitos hacia el plasma (donde se unen a la TF) para la síntesis de hemoglobina, y

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Fe

FIGU RA 15-4. Entrada de hierro en el eritroblasto. RTF, receptor de la transferrina; TF, transferrina.

son los mismos que se depositan diariamente en los depósitos como consecuencia de la eliminación de los eritrocitos envejecidos y el catabolismo de la hemoglobina (fig. 15-5). Debido a que la cantidad de hierro que diariamente se absorbe por el intestino (1,5 mg) es prácticamente la misma que la que se pierde, también diariamente, de forma fisiológica por la descamación epitelial, las secreciones externas, las faneras y otros medios, el organismo reutiliza permanentemente el hierro de reserva (unos 30 mg) para mantener constante la concentración de hemoglobina. Por ello si disminuye la absorción de hierro, aumentan las necesidades fisiológicas (crecimiento o embarazo, principalmente) o se produce una pérdida crónica del mismo (hemorragia o hemoglobinuria), y las reservas de hierro del organismo van disminuyendo paulatinamente. Tanto en un caso como en otro, una vez agotadas las reservas de hierro, se inicia un descenso progresivo de la síntesis de hemoglobina, que conduce a la anemia y a otras alteraciones generales propias de la carencia de hierro. Las causas más frecuentes de anemia ferropénica se resumen en la tabla 15-2. La anemia ferropénica es la causa más frecuente de consulta hematológica, y su expre­ sividad más característica es la disminución del tamaño y contenido hemoglobínico de los

1.5 mg/día Ingesta Eritrocitos Macrófagos (SM F)




©

Pérdidas (descam ación epitelial, sudor) 1,5 mg/día

FIGU RA 15-5. Esquema del mecanismo de reutilización del hierro por el organismo. SMF, sistema mononuclear fagocítico.

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Capítulo 15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

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TABLA 15-2. Causas de ferropenia Tipo

Causas

Mecanismos

Fisiológicas

Embarazo Crecimiento Menstruación Hernia de hiato y varices esofágicas Ingesta de aspirinas Neoplasia digestiva Hemólisis intravascular crónica (hemoglobinuria paroxística nocturna)

Hiperconsumo Hiperconsumo Pérdida Pérdida crónica por microsangrado digestivo

Patológicas

Pérdida crónica por la orina

eritrocitos (microcitosis hipocroma). Estas alteraciones morfológicas pueden apreciarse fácilmente mediante la observación microscópica de una extensión de sangre (fig. 15-6), aunque deben ser corroboradas mediante la práctica de u n hemograma (disminución del VCM y de la HCM). Existen otras formas de anemia que también pueden cursar con microcitosis e hipocromía y que no deben confundirse con la ferropenia. Las más frecuentes son los síndromes inflamatorios crónicos y neoplasias (anemia inflamatoria), la disminución congénita de la síntesis de hemoglobina (talasemia) y los defectos de la síntesis del grupo hemo (anemia sideroblástica) (cuadro 15-1). La anemia inflamatoria obedece a una retención del hierro en los depósitos debido a la existencia de una dificultad en su liberación desde los macrófagos. Puede confundirse fácilmente con la anemia ferropénica porque la microcitosis hipocroma suele acompa­ ñarse de una disminución de la concentración de hierro en plasma (sideremia) y de la ferritina. La práctica de otras determinaciones, como la capacidad de saturación de la TF (CST) o del índice de saturación de la TF (1ST), es aquí de extraordinaria importancia para establecer el diagnóstico diferencial. La talasemia, relativamente frecuente en nuestro medio bajo la forma de «rasgo tala­ sémico», rara vez se confunde con una ferropenia si se presta atención a la información que sum inistra el hemograma. En prim er lugar, destaca una microcitosis superior a la que se observa en la ferropenia; una escasa hipocromía, inferior a la que se observa

FIGU RA 15-6. Disminución del tamaño y contenido hemoglobínico de los eritrocitos (microcitosis hipocroma) en la anemia ferropénica.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

CUADRO 15-1. Anemias no ferropénicas que pueden cursar con hipocromía y microcitosis • Síndromes inflamatorios crónicos (polimialgia reumática) y neoplasias: • Anemia «inflamatoria» por defecto de utilización del hierro (bloqueo férrico a nivel de los depósitos) • Disminución congénita de la síntesis de cadenas de globina: • Anemia microcítica de la talasemia • Trastornos en el mecanismo de síntesis del grupo hemo: • Anemia sideroblástica congénita o adquirida

CUADRO 15-2. Tipos de anemia microcítica sideroblástica Congénitas • Anemia sideroblástica congénita ligada al sexo (gen ALAS2) • Anemia sideroblástica congénita ligada al sexo con ataxia (gen ABCB7) • Anemia sideroblástica congénita no sindrómica y recesiva (gen SLC25A38) • Anemia sideroblástica con sobrecarga de hierro hepática (gen GLRX5) Adquiridas • Anemia sideroblástica secundaria • Por alcohol • Por medicamentos (isoniazidas, cloranfenicol) • Por tóxicos (plomo) • Anemia sideroblástica idiopática

en la ferropenia, y una concentración de eritrocitos prácticamente siempre superior a la normal (falsa poliglobulia) debido al aumento de la regeneración eritroblástica. Asimis­ mo, en el rasgo talasémico la concentración de hierro en plasma (sideremia) ha de ser normal o aumentada, excepto en el caso de que coexista con una ferropenia. Finalmente, la anemia sideroblástica es una form a de anemia m inoritaria debido a un defecto en la utilización del hierro p or los eritroblastos, y puede tener un origen congénito o adquirido (cuadro 15-2). La form a congénita se observa en la edad infantil o juvenil, y la adquirida, en individuos adultos de más de 60 años. C onfundir una anem ia sideroblástica con una ferropénica es prácticam ente imposible porque, adem ás del hecho de que la m icrocitosis es m enos frecuente que la norm ocitosis o macrocitosis, la ferritina (hierro de depósitos) suele hallarse aum entada, a veces considerablem ente. La anem ia sideroblástica adquirida constituye u n a form a de m ielodisplasia (anem ia refractaria sideroblástica) que se caracteriza p or un gran aumento de eritroblastos con abundante hierro intracitoplásmico o sideroblastos. Estos eritroblastos pueden ponerse fácilmente de manifiesto m ediante la tinción del azul de Prusia o tinción de Perls, que transform a la ferritina en gránulos de hemosiderina muy visibles por su destacado color verde azulado. En la anemia sideroblástica (congénita o adquirida) los gránulos de hemosiderina son tan abundantes que rodean el núcleo de los eritroblastos, dando lugar a los llamados sideroblastos en anillo (fig. 15-7). D istinguir una ferropenia de un trastorno en la utilización del hierro es de gran im portancia en la práctica clínica. En la tabla 15-3 se esquem atizan las pruebas de laboratorio que pueden facilitar el diagnóstico diferencial.

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Capítulo 15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

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397

FIGU RA 15-7. Imagen microscópica de un sideroblasto en anillo (X 1.000).

MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HIERRO EN SUERO Introducción

La concentración de hierro sérico, conocida como sideremia, puede determ inarse m ediante m étodos colorim étricos y de absorción atóm ica. Los prim eros se basan en la form ación de u n a sustancia coloreada cuando el hierro, en su form a reducida, reacciona con un derivado de la fenantrolina. Pueden emplearse indistintam ente dos derivados de la fenantrolina: batofenantrolina y o-fenantrolina. Actualmente es­ tos sistemas de medida, en especial los colorimétricos, han sido estandarizados por diferentes firmas comerciales para poder ser utilizados en analizadores autom atiza­ dos. De esta form a puede realizarse un elevado núm ero de determ inaciones, junto a muchas otras, de form a sim ultánea y en m uy poco tiem po. Entre estos sistemas comerciales de m edida de la concentración de hierro en plasm a (o suero) destacan los siguientes: • ADVIA 1650 (Bayer). • Alcyon 300 (Chema Diagnóstica). • Dimension (Dade Behring). • Ilab 600 (Instrumentation Laboratory). • Hitachi (Roche Diagnostics). • Cobas Integra (Roche Diagnostics).

TABLA 15-3. Diagnóstico diferencial de la anemia ferropénica Prueba diagnóstica

Falta de hierro (ferropenia)

Defectos en la utilización del hierro

Sideremia

Disminuida

Ferritina sérica Capacidad de saturación de la transferrina (CST) Indice de saturación de la transferrina (1ST) Tinción de Perls del aspirado medular

Disminuida Aumentada

Normal Aumentada Disminuida Normal o aumentada Normal o disminuida

Disminuido Hierro ausente

Normal o aumentado Hierro normal o aumentado

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398

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

El Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH) recomienda el método colorimétrico con batofenantrolina, que, con ligeras modificaciones, es el que se describe aquí.

Principio Debido a que, en el plasma, el hierro (TF-Fe+++) se halla unido en su totalidad a la TF, puede ser cuantificado fácilmente a partir de un extracto desproteinizado del mismo. La adición de una sustancia precipitante y reductora produce la liberación de hierro a partir de la TF y su reducción a Fe++, al cual se une posteriormente el derivado de la fenantrolina (sulfonato de batofenantrolina) o compuesto cromógeno, y con ello se produce un cambio de color. T F -Fe"^ Precipitación Reducción donde C = cromógeno y CC = compuesto coloreado. La densidad óptica o absorbancia (A) del compuesto coloreado es finalmente ana­ lizada mediante un fotocolorímetro (filtro verde) o un espectrofotómetro a 535 nm. M a te ria l • Material de vidrio volumétrico de pureza garantizada (Pyrex®) y totalmente desprovis­ to de contaminación con hierro. Para ello, antes de toda determinación, el material de vidrio debe lavarse con detergentes o mezcla crómica y permanecer a continuación durante 24 h en solución de HC1 concentrado, diluido al 50%. Antes de su empleo, el material debe aclararse con abundante agua desionizada o doblemente destilada. • Fotómetro o colorímetro capaz de leer a 535 nm. • Cubetas específicas para esta determinación. • Tubos de hemólisis de 12 X 100 mm. • Pipetas graduadas de 2 y 5 mi. • Centrífuga. R eactivos • Solución precipitante. Esta solución debe conservarse en botella. Mantenida a 4 °C, tiene una estabilidad de 3-4 meses y a temperatura ambiente unas 2 semanas. • Ácido tricloroacético, 49 g. • Ácido tioglicólico, 14 mi. • H C11 mol/1 hasta 500 mi. • Solución cromógena. • Solución de acetato sódico de 1,5 mol/1 que contiene 0,25 g/1 de ferrocina (3 -[2-piridil]-5,6-bis-[ácido fenilsulfónico]-l,2,4-triacina). Se deja m adurar en frasco topacio envuelto en hoja de papel de aluminio durante 2 semanas. Se completa hasta 500 mi con agua destilada o desionizada. • Patrón de hierro: - Solución madre (reserva) de hierro puro (20 mmol/1) en una dilución al 50% de HC1 concentrado. - Solución patrón, 40 (xmol de hierro p or litro (2,24 |JLg/l) preparada extem­ poráneamente mediante dilución de 2 mi de la solución madre en 11 de agua destilada o desionizada.

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Capítulo 15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

399

• Espécimen de suero que se va a analizar. • El hierro sérico debe medirse siempre a partir de suero totalmente libre de hemó­ lisis, ya que el hierro hemoglobínico constituiría un factor de error decisivo en la determinación. • Si se requiere plasma, este debe obtenerse a partir de sangre heparinizada.

M étodo Para cada suero se realizará siempre una triple determinación de acuerdo con la siguiente sistemática: 1. En una gradilla se colocan tres tubos de hemólisis que se enumeran del 1 al 3. 2. A cada uno de ellos se añade: (a) Tubo A: 1 mi de suero problema. (b) Tubo B: 1 mi de solución estándar de hierro. (c) Tubo C: 1 mi de agua bidestilada (totalmente exenta de hierro). 3. A los tres tubos se añade 1 mi de la solución precipitante y se procede a realizar una agitación vigorosa seguida de un reposo de 5 min. (a) Se centrifuga el tubo A hasta obtener un sobrenadante transparente. (b) Se preparan otros tres tubos de hemólisis y en cada uno de ellos se coloca: (i) Tubo D: 1 ml del sobrenadante obtenido con la centrifugación del tubo A. (ii) Tubo E: 1 ml del líquido contenido en el tubo B. (iii) Tubo F: 1 ml del líquido contenido en el tubo C. (iv) A continuación, se añade a todos ellos 1 mi de solución cromógena y después de realizar u n a buena homogeneización se dejan en reposo durante 10 min. (c) Finalmente, mediante un espectrofotómetro bien calibrado se lee el valor de la absorbancia (A) de cada tubo a 535 nm frente a un blanco de agua bides­ tilada. Si se utiliza un colorímetro, debe emplearse el filtro verde.

Cálculo del resultado A535suero (tuboD )-A 535blanco (tuboF)x40 Sideremia (|im ol/l) =A535 estándar (tuboE)-A 535blanco (tuboF)

Interpretación del resultado Para una población sana, la concentración plasmática de hierro (sideremia) expresada como concentración de sustancia (Pla-Hierro; c.sust) o de masa (Pla-Hierro; c.masa) varía ampliamente según la edad y el sexo (tabla 15-4). El descenso de la sideremia es característico de la anem ia ferropénica, pero puede observarse tam bién en todas aquellas situaciones que se acompañan de un bloqueo del hierro en las células del SMF, tales como los síndromes inflamatorios crónicos y los procesos neoplásicos avanzados (anemia inflamatoria). Un aumento de la sideremia suele observarse en los llamados estados de sobrecarga férrica, es decir, en todas aquellas situaciones en las que el organismo acumula hierro en exceso debido a un aumento de la absorción (hemocromatosis) o no puede utilizarlo de forma apropiada (anemia sideroblástica y talasemias). En tales casos, el hierro en exceso tiende a depositarse abundantemente en los tejidos de reserva e incluso en otras células como los hepatocitos, el tejido glandular o las células musculares, lo que da lugar

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400

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 15-4. Valores normales de la concentración de hierro en plasma (Pla-hierro) Edad (años) Recién nacido 1-20 20-29 30-39 40-49 50-59 60-70 Más de 70

Hombres

Mujeres

(|Xg/l)

((xmol/1)

(M-g/1)

((x m o l/ I)

1.600 140-1.200 450-1.740 450-1.570 450-1.570 390-1.620 340-1.620 340-1.620

28,6 2,5-21,5 8-31 8-28 8-28 7-29 6-29 6-29

1.600 140-1.200 340-1.620 170-1.680 280-1.620 390-1.450 390-1.450 340-1.450

28,6 2,5-21,5 6-29 3-30 5-29 7-26 7-26 6-26

a trastornos funcionales, generalmente graves (insuficiencia cardíaca, diabetes mellitus, cirrosis hepática y otros). También puede observarse aumento de la concentración plas­ mática de hierro en anemias hemolíticas o diseritropoyéticas, generalmente intensas y de larga evolución, ya que todas estas situaciones se acom pañan de un aum ento de la absorción intestinal de hierro. Igualmente, en la hepatitis aguda o crónica con hepatólisis y en el alcoholismo agudo o crónico, suele observarse un aum ento de la concentración de hierro plasmático (sideremia) con aumento del hierro de depósito, lo que, en individuos predispuestos genéticamente, puede ser un factor desencadenante de hemocromatosis. Cuando no existe un motivo clínico que justifique el aumento aislado de la concen­ tración del hierro en plasma, debe pensarse siempre en causas metodológicas como, por ejemplo, contaminación del material empleado para el análisis (tubos de recogida, principalmente, por los tapones de goma), hemólisis en caso de extracción dificultosa, conservación defectuosa de la muestra u otras causas muchas veces difíciles de determi­ nar (interferencias, errores técnicos, envejecimiento de la muestra, entre otros). C A PA C ID A D E ÍN D IC E D E S ATU R AC IÓ N D E L A TR A N S FE R R IN A P rin c ip io La CST es la cantidad de TF del plasma que puede ser saturada por el hierro y constituye una medida indirecta de la concentración plasmática (o sérica) de TF. Debido a que prácticamente todo el hierro circulante se halla unido a la TF, la CST se determina añadiendo al plasma (o suero) un exceso de hierro, suficiente para saturar completamente la TF. Después de que se haya eliminado todo el excedente de hierro libre mediante carbonato de magnesio (quelante o fijador del hierro), se realiza una nueva determinación de la sideremia. M é to d o m a n u a l A 2 mi de suero se añaden 4 mi de una solución clorhídrica de cloruro férrico (FeCl36H20 ) que contenga 5 mg de hierro por cada mililitro de HCI, 0,005 N. Transcurridos 5 min, se añaden a la mezcla 0,4 g de carbonato magnésico (M g C 0 3) y, después de agitar intensam ente la mezcla, se deja en reposo durante 30 min. Después de centrifugar durante 15 m in a 1.500 g, se determina el hierro a partir de 2 mi de sobrenadante, según el método descrito anteriormente.

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Capítulo 15

Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro

40 1

M étodos autom atizados Actualmente, existen diversos procedimientos que permiten, además de medir automáti­ camente la concentración de hierro en plasma, determinar también la CST. En este caso, la CST se calcula a partir de la medida de la TF como proteína mediante un método basado en una reacción antígeno-anticuerpo y de la sideremia. Esta metodología, que es la que se usa cada vez más, tiene un coste superior al procedimiento manual y posee mayores desviaciones en los valores extremos en caso de ferropenia o de acúmulo de hierro.

Interpretación del resultado Cada miligramo de TF fija alrededor de 1,4 (xg de hierro, por lo que la CST puede variar entre 2,5 y 4 g/1 (45 y 70 (xmol/1), así el tanto por ciento de TF normalmente saturada por el hierro, o 1ST, es de aproximadamente u n 33%. Los valores de referencia para la concentración de TF en plasma determ inada mediante procedimientos automáticos son algo inferiores a los obtenidos con el m étodo manual, y sus valores, expresados en concentración de sustancia (Pla-TF; c.sust) oscilan entre 20 y 50 jxmol/1, y en con­ centración de masa (Pla-TF; c.masa) entre 1,7 y 4 g/1. Mientras que la CST depende de la cantidad de TF, el 1ST depende de la cantidad de hierro plasmático (sideremia), de manera que a mayor valor de sideremia, mayor 1ST y viceversa. En el organism o hum ano norm al existe u n a relación inversa entre la cantidad de hierro de depósito y la síntesis de TF, de manera que, cuando disminuye el hierro de los depósitos, aumenta la síntesis de TF y viceversa. Debido a ello, en la ferropenia se observa prácticamente siempre un aumento paralelo de la concentración de TF plas­ mática. El análisis de la relación entre concentración de hierro en plasma (sideremia), CST e 1ST es determinante para establecer el diagnóstico diferencial entre ferropenia por falta real de hierro (ferropenia verdadera) o por bloqueo del hierro en los depósitos (seudoferropenia). Así, mientras que en una ferropenia verdadera la disminución de la sideremia y ferritina se acompaña, prácticamente siempre, de un aumento de la CST y de una marcada disminución del 1ST ( 120 fl) con eventuales inclusiones (cuerpos de Howell-Jolly y/o anillos de Cabot) • Cifra normal de reticulocitos • Eventualmente leucopenia y/o plaquetopenia • Presencia de pleocariocitos o neutrófilos hipersegmentados gigantes • Médula ósea: • Megaloblastos (asincronía madurativa núcleo-citoplasma de los eritroblastos: núcleos inmaduros y citoplasma con abundante hemoglobina) • Mielocitos y/o metamielocitos gigantes • Megacariocitos hipersegmentados

Anemia perniciosa

FIGU RA 16-5. Esquema general de la prueba de Schilling.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE FACTORES MADURATIVOS La medida de la concentración de cobalamina en suero, así como la de folato (séricos o in­ traeritrocitarios), puede realizarse mediante métodos microbiológicos o radioisotópicos.

M étodos m icrobiológicos Consisten en estudiar el crecimiento de un microorganismo, dependiendo del factor cuya concentración hay que medir. El crecimiento es apreciado por la m edida de la opacificación del medio o de la disminución del pH, debido a la producción de ácido láctico. El resultado obtenido con una muestra de suero control o del paciente se compara con un patrón obtenido a partir de diluciones conocidas de cobalamina sérica o de ácido fólico. Los gérmenes más utilizados son: a) para la determinación de cobalamina sérica la Euglena gracilis, el Lactobacillus leichmannii o la Escherichia coli, y b) para la del ácido fólico, el Lactobacillus casei.

M étodos isotópicos Están basados en el principio de unión competitiva p or los lugares de fijación de una sustancia aceptora o ligante (generalmente una proteína) específica de la sustancia que se desea medir. Para la determinación de cobalamina se utiliza como ligante Fl porcino purificado, que elimina las posibles interferencias de las proteínas R, y se puede calificar de específico para la cobalam ina biológicam ente activa. Para el folato se utiliza la (3-lactoglobulina como proteína de unión. La competición por un número limitado de lugares de fijación del ligante se establece entre el folato o cobalamina presentes en el espécimen a analizar (analito), y una cantidad fija de folato o cobalamina (o análogos de los mismos), marcados con un isótopo radiactivo. Los isótopos más utilizados para la determinación de cobalamina han sido el 57Co y 58Co y para el folato el 3H y 125I. La utilización conjunta de ácido fólico-125I y cobalamina-57Co permite la determinación simultánea de ambas sustancias en la misma muestra, debido a las diferentes energías de radiación, perfectamente separables y sin interferencias. C uando en la m uestra problem a existe una pequeña concentración de analito, el ligante fijará mayor concentración de sustancia radiomarcada que cuando el analito se encuentre en elevada concentración. Existirá, por lo tanto, mayor radiactividad en el complejo analito ligante para bajas concentraciones de analito y m enor para altas concentraciones del mismo, una vez separado de la fracción unida a la fracción libre. Sim ultáneamente a los especímenes de suero problem a se procesan una serie de muestras control (patrones) con concentración conocida de cobalamina y de folato que permitirán obtener las concentraciones de ambas sustancias en el espécimen problema, al poder construir las curvas de radiactividad/concentración.

M étodos autom áticos Usando el mismo método de unión a un transportador (en este caso el Fl gástrico), se han construido numerosas metodologías automatizadas basadas en aquellas que ponen de relieve la concentración de vitamina B12unida a su transportador. Esta varía de una casa comercial a otra. Lo importante es que usen Fl como ligando, ya que esta proteína es específica de la cobalamina; otros transportadores, como las cobalofilinas o transcobalamina I, no lo son. En los métodos inmunológicos automatizados se han descrito interferencias que pueden dar resultados falsos, tanto falsos positivos como falsos negativos. Sin embargo,

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Capítulo 16

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

44 1

han permitido una generalización de la determinación de los factores de maduración. Ac­ tualmente, son los métodos más usados de forma rutinaria; tanto los métodos isotópicos como, sobre todo, los microbiológicos solo los realizan laboratorios muy especializados y, en muchos casos, con fines científicos. M É TO DO S M IC R O B IO L Ó G IC O S

Concentración de cobalam ina sérica Material de vidrio Se lava cuidadosamente con mezcla sulfocrómica todo el material de vidrio y después se aclara abundantem ente con agua destilada. A continuación, se esteriliza durante 30 min a 180 °C.

Espécimen de sangre Se extraen 10 mi de sangre en un tubo sin anticoagulante y se separa el suero al cabo de unas 2 h (el suero puede conservarse a —20 °C si no va a efectuarse la dosificación el mismo día). La presencia de hemólisis tiene poca importancia, ya que el contenido eritrocitario en cobalamina es muy pequeño.

Medios de cultivo Pueden emplearse indistintamente medios de cultivo comerciales: BBL o DIFCO. La preparación y el modo de empleo de ambos están indicados en los frascos corres­ pondientes. Además se precisa: • B12Culture Agar (para el mantenimiento de la cepa). • B12Inoculum Broth (para la preparación del inóculo). • B12Assay Medium (para la dosificación propiamente dicha).

Microorganismo El microorganismo utilizado es el Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, que se mantiene por reincubación cada 10-15 días en agar-agar (incubación durante 24 h a 37 °C) y se conserva a 4 °C. El día anterior a la dosificación, el germen se transfiere a un caldo de cultivo (Inocu­ lum Broth) y se incuba 24 h a 37 °C. Este cultivo de 24 h será centrifugado en condiciones estériles en tubos de tapón de rosca, lavado cuatro veces en solución salina fisiológica es­ téril y resuspendido en 10 mi de suero fisiológico. El inóculo estará constituido por una dilución al 1/100 en suero fisiológico de esta última suspensión.

Reactivos • Tampón acetoacético, 0,4 mol/1, pH = 4,6:54,4 g de acetato sódico-trihidrato en 900 mi de agua destilada. Se ajusta el pH a 4,6 con ácido acético glacial y se completa el volumen hasta 11 con agua destilada. • Solución de cianuro potásico (KCN), 400 mg/1. • Monodihidrogenofosfato de potasio 0,2 mol/1 (34,84 g/1 de K2H P 0 4).

Método Paso 1. Se extrae la vitamina B12de las proteínas séricas. Para ello, se prepara en primer lugar la siguiente mezcla:

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• • • •

Suero, 1 mi. Tampón acetoacético, 1 mi. Solución de KCN, 0,25 mi. Agua destilada, 6,45 mi. Paso 2. Se introduce la mezcla en un autoclave durante 10 m in (120 °C) y se deja enfriar a 0 °C. Se añaden 1,5 mi de KH 2P 0 4 y se centrifuga a 5.000 r.p.m. A partir del so­ brenadante se practican cuatro diluciones, a una de las cuales se añade el medio de cultivo. 1 Sobrenadante (mi) Agua destilada (mi) M edio de cultivo (mi)

2

0,2 4,8 5

0,5 4,5

3

4

1 4

2 3

Paso 3. Se elabora un patrón de soluciones de cianocobalamina. Para ello se emplea una solución madre de cianocobalamina de 20 mg/1 en agua destilada. La cianocobala­ mina debe guardarse a 4 °C durante un máximo de 15 días. A p artir de la solución madre, se practican dos soluciones sucesivas de 1/1.000, es decir, se obtiene una solución de 20 pg/ml (20 X 10 -12 g/ml); después se preparan ocho diluciones de acuerdo con la sistemática indicada a continuación:

Concentración (pg/ml) Solución de 20 pg/m l (mi) Agua destilada (mi) M edio de cultivo (mi)

1

2

3

4

5

6

7

8

5 0,25 4,75 5

10 0,5 4,5

20 1 4

30 1,25 3,5

40 2 3

60 3 2

80 4 1

100 5 —

1. Todas las soluciones que hay que estudiar deben ser esterilizadas durante 10 min a 120 °C y, después de un enfriamiento inmediato, se siembran mediante una gota de inóculo. Finalmente, se colocan en la estufa a 37 °C. Hay que preparar también dos tubos testigo (5 mi de agua ± 5 mi de medio) para el control de esterilidad y dos tubos testigo (5 mi de agua destilada ± 5 mi de Assay m edium-inóculo) para el control de la dependencia del germen frente a la vitamina B12. Los tubos testigo deben ser esterilizados e incubados a 37 °C en idénticas condiciones que el patrón y las soluciones problema. 2. La lectura del resultado se efectúa valorando fotom étricam ente a 550 nm la turbidez originada por el crecimiento del germen después de 2 0 h de incuba­ ción. Las dosificaciones serán calculadas a partir de la curva del patrón, procurando que las tomas sean variadas y teniendo en cuenta la dilución a 1 / 1 0 del suero. Otro método de apreciación del crecimiento del germen consiste en dosificar el ácido láctico liberado p o r el Lactobacillus, mediante titulación con NaOH 0,1N. El patrón se establece sobre papel semilogarítmico, indicando en abscisas la concentración y en ordenadas los volúmenes de NaOH consumidos.

C oncentración de folato sérico e in traeritrocitario Material de vidrio Se lava cuidadosamente con mezcla sulfocrómica o con detergentes enérgicos el material de vidrio, aclarando con abundante agua destilada. Se esteriliza a continuación durante 30 min a 180 °C.

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Capítulo 16

443

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

Espécimen de sangre Para la m edida de la concentración de folato en suero, la extracción de sangre debe efectuarse en un tubo sin anticoagulante. El suero se obtiene por centrifugación trans­ curridas 2-3 h de la extracción, y se puede guardar congelado ( —20 °C), si la determina­ ción no puede realizarse el mismo día, ya que los folatos reducidos son lábiles. Una vez preparado el suero, se le añaden 5 mg/ml de ácido ascórbico al objeto de proteger el es­ tado reducido de los folatos y evitar la pérdida de su actividad. La adición de un producto reductor es imprescindible si el suero no va a ser conservado a —20 °C. Además, es muy im portante evitar en lo posible el más m ínimo grado de hemólisis, ya que el contenido de folatos eritrocitarios es entre 50 y 100 veces superior al del suero. Los folatos eritrocitarios se determinan mediante una extracción sanguínea realizada con anticoagulante seco (heparina o EDTA). Se determ ina el valor hem atocrito y se provoca la hemólisis eritrocitaria (0,5 mi de sangre total + 4,5 mi de agua destilada enriquecida con ácido ascórbico a la concentración de 1 g/dl). Este hemolizado puede conservarse a —20 °C hasta el momento de la dosificación.

Microorganismos El microorganismo utilizado es el Lactobacillus casei ATCC 7469, el cual se mantiene por reinoculación en agar 10 días (incubación durante 24 h a 37 °C) y se conserva a 4 °C. El día anterior a la dosificación, el germen es transferido a un caldo (Inoculum Broth) y se incuba 24 h a 37 °C. Este último cultivo sirve para preparar el inóculo, de acuerdo con la sistemática siguiente: se centrifuga en condiciones de esterilidad en tubos de tapón de rosca, se lava cuatro veces con 1 0 mi de suero fisiológico, y la dilución al 1 / 1 . 0 0 0 de esta última suspensión constituye el inóculo.

Medios Los medios pueden ser BBL, Difeo o Daño. Además, se precisa: • Lactobacillus culture agar (mantenimiento de la cepa). • Folic acid assay medium (dosificación propiamente dicha). Las indicaciones para la preparación y utilización de cada uno de estos medios son proporcionadas por los proveedores.

Reactivos • Tampón fosfato (KH 2P 0 4-NaH 2P 0 4), 0,06 mol/1 (pH = 6,2). • Tampón fosfato + ácido ascórbico (100 mg/dl).

Método Paso 1. Se extraen los folatos de las proteínas preparando la mezcla siguiente: • 1 mi de suero (para folatos séricos) o 1 mi de hemolizado (para folatos eritrocitarios). • 9 m i de tam pón fosfato-ácido ascórbico. Se esteriliza la mezcla en autoclave durante 10 m in a 120 °C y se deja enfriar a 0 °C. A continuación, se centrifuga a 5.000 r.p.m. y se separa el sobrenadante. Paso 2. Se preparan las soluciones siguientes: • Determinación de folatos séricos: Sobrenadante sérico (mi) Agua destilada (mi) M edio (mi)

0,75 1,75 2,5

1 1,5 2,5

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1,25 1,25 2,5

1,5 1 2,5

444 •

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

D eterm inación de folatos totales: Sobrenadante de hem olizado (mi) Agua destilada (mi) M edio (mi)

0,1 2,4 2,5

0,25 2,25 2,5

0,5 2 2,5

1 1,5 2,5

Paso 3. Se prepara un patrón a partir de una solución madre de ácido fólico (ácido pteroilmonoglutámico) de 2 0 mg/dl de la mezcla agua/alcohol absoluto (80 volúmenes por 20 volúmenes). La disolución del ácido fólico puede facilitarse añadiendo NaOH y el pH se ajusta finalmente a 7 mediante HC11N. A partir de la solución puede prepararse una solución estándar de 1 ng/ml en agua bidestilada. Solución patrón o estándar (mi) Agua destilada (mi) M edio (mi)

0,1 2,4 2,5

0,3 2,2 2,5

0,5 2 2,5

0,75 1,75 2,5

1 1,5 2,5

1,25 1,25 2,5

1,5 1 2,5

1,75 0,75 2,5

2 0,5 2,5

Tanto las soluciones como los patrones deben esterilizarse durante 10 m in a 120 °C, enfriándose inmediatamente y efectuando la siembra con una gota de inóculo. A conti­ nuación, se colocan en una estufa a 37 °C. Paso 4. Se preparan dos tubos testigo, uno con 2,5 mi de agua destilada y 2,5 mi de medio para el control de esterilización, y otro con 2,5 mi de medio más una gota de inó­ culo para el control de la dependencia del germen frente a los folatos. Los testigos de esterilización se incubarán a 37 °C en las mismas condiciones que los patrones y que las soluciones problema. Paso 5. La lectura se efectúa valorando la turbidez originada por el crecimiento del germen, y se puede apreciar transcurridas las 24 h de incubación, midiendo la densidad óptica en un colorímetro a 550 nm. De manera similar que para la vitamina B12, otro método de apreciación del creci­ miento bacteriano consiste en titular m ediante N aOH 0,1N el ácido láctico liberado por el germen. Los niveles de folato sérico se calculan a partir de la curva del patrón, procurando que las tomas sean variadas y teniendo en cuenta la dilución al 1 / 2 0 del suero. Los folatos eritrocitarios se calculan a partir de la tasa de folatos totales, de los folatos séricos y del hematocrito (Hto), según la fórmula: „ . . . . Folatos totales-Folatos séricos (1-100) Hto Folatos entrocitanos = ------------------------- ==---------------------------Hto 100

MÉTODO ISOTÓPICO Principio El método isotópico permite la medida simultánea de la concentración de cobalamina y folato (sérico y eritrocitario). El proceso consiste en tres secuencias: 1. Desnaturalización alcalina de las proteínas endógenas a p H = 12-13, en presencia de ditiotreitol y cianuro potásico. De esta forma se inactivan los anticuerpos antiFI (presentes en más de la mitad de las anemias perniciosas) y los niveles elevados de proteínas transportadoras de vitamina B12.

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Capítulo 16

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

445

2. Competición por el Fl y (3-lactoglobulina purificados (inmovilizados en partículas de celulosa), utilizados como ligantes, a pH = 9,3. 3. Separación del complejo analito-ligante, unido a la fase sólida de partículas de celulosa, p o r centrifugación y decantación.

M aterial • • • • • •

Contador de centelleo para emisores de radiación 7 . Centrífuga capaz de alcanzar los 2.000 g. Baño maría a 37 °C. Vórtex. Agitador magnético. Tubos de plástico de 12 X 75 mm.

Especímenes de sangre La dosificación de folatos y vitamina B 12 se realiza en suero. La recogida y el almacena­ miento de muestras sanguíneas se efectúan de igual forma a la descrita para la determina­ ción por el método microbiológico. Para la dosificación de folatos eritrocitarios se utiliza sangre recogida en EDTA, diluyéndola en ácido ascórbico al 1%, en proporción 1:21.

Reactivos (cantidad suficiente para 100 tubos) • Solución trazadora: vial con 110 mi, que contenga 74 kBq de vitamina B 12 marcada con 57Co y 259 kBq de ácido fólico marcado con 125I. • Solución ligante: vial con 120 m i, que c o n ten g a so lu ció n de Fl porcin o y (3-lactoglobulina purificada e inmovilizada en partículas de celulosa microcristalina, disueltas en tampón fosfatoglicina con proteína y azida de sodio. • Calibradores: siete viales, que contengan 0; 50; 100; 300; 600; 1.200 y 2.400 pg/ml de vitamina B 12 y 0; 0,5; 1; 3; 6 ; 12 y 24 ng/ml de ácido fólico, respectivamente. • NaOH/KCN. • Ditiotreitol (vial de 6 m i de solución al 8 %). • Ácido ascórbico, solución al 1 % preparada extemporáneamente.

M étodo 1. Se marca el suficiente número de tubos, por duplicado, para identificar la actividad total (AT), enlace no específico (ENE), máximo enlace (ME), calibradores, pro­ blemas y controles. 2. Se dispensan 200 |xl del calibrador 0 en los tubos de ENE y ME, y 200 |xl de los res­ tantes calibradores, muestras problema y controles en los tubos correspondientes. 3. Se prepara la solución de trabajo, añadiendo a cada mililitro de solución trazadora 50 |xl de ditiotreitol. Esta solución se prepara inmediatamente antes del uso. 4. Se añade 1 mi de solución de trabajo a todos los tubos y se agita al vórtex. 5. Se incuba 30 m in a temperatura ambiente. 6 . Se añaden 50 |xl de NaOH/KCN a todos los tubos y se agita al vórtex. 7. Se incuba 30 m in a 37 °C. 8 . Se añade 1 mi de solución ligante a todos los tubos, excepto a los identificados como ENE, y se agita vigorosamente al vórtex. A los tubos ENE se adiciona 1 mi de agua bidestilada. 9. Se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. 10. Se centrifuga durante 15 min a 2.000 g.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

11. Se decanta y desecha el sobrenadante. 12. Se cuenta el precipitado durante 1 min en el contador de centelleo en las condi­ ciones de 125I y 57Co.

Cálculo del resultado 1. Se determina la media de las actividades del 125I y 57Co de cada par de tubos. 2. Se obtienen los recuentos netos, restando al recuento medio de cada par de tubos los recuentos correspondientes al ENE. 3. Se determ ina el porcentaje de unión, tom ando los recuentos del ME como 100%. TT •, v Recuentos netos de la muestra , _ Unión (%) = --------------------------------------- x 100 Recuentos netos del ME Se representan los porcentajes de unión de los calibradores en papel Logit-Log y se obtiene la gráfica que une todos los puntos (línea recta). La concentración de folatos y vitamina B 12 de los problemas y controles se obtendrá interpolando en la gráfica corres­ pondiente el porcentaje de unión de cada muestra (fig. 16-6).

VALORES DE REFERENCIA E INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO Concentración de cobalam ina sérica La medida de la concentración de cobalamina (Pla-Cobalamina; c.sust o Pla-Cobalamina; c.masa) está indicada en caso de anemia macrocítica con o sin megaloblastosis. No

F IG U R A 1 6 -6 . Porcentaje de unión de ácido fólico y vitam ina B12.

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Capítulo 16

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

447

obstante, debe recordarse que esta determinación no tiene valor si el enfermo ha tomado recientemente medicamentos con vitamina B12. Los valores de referencia de cobalamina sérica varían entre 200 y 1.000 pm ol/m l. En caso de déficit se puede llegar a valores inferiores a 100 pmol/1 (anemia perniciosa y otras carencias de vitamina B 12 no tratadas). Por el contrario, se pueden alcanzar va­ lores que sobrepasan incluso los 1.500 pmol/1 en ciertos síndromes mieloproliferativos (especialmente leucemia mieloide crónica) o en las hepatopatías crónicas evolutivas.

Concentración de folato sérico y eritrocitario Los valores de referencia no presentan diferencias significativas entre los dos métodos (microbiológicos e isotópicos) aquí descritos. Así, los valores medios de concentración de folato en plasma (Pla-Folatos; c.sust o Pla-Folatos; c.masa) varían entre 2 y 17 (xg/1 (concentración de masa) o entre 2,5 y 46 nmol/1 (concentración de sustancia). Los valores de concentración de folato en sangre total (folato eritrocitario) varían entre 250 y 1.100 (xg/ml, aproximadamente. Valores inferiores a los indicados son altamente indicativos de carencia de folato, independientemente de su causa. En ciertos pacientes con déficit de vitam ina B 12 puede observarse una concentración norm al o incluso elevada de folato sérico acompañada de u n descenso de la concentración de folato eri­ trocitario. Esta disociación se debe a la interrelación existente entre el metabolismo de la vitamina B12 y el del folato, y al defecto en la entrada del folato dentro de las células como consecuencia de la falta de vitamina B12. El folato sérico y el folato eritrocitario no son intercambiables. El sérico evalúa el balance fólico (equilibrio entre absorción y pérdidas/utilización) en un mom ento determinado. En cambio, el eritrocitario tarda más tiempo en variar, pues refleja los depósitos de folato en el organismo. Por lo tanto, el folato eritrocitario es más específico que el sérico para evaluar el déficit de folato. En el déficit de folato, existe una excelente correlación entre el folato eritrocitario y la elevación de homocisteína, que es peor en el caso del folato sérico. El folato sérico es una técnica sensible, pero menos específica que el folato eritrocita­ rio; sobre todo, en el ambiente hospitalario donde hay una ingesta inadecuada de folato de forma pasajera (postoperatorio, enfermos de cuidados intensivos, etc.).

CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DE VITAMINA B12LIBRE POR EL PLASMA Principio El análisis de la capacidad de captación (CC) de vitamina B12 por el plasma constituye un método indirecto de cuantificación de todas aquellas proteínas del plasma capaces de fi­ jar de manera específica cobalamina o transcobalaminas. En situación normal el plasma contiene tres formas de transcobalaminas: I, II y III. De ellas, solo la transcobalamina II (T C II) es transportadora; las otras dos (T C I y T C III) solo fijan la cobalamina, pero no la transportan y p or ello se las conoce también como cobalofilinas. No obstante, la medida de la capacidad que tiene el plasma para fijar la cobalamina, al igual que la que tiene para fijar el hierro a la transferrina (capacidad de saturación de la transferrina), es un reflejo de la cantidad de transcobalamina libre de vitamina B12 presente en el plasma. Esta determinación se efectúa m ediante una técnica isotópica de saturación, aña­ diendo al plasma vitamina B12 radiactiva en exceso y midiendo la actividad fijada a las transcobalaminas.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

M aterial • • • • •

Contador de centelleo para muestras emisoras de radiación. Centrífuga capaz de alcanzar los 2.000 g. Vórtex. Tubos de cristal de 10 mi. Sangre. La dosificación se efectúa en suero obtenido del paciente en ayunas. Puede conservarse a 2-8 °C durante 48 h o a -2 0 °C para almacenamientos prolongados.

Reactivos • Charcoal recubierto de albúmina: en un vaso de precipitado de 250 mi se pesan 2,6 g de Charcoal (Norit A, grado farmacéutico) y 0,5 g de albúmina (BSA, fracción V). Se añaden 100 mi de H20 bidestilada y se mantiene en agitación durante 1 h antes de su utilización. Puede usarse durante 1 mes conservado a 4 °C. • Solución trazadora: se toma una cantidad determinada de solución madre de cianocobalamina 57Co de actividad específica, 555 kBq/|xg, y se diluye con suero fisiológico salino para obtener una solución de concentración conocida (p. ej., 4.000 pg/ml). Puede utilizarse durante 1 mes a 4 °C.

M étodo 1. Se llevan todos los reactivos y los sueros de los pacientes a temperatura ambiente. 2. Se numera una serie de tubos y se identifica (por duplicado) la AT, el trazador no arrastrado (NA) y los sueros de los pacientes. 3. Siguiendo el mismo esquema que en la determinación de la vitamina B12, se dis­ pensan en cada tubo las cantidades expresadas de solución salina, sueros problemas y solución trazadora. 4. Se mezcla con vórtex durante unos segundos, se añade el Charcoal y se centrifuga a 2 . 0 0 0 g durante 1 0 min. 5. Se cuenta el sobrenadante durante 1 min en el contador de centelleo en las con­ diciones del 57Co.

Cálculo del resultado Paso 1. Se determina la media de las actividades de cada pareja de tubos. Se obtienen las actividades netas restando al recuento medio de los problemas la actividad NA. _ c.p.m. (1 -N A [c.p.m.]) c.p.m. netas = AT (c.p.m.) Paso 2. Se determina la capacidad de captación (CC) de la vitamina B 12 mediante la expresión: nn d _ Activ. problema (c.p.m. netas) x(A T)(pg/m l) x 2 vvVv oe Dp AT (c.p.m.)

Valores de referencia e interpretación del resultado La vitamina B 12 fijada a las transcobalaminas del plasma, o CC de vitamina B12 por el plasma, oscila, en sujetos sanos, entre 800-1.600 (xg/1. Su aumento es un reflejo de un aumento de transcobalaminas circulantes, en especial de la transcobalamina I (TC I),

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Capítulo 16

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

449

sintetizada por los granulocitos neutrófilos y sus precursores de la médula ósea. Por ello la CC de vitamina B12 por el plasma aumenta en los síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC), especialmente cuando el recambio celular es m uy elevado como sucede, por ejemplo, en la leucemia mieloide crónica (LMC) y la policitemia vera (PV) donde cons­ tituye, además, un criterio diagnóstico de la enfermedad. En ambos casos, el trastorno obedece a la liberación de TC I a p artir de los leucocitos en exceso. La captación de vitamina B 12 libre por el plasma puede hallarse también aumentada en otras situaciones como, por ejemplo, en la anemia megaloblástica y especialmente en la congénita (déficit congénito de TC II), donde existe un aumento compensador de TC I y TC III.

ABSORCIÓN INTESTINAL DE VITAMINA B12 (PRUEBA DE SCHILLING) Principio Tras la adm inistración oral de vitam ina B 12 se observa un pico de máxima actividad sanguínea entre las 8 y 1 2 h, debido a que la absorción ocurre solo en el íleon y existe un retraso en la transferencia mucosa-sangre. La vitamina B12 no absorbida es eliminada en heces en un período de 3 a 6 días. Desde la sangre, la vitamina B 12 es captada pos­ teriormente por el hígado. La medida de la actividad sanguínea, la vitamina B12 excretada en heces o la detección de la actividad hepática podrían proporcionar datos útiles para la cuantificación de la absorción de vitamina B12, pero todas estas pruebas tienen grandes limitaciones, desde el punto de vista práctico. Sin embargo, cuando se administra vitamina B 12 intramuscular­ mente en cantidad suficiente para saturar los lugares de fijación (TC II y cobalofilinas) y, a continuación, se administra una dosis de vitamina B12 marcada radiactivamente por vía oral, a las 2 h se observa como 1/3 de la misma es excretada por el riñón. Esta es la base de la prueba de absorción intestinal de vitamina B|2.

M aterial • Una cápsula de cianocobalamina-57Co (E; 122 keV; T 1/2: 270 días): 0,25 g, 18,5 Hbq unida a jugo gástrico hum ano (Fl). • Una cápsula de cianocobalamina-58Co (E: 475 keV; T 1/2: 71 días): 0,25 g, 29,6 Hbq. • Una ampolla de cianocobalamina fría: 1 mg, 1 mi. • Dos soluciones estándar de 57Co y 58Co: 1 m í de cada una de estas soluciones contiene el 2 % de la radiactividad contenida en cada una de las cápsulas. • Contador de centelleo para emisores de radiación -y.

Preparación del paciente El paciente debe permanecer en ayunas durante las 10-12 h previas al inicio de la prueba y no recibir ningún laxante durante la misma.

M étodo 1. Se administran las dos cápsulas de cianocobalamina-57Co (Fl) y 58Co. 2. Se inyecta por vía intramuscular 1 mg de cianocobalamina fría, 1,5-2 h después de la ingestión de las cápsulas. 3. Se inicia la recogida de orina total durante las 24 h siguientes a la administración de las cápsulas.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

4. Se anota el volumen de orina excretado y se dispensan partes alícuotas (p. ej., 5 mi) por triplicado, en tubos de recuento. 5. Se preparan los estándares dispensando una parte alícuota (p. ej., 1 mi) de ambas soluciones estándar, por triplicado, en tubos de recuento. 6 . Se mide la actividad en un contador de centelleo para emisores de radiación 7 en las ventanas prefijadas para ambos isótopos.

Cálculo del resultado Paso 1. Se determina la media de los triplicados de cada muestra y se resta la radiación de fondo de cada isótopo. Paso 2. Se calcula el porcentaje de inclusión del 58Co en la ventana del 57Co: t 1 •, /f\/\ Actividad estándar del 58Co en ventana del 57Co (c.p.m.) Inclusion (%) = ----------------------------- ---------------------------------------Actividad estándar del Co en ventana del Co (c.p.m.) Paso 3. Se resta a la actividad de la orina en la ventana del 57Co la debida a la con­ tribución del 58Co: Actividad neta de orina e n 57Co (c.p.m./ml)= Actividad de orina en ventana d e l57Co (c.p.m ./m l)-% de inclusiónx Actividad de orinaenventanadel58Co (c.p.m./ml). Paso 4. La actividad administrada vendrá dada multiplicando por 50 los recuentos obtenidos por cada isótopo en su ventana correspondiente: Actividad administrada del 57Co (c.p.m.) = Actividad estándar d e l57Co (c.p.m.) x 50 Actividad administrada del 58Co (c.p.m.) = Actividad estándar del 58Co (c.p.m.) x 50 Paso 5. Se determina la actividad eliminada multiplicando el volumen excretado por la actividad neta de la orina en su canal correspondiente: Actividad eliminada d e l57Co (c.p.m.) = Actividadnetadeorinaen 57Co (c.p.m./ml) x Volumen de orina (mi) Actividad eliminada del 58Co (c.p.m.) = Actividadnetadeorinaen 58Co (c.p.m./ml) x Volumende orina (mi) Paso 6 . Se calcula el porcentaje de eliminación de cada isótopo. Eliminación de • r. vitaminaB 12 en

57/57Co(FI)(%) =

Actividad eliminada en 57Co (c.p.m.) ---------------------------------F— — xlOO Actividad administrada en Co (c.p.m.)

Eliminación de • r» 58^ Actividad eliminada en 58Co (c.p.m.) vitaminaB 12 en 58C o(FI)(% )=---------------------------------F— — xlOO Actividad administrada en Co (c.p.m.)

Valores de referencia e interpretación del resultado Los valores de referencia en sujetos sanos, así como los obtenidos en sujetos con mala absorción (con o sin déficit de Fl), están expresados en la tabla 16-1. Además del déficit

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Capítulo 16

45 1

Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica

TABLA 16-1. Prueba de Schilling: eliminación urinaria porcentual (%) de vitamina B12 en 57Co y en 58Co 57Co + Fl (%)

57Co (%)

20

21

1 1 -2 8

12 -30

Normal:

- X - Límites Anemia perniciosa y ciertas lesiones gástricas:

- X - Límites Malabsorción no causada por déficit de Fl

2

10

0 ,5-5 Lys a92 (FG4) Arg —» Leu o¡2 (A10) Ala —» Asp a58 (E7) His -» Tyr a87 (F8) His —» Tyr

No No No Inestable Inestable Afinidad aumentada por el 0 2 — Afinidad aumentada por el 0 2 No Metahemoglobinemia Metahemoglobinemia

de vida. La m ortalidad en niños con enfermedad de células falciformes es máxima entre los 1 y 3 años de vida, y generalmente es debida a infecciones p or Streptococcus pneum oniae. El diagnóstico precoz y la tom a de m edidas preventivas d urante el período perinatal, la profilaxis an tibiótica y la vacunación antineum ocócica dis­ m inuyen significativamente la m orbilidad y m ortalidad asociadas a la enfermedad. De ahí la im portancia de establecer programas de cribado neonatal de la enfermedad de células falciformes en regiones donde el nivel de prevalencia lo exige, como, por ejemplo, en Cataluña y Madrid. Además de la HbS, hasta la actualidad se han descrito más de 500 hemoglobinopatías diferentes; las más frecuentes se han recogido en la tabla 17-3. Su importancia clínica es m ucho m enor que la HbS porque no cursan con manifestaciones tan graves, excepto cuando coexisten con un gen po rtad o r de HbS. La hem oglobinopatía C (H bC) se caracteriza p or la sustitución del ácido glutámico de la posición 6 de la cadena 3 de la globina por lisina. Es una hemoglobinopatía propia del África occidental, pero no infrecuente en España (existen focos de familias en algunas zonas del sur de España, es­ pecialmente en Extremadura). El estado heterocigoto (0 /0 °) es asintomático mientras que el homocigoto ( 0 C/ 0 C) se acompaña de una moderada anemia hemolítica de carácter crónico y esplenomegalia. La hemoglobinopatía J (HbJ) es una Hb de migración rápida. Endémica en Europa, puede encontrarse en España. La hemoglobinopatía D (HbD) asintomática en estado heterocigoto se caracteriza por una leve anemia hemolítica en estado homocigoto, muy infrecuente en España. La hemoglobinopatía E (HbE) es relativamente frecuente en el sudeste asiático y en estado homocigoto cursa con un síndrome anémico leve de características similares a la (3-talasemia heterocigota. En estado heterocigoto m uestra microcitosis m oderada sin anem ia que puede pasar desapercibida desde el punto de vista clínico; se caracteriza por la aparición de hematíes «en diana» (fig. 17-3). Las hemoglobinas inestables obedecen a un cambio de am inoácidos cerca de la cavidad del hemo, y las cadenas de globina pueden precipitar, produciendo hemólisis, con anemia y esplenomegalia. Se han descrito más de 100 formas diferentes de hem o­ globina inestable y sus manifestaciones clínicas pueden variar desde crisis de hemólisis neonatal hasta una ausencia de las mismas, pasando por cuadros de anemia hemolítica crónica. Las hem oglobinopatías con alteración de la afinidad p or el oxígeno obedecen a mutaciones que se traducen en una mayor o m enor afinidad de la hemoglobina por el

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGU RA 17-3. Presencia de dianocitos en sangre periférica de un paciente afecto de p-talasemia mayor.

oxígeno, alterando, con ello, el grado de liberación del oxígeno a los tejidos (oxigenación). El defecto más frecuente es un aum ento de afinidad que disminuye la liberación de oxígeno a los tejidos dando lugar a hipoxia y aumento de la síntesis de Epo, con aparición de eritrocitosis secundaria que se debe tener en cuenta en el diagnóstico diferencial de la poliglobulia. Finalmente, la metahemoglobinemia hereditaria obedece a mutaciones que alteran el estado del hierro hemínico favoreciendo su estado oxidado, es decir, incapaz de trans­ portar oxígeno. Normalmente, el hierro de la molécula de hemoglobina se encuentra en estado ferroso (Fe2+) y, en condiciones normales, menos del 1% está oxidado (Fe3+) gracias a la existencia de un sistema metabólico específico (sistema diaforasa-citocromo b5) que mantiene permanentemente reducido el Fe3+.

Talasemias Son disminuciones hereditarias de la síntesis de alguna de las cadenas de globina y, según la naturaleza de esta, se clasifican en: a-talasem ia (disminución de cadenas a ), 0 -talasemia (disminución de cadenas 0 ) o 80-talasemia (disminución simultánea de cadenas 8 y 0). Existen talasemias en las que coexiste la disminución de síntesis con una alteración estructural (hemoglobinopatías talasémicas). Un ejemplo de ello son las hemoglobinopatías producidas por un intercambio anómalo de material genético durante la meiosis. En este caso se producen cadenas de globina híbridas, constituidas por residuos aminoacídicos normales de dos cadenas diferentes de globina como, por ejemplo, en el caso de la Hb Lepore, formada por residuos aminoacídicos de las cadenas 8 y 0 , y que constituye una forma de talasemia porque cursa clínicamente con seudopoliglobulia microcítica. El mecanism o m olecular de las talasemias es m uy variable, aunque destacan la mutación delecional en las a talasemias y las mutaciones puntuales en las 0 talasemias. La deleción de 3,7 kb del gen a-globina (del a -3,7) constituye la forma molecular de rasgo talasémico más frecuente en nuestro medio, seguida de las mutaciones del gen /3 ( 0 -talasemia heterocigota). En ambos casos existe un exceso de síntesis de las res­ tantes cadenas de globina, de form a que en el caso de la 0 -talasem ia se observan precipitados intraeritroblásticos de cadenas a , y en el caso de a-talasemia, precipitados de cadenas 0. Estos precipitados de exceso de cadenas dificultan la m aduración norm al

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

457

de los eritroblastos, con su consiguiente desaparición en la propia médula ósea antes de madurar a eritrocitos (eritropoyesis ineficaz). La eritropoyesis ineficaz constituye, por tanto, el mecanism o fisiopatológico fundam ental de la anemia en la talasemia. Igualm ente, la dism in u ció n de cadenas p da lugar a un au m en to com pensador de cadenas 8 (HbA2) o 7 (H bF), p o r lo que u n a m utación del gen ¡3 con síntesis parcial de cadenas 0 ( 0 +-talasemia) suele acom pañarse de un m oderado aum ento de la fracción H bA 2 (3 ,5-4, 8 % ); y cuando existe u n a ausencia to ta l de síntesis (P°-talasemia), junto al aum ento de HbA^, suele observarse tam bién un aum ento de la hemoglobina fetal (HbF). jS-talasem ia En nuestro medio, la (3-talasemia m enor o rasgo talasémico es la forma más conocida, ya que su detección, especialmente de formas asintomáticas, viene facilitada por el empleo de analizadores automatizados que suministran sistemáticamente el VCM. El diagnóstico definitivo de 0 -talasemia requiere la separación y cuantificación de las fracciones de la Hb, en los que debe existir un aumento de la fracción HbA 2 (>3,5% ), y ocasionalmente también de HbF (>1,5% ). La expresividad clínica de la 0 -talasemia depende de la intensidad del déficit de síntesis de cadena 0 , que varía según la naturaleza de la mutación y su presencia en estado homocigoto o heterocigoto (tabla 17-4). Dentro de los síndromes 0-talasémicos también podem os encontrar asociaciones entre genes 0 -talasémicos y genes 8(3-talasémicos, como la Hb Lepore. La forma más grave de 0 -talasemia se produce cuando la síntesis de cadenas 0 es mínim a o inexistente. Esta forma de talasemia se conoce con el nom bre de talasemia mayor y cursa con una anem ia hem olítica crónica grave con requerim iento transfusional de por vida. La forma más leve de 0 -talasemia es el estado heterocigoto, en el que la anemia es de poca intensidad o prácticamente ausente. Esta forma de talasemia se conoce como 0 -talasemia m enor o rasgo talasémico, y su expresividad hematológica más característica es la seudopoliglobulia microcítica. La talasemia intermedia se debe a genotipos intermedios, homocigotos o compuestos dobles heterocigotos de diferentes

TABLA 17-4. Genotipos asociados a las diferentes categorías clínicas presentes en los síndromes 0-talasémicos Fenotipo

Genotipo

Talasemia mínima Talasemia menor

pSiknüyp P Silentej^Silente

Talasemia intermedia

P+/P 0 p " /p P ° /p P " /P * o P * 7 P ~

m

PV8(J" 0 (J"/S3Ü Talasemia mayor

p*/p* p*/p" P"/P" f>[íl'l',"/fl(íl‘T'"

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

mutaciones 0 -talasémicas, y es la que presenta mayor variabilidad clínica dependiendo de las mutaciones implicadas. En general, estas formas de talasemia no requieren transfusión. a -ta la se m ia Aunque tradicionalmente se ha considerado algo menos frecuente que la anterior, por existir un mayor número/porcentaje de casos asintomáticos, diversos estudios han demos­ trado que su incidencia es, al menos en nuestro medio, superior a la de 0 -talasemia heterocigota. En este sentido, hay que señalar que con la introducción de la biología molecular, muchas de las microcitosis familiares no diagnosticadas electroforéticamente han resul­ tado ser formas heterocigotas de a-talasemia (del a -3,7). A diferencia de la 0-talasemia, en la que predominan las mutaciones puntuales del gen /3 en zonas relacionadas con la maduración del ARNm, en la a-talasemia predominan las deleciones de uno o dos de los genes a . Con todo, la aplicación sistemática de los métodos de biología molecular ha perm itido describir un núm ero cada vez más elevado de variantes moleculares de a-talasem ia debidas a m utaciones del gen a 2 que, al igual que en la 0 -talasemia, alteran el proceso madurativo del ARN. El déficit de cadenas a se acom paña de un exceso de cadenas 0, que al unirse entre sí form an hom otetrám eros 0 4 (H bH ). D u­ rante el período fetal (en el que, en lugar de cadenas 0 , existen cadenas 7 ), se forman homotetrámetros 7 4 que reciben el nombre de hemoglobina Bart. La H bH (y también la H b Bart en sangre de cordón) puede identificarse m ediante electroforesis en ace­ tato de celulosa a pH alcalino por una fracción de migración más rápida que la HbA (fig. 17-4) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (fig. 17-5). Al igual que la 0 -talasemia, la a-talasemia presenta diversas formas clínicas según el carácter heterocigo­ to u homocigoto del defecto molecular. La forma más grave de a talasemia es la llamada anasarca fetoplacentaria o hydrops fetalis, en la que existe una ausencia total de cadenas a . Debido a que en la composición de todas las hemoglobinas interviene la cadena a y las HbH y Hb Bart carecen de capacidad para transportar oxígeno, esta forma de talasemia es incompatible con la vida. Las otras formas de a talasemia se caracterizan por anemia de

Hb Lepore

ü

II A C ------►

HbH HbS/C

^

HbA2 — ►

HbA/F HbA

II

HbA/D Hb Fannin-Lubbock Hb Barcelona

Origen

FIGU RA 17-4. Electroforesis de hemoglobinas en acetato de celulosa con pH 8,6. La fracción de HbH, y también la Hb Bart (presente en sangre de cordón umbilical), pueden identificarse mediante electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino, ya que muestran una migración más rápida que la fracción HbA normal.

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Capítulo 17

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Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

Fenotipo FA (normal)

Fenotipo FAS {rasgo falciforme)

Time

Area

0,11 0,19 0,4 0,72 0,95 area S

122377 202951 747876 2433335 558320 4064859 0%

0.11 0.19 0.37 0.72 0.95 1.26 area S

102473 101000 395122 1670603 217866 154226 2641379 5.8%

Fenotipo FAC Irasgo HbC)

Unknown 1 2.9 FAST 3,6 Unknown 213.3 Unknown 3 0.2

0,11 0,19 0,41 0,72 9.6 1.56 1.81 rea S

172643 122254 445739 2212932 309245 6456 165799 3359475 0%

Fenotipo FS Idrepanocitosis)

Unknown 1 4.8 FAST 14,2 Unknown 216,8

0.12 0.18 0.53 0.77 0.86 0.95 1.28 rea

110688 331967 307835 1406121 15936 10168 88415 2330131

Fenotipo FS C Idrepanocitosis)

Unknown 1 6 FAST 18,2 Unknown 2 13,8 Ib4./ Unknown 3 0,5 Unknown 4 0,2

0,11 0,18 0,55 0,73 0,85 0,95 1,26 1,55 1,79 rea S

172643 525179 397968 1579026 15558 31164 86951 5300 73850 2330131 3%

FIGU RA 17-5. Perfiles cromatográficos obtenidos mediante el programa para cribado neonatal de la anemia de células falciformes utilizado por el equipo Variant System de Bio-Rad®.

intensidad variable y la presencia de mayor o m enor cantidad de H bH , que puede ponerse fácilmente de manifiesto mediante la electroforesis convencional o la tinción vital de los eritrocitos con azul de cresilo brillante; este, al producir la precipitación de la HbH, dará lugar a una imagen de inclusiones eritrocitarias en forma de mórula muy características (fig. 17-6). La forma más leve de a-talasemia es totalmente asintomática y solo puede diagnosticarse mediante análisis del ADN y, ocasionalmente, el estudio in vitro de la síntesis de cadenas de globina.

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460

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGURA 17-6. Cuerpos de Heinz espontáneos en un caso de a-talasemia. Obsérvese su aspecto característico en forma de mórula (ACB X 1.000).

8(3-talasemia Se caracteriza por un defecto en la síntesis de las cadenas 8 y (3. Genéticamente se debe a amplias deleciones en el locus 0 del cromosoma 11. En el estado homocigoto, solo se sintetiza HbF, y en el heterocigoto se aprecia un valor elevado de HbF (entre 7 y 16%) con presencia de las restantes fracciones hemoglobínicas normales. Las manifestaciones clínicas solo se observan en el estado homocigoto y suelen ser parecidas a una 0-talasemia intermedia de baja intensidad. La 80-talasemia heterocigota es relativamente frecuente en la zona mediterránea de España, aunque menos que la 0-talasemia. La 80-talasemia debe distinguirse de la Hb Lepore, debida a un entrecruzamiento (crossing-over) entre los genes 8 y 0. Las manifestaciones clínicas son muy similares, si bien la 80-talasemia se caracteriza por un mayor grado de anemia microcítica e hipocromía.

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS GENERAI.F.S Las técnicas empleadas en el estudio de las hemoglobinas son muy diversas, desde la simple electroforesis sobre acetato de celulosa hasta el análisis de los genes de globina mediante técnicas de biología molecular. En la práctica clínica, las técnicas más empleadas son las que permiten detectar fácilmente la presencia de hemoglobinopatía, dejando para laboratorios especializados todos aquellos procedimientos encaminados a identificar la mutación genética. Estas técnicas son esencialmente las siguientes: 1. Electroforesis convencional de hemoglobinas e isoelectrofocalización 2. Cuantificación de la fracción hemoglobínica HbA2 3. Cuantificación de la hemoglobina fetal (HbF) 4. Análisis de la estabilidad molecular de la hemoglobina 5. Detección y cuantificación de la hemoglobina M (HbM)

Electroforesis convencional de hem oglobinas e isoelectrofocalización Principio La hemoglobina, p o r ser una molécula de naturaleza proteica, está constituida por aminoácidos los cuales se unen entre sí mediante enlaces peptídicos formando cadenas secuenciales (globinas) que poseen radicales ácidos C00“ y básicos N H 3+. La carga eléc­ trica de estos grupos depende del pH del medio en que están disueltos. En su punto

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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isoeléctrico (igual cantidad de C00~ y N H 3+), la proteína es eléctricamente neutra. A medida que se eleva el pH, los radicales N H 3+van siendo neutralizados por la base del regulador del medio (tampón o buffer) y predominan los radicales C00-, lo que confiere a la proteína una carga negativa. Si el pH es ácido, obviamente ocurre lo contrario. En el prim er caso, la proteína cargada negativamente será atraída por el polo positivo del campo eléctrico (ánodo), y en el segundo, lo será por el polo negativo (cátodo). Las diferentes hemoglobinas normales (HbA, HbA, y HbF), al igual que las proteínas del plasma, cuando se colocan en un medio a un determinado pH, presentan diferente carga eléctrica, por lo que pueden ser separadas debido a su distinta movilidad al aplicar un campo eléctrico. Existen distintas modalidades de electroforesis y cada una de ellas con sus aplica­ ciones específicas. En el caso concreto de las hemoglobinas, la electroforesis de zona es, ampliamente, la más utilizada, habiendo quedado la electroforesis libre (en la que las proteínas que hay que separar migran disueltas en un sistema am ortiguador a un determinado pH, en un tubo en U) completamente relegada. En la electroforesis de zona, el sistema amortiguador impregna u n soporte (papel, gel de agar, almidón, acetato de celulosa, gel de poliacrilamida, etc.), sobre el que se coloca una muestra de la solución de hemoglobinas que hay que analizar. Las fracciones separadas se pueden visualizar después del revelado con colorantes adecuados. De los distintos soportes disponibles, los más utilizados en el estudio de las hemoglobinas son el acetato de celulosa, el gel de agar y el gel de poliacrilamida. En la práctica diaria, el soporte más empleado es el acetato de celulosa a pH 8,6. El acetato de celulosa es el soporte ideal, tanto por su carácter homogéneo y no absorbente como por su elevada resistencia mecánica que le confiere una fácil manipulación. Tiene la ventaja de ser completamente soluble en ácido etanoico concentrado, lo que permite eluir las fracciones separadas y analizarlas cuantitativamente por colorimetría. Cualitativamente, esta técnica permite la separación de las hemoglobinas normales de un hemolizado (A, A2, F), así como determi­ nados imitantes estructurales (HbS, HbE, HbJ, etc.). Determinados tipos de hemoglobinas, debido a que poseen una intensidad de carga similar, migran prácticamente al mismo nivel cuando se separan en soporte de acetato de celulosa a pH 8,6. Un ejemplo de ello lo cons­ tituyen las hemoglobinas HbA2, HbC y HbE, y las HbS y HbD. En estos casos, para conseguir una mejor separación entre dichas fracciones se recomienda el empleo de otro valor de pH, generalmente pH 6, y casi siempre otro soporte (el más empleado es el gel de agar). A diferencia del acetato de celulosa, en que el factor fundamental de separación es la intensidad de la carga eléctrica molecular, en el gel de agar intervienen, además, otros factores, tales como ciertas interacciones fisicoquímicas entre el agar y las moléculas de hemoglobina que dependen de la localización superficial de la mutación. Debido a ello, el gel de agar permite en muchos casos separar dos fracciones de hemoglobinas, que en acetato de celulosa migran casi al mismo nivel. Así, el agar a pH ácido es especialmente útil para separar la HbS de la HbD y la HbC de la HbE, y además es muy manejable, ya que forma geles rígidos aun a concentraciones del 1%. El gel de agar con el que se obtiene una mejor resolución de las fracciones de hemoglobina es la poliacrilamida, resultado de la polimerización a partir de una mezcla de acrilamida y N, N ’ metilenbisacrilamida. Es preciso añadir a la misma un agente activador de la polimerización, que generalmente es el TEMED, junto al persulfato amónico. La N, N’-metilenbisacrilamida facilita el entrecruzamiento de las cadenas de acrilamida, y su concentración en el gel condiciona el tamaño del poro obtenido. Los geles obtenidos son en general transparentes y elásticos, y las distintas fracciones separadas se pueden visualizar sin necesidad de tinción específica, aprovechando el color que posee la hemoglobina y precipitándolas sobre el gel con una solución diluida de ácido tricloroacético (TCA).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Electroforesis a p H alcalino (8,6) Material • Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante aunque se recomienda la heparina. • Cubetas de electroforesis con fuente de alimentación. • Solución tampón: TEB (Tris EDTA borato, pH 8,2-8,6) preparado de la siguiente forma: • Tris-(hidroximetil-aminometano), 10,2 g. • EDTA, 0,6 g. • Ácido bórico, 3,2 g. • H20 destilada, hasta 1.000 mi. • Solución colorante: negro amido B-10 (0,5 g en una solución constituida por 50 mi de metanol, 40 mi de agua destilada y 10 m i de ácido acético glacial). Puede emplearse, alternativamente, el verde de lisamina o el rojo de Ponceau. • Solución decolorante (475 mi de agua destilada, 475 mi de metanol y 50 mi de ácido acético glacial). • Soporte de acetato de celulosa. • Solución transparentadora (83 mi de metanol absoluto, 17 mi de ácido acético glacial y 1 mi de glicerina). Método 1. Lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1 y obtener el hemolizado aña­ diendo un volumen de eritrocitos lavados a dos volúmenes de agua destilada mediante congelación descongelación tres veces consecutivas. 2. Centrifugar el hemolizado, obteniendo en el sobrenadante una solución de hemo­ globina que se ajusta mediante agua destilada a una concentración de 8-10 g/dl. 3. Sumergir el soporte de acetato de celulosa en tam pón como m ínim o durante 20 min y colocarlo en el puente de la cubeta electroforética, una vez eliminado el exceso de tampón mediante papel de filtro WHATMAN®. 4. A 2 cm aproximadamente del lado catódico (polo negativo) del soporte se de­ positan linealmente (o m ediante un aplicador adecuado) 2 |xl de solución de hemoglobina y la electroforesis se lleva a cabo durante 15 min a 350 V. 5. Después de la electroforesis, los soportes se colorean colocándolos durante 5 min en solución colorante y a continuación en la decolorante hasta que desaparezca el color de fondo. Una vez decolorado, el soporte puede transparentarse sumergién­ dolo durante 30 s en metanol absoluto y 3 min en la solución transparentadora. Finalmente, la placa debe colocarse en una estufa de cultivo a 37 °C hasta que esté completamente seca. Interpretación del resultado En la electroforesis de u n hem olizado destacan tres fracciones bien diferenciadas (v. fig. 17-4). La fracción más rápida y más intensamente coloreada corresponde a la hemoglobina A (HbA), la segunda fracción corresponde a la HbA^ y la tercera, cerca del origen, no es hemoglobina y corresponde a la anhidrasa carbónica (AC), muy abundante en el eritrocito. Si se parte de eritrocitos de cordón umbilical o de sangre de recién nacido, se observa inmediatamente detrás de la hemoglobina A una fracción correspondiente a la hemoglobina fetal (HbF). Las alteraciones cuantitativas que se observan con mayor frecuencia son el aumento de la fracción HbA2 (0 -talasemia m enor y anemia megaloblástica) y el incremento de la

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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CUADRO 17-1. Causas de aumento de la hemoglobina fetal • Anemia intensa • Aplasia medular (congénita o adquirida) • Anemia perniciosa • Esferocitosis hereditaria (EH) • Eliptocitosis congénita • Hemoglobinuria paroxística nocturna • Eritropoyesis exagerada o de estrés • Mielofibrosis • Neoplasias • Tumores metastásicos • Leucemia (particularmente, la mielomonocítica infantil) • Histiocitosis • Mieloma múltiple • Hemoglobinopatías • Talasemia mayor y menor • Hemoglobina Lepore • Hemoglobinas S, C, D y E en las formas homocigotas • Persistencia hereditaria de la HbF

HbF (80-talasemia, persistencia hereditaria de la HbF y ciertos trastornos adquiridos de la eritropoyesis) (cuadro 17-1). La presencia de fracciones hemoglobínicas anómalas es característica de las hemoglobinopatías estructurales que modifican la carga superficial. Es rara, por el contrario, en las hemoglobinopatías inestables (excepto en la Hb Kóln) y en las hemoglobinopatías con aumento de la afinidad por el oxígeno, ya que en estos casos las hemoglobinas mutadas suelen presentar la misma carga que la HbA y, por tanto, su misma velocidad de migración electroforética. Electroforesis a p H ácido (6) Material • Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante, aunque se recomienda la heparina. • Soporte de gel de agar. • Bacto agar (Difeo®). • Cubetas de electroforesis adaptadas al empleo de placas Helena® (Helena Biosciences Europe) y fuente alimentadora adecuada. • Soluciones de tam pón citrato sódico.

Solución A madre o de reserva (citrato sódico 0,5 mol/l) • • • •

Citrato sódico (Na3C2H50 7 2H20 ) , 147 g. H20 bidestilada, 500 mi. Mediante ácido cítrico (300 g/1) ajustar el pH a 6. Añadir agua bidestilada, c.s.p. 1.000 mi.

Solución B de trabajo (citrato sódico 0,05 mol/l) • Diluir a 1/10 la solución A (citrato sódico 0,5 mol/1) y equilibrar a pH 6 con ácido cítrico (300 g/1).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Reactivo de tolidina (preparación extemporánea) • O-tolidina-dihidroclorohidrato, 1 g. • Ácido acético glacial, 25 mi. • Agua destilada c.s.p. 100 mi.

Método 1. Lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1 y obtener el hemolizado aña­ diendo un volumen de eritrocitos lavados a dos volúmenes de agua destilada mediante congelación descongelación tres veces consecutivas. Centrifugar el hemolizado, obteniendo en el sobrenadante una solución de hemoglobina que se ajusta mediante agua destilada a una concentración de 1-3 g/dl. 2. Disolver 1 g de Bacto agar (Difeo®) en 100 mi de solución B de trabajo (citrato sódico 0,05 mol/1), añadir dos gotas de cianuro potásico (KCN) al 5%. Calentar al baño maría a ebullición hasta que el agar se haya disuelto completamente. 3. Mediante una pipeta cubrir un soporte de plástico con una capa de agar (general­ mente son necesarios 5 mi de la solución) y dejar enfriar hasta que el agar tome cuerpo y se solidifique. 4. Guardar las placas preparadas a 4 °C en cámara húmeda hasta su uso, para lo cual deben haber transcurrido como mínimo 2 h desde su preparación. 5. Preparar la cámara de electroforesis para la colocación de los soportes con el agar. 6. Depositar la muestra en el centro de la placa. 7. Colocar la placa con el gel de agar sobre el puente de la cubeta electroforética, asegurando el contacto con el tam pón mediante sendas bandas de papel de filtro. 8. La electroforesis se lleva a cabo durante 45 min a 40 V. 9. Una vez term inada la electroforesis, verter sobre la placa 5 mi de reactivo de O-tolidina, a los que se han añadido 3 o 4 gotas de ácido acético glacial. 10. Después de 2-3 min, eliminar el exceso de líquido de la placa mediante decantación y sumergirla en una solución de peróxido de hidrógeno (H 20 2) (1 mi de H20 2 en 200 mi de agua destilada) y dejar en reposo hasta que aparezca el revelado (bandas o fracciones de color azul). 11. Sumergir la placa en agua destilada durante 30 min. 12. Finalmente, eliminar el exceso de agua, transferir la placa a u n soporte de papel de filtro y dejarlo secar en la estufa (37 °C) durante 24 h.

Interpretación del resultado La electroforesis en gel de agar (citrato de agar, pH 6) permite diferenciar perfectamente la HbA de la HbF, lo cual resulta difícil mediante la electroforesis sobre acetato de celulosa a pH 8,6. Asimismo, resulta útil para diferenciar perfectamente ciertas hemoglobinas patológicas, como la HbS de la HbD. Isoelectrofocalización

Principio La electrofocalización, llamada también técnica del isoelectroenfoque, permite la sepa­ ración de moléculas proteicas en función de su punto isoeléctrico. Dado que las hemo­ globinas forman parte de este grupo de moléculas, en presencia de un campo eléctrico y de un gradiente de pH, se desplazan hasta llegar a una línea de valor de pH en la que su carga eléctrica global es nula (punto isoeléctrico), y en ese m omento la hemoglobina deja de m igrar al no poder ser atraída por los polos del campo.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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Material • Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante, aunque se recomienda la heparina. • Dos placas de vidrio de 260 X 125 X 1 mm y pinzas de presión. • Banda de caucho de 1 m m de espesor. • Jeringa y aguja con calibre de 0,5 mm. • Matraz Kitasato de 100 mi. • Solución madre de acrilamida bisacrilamida preparada de la siguiente forma: • Acrilamida, 9,7 g. • Bisacrilamida, 0,3 g. • Agua destilada, 50 mi. • A nfolinas (Anpholine® [Amersham Pharmacia-Biotech] de gradientes pH 6-8 Y 7 -9 ).

• Temed®. • Persulfato amónico al 30%.

Método 1. Preparación del gel (a) Lavar las placas de vidrio escrupulosamente, aclarándolas con agua destilada y rociando una de ellas con etanol para facilitar la adherencia del gel a una de ellas. Colocar la banda de caucho entre ambas placas, dejando un pequeño espacio para introducir la acrilamida. A continuación, se unen fuertemente mediante las pinzas de presión. Colocar las placas así dispuestas, los reactivos, el matraz Kitasato, la jeringa y la aguja en nevera a 4 °C. (b) Verter en el matraz Kitasato: (i) Solución madre de acrilamida bisacrilamida, 7,5 mi. (ii) Anpholine® (pH 6-8), 6 mi. (iii) Anpholine® (pH 7-9), 1,6 mi. (iv) Agua destilada, 20 mi. (c) Tapar y eliminar el aire retenido mediante una bomba de vacío durante 5 min y a continuación añadir 20 |xl de Temed® y 100 (xl de persulfato amónico. Remover suavemente la mezcla, e inm ediatam ente verter la solución en la jeringa e inyectarla entre las placas de vidrio, evitando la formación de burbujas. Dejar que la gelificación tenga lugar durante 1 h a tem peratura ambiente. Colocar la placa en nevera 24 h antes de usarla. (d) Se retira con cuidado la junta de caucho y con la punta de una espátula se procede a la separación de las placas de vidrio. El gel quedará adherido a una de ellas, que casi siempre será la que ha sido rociada con alcohol. Se tendrá la precaución de eliminar el exceso de líquido de las tiras secándolas entre dos hojas de papel de filtro. 2. Migración. Preelectroforesis (antes de colocar las muestras): 15 m in a potencia constante (0,9 W /m l de gel). 3. Obtención de la muestra: lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1 y obtener el hemolizado añadiendo un volum en de eritrocitos lavados a dos volúmenes de agua destilada m ediante congelación-descongelación tres veces consecutivas. Diluir el hemolizado a 1:5 con agua destilada y centrifugar. 4. Depósito de la muestra: depositar 5 |xl de la muestra obtenida sobre cuadritos de papel de filtro WATHMAN 3, y colocarlos con una pinza sobre el gel a 1 cm del cátodo y dejando un espacio de 2 m m entre ellas.

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Hb Lepore

m m

~n

mm

HbH

HbS/C

HbA/F

HbA

HbA/D

tt

SI ▼ Origen

Hb Fannin-Lubbock

Hb Barcelona

FIGU RA 17-7. Imagen característica de un fraccionamiento de hemoglobinas mediante la técnica del isoelectroenfoque (IEE) o electrofocalización.

5. Migración electroforética: se realiza durante 1-1,5 h al mismo voltaje de la preelectroforesis. 6. Secado: finalizada la migración, la placa se sumerge en solución de ácido tricloroacético al 12% durante 10 min; luego se transfiere el gel a un papel de filtro y se seca a 60 °C durante 2 h, o a 37 °C durante 24 h.

Interpretación del resultado La imagen obtenida tras la electroforesis está constituida por los diferentes componentes hemoglobínicos del hemolizado en forma de bandas focalizadas en diferentes líneas según sus puntos isoeléctricos (fig. 17-7).

Cuantificación de la fracción HbA2de la hem oglobina Principio La apreciación subjetiva de la fracción HbA2 mediante la inspección visual de la elec­ troforesis sobre acetato de celulosa permite, en la mayoría de los casos, dem ostrar la presencia de un aumento del mismo. Esta apreciación, no obstante, es puramente cua­ litativa y en ocasiones puede ser incluso errónea, especialmente cuando la electroforesis se ha realizado a partir de una solución excesivamente concentrada de hemoglobina. El diagnóstico de 0 -talasemia exige, por tanto, la cuantificación de esta fracción normal de hemoglobina. La cuantificación de la HbA2 se realiza tradicionalm ente mediante dos técnicas manuales: a) elución de la fracción electroforética, y b) microcolumna de DEAE-celulosa. La elución de la fracción electroforética consiste en separar físicamente la banda co­ rrespondiente a la HbA2. Para ello, se parte de la tira electroforética de acetato de celulosa sin transparentar y la elución se consigue sumergiendo la fracción separada en amoníaco

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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diluido. Una vez eluida la tira, se cuantifica analizando mediante un fotocolorímetro la absorbancia de la solución obtenida con relación a la del total de hemoglobina. La dosificación de la HbA2 por microcolumna de DEAE celulosa se basa en la ad­ sorción relativa de la misma en un lecho o soporte de DEAE celulosa, que es una resina intercambiadora de iones. Debido a que la adsorción de la HbA2 en la resina difiere de la de la HbA, puede eluirse y obtenerse separadamente de esta, haciendo pasar a través de la columna un tampón de pH adecuado. La DEAE celulosa puede utilizarse no solo para separar hemoglobinas normales, sino también diferentes hemoglobinas patológicas. A ctualmente, existe un m étodo autom atizado para realizar la cuantificación de las fracciones hemoglobínicas HbF y HbA2 que presenta mayor reproducibilidad y sensibilidad que los métodos manuales.

Elución de la fracción electroforética Se describe aquí un método rápido para la cuantificación de la fracción HbA2 de la hemoglobina que presenta muy pocas variaciones respecto al recomendado por el ICSH.

Material El mismo que el empleado en la electroforesis de hemoglobinas sobre soporte de acetato de celulosa a pH 8,6.

Método 1. Realizar los pasos 1,2 y 3 del apartado «Método» de la electroforesis de hem o­ globinas sobre soporte de acetato de celulosa a pH 8,6. 2. Sin teñir la tira electroforética, y mediante unas tijeras, se cortan las fracciones HbA y HbA2y se introducen en 15 y 1,5 mi, respectivamente, de NH4OH diluido (2:100), durante 30 min. A continuación se lee la absorbancia mediante un espectrofotómetro a 415 nm de las soluciones obtenidas. 3. La proporción de HbA2 se calcula del siguiente modo: HbA2(%) = ------ AHbA, X100-----10 X (AHbA - A H bA ,) (A = absorbancia o densidad óptica) Como blanco para esta lectura se emplea un fragmento de tira de acetato de celulosa sin Hb y eluida de la misma forma que las fracciones que hay que analizar.

Interpretación de los resultados y valores de referencia Mediante este método, en un sujeto adulto normal, el porcentaje de HbA2 oscila entre el 2,5 y 3,5%. Esta cifra aumenta sensiblemente en la 0-talasemia menor, en la que puede llegar a alcanzar valores comprendidos entre el 3,8 y el 7%. Valores situados entre 3,5 y 3,8% deben ser considerados con especial atención, ya que podrían tratarse de rasgos talasémicos con baja expresividad de HbA2o, lo más probable, podrían reflejar la coexis­ tencia de una ferropenia. En tales casos es m uy conveniente repetir la determinación a partir de un nuevo espécimen y descartar las causas citadas. La 8 0-talasemia y la hemo­ globina Lepore cursan con valores normales de HbA2. Aunque el interés diagnóstico de la dosificación de HbA2se centra casi exclusivamen­ te en la 0-talasemia menor, existen otras situaciones patológicas en las que esta fracción hemoglobínica puede observarse alterada. Así, puede hallarse aum entada en ciertas

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hemoglobinopatías inestables por m utación de la cadena 0, en la anemia megaloblás­ tica y en la eritroleucemia; y disminuida en la ferropenia, la anemia sideroblástica, el rasgo a-talasémico asociado a HbS y ciertas hemoglobinopatías por mutación de las cadenas a y 8 de globina.

Elución en microcolumna de DEAE-celulosa Resultados similares al m étodo de la elución de la fracción electroforética pueden obtenerse m ediante la técnica de la elución en microcolumna de DEAE-celulosa. El m étodo descrito aquí corresponde al de un kit comercial basado en el de Efremov, también recomendado por el ICSH. No obstante, en la actualidad esta técnica solo se utiliza excepcionalmente, porque en los laboratorios donde puede realizarse ha sido sustituida por la HPLC (v. más adelante). M aterial • Sangre total heparinizada. • Microcolumna de DEAE-celulosa. M étodo A 250 |xl de reactivo hemolizante, añadir 50 |xl de sangre total. Dejar en reposo 10 min. Extracción crom atográfica 1. Destapar la columna en la parte superior, mezclar la resina de la columna mediante pipeta de Pasteur, retirar el tapón inferior y dejar eluir el exceso de tampón. 2. Añadir 100 |jl1del hemolizado, el cual queda adsorbido en la parte superior de la resina. 3. Una vez que la columna está así dispuesta, colocar sobre un tubo colector con señal de enrase y añadir por su extremo superior 2,5 ml del tampón (HbA2 Developer), recogiendo a continuación todo el eluido que contiene la fracción hemoglobínica A,. 4. En otro tubo colector con señal de enrase a 15 mi se colocan 100 (xl del hemolizado y se añade agua destilada hasta dicho enrase (agitar suavemente). 5. El tubo colector que contiene la fracción hemoglobínica A2 recogida se completa hasta el enrase de 3 mi con agua destilada (agitar suavemente). 6. Finalmente se realiza la lectura espectrofotométrica de ambas muestras a 415 nm contra un blanco de agua destilada y se aplica el siguiente cálculo: _ , /n/x HbA 2(%) =

A415 x H b A 2 xlOO ... ------ - 2 - -----------A de hemolizado total x 5

Interpretación de los resultados y valores de referencia Los individuos normales presentan unos valores de HbA, que oscilan entre 2,8 y 3,6%. La interpretación de la técnica es superponible a lo dicho en el método anterior.

Cuantificación de la hem oglobina fetal (HbF) Existen dos métodos tradicionales para determinar la HbF: a) método cuantitativo de la desnaturalización alcalina, y b) método cualitativo de la resistencia a la elución ácida sobre porta. Actualmente, existe un método automatizado para realizar la cuantificación de las fracciones hemoglobínicas HbF y HbA2que presenta mayor reproducibilidad y sensibilidad que los métodos manuales (v. «Cromatografía líquida de alta resolución»).

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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Método de la desnaturalización alcalina según Betke (ICSH) Principio La HbF es más resistente a la desnaturalización alcalina que las otras hemoglobinas, apareciendo en el filtrado después de neutralizar el pH con una solución saturada de sulfato amónico. Para el diagnóstico clínico, este método ha sido totalmente desplazado por la HPLC (v. «Cromatografía líquida de alta resolución»), pero se describe aquí porque aún puede ser utilizado cuando no se dispone de la tecnología actual.

Reactivos 1. Solución de Drabkin preparada del siguiente modo: (a) Ferricianuro de potasio Fe (CN)6 K3, 200 mg. (b) Cianuro de potasio (KCN), 200 mg. (c) Agua destilada, c.s.p. 1.000 mi. 2. Sulfato amónico ([N H J2 S 0 4) a saturación. 3. Solución de NaOH, 1,2 N. 4. Hemolizado con una concentración de hemoglobina aproximada de 8 g/dl.

Método La técnica debe realizarse siempre a temperatura ambiente (18-20 °C): 1. A 0,6 m i de hemolizado se añaden 10 mi de solución de Drabkin. 2. De la solución de cianometahemoglobina así obtenida (paso 1) se toman 2,8 mi y se colocan en un tubo de hemólisis, al que se añaden a continuación 0,2 mi de NaOH 1,2 N (tubo 1). 3. Agitar durante 2 m in y añadir 2 mi de sulfato amónico saturado. Agitar fuerte­ mente, dejar en reposo durante 5 min y filtrar. 4. Leer la absorbancia (A) del filtrado a 540 nm. 5. Para obtener la densidad óptica de la hemoglobina total se diluyen 2,8 mi de la solución de cianometahemoglobina con agua destilada hasta completar un volumen final de 25 mi (tubo II). 6. El blanco se obtiene mezclando 2,8 mi de D rabkin con 0,2 mi de NaOH y 2 mi de (NH4)2S 0 4. 7. El cálculo del resultado se realiza aplicando la fórmula siguiente: H b P (% )= D 0deltub0lX 100 DO del tubo 11x5

Método de la resistencia a la elución ácida según Kleihauer-Betke Principio Se trata de un método citoquímico empleado para cuantificar la intensidad de la hemo­ rragia fetomaterna mediante observación microscópica de la HbF presente en los eri­ trocitos. La reacción se basa en la mayor resistencia de la HbF a la elución cuando los eritrocitos puestos sobre una extensión se someten a valores de pH ácidos, lo cual se pone de manifiesto por su intensa coloración roja.

Material • Sangre total mantenida en EDTA. • Tampón cítrico fosfato, pH 3,7. • Ácido cítrico, 0,715 mol/1. • Difosfato sódico, 0,57 mol/1.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• Solución de hematoxilina ácida (1 g/1), pH 3,3. • Solución de eosina al 0,1 %.

Método 1. Realizar una extensión muy fina y dejar a temperatura ambiente hasta que esté completamente seca. 2. Preparar un baño maría a 37 °C y colocar en el mismo un vaso de Coplin con una dilución 1/10 del tam pón cítrico-fosfato en agua destilada. Dejar estabilizar durante 30 min. 3. Sumergir la preparación en metanol al 80% durante 5 m in y lavar con abundante agua corriente. 4. Sumergir la preparación en la solución tam pón durante 5 min, agitando después del prim er y el tercer minuto. 5. Lavar con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente durante 1 h. 6. Teñir la preparación sumergiéndola 3 min en la solución de hematoxilina. (a) Transcurrido este tiempo, se extrae y se lava con agua destilada. 7. Contrastar la preparación con eosina durante 4 m in, lavar con agua destilada y dejar secar, m om ento en el que ya está lista para su observación.

Interpretación del resultado En condiciones normales, prácticamente no existen eritrocitos que contengan HbF (< 1 %), por lo que la mayoría carecen de hemoglobina teñida (ácido sensible) en su interior; por el contrario, puede hallarse aumentado su núm ero en el caso de una mujer embarazada con eritrocitos fetales en su torrente circulatorio (hemorragia transplacentaria). Asimismo, son mayoría cuando se observa una muestra de sangre de cordón umbilical e incluso de un recién nacido. Los eritrocitos que contienen HbF se caracterizan por su intenso color rojo, que difiere notablemente del de los eritrocitos adultos (fig. 17-8).

Análisis de la estabilidad m olecular de la hem oglobina Introducción Existe un grupo de hemoglobinas patológicas que se caracterizan por poseer una molécula inestable capaz de desnaturalizarse en presencia de ciertas condiciones físicas (temperatura o agentes químicos), que son perfectamente toleradas por la HbA. Las hemoglobinas inestables generalmente son el resultado de una mutación de carácter neutro y, por tanto, no se acompa­ ñan de variación en la carga de la molécula de hemoglobina. Al migrar electroforéticamente,

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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igual que la HbA, no pueden ser detectadas mediante este procedimiento. En este ti­ po de hemoglobinopatías la m utación suele estar localizada en la cavidad del grupo hemo, por lo que su desnaturalización va precedida de una desheminización o pérdida espontánea del grupo hemo. La desnaturalización in vivo de la hemoglobina condiciona la aparición de precipitados de hemoglobina en el interior del eritrocito o cuerpos de inclusión (cuerpos Heinz), que son la causa de la hemólisis. En la práctica se utilizan dos procedimientos para poner a prueba la estabilidad molecular de la hemoglobina: 1. Método de la estabilidad frente al calor (estabilidad térmica). 2. Método de la estabilidad frente al isopropanol (estabilidad química). Tanto el estudio de la estabilidad térmica como la influencia del isopropanol son igualmente sensibles en la detección de hemoglobinas inestables. No obstante, pueden observarse en ocasiones falsas positividades, especialmente cuando existe metahemo­ globina o un aumento de la HbF.

Prueba de estabilidad de la hemoglobina al calor Principio Esta prueba debe ser practicada siempre a p artir de sangre fresca y con un control simultáneo normal. Consiste en incubar una solución de hemoglobina durante 2 h a 50 °C y observar la eventual aparición de precipitado evidente.

Material • Sangre total heparinizada (del paciente y un control norm al). • Tampón Tris-HCI 0,15 mol/1, pH 7,4. • Tris, 5,05 g. • Agua destilada c.s.p. 1.000 mi. • Ajustar el pH con H C 11 N hasta conseguir un valor de 7,4.

Método 1. Lavar los eritrocitos tres veces con solución salina fisiológica. 2. Realizar el hemolizado mezclando 100 |xl de eritrocitos lavados y 200 (jlI de agua destilada. 3. Eliminar los estromas mediante centrífuga Eppendorf®. 4. En dos tubos, uno para el paciente y otro para el control, colocar 1,8 mi de solución tam pón Tris HC1, pH 7,4, y añadir 200 (xl de los hemolizados correspondientes. 5. Incubar 2 h a 50 °C y observar la eventual aparición de un precipitado.

Interpretación del resultado Cada hora debe observarse el contenido del tubo para ver la posible aparición del precipitado, el cual debe caracterizarse por una floculación blanquecina o la desaparición de la transparencia. La prueba se considera positiva solamente cuando dicho precipitado aparece en el hemolizado problema y no en el tubo control.

Prueba de estabilidad de la hemoglobina al isopropanol Principio El isopropanol, debido a su carácter intensam ente polar, produce un efecto deses­ tabilizador sobre la molécula de hemoglobina. Este efecto, a la concentración en que se utiliza en la prueba, es bien resistido por una hemoglobina normal, mientras que en

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

una hemoglobinopatía inestable produce una precipitación de características similares a las descritas en la prueba térmica.

Reactivos 1. Sangre heparinizada (paciente y control). 2. Solución de isopropanol al 17% en Tris-HCl 0,1 mol/1, pH 7,4.

Método 1. Lavar los eritrocitos del paciente y los eritrocitos control. 2. Preparar el hemolizado a partir de los eritrocitos lavados, de la misma forma que en el método de la desnaturalización por el calor. 3. Si la concentración de hem oglobina del hemolizado es m uy alta, ajustarla a 10 g/dl. 4. En dos tubos situados en un baño maría a 37 °C, introducir, respectivamente, 2 mi de tam pón isopropanol y dejarlo equilibrar durante 5 min. A uno de los tubos se le añaden 0,2 mi de hemolizado problema y al otro, 0,2 mi de hemolizado control. 5. Los tubos, una vez tapados, se agitan suavemente por inversión y se colocan de nuevo en el baño maría a 37 °C. Observar si existe precipitado a los 5 m in y, si no, esperar otros 15 y ver si existe un floculado blanquecino.

Interpretación del resultado Si no existe hem oglobina inestable, la solución del hemolizado permanecerá trans­ parente durante más de 30-40 min. Por el contrario, si existe hemoglobina inestable, aparecerá un precipitado o flóculo blanco dentro de los primeros 10 min tras iniciarse la incubación o bien desaparecerá la transparencia (fig. 17-9). Como se ha comentado anteriormente, debe tenerse siempre presente que un aumento de HbF o la presencia de metahemoglobina pueden dar lugar a falsos positivos.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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FIGURA 17-10. Cuerpos de Heinz espontáneos en un caso de hemoglobinopatía inestable. Obsérvese su aspecto único y de localización excéntrica (ACB X 1.000).

Prueba de la formación de cuerpos de Heinz espontáneos Ciertas hemoglobinopatías inestables en presencia de azul de cresilo brillante (ACB) precipitan y originan cuerpos de inclusión intraeritrocitarios, o cuerpos de Heinz. Estos pueden adoptar dos morfologías bien distintas: 1. La presencia de un único cuerpo de inclusión adherido a la membrana eritrocitaria (cuerpo de Heinz), que aparece en la mayoría de las hemoglobinas inestables des­ pués de la esplenectomía (Hb Kóln, Hb Zurich, H b Hammersmith) (fig. 17-10). 2. La presencia de inclusiones múltiples redondas y pequeñas, azules verdosas y distribuidas por la totalidad del citoplasma eritrocitario, que aparecen de forma casi exclusiva en la a-talasemia (HbH) (v. fig. 17-6).

Método La técnica empleada para poner de manifiesto estos cuerpos de inclusión es la misma que se emplea en la tinción de reticulocitos. A un volumen de sangre total se añade un volumen de una solución de ACB en solución salina citratada (10 g/1). Después de una incubación de 5 m in a 37 °C se practica una extensión de la suspensión de eritrocitos y se deja secar. No hace falta contratinción para observar esta preparación al microscopio óptico.

Detección y cuantificación de la hem oglobina M (HbM) Introducción Las hem oglobinas M son resultado de mutaciones de la cadena de globina que es­ tabilizan el hierro (Fe) de dos grupos hemo en su forma férrica u oxidada. Esto hace que de cada molécula de hem oglobina M solo la m itad pueda tran sp o rtar oxígeno (metahemoglobina), hecho por el cual existe un déficit de oxigenación de los tejidos periféricos con cianosis o coloración violácea de piel y mucosas. La hemoglobina M se hereda con carácter autosómico dominante y la única manifestación clínica es la cianosis permanente. Esta cianosis, a diferencia de la secundaria a un déficit de metahemoglobina reductasa (diaforasa), no desaparece con la administración de ácido ascórbico (vitamina C) o azul de metileno. Se conocen varios tipos de hemoglobinas M que pueden ser diferenciados de la metahemoglobina normal (HiA) mediante métodos espectroscópicos (debido al espectro de absorción visible característico de las hemoglobinas M; fig. 17-11) y electroforéticos.

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FIGURA 17-11. Espectro de absorción de una hemoglobinopatía M (línea discontinua) frente a patrón normal de metahemoglobina (línea continua) (absorbancia 450-650 |xm).

Fraccionamiento electroforético de las hemoglobinas M Debido a que en la mayoría de casos la mutación de la cadena globínica neutraliza la carga positiva creada por la oxidación del hierro, las hemoglobinas M presentan una movilidad electroforética idéntica a la de la HbA. Por ello, para poder evidenciar su presencia hay que transform ar previamente la HbA en metahemoglobina, que presenta una mayor carga positiva. Esto se consigue añadiendo ferricianuro potásico (15 mg/1) al hemolizado (normal y patológico) y se procede a realizar una electroforesis convencional (pH 8,9) sobre acetato de celulosa. La migración simultánea del hemolizado normal (con toda la HbA transformada en HiA) y el hemolizado patológico, permitirá apreciar, en caso de hemoglobina M, una fracción de migración más lenta que la HbA.

Escrutinio de la anem ia falciform e (HbS) Prueba de la reducción de HbS A diferencia de la HbA, en presencia de un agente reductor, la HbS gelifica y se vuelve insoluble. Por ello, esta prueba es prácticamente específica de esta hemoglobinopatía.

Reactivos 1. 2. 3. 4. 5.

Sulfato amónico ([NH 4]2S 0 4). Fosfato dipotásico (K2H P 0 4 3H20 ). Saponina. Ditionito sódico (Na2S20 4). Hidróxido potásico (KOH).

Preparación del tampón pH 7,5 • En un vaso de precipitados de 100 mi se disuelven 30 g de sulfato am ónico en 80-90 m i de agua destilada. • Se añaden 1,2 g de fosfato dipotásico, calentando m oderadam ente para disolver a continuación 1 g de saponina. Debe agitarse lentam ente la mezcla, ya que la

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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saponina en solución form a espum a con rapidez. La agitación debe m antenerse hasta que la disolución se complete. • Finalmente, el volumen se ajusta a 100 mi mediante un m atraz aforado, y el pH a 7,5 con solución de KOH 1 N. El tam pón así preparado es estable en frasco oscuro durante meses. M étodo 1. En dos tubos de 5 mi (paciente y control) se colocan: (a) Tampón a pH 7,5,2 mi. (b) Ditionito sódico, 20 mg. 2. La mezcla se agita y se añaden 0,1 mi de sangre total o 0,5 |xl de eritrocitos lavados. La solución se ajusta dejándola en reposo durante 5-10 min y, finalmente, se cen­ trifuga durante 2 m in a 3.000 r.p.m. Interpretación del resultado Se pueden presentar tres situaciones: 1. Presencia de un sobrenadante rojo con precipitado blanquecino en el fondo: solubilidad normal. 2. Presencia de un sobrenadante rosado con precipitado hemoglobínico: solu­ bilidad parcialm ente dism inuida que indica un p ortador heterocigoto HbA/ HbS. 3. Presencia de un sobrenadante pálido con precipitado rojo: insolubilidad total, indicativa de un paciente con hemoglobinopatía S homocigoto (fig. 17-12).

II

FIGURA 17-12. Aspecto de la prueba de la solubilidad de la hemoglobina en un paciente con drepanocitosis (HbSS). En el tubo de la izquierda existe insolubilidad total de la hemoglobina. El tubo de la derecha corresponde a un control normal.

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Prueba de la falciformación (Prueba deltano) Principio Consiste en provocar la falciformación de los eritrocitos a partir de sangre total, cuando esta es expuesta a un medio pobre en oxígeno. Como es sabido, la HbS, cuando se halla en estado desoxigenado, presenta unas características de solubilidad distintas a las de la HbA, consistentes en una im portante pérdida de la misma y la tendencia a formar polímeros de desoxi-HbS, que deforman intensamente el eritrocito (falciformación). Como consecuencia de ello, los eritrocitos adquieren una forma alargada e incurvada que recuerda a una hoz (sickle-cell). Este fenómeno se observa en los portadores del rasgo falciforme (Hb A/S) y en los afectos de drepanocitosis o enfermedad de células falciformes (Hb S/S, Hb S/C y H b S/0-tal).

Método Después de practicar una dilución de sangre en NaCl 0,15 mol/1 al 50%, se coloca una gota sobre un portaobjetos y se tapa con un cubreobjetos, cuyos bordes son pos­ teriormente sellados con parafina líquida. Esta preparación se observa al microscopio antes y después de incubarla 1 h (como mínimo) a 37 °C.

Interpretación del resultado En caso de HbS hom ocigota (HbSS), la falciformación es inmediata (sin necesidad de incubación) y consiste en la aparición de num erosos drepanocitos o eritrocitos falciformes (fig. 17-13). En caso de HbS heterocigota (HbAS), solo aparecerán algunos drepanocitos después de la incubación.

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ESPECIAI.F.S Los m étodos diagnósticos de las hem oglobinopatías d enom inados «especiales» son tod o s aquellos que, fu era de los clásicam ente em pleados y d escritos en el apartado anterior, profundizan en los aspectos proteicos, moleculares y genéticos de la hem oglobina para conseguir un diagnóstico preciso de la m utación o m uta­ ciones im plicadas en cada caso. Esto resulta actualm ente im prescindible porque el im pacto inm igratorio observado en u n elevado núm ero de países de la U nión

FIGU RA 17-13. Prueba de la falciformación en un portador de anemia drepanocítica. Obsérvese la presencia de numerosos drepanocitos (hematíes falciformes) inducidos por la desoxigenación.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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CUADRO 17-2. Métodos diagnósticos de las hemoglobinopatías 1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 2. Electroforesis capilar (EC-Capillarys) 3. Electroforesis ácida/alcalina 4. Síntesis de cadenas de globina 5. Técnicas de biología molecular (a) (b) (c) (d) (e) (f)

A R M S-PCR (escrutinio de m utaciones HbS, H bC , H b D y HbE) Secuenciación del gen ^-globina (hem oglobinopatías estructurales y (3-tal) Secuenciación del gen a-globina (hem oglobinopatías estructurales y a -ta l) GA P-PCR (escrutinio de m utaciones a-talasem ia) STR IP ASSAY K IT (escrutinio de m utaciones fJ-talasemia) GA P-PCR y secuenciación (escrutinio y análisis genético de la hem oglobina Lepore) (g) GA P-PCR (escrutinio de la persistencia hereditaria de la hem oglobina fetal [PH H F]) (h) GA P-PCR (escrutinio de la 8(3-talasemia)

Europea (especialmente p or poblaciones africanas, asiáticas y de América central o del sur) ha condicionado un cam bio en el com portam iento clínico de m uchas hem oglobinopatías, especialmente de sus formas más graves (síndrom e falciforme y talasem ia m ayor) que ha obligado al la im plem entación del m ayor núm ero de procedim ientos para po d er identificar las causas m oleculares de la variabilidad clínica. Estas técnicas diagnósticas especiales (cuadro 17-2) son las que se utilizan para confirm ar las alteraciones detectadas mediante las pruebas generales aplicadas al diagnóstico clínico, o las que se utilizan en el escrutinio neonatal de hem oglobi­ nopatías (prueba del talón).

Crom atografía líquida de alta resolución (HPLC) Introducción Los métodos convencionales para el estudio de hemoglobinas basados en procedimientos electroforéticos y cromatográficos han sido y continúan siendo de utilidad para el es­ crutinio de hemoglobinopatías y talasemias en áreas geográficas donde estas causas de anemia presentan cierto grado de prevalencia. La región m editerránea es una de las áreas donde este tipo de estudios epidemiológicos revisten interés sanitario y social. Por ello, la posibilidad de automatizar la determinación de las hemoglobinas HbA2 y HbF, así como la posibilidad del escrutinio, también automatizado, de hemoglobinopatías es prácticamente una necesidad en todos aquellos centros que realizan estudios sistemáticos de estas enfermedades congénitas. A principios de los años ochenta se introdujo la cromatografía líquida de alta resolu­ ción (HPLC) para la separación y cuantificación automatizada de las fracciones hemoglobínicas normales (HbA, HbA2y HbF), así como de posibles hemoglobinopatías (HbS, HbC, HbD, etc.) y de derivados glicados de la hemoglobina (HbAt, principalmente), de utilidad clínica en el seguimiento terapéutico de la diabetes mellitus. Actualmente, existe un equipo especialmente diseñado para el análisis de muestras de sangre de adulto y de recién nacido impregnada en papel y que permite la detección de talasemias (HbA2 y HbF) y hemoglobinopatías estructurales de manera estandarizada, rápida y precisa (Variant Hemoglobin Testing System® de Bio-Rad).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

La base del procedimiento empleado es una columna de intercambio catiónico con gradientes preprogram ados que van increm entando la fuerza iónica del tam pón de elución, siendo las hemoglobinas más fuertem ente unidas a la colum na las últimas en eluir. La elución de la colum na es m onitorizada m ediante un espectofotóm etro que detecta cambios en la absorbancia a dos longitudes de onda 415/690 nm. La re­ presentación de estos cambios en relación al tiem po genera un crom atogram a para cada una de las m uestras problem a. Cada variante de hem oglobina tiene asociado un tiem po de retención; este tiem po de retención se m ide desde el m om ento en que la m uestra es inyectada hasta el máximo punto de cada pico representado en el cromatograma. Dispone de dos programas básicos para la detección de: 1. Talasemia en adultos: 0-thalassemia Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA). 2. Cribado neonatal de la enfermedad de células falciformes a partir de sangre seca: Sickle Cell Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA). Ambos program as perm iten la separación e identificación de las hemoglobinas norm ales (HbA, HbF y H bA 2), así como las hem oglobinopatías estructurales más comunes (HbS, HbC, HbD y HbE). El programa para la identificación de talasemias, además, permite la cuantificación de HbA2y HbF mediante una cromatografía de 6 min. Aunque con la fracción HbA2 existe coelución de la hemoglobinopatía E (HbE), ello carece de importancia en la práctica, ya que valores de HbA2de alrededor del 30% deben hacer sospechar la existencia de HbE o alguna otra hemoglobina anormal y proceder a la correspondiente investigación. El program a de cribado de la anemia falciforme, m ediante una cromatografía de 3 m in de duración, tiene como objetivo la identificación y cuantificación relativa de la HbS y permite la identificación de la enfermedad de células falciformes, tanto en estado homocigoto de la HbS como en estado doble compuesto heterocigoto con otras hem o­ globinopatías estructurales y talasémicas. Además, también permite la identificación del carácter portador de la HbS y otras hemoglobinopatías estructurales presentes en la población.

Procedimiento para la detección de talasemia en adultos Muestra Sangre total con EDTA como anticoagulante. Las muestras son estables durante 7 días si se mantienen a 2-8 °C.

Material • Columnas cromatográficas. • Viales de 1,5 mi. • Punta Azul Daslab®.

Reactivos Programa 0-thalassemia Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA): 1. Tampón de elución 1. 2. Tampón de elución 2. 3. Solución de lavado. 4. Cebador sangre total. 5. Reactivo de hemólisis. 6. Calibrador HbA2/F y diluyente.

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Capítulo 17

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Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

Equipos • Pipeta automática regulable de 0-20 |xl MicroOne®. • Pipeta automática regulable de 100-1.000 |xl MicroOne®. • Bio-Rad VARIANT Hemoglobin Testing System.

Preparación de reactivos Cebador de sangre Preparar el cebador añadiendo 1 mi de H20 destilada, agitar ligeramente y dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente. El cebador, una vez reconstituido, es estable durante 24 h a una temperatura de 2-8 °C.

Calibrador HbAJF Preparar el calibrador añadiendo 10 mi de diluyente, agitar ligeramente y dejar reposar durante 10 m in a temperatura ambiente. El calibrador, una vez reconstituido, es estable durante 7 días a una temperatura de 2-8 °C.

Preparación de la muestra 1. Pipetear 5 |xl de sangre total en un vial de 1,5 mi. 2. Añadir 1 mi de reactivo de lisis en cada vial. 3. Homogeneizar por inversión.

Procesado de las muestras 1. Colocar las muestras en la bandeja del Bio-Rad. VARIANT Hemoglobin Testing System. 2. El cebador de sangre total debe usarse al principio de cada montaje para acondi­ cionar la columna para el análisis. 3. El calibrador deberá procesarse de m anera paralela a cada grupo de muestras problema. 4. Programar el equipo con la lista de trabajo.

Interpretación del resultado El programa para la detección de 0-talasemia permite separar y determinar los porcen­ tajes de las áreas para la hemoglobina A2 y la hemoglobina F. Este programa también permite la identificación de las variantes de la hemoglobina más comunes (hemoglobinas S, D, C y E; v. fig. 17-5). El área total de cada análisis debería estar entre 1.000.000 y 3.000.000 (xvolt por segundo. La interpretación de los resultados según los valores de HbA 2 y HbF se representa en la tabla 17-5.

TABLA 17-5. Interpretación de los resultados según los valores de HbA2/F Genotipo

Nivel HbA2

Nivel HbF

(3-talasemia heterocigota (3-talasemia homocigota 8(3°-talasemia heterocigota 8 (3o-talasemia homocigota HPFH heterocigota HPFH homocigota

3,8-9% Normal o elevada 2,3-3,2% 0,65-0,92% 1 y en el de una a-talasemia, por el contrario, < 1.

D iagnóstico m olecular de las hem oglobinopatías Extracción de ADN Material • • • • • • • • • • • •

Sangre total con EDTA. Tubos Falcon de 50 mi. Eppendorf de 1,5 mi. Pipetas Pasteur. Pipetas de 5 y 10 mi. Baño de agua. Centrífuga. Espectrofotómetro. Cubetas de cuarzo. Agitador. Baño seco. Microcentrífuga. Nota: Utilizar todo el material estéril.

Reactivos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Tampón BLB. Cloroformo. H20 bidestilada estéril. CTAB al 5%. NaCl 1,2 M. Etanol absoluto. Etanol al 70%.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

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Soluciones amortiguadoras 1. CTAB 5% (a) CTAB, 2,5 g. (b) NaCl 5 M, 4 mi. (c) H20 bidestilada, c.s.p. 50 mi. (d) Filtrar y guardar a 4 °C. 2. Tampón BLB (a) DTAB, 8g. (b) NaCl 5 M, 30 mi. (c) Tris-HCl 1 M, 10 mi. (d) H20 bidestilada, c.s.p. 100 mi. (e) Filtrar.

Método Lisis y desnaturalización 1. 2. 3. 4.

En un tubo Falcon de 50 mi introducir la sangre total con EDTA (de 1 a 2,5 mi). Añadir 2 mi de tampón BLB por mi de sangre y mezclar suavemente. Incubar en el baño a 68 °C durante 5 min. Añadir 3 mi de cloroformo por mililitro de sangre, mezclar suavemente y cen­ trifugar a 3.000 r.p.m. durante 15 min. Traspasar la fase superior a otro tubo Falcon y desechar las dos fases restantes.

Precipitación y resuspensión del ADN 1. Añadir 3 mi de H20 bidestilada estéril por mililitro de sangre y mezclar suavemente. 2. Agregar 0,35 mi de tampón CTAB 5% por mililitro de sangre, agitar suavemente hasta que aparezca el ADN. 3. Centrifugar 5 m in a 3.000 r.p.m., decantar el sobrenadante y dejar secar boca abajo sobre un papel de filtro para eliminar todo el líquido restante. 4. Añadir 1 mi de NaCl 1,2 M por mililitro de sangre y dejar el tubo en agitación hasta que se haya disuelto completamente el ADN (mínimo 30 min). 5. Agregar 2,5 mi de etanol absoluto por mi de sangre, agitar suavemente hasta que aparezca otra vez el ADN. Preparar un tubo Eppendorf con 1 mi de etanol al 70%. 6. Coger el ADN con una varilla de vidrio y pasarlo al tubo Eppendorf. 7. Centrifugar a 14.000 r.p.m. durante 10 min. 8. Extraer el sobrenadante y dejar secar el ADN a 37 °C, mínimo 1 h. 9. A continuación resuspender en 100 (jlI de H 20 bidestilada. Se puede incubar a temperatura ambiente toda la noche para una mejor resuspensión.

Cálculo de la concentración de ADN 1. Preparación de blanco y muestras: (a) Blanco: 400 |xl H20 bidestilada. (b) Muestras: 395 |xl H20 bidestilada + 5 |xl ADN. 2. Medir la concentración en el espectrofotómetro a 260 nm en cubeta de cuarzo. 3. Cálculo del resultado: DO x 50x 80 = DO260x 4 = [ADN] |Xg/jil

1.000

1 unidad de DO260 = 50 |JLg/ml Factor de dilución de la m uestra = 1/80. Con este método de extracción se obtienen valores de concentración de 0,5 a 1 (ig/(xl.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Análisis genético de la mutación /3s CD6 GAG > GTG responsable de la hemoglobinopatía S (HbS) Introducción Para la confirmación de la hemoglobinopatía S (HbS) se utiliza el sistema ARMS (Am­ plification Refractory M utation System). Este sistema se basa en la amplificación de manera específica del alelo normal y del alelo mutado. Para ello se diseñan dos cebadores que presentan el nucleótido portador de la mutación que se quiere estudiar en el extremo 3’. Uno de los cebadores es com plem entario al alelo norm al y el otro al alelo mutado. Además, en ambos cebadores se introduce una mutación en posición 3 desde el extremo 3’. De esta manera, la reacción será alelo-específica. Como control interno se amplifica una región del gen de la 0-globina de 890 bp con los siguientes cebadores: Nombre

Secuencia

CIF CIR

5’ GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA 3’ 5’ CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC 3’

Los cebadores utilizados para la detección del alelo norm al y el alelo portador de la mutación (3Sson los siguientes: Nombre

Secuencia

HbSC HbSN HbSM

5’ ACCTCACCCTGTGGAGCCAC3’ 5’ CACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGCT 3’ 5’AGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGC 3’

Se llevan a cabo dos reacciones de PCR, una con el cebador com ún (HbSC) y el cebador específico para el alelo normal (HbSN), y otra con el cebador común (HbSC) y el cebador específico para el alelo mutado (HbSM).

Mezcla de reacción Las reacciones de PCR se llevan a cabo en un volumen final de 2 5 (jlI, consistente en 10 -15 |xl de la extracción de ADN, 0,6 5 prnol/jil de cada uno de los cebadores alelo-específicos para la mutación (3\ 1,12 prnol/jil de cada uno de los cebadores CIF y CIR, Ecotaq® tampón 10% (Ecogen, Barcelona), 1,5 mM de MgCl, 0,2 5 mM de dNTP y 2,5 U de Ecotaq® (Ecogen, Barcelona).

Condiciones de amplificación • Desnaturalización inicial: 5 m in a 93 °C. • Programa 35 ciclos: • Desnaturalización: 93 °C durante 48 s. • Hibridación: 61 °C durante 48 s. • Elongación: 72 °C durante 60 s. • Elongación final 72 °C durante 10 min. Separación y visualización de los productos de PCR mediante un gel de agarosa 1,2%. Interpretación de los resultados:

Reacción C.1.890 bp (3 o ps 200 bp

Resultado 1

Resultado 2

N — —

N — —

M —

Resultado 3 M — —

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N —

M _ —

Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

489

El resultado 1 corresponde al genotipo homocigoto para el alelo normal (0/0). El resultado 2 corresponde al genotipo heterocigoto para el alelo p ortador de la mutación ( 0 / 0 s). El resultado 3 corresponde al genotipo hom ocigoto para el alelo p ortador de la mutación ( 0 S/ 0 S).

Diagnóstico molecular de la (3-talasemia Introducción Debido a la elevada heterogeneidad genética asociada a la 0-talasemia, la técnica de elección para su caracterización genética es la secuenciación del gen de la 0 -globina: región promotora, exónica e intrónica flanqueante, ya que es la única que nos permite detectar el 1 0 0 % de las m utaciones independientem ente del origen geográfico del paciente. Esto es básico para poder realizar un adecuado consejo genético y diagnóstico prenatal, si procede. Se lleva a cabo la secuenciación del gen de la 0-globina desde la posición -384 hasta el nucleótido 42 del segundo intrón (IVS2:42), y desde el nucleótido 776 del segundo intrón (IVS2:776) hasta 194 bp después del codón de terminación.

Cebadores Gen F P-globina

R

Promotor Exón 1 Exón 2 Exón 3

5’ CCAGGGCCTCACCACCAACT 3’ 5’ GTCTCCACATGCCCAGTTTCTAT 3’ 5’ AAGAAGGGGAAAGAAAACATCAAG 3’ 5’ TGCACTGACCTCCCACAT 3’

5’ GCTGAATTATGGTAGACAAAACTC 3’ 5’ CATCTATTGCTTACATTTGCTTCT 3’ 5’ CTCTTGGGTTCTGATAGGCACTG 3’ 5’ AAGGCTGGATTATTCTGA 3’

Mezcla de reacción La mezcla de reacción para cada exón se realiza en un volumen final de 25 (jlI usando 2 unidades de Taq polimerasa, Ecotaq® (Ecogen, Barcelona), 2,5 |xl de tam pón 10X comercial (Ecogen, Barcelona), 0,64 pmol/|xl de cada cebador, 0,2 mmol/1 de cada nu­ cleótido y 1,5 mmol/1 de Cl2Mg. A la mezcla de reacción se le añade 1 (jlI de la extracción de ADN (500 ng/|xl).

Condiciones de amplificación • Desnaturalización inicial: 10 m in a 93 °C. • Programa 35 ciclos: • Desnaturalización: 93 °C durante 48 s. • Hibridación: 56 °C durante 48 s. • Elongación 72 °C durante 60 s. • Elongación final: 72 °C durante 10 min. El producto de amplificación se visuaüza en un gel de agarosa al 1,2%. Región p-globina

Tamaño fragmento

Promotor Exón 1 Exón 2 Exón 3

568 bp 215 bp 324 bp 397 bp

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490

Orden de frecuencia de mutaciones 2

3 4 5 6

7 8

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Tipo de mutación

Consecuencia de la mutación

CD39 (C-T) IVS1:110 (G-A) IVS1:6 (T-C) IVS1:1 (G-A) IVS2: 745 (C-G) IVS2:1 (G-A) -87 (C-G) CD6-A

ARNm no funcional Procesamiento de ARNm Procesamiento de ARNm Procesamiento de ARNm Procesamiento de ARNm Procesamiento de ARNm Transcripción ARNm no funcional

El volumen total de producto amplificado es purificado con QIAquick® PCR Purifi­ cation Kit (QUIAGEN) mediante un sistema de purificación por columna de la banda obtenida. Una vez purificados los productos de amplificación, se lleva a cabo la reacción de secuenciación. Para ello se utiliza un secuenciador automático ABI Prism® 3130 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster city CA, USA) y el kit comercial BigDye Terminator v3.1. Una vez finalizada la PCR de secuenciación, se realiza la eliminación de los term inadores sobrantes m ediante colum na AutoSeq™ G-50 Dye Term inator Removal Kit (GE Healthcare, UK). En la tabla 17-8 se representan las mutaciones más frecuentemente encontradas en el área mediterránea.

Diagnóstico molecular de la (f38)°-talasemia La 80-talasem ia consiste en una dism inución o desaparición de la síntesis de cade­ nas 8 y 0. Se divide en 8 0 +- y 8 0 o-talasemia, según el grado de síntesis de las cadenas 8 y 0 por parte del crom osom a afectado. La 8 0 -talasem ia obedece norm alm ente a largas dilecciones que im plican al clúster 0 -globina y elim inan los dos genes 8 y 0, dejando intacto uno o los dos genes 7 . Esta form a de talasem ia se caracteriza por el aum ento, a veces exclusivo, de la HbF, que en las form as heterocigotas oscila entre un 7 y 15% y en las hom ocigotas se halla cercana al 100%. D ebido a ello se la conoce tam bién con el nom bre de talasemia F y en España obedece prácticamente siempre a un m ismo tipo de deleción que se conoce con el nom bre de 80°-talasemia spanish.

Material • Tampón 80Tal 10X: KC1, 500 mM; Tris HC1, 100 mM; pH 8,3; Cl2Mg, 15 mM; albúmina 1 0 0 jxg/ml. • dNTP 2 mM. • Taq polimerasa, 5 U / (ii. • ADN, 5 |xg/|xl. • Primers Nj, N 2 y 80del a 10 pmol/ jjl I : • N j: 5’ATG GGT ATT TCA CTT GTT AT 3’ • N 2 : 5’ACT TTG TCT GTT AAT TCC AA 3’ • 80del 5’ACT GTG GGA GCC CCT TTC TG3’ - Nj-N 2 amplifica el gen normal. - Nj-SfSdel amplifica el gen que contiene la mutación.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

49 1

TABLA 17-9. Preparación de la mezcla de reacción de la PCR de 80-talasemia N.° muestras

Vol (|xl) XI 36,75 5 5 0,25 1 1 1

H 20

TPO 10X dNTP 2 mM Taq-polimerasa N, N2

Spdel

Preparación de la mezcla de reacción de la PCR (Master-Mix) (tabla 17-9) Añadir a la mezcla de reacción (Master Mix) 1 (xl de ADN del paciente.

Condiciones de la PCR • Primera desnaturalización: 94 °C durante 7 min. • 30 ciclos con el siguiente programa: • Desnaturalización: 94 °C durante 1 min. • Hibridación: 55 °C durante 1 min. • Elongación: 72 °C durante 1 min. • Última elongación: 72 °C durante 7 min.

Electroforesis en gel de agarosa al 2% Migración de las muestras amplificadas con un marcador de peso molecular. Fragmentos: • N j-N2, 685bp (gen normal). • Nj-Spdel 299 bp (gen con la mutación).

Diagnóstico molecular de a-talasemia La a-talasemia constituye la alteración genética más frecuente en la población mundial y está ampliamente extendida en los países mediterráneos. La patología molecular de la a-talasem ia está determ inada p or u na serie heterogénea de deleciones de diversa extensión que: • En el caso de la a°-talasemia implican todo el complejo de genes a-globina, o la región que controla su expresión. • La a +-talasemia es el resultado de deleciones de menor tamaño que eliminan uno de los dos genes a-globina o de mutaciones puntuales (a-talasemia no delecional) que, a pesar de dejar los genes intactos, pueden causar su inactivación parcial o completa. La forma más frecuente de a-talasemia es la que se asocia a anemias microcíticas e hipocromas no ferropénicas sin expresividad electroforética (microcitosis familiares atípicas) y las más graves son la H bH y la hidropesía fetal, que vienen determinadas por la presencia de H bH y Hb Bart respectivamente.

Detección de las deleciones 3,7 kb y 4,2 kb Material • ADN genómico 0,5 (xg/|xl. • Taq polimerasa 2,5 U/|xl.

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492

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• T am pón u n iv ersal 10X: (N H 4) 2 S 0 4, 166 m M ; T ris-H C l 670 mM con pH 8,8; Na2EDTA, 670 |xM; BSA, 160 |xg/ml; 0-m ercaptoetanol, 100 mM ; M gCl2, 25 mM. • dNTP 2 mM. • Mezcla de oligonucleótidos o cebadores (C 10/C3y C 10/C 9c) a una concentración final de 25 pmol/|xl. Secuencia de los cebadores: • C 10: 5’ GAT GCA CCC ACT GGA CTC CT 3’ • C3: 5’ CCA TTG TTG GCA CAT TCC GG 3’ • C9C: 5’ CCA TGC CTG GCA CGT TTG CTG AGG 3’ C 10amplifica el extremo 5’ tanto para el gen como para a 2. C 10 + C3amplifican la zona a 2 en la que se ha producido el entrecruzamiento. C 10 + C2 amplifican la zona correspondiente al gen a r

Método 1. Preparar dos reacciones de PCR en dos tubos E p p en d o rf con u n volum en final de 50 |xl cada uno. Estos volúmenes corresponden a u n a sola m uestra (tabla 17-10). 2. Añadir 1 |xl de ADN 0,5 |xg/|xl en cada tubo. 3. Condiciones de PCR: (a) Primera desnaturalización: -9 4 °C durante 10 min. (b) 30 ciclos con el siguiente programa: (i) Desnaturalización: -9 4 °C, 45 s. (ii) Hibridación: -5 6 °C durante 1 min. (iii) Extensión: -7 2 °C durante 1 min. (c) Última elongación: -7 2 °C durante 10 min. 4. Migrar el producto de la PCR en un gel de agarosa al 1,2%. 5. Visualización del resultado de la amplificación.

Interpretación de los resultados La utilización de las dos reacciones paralelas de PCR por cada m uestra (tabla 17-11) permite diferenciar: • La condición de homocigoto y heterocigoto de la deleción de 3,7 kb. • La triplicación del gen a. • La condición de doble heterocigoto 3,7 kb y 4,2 kb. • La condición de homocigoto de la deleción 4,2.

TABLA 17-10. Preparación de la mezcla de la reacción de la PCR en la a-talasemia Tubo 1 (jjlI) Agua bidestilada estéril Tampón universal 10 X dNTP 2 mM DMSO al 10% Taq-polimerasa C10 25 pm/p,l C3 25 pm/|xl 25 pm/|xl

32,5 5 5 5 0,5 1 1 —

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Tubo 2 (|xl) 32,5 5 5 5 0,5 1 — 1

Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

493

TABLA 17-11. Reacciones paralelas de PCR para los diferentes tipos de a-talasem ia C,o-C3 fragmento (kb)

CI0-C9Cfragmento (kb)

1,9 1,9

2,1 1 ,9/2,1

a a a ” ti3’7/ a a

1,9/2,1

2,1

a a a anti3’7/-a 3,7

1,9/2,1

1 ,9/2,1

o ta/aa -a 3'7/ a a -a 3’7/-a 3’7

1,9

-a 4,2/-a 4,2

2,1

-a 3,7/-a 4,2

1 ,9/2,1

a a a anti4’2/-a 3,7

1,9

1,9

Patrón normal Heterocigoto para la deleción de 3,7 kb Homocigoto para la deleción de 3,7 kb Heterocigoto para el triple gen a Doble heterocigoto para el triple gen a y la deleción de 3,7 kb Homocigoto para la deleción 4,2 Doble heterocigoto para las deleciones 3,7 y 4,2 Doble heterocigoto triple a anü4,2/deledón 3,7

Detección de las deleciones__ MED,__ SEA y _ a 20,5

Secuencia de los cebadores 1. D eleción__ MED (a) 5’MED: 5’ACA GTC ACT CCT GAG GCC AGT C 3’ (b) 5’MED N: 5’TAC AGC AGA GTG AGT GCT GCA T 3’ (c) 3’ MED: 5’GGA GAA GTA GGT CTT CGT GGC 3’ 2. D eleción__ SEA (a) 5'SEA: 5’CTC TGT GTT CTC AGT ATT GGA G 3’ (b) 3'SEA N: 5’TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGT CA 3’ (c) 3'SEA: 5’ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TC 3’ 3. Deleción _ a 20>5 (a) 5’- a 20,5: 5’ GGC AAG CTG GTG GTG TTA CAC A 3’ (b) 5’ TGG AGG GTG GAG ACG TCC TG 3’ (c) 3’a,: 5’ CCA TGC TGG CAC GTT TCT GAG G 3’

Método Las deleciones__ M ED ,__ SEA, y __ a 20,5 pertenecen a un grupo de deleciones de 1830 kb. Para detectar la presencia de una de estas deleciones se realizan dos reacciones de PCR. Una contiene un par de cebadores designados para detectar la deleción, y la otra un par para detectar la secuencia normal (tablas 17-12 a 17-14). 1. Preparar las siguientes reacciones de PCR en dos tubos Eppendorf con un volumen final de 50 jjlI cada uno. 2. Añadir 1 |xl de ADN de concentración de 0,5 |xg/(jlI en cada tubo. 3. Condiciones de PCR: (a) Desnaturalización inicial: 94 °C, 10 min. (b) 30 ciclos con el siguiente programa:

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494

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 17-12. Detección de la deleción__ MED Tubo 1 (|xl) Agua bidestilada estéril Tampón universal 10X dNTP 2 mM DMSO Taq-polimerasa 5’-MED 25 pm/(xl 3’-MED 25 pm/pd 5’-MED N 25 pm/|xl

32,5 5 5 5 0,5 1 1 —

Tubo 2 (jxl) 32,5 5 5 5 0,5 — 1 1

TABLA 17-13. Detección de la deleción _ _SEA Tubo 1 (|xl) Agua bidestilada estéril Tampón universal 10 X dNTP 2 mM DMSO Taq-polimerasa 5’-SEA 25 pm/|xl 3’-SEA 25 pm/|xl 5’-SEA N 25 pm/|xl

32,5 5 5 5 0,5 1 1

—

Tubo 2 (jil) 32,5 5 5 5 0,5 — 1 1

TABLA 17-14. Detección de la deleción _ _ a 20-5 Tubo 1 (|xl) Agua bidestilada estéril Tampón universal 10 X dNTP 2 mM DMSO Taq-polimerasa 5’-(a 20,5) 25 pm/(xl 3’-a, 25 pm/|xl C, 25 pm/|xl

32,5 5 5 5 0,5 1 1 —

Tubo 2 (|jJ) 32,5 5 5 5 0,5 — 1 1

(i) Desnaturalización: 94 °C durante 45 s. (ii) Hibridación: 56 °C durante 1 min. (iii) Extensión: 72 °C durante 1 min. (c) Extensión final: 72 °C durante 10 min.

Interpretación de los resultados La interpretación de los resultados para las deleciones MED, SEA y a 20,5 se resume en la tabla 17-15.

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Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

495

I TABLA 17-15. Interpretación de los resultados para las deleciones de a-talasemia MED,

SEAy5’-a20-5- 3-aj

a a /a a a a / - MED

5’MED - 3’MED fragmento mutado (kb)

5’MED N - 3’MED fragmento normal (kb)

___

1 1 —

_MED _MED

0,65 0,65 5’SEA - 3’SEA fragm ento m utado (kb)

a a /a a

—

a a / —SEA

0,66 0,66 5’- a 20'5- 3 - a 1fragm ento m utado (kb) — 1,18 1,18

j

_SEAj _SEA

a a /a a a a / — a 20'5 —a 20,5/ — a 20,5

5’SEA - 3’SEA N fragm ento norm al (kb) 0,98 0,98

— 0 ,-3 - a , fragm ento norm al (kb) 1,07 1,07

—

LECTURAS RECO M ENDADAS Bain B, Bates I, Laffan M, Lewis M editors. Dacie and Lewis Practical Haematology. 11.a ed. Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier; 2012. Betke K, M arti HR, Scilicet I. Estimation o f small percentages o f fetal hemoglobin. Nature 1959;184:1877-8. Carrell RW, Kay R. A simple m ethod for the detection o f unstable haemoglobins. Br J Haematol 1972;23:615. Clegg JB. Haemoglobin Synthesis. En: Wheatherall DJ editor. M ethods in Haematology. Edinburgh: Churchill Livingstone; 1983. p. 54-73. Efremov GD, Huisman THJ. The laboratory diagnosis o f the haemoglobinopathies. Clin Haematol 1974;3:542. Huitsman RG, Barclay GPT, Canning DM, Yawson GL. A rapid whole blood solubility test to differentiate the sickle-cell trait from sickle-cell anemia. J Clin Pathol 1970;23:781. International Committee for Standardization in Haematology. ICSH recommendations for Fetal Hemoglobin Reference Preparations and Fetal Hemoglobin determination by the Alkali Penetration Method. Br J Haematol 1979;42:133-6. International Committee for Standardization in Haematology. ICSH Recommendations for selected m ethods for quantitative estimation o f HbA2 and for HbA^ reference preparation. Br J Haematol 1978;38:573-8. Itano HA, Pauling L. A rapid diagnostic test for sickle cell anemia. Blood 1949;4:66-7. Kleihauer E, Braun H , Betke K. Demonstration von fetalem Hamoglobin in der Erythrocyten eines Blutausstrichs. Klin Wuchenschr 1957;35:635. Mañú M, Martínez A, Sitjá E, Cararach V, Sabriá J, Boixadera J, et al. Cribado neonatal de hemoglobinopatías y déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) en Cataluña. Estudio molecular de la anemia falciforme asociada a a-talasemia y déficit de G6PD. Medicina Clínica 2007;129(5):161-4. Mañú Pereira M, Cabot A, Vives Corrons JL. Molecular heterogeneity o f (3-thalassemia alleles in Spain and its importance in the diagnosis and prevention o f (3-thalassemia major and sickle cell disorders. H emoglobin 2009;33(3-4):226-34. Marengo-Rowe A.Q. Rapid electrophoresis and quantitation o f haemoglobines on cellulose acetate. J Clin Pathol 1969;18:790. Vives Corrons JL, Pujades Beneit MA, Miguel-García A, Miguel-Sosa A, Cambiazzo S. Rapid detection o f Spanish (Sp)°-thalassemia deletion by polymerase chain reaction. Blood 1992;80:1582-5.

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1

Capítulo 17

Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias

4 9 5 .e l

Autoevaluación 1. ¿Qué se conoce con el térm ino de hemoglobinopatía? (a) Una disminución parcial en la síntesis de una cadena globínica. (b) Un cambio estructural en la síntesis de una cadena globínica. (c) Una disminución total en la síntesis de una cadena globínica. (d) Las respuestas a y b son correctas. (e) Ninguna es correcta. Respuesta correcta: d. Respueta razonada: las hemoglobinopatías son alteraciones cualitativas o cuantitativas de la hemoglobina, cuya consecuencia puede ser una modificación estructural de la hemoglobina o una disminución variable de la síntesis de una cadena de globina. 2. ¿Qué se conoce con el térm ino de talasemia? (a) La disminución total en la síntesis de la cadena (3-globina. (b) La disminución total en la síntesis de la cadena a-globina. (c) Una variante estructuralmente anómala de la hemoglobina. (d) La disminución total o parcial de una de las cadenas de globina. (e) Todas son correctas. Respuesta correcta: d. Respuesta razonada: conocemos como talasemia la dism inución parcial o total de una de las cadenas que forman parte de la hemoglobina: cadena a , (3 o 8. 3. ¿Cómo se produce una hemoglobinopatía estructural? (a) Es el resultado de mutaciones genéticas que afectan a la estructura de la hemoglobina. (b) Es consecuencia de m utaciones genéticas que afectan a la capacidad de síntesis de una cadena de globina. (c) Es consecuencia de m utaciones genéticas, generalmente grandes deleciones. (d) Es consecuencia de la exposición a ciertos medicamentos. (e) Las respuestas a y c son correctas. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: las hemoglobinopatías estructurales son el resultado de mutaciones genéticas que afectan a la estructura de una de las cadenas de la globina; generalmente afecta a u n o o pocos aminoácidos. 4. ¿Qué es la hemoglobinopatía S? (a) Un tipo de talasemia de cadena (¡J-globina. (b) Una variante estructural de cadena p-globina. (c) Una variante estructural de cadena a-globina. (d) Una de las hemoglobinas normales en la infancia. (e) Ninguna es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la hem oglobinopatía S es una variante estructural de la hemoglobina, consecuencia de una m utación que afecta al codón 6 de la cadena (3-globina. 5. ¿En qué porcentaje se expresará una hemoglobinopatía estructural en estado heterocigoto debida a una m utación en la cadena a-globina? (a) En un 50%. (b) En un 100%. (c) En un 25%. (d) Entre un 50 y un 100%. (e) Depende de si se hereda de la m adre o del padre. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la cadena a-g lo b in a está sintetizada p o r dos genes, el a2 y el a,. Por consiguiente, una m utación que afecte a un gen a representará u n 25% de cadena m utada c u ando se encuentre en estado hetero cig o to y u n 50% c u an d o se en cu en tre en estado hom ocigoto.

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4 9 5 .e2

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

6. ¿En qué porcentaje se expresará una hemoglobinopatía estructural en estado heterocigoto debida a una m utación en la cadena (¡J-globina? (a) En u n 50%. (b) En u n 100%. (c) En u n 25%. (d) Entre un 50 y un 100%. (e) Depende de si se hereda de la m adre o del padre. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la cadena p-globina está sintetizada por un único gen. Por consiguiente, una m utación que afecte al gen (3-globina representará u n 50% de cadena m utada cuando se encuentre en estado heterocigoto y un 100% cuando se encuentre en estado homocigoto. 7. ¿Qué nos indica una cuantificación de la HbA2 de 5,6%? (a) Presencia de una a-talasemia. (b) Presencia de una ^-talasemia. (c) Presencia de una 8 /(3-talasemia. (d) Presencia de una H b estructural de cadena a. (e) Presencia de una anemia ferropénica. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: los valores de HbA2 superiores al 3,5% nos indican la presencia de una P-talasemia. En la a - y la 8/(3-talasemia, así como en la anemia ferropénica, los valores de HbA2 son siempre normales. 8. ¿Qué nos indica la presencia de H bH en un individuo? (a) Que el individuo padece anemia falciforme. (b) Es un indicador de fJ-talasemia. (c) Que el individuo padece a-talasemia. (d) Que el individuo padece talasemia sin poder diferenciar entre a o (3. (e) Ninguna es correcta. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la presencia de H bH nos indica que el individuo padece una a-talasemia causada por la deleción de tres alelos a-globina. Las cadenas (3-globina que se encuentran en exceso se unen entre sí dando lugar a hom otetrám eros que conocemos como HbH. 9. ¿Cuál es el soporte más empleado para realizar la electroforesis de hemoglobinas? (a) Acetato de celulosa a pH 5,6. (b) Acetato de celulosa a pH 8,6. (c) Poliacrilamida a pH 5,6. (d) Poliacrilamida a pH 8,6. (e) Ninguna es correcta. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: en la práctica diaria, el soporte más empleado es el acetato de celulosa a pH 8,6. El a c e ta to d e c e lu lo sa es el soporte ideal, tanto por su carácter homogéneo y no absorbente como por su elevada resistencia mecánica, que le confiere una fácil manipulación. 10. ¿Qué ventajas confiere la cromatografía líquida de alta resolución sobre la electroforesis convencional? (a) Permite la cuantificación relativa de las fracciones de la hemoglobina. (b) Facilita realizar programas de cribado de hemoglobinopatías. (c) Mayor sensibilidad. (d) Ninguna. (e) Las respuestas a, b y c son correctas. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) perm ite de manera es­ tandarizada, rápida y sencilla la separación y cuantificación automatizada de las fracciones hemoglobínicas normales (HbA, HbA2y HbF), así como la detección de posibles hemoglobinopatías (HbS, HbC, HbD, HbE entre otras).

ERRNVPHGLFRVRUJ

C

A

P

Í

T

U

L

O

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Métodos para el diagnóstico de las membranopatías eritrocitarias M. L. Ribeiro, I. Besson y J. L. Vives Corrons

ESTRUCTURA D E L A M E M B R A N A D E L E R ITR O C IT O El eritrocito es una célula discoide, muy deformable, que circula libremente por la sangre periférica, sobreviviendo a la turbulencia de la microcirculación durante 120 días apro­ ximadamente, hasta que es fagocitado por las células del sistema mononuclear fagocítico (SMF). Su elevada elasticidad y resistencia, que le permiten atravesar territorios capilares de diámetro muy inferior al suyo, dependen de la composición y estructura de una membrana capaz de responder prontamente al estrés y soportar grandes tensiones sin fragmentarse. Esta m embrana, al mismo tiempo, permite mantener el equilibrio iónico y acuoso del eritrocito, protege a la hemoglobina y a otras proteínas celulares de la oxidación y retiene selectivamente a los componentes vitales mientras se libera de los nocivos. El fallo de cualquiera de estas funciones conlleva una disminución de la supervivencia de los eritrocitos en la circulación. La disminución de la vida media eritrocitaria, o hemólisis, puede ser debida a factores extracorpusculares, extrínsecos al propio eritrocito (en general de origen plasmático o vas­ cular), o a factores intracorpusculares que alteran algunos de los componentes estructurales: membrana, hemoglobina o enzimas del metabolismo. A diferencia de los factores ex­ tracorpusculares, la mayoría de los defectos intracorpusculares tienen un origen congénito. En la fisiopatología de las anemias hemolíticas en general, la membrana eritrocitaria tiene gran importancia porque cualquier alteración de los componentes estructurales de los eritrocitos, resultante de factores extrínsecos o intrínsecos, en últim a instancia repercute sobre la membrana, dando lugar a una alteración de la forma y de la capacidad de deformación eritrocitaria. La membrana del eritrocito está compuesta por tres estructuras que interaccionan: una bicapa lipídica (formada esencialmente por fosfolípidos y colesterol no esterificado), las proteínas integrales o transmembrana (que atraviesan la bicapa lipídica) y el citoesqueleto (una red de proteínas que confieren integridad estructural a la célula) (fig. 18-1). Las proteínas de la m embrana eritrocitaria pueden ser identificadas mediante elec­ troforesis en poliacrilamida. Esta técnica permite separar las proteínas según su peso molecular (PM), teñirlas con un colorante de proteínas y cuantificarlas por densitometría. Cada banda en la electroforesis se identifica mediante la asignación de un núm ero de acuerdo a la nomenclatura internacional (fig. 18-2). E s tru c tu ra lip íd ic a La bicapa lipídica de la membrana del eritrocito está compuesta por colesterol y fosfolí­ pidos distribuidos asimétricamente. La fosfatidilcolina y la esfingomielina se concentran en la capa externa, mientras que la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina predominan

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FIGURA 18-1. Esquema de la estructura de la membrana eritrocitaria.

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Espectrina a Espectrína Isoformas anquirina

Proteina 4.1a y b Proteina 4.2/palidina

Banda 5/actina

Banda 6/G3PDH Banda 7/estomatina

Hemoglobina

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FIGURA 18-2. Esquema de las fracciones correspondientes a las proteínas de la membrana eritrocitaria separadas mediante electroforesis (coloración con Azur de Coomassie).

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en la capa interna. Esta asimetría es im portante para m antener las propiedades de la mem brana y resulta de un sistema dinámico de transform ación constante (flip-flop) entre las dos capas. El colesterol se halla en proporciones similares en ambos lados de la bicapa lipídica y se mueve con mucha rapidez entre ellos, lo que evita las diferencias de presión cuando el eritrocito sufre una compresión. Los glucolípidos están concentrados en la capa externa y transportan determinantes antígenos de los grupos sanguíneos, principalmente de los grupos A, B, H, Lea, Leb y P. En condiciones fisiológicas, la bicapa lípídica se encuentra en estado líquido, y permite que las proteínas transmembranosas, los antígenos y otras moléculas que están en la superficie se muevan en el plano de la membrana. En algunas situaciones patológicas se ha demostrado disminución de la fluidez de la m embrana por exceso de colesterol, con formación de acantocitos o spur cells en la terminología anglosajona (abetalipoproteinemiay enfermedades hepatocelulares graves). La incorporación excesiva de lípidos en la bicapa causa un aumento de superficie de la membrana, con formación de células diana (dianocitos o target cells) o codocitos, como acontece en las enfermedades hepáticas obstructivas, en el déficit familiar de lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT), en la hipocromía muy intensa (talasemia y ferropenia) y en la hemoglobinopatía C homocigota. E s tru c tu ra p ro te ic a La capa interna de la membrana del eritrocito está revestida por una red de proteínas que se entrelazan formando un esqueleto flexible, el cual da forma y estabilidad mecánica a la célula. Es una estructura densa que puede distenderse de manera uniforme y adquirir una superficie 7-8 veces mayor que la del eritrocito norm al, perm itiéndole soportar grandes deformaciones sin llegar a fragmentarse. Esta red está formada por largos filamentos de a - y (3-espectrina, asociados en heterodímeros, que, a la vez, se asocian en tetrámeros y forman una red densa en la superficie interna de la bicapa lipídica. La estructura es predominantemente hexagonal, con complejos de interconexión en el centro y en los vértices, formados por seis tetrámeros de espectrina (de media) entrelazados a pequeños filamentos de actina, estabilizada por la tropomodulina. La interacción actina-espectrina está reforzada p or las proteínas 4.1 y aducina. El esqueleto tiene dos lugares de unión a la bicapa lipídica: uno de alta afinidad entre la p-espectrina y la anquirina, con interacción de la proteína banda 3 reforzada por la proteína 4.2, y otro entre la proteína 4.1 (del complejo funcional) y la glucoforina C, con interacción de la proteína p55.

Proteínas integrales Las principales proteínas integrales de la membrana del eritrocito son la banda 3 y las glucoforinas A, B, C y D. Estas son, en general, proteínas con tres dominios específicos: a) dominio extracelular, o receptor glucosilado que contiene los determinantes antígenos de los grupos sanguíneos; b) dominio intramembranoso, muy hidrófobo, que se integra con los fosfolípidos, y c) dominio citoplásmico, lugar de unión de las proteínas del citoesqueleto. Existen muchas otras proteínas integrales que penetran o atraviesan la membrana del eritrocito y que se conocen como proteínas del sistema Rh, Kell y Dufíy; proteínas del com­ plemento (C3b y C4b) y proteínas que sirven de transportadores y receptores. B anda 3 (AE1) La banda 3 o AE1 (del inglés anion exchanger, «intercambiador amónico») forma parte de una familia multigénica de proteínas AE con dominios intramembranosos implicados en

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el transporte iónico. Es la mayor y más abundante proteína integral de la membrana, con cerca de 1,2 millones de copias por eritrocito; representa el 20-30% de las proteínas de la membrana. Tiene tres dominios estructurales: a) citoplásmico (residuos 1-403), lugar de unión a las enzimas glucolíticas, hemoglobina, hemicromos y proteínas del citoesqueleto; b) membranoso (residuos 404-882), compuesto por 14 regiones helicoidales que atraviesan la membrana y forman un canal para el intercambio iónico, y c) otro dominio citoplásmico (residuos 883-911), de función desconocida. La anquirina, la proteína 4.1 y la proteína 4.2 se unen al dominio citoplásmico, probablemente en más de un lugar. En la esferocitosis hereditaria (EH) se han descrito mutaciones del gen EPB3 que producen una disminución de la síntesis, la estabilidad y la inserción de la banda 3 en la membrana, o la alteración de las regiones de unión a la proteína 4.2. La deleción de ocho residuos aminoacídicos (400 a 408) se ha asociado a una forma especial de ovalocitosis conocida como ovalocitosis SAO (sudeste asiático). En formas raras de acantocitosis hereditaria se han descrito variantes de la banda 3 con aumento del transporte aniónico. También, en la anemia diseritropoyética congénita (CDA) tipo II se observa una altera­ ción cualitativa de la banda 3 en la electroforesis, más compacta y rápida. La banda 3 también se expresa en las células intersticiales de los túbulos distales del riñón, donde contribuye a mantener el equilibrio acidobásico de la sangre. Para la síntesis de la proteína AE1 renal, el gen EPB3 utiliza un prom otor localizado en el intrón 3, pero debido a que carece de los 65 primeros aminoácidos no se une a los componentes citoplásmicos.

Glucoforinas Con base en las propiedades y en la estructura génica, las glucoforinas pueden ser subdivididas en dos grupos. El primero está constituido por las glucoforinas A (GPA), B (GPB) y E (GPE), estructuralm ente homologas y asociadas a los antígenos de los grupos sanguíneos MNS. Las GPA y GPB transportan más del 90% de los residuos del ácido siálico que confieren carga negativa a la superficie de los eritrocitos. La GPA ya es detectable en los proeritroblastos y constituye un marcador específico de la línea eritroide. La ausencia de GPA y/o GPB no se acompaña de alteraciones morfológicas o funcionales de los eritrocitos. Las glucoforinas C (GPC) y D (GPD) constituyen un segundo grupo que contiene los antígenos de los grupos sanguíneos Gerbich (Ge). Ambas proteínas son sintetizadas por un único gen, utilizando diferentes códigos de iniciación: GPD es una forma modificada de GPC a la que le faltan los primeros 21 aminoácidos del grupo terminal NH2. Las GPC y GPD se expresan en tejidos eritroides y no eritroides y pueden actuar de receptores para el Plasmodium falciparum. La ausencia completa de estas glucoproteínas se asocia a eliptocitosis. La GPC se halla unida a la proteína 4.1 y forma un importante lugar de anclaje del citoesqueleto a la membrana.

Proteínas del citoesqueleto Espectrina La espectrina es la proteína más abundante y larga de la m em brana del eritrocito. Es un heterodímero form ado por dos subunidades, a y 0, enrolladas entre sí en una orientación antiparalela. Los heterodímeros se asocian en tetrámeros a 2$2 a través de su terminal proximal (cabeza), que está formado por el terminal NH2 de la cadena a y el terminal C OOH de la cadena (3. La interconversión dímero-tetrámero está regulada por un equilibrio termodinámico que, en condiciones fisiológicas, favorece fuertemente los tetrámeros de espectrina.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

En el terminal distal o caudal, los heterodímeros, con ayuda de la proteína 4.1, se unen a pequeños filamentos de actina, y forman un complejo funcional con la tropomiosina y la aducina. El principal lugar de unión del esqueleto de la m em brana a la bicapa lipídica se establece por la interacción (3-espectrina-anquirina que, a su vez, se une al dominio citoplásmico de la banda 3. La interrupción de esta unión vertical causa EH por deses­ tabilización y vesiculación del citoesqueleto y de la capa lipídica. Una segunda unión vertical está mediada p or la asociación (3-espectrina-actina-proteína 4.1, unida a su vez a la glucoforina C. Las alteraciones en esta interacción no parecen ser causa de EH.

Anquirina (proteína 2.1) La anquirina tiene tres dominios funcionales: a) dominio con carga positiva, compuesto por 23 segmentos de 33 AA, con lugares de unión para la banda 3 y para otras proteínas integrales; b) dominio neutral donde la anquirina se une por afinidad a la 0 -espectrina, y c) dominio regulador que modula la interacción de la anquirina con la espectrina y con la banda 3. Este segmento tiene varias isoformas que resultan del reordenamiento (splicing) alternativo del ARNm y cuya función se desconoce. La fosforilación de la anquirina también funciona como mecanismo regulador: la anquirina no fosforilada se une preferentemente a los tetrámeros y oligómeros de espectrina en detrim ento de los dímeros. La fosforilación disminuye esta unión preferente y reduce la capacidad de la anquirina para unirse a la banda 3. La anquirina eritroide también se expresa en las células de Purkinje del cerebelo, por lo que los individuos con déficit de anquirina pueden presentar una disfunción neurológica grave.

Proteína 4.1 La proteína 4.1 interacciona con varias proteínas transmembranosas y del citoesqueleto, contribuyendo a la estabilidad de la red de espectrina-actina. Está constituida por cuatro dominios comprendidos por los aminoácidos 1 a 300,301 a 404,405 a 471 y 472 a 662. El prim er dominio está implicado en una interacción con la GPC, reforzada por la unión a la proteína p55, pero no está claro si in vivo interacciona también con la GPA y la banda 3. El tercer dominio está relacionado con la unión a la 0-espectrina, que se establece junto al lugar de unión espectrina-actina, contribuyendo a reforzarla. Al parecer, la proteína 4.1 también se une directamente a la actina formando un complejo espectrina-actinaproteína 4.1. La ausencia de proteína 4.1 se asocia a eliptocitosis hereditaria, con un cuadro clínico de anemia hemolítica crónica, debido a inestabilidad de la membrana. Mediante electroforesis (SDS-PAGE) la proteína 4,1 puede ser separada en proteína 4. la y 4. Ib. La 4. Ib predomina en los reticulocitos y da origen a la 4. la por desanimación gradual del Asn 502. La proteína 4.1 tiene una variedad de isoformas con especificidad tisular y del estado de maduración celular y que resultan de diferentes splicings en el gen EPB41.

Proteína 4.2 La proteína 4.2 está unida a varias proteínas, en particular la banda 3 y la anquirina. La deficiencia completa de proteína 4.2 se asocia a la esferovalocitosis con anemia hem o­ lítica, lo que sugiere el desempeño de un papel importante en la integridad de la mem­ brana. Existen cuatro isoformas resultantes del splicing alternativo en el gen EPB42 en la región correspondiente al terminal N H 2 de la proteína. La proteína 4.2 tiene una gran analogía con las proteínas de la familia de las transglutaminasas, como el factor XIII de la coagulación, pero no posee actividad enzimática.

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Proteína p55 La proteína p55 se une a la proteína 4.1 y a la región citoplásmica de la GPC estableciendo un puente de unión entre ambas. Los eritrocitos sin proteína 4.1 o sin GPC tampoco tienen p55.

Actina y otras proteínas asociadas La actina forma parte del complejo funcional y está organizada en pequeños filamentos en doble hélice, que parecen estabilizarse por las interacciones con la espectrina, aducina, proteína 4.1, tropomiosina y tropomodulina. La unión a espectrina es ineficaz en ausencia de la proteína 4.1. La aducina es un heterodímero, formado por dos cadenas, a y (3, estructuralmente parecidas, que se une a la espectrina y la actina para promover la asociación de las dos proteínas. La desm antina (proteína 4.9) une los filamentos de actina agrupándolos. La tropom iosina se une con la actina, y en concentraciones saturadas de tropom iosina inhibe la unión espectrina-actina. La tropom odulina está asociada a actina e interacciona con la tropomiosina en los respectivos terminales N H 2. La miosina está formada por dos cadenas ligeras y una pesada, tiene actividad ATPasa y se une a la actina y posiblemente también a la proteína 4.1. En los eritrocitos del recién nacido existen cerca de 2,5 veces más copias de miosina que en los adultos.

TRASTORNOS CONGÉNITOS DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO Las proteínas que forman el esqueleto de la m embrana del eritrocito establecen entre sí interacciones verticales (entre el esqueleto y la bicapa lipídica) y horizontales (entre las proteínas que form an la red del citoesqueleto). La interrupción de estas interacciones, por defectos de alguna de las proteínas, altera la integridad estructural y funcional de la membrana y puede reducir la supervivencia del eritrocito (tabla 18-1). La interrupción de las interacciones verticales, que implican a la espectrina o a las proteínas que unen la espectrina a la m em brana (como la anquirina, la proteína 4.2 y la banda 3), es causa de EH. La interrupción de las interacciones horizontales (entre las espectrinas a y 0, la (3-espectrina y la proteína 4.1; o la pro teína 4.1 y la actina) es causa de eliptocitosis (ElipH) o piropoiquilocitosis hereditaria (PPH). La ovalocitosis del sudeste asiático (SAO) es una forma de ElipH que resulta de una alteración específica en la banda 3.

I TABLA 18-1. Anem ias hem olíticas asociadas a alteraciones en las proteínas de la m em brana eritrocitaria Proteína

EH

ElipH

PPH

a-espectrina ^-espectrina Anquirina Banda 3 Proteína 4.1 Proteína 4.2 Estomatina Glucoforina A Glucoforina C

X X X X

X X

X X

SAO

EstH

X

CDA-II

X

X X X X X

CDA-II, anemia diseritropoyética congénita tipo II; EH, esferocitosis hereditaria; ElipH, eliptocitosis H; EstH, estomatocitosis hereditaria; PPH, piropoiquilocitosis hereditaria; SAO, ovalocitosis del sudeste asiático.

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Los trastornos en la perm eabilidad de la m em brana de los eritrocitos alteran la concentración intracelular de los cationes monovalentes, causando un conjunto de enfermedades hereditarias conocidas como estomatocitosis hereditaria.

Esferocitosis hereditaria (EH) Es la anemia hemolítica crónica más frecuente en Europa. Se encuentra en todos los grupos étnicos, y se caracteriza p or la presencia de eritrocitos con form a esférica y osmóticamente más frágiles (fig. 18-3). El cuadro clínico, de intensidad muy variable, se caracteriza clásicamente por ictericia, anemia con reticulocitosis y esplenomegalia. La variabilidad clínica depende fundamentalmente de la proteína afectada y del tipo y localización de la alteración, pero también está influenciada p o r múltiples factores intra- y extragénicos. En aproxim adam ente el 75% de los casos de EH, la transm isión es autosóm ica dom inante y en el 25% restante es esporádica. Se estima que los casos esporádicos, aunque pueden ser autosómicos recesivos, están causados en su mayoría por mutaciones de novo en el gen de la anquirina o de la 0-espectrina. El estado homocigoto para las formas dominantes de EH es raro, probablemente debido a que es incompatible con la vida. La gravedad de los cuadros clínicos descritos en la literatura médica justifica que en el caso del diagnóstico de una EH autosómica dominante en uno de los miembros de una pareja, se estudie al otro miembro para consejo genético y, si estuviera indicado, ofrecer el diagnóstico prenatal. La causa más frecuente de EH en la población europea y americana es un déficit de anquirina/espectrina (35-65%), seguido del déficit de banda 3/proteína 4.2 (15-30%). El déficit aislado de proteína 4.2 es raro en la población europea, pero tiene una elevada preva­ lencia en Japón. Como resultado de la estrecha interacción entre estas proteínas, la reducción primaria de una proteína origina reducciones secundarias de las que le están asociadas. La alteración de las interacciones verticales entre el esqueleto y la bicapa lipídica conlleva la formación de microvesículas membranosas que, al ser eliminadas por los macrófagos, producen una reducción progresiva de la superficie de la membrana eri­ trocitaria, lo que constituye la causa de esferocitosis. Los principales defectos proteicos primarios en la EH son los déficits de anquirina, banda 3, espectrina y proteína 4.2. • Déficit de anquirina: el déficit primario de anquirina es la causa más frecuente de EH y, en la mayoría de los casos, se acompaña de un déficit secundario de espectrina, que

Frotis de sangre periférica de una muestra con esferocitosis hereditaria. Se identifican numerosos eritrocitos con forma esférica (esferocitos). La flecha muestra un eritrocito «en champiñón», frecuente en las EH por déficit de banda 3.

F IG U R A 18 -3 .

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se degrada por falta de anquirina para unirse a la membrana. El fenotipo resulta de mutaciones en el gen ANK1. En las formas de transmisión dominante las mutaciones, en estado heterocigoto, originan casi siempre codones de paro (stop) de la traducción (frameshift). Las formas de transmisión recesiva están asociadas, más frecuentemente, a mutaciones en la región promotora del gen. No siempre existe correlación genotipofenotipo debido a la asociación con otros factores que modifican la expresión del defecto primario. • Déficit de banda 3: se considera responsable de un 15-30% de los casos de EH dominante y resulta de mutaciones en el gen EPB3 asociadas a alteraciones que disminuyen la esta­ bilidad o la capacidad de inserción de la banda 3 en la membrana. El cuadro clínico suele ser una anemia hemolítica leve o moderada, con disminución (20-30%) de banda 3 y déficit proporcional de proteína 4.2. Las mutaciones en la secuencia que codifica el dominio citoplásmico de la banda 3 pueden alterar el locus de unión de la proteína 4.2, que en estos casos se presenta más reducida que la banda 3. Aparentemente, estas alteraciones solo se manifiestan en estados homocigotos o asociados a otras mutaciones esferocíticas. Algunas mutaciones en el gen EPB3 alteran la banda 3, que se expresa en las células tubulares distales del riñón, dando lugar a acidosis tubular distal. • Déficit de espectrina: es la tercera causa más frecuente de EH y el grado de deficiencia de espectrina se correlaciona con el grado de hemólisis. En general, las mutaciones en el gen de 0 -espectrina (SPTB) se asocian a EH dom inante con fenotipo leve a moderado, mientras que las mutaciones en el gen de a-espectrina (SPTA1) se asocian a EH recesiva y hemólisis muy intensa en homocigotos. Más del 50% de los pacientes con formas recesivas y graves de EH presentan una mutación en el gen SPTA1. • Déficit de proteína 4.2: la EH por déficit de proteína 4.2 tiene un fenotipo de trans­ misión autosómica recesiva que puede resultar de mutaciones en el gen EPB42 o en el EPB3, en la secuencia que codifica el local de unión de la proteína 4.2 al dominio citoplásmico de la banda 3.

Eliptocitosis (ElipH) y piropoiquilocitosis hereditarias (PPH) La ElipH es frecuente en las poblaciones del Mediterráneo y África y se caracteriza por la presencia de eritrocitos ovalados o elípticos (fig. 18-4). Su expresividad clínica es muy variable y predominan las formas asintomáticas, por lo que existen muchos casos que no se detectan. La mayoría de las ElipH presentan una transmisión autosómica dominante:

FIGURA 18-4. Frotis de sangre periférica de una muestra con eliptocitosis hereditaria. A. Forma ligera. B. Forma severa. C. Piropoiquilocitosis hereditaria.

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los heterocigotos son asintomáticos, sin signos de hemólisis; los homocigotos, o heterocigotos compuestos, suelen tener anemia hemolítica de m oderada a severa. La PPH es una form a rara de ElipH, que se presenta en el período neonatal con anemia hemolítica intensa, marcada anisopoiquilocitosis, formas bizarras, esferocitos y algunos eliptocitos. La transmisión es autosómica recesiva, los padres son heterocigotos para una mutación que afecta el lugar de unión de los heterodímeros a|3-espectrina, o uno es heterocigoto para una m utación en el mismo sitio y el otro tiene un alelo de baja expresión ( a LELYo spectrinstLoms). En la mayoría de los casos la anemia disminuye de intensidad en los primeros 6 meses de vida y se queda con un cuadro típico de ElipH con anemia leve o moderada. La ElipH y la PPH resultan de una pérdida de estabilidad del citoesqueleto de la membrana, como consecuencia de defectos de interacción horizontal de las proteínas a-espectrina, (¡J-espectrina y proteína 4.1. • Déficit de a-espectrina o -espectrina: la mayoría de los casos de ElipH por déficit de es­ pectrina son consecuencia de mutaciones en los genes de la a-espectrina (SPTA1) o de la 0-espectrina (SPTB), que modifican los lugares de unión entre los heterodímeros de espectrina. La intensidad del cuadro clínico está directamente relacionada con la cantidad de espectrina en la m embrana y con el porcentaje de heterodímeros. El porcentaje de dímeros de espectrina depende principalmente de dos factores: la dis­ función de la espectrina m utada (las mutaciones próximas al lugar de unión de las cadenas producen un fenotipo más grave) y la cantidad de espectrina mutada que se incorpora en la membrana (depende de si existen uno o dos alelos mutados y de la presencia de alelos de baja expresión). En general, las mutaciones en el gen SPTB cau­ san fenotipos de transmisión dominante con expresividad variable, mientras que los heterocigotos para mutaciones en el gen SPTA1 son asintomáticos y los homocigotos suelen presentar anemia m oderada o intensa. Una misma m utación puede hallarse asociada a cuadros clínicos de intensidad variable debido a la herencia conjunta de alelos de baja expresión. El más frecuente es el polimorfismo a LELY (mutaciones SPTA1 CD1857 C—>G y nt-12 C —>T en el intrón 45, con skipping parcial del exón 46), con una frecuencia génica estimada del 20 al 30% en algunos grupos étnicos. Este alelo es silente en estado homocigoto, debido a que las cadenas de a-espectrina son sintetizadas en exceso y el skipping del exón 46 acontece en apenas el 50% del ARN. Si se asocia a una mutación estructural del gen a-espectrina, el a LELYmejora el fenotipo cuando ocurre en cis, pero lo empeora si ocurre en trans, lo que produce un fenotipo de PPH. • Déficit de proteína 4.1: produce una marcada inestabilidad del esqueleto de la m em­ brana eritrocitaria. En este defecto proteico, los heterocigotos para mutaciones en el gen EPB41 presentan eliptocitosis intensa, pero sin hemólisis ni aum ento de la fragilidad osmótica (FO) de la membrana. Los homocigotos presentan una ElipH moderada a intensa y hemólisis crónica. El déficit de proteína 4.1 es frecuente en las poblaciones europeas y árabes, pero no se encuentra en poblaciones de origen africano. • Déficit de glucoproteína C (GPC): al igual que en el déficit de proteína 4.1, en el de GPC existe una marcada inestabilidad del esqueleto de la membrana eritrocitaria. El déficit de GPC se transmite con carácter autosómico recesivo y los pacientes homocigotos o compuestos heterocigotos para mutaciones en el gen GYPC, con déficit completo de GPC (fenotipo Leach), carecen de antígeno Gerbich. Clínicamente, el déficit de GPC cursa con ElipH esferocítica y anemia hemolítica moderada con transmisión recesiva.

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Ovalocitosis del sudeste asiático También conocida como eliptocitosis estomatocítica, la ovalocitosis del sudeste asiático (SAO) es una forma de ElipH de elevada prevalencia (del 5 al 25%) en Malasia, Indonesia, Papúa Nueva Guinea y Filipinas, zonas endémicas de malaria. Su transmisión es auto­ sómica dominante y los portadores son asintomáticos o afectos de hemólisis moderada. No están descritas formas homocigotas, lo que hace suponer que son incompatibles con la vida (letal in útero). Muchos de los eritrocitos son ovales y presentan una o dos estrías transversales que dividen el halo claro central (fig. 18-5). Al contrario de otras formas de eliptocitosis, en la SAO los eritrocitos tienen una m em brana más rígida y menos deformable, lo que les hace más resistentes al calor y a la crenación. El defecto molecular se sitúa en el gen EPB3, que presenta dos mutaciones en cis: la deleción de nueve codones que codifican los aminoácidos 400 a 408, situados en la transición entre los dominios citoplásmicos y transmembranosos, o la sustitución Lys56Glu (banda 3 Memphis).

Estom atocitosis hereditaria La hidratación de los eritrocitos depende de la concentración intracelular de los cationes monovalentes: un aumento intracelular de Na+y K+ hace entrar agua, lo que da origen a estomatocitos, y la pérdida de Na+ y K+ deshidrata la célula, originando los xerocitos. La estomatocitosis o hidrocitosis hereditaria (EstH) y la xerocitosis hereditaria (XH) representan los extremos de las alteraciones de permeabilidad y existen casos clínicos con características interm edias que pueden ser agrupados en tres subtipos: criohidrocitosis, seudohiperpotasemia y xerocitosis estomatocítica. Todas estas patologías, no bien definidas ni clínica ni molecularmente, presentan una transmisión hereditaria aparentem ente autosóm ica dom inante y cursan con hemólisis crónica m oderada y reticulocitosis importante. • Estomatocitosis o hidrocitosis hereditaria (EstH): la EstH, así llamada por presentar eri­ trocitos con palidez central alargada o en forma de «boca» (fig. 18-6), se halla asociada a una ausencia de estomatina o banda 7.2b (proteína integral de membrana), cuya función no está aún bien definida. En los estomatocitos, el transporte pasivo de Na+ al interior es mayor que la pérdida de K+, por lo que la célula retiene agua, aumenta de volumen y se vuelve osmóticamente más frágil. Estos eritrocitos son relativamente

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FIGURA 18-6. Frotis de sangre periférica de muestras con estomatocitosis hereditaria que presentan numerosos estomatocitos. A. Eritrocitos con palidez central alargada, o en forma de boca, y cup cells. B y C. Eritrocitos con hemoglobina desplazada lateralmente.

rígidos y necesitan de una elevada cantidad de ATP para bombear el Na+y el K+, con el fin de mantener la homeostasis. Los estomatocitos son un artefacto frecuente al realizar la extensión de sangre. Pueden observarse también en la intoxicación alcohólica aguda con hemólisis leve y después de la administración terapéutica de alcaloides de la vinca. El cuadro típico de la EstH es el de anemia hemolítica crónica con estomatocitos en sangre periférica (5-50%), macrocitosis (110-150 fl), disminución de la concentración de hemoglobina corpuscular media (CMHC) (24-30 g/dl) y aumento de la FO. La esplenectomía disminuye el proceso hemolítico, pero está contraindicada porque favorece un estado de hipercoagulabilidad, con mayor riesgo de padecer trombosis venosas. Xerocitosis hereditaria (XH): es una anemia hemolítica crónica, en la que los eri­ trocitos se deshidratan debido a un aumento de la permeabilidad de la membrana al K+. Está asociada a un aumento de la fosfatidilcolina, y se desconoce su alteración molecular. Los eritrocitos tienen un exceso de membrana; son relativamente rígidos, frágiles y muy sensibles a sustancias oxidantes. La CMHC y el VCM se hallan aumen­ tados, la FO disminuida y se observa un aumento de la autohemólisis que se corrige con la adición de glucosa. La cuantificación de las proteínas de membrana es normal y la concentración de 2,3-DPG está ligeramente disminuida. En la mayoría de los casos se observan eritrocitos en diana (codocitos), algunos acantocitos y estomatocitos y, en los casos más graves, pueden observarse equinocitos (eritrocitos contraídos y espiculados) y algunos eritrocitos hiperdensos con hemoglobina desplazada late­ ralmente (excentrocitos). La esplenectomía no mejora el proceso hemolítico y está igual­ mente contraindicada por su asociación a fenómenos tromboembólicos (trombofilia). La criohidrocitosis, la seudohiperpotasemia y la xerocitosis estomatocítica son tras­ tornos de probable transmisión autosómica dominante mal definidos desde el punto de vista clínico y molecular. Generalmente cursan con hemólisis crónica de intensidad variable. La criohidrocitosis se caracteriza por estomatocitos, FO normal, sin incuba­ ción y autohemólisis aumentada, más intensa a 4 que a 37 °C. La seudohiperpotasemia es similar a la criohidrocitosis, pero los eritrocitos presentan un mayor grado de deshidratación y la pérdida de K+ es más acentuada en frío. La cuantificación de K+ plasmático de una muestra de estos pacientes, conservada algunas horas a temperatura ambiente o refrigerada, muestra valores elevados. En la xerocitosis estomatocítica predominan los estomatocitos, pero la FO está disminuida (al contrario de lo que ocurre en la EstH).

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Capítulo 18

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En los síndromes Rh-nulo (Rhnull), en que hay ausencia o disminución de antígenos Rh, los pacientes tienen una anemia hemolítica que varía de moderada a intensa, carac­ terizada por presentar esferocitos y estomatocitos, y FO ligeramente aumentada.

TRASTORNOS ADQUIRIDOS DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO Las alteraciones estructurales de la membrana de los eritrocitos alteran su conformación, lo que permite sospechar el diagnóstico con una sencilla observación microscópica de la morfología de la sangre periférica. Todavía hay otras patologías adquiridas que pueden causar alteraciones morfológicas semejantes y confundir el diagnóstico. 1. Esferocitos: además de la EH, pueden hallarse esferocitos en algunas enfermedades como la anemia hemolítica autoinmune, la incompatibilidad ABO en el recién nacido, las reacciones transfusionales con hemólisis inm une, en las primeras 24-48 h después de quem adura extensa, las sepsis p o r Clostridium welchii o Clostridium perfringens y las anemias hemolíticas microangiopáticas (microesferocitos). El veneno de algunos reptiles y arañas, así como una picadura masiva de abejas o de avispas, pueden desencadenar anemia hemolítica esferocítica. 2. Codocitos: los codocitos o hematíes en diana resultan de un aumento de la relación superficie/volumen de la m em brana del eritrocito. Se asocian a trastornos que aumentan la bicapa lipídica (como la colestasis hepática, la hipobetalipoproteinemia y el déficit familiar de LCAT), o que disminuyen el volumen eritrocitario (por disminución de cationes y agua) o de la hemoglobina (ferropenia, talasemia o algunas otras hemoglobinopatías). El déficit familiar de LCAT es una enfer­ medad autosóm ica recesiva, caracterizada p or anemia, opacidad de la córnea, hiperlipidemia, proteinuria, nefritis crónica y arteriosclerosis precoz. Cursa con anemia normocrómica ligera o moderada y abundantes codocitos circulantes. La enfermedad del ojo de pez, un déficit parcial de LCAT, se caracteriza por opacidad de la córnea, hipertrigliceridemia y niveles muy bajos de HDL. 3. Equinodtos: los equinocitos son eritrocitos que presentan pequeñas prolongaciones de la membrana regularmente distribuidas en toda la superficie y constituyen un trastorno relativamente frecuente en la práctica del laboratorio. En la mayoría de los casos es un artefacto en extensiones mal preparadas o por empleo de sangre envejecida, por lo que es aconsejable exam inar siempre extensiones de buena caüdad, realizadas poco después de la recogida de la sangre. Los equinocitos pueden ser inducidos por factores diversos, intra- o extraeritrocitarios. Entre los factores intraeritrocitarios destacan los trastornos congénitos del metabolismo que afectan fundamentalmente a la función normal de la glucólisis anaerobia: déficit congénito de piruvato cinasa (PK) o de cualquier otra enzima capaz de bloquear la producción normal de ATP por el eritrocito. Generalmente, solo son observados después de esplenectomía. Entre las causas extraeritrocitarias cabe mencionar la hipofosfatemia, la uremia y la hemólisis mecánica producida por ejercicio muscular extenuante (atletas). Los equinocitos se observan también en algunos enfermos con anemia hemolítica microangiopática y en los recién nacidos, en especial en los prematuros. 4. Acantocitos: los acantocitos son eritrocitos con prolongaciones de la membrana de base amplia, diferentes tamaños y distribución irregular. Pueden observarse en el hipotiroidismo, las enfermedades hepatocelulares graves (spur cells), el síndrome de Zieve, la picnocitosis infantil, la anorexia nerviosa grave, el ayuno prolongado o la m alnutrición, la abetalipoproteinem ia, la corea amiotrófica, el síndrome McLeod (ausencia del precursor Kx del antígeno Kell) y el fenotipo Lutheran nulo

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Lua-b_. Los enfermos con hipotiroidismo tienen con mucha frecuencia acantocitos «en dedo de guante», y es aconsejable practicar las pruebas de la función tiroidea en todos aquellos enfermos que muestren acantocitosis.

PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO El diagnóstico de las enfermedades más frecuentes de la m embrana del eritrocito como, por ejemplo, la EH y la ElipH, se basa en los datos aportados p or la historia clínica del paciente y su familia, el hemograma (incluido el recuento de reticulocitos) y la observa­ ción morfológica de la sangre periférica, que se complementan con las siguientes pruebas de laboratorio denominadas «de hemólisis no inmune»: 1. La FO de los eritrocitos (o resistencia osmótica eritrocitaria), dependiente de la relación superficie/volumen, que incluye la prueba de la lisis en glicerol acidificado (AGLT) y la prueba de pink. 2. La susceptibilidad de los eritrocitos a la criofragmentación, o criotest. 3. La cuantificación de la banda 3 en la membrana de los eritrocitos mediante medida de la fluorescencia con eosina-5’-maleimida (EMA), para el empleo de un equipo de citometría de flujo. La elección de las pruebas de laboratorio más apropiadas para el diagnóstico de EH se basa en su sensibilidad y especificidad, pero también en la complejidad y coste de los procedimientos. Las pruebas más sensibles y específicas para el diagnóstico de EH son la AGLT, el criotest y la EMA, y emplearlas conjuntamente mejora la capacidad diagnóstica, incluso en formas poco expresivas de EH. Empleadas por separado, no permiten sacar conclusiones en un número significativo de casos. El empleo de analizadores hematológicos autom atizados de últim a generación, utilizando diferentes principios para el análisis celular, perm ite obtener u na elevada variabilidad de mediciones celulares, algunas de las cuales (referidas exclusivamente a los eritrocitos) son de gran utilidad en el diagnóstico de las anemias. Así, en la EH se detecta un elevado porcentaje de hematíes hipercrómicos (aumento de la HCM y CMHC), y el gráfico de dispersión de la concentración de hemoglobina corpuscular (CHC) frente al volumen celular (VC) (fig. 18-7, A), así como el histograma de distribución de la CHC (fig. 18-7, B) m uestran configuraciones muy características que indican la presencia de esferocitos. De esta forma, estos instrumentos constituyen, hoy en día, un procedimiento al alcance de muchos laboratorios para el cribado de la EH (v. capítulo 5). La medida de la deformabilidad eritrocitaria, mediante viscosimetría o ectacitometría de gradiente osmótico, es una tecnología muy sofisticada que permite hacer el diagnóstico diferencial de muchas de las enfermedades de la membrana eritrocitaria. Los eritrocitos son incubados en soluciones con un amplio intervalo osmótico (de concentraciones muy hipotónicas a hipertónicas) y sujetos a condiciones de estrés mecánico (shear-stress), lo que permite establecer una curva de deformabilidad, que varía en función de la relación superficie-volumen del eritrocito, de su estado de hidratación y del contenido hemo­ globínico. La curva es comparada con los perfiles de deformabilidad establecidos para las diferentes alteraciones del eritrocito. Desgraciadamente, esta tecnología solo está al alcance de unos pocos laboratorios altamente especializados o de investigación. C uando se detecta alguna alteración que hace sospechar un defecto de proteínas de m embrana eritrocitaria, resulta im portante identificar cuál es la proteína afectada mediante electroforesis en poliacrilamida (PAGE) y dodecilsufato sódico (SDS), lo que

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A

FIGURA 18-7. A. Gráfico de dispersión de la concentración de hemoglobina corpuscular (CHC) (g/dl) frente al volumen globular (fl) en una muestra normal (1) y una muestra con EH (2). Los eritrocitos hipercrómicos se encuentran a la derecha del eje que indica CHC 41 g/dl. B . Histograma de distribución de la concentración de hemoglobina corpuscular (CHC): 1, muestra normal; 2 y 3, muestras con EH; 4, muestra con anemia hemolítica autoinmune (AHAI). En la EH y en la AHAI se observa un claro desplazamiento de la curva en relación al eje X, en el punto de intersección con el eje derecho, que está en relación con el número de esferocitos presentes en la muestra. (Adaptado de

Cell-Dyn Sapphire, Abbott Diagnostics, California.) se conoce como SDS-PAGE. Mediante este procedimiento se puede realizar el análisis cuantitativo y cualitativo de las principales proteínas estructurales que forman la mem­ brana de los eritrocitos. Un paso más es la identificación de mutaciones de los genes que codifican las pro­ teínas de la membrana, pero solo está justificada en casos m uy concretos o de elevada complejidad, o bien cuando se desea realizar un diagnóstico prenatal. Estos estudios permiten elucidar la base genética de la variabilidad fenotípica en diferentes pacientes de una misma familia, confirmar mutaciones recesivas o de novo cuando los progenitores son aparentemente normales, y hacer el diagnóstico prenatal cuando hay riesgo de que nazca un niño con una forma muy grave de EH. Debido a su complejidad y precio, los estudios de las proteínas de la membrana eri­ trocitaria y los estudios moleculares de los genes que codifican estas proteínas se efectúan solamente en centros especializados o de referencia.

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Fragilidad osm ótica eritrocitaria (FO) La prueba de la FO evalúa la capacidad de resistencia de los eritrocitos al efecto de diferentes grados de hipotonía del medio; depende de la relación existente entre superficie y volumen eritrocitario, y de la CMHC. Los eritrocitos normales pueden aceptar, sin hemolizar, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta en un 70%, mientras que los esferocitos, con una relación superficie/volumen disminuida, tienen una capacidad mucho m enor y hemolizan en soluciones salinas de m enor hipotonía, es decir, más próximas al suero fisiológico. El aumento de la FO de los esferocitos condiciona su forma esférica (menor relación superficie/volumen), independientemente de la causa de la esferocitosis. Para realizar la prueba de FO se incuban pequeños volúmenes de sangre en soluciones salinas con un gradiente de concentración de isotónico a hipotónico, y la hemólisis en cada uno de los tubos se determina mediante espectrofotometría. La prueba se realiza a tem peratura ambiente (prueba inmediata) y después de 24 h de incubación a 37 °C (prueba incubada), y los resultados se representan mediante una gráfica que tiene forma sigmoide (fig. 18-8). Los eritrocitos con alteraciones de la membrana muestran una FO más aumentada después de la incubación durante 24 h a 37 °C, lo que incrementa la sensibilidad de la prueba. Ello obedece al aumento del volumen de la célula producido por un exceso de entrada de sodio que supera la pérdida de potasio, ya que con la incubación se produce un fallo del transporte iónico secundario a la disminución de glucosa del medio, imprescindible para el mantenimiento del ATP, o energía celular.

Muestra de sangre total Se utiliza sangre heparinizada. No deben utilizarse anticoagulantes como oxalato, el EDTA o citrato, debido a su efecto sobre la concentración salina del medio hipotónico. La prueba de FO inmediata (determinación mediante sangre recién extraída) debe realizarse dentro de las 2 h de practicada la extracción, o dentro de las primeras 6 h si la

1

2

3

3,5

4

4 ,5

5

5,5 6

6,5 7

7,5 8

8,5 9

10

NaCl (g %o)

FIGURA 18-8. Representación gráfica de la curva de la fragilidad osmótica eritrocitaria a temperatura ambiente inmediata (líneas continuas) y tras 24 h de incubación (líneas de puntos). La curva continua y la curva de puntos a la izquierda corresponden a una muestra normal; la curva continua y la curva de puntos a la derecha corresponden a una muestra con esferocitosis hereditaria.

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sangre se ha conservado a 4 °C. La muestra del paciente debe ser procesada siempre en paralelo con un control normal recogido en las mismas condiciones.

Reactivos Solución madre: cloruro de sodio (NaCl) a 100 g/1 Se prepara como sigue: • NaCl, 100 g. • H20 bidestilada, c.s.p. 1.000 mi. Bien tapada y a 4 °C esta solución se conserva durante varios meses. Pueden formarse cristales de sal que deben ser cuidadosamente disueltos antes de usar la solución.

Soluciones de trabajo Se preparan a p a rtir de la solución m adre m ediante diluciones graduales en agua bidestilada: • Concentración 1:100. • 1 g/1 solución madre, 1 mi. • H 20 bidestilada, c.s.p. 100 mi. Se hace un gradiente de diluciones en los otros tubos: 2:100; 3:100; 3,5:100; 4:100; 4,5:100; 5:100; 5,5:100; 6:100; 6,5:100; 7:100; 7,5:100; 8:100; 8,5:100; 9:100; 10:100. Las concentraciones finales de NaCl (g/1) son: 1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9 y 10. Estas soluciones, una vez preparadas, pueden mantenerse durante varias semanas a 4 °C, aunque se debe prestar especial atención a la formación de hongos, ya que, en ese caso, la solución debe ser descartada.

Método Sangre heparinizada, 2 mi. La determinación de la FO se realiza a partir de sangre recién extraída (FO inmediata) y después de su incubación durante 24 h a 37 °C (FO incubada). Una vez preparadas las soluciones hipotónicas, se procede según la siguiente meto­ dología: 1. Se colocan 5 mi de cada una de las soluciones hipotónicas en una batería de tubos de centrífuga, dispuestos en una gradilla (1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9 y 10 [g/1]), y a continuación se añaden a cada uno 0,05 mi (50 |xl) de sangre total. Después de agitar suavemente todos los tubos p o r inversión (el mismo núm ero de veces cada uno de ellos), se dejan a la tem peratura del laboratorio (25 °C) durante 30 min. 2. Transcurrido este el tiempo, los tubos se centrifugan a 2.500 r.p.m. durante 5 min y, a continuación, se separa el sobrenadante. 3. El grado de hemólisis presente en cada sobrenadante se determina mediante la lectura de DO en un espectrofotómetro (540 nm), considerando como el 100% de hemólisis el tubo con 1 g/1 de NaCl y el 0% (blanco) el tubo con 10 g/1 de NaCl (tubo 1). La prueba de FO incubada debe hacerse con 1-2 mi de sangre heparinizada incubada a 37 °C durante 24 h. La metodología es exactamente la misma que la descrita para la prueba inmediata. En el cuadro 18-1 se presentan las diferentes causas de error que pueden alterar el resultado de la FO.

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CUADRO 18-1. Causas de error en la determinación de la fragilidad osmótica

Empleo de otros anticoagulantes distintos a la heparina. Defecto en la preparación de las soluciones hipotónicas. • Variaciones en la temperatura ambiente. Diferentes cantidades de sangre en cada tubo. Diferentes volúmenes de salino en cada tubo. • Variaciones del pH de las soluciones hipotónicas. La relación entre el volumen de la sangre y el volumen de la solución salina entre los diferentes tubos. La proporción de 1 (volumen de sangre) por 100 (volumen de salino) es la ideal para que la cantidad de plasma no interfiera en la concentración final de la solución.

Valores de referencia e interpretación del resultado En m uestra con eritrocitos normales, la form a sigmoidea de la curva indica que las células normales varían en su resistencia en soluciones hipotónicas en función de su juventud, de forma que los hematíes más viejos son los menos resistentes, porque tienen un contenido de sodio más elevado. Los reticulocitos, de tamaño más elevado y menor contenido hemoglobínico que los hematíes maduros, son más resistentes a la hemólisis hipotónica, por lo que una intensa reticulocitosis puede llegar a enmascarar un aumento de la FO y hacer que esta tenga valores normales. Los valores de referencia de la FO (antes y después de la incubación) están representa­ dos en la tabla 18-2. La forma de la curva sigmoidea ofrece una información importante, porque pone de relieve la heterogeneidad de la FO de la población de eritrocitos analizada y contribuye al diagnóstico diferencial con otras enfermedades que pueden acompañarse de alteraciones en la FO (cuadro 18-2). Sin incubación, la FO suele ser norm al en un 10-20% de los casos de EH, mientras que tras incubación de la sangre durante 24 h a 37 °C aum enta la sensibilidad y disminuye el porcentaje de resultados normales. Con todo, aún persiste un porcentaje relativamente importante de «falsos negativos».

TABLA 18-2. Valores de referencia de la fragilidad osm ótica (%) a diferentes concentraciones de NaCl (en g/1) NaCl

H em ólisis inmediata (sin incubar) (%)

Hem ólisis incubada (24 h a 37 °C) (%)

2 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 Hemólisis al 50% (H )

95-100 97-100 88-100 50-85 5,55 0-5 0 0 0 0 0 0 0 0 3,6-4,2

97-100 83-100 88-99 84-98 77-97 47-85 15-55 0-32 0-10 0-6 0-5 0-3 0 0 4,5-5,2

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CUADRO 18-2. Enferm edades q u e c u rsa n con alteraciones d e la fragilidad osm ó tica A u m e n to d e la F O • • • •

Esferocitosis hereditaria Eliptocitosis hereditaria (FO norm al en las E lipH sin hemólisis) Estom atocitosis hereditaria o hidrocitosis (C M H C baja) A nem ia hem olítica autoinm u n e

D is m in u c ió n d e la F O • Talasemias • Anem ia ferropénica • Xerocitosis hereditaria (C M H C elevada)

En la EH toda la curva suele hallarse desplazada hacia la derecha, pero a veces está muy poco desplazada y solo se observa una pequeña «cola» de células con FO muy aumentada que corresponde a una población muy frágil de esferocitos. Esta imagen, frecuente en pacientes con EH no esplenectomizados, suele desaparecer con la esplenectomía, porque la población de células se hace más homogénea y la curva muestra una imagen de mayor continuidad desde los más frágiles a los de menor FO normales. Los hematíes de pacientes esplenectomizados muestran un aumento de superficie, lo que los hace más resistentes a hemólisis hipotónica. Una FO disminuida indica la presencia de eritrocitos con relación superficie/volumen aumentada, tal como sucede en la ferropenia o la talasemia. Cuando la EH se asocia a hipocromía (ferropenia o talasemia), el valor de la FO puede resultar falsamente normal, debido a que la hipocromía disminuye la FO. En la interpretación de FO debe recordarse que, además de la esferocitosis, existen otras situaciones que pueden acompañarse de FO anormal, lo que invariablemente indica la presencia de eritrocitos anormales; una FO en el rango de la normalidad no significa que los eritrocitos sean normales. Las principales situaciones patológicas que suelen acompañarse de una FO alterada se resumen en el cuadro 18-2. En la anem ia hem olítica autoinm une gran parte de la curva puede ser norm al, pero con una «cola» de células más frágiles que corresponden a los esferocitos. En las anemias hemolíticas por déficits enzimáticos de la vía glucolítica la curva de FO puede ser anormal, en especial en los casos más graves, debido a la presencia de reticulocitos («cola» de células más resistentes) y de células más frágiles.

Prueba de lisis en glicerol acidificado La AGLT es una forma de m edir la fragilidad eritrocitaria, y en ella se registra el tiempo (en segundos) que tarda en producirse el 50% de la hemólisis de los eritrocitos cuando se incuban en un medio hipotónico acidificado salino-glicerol (AGLT50). El glicerol dis­ minuye la entrada de agua en los eritrocitos, lo que permite un registro continuo de la hemólisis mediante u n espectrofotómetro (fig. 18-9). El principio es el mismo que en la FO: los eritrocitos con disminución de la relación super­ ficie/volumen (esferocitos) resisten menos a la entrada de moléculas de agua que los eritrocitos normales y, por tanto, sucede siempre que existan esferocitos circulantes, independientemente de su causa. Un valor normal de AGLT50 es siempre superior a 1.800 s y en la EH disminuye.

Muestra de sangre total Se tom an 2 mi de sangre total en EDTA. La prueba debe hacerse siempre frente a un espécimen de sangre control.

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Tiempo

FIGU RA 18-9. Representación gráfica del test de hemólisis en glicerol acidificado, ctr, muestra control normal; EH, muestra con esferocitosis hereditaria.

Reactivos • Tampón de fosfato salino pH 6,9 (solución A): • Fosfato dihidrógeno potásico (KH2P 0 4) 0,1 M, 0,63 g. • Fosfato disódico (Na2H P 0 4) 0,1 M, 1,3 g. • Cloruro sódico (NaCl) 0,15 M, 8,1 g. • H20 bidestilada, c.s.p. 1.000 mi. • Solución de glicerol (solución B): • Glicerol, 2,2 mi. • Tampón de fosfato salino pH 6,9,30 mi. • H20 bidestilada, c.s.p. 67,8 mi.

Método Los reactivos deben estar a temperatura ambiente y el espectrofotómetro equilibrado a 625 nm, mediante un blanco (1 mi de solución A + 2 mi de solución B), en modo cinético (absorbancia/tiempo). La sistemática que se debe seguir es la siguiente: 1. En un tubo se introducen 5 mi de solución A, pH 6,9 (el pH de la solución es muy importante para la fidelidad de los resultados). 2. Se añaden 20 (xl de sangre total y se mezcla con cuidado. 3. Se pipetea 1 mi de la suspensión y se introduce en la cubeta de lectura de un es­ pectrofotómetro equipado con registro lineal-logarítmico. 4. Se coloca en la largura de onda 625 nm, se ajusta el cero de DO mediante el blanco de referencia. 5. Se añaden 2 mi de la solución de glicerol. 6. Se mezcla con cuidado y se lee inmediatamente la DO. 7. Se anotan los valores de DO hasta los 6 min y se mide el tiempo necesario para alcanzar la mitad de la absorbancia inicial. La hemólisis es cuantificada por la turbidez de la solución. Los resultados son ex­ presados en el tiempo necesario para que la densidad óptica disminuya a la m itad del valor inicial (AGLT50).

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Valores de referencia e interpretación del resultado Una solución con eritrocitos normales tarda más de 30 min (1.800 s) en alcanzar el 50% de la hemólisis (AGLT50). Este valor es similar en la sangre de un adulto normal, de un recién nacido o en la sangre de cordón umbilical. En la EH el AGLT50 varía entre 25 y 150 s. El AGLT50 disminuido también se puede encontrar en pacientes con insuficiencia renal crónica, leucemias crónicas, anemias hemolíticas autoinmunes y en algunas mujeres embarazadas. El AGLT es un buen test de cribado: es sencillo, no es caro y utiliza una pequeña cantidad de sangre, que puede ser procesada hasta 24 h después de recogida, con resul­ tados fiables.

Prueba de p in k (pink test) Es una prueba complementaria de la AGLT. Se considera más sensible, pero algo menos específica. Según algunos autores, es más reproducible que la AGLT, por lo que se con­ sidera más recomendable su uso en el laboratorio clínico general. La principal diferencia con respecto a la AGLT es que se emplea el tam pón Bis-Tris en lugar de tam pón fosfato, y el pH ha de ajustarse exactamente a 6,6.

Muestra de sangre total Se mezclan 3 mi de sangre total con heparina o EDTA. La prueba debe hacerse siempre frente a un espécimen de sangre control.

Reactivos • Solución amortiguadora (esta solución se conserva a 4 °C indefinidamente): • Bis-Tris 70 mM /1,14,6 g. • NaCl 25 mM /1,1,46 g. • Azida sódica 1,5 mM /1,0,1 g. • Glicerol 135 mM /1,12,43 g. • Agua bidestilada, c.s.p. 1.000 mi. • Se ajusta el pH a 6,6 con HC1 concentrado y la osmolaridad a 290 ± 5 Osm/1 con NaCl al 30%. • Solución hemolizante: • Tritón X-100 al 2% en agua destilada.

Método Los reactivos deben estar a temperatura ambiente: 1. Se introducen en un tubo de centrífuga 3 mi de solución tampón. 2. Se añaden 10 (xl de sangre total. 3. Se mezcla cuidadosamente y se incuba a tem peratura ambiente durante 40 o 45 min. 4. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 10 min. 5. Se lee la densidad óptica del sobrenadante a 540 nm y se devuelve al tubo correspondiente. 6. Se añaden al tubo dos gotas de solución hemolizante. 7. Se agita hasta conseguir la hemólisis completa de los eritrocitos. 8. Después de 5 m in se lee la DO a 540 nm (DO del hemolizado).

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9. Se calcula el resultado aplicando la fórmula siguiente: Hemólisis (%) = DO del sobrenadante x ÍOO/DO del hemolizado

Valores de referencia e interpretación del resultado En los sujetos normales, el porcentaje de la hemólisis es siempre inferior al 25%. En la EH y otras enfermedades que cursan con esferocitos circulantes, este valor puede ser superior al 60%. La prueba de pink suele aumentar en el fallo renal, la anemia hemolítica autoinmune y en mujeres embarazadas. En esta prueba el pH de la solución no es tan im portante como en la AGLT; por eso se considera más reproducible. Dada su gran asequibilidad, se considera u na prueba muy recomendable para detectar la existencia de EH.

P rueba de la criohem ólisis (criotest) La prueba de la criohem ólisis se basa en la m ayor susceptibilidad a la ro tu ra por efecto del frío que tienen los eritrocitos con alteraciones proteicas de m em brana. Al contrario de las pruebas de FO, cuyo resultado aum enta independientem ente de la causa de la esferocitosis, el criotest es independiente de la relación superficie/ volumen eritrocitario, lo que aum enta su especificidad para el diagnóstico de la EH. Su sensibilidad se ha descrito inicialmente como del 100% y su especificidad del 90%, aunque todavía no existen resultados concluyentes. En la anem ia diseritropoyética congénita tipo II (CDA-II), en la SAO y en la EstH, el criotest suele ser positivo. Teniendo en cuenta que estas son enferm edades raras y que el procedim iento es sencillo y económ ico, el c rio test se considera u n a b u en a p ru e b a de lab o ratorio general para el cribado de la EH.

Muestra de sangre total La prueba puede realizarse en una muestra de sangre en EDTA hasta 1 día después de recogida. Se debe usar siempre un control norm al y, si es posible, un control positivo con EH, procesado en las mismas condiciones.

Reactivos • Tampón fosfato 50 mmol/1, pH 7,4: • Na2H P 0 4, 0,72 g. • H20 destilada, 60 mi. • Se ajusta el pH a 7,4 con un fosfato ácido (NaH2P 0 4. H20 50 mmol/1). • H20 destilada, c.s.p. 100 mi. • Tampón 0,7 mol/1 de sacarosa: • Sacarosa, 23,96 g. • Tampón fosfato 50 mmol/1 pH 7,4,100 mi. Esta solución puede ser congelada en alícuotas de 2 mi preparados para usar.

Método 1. Se lavan los eritrocitos tres veces con salino frío (NaCl 9 g/1 a 4 °C, 2.500 r.p.m./5 min). Se hace una suspensión de células del 50% en la solución salina y se m antiene en hielo hasta el análisis.

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

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2. Se preparan dos tubos con 2 m i de la solución tampón (0,7 mol/1 de sacarosa) y se colocan 10 min a 37 °C para equilibrar la temperatura. 3. Se pipetean 50 |xl de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos con la solución caliente (Al y A2), se agita de inmediato unos segundos en el vórtex y luego se calienta durante exactamente 10 m in a 37 °C. 4. De inmediato se trasfieren los tubos para un baño de hielo (0 °C) durante 10 min exactos. Se agitan en el vórtex durante unos segundos y luego se centrifugan (2.500 r.p.m./5 min) para sedimentar las células restantes. 5. Se prepara una solución con un 100% de hemólisis pipeteando 50 (xl de la muestra original para 2 mi de agua. Se centrifuga y se diluyen 200 |xl del sobrenadante en 4 mi de agua (A3). 6. Se lee la absorbancia a 540 nm de las dos pruebas (Al y A2) y de la muestra con el 100% de lisis (A3). , ... . Media de las 2 absorbancias Al yA 2 Calculo de lisis: % cnohemólisis = ------------------------------------------- -------- x 21 Absorbancias con 100% de hemólisis A3

Valores de referencia e interpretación del resultado Son considerados valores normales de lisis entre el 3 y el 15%; en la EH la lisis es >20%. Considerando las características de la técnica, se recomienda que cada laboratorio encuentre sus valores de referencia. Las causas de error pueden ser una deficiente preparación de la solución madre de tam pón fosfato-sacarosa o la falta de precisión en el tiempo de incubación.

C itom etría de flujo con eosina-S’-m aleim ida (EMA) La evaluación m ediante citom etría de flujo de la fluorescencia de la EMA en los eritrocitos es u na prueba muy sensible (92,7%) y específica (99,1%) para el diagnós­ tico de EH. En presencia de EMA, alrededor de un 80% de esta substancia se une, m ediante enlaces covalentes, al g rupo e -N H 2 de la Lys-430, localizada en la p rim era ansa extracelular de la proteína banda 3, y el 20% restante a proteínas del complejo Rh y CD47. En la EH la fluorescencia media está dism inuida respecto a los controles norm ales, independientem ente de la p ro teín a de la m em brana que esté afectada (fig. 18-10). La elevada especificidad de esta prueba obedece a que en la EH la unión de la EMA a las proteínas integrales de la membrana interacciona directamente con el citoesqueleto eritrocitario, mientras que en otras enfermedades con esferocitosis pero sin alteración proteica del citoesqueleto (p. ej., anemia hemolítica autoinm une) no sucede así y el resultado de la prueba es normal. No obstante, en algunas enfermedades raras, como la PPH, la CDA-II, la criohidrocitosis y la SAO, puede observarse una moderada dis­ minución del valor medio de fluorescencia. Por el contrario, en ciertas EH con hemólisis compensada (sin anemia) o acompañadas de macrocitosis, la prueba de EMA suele ser normal.

Muestras Muestras de sangre periférica en EDTA-K3, máximo 48 h después de haber sido recogida, conservadas a 4 °C.

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A

Manual de técnicas de laboratorio en hematología

B

FIGU RA 18-10. A. Histograma de fluorescencia de eritrocitos marcados con eosina-5-maleimida (EMA) en una muestra normal y en otra con esferocitosis hereditaria (EH). La intensidad media de fluorescencia (MFI) es menor en la EH que en la muestra normal. B. Muestra de un paciente de EH con ausencia de banda 3 en régimen hipertransfusional. La doble población corresponde a los eritrocitos del paciente (1), con MFI muy baja, y a los eritrocitos trasfundidos (2). (Adaptado de Cytomics FC500, da Beckman-Coulter.)

En cada ensayo se deben usar seis muestras control con parámetros hematológicos normales y, si es posible, un control con EH recogido en las mismas condiciones. Hay que tener en cuenta si ha habido transfusiones previas.

Reactivos 1. EMA (a) Preparación de la solución madre: Concentración final (Cf) = 1 mg/ml EMA en tampón PBS. (b) Se almacena congelado a —80 °C en alícuotas de 2 mi en la oscuridad, porque el colorante es sensible a luz y la temperatura. Estabilidad de, aproximada­ mente, 4 meses. (c) Solución de trabajo: C f = 0,5 mg/ml EMA en tampón PBS. (d) Esta solución debe ser preparada solo en el m om ento de su utilización Ci X Vi = C f X V f (concentración inicial X volumen inicial = concentración final X volumen final). 2. Solución de albúmina (BSA) al 30%: (a) Disponible comercialmente. Diluir a 0,5% en PBS. 3. Tampón fosfato (PBS): (a) Pastillas disponibles comercialmente para disolver en agua. Alternativamente se puede preparar, en partes iguales, tampón fosfato isoosmótico y NaCl 9 g/1. (b) Tampón fosfato isoosmótico, pH 7,2: (i) NaH2P 0 4.2 H 20 (150 mmol/1), 23,4 g/1. (ii) NaH2P 0 4 (150 mmol/1), 21,3 g/1. (c) Se añaden 24 mi de reactivo A a 76 m i de reactivo B.

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Capítulo 18

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Equipamiento • • • • •

Citómetro de flujo. Centrífuga. Agitador mecánico. Pipetas. Tubos de citometría de flujo.

Método 1. Se pipetean 50 |xl de sangre en EDTA para un tubo. 2. Se lavan las células tres veces con PBS (3 m in a 2.500 r.p.m.). 3. En un tubo de citometría de flujo se pipetean 25 |xl de la solución de trabajo EMA (0,5 mg/ml), previamente descongelada en oscuridad y preparada, y 5 (xl de las células previamente lavadas. 4. Se homogeniza bien. 5. Se incuba en oscuridad, a temperatura ambiente. Media hora después, se hom o­ geniza de nuevo la mezcla y se incuba durante media hora más. 6. Se centrifugan los tubos 20 s a 5.000 r.p.m. 7. Se retira con cuidado el exceso de sobrenadante que contiene el colorante no ligado. 8. Se lava tres veces con PBS/BSA el pellet de células marcadas. En la últim a cen­ trifugación el sobrenadante debe quedar incoloro. Si la lectura en el citómetro es inmediata, se pueden lavar las células solamente con PBS, sin BSA. 9. Se resuspenden las células marcadas en 1,5 mi de PBS/BSA (o solo PBS, si la lectura es inmediata). 10. Se leen en el citómetro de flujo las muestras y controles, con adquisición de 15.000 eventos. Se hace un gate para los eritrocitos en log forward scatter (FS)/log side scatter (SS). 11. Se determina la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las muestras y con­ troles en FL1 (fluorescencia verde). Cálculo del resultado: Los resultados deben expresarse como la razón de las MFI obtenidas en las muestras y los controles normales: _ . MFI de la muestra Razón= ------------------------------------MFI media de los 6 controles

Valores de referencia e interpretación del resultado En general, el punto de corte para el diagnóstico de EH es de 0,8. Sin embargo, cada laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia para cada citómetro de flujo utilizado, así como su punto de corte para el diagnóstico de la EH y la respectiva sensibilidad y especificidad de la técnica. Las causas de error más frecuentes son el deterioro de las muestras y/o del EMA, por conservación inadecuada, y la demora entre la preparación de las muestras y la lectura en el citómetro de flujo.

Electroforesis de proteínas de m em brana eritrocitaria El estudio de las proteínas de la membrana por electroforesis en en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), con cuantificación por densitometría, permite un

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGURA 18-11. Electroforesis de proteínas de la membrana eritrocitaria (SDS-PAGE): método Laemmli (electroforesis de gradiente lineal) y método Fairbanks (electroforesis de gradiente exponencial). (Por cortesía de Helena Almeida, Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra.) análisis cuantitativo y/o cualitativo de las principales proteínas estructurales: a y 0-espectrinas, anquirina, banda 3, proteína 4.1, proteína 4.2, actina, estomatina y glucoforinas. Es una técnica muy sensible, que requiere un procedimiento muy estricto y que solo está al alcance de laboratorios especializados. En la inmensa mayoría de los casos, este estudio no es necesario para el diagnóstico, pero es muy útil para elucidar casos más complejos de EH, ElipH o EstH. En la CDA tipo II la banda 3 es más estrecha y tiene una migración más rápida de la normal en SDS-PAGE, debido a una m enor glucosilación. En los raros casos en que son necesarios estudios moleculares (p. ej., si estuviera indicado el diagnóstico prenatal, o en el estudio de proteínas de m embrana por SDSPAGE) es imprescindible la identificación de la proteína afectada. Son dos los métodos comúnmente empleados: la electroforesis de gradiente lineal (5-15%), según Laemmli, y la electroforesis de gradiente exponencial (3,5-17%), según Fairbanks (fig. 18-11).

Muestra de sangre total Se toma una muestra de 2-5 mi de sangre en EDTA. Se conserva a 4 °C y se hace la extrac­ ción de las membranas de los eritrocitos en las 48 h posteriores a la recogida de la muestra. Para cada electroforesis se deben analizar cuatro m uestras control además de la muestra del paciente.

Método Los métodos de Laemmli y de Fairbanks comparten el procedimiento, aunque difieren en los reactivos y las concentraciones utilizadas. Se describen a continuación, indicando las variantes correspondientes para cada uno de los métodos. Los procedimientos comprenden: 1. Extracción de las proteínas de m embrana por lisis hipotónica. 2. Cuantificación de las proteínas por el método de Lowry. 3. Solubilización de las proteínas. 4. Electroforesis en SDS-PAGE de gradiente lineal y exponencial (según Laemmli y Fairbanks). 5. Coloración, fijación y tinción de la placa de electroforesis con azul de Coomassie. 6. Cuantificación de las fracciones proteicas mediante densitometría.

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

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Preparación del tampón P 0 4 500 mM a pH 8 necesario a extracción, cuantificación y solubilización de las proteínas de la membrana: • Tampón P 0 4 (500 mM, pH 8): • Na2H P 0 4 500 mM, 71 g. • H20 destilada, 900 mi. • Ajustar el pH 8 con un fosfato ácido NaH2P 0 4. H20 , 500 mM/1: • H20 destilada, c.s.p. 1.000 mi.

Extracción de las proteínas de membrana por lisis hipotónica Reactivos Se preparan 30 m in antes y se guardan en hielo. • Tampón A: tampón de lavado (PBS): • Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,2 mi. • NaCl 1,5 M, 20 mi. • H 20 bidestilada, c.s.p. 200 mi. • Tampón B: tam pón de lisis: • Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,1 mi. • PMSF 200 mM, 150 |xl. • H 20 bidestilada, c.s.p. 100 mi. • Solución de PMSF (fenilmetano sulfonil fluoruro) 200 mM: • PMSF (PM 174,2), 0,871 g/25 m i de etanol absoluto. • Se guarda en alícuotas a -2 0 °C. • Tampón C: tampón de lavado de m embranas (P 0 4Na 5 mM pH 8): • Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,2 mi. • H 20 bidestilada, c.s.p. 200 mi.

Procedimiento 1. Lavado de los eritrocitos. Se lavan los eritrocitos tres veces con el tam pón A (10 min/10.000 r.p.m. a 4 °C). 2. Preparación del hemolizado: (a) Se toma 1 ml del concentrado de eritrocitos (previamente lavado y agitado en vórtex) y se añade a 20 mi de tam pón de lisis (tampón B) a 4 °C para que se produzca una lisis hipotónica (proporción exacta). (b) Se agita en el vórtex. Se deja durante 10 min a 4 °C (hielo). (c) Se centrifuga a 15.000 r.p.m. a 4 °C durante 10 min. (d) Se retira suavemente el sobrenadante procurando no alterar la capa de mem­ branas que se ha formado. 3. Lavado de las membranas. Se lavan las membranas tres veces consecutivas me­ diante tam pón fosfato (P 0 4) 5 mM (tampón C). En la última centrifugación las membranas deben quedar como una pastilla blanca de precipitación en el fondo del tubo. En el último lavado se debe aspirar muy bien el tampón. Se guardan las membranas en alícuotas a —80 °C.

Cuantificación de las proteínas por el método de Lowry La concentración proteica de las membranas se determina mediante el método colorimétrico de Lowry utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como estándar. En presencia de iones de cobre (Cu2+) y reactivo de Folin las proteínas adquieren color con una intensidad proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra. Los reactivos se encuentran estandarizados comercialmente en el Protein Assay Lowry membranes Kit.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 18-3. Elaboración de la curva de calibración para la medida de la concentración de proteínas Tubos H 20 bidestilada BSA mg/ml Solución A + S Solución B (reactivo de Folin) Proteínas (concentración final mg/ml)

0

1

50 (xl 0 |xl 250 (xl 2 mi 0

40 |xl 10 |xl 250 |xl 2 mi 10

2 30 |xl 20 |xl 250 |jl1 2 mi 20

3

4

20 m-1 30 n,l 250 jjlI 2 mi 30

10 |xl 40 |xl 250 |jl1 2 mi 40

Reactivos • Solución de trabajo (A + S): p or cada mililitro de solución alcalina de tartrato de cobre (solución A) se añaden 10 (jlI de solución surfactante (solución S). • Solución de trabajo B: reagente de Folin. • Seroalbúmina bovina (BSA).

Procedimiento 1. Se hace u n a curva de calibración con diferentes concentraciones de BSA (tabla 18-3). 2. Cada muestra se prepara por duplicado (tabla 18-4). 3. Se agitan los tubos suavemente. 4. Se incuba a tem peratura ambiente durante un m ínim o de 15 min. El color es estable hasta 2 h. 5. Se lee la absorbancia a 730 nm. 6. Se extrapolan los valores de absorbancia obtenidos en la curva de calibración para obtener las concentraciones proteicas de las muestras.

Solubilización de las proteínas Todas las muestras cuantificadas se equiparan a una misma concentración proteica de 1 mg/ml. Para cada 100 |xg de proteína se añadirán 21 jjlI de medio de solubilización (MS). El volumen de tam pón P 0 4 5 mM que se debe añadir será igual a: Q(cantidad de proteínas)-(volum en de la muestra+ volumen MS)

Reactivos • Medio de solubilización (MS): • Dodecil sulfato sódico (SDS) al 20% EDTA 10 mM, 4.000 |xl. • Azul de bromofenol al 1%, 400 |xl.

TABLA 18-4. Preparación de las muestras

H 20 bidestilada Membranas (agitadas suavemente) Solución A + S Solución B (reactivo de Folin)

Membranas

Blanco

40 |jl1 10 |xl 250 |xl 2 mi

50 |xl — 250 |¿1 2 mi

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

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• Glicerol (87-99%), 4.000 \ú. • Ditiotreitol (DTT), 520 mg. • Se mezcla bien y se distribuye en alícuotas de 500 |xl. Se congela a -20 °C. Ejemplo: Para 112 |xg de proteína se pondrán 23,5 |xl de MS y un volumen de 70 |xl de muestra. El volumen de tam pón se calcula del siguiente modo: Volumen de tampón P 0 4(5 mM) = 112 - (70 + 23,5) = 18,5 (il Procedimiento Para los Eppendorf con las membranas extraídas (muestras y controles) se pipetean los volúmenes tam pón P 0 4 5 mM y de MS calculados. Se homogeniza, se llevan las muestras a ebullición durante 3 m in para realizar la desnaturalización proteica y se colocan de inmediato en hielo para evitar la desnatu­ ralización. Se reparten en alícuotas y se guardan a —80 °C hasta el mom ento de realizar la elec­ troforesis. Electroforesis en gel de poliacrilam ida (SDS-PAGE) de gradiente lineal y exponencial (según Laemmli y Fairbanks) Reactivos • Acrilamida-bisacrilamida, 30:0,8 (Laemmli): • Acrilamida, 60 g. Bisacrilamida, 1,6 g. • H20 , c.s.p. 200 mi. • Se filtra y se conserva a 4 °C en botella oscura. • Solución tampón Tris 1,5 M pH 8,8 (gel separating de Laemmli): • Tris, 18,16 g. • H20 , 80 mi. • Se ajusta el pH a 8,8 con HC1 concentrado. • SDS, 0,4 g. • H20 , c.s.p. 100 mi. • Se disuelve en baño maría con agitación. • Solución tampón Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (gel staking de Laemmli): • Tris, 6,05 g. • H20 , 60 mi. • Se ajusta el pH a 6,8 con HC1 concentrado. • SDS, 0,4 g. • H20 , c.s.p. 100 mi. • Se disuelve en baño maría con agitación. • Sacarosa (Fairbanks): • Sacarosa, 500 mg. • Acrilamida-bisacrilamida (40:1,5) (Fairbanks): • Acrilamida, 40 g. • Bisacrilamida, 1,5 g. • H20 bidestilada, c.s.p. 100 mi. • Se filtra y se conserva a 4 °C en botella oscura.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• Peroxodisulfato de amonio (PSA) 10%: • PSA, 0,1 g. • H20 , c.s.p. 1 mi. • Se guarda en un Eppendorf durante un máximo de 5 días. • Solución A (solución tamponada de migración 10X, según Fairbanks): • Tris 40 mM, 48,456 g. • CH3COONA 20 mM, 16,406 g. • EDTANa2 2 mM, 7,445 g. • H20 , c.s.p. 900 mi. • Se ajusta el pH a 7,4 con C 0 3C 0 0 H . • H20 bidestilada, c.s.p. 1.000 mi. • Se guarda en la nevera a 4 °C. • Solución B (solución A + SDS) (preparación extemporánea): • Solución A, 80 mi. - SDS, 2 g. - Se agita y se deja en el microondas 2 min hasta su disolución completa. - Tampón, c.s.p. 100 mi. • Solución tamponada de migración 10 X, según Laemmli: • Tris 0,177 M, 21,4 g. • Glicina 1,92 M, 144 g. • H20 , 1.000 mi. • Se disuelve la glicina en 600 mi de H20 en baño maría durante 30 min. • Se disuelve el Tris en 400 mi de H 20 . • Se mezcla un mismo volumen de ambas soluciones (Tris-glicina) y se añaden 10 g de SDS. Este tampón de migración se diluye hasta 1X en el momento de hacer la electroforesis. • Solución tamponada de migración IX , según Fairbanks: • Solución B, 80 mi. • H20 , c.s.p. 800 mi. • Se conserva a temperatura ambiente.

Procedimiento • Se lavan m uy bien las placas de cristal pequeñas. • Se pasan por alcohol a 70 °C, se secan y luego se limpian con agua destilada. Se ubican las placas de cristal en sus soportes, de manera que entre las mismas quede un espacio para la fabricación del gel. • Se introducen en las dos columnas del Gradient Former las mezclas de acrilamida (del 5 y el 15% para la electroforesis de Laemmli y del 3,5 y el 17% para la electroforesis de Fairbanks), que se prepararán como se muestra en las tablas 18-5 y 18-6. TABLA 18-5. Gel de gradiente lineal, según Laemmli Reactivos H 20 Acrilamida-bisacrilamida 30:0,8 Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Total PSA 10% Temed

Sol. 5% (mi) 2,4 0,6 1 4 10 |xl 4,5 |jl1

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Sol. 15% (mi) 1 2 1 4 10 (xl 4,5 |xl

Capítulo 18

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Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

TABLA 18-6. Gel de gradiente exponencial (4,5-17%), según Fairbanks Reactivos H20 Acrilamida-bisacrilamida 40:1,5 Tampón 10 X SDS 2% (solución B) Sacarosa Total PSA 10% Temed

Sol. A 3,5% (mi) 4,65 675 |xl 600 |il —

6 100 |xl 3,5 |xl

Sol. B 17% (mi) 1,3 1,4 mi 330 |xl 500 mg 1,05 15 |xl 1 |xl

• En el fondo de cada una de las dos columnas del Gradient Former se colocará un imán pequeño para poder agitar las acrilamidas. • Se coloca en cada columna el PSA y el Temed (tetrametiletilenodiamina) y rápida­ mente se monta la placa regulando el volumen al abrir el grifo que pone en contacto las dos columnas. Una vez colocada la acrilamida dentro de la placa se pone H20 y se espera a que polimerice antes de poner el gel stacking. • Se elimina el H20 y se seca la parte de arriba de la placa con papel de filtro 1 MM. • Se añade el gel stacking (cuadro 18-3) con una pipeta Pasteur encima del gel de separación e inmediatamente se pone el peine. Esperar a que polimerice. • Se retira el peine. Se monta el gel en el sistema para electroforesis. • Se dispensa el tampón de migración, que es distinto para cada tipo de electroforesis. • Se realiza una premigración, sin muestras, durante 15 m in a 100 V para la elec­ troforesis de Laemmli. • Se aplican 8 |xl de cada m uestra y un marcador de migración para proteínas (low range: 102-20 kDa) en los diferentes pocilios. Se deja migrar 30 min a 100 V, período en el cual las muestras pasarán del gel stacking al de separación. Una vez finalizada esta etapa, se realiza la separación de las proteínas a 200 V durante 140 m in (solo en la electroforesis Laemmli).

CUADRO 18-3. Preparación del gel stacking Según Laemmli • HzO, 1,58 mi • Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8): 275 |xl • Tris-HCl 0,5 M: 650 |xl • Total: 2,5 mi • PSA 10%: 12,5 p.1

• Temed: 4,5 |xl Según Fairbanks • Gel stacking al 3,6% • H20 bidestilada: 1.975 mi • Acrilamida-bisacrilamida (40:1,5): 225 mi • Tampón Fairbanks 10X + SDS al 2%: 250 mi • PSA al 10%: 18,5 m-1 • Temed: 6 |xl

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

• En la electroforesis según Fairbanks, la migración es siempre a 90 V durante 120 min. • Finalizada la electroforesis, se para la fuente de alimentación y se retira el gel de los dos cristales eliminando el stacking gel.

Coloración, fijación y tinción de la placa de electroforesis con azul de Coomassie Reactivos • Azul de Coomassie: • Azul de Coomassie, 0,125 g. • Ácido acético, 25 mi. • Isopropanol, 62,5 mi. • H20 , c.s.p. 250 mi. • Se agita hasta una completa disolución. • Se filtra y se guarda en botella oscura. • Solución de descoloración I: • Alcohol isopropílico, 125 mi. • Ácido acético glacial, 50 mi. • H20 bidestilada, c.s.p. 500 mi. • Solución de descoloración II: • Alcohol isopropílico, 50 mi. • Ácido acético glacial, 50 mi. • H20 bidestilada, c.s.p. 500 mi. • Solución de descoloración III: • Ácido acético glacial, 50 mi. • H20 bidestilada, c.s.p. 500 mi. Procedimiento Coloración y fijación del gel: se coloca la placa de acrilamida en la solución fijadora y colorante durante 10-24 h en agitación a temperatura ambiente. • Decoloración del gel: se coloca el gel durante 45 min en cada una de las soluciones de descoloración (solución I, II y III), a tem peratura ambiente y en agitación, para producir su decoloración total. • Después de la decoloración, los geles se reposan en agua hasta su cuantificación mediante densitometría. •

Cuantificación de las fracciones proteicas mediante densitometría Se procede a la lectura de los geles a 570 nm con un densitómetro, en función de la densidad óptica de las diferentes bandas. La intensidad de la tinción es proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra. La integración del área de cada pico o banda se utiliza para calcular la cantidad de proteína, expresada como porcentaje relativo.

Interpretación del resultado Los porcentajes relativos de cada una de las proteínas de m em brana eritrocitaria del paciente se comparan con los intervalos de normalidad (X ± 2DE) determinados a partir de los cuatro controles que se hacen m igrar paralelamente en cada gel. La cuantificación de las proteínas de la membrana eritrocitaria constituye un com ­ plemento de gran importancia en el estudio de las membranopatías hereditarias. Gracias a ello, puede identificarse la proteína m utada e iniciarse el estudio molecular del gen implicado.

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Capítulo 18

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Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

Prueba de estabilidad térm ica eritrocitaria La m embrana del eritrocito resiste a aumentos de temperatura que pueden llegar a los 49 °C. Si se sobrepasa este límite se inicia un proceso de desestructuración y fragmenta­ ción que origina microesferocitos y eritrocitos fragmentados (poiquilocitos). La PPH es una anemia hemolítica congénita rara que se caracteriza por presentar numerosos microesferocitos y piropoiquilocitos en el frotis de sangre periférica. Es debida a alteraciones que causan una disrupción grave en la red de espectrina de la membrana eritrocitaria. Estos eritrocitos tienen una sensibilidad aumentada al calor, la cual puede comprobarse con la prueba de estabilidad térmica eritrocitaria. Este es un método sencillo que puede ser realizado en cualquier laboratorio medianamente dotado.

Muestras, equipamiento y reactivos • • • •

Sangre total reciente (paciente y control) tratada con EDTA-K3. Baño maría de precisión (para pequeñas variaciones de temperatura). Microscopio óptico. Solución am ortiguadora o tam pón I (cacodilato 0,15 mol/1): se disuelven 3,21 g de sodio-cacodilato hasta 100 mi de agua, ajustando la solución a un pH de 7,4 mediante HCI 2N. La osmolaridad final debe estar entre 265-300 mOsm (se ajusta cuidadosamente con solución de sacarosa). • Solución amortiguadora o tampón II (cacodilato 0,05 mol/1): se disuelven 1,07 g de sodiocacodilato hasta 100 mi de agua ajustando la solución a un pH de 7,55 mediante HCI 2N. • Solución de glutaraldehído: extemporáneamente se diluyen 9,2 mi de tam pón II en 0.8.mi de solución madre de glutaraldehído.

Método 1. Se incuba una suspensión de 400 |xl de sangre total (paciente y control) en 2 mi de tampón I a 46,47,48 y 49 °C durante 15,30 y 60 min. 2. Para cada temperatura analizada se preparan tres tubos que contengan 0,5 m i de solución de glutaraldehído. 3. A cada tubo se añaden 100 |xl de la suspensión de sangre total incubada, una vez transcurrido el tiempo correspondiente (15, 30,60 min). 4. Una vez finalizada la incubación, se coloca una gota de cada una de las suspensio­ nes de sangre total incubada, y de la correspondiente al tiempo 0, en portaobjetos y se cubren con lamelas. 5. Se observan al microscopio óptico para valorar la morfología de los eritrocitos (torocitos, torocitos espiculados y eritrocitos fragmentados). Los valores obtenidos se expresan según el esquema indicado en la tabla 18-7.

TABLA 18-7. Prueba de la fragmentación térmica en una muestra normal

Temperatura

Tiempo (min)

Torocitos (%)

46 °C

15 30 60 30 60

63,5±0,2 67,5±9,2 68,2±9,5 49,4±13,6 26,0±7,5

49 °C

Torocitos espiculados (%)

Eritrocitos fragmentados (%)

_ — —

_ — —

26±14,3 19,9±9,3

21,1+10,3 59,4111,3

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

FIGU RA 18-12. Imagen de eritrocitos fragmentados a 46 °C (en un caso de piropoiquilocitosis hereditaria).

Interpretación del resultado En la PPH es característica la disminución de la estabilidad térmica de la m embrana eritrocitaria y, p o r tanto, se observan eritrocitos fragm entados a la tem peratura de incubación de 46 °C (fig. 18-12). La estabilidad térmica de los eritrocitos se halla sensiblemente aumentada en la XH, una anem ia hemolítica rara debida a un trastorno de la perm eabilidad iónica de la membrana de los eritrocitos, cuya consecuencia es un gran aumento de la permeabilidad pasiva al sodio y potasio con deshidratación de los eritrocitos.

Evaluación de la perm eabilidad de la m em brana eritrocitaria al sodio (Na+) y potasio (K+) La membrana eritrocitaria desempeña una función crucial en la regulación del volumen de la célula. Muchas de las proteínas están implicadas en la homeostasis de los cationes y, consecuentemente, en la cantidad de agua en la célula. La pérdida de capacidad de regular su volumen compromete el desempeño del eritrocito y reduce su vida media. Un aumento intracelular de Na+ y K+, que se acompaña de un aumento de la cantidad de agua, lleva a un aumento de volumen de la célula, en cuanto que la pérdida de Na+ y K+deshidrata la célula, con la consecuente diminución del volumen del eritrocito. Las enfermedades congénitas de la m em brana eritrocitaria con trastornos en el transporte iónico transmembranoso presentan dos fenotipos distintos: estomatocitosis hereditaria deshidratada (xerocitosis) y estom atocitosis hereditaria hiperhidratada (hidrocitosis). Algunos fenotipos de características intermedias pueden ser agrupados en tres subtipos: criohidrocitosis, seudohiperpotasemia y xerocitosis estomatocítica. La cuantificación de Na+ y K+ intraeritrocitarios y la medida de la permeabilidad de la membrana eritrocitaria al Na+ y K+suelen ayudar al diagnóstico de las enfermedades de permeabilidad de la membrana eritrocitaria.

Concentración desodio (Na+) y potasio (K+) intraeritrocitarios Equipam iento • • • •

Tubos Greiner de 50 mi estériles. Tubos Greiner de 10 ml estériles. Capilares de hematocrito. Fotómetro de llama Eppendorf® ELEX 6361.

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Capítulo 18

• • • • •

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

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Centrífuga refrigerada. Pipetas automáticas: P-1000, P-100 y P-20. Centrífuga de hematocrito. Baño maría. Agitador de tubos vórtex.

Reactivos • • • • • • •

Sacarosa. Cloruro de magnesio (MgCl,). Cloruro de litio (LiCl). Cloruro de potasio (KC1). MOPS-Tris. Ouabaína. Bumetanida.

Recogida y procesamiento de la muestra 1. Se extraen 10 mi de sangre venosa en un tubo heparinizado y se centrifuga a 1.750 rpm durante 15 min, a 4 °C, con el fin de eliminar el plasma y la capa leucocitaria. 2. Se efectúan tres lavados de 10 min cada uno a 4 °C y 1.750 rpm con una solución de MgCl2 110 mM. 3. Se resuspende el paquete de eritrocitos en u n a solución am ortiguadora de Mg2+-sacarosa a pH 7,4 y osmolaridad 295 ± 5 mOsm que contenga (mM): 75 MgCl2, 85 sacarosa, 10 MOPS-Tris y 10 glucosa hasta conseguir un hematocrito del 20 al 25%.

Método 1. Se añaden 4 mi de agua bidestilada a 100 (jlI de la suspensión de eritrocitos explicada en el apartado anterior. 2. Se lee el contenido catiónico del lisado en el fotómetro de llama. 3. Se multiplica el resultado obtenido por el siguiente factor corrector (Fe):

Hto inicial donde el hematocrito (Hto) es de la suspensión de eritrocitos. 4. Se expresa el resultado en mmol/1.

Medida de la permeabilidad de la membrana eritrocitaria al sodio (Na+) y al potasio (K+) Principio La determinación de los sistemas de transporte a través de la membrana eritrocitaria se realiza mediante la técnica de Garay et al. modificada (I. Besson), siguiendo el esquema representado en la figura 18-13.

Método 1. Se preparan cuatro soluciones de Mg2+-sacarosa de 25 mi cada una que contengan (mM): 2 KC1 (solución 1), 0,1 ouabaína (solución 2), 0,1 ouabaína y 0,02 bum e­ tanida (solución 3); y 0,1 ouabaína, 0,02 bumetanida y 10 LiCl (solución 4).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

[

H

a

s

s

1

1-2

2-3

3

3-4

Flujo total

Flujo activo

Cotransporte

Flujo pasivo

Contratransporte

FIGU RA 18-13. Esquema del método para determinar los sistemas de transporte transmembranoso de Na+y K+.

2. Se prepara una batería de 16 tubos de 10 mi, de tal m anera que haya cuatro para cada solución: dos para el tiempo 0 m in (t0) (soluciones 1 ,2 ,3 y 4), dos para el tiem po 30 m in (t30) (solución 1) y dos para el tiempo 60 m in (t60) (soluciones 2, 3 y 4). 3. Se coloca la batería de tubos en una bandeja con hielo picado y agua y se añade a cada uno de ellos 1 mi de la solución correspondiente y 250 |xl de la suspensión de eritrocitos. Es importante m antener siempre cubiertos los tubos abiertos con papel de filtro, así como los tapones, para evitar la posible contaminación de Na+ del ambiente. 4. Se agitan rápidamente los tubos en el vórtex y se depositan los t30y t60 para incubar en el baño maría a 37 °C. 5. Se centrifugan rápidamente los ocho tubos t0 a 1.750 g durante 5 min, a 4 °C; se recoge el sobrenadante y se guarda a 4 °C. 6. Pasado el tiempo de incubación (30 m in para los dos tubos de la solución 1, y 60 min para los seis de las soluciones 2,3 y 4), se depositan los tubos durante 2 min en la bandeja de hielo picado y agua para detener la actividad de los sistemas de transporte, y se procede igual que para los tubos 4 y 5. 7. Los sobrenadantes de los 16 tubos se leen inmediatamente o se conservan durante 1 semana a 4 °C. La lectura se realiza a temperatura ambiente.

Cálculo del resultado Para calcular la intensidad de los flujos catiónicos (FC) debe aplicarse la siguiente fórmula: „ D cat x (1 - Hto final) F C = --------------------------Hto final donde D cat es la diferencia entre la concentración catiónica después de incubar a 37 °C y a tiempo cero. El hematocrito final se calcula del siguiente modo:

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

531

TT . . l-(H toinicial/100) H to final = (Hto inicial/100) De esta forma: La actividad de la ATPasa Na+, K+ se calcula restando el flujo de Na+ en presencia (solución 2) y ausencia (solución 1) de ouabaína. La actividad del cotransporte Na+, K+se obtiene mediante la diferencia entre el flujo de Na+obtenido en presencia de ouabaína con (solución 3) y sin (solución 2) bumetanida. La actividad del contratransporte Na+, Li+ se obtiene mediante la diferencia entre el flujo de Na+ de la solución 4 del obtenido en la 3. Los flujos pasivos de Na+y K+ son los que se obtienen directamente de la solución 3. Los resultados se expresan en |xmol/l.cel. En la figura 18-13 se resume un esquema de esta técnica.

Pruebas de hem ólisis para el diagnóstico de hem oglobinuria paroxística nocturna La hem oglobinuria paroxística nocturna (HPN) es un síndrom e hemolítico secun­ dario a un defecto adquirido de la m em brana eritrocitaria, p o r el que los eritrocitos presentan un aum ento de la sensibilidad a la acción lítica del complemento (C3b). Es u na enfermedad rara de la célula m adre pluripotente o stem cell, que afecta todas las líneas celulares y presenta tres características clínicas que varían de paciente a paciente y en el curso de la enfermedad: 1. Hemólisis intravascular m ediada p or complemento, con hemoglobinuria noc­ turna (25% de los pacientes) y hemosiderinuria. 2. Trombofilia o hipercoagulabilidad. 3. Insuficiencia de la médula ósea. La H PN resulta de una mutación somática en el gen PIGA, localizado en el brazo corto del cromosoma X, que causa déficit parcial o total de las proteínas normalmente ancladas a la m embrana celular vía glicofosfatidilinositol (GPI). Aunque más de 20 de estas proteínas se expresen en las células hematopoyéticas, el déficit de CD55 (factor acelerador de la degradación [DAF]) y de CD59 (inhibidor de la lisis de mem brana [MIRL]) son los responsables de la anemia hemolítica. Los eritrocitos desprovistos de CD55 y CD59 sufren hemólisis intravascular espontánea por la activación descontrolada de la vía alternativa del complemento. La forma clásica de HPN presenta anemia hemolítica con hemoglobinuria nocturna, ictericia y hemosiderinuria, y frecuentemente trombosis venosas. La gravedad del cuadro clínico depende de la intensidad de la hemólisis, del fallo m edular y de la frecuencia e intensidad de los fenómenos trombóticos venosos. La HPN puede surgir como fenómeno asociado a otros síndromes de insuficiencia medular. En el desarrollo de la HPN se ha demostrado que existen eritrocitos con gran sensi­ bilidad a la lisis por acción del complemento (HPN tipo III, 10-15 veces la normal), con sensibilidad mediana (HPN tipo II, 3-5 veces la normal) y con sensibilidad normal (HPN tipo I). La intensidad de la anemia hemolítica de un paciente está directamente relacionada con el porcentaje de eritrocitos más susceptibles a la lisis que posee en cada momento. La elevada sensibilidad de los eritrocitos HPN al complemento puede ponerse de ma­ nifiesto mediante la activación de la vía alternativa del C3 por diferentes procedimientos in vitro, tales como la prueba de la hemólisis en medio ácido, o prueba de Ham-Dacie, y la prueba de la sacarosa.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

La cuantificación de la expresión de las proteínas unidas a grupos fosfatidil inositol (GPI), utilizando anticuerpos monoclonales y citometría de flujo, se considera la mejor metodología para diagnosticar y realizar la monitorización o seguimiento de la HPN. La citometría de flujo tiene la ventaja, sobre los métodos clásicos, de perm itir no solo identificar, sino cuantificar el número de células HPN, lo que facilita el seguimiento de la enfermedad mediante determinaciones periódicas de las proteínas CD55 y CD59. Además, permite realizar el estudio en leucocitos (monocitos y neutrófilos), que puede ser más informativo que el análisis de los eritrocitos, porque estos sufren una hemólisis selectiva; por otro lado, evita los inconvenientes de analizar a pacientes sometidos a transfusiones. Las bases técnicas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo se explican en el capítulo 10.

Prueba de lisis en el suero acidificado (prueba de Ham) El complemento, al unirse al complejo antígeno anticuerpo en la superficie de los eritrocitos, favorece la lisis celular. Esta acción lítica del complemento resulta favorecida por un descenso del pH del medio (6,5-7) o de la fuerza iónica. En los eritrocitos normales la acción lítica del complemento no se desarrolla, ni aun en presencia de suero acidificado, pero en los eritrocitos HPN basta una pequeña disminución del pH del medio para que sobrevenga la hemólisis. En una form a rara de anem ia hereditaria (CDA-II HEMPAS [m ultinuclearidad eritroblástica hereditaria con positividad en suero acidificado]), los eritrocitos solo hemolizan cuando son incubados en algunos sueros normales acidificados, pero no en presencia del suero propio. El mecanismo de la hemólisis en medio ácido difiere del de la HPN, ya que es debido a la presencia, en un porcentaje de sueros normales (~30% ), de un anticuerpo IgM (anti-HEMPAS) que reacciona con un antígeno presente en la m embrana eritrocitaria de los pacientes con CDA tipo II. En presencia de HEMPAS, la prueba de la sacarosa es negativa, y la expresión de las proteínas unidas a GPI normal. M uestras • Eritrocitos del paciente obtenidos de sangre desfibrinada, heparinizada, oxalatada o con EDTA. Si la sangre se ha mantenido estéril a 4 °C en ACD, la prueba puede rea­ lizarse incluso después de algunos días de la extracción. Los reticulocitos son mucho más sensibles que los eritrocitos maduros a la lisis en medio ácido, por lo que algunos autores han sugerido aum entar la sensibilidad del método empleando solamente la capa eritrocitaria correspondiente a la parte superior del paquete eritrocitario cen­ trifugado, debido a su mayor contenido en reticulocitos. • Suero o plasma del paciente y de un sujeto control isogrupo. Los sueros deben ser obtenidos por desfibrinación, para que no haya lisis, aunque el suero control también puede ser obtenido de sangre que haya coagulado espontáneamente a temperatura ambiente o a 37 °C. Los sueros deben ser recientes, aunque pueden conservarse a -70 °C sin que pierdan su poder lítico en el curso de varios meses. Si es posible, se debe procesar en paralelo una muestra de células conocidas de HPN, como control positivo. M étodo Para realizar la prueba de Ham-Dacie se necesitan seis tubos de hemólisis que se enu­ meran del 1 al 6. 1. Se depositan 0,5 mi de suero fresco normal, del grupo AB o ABO compatible con la sangre del paciente en los 6 tubos.

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Capítulo 18

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Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

2. Los tubos 1 ,2 ,4 y 5 se mantienen a temperatura ambiente. 3. Los tubos 3 y 6 se introducen en un baño maría a 56 °C durante 30 min con el fin de inactivar el complemento. 4. Se añade a los tubos 2 ,3 ,5 y 6 0,05 m l de HCI, 0,2 mol/1. 5. Se colocan todos los tubos a 37 °C. 6. A los tubos 1, 2 y 3 se añaden 0,05 mi de una suspensión al 50% (en solución salina) de eritrocitos lavados del propio paciente. Se mezcla cuidadosamente y se coloca a 37 °C durante 1 h. 7. A los tubos 4, 5 y 6 se añaden 0,05 mi de una suspensión al 50% (en solución salina) de eritrocitos normales de control lavados. Se mezcla cuidadosamente y se coloca a 37 °C durante 1 h. 8. Se centrifuga y se observa si hay hemólisis.

Interpretación del resultado (tabla 18-8) La muestra de células normales de control no presentará üsis en ninguno de los tres tubos (4,5 y 6). En un paciente con HPN se observará lisis bien definida, aunque incompleta, en el suero acidificado (tubo 2). Una lisis mucho menor, o incluso inexistente, se podrá observar en el suero no acidificado (tubo 1). No deberá haber ninguna lisis en el suero acidificado inactivo (tubo 3); si se observa alguna lisis el test no puede ser considerado positivo. Si la prueba es positiva utilizando suero norm al, es im portante testar con suero del paciente para excluir la CDA tipo II o HEMPAS. En esta patología, la prueba de Ham-Dacie es positiva solo cuando los eritrocitos del paciente se enfrentan con un determinado núm ero (aproximadamente 30%) de sueros isogrupo acidificados, pero nunca con el propio suero. No todos los eritrocitos del paciente tienen igual susceptibilidad a la lisis por com ­ plemento, ni siquiera en las mejores condiciones del test. La variación en el grado de hemólisis se debe al carácter heterogéneo de la población eritrocitaria, con diferentes porcentajes de eritrocitos más sensibles o menos sensibles a la hemólisis en medio ácido. El predominio de una u otra población puede variar de forma importante en el curso de la enfermedad, por lo que la intensidad de la hemólisis puede ser diferente según su m om ento evolutivo. Incluso puede existir la negativización de la prueba si, en el momento en que se practica, el núm ero de eritrocitos HPN es muy escaso.

Prueba de la sacarosa La prueba de la sacarosa es menos sensible y menos específica para el diagnóstico de HPN que la hemólisis en medio ácido. La lisis eritrocitaria en presencia de sacarosa se

TABLA 18-8. Prueba de la lisis en suero acidificado Reactivos

Prueba (mi)

Tubos

1

2

Suero normal fresco Suero normal inactivado (56 °C) HCI, 0,2 mol/1 Hematíes del paciente (50%) Hematíes normales (50%) HPN-lisis

0,5

0,5

Controles (mi) 3

4

5

0,5

0,5 —

0,05 0,05

0,5 0,05 0,05

—

0,05 —

—

—

0-+

+++

0

— —

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6

—

0,05

0,5 0,05

—

—

—

0,05 0

0,05 0

0,05 0

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

basa en el principio de que los eritrocitos fijan el complemento sérico en presencia de solutos de baja fuerza iónica (sacarosa), p or lo que, si se trata de eritrocitos HPN, se facilitará la hemólisis.

Muestras y método 1. 2. 3. 4.

Sangre total del paciente mantenida incoagulable en oxalato cálcico o ACD. Sangre control (no necesariamente isogrupo) recientemente extraída. Solución isotónica de sacarosa (92,4 g/1). En dos tubos (paciente y control) de hemólisis se introducen 1,8 mi de la solución de sacarosa. 5. En el tubo del paciente se añaden 0,2 mi de sangre total y en el tubo control 0,2 mi de una sangre control recientemente extraída. 6. Se agitan suavemente ambos tubos y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 30 min. 7. Se centrifugan los tubos y se observa la aparición de hemólisis.

Interpretación del resultado La prueba es positiva cuando se observa aparición de hemólisis en el tubo del paciente. Es casi siempre positiva en la H PN , especialmente cuando existe positividad de la prueba de Ham-Dacie. El grado de positividad puede variar ampliamente (entre 10 y 80% de hemólisis) e incluso, en ocasiones, ser negativo, aun en presencia de HPN. En el HEMPAS, por el contrario, esta prueba es siempre negativa. En ciertas hemopatías puede observarse una ligera positividad de la prueba de la sacarosa, con negatividad de la prueba de Ham-Dacie. No obstante, en estos casos no puede hablarse de HPN, excepto en el caso en que la prueba de Ham-Dacie se haga finalmente positiva.

LECTURAS RECOMENDADAS An X, M ohandas N. Disorders o f red cell membrane. Br J Haematol 2008;141:367-75. Bain B, Bates I, Laffan M, Lewis S. Dacie and Lewis Practical Haematology. 11th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier; 2012. Barcellini W, Bianchi P, Fermo E, et al. Hereditary red cell m em brane defects: diagnostic and clinical aspects. Blood Transf 2011;9:274-7. Bolton-Maggs PHB, Langer JC, Iolascon A, Tittensor P, King MJ. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis—2011 update. Br J Haematol 2011;156(l):37-49. Bolton-Maggs PHB, Stevens RF, D odd NJ, et al. Guidelines for the diagnosis and m anagement of hereditary spherocytosis. Br J Haematol 2004;126(4):455-74. Borowitz MJ, Craig FE, DiGiuseppe JA, Illingworth AJ, Rosse W, Sutherland DR, et al. Guidelines for the Diagnosis and M onitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria and Related Disorders by Flow Cytometry Cytometry B Clin Cytom 2010;78(4):211-30. Coca A, Garay RP, et al. Disturbances of transm em branous sodium transport systems induced by ethanol in hum an erythrocytes. Am J Hypertens 1989;2(10):784-7. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan DJ. The preparation and chemical characteristics o f hemoglobin-free ghosts o f hum an erythrocytes. Arch Biochem Byophys 1963;100:119-30. Eber S, Lux SE. Hereditary spherocytosis - defects in proteins that connect the m embrane skeleton to the lipid bilayer. Semin Hematol 2004;41:118-41. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DFH. Electrophoresis o f the m ajor polypeptides o f hum an erythrocyte m embrane. Biochemistry 1971;10:2606-17. Gallagher P. Red cell membrane disorders. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 13-8. Gallagher P. Hereditary elliptocytosis: spectrin and protein 4.1R. Semin Hematol 2004;41:142-64.

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

5 3 5 .e l

Autoevaluación 1. La interrupción de las interacciones verticales entre las proteínas del citoesqueleto y la bicapa lipídica es causa de: (a) Esferocitosis hereditaria. (b) Eliptocitosis hereditaria. (c) Ovalocitosis del sudeste asiático. (d) Estomatocitosis hereditaria. (e) Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: a. Respuesta razonada: la interrupción de las interacciones verticales, que implican la espectrina o las proteínas que unen la espectrina a la m em brana, com o la anquirina, la p roteína 4.2 y la banda 3, es causa de esferocitosis hereditaria. Estas alteraciones conllevan la form ación de m icrovesículas m em branosas, que al ser rem ovidas en el sistem a reticu lo en d o telial producen una reducción progresiva de la superficie de la m em brana eritrocitaria originando los esferocitos. 2. En la esferocitosis hereditaria ¿cuál es el déficit de proteína más frecuente? (a) Déficit de espectrina. (b) Déficit de anquirina/espectrina. (c) Déficit de banda 3/proteína 4.2. (d) Déficit de proteína 4.2. (e) Déficit de proteína 4.1. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: la causa más frecuente de EH en la población europea y americana es un déficit de anquirina/espectrina (35-65% ), seguido del déficit de banda 3/proteína 4.2 (15-30%). El déficit aislado de proteína 4.2 es raro en la población europea, pero tiene una elevada prevalencia en Japón. Com o resultado de la estrecha interacción entre estas proteínas, la reducción prim aria de una proteína origina reducciones secundarias de las que le están asociadas. 3. ¿Cuáles son los parámetros esenciales del diagnóstico de esferocitosis hereditaria? (a) Parámetros hematológicos. (b) Recuento de reticulocitos. (c) Observación morfológica de la sangre periférica. (d) Historia clínica del paciente y su familia. (e) Todas las anteriores. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: el diagnóstico de esferocitosis hereditaria se hace con base en los datos de la historia clínica del paciente y su familia, los parámetros hematológicos (incluido el recuento de reticulocitos) y la observación morfológica de la sangre periférica, complementado con una o dos pruebas de laboratorio. 4. ¿Cuáles son los test de laboratorio que en asociación presentan m ejor sensibilidad en el diagnóstico de esferocitosis hereditaria? (a) AGLT y criotest. (b) Criotest y EMA. (c) AGLT y EMA. (d) Fragilidad osmótica y AGLT. (e) Fragilidad osmótica y EMA. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: los test que presentan mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de esferocitosis hereditaria son el AGLT, el criotest y el EMA. Sin embargo, algunos autores demos­ traron que cada uno de estos test por separado no perm ite diagnosticar un núm ero significativo de casos. El AGLT en asociación con el EMA demuestra la mejor sensibilidad en el diagnóstico de EH, incluso en las formas ligeras.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

5. ¿Cuáles son las enfermedades que cursan con alteraciones de la fragilidad osmótica? (a) Esferocitosis hereditaria. (b) Anemia hemolítica autoinmune. (c) Anemia ferropénica. (d) Talasemia. (e) Todas las anteriores. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: enfermedades que cursan con alteraciones de la fragilidad osmótica (FO): 1. AUMENTO DE LA FO: Esferocitosis hereditaria Eliptocitosis hereditaria (FO norm al en las ElipH sin hemólisis) Estomatocitosis hereditaria o hidrocitosis (CMFIC baja) Anemia hemolítica autoinm une Anemia hemolítica microangiopática 2. DISMINUCIÓN DE LA FO: Talasemias Anemia ferropénica Hemoglobinopatía S Hemoglobinopatía C Xerocitosis hereditaria (CMHC elevada) 6. El test de hemólisis en glicerol acidificado (AGLT) es una prueba que evalúa: (a) La susceptibilidad de los eritrocitos a la rotura por frío. (b) La fragilidad osmótica eritrocitaria. (c) La cantidad de banda 3 en la m em brana de los eritrocitos. (d) Todas las anteriores. (e) Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: b. Respuesta razonada: el test de hemólisis en glicerol acidificado es otra prueba de fragilidad eritrocitaria, en que se registra el tiem po (en segundos) que tarda en verificarse el 50% de la hemólisis de los eritrocitos (AGLT50) cuando estos se incuban en una m istura hipotónica acidificada salino-glicerol. El glicerol retrasa el ritm o de entrada de las moléculas de agua en los eritrocitos, lo que perm ite un registro continuo de la hemólisis en el espectrofotómetro. El principio es el m ismo que en el test de fragilidad osmótica: los eritrocitos con disminución de la relación superficie/volumen (esferocitos) resisten menos a la entrada de moléculas de agua que los eritrocitos normales. Esto se aplica a todos los esferocitos, independientemente de que se trate de una EH u otra patología que curse con esferocitos en circulación. 7. El test de EMA suele estar disminuido ¿en qué enfermedades? (a) Anemia diseritropoyética congénita tipo II. (b) Esferocitosis hereditaria. (c) Anemia hemolítica autoinmune. (d) Todas las anteriores. (e) a y b . Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: la evaluación p or citometría de flujo de la fluorescencia de la eosina-5’maleimida (EMA) en los eritrocitos es una prueba con gran sensibilidad (92,7%) y excelente especificidad (99,1%) para el diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH). La unión de la EMA a las proteínas integrales de la m em brana, que se unen directamente con el citoesqueleto eritrocitario, contribuye a la elevada especificad de esta prueba. En otras patologías que cursan con esferocitos en sangre periférica y que no resultan de alteraciones estruc­ turales en la m em brana como la anemia hemolítica autoinm une, la prueba de EMA es normal. Sin embargo, se observa una disminución de la fluorescencia media en algunas enfermedades raras, como la piropoiquilocitosis hereditaria (PPH), la anemia diseritropoyética congénita tipo II, la criohidrocitosis y la ovalocitosis del sudeste asiático (SAO).

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Capítulo 18

Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias

5 3 5 .e 3

8. En las enfermedades de la membrana eritrocitaria ¿cuál es la técnica utilizada para identificar la proteína que tiene alteraciones? (a) Fragilidad osmótica eritrocitaria. (b) Test de lisis en glicerol acidificado. (c) Electroforesis de proteínas de m embrana eritrocitaria. (d) Prueba de citometría de flujo con eosina-5’-maleimida (EMA). (e) Prueba de la autohemólisis. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: las proteínas de la membrana eritrocitaria pueden ser identificadas mediante electroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE). Esta técnica perm ite separar las proteínas según su peso molecular, teñirlas con un colorante de proteínas y cuantificarlas por densitometría. Cada banda en la electroforesis se identifica mediante la asignación de un núm ero de acuerdo la nomenclatura internacional. 9. En las enfermedades de la m embrana eritrocitaria ¿cuándo está indicado hacer el estudio de las proteínas de m embrana, m ediante electroforesis SDS-PAGE, y estudios moleculares? (a) Casos clínicos complejos. (b) Si hay una gran variabilidad fenotípica en diferentes pacientes de una misma familia. (c) Para confirmar mutaciones recesivas o de novo. (d) Para hacer el diagnóstico prenatal. (e) Todas las anteriores. Respuesta correcta: e. Respuesta razonada: en los casos más complejos de enfermedades de la m em brana eritrocitaria es importante identificar cuál es la proteína que está afectada. Mediante electroforesis SDS-PAGE se puede hacer el análisis cuantitativo y cualitativo de las principales proteínas estructurales de la m em brana de los eritrocitos. Los estudios moleculares para identificación de m utaciones en los genes que codifican las proteínas de la membrana solamente se justifican en casos muy raros y complejos, o si estuviera indicado el diagnóstico prenatal. Estos estudios perm iten elucidar la base genética de la variabi­ lidad fenotípica en diferentes pacientes de una misma familia, confirmar mutaciones recesivas o de novo cuando los progenitores son aparentemente normales, y hacer el diagnóstico prenatal cuando hay riesgo de nacimiento de u n niño con una forma muy severa de HS. 10. ¿Cuál es la m ejor m etodología de diagnóstico de hem oglobinuria paroxística nocturna (HPN)? (a) Prueba de lisis en el suero acidificado (prueba de HAM). (b) Prueba de la sacarosa. (c) Cuantificación, por citometría de flujo, de la expresión de las proteínas ancladas a GPI. (d) Todas las anteriores. (e) Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: c. Respuesta razonada: la cuantificación de la expresión de las proteínas ancladas a GPI, utilizando anticuerpos monoclonales m ediante citom etría de flujo, se considera la m ejor metodología para diagnosticar y m onitorizar hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). La citometría de flujo tiene la ventaja, sobre los m étodos clásicos, de perm itir no solo identificar, sino tam bién cuantificar el núm ero de células HPN, lo que facilita seguir la evolución de la enfermedad a partir de la cuantificación periódica. Además posibilita realizar el estudio en leucocitos (monocitos y neutrófilos), que puede ser más informativa que el análisis de los eritrocitos, porque estos sufren una hemólisis selectiva; y, asimismo, evita los inconvenientes de analizar pacientes sometidos a transfusiones.

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C

A

P

Í

T

U

L

O

19

Diagnóstico de las eritroenzimopatías M. A. Pujades y J. L. Vives Corrons

INTRODUCCIÓN El eritrocito cumple tres funciones principales encaminadas, todas ellas, a m antener la función y el transporte de la hemoglobina desde los pulmones a los tejidos y viceversa: 1. Conservar la integridad de sus componentes para sobrevivir en la circulación sanguínea aproximadamente 120 días. 2. M antener el hierro hemoglobínico en estado reducido o funcional para que la hemoglobina pueda fijar reversiblemente el oxígeno molecular. 3. Contribuir a la función de la hemoglobina, facilitando la liberación del oxígeno a los tejidos. Estas funciones las realiza gracias a su reducida, pero suficiente, dotación enzimática, he­ redada de sus precursores, los eritroblastos, y que le permite obtener energía en forma de ATP (metabolismo energético), proteger la hemoglobina de los agentes oxidantes (metabolismo oxidorreductor y diaforásico) y contribuir a la función respiratoria de la hemoglobina (síntesis de 2,3-bisfosfoglicerato). La ausencia de síntesis proteica en el eritrocito maduro imposibilita el recambio molecular de estas enzimas, por lo que su déficit congénito tiene, casi siempre, una repercusión fisiopatológica mucho mayor que en cualquier otra célula del organismo. Las enzimopatías cuyo estudio clínico reviste mayor interés son las que se acompañan de un síndrome hemolítico solo o asociado a otro trastorno no hematológico como, por ejemplo, neuropatía, miopatía o retraso mental. Se ha atribuido también importancia a determinadas eritroenzimopatías sin anemia pero asociadas a eritrocitosis como, por ejemplo, el déficit hereditario de bisfosfoglicerato sintasa y la hiperactividad piruvato cinasa. Desde el punto de vista fisiopatológico, las eritroenzimopatías se clasifican en cuatro grupos según la vía metabólica afectada: • Enzimopatías de la glucólisis anaerobia (metabolismo energético). • Enzimopatías de la vía de pentosas y metabolismo del glutatión (metabolismo oxido­ rreductor). • Enzimopatías del metabolismo nucleotídico. • Enzimopatías del sistema reductor de la hemoglobina (diaforasa). En la figura 19-1 se representan las enzimas pertenecientes a las tres vías metabólicas impres­ cindibles para mantener la viabilidad del eritrocito maduro; glucólisis anaerobia (producción de ATP), vía de pentosas y glutatión (sistema antioxidante). El estudio de las enzimas del me­ tabolismo eritrocitario ha representado un gran avance en el diagnóstico de ciertas formas de hemólisis congénita no esferocítica. Aunque, en nuestro medio, el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es la enzimopatía más frecuente, la presencia de otras eritroenzimo­ patías no constituye un hecho excepcional. Así, se han descrito déficits de piruvato cinasa (PK), fosfoglucosa isomerasa (PGI), triosa fosfato isomerasa (TPI), pirimidina-5'-nucleotidasa (P5'N), fosfofructocinasa (PFK) y diaforasa. Las características de las eritroenzimopatías más importantes desde el punto de vista clínico y genético se representan en la tabla 19-1.

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2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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Capítulo 19

537

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

1 ,3 -D P G M utasa ^ I 2 ,3 -D P G I Fosfatasa

PGK ^ADP S |atp!

ATP | ADP

3-P G M utasa

2-P G 4--------- ► PEP Enolasa

— . | PK [

NADH

►Pinivatn —

NAD >I

Lactato deshidrogenasa

FIGU RA 19-1. Esquema de la glucólisis anaerobia y metabolismo oxidorreductor.

TABLA 19-1. Manifestaciones clínicas de las erítroenzimopatías Enzimopatía

Hemólisis

Otras manifestaciones

Hexocinasa Glucosa fosfato isomerasa Fosfofructocinasa Triosa fosfato isomerasa Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa Fosfoglicerato cinasa Piruvato cinasa Fosfoglicerato mutasa Diaforasa Enolasa Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 6-fosfogluconato deshidrogenasa Glutatión reductasa Glutatión peroxidasa Glutatión sintetasa y-glutamil-cisteína sintetasa crónica Lactato deshidrogenasa

Crónica Crónica Crónica Crónica Crónica

No Sí (neuropatía) Sí (miopatía, glucogenosis) Sí (neuropatía muy grave) No

Crónica Crónica No No ND Aguda (favismo)

Sí (neuropatía) No Poliglobulia Cianosis

Crónica

No

Aguda (favismo) ND Crónica Neuropatía

Cataratas

ND

ND, no demostrada.

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No

Oxoprolinuria

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

El déficit de G6PD constituye una causa de anemia hemolítica aguda y su existencia debe sospecharse siempre que se trate de un individuo con crisis hemolíticas poco después de la ingesta de habas o de alguno de los llamados medicamentos «oxidantes», algunos de los cuales se m encionan en el cuadro 19-1. La determinación de las actividades enzimáticas del eritrocito no es compleja, aunque sí delicada, por cuanto cualquier contaminación por pequeña que sea o ligeras variacio­ nes de la temperatura pueden modificar los resultados. Así, el análisis cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias debe efectuarse siempre a partir de hemolizados desprovistos de contaminación leucocitaria. Ello es especialmente importante en la de­ terminación de la actividad de PK, ya que esta enzimopatía eritrocitaria se acompaña de una actividad leucocitaria normal; debido a ello, la contaminación del hemolizado por leucocitos puede dificultar la detección del déficit.

CUADRO 19-1. Sustancias con potencial de acción hemolítica en el déficit de G6PD

• Analgésico/antipiréticos • Acetanilida • Acetofenetidina (fenacetina) • Amidopirina (aminopirina) • Antipirina • Ácido acetilsalicílico • Fenacetina • Probenecida • Piramidón • Antipalúdicos • Cloroquina • Hidroxicloroquina • Mepacrina (quinacrina) • Pamaquina • Pentaquina • Primaquina • Quinina • Quinocida • Agentes cardiovasculares • Procainamida • Quinidina • Sulfonamidas/sulfonas • Dapsona • Sulfacetamida • Sulfametoxipirimidina • Sulfanilamida • Sulfapiridina • Sulfasalacina • Sulfisoxazol • Miscelánea • a-metildopa • Ácido ascórbico (vitamina C) • Dimercaprol (BAL) • Hidracina • Mestranol • Azul de metileno

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Capítulo 19

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

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CUADRO 19-1. Sustancias con potencial de acción hemolítica en el déficit de G6PD (cont.)

• Ácido nalidíxico • Naftaleno • Niridazol • Fenilhidracina • Piridio • Quinina • Azul de toluidina • Trinitrotolueno • Uratoxidasa • Vitamina K soluble • Citotóxicos/antibacterianos • Cloranfenicol • Cotrimoxazol • Furazolidona • Ácido nalidíxico • Neoarsfenamina • Nitrofiirantoína • Nitrofiirazona • PAS • Ácido paraaminosalicílico • Habas (favismo)

Al objeto de sistematizar la metodología aplicada al análisis de las actividades enzi­ máticas eritrocitarias en la práctica clínica, el Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH) ha unificado la preparación del hemolizado y estandarizado los diferentes métodos de análisis correspondientes a cada una de las enzimas que hay que determinar. Ello ha constituido en gran m anera a disminuir la variabilidad entre laboratorios y a garantizar la calidad de los resultados, especialmente de aquellos con menos experiencia en este tipo de determinaciones. Finalmente, al interpretar los resultados de un estudio enzimático eritrocitario, debe tenerse en cuenta la edad del paciente y el número de reticulocitos presentes en el momento de realizar el estudio. En los recién nacidos y niños menores de 1 año, ciertas enzimas presentan actividades inferiores a las del estado adulto, lo que puede hacer creer un falso déficit enzimático si no se tiene en cuenta la edad (tabla 19-2). Asimismo, el grado de reticulocitosis es también muy importante, por cuanto los eritrocitos jóvenes poseen actividades enzimáticas generalmente muy superiores a las del eritrocito adulto normal. En tales casos, si la reticulocitosis es lo suficientemente alta, puede enmascarar un déficit enzimático, al observarse una falsa «actividad normal» debida al efecto de los reticulocitos (fig. 19-2).

TIPOS DE ERÍTROENZIMOPATÍAS Enzim opatías de la glucólisis anaerobia El eritrocito carece de mitocondrias, por lo que su única fuente de energía (ATP) es la glucólisis anaerobia u oxidación de la glucosa a piruvato (v. fig. 19-1). Esta oxidación se realiza en dos etapas: 1) transformación de una molécula de glucosa en dos triosa

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

TABLA 19-2. Valores de referencia de las actividades enzimáticas en adultos sanos, adultos con reticulocitosis (> 1 0 0 X 109/1) y recién nacidos a término Reticulocitosis Adultos

Recién nacidos

> 100.000 X 109/1

0,62-1,26 3,93-5,67 1,46-3,46 45-66 6,2-13,9 168-300

1,3-2,1 9-13 1,83-4,3 73-107 5,8-8,25 206-367

1,37-2,86 5,6-8 2,1-4,9 56-81 10,8-16,1 265-473

197-343 8,4-15,2 10,7-20,63 2,86-7,7

254-442 8,85-16 10,8-21 3,41-9,1

250-437 10,4-18,9 12,1-23,4 3,41-9,1

1.361-2.759

1.442-2.820

2.075-3.449

5,7-9,9

8,4-14,6

8,6-14,9

6,12-10,2

6,7-9,85

8,8-14,9

7,6-17 5,5-12,9

6,5-14,6 12-31 54-78 43-62

1. GLUCÓLISIS ANAEROBIA Hexocinasa (HK) Enolasa (ENOL) Aldolasa (ALD) Glucosa fosfato isomerasa (GPI) Fosfofructocinasa (PFK) Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GA3PDH) Fosfoglicerato cinasa (PGK) Piruvato cinasa (PK) 3-fosfoglicerato mutasa (3-PGM) 2,3-difosfoglicerato sintasa (2,3-DPGS) Triosa fosfato isomerasa (TPI) 2. VÍA DE PENTOSAS-FOSFATO Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGDH)

3. METABOLISMO DEL GLUTATIÓN Glutatión reductasa (GS-SG RED) Glutatión peroxidasa (GPX) Glutatión reducido (GSH) GSH + AFH

5,3-11,9 9,1-25 58-84 47-71

—

4. METABOLISMO NUCLEOTÍDICO Adenilato cinasa (AK)

64 109

180-310

186-315

La actividad enzimática viene expresada en unidades/gramo de Hb. El GSH viene expresado en mg/100 mi de hematíes. AFH, acetilfenilhidracina.

Reticulocitos (%)

FIGU RA 19-2. Relación entre actividad enzimática y porcentaje de reticulocitos (R. Van Wijk, 2011).

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Capítulo 19

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Diagnóstico de las erítroenzim opatías

fosfatos (gliceraldehído 3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), con consum o de dos moléculas de ATP, y 2) transformación de las triosa fosfatos en piruvato con producción de dos moléculas de ATP. El rendimiento energético de esta vía metabólica es favorable, debido a que en el eritrocito existe una conversión total de la dihidroxiacetona fosfato en gliceraldehído-3-fosfato, con lo que la oxidación de una molécula de glucosa a piruvato supone siempre un rendimiento neto de dos moléculas de ATP. Aunque la cantidad de ATP, que se obtiene a través de la glucólisis anaerobia, es muy inferior a la que podría obtenerse por oxidación mitocondrial del piruvato, resulta suficiente para las escasas necesidades energéticas del eritrocito. La enzima más importante de esta vía es la PK, cuyo déficit congénito constituye la causa más frecuente de anemia hemolítica crónica no esferocítica (AHCNE). Junto a las enzimas de la glucólisis, el eritrocito posee otras que contribuyen tam bién al m antenim iento de ATP. Entre ellas destacan como más importantes la adenilato cinasa (AK), la pirimidina 5’-nucleotidasa (P5’N) y la adenosina desaminasa (ADA). La im portancia de la glucólisis anaerobia en el eritrocito se pone de manifiesto cuando por algún mecanismo disminuye su actividad fisiológica. Así, el descenso del pH intraeritrocitario disminuye la actividad de enzimas situadas en la prim era etapa de la glucólisis y aumenta la formación de piruvato a expensas del 2,3-difosfoglicerato (2,3DPG). El 2,3-DPG es un metabolito muy abundante en el eritrocito y fundamental para la regulación de la función hemoglobínica. Se origina a partir del 1,3-difosfoglicerato (glicerato-l,3-P2) mediante u na reacción enzimática catalizada por la enzima 2,3-bisfosfoglicerato sintasa (BPGS), que posee tam bién actividad m utasa o fosfoglicerato mutasa (MPGM). Cuando desciende el pH eritrocitario, se activa la función fosfatásica de la BPGS y el 2,3-DPG se transform a en 3-fosfoglicerato (3-PG); con ello se cierra el llamado «ciclo del 2,3-DPG». Finalmente, el 3-PG se transform a en lactato a través de varias reacciones enzimáticas, en una de las cuales se produce una molécula de ATP. D ebido a ello, cuando se produce un bloqueo metabólico de la prim era etapa de la glucólisis, el eritrocito puede m antener durante cierto tiem po su contenido en ATP gracias al consumo de 2,3-DPG (fig. 19-3).

GI ¡ce ra Ideh ído-3-fosfato

1 ,3 - b ¡ s f 0 s f 0 g l¡ c e r a t 0 ,

B isfosfo glicerato

bisfosfo glice rato fosfatasa

P.

* Piruvato

FIGU RA 19-3. Ciclo del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-DPG).

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Enzim opatías de la vía de las pentosas-fosfato La protección de las proteínas eritrocitarias y en especial de la hemoglobina frente a la acción de los llamados agentes oxidantes, norm alm ente presentes en el interior del eritrocito, se realiza mediante los sistemas antioxidantes, cuya finalidad es m antener el glutatión eritrocitario en estado reducido (GSH) y, a la vez, reducir el hierro hemínico (Fe++), para evitar la transformación de la hemoglobina en metahemoglobina. El glutatión es un tripéptido sintetizado en el propio eritrocito, que actúa eliminando el exceso de peróxido de hidrógeno (H20 2) mediante una reacción enzimática catalizada por la glutatión peroxidasa (fig. 19-4). La catalasa, que es tam bién una enzima es­ pecífica para la desintoxicación del H 20 2, solo actúa cuando su concentración es muy elevada. Cuando disminuye la concentración eritrocitaria de GSH el exceso de H 20 2 no eliminado facilita la desnaturalización de la hemoglobina, dando lugar a la formación de precipitados intraeritrocitarios llamados cuerpos de Heinz (v. fig. 17-10). La presencia de cuerpos de Heinz dificulta el paso de los eritrocitos a través del bazo y facilita su eliminación o hemólisis. Asimismo, el H20 2 y otros peróxidos pueden actuar también sobre las proteínas de membrana, dando lugar a la formación de agregados de espectrina que disminuyen también la deformabilidad eritrocitaria y, por tanto, la vida media de los eritrocitos en la circulación. La causa más frecuente y mejor conocida de descenso del poder reductor eritrocitario es el déficit congénito de la G6PD. Esta enzimopatía es muy frecuente en nuestro medio y constituye la base molecular de la anem ia hemolítica aguda, desencadenada p or la ingesta de habas o favismo.

Enzim opatías del m etabolism o nucleotídico Como el eritrocito carece de síntesis de nucleótidos adenílicos (AMP, ADP y ATP), todas aquellas enzimas que de alguna form a eviten su degradación o intervengan en su síntesis adquieren gran im portancia funcional. Entre las enzimas im portantes de esta vía, y cuyo déficit se acom paña de anemia hemolítica, destacan la P5'N, la ADA y la AK. El déficit de P5'N produce u n acúm ulo intraeritrocitario de nucleótidos adenílicos con dism inución de la degradación del exceso de ARN, que es la causa del

6-fosfogluconato

FIGU RA 19-4. Sistema antioxidante eritrocitario.

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Capítulo 19

Diagnóstico de las eritroenzim opatías

543

punteado basófilo. El defecto hereditario de ADA que produce hemólisis consiste un aum ento de la actividad o hiperactividad de la enzima p or m utación del gen regu­ lador. El déficit de AK es excepcional y existen casos en los que la anemia hemolítica crónica se acom paña de neuropatía.

Enzim opatías del sistem a reductor de la hem oglobina El mantenimiento del hierro hemínico en estado reducido (Fe++) es fundamental para que este pueda fijar reversiblemente el oxígeno molecular y, por tanto, para el transporte de oxígeno a los tejidos. Ello depende de la actividad de la enzima m etahemoglobina reductasa o NADH-diaforasa que se ha identificado con la fracción soluble de la citocromo b5reductasa presente en numerosas células del organismo. El déficit hereditario de NADH-diaforasa es causa de metahemoglobinemia, que en algunos pacientes puede ir asociada a un trastorno neurológico grave. Junto a la NADH-diaforasa, el eritrocito posee u n sistema diaforásico secundario (NADPH-diaforasa) que no funciona en condiciones fisiológicas porque le falta el aceptor de electrones (citocrom o b5). No obstante este sistema secundario (NADPH-diaforasa) puede actuar si se administra un receptor apropiado, como por ejemplo, el azul de metileno. Por ello, en caso de déficit de NADH-diaforasa, la administración de azul de metileno produce la reducción de la hemoglobina y la desaparición de la cianosis.

MÉTODOS APLICADOS AL DIAGNÓSTICO DE LAS ERITROENZIMOPATIAS En la actualidad, existen diferentes procedimientos que informan acerca de la simple existencia de un déficit de actividad enzimática hasta las características y mecanismos moleculares de una enzimopatía determinada. La detección de una eritroenzimopatía puede realizarse mediante métodos cualitativos o cuantitativos. Los métodos cualitativos y de cribado se han aplicado principalm ente al es­ crutinio del déficit de G6PD en poblaciones y, con m ucho m enor éxito, al de otras enzimopatías de la glucólisis eritrocitaria. Debido a la elevada frecuencia del déficit de G6PD en determ inadas razas o poblaciones (negra, asiática o m editerránea), el ICSH recomienda emplear la prueba de la m ancha fluorescente para el escrutinio de portadores asintomáticos de esta enzimopatía. Asimismo, la presencia de mosaicismo en mujeres heterocigotas puede ponerse de manifiesto fácilmente m ediante un método citoquímico basado en la incapacidad de los eritrocitos con déficit de G6PD para reducir la metahemoglobina. Los métodos cualitativos aplicados a la detección del déficit de PK se basan también en el principio de la m ancha fluorescente, aunque han dem ostrado ser menos reproducibles que los empleados para la detección del déficit de G6PD. Los métodos cuantitativos son los únicos válidos para confirm ar la existencia de una eritroenzim opatía. En general, aunque con ligeras diferencias, todos ellos se basan en el em pleo de una mezcla de sustrato-coenzim as e iones en un m edio tam ponado, donde la enzima que hay que estudiar constituye la etapa limitante. A la reacción catalizada p or la enzim a se le acopla la transform ación de un nucleótido nicotinam ídico (NAD o NADP) desde su form a oxidada a reducida o viceversa. Debido a que el NADH y el NADPH presentan una absorbancia específica a 340 nm, la medida espectrofotométrica de su velocidad de formación o desaparición determinará la actividad enzimática.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

M étodos cualitativos y de cribado P rueba de la m a n ch a fluorescente

Principio Esta prueba, recomendada por el ICSH para el escrutinio del déficit de G6PD, consiste en incubar sangre total en presencia de una solución tamponada que contenga los sus­ tratos de la enzima G6PD (G6P y NADP) y después de impregnar una gota de la misma sobre u n filtro, observarlo mediante luz ultravioleta (emisión de 340 nm) y apreciar la aparición o no de fluorescencia (formación de NADPH2). Si existe suficiente actividad de G6PD en la sangre, la mancha será fluorescente. Por el contrario, en caso de déficit de G6PD (escasa o nula formación de NADPH2) no exis­ tirá fluorescencia.

Material y reactivos • Sangre total heparinizada o mantenida incoagulable con EDTA o ACD (paciente y control). • Lámpara ultravioleta. • Papel de filtro (W hatman n.° 1). • Solución de glucosa-6-fosfato (G6P) de 10 mmol/1 (305 mg de sal disódica en 100 mi de agua destilada). • Solución de NADP, 7,5 mmol/1 (600 mg de sal disódica en 100 mi de agua destilada). • Saponina al 1% (10 g/1). • Tris-HCl 750 mmol/1, pH = 7,8. • Tris (hidroximetil-aminometano), 90,86 g/1,250 mi. • HCI 1N , 33 mi. • Agua destilada, c.s.p.* 1.000 mi. • Glutatión oxidado (GSSG), 8 mmol/1.

Método 1. Se prepara de forma extemporánea la solución-reactivo. En la actualidad, existen kits comerciales en los que deben seguirse las instrucciones correspondientes en el mom ento de preparar la solución-reactivo: (a) G6P 10 mmol/1,200 |xl. (b) NADP 7,5 m mol/1,100 |xl. (c) Saponina al 1%, 200 |xl. (d) Tris-HCL 750 mmol/1, 300 |xl. (e) GSSG 8 m mol/1,100 (jlI. (f) H20 , 100 |xl. 2. En un tubo de ensayo se colocan 100 |xl de solución-reactivo y se añaden 10 jxl de sangre total. Se agita suavemente. 3. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 5-10 min. 4. Se tom an 10 (xl de la mezcla y se impregna con ella el papel de filtro. 5. Se visualiza la mancha mediante una lámpara de luz ultravioleta. Junto al estudio del espécimen de sangre problema deben procesarse simultáneamente uno o varios controles normales.

c.s.p.: cantidad suficiente para.

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Capítulo 19

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

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Interpretación del resultado En muestras de sangre normales (controles), las manchas son intensamente fluores­ centes debido a la formación de NADPH2. Cuando existe déficit de G 6 PD (D >Oxi-Hb Oxi-Hb — M11 ) Formazán

Material y reactivos • Sangre heparinizada o en ACD. • Nitrito sódico, 0,18 mol/1. • Solución incubadora (preparación extemporánea). • NaCl 0,15 mol/1,4 mi. • Glucosa al 5%, 1 mi. • Tampón fosfato potásico (0,3 mol/1, pH = 7), 2 mi. • Sulfato de azul de Nilo (11 mg/100 ml), 1 mi. • H20 bidestilada, 2 mi. • Solución de metiltiotiazol (MTT): • 5 mg/ml de NaCl 0,15 M (preparación extemporánea). • NaCl al 0,6% en agua destilada.

Método 1. Se centrifuga la sangre a +4 °C durante 5 min a 3.000 r.p.m. y se elimina el plasma. 2. Se mezclan 0,5 m i de eritrocitos con 9 mi de NaCl 0,15 mol/1 y 0,5 m i de nitrito sódico 0,18 mol/ 1. 3. Se incuba la mezcla a 37 °C durante 20 min. 4. Se centrifuga a +4 °C durante 15 m in (3.000 r.p.m.). 5. Se elimina el sobrenadante sin eliminar la capa de leucocitos. Se añaden 9 mi de NaCl 0,15 mol/1, y se centrifuga eliminando el sobrenadante. Se repite la misma operación dos veces más. Al final del último lavado se elimina la capa de leucocitos. 6 . Se mezcla bien el paquete eritrocitario y se añaden 50 |jil del mismo a 1 mi de líquido incubador. 7. Se incuba la suspensión a 37 °C durante 30 m in sin agitar y después de este tiempo se añaden 0,2 mi de solución MTT. Se agita y se continúa la incubación durante 1 h más. 8 . Se mezcla una gota de la suspensión con una gota de NaCl al 0,6%, se coloca la mezcla encima de un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. 9. Se m ira al microscopio ( X40). 10. Se analiza la presencia de gránulos de formazán en un mínimo de 500 eritrocitos de acuerdo con el criterio siguiente: (a) Puntuación 0: inexistencia de granulación. (b) Puntuación 1+: de uno a tres gránulos. (c) Puntuación 2+: cuatro o más gránulos.

Interpretación del resultado Esta prueba, utilizada hace años para detectar portadoras heterocigotas de déficit G 6 PD, es muy engorrosa, y en la actualidad ha sido totalmente sustituida por el estudio genético de la G 6 PD, mediante PCR o secuenciación. Debido al fenómeno de Lyon, o inactivación cromosómica durante el desarrollo, el número de eritrocitos con capacidad para reducir el M TT a form azán es generalmente superior al de los que carecen de ella. En tales casos, la actividad G 6 PD obtenida a partir del hemolizado puede hallarse normal o muy poco disminuía, por lo que la prueba citoquímica permitirá demostrar la

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

presencia de una población eritrocitaria desprovista de G6PD y establecer así el carácter portador del déficit. En condiciones normales, la mayoría de eritrocitos analizados contienen cuatro o más gránulos de formazán en su interior. Ello se debe a que poseen una capacidad normal para reducir el MTT a formazán debido a la actividad G6PD. En caso de déficit, aumenta sensiblemente el núm ero de eritrocitos sin granulación, con lo que se observa un predom inio de los mismos con puntuación 0. C uando el déficit de G6PD es de prácticamente 0 (sujetos hemicigotos con variantes de tipo mediterráneo), la puntuación 0 es de prácticamente el 100%. Cuando la actividad es de aproximadamente el 50% (mujeres heterocigotas), se aprecia un 50% de la población eritrocitaria desprovista de granulación (puntuación 0) y un 50% con granulación normal.

M étodos cuantitativos El análisis cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias, excepto la pirimidina-5'-nucleotidasa (P5'N), se basa en la preparación, para cada una de ellas, de una mez­ cla reactiva, en la que la enzima que hay que analizar constituye la etapa limitante y en el curso de la reacción enzimática existe una transformación de derivados nicotinamídicos desde sus formas oxidadas a reducidas o viceversa. Debido a que tanto el NADH2 como el NADPH2presentan una absorción específica a 340 nm, la medida espectrofotométrica de la velocidad vendrá dada por la velocidad observada en la formación o desaparición de estos compuestos (variación de absorbancia por m inuto o A/min). Como el principio utilizado para determ inar todas las actividades enzimáticas es el mismo, el ICSH ha estandarizado la metódica a emplear en la clínica para que los resultados obtenidos en diferentes laboratorios sean comparables. Las actividades enzimáticas pueden expresarse en U/100 m i de eritrocitos, U/109 de eritrocitos o U l/g Hb. La forma recomendada por el ICSH es la de U l/g Hb a 37 °C, para lo cual una vez realizada la lectura espectrofotométrica se aplica la siguiente fórmula común: TTT/ TT, AA340 1 100C _ U I/s H b = --------------- x — x ------- x D eNAD(P)H Vh Hb AA340 = variación de la absorbancia por minuto. 8 = coeficiente de extinción molar del NADH o NADPH (6,22 X 103). H b = hemoglobina del hemolizado. Vh = volumen de hemolizado en la cubeta. C = paso de luz de la cubeta (1 cm). D = dilución del hemolizado empleado.

Aspectos generales que se deben tener en cuenta Las actividades enzimáticas, aunque pueden medirse aisladamente, en general se determi­ nan bajo forma de perfil completo o batería de 18 enzimas que explora, de una vez, todas las vías metabólicas más importantes del eritrocito. Este listado, con sus correspondientes valores de referencia se representa en la tabla 19-2. Los valores de referencia de las acti­ vidades enzimáticas listadas en esta tabla corresponden a individuos adultos, los cuales difieren de los correspondientes al período neonatal (recién nacidos a término). Cada una de las enzimas incluidas en esta tabla se analiza de manera individual, pero de forma conjunta con todas las demás. Debido a ello se requiere tener preparados todos los reactivos imprescindibles para realizar estas determinaciones de forma conjunta (cuadro 19-1).

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Capítulo 19

Diagnóstico de las eritroenzim opatías

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Cabe señalar otros tres aspectos importantes: 1. La inclusión del cociente PK/HK resulta muy im portante en pacientes con in­ tensa reticulocitosis, ya que la actividad PK es muy dependiente de la juventud eritrocitaria y, por tanto, en casos de elevada reticulocitosis, puede m ostrar una actividad aparentemente normal (dentro de los límites de referencia). Para poder desenmascarar esta falsa apariencia de normalidad, se utiliza el cociente PK/HK que compara su actividad con la de la HK, otra enzima aún más dependiente de la reticulocitosis (v. fig. 19-2). Así, mientras en condiciones normales, es decir, en ausencia de déficit de PK, el cociente PK/HK oscila entre 7,2 y 15,6, en caso de déficit con intensa reticulocitosis este valor es generalmente inferior a 7,2. Este hallazgo perm ite sospechar la existencia de un déficit de PK enmascarado por la reticulocitosis. Aunque más rara, también puede darse la situación inversa, es decir, la existencia de un déficit de HK, en cuyo caso el cociente PK/HK mostrará un valor próximo a 15,6 o superior. 2. El contenido en glutatión reducido eritrocitario es un sustrato que se mide en mg/dl de eritrocitos. Tiene valor como m étodo de cribado de déficit de GR o de alguna de las enzimas que interviene en la síntesis del glutatión (GGCS y GS). 3. Preparación del hemolizado: la sangre puede ser recogida mediante los anticoa­ gulantes heparina o ACD. Es esencial que los eritrocitos estén libres de leucocitos y plaquetas; para ello, la sangre total debe filtrarse a través de una columna de celulosa microcristalina a-celulosa preparada del siguiente modo: (a) Se mezcla una parte de celulosa microcristalina con dos partes de a-celulosa, disueltas en suero fisiológico. De esta mezcla se ponen 2 mi en una jeringa de 5 ml, a la que previamente se ha colocado un pequeño papel de filtro en el fondo. La columna es equilibrada con suero salino fisiológico. (b) Se hace pasar por la columna 1 mi de sangre total que tenga un hematocrito de aproximadamente el 50%, y se recoge el eluido formado por eritrocitos libres de leucocitos y plaquetas en un tubo. (c) Se vuelve a pasar suero fisiológico para que la columna quede lo más limpia posible de eritrocitos. Los eritrocitos así obtenidos se lavan dos o tres veces con suero fisiológico y el paquete final es resuspendido al 50% en suero fisiológico. Para preparar el hemolizado, se mezcla un volumen de la suspensión de eritrocitos lavados (al 50% en suero fisiológico) con nueve volúmenes de la solución estabilizadora y se procede a su congelación-descongelación tres veces consecutivas. Con ello se obtiene un hemolizado que corresponde a una dilución 1/20 del paquete eritrocitario inicial. A partir del hemolizado 1/20 (que es el que se empleará para la mayoría de las determinaciones enzimáticas) se procede a preparar dos nuevas diluciones en solución estabilizadora: una de 1/200 y otra de 1/2.000, necesarias para la dosificación de algunas actividades enzimáticas.

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGD) Principio La G6PD (EC 1.1.1.49) es una enzima presente en todos los seres vivos. En los mamíferos cataliza la primera reacción en la vía de la pentosa fosfato, la ruta metabólica que aprovi­ siona a la célula de NADPH y de pentosas para la síntesis de ácidos nucleicos. La reacción catalizada por la G6PD es la reducción de la NADP+a expensas de la deshidrogenación de la glucosa-6-fosfato en 6-fosfogluconato.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

G 6P+ NADP+ fí6l>D >6-PG + NADPH+ H + 6-PG+ NADP+ 6'PGU ) Ribulosa-5-fosfato+ NADPH++ H++ C 0 2 Método En cuatro cubetas se coloca el volumen (jxl) de reactivos indicados a continuación: Cubetas 1 Blanco (|jl 1)

2 G6PD (|xl)

3 6-PGD (|xl)

4 G6PD + 6-PGD (|xl)

— Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 100 100 MgCl2, 0,1 mol/1 — 100 100 — NADP, 2 mmol/1 100 100 Hemolizado (1/20) — 20 20 Agua bidestilada 1.000 580 580 Se incuba a 37 °C durante 10 min. G6P, 6 mmol/1 100 100 6-PG, 6 mmol/1 Se mide la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm (a 37 °C).

100 100 100 20 480 100 100

Cálculo del resultado AAM7m in 1 100 ADO/min „ „ UI/gH b = --------------- x — x ----- = --------------- x0,8 6,22 20 Hb Hb(g/dl) La actividad de G6PD se obtiene a partir de la diferencia entre la actividad observada en la cubeta n.° 4 y la observada en la n.° 3. Valores de referencia e interpretación del resultado Los valores de referencia ( X ± 2DE a 37 °C) para la actividad G6PD son de 5,7 a 9,9 Ul/g Hb. Junto a esta actividad se determina sistemáticamente la de la enzima 6-PGD cuyos valores de referencia son 6,18 a 10,22 U/g Hb. El déficit de G6PD es la eritroenzim opatía más frecuente y la m ejor conocida. Se ha estudiado am pliam ente tanto clínica com o m olecularm ente, en un elevado núm ero de grupos étnicos. Su frecuencia es mayor en determ inadas razas (negra, caucásica del área m editerránea y asiática), y nuestro país es uno de los afectados, aunque en m enor intensidad que otras áreas del litoral m editerráneo. Su transm isión hereditaria se halla ligada al sexo, y p or ello la expresividad clínica es propia de los individuos hemicigotos (varones) y hom ocigotos (mujeres). Esta enzim opatía suele presentarse bajo la form a de un síndrom e aném ico agudo, generalm ente intenso, con cefalea, fiebre, ictericia y hem oglobinuria, pocas horas después (a veces 1 o 2 días) de la ingesta de ciertos m edicam entos (cuadro 19-2) o alimentos, como por ejemplo, habas. O tros factores desencadenantes de hemólisis aguda en el déficit de G6PD son las infecciones, en especial la neum onía bacteriana, la hepatitis aguda y tam bién tra sto rn o s m etabólicos diversos en tre los que destaca la cetoacidosis diabética. Con m ucha m enor frecuencia, el déficit de G6PD puede cursar con un síndrom e hemolítico crónico.

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Capítulo 19

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

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CUADRO 19-2. Reactivos imprescindibles para la medida de las actividades enzimáticas

Reactivos generales • Ácido clorhídrico (HC1) • Fosfato disódico (Na2H P04) • (3-mercaptoetanol • Hidroximetil-amino-metano (Tris) • Ácido etilenodiaminotetraacético, sal disódica (EDTA) • Cloruro sódico (NaCl) • Fosfato potásico (KH2P 0 4) • Cloruro magnésico (MgCl2) • Cloruro potásico (KC1) • Ácido tricloroacético al 30% • Ácido molíbdico • Solución de Fiske Subbarow (Sigma®) • Fosfato dipotásico (K2H P04) • Bicarbonato sódico (NaHC03) • Enzimas purificadas • Lactato deshidrogenasa (LDH), 60 U/ml • Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), 10 U/ml • Piruvato cinasa (PK), 50 U/ml • Glutatión reductasa (GR), 10 U/ml • Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GA3PD), 40 y 50 U/ml • Glicerín-3-fosfato deshidrogenasa (G3PD), 2 U/ml • Enolasa (ENOL), 10 U/ml • 3-fosfoglicerato cinasa (3-PGK), 50 U/ml • Triosa fosfato isomerasa (TPI), 60 U/ml • Aldolasa (ALD), 5 U/ml • Malato deshidrogenasa (MDH), 1 U/ml Sustratos • Nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) • Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) • Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH) • 6-fosfogluconato (6-PG) • Glucosa-6-fosfato (G6P) • Adenosín-5-difosfato (ADP) • Fosfoenol-piruvato (PEP) • Fructosa-1,6-bisfosfato (F1,6BP) • Fructosa-6-fosfato (F6P) • Glucosa • Adenosa-5-trifosfato (ATP) • Glucosa-1-fosfato (G1P) • Glucosa-1,6-bisfosfato (G1,6BP) • Adenosín-monofosfato (AMP) • Glutatión oxidado (GSSG) • Flavina adenina dinucleótido (FAD) • Glutatión reducido (GSH) • 3-fosfoglicerato (3-PG) • 2-fosfoglicerato (2-PG) • Citidina monofosfato (CMP) • Uridina monofosfato (UMP) (Continúa)

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

CUADRO 19-2. Reactivos imprescindibles para la medida de las actividades enzimáticas (cont.)

• • • •

Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) Piruvato sódico Adenosina

Soluciones • Solución salina fisiológica (NaCl, 0,15 mol/1) • Solución estabilizadora formada por EDTA, 2,7 mmol/, y mercaptoetanol, 0,7 mmol por litro, pH = 7 • Solución tampón de Tris-HCl 1 mol/1 (EDTA, 5 mmol/1), pH = 8 • Solución tampón de fosfato sódico potásico, 0,2 mol/1, pH = 7 • Solución de cloruro magnésico (MgClj), 0,1 mol/1 • Solución de cloruro potásico (KC1), 1 mol/1 • Solución tampón de Tris-HCl, 10 mmol/1 (+ EDTA, 2,7 mmol/1) + mercaptoetanol, 0,7 mmol/1, pH = 6,5 • Solución tampón Tris, 30 mmol/1 (+ MgCl2, 30 mmol/1), pH = 8 • Solución tampón de diálisis (P5 N) Tris 10 mmol/1 + NaCl, 150 mmol/1 + MgCl2, 10 mmol/1 + EDTA, 0,02 mmol/1, pH = 8 • Solución bicarbonato sódico al 1% (NaHC03)

En el curso de la reticulocitosis es frecuente observar un aumento variable de la G6PD. No obstante, esta es una enzima relativamente lábil y muy sensible al envejecimiento eri­ trocitario, por lo que, si su determinación se demora mucho tiempo (>48 h) después de extraída la sangre, pueden apreciarse importantes disminuciones de la actividad que in­ cluso pueden simular un déficit. Dada la frecuencia en nuestro medio de la variante G6PD deficiente mediterránea, cuya actividad es prácticamente 0 en hemicigotos, la detección del dé­ ficit de G6PD, siguiendo la metódica descrita, resulta relativamente sencilla. Por ello, la existencia de una actividad de G6PD solo ligeramente disminuida en un varón en el que exis­ te sospecha de déficit G6PD debe hacer replantear el diagnóstico o en todo caso repetir de nuevo la determinación enzimática a partir de una nueva muestra de sangre. Si después de ello la actividad de G6PD continúa aún por debajo de los límites normales (< 2 DE), es recomendable, antes de afirmar la existencia de déficit, repetir la determinación después de renovar las soluciones tampón y los reactivos empleados para la misma. En mujeres, la detección del déficit de G6PD es algo más delicada, aunque es rela­ tivamente simple en portadoras con un 50% de actividad. Si la actividad es superior al 60% de la normal, en este caso la confirmación del carácter de portador debe hacerse m ediante el estudio genético de la G6PD utilizando PCR (m utación conocida en la familia) o secuenciación del gen G6PD. El déficit de G6PD en su fase de hemólisis aguda (crisis de hemólisis) puede manifestarse también por una alteración morfológica muy característica, que es la retracción del conte­ nido hemoglobínico de los eritrocitos y la observación de espacios vacíos (desplazamiento de la hemoglobina hacia uno de los extremos de la célula). A esta alteración se la conoce con el nombre de excentrocitosis (fig. 19-5), y permite realizar el diagnóstico de déficit de G6PD incluso antes de su confirmación mediante el estudio de la actividad en el hemolizado. El déficit de 6-PGD es extremadamente raro, y se han descrito muy pocos casos. Clínicamente es parecido al déficit de G6PD (crisis hemolíticas agudas generalmente medicamentosas), pero dado que se hereda con carácter autosómico recesivo, puede afectar a ambos sexos por igual.

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Capítulo 19

553

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

Fosfoglucom utasa (PGM1) Principio La fosfoglucomutasa (PGM1; EC 5A.2.2) es una enzima que cataliza la transferencia del grupo fosfato desde el carbono 1 de la glucosa-1-fosfato (G1P) al carbono 6 de la glucosa-5-fosfato. Glucosa-lP
Glucosa-6-P

G-6-P+N A D P+ C,6PD >6-PG+ NADPH+ H + 6-PG+NADP+ 6 PC,U >Ribulosa-5-P+ NADPH+ H + La reducción de NADP se realiza a 340 nm. Método Blanco ((xl)

Problema (|xl)

Tris-HCl, M, EDTA, 5 mM, pH = 8 — Cl2M g,0,lM — NADP, 2 mM — Hemolizado al 1/20 — G6PD, 10 U/ml — Gl,6-difosfato, 0,7 mM — H20 1.000 Se incuba a 37 °C durante 10 min. G1,6-difosfato, 0,05 M — Se lee la variación de absorbancia (A) por m inuto.a 340 nm (a 37 °C).

100 50 100 50 20 200 430 50

Cálculo del resultado TTT/ ADO340nm/min UI/gH b = --------------------- x0,16 Hb(g/dl)

9*0^ . •

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* FIGURA 19-5. Excentrocitos en un paciente con crisis hemolítica aguda debida a un déficit de G6PD.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

Valores de referencia e interpretación del resultado Los valores de referencia ( X ± 2D E a 37 °C) de la PGM varían entre 1,41 y 2,69 UI/g Hb. El interés clínico de esta enzimopatía es m uy limitado porque no se han descrito defi­ ciencias de la misma que hayan podido atribuirse a anemia u otra manifestación clínica.

Piruvato cinasa (PK) Principio La PK (EC 2.7.1.40) es una enzima de la glucólisis que cataliza la transferencia de un grupo fosfato del fosfoenolpiruvato (PEP) a la adenosina difosfato (ADP), produciendo una molécula de piruvato y otra de adenosina trifosfato (ATP). Fosfoenol piruvato+ ADP —- ^ +-~>Piruvato+ ATP Piruvato+ NADH —LUH >Lactato+ NAD+ La enzima posee un PM de 60 kDa, y está constituida p or tres m onóm eros. En humanos, dos genes codifican para esta proteína: PKLR y PKM. El gen PKLR codifica la secuencia de la enzima eritrocitaria (PKR) y hepática (PKL), mientras que el gen PKM codifica dos isoenzimas (PKM1, que se expresa en el tejido muscular y embrionario, y PKM2, que lo hace en otros tejidos, leucocitos y plaquetas). Todas estas isoenzimas se originan mediante un mecanismo de splicing alternativo. Método Se preparan dos cubetas: blanco (H20 ) y problema, que contiene el sustrato (PEP) a saturación. Blanco HzO (pl) Tampón TRIS-HCL, mol/1, pH = 8 MgCl2, 0,1 mol/1 NADH, 2 mmol/1 ADP, 30 mmol/1 (neutralizado)

r V*® ■

Problema (pl) 100 100 100 50

—

— — — 1.000 —

LDH, 60 U/ml Agua bidestilada Hemolizado 1/20 Se incuba a 37 °C (durante 10 min). PEP, 100 mmol/1 — Se lee la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm (a 37 °C).

100 330 20 100

Con lo expuesto se pretende medir la actividad de la PK a concentración saturante de sustrato PEP (reacción enzimática convencional).

Cálculo del resultado A D O ^/m in

1

100

AAJ4l7m in X 0 ,8

UI/gH b = ----------------- X— X------------- = ---------------------6 ,2 2 20 Hb(g/dl) H b(g/dl) Valores de referencia e interpretación del resultado Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la actividad PK varían entre 8,4 y 15,2 UI/g Hb. El déficit congénito de PK es m ucho m enos frecuente que el de G6PD, pero puede observarse en nuestro m edio con una incidencia sim ilar a la del resto de Europa en general (1 p or cada 50.000 habitantes). Cursa con u n cuadro clínico similar al de la esferocitosis hereditaria (anemia de intensidad variable, reticulocitosis y es­ plenomegalia), pero sin esferocitos y una fragilidad osm ótica eritrocitaria norm al.

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Capítulo 19

555

Diagnóstico de las erítroenzim opatías

TABLA 19-3. Variaciones de las actividades enzimáticas eritrocitarias en sangre fetal (recién nacidos) y en caso de reticulocitosis (>100 X 109/1) Aumento de actividad

Disminución de actividad

Reticulocitosis y eritrocitos fetales

Eritrocitos fetales

• • • • • • • • • •

• • • • •

Hexocinasa Enolasa Aldolasa Triosa fosfato isomerasa Fosfoglucosa isomerasa Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) Pirimidina-5-nucleotidasa 2,3-difosfoglicerato sintasa Glutatión reductasa Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

Fosfofructocinasa Glutatión peroxidasa Adenilato cinasa Acetilcolinesterasa Diaforasa

Reticulocitosis (exclusivamente)

Diseritropoyesis adquirida

• • • • •

• Piruvato cinasa • Adenilato cinasa

Piruvato cinasa 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGD) Fosfofructocinasa Glutatión peroxidasa 3-fosfoglicerato mutasa

Ocasionalm ente, se observan algunos equinocitos (eritrocitos con espículas) que pueden co n trib u ir al diagnóstico (fig. 19-6). La presencia de equinocitosis en un déficit enzimático se atribuye a la falta de ATP, ya que no es exclusiva del déficit de PK sino que puede observarse en cualquier enzimopatía de la glucólisis anaerobia. La transm isión hereditaria del déficit de PK es autosóm ica recesiva, por lo que los porta­ dores heterocigotos del déficit suelen carecer de expresividad clínica o hematológica, aunque se han descrito algunos casos en que puede observarse hemólisis neonatal o la aparición de un síndrome hemolítico en el curso de situaciones de estrés. Finalmente, en ciertas hem opatías, especialmente en los llamados síndrom es mielodisplásicos, pueden verse disminuciones adquiridas de la enzima de hasta un 50% de su actividad norm al (tabla 19-3). En la determinación de la PK existen tres posibles causas de error: 1. Reticulocitosis. 2. Contaminación leucocitaria. 3. Variantes moleculares con comportamiento cinético peculiar: (a) La PK es una enzima m uy influenciable p or la reticulocitosis debido a que los reticulocitos tienen actividad PK varias veces superior a la de los hema­ tíes maduros. Debido a ello, al analizar la actividad enzimática a partir del hemolizado debe tenerse siempre muy en cuenta la cifra de reticulocitosis. Por ello, cuando esta es muy elevada puede llegar a enmascarar un déficit de PK. (b) O tro aspecto a tener en cuenta en el análisis de la PK es que el hemolizado esté totalmente desprovisto de leucocitos. Ello es así porque el déficit de PK eritrocitaria (PKLR) se acompaña de una actividad normal de PK leucocitaria (PKM2). En consecuencia, la presencia de contaminación leucocitaria puede dificultar el diagnóstico de un déficit de PK.

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Manual de técnicas de laboratorio en hematología

F IG U R A 19 -6 .

Equinocitos en un paciente con déficit de piruvato cinasa e intensa anemia.

(c) Finalmente, existen variantes deficientes de PK en las que el déficit solo se po n e de m anifiesto en presencia de co ncentraciones m uy bajas de sustrato. Por ello, si solo se emplea una concentración saturante de sustrato, como sucede con cualquier determ inación enzimática, la detección de la enzimopatía resulta imposible, ya que la actividad que se obtiene en estas condiciones es normal.

Glucosa fosfatoisomerasa (GPI) Principio La glucosa-6-fosfatoisomerasa (EC 5.3.1.9) es una enzima, presente en gran parte de los seres vivos; cataliza la reacción reversible de G6P a fructosa-6-fosfato (F6P). En el citoplasma, forma parte de las rutas metabólicas de la glucólisis y la gluconeogénesis, y en la matriz extracelular funciona como factor neurotrófico. G6P-