Manual 2008

1 UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORI

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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8

Recopilado y revisado por: ALEJANDRO MARTINEZ M. GLORIA AMPARO VALENCIA P. NORA JIMENEZ U. MONICA MESA ELKIN GALEANO J.

Medellín, Mayo de 2008

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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8 Objetivo general ♦ Al finalizar el curso el estudiante estará en capacidad de evaluar, extraer, aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biológico.

Temas del curso 1. INTRODUCCIÓN. Duración: 6 Horas ♦ Presentación del curso ♦ Entrega de Equipos ♦ Normas de laboratorio 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA VEGETAL. PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN. Duración: 6 Horas 3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duración: 6 Horas 4. TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA). Duración: 12 Horas

5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duración: 6 Horas 6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA. Duración: 6 Horas 7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duración: 12 Horas 8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIÓN Y VALORACION DE UNA DROGA Duración: 12 Horas 9. MARCHA FITOQUIMICA. Duración: 18 Horas

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10. PRACTICA ESPECIAL. Duración: 60 Horas ♦ Revisión bibliográfica y elaboración de un anteproyecto. Duración: 12 Horas ♦ Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duración: 36 Horas ♦ Póster: Elaboración 6 Horas, Presentación: 6 Horas ♦ Contenido: Elaboración de un fitofármaco. Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios.

PRESENTACIÓN Este MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMCA 200 8, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo de 2003 (ISBN 958 -655-682-4). CONTENIDO Pág. PRACTICA No. 1 PRACTICA No. 2 PRACTICA No. 3 PRACTICA No. 4 PRACTICA No. 5

RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA, TAXONOMÍA VEGETAL, PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA) RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE DROGAS PULVERIZADAS) RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA

19

5

22

38 38 38 39 40 40 41 42 43

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PRACTICA No. 6 PRACTICA No. 7

PRACTICA No. 8 PRACTICA No. 9

MATRICARIA RECONOCIMIENTO PO R CCF DEL ROMERO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES)

43 44 45 45 46 47

TÉCNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACIÓN DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE ANETOL

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MARCHA FITOQUÍMICA

68

PRACTICA ESPECIAL

-

Pautas para la elaborac ión del informe de laboratorio

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PRACTICA N° 2 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS OBJETIVO Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas químicas de coloración y precipitación. Consultar: Domínguez, X. 1973.Capítulo 3.

A.,

“Métodos

de

Investigación

Fitoquímica”,

Ed.Limusa,México,

MARCO TEÓRICO Metabolitos Primarios: Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. Metabolitos Secundarios: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o l umínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides. Reconocimientos de Metabolitos: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la

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estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. • Reconocimiento de Alcaloides: Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido org ánico.

N CH3 N

Nicotina Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos.



Reconocimiento de Flavonoides: (+)-Catequina O

OH

Los Flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono, cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 – C3 – C6. • Reconocimiento de Cardiotónicos: Una aglicona cardiotónica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C–18 y C-19,

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un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico carbonos unido al carbono 17 del núcleo esteroidal.

α-β insaturado de cuatro O O

Digoxin

H3 C H

OH CH3

O

O CH3

3

OH

OH O

Estas agliconas toman el nombre de cardenólidas por presentar acti vidad estimulante sobre el músculo cardiaco, cuando están en forma de glicósidos. • Reconocimiento de Saponinas: Las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial d el agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina. CH3 O

H3C CH3 O CH3

Diosgenina HO

La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.

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• Reconocimiento de Cumarinas: Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólic os y tienen en común la estructura química de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

O •

O

Reconocimiento de Taninos:

Los taninos son productos de excreción de muc has plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se encuentran más comúnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Químicamente los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en: Taninos Hidrosolubles o Pirogálicos: Son ésteres fácilmente hidrolizables formados por una molécula de azúcar (en general glucosa) unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledóneas. OH

OH COOH

O

OH HO

Ác. Gálico

O

Leucoantocinidina HO OH

OH

Ác. Elágico

OH HO

O

OH

OH

Flavan 3,4-diol Leucopelargonidin

OH

Taninos no Hidrosolubles ó Condensados : Tienen una estructura química similar a la de los flavonoides. Por hidrólisis dan azúcar y ácido elági co, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrólisis ácida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.

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Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides: CH3 H3C

CH3

CH3 CH3 CH3

Ergosterol

HO

Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17. • Reconocimiento de Quinonas: Las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas que por reducción se convi erten en polifenoles, siendo reversible esta reacción. Las quinonas derivan su nombre del miembro más simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidación del ácido quínico. O

O

Antraquinona

Las quinonas, por el sistema aromático que dan al reducirse se pueden clasificar en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las más numerosas) y Fenantroquinonas (las menos numerosas). • Reconocimiento de Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores ácido – base debido al proceso:

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Pelargonidina

HO

O

HO

+

HO

O

HOOH OH

pH < 3 Catión cianina

O

O

OH

O

HO-

H+

OH OH

pH 8.5 Base cianina

-

H+

O OH

pH > 11 Anión cianina

Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fácil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado pro otros pigmentos, como la clorofila.

Procedimiento Experimental 1. Recolectar y preparar las muestras frescas 2. Reconocimiento de alcaloides Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra esté en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño maría durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de quinina en solución ácida. 3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotónicos En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al baño maría durante unos 5 minutos, con agita ción. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual de solución de acetato de plomo al 4% que contenga ácido acético al 0.5 %,

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agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos. a) Ensayo para flavonoides Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de rutina o quercetina en solución acuo -alcohólica. b) Ensayo para Leucoantocianidinas Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparición de

coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la muestra. c) Ensayo para Cardiotónicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra. 4) Ensayo para saponinas Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. 5) Ensayo para taninos Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. añadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver

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el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Añadir 2 -3 gotas de solución de cloruro férrico al 10%. La formación de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparición de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra. 6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitación. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgánico. Añadir 1 ml de anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar resbalar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides. 7) Ensayo para Quinonas Ensayo con una fracción : Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de peróxido de hidrógeno al 20% y 1 ml de ácido sulfúrico al 50%. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Añadir 5 ml de tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase toluénica. Trasvasar 2 ml fase toluénica a un tubo de ensayo. Añadirle 1 ml de una solución de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloración rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.

Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca (ó 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fracción acuosa. 8. Reconocimiento de Antocianinas En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos 5 minutos. Filtrar.

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Ensayo En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Añadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Añadir unas 6 gotas de un ácido mineral diluido. Observar el color formado. Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH. 9. Reconociemiento de Cumarinas. En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullición el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm.

Plantas con alcaloides:

Datura sp. (borrachero), hojas y flores. Catharantus roseus (cortejo), hojas. Hojas de tabaco, té. Plantas con flavonoides: Pétalos de rosas rojas y amarillas. Pétalos de lirio africano. Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sábila). Fruto de Solanum quitoense (lulo). Cáscara de Dioscorea ssp. (ñame). Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantén). Hojas de guayaba Té (Thea sinensis ), hojas. Uvas (Vitis vinifera ). Plátano o guineo (Musa ssp.). Agallas de alepo ( Querquis ssp. ). Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ). Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya). Aceite de oliva (Olea europeae ). Plantas con cardiotónicos: Azuceno de la habana, hoj as. Plantas con antocianinas: Repollo morado.

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Plantas con quinonas:

Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Ruibarbo (rizomas)

6. Reactivos y materiales necesarios por grupo 150 ml HCl al 5% 1 ml peróxido de hidrógeno al 20% 50 ml Acetato de plomo al 4% con ácido acético al 0.5% 2 ml Urea 10M gotas de FeCl 3 al 10% 2 ml de ácido sulfúrico al 50% 2 ml de solución NaOH al 5% con amoniaco al 2% R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio. R. gelatina-sal R. Kedde solucione s A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno 2 ml anhídrido acético Acido sulfúrico concentrado Acido clorhídrico concentrado 5 papeles de filtro limaduras de magnesio sulfato de sodio anhidro centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos cuchillo.

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Práctica 3 TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)

OBJETIVOS • Seleccionar de una serie eluotrópica el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales. • Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos de coloración, cromatográficos y espectrales. • Identificar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para análisis. BASE DEL MÉTODO La muestra aplicada en la fase estacionaria es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc.) y para su posterior liberación de acuerdo a la constante de afinidad de por los constituyentes de la muestra por la fase móvil. MARCO TEÓRICO CROMATOGRAFÍA La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswe tt. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de cromatografía de capa fina. Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de capa fina, estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a esta técnica simple, económica y eficiente. TERMINOLOGÍA • Fase Estacionaria (Adsorbente) Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un lí quido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (Fase Ligada) o inmovilizado sobre él (Fase Inmovilizada). Los adsorbentes má s utilizados son

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• Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) • Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) • Tierra Silícea ó Kieselguhr • Celulosa (Nativa o micro -cristalina) • Poliamidas. Estos sorbentes varian en tamaño de partícula, día metro del poro, homogeneidad y pureza. • Fase Móvil (eluente) Es el fluido (solvente o mezcla de solventes) que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario (fase estacionaria), en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquid a), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). Cuando se utiliza un líquido como fase móvil mediante una serie eluotrópica (Tabla 1) se escoge la mejor combinación de solventes miscibles para una buena separación cromatográfica de una muestra en sus componentes. Tabla 1. Serie eluotrópica de solventes Hidrocarburos «ligeros» (éter de petróleo, hexano, heptano. etc.) Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tricloroetileno Tolueno Benceno Diclorometano Cloroformo Eter etílico Acetato de etilo Acetona n-Propanol Etanol Metanol Agua • Muestra Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.

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• Componentes de la Muestra Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.

CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA Clasificación de acuerdo a la forma del lecho cromatográfico § Cromatografía en Columna § Cromatografía Plana Clasificación de acuerdo al estado físico de la fase móvil § Cromatografía de Gases (GC) § Cromatografía Líquida (LC) § Cromatografía co n Fluido Supercrítico (SFC) Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación § Cromatografía de Adsorción § Cromatografía de Reparto § Cromatografía de Intercambio Iónico § Cromatografía de Exclusión § Cromatografía de Afinidad Técnicas especiales § Cromatografía con Fase Invertida § Cromatografía con Fase Normal § Análisis Isocrático § Elusión con Gradiente § Cromatografía Bidimensional CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC) Es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada líquida o sólida (adsorbida por fase la estacionaria). Posteriormente se agrega el eluente por la parte superior del tubo cromatográfico y se recogen volúmenes definidos por el analista de eluente luego de ser eluí do por el tubo cromatográfico, separando una muestra en sus componentes como se ilustra en la figura 1:

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Recolector de fracciones

Figura 1. Diagrama de una cromatografía en columna.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Es la técnica de separación en la qu e la fase estacionaria está sobre un plano formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser e luída dentro de un tanque cromatográfico como se ilustra en la figura 2. Marca de fin

Marca de inicio

Muestra

Eluente

Figura 2. Diagrama de una cromatografía en capa fina

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Si los componentes de la muestra (manchas) no son coloreados, se requiere de métodos que nos permitan visualizarlos componente presentes. Este procedimiento también se conoce este como “revelado de la placa”. El revelado de las placas se puede realizar mediante dos métodos: • Método químico (por inmersión o rociado de reactivos coloreantes). Se obtienen derivados coloreados o fluo rescentes de los componentes de la muestra. • Método físico (ópticos). Generalmente se utiliza mediante la radiación con luz UV a la placa cromatográfica a 254nm y/o 365nm. La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo, siempre requiere contar con un estándar de referencia para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del estándar al ser revelada con agentes químicos, con los datos experimentales obtenidos. El factor de retardo (Rf) es un valor relativo par a cada sustancia y depende de las condiciones cromatográficas con que se haya trabajado (fase móvil, fase estacionaria, eluente y el tiempo de saturación). Se define como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia re corrida simultáneamente por la fase móvil como se ilustra en la figura 3.

c Distancia recorrida por la fase móvil (X)

b a

Destancia recorrida por cada muestra

Figura 3. Factor de retardo de una muestra. Rf para la mancha 1 = a / X Rf para la mancha 2 = b / X Rf para la mancha 3 = c / X Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).

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CAROTENOIDES Los tetraterpenoides más conocidos son los pigmentos liposolubles amarillos -rojos denominados carotenoides, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal y en diversos tipos de tejidos. Se conocen al go más de 400 carotenoides. A los pigmentos hidrocarbonados se les denomina CAROTENOS, y a los oxigenados XANTOFILAS. Se conocen también tetraterpenos incoloros como el fitoeno y el fitoflueno, pero han sido menos estudiados que los carotenoides. La única diferencia estructural entre los tetraterpenoides coloreados e incoloros es el mayor número de enlaces dobles conjugados en los primeros. Los tetraterpenoides, a diferencia de otras clases de terpenoides, no poseen sistemas anulares complejos y son acíclic os, mono- o biciclicos. Los miembros acíclicos contienen básicamente el siguiente esqueleto:

Debe notarse que la molécula es simétrica a cada lado de la línea punteada y puede racionalizarse como la unión de dos radicales diterpénicos tipo fitilo. Las variaciones se introducen por enlaces dobles y grupos funcionales tales como hidroxilos, epóxidos, carboxilos, etc. A medida que se aumenta el número de enlaces dobles se incrementa la posibilidad de isomerismo CIS-TRANS, y muchos de los problemas de la q uímica de los carotenoides proviene de la dificultad para distinguir y separar isómeros geométricos de este tipo. La mayoría de los carotenoides nativos son todo trans, y al nombrarlos se asume por defecto que tienen la configuración trans a menos que se c ite la geometría cis. La ciclización puede ser a uno o ambos lados de la cadena. Cuando solo hay ciclización en uno de los extremos se les denomina carotenoides del tipo IONONA:

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Algunos pigmentos como la bixina y la crocetina tienen menos de 40 carbono s pero se clasifican como carotenoides porque las peculiaridades de su estructura sugieren que se derivan de la degradación de carotenoides, en lugar de producirse a partir de unidades más pequeñas. Los apo -carotenoides son compuestos C -27 o C-30 derivados probablemente de la degradación de Xantofilas. Hasta el momento no ha sido asignada ninguna función general a los carotenoides. Existen indicios de que son receptores de luz para el fototropismo. Como los pigmentos florales podrían participar en la atracc ión de insectos, pero principalmente se cree que funcionan como pigmentos de cloroplastos de las hojas. Hasta cierto grado la luz absorbida por los carotenoides puede transferirse a la ferredoxina o la clorofila, donde es usada para la fotosíntesis. Tambié n se tienen evidencias de que los carotenoides protegen a la clorofila contra la fotodestrucción por luz de corta longitud de onda p. ej: Longitudes de onda cercanas a 400 nm donde tanto las clorofilas como los carotenoides absorben intensamente. Las plant as albinas carecen de carotenoides y clorofilas bajo condiciones normales de crecimiento, pero bajo luz débil son capaces de acumular clorofila. En condiciones normales de luz la clorofila se destruye rápidamente porque los carotenoides no están presentes para protegerla. El carotenoide más ampliamente distribuido es el ? -caroteno, el cual constituye casi el 0.1% de las hojas verdes secas. La luteína es la xantofila más importante de hojas y puede encontrarse en mayores concentraciones que el ? -caroteno. La mayoría de carotenoides tienen la misma cadena central del ? -caroteno y difieren solamente en las porciones correspondientes a los dos anillos.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO • 30g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo, Pimentón verde -rojo, zanahor ia, Pimentón rojo, ahuyama, mango cáscara roja, pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.) • • • • • • • • • •

Erlenmeyer 250 ml Sílica gel para columna 1 columna de cromatografía n-hexano puro (ó éter de petróleo) Acetato de etilo puro Metanol ó etanol para extraer (destilado) Algodón o gasa Papel filtro Sulfato de sodio anhidro 15g. Capilares

• • • • • • • • •

Tubos de ensayo limpios Lápiz de grafito Tanque para cromatografía Baño María Rotaevaporador Mortero con pistilo Licuadora Espectrofotómetro UV -Visible Etanol puro 50mL.

NOTA= Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para esta práctica y su color antes de ir a la sección de clase.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL OBJETIVOS • Seleccionar de una serie eluotrópica , el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales. • Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos de coloración, cromatográficos y espectrales. • Conocer otros sist emas cromatográficos para la separación de carotenoides.

a. Deshidratación En un erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente en un mortero. Se añade un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra la muestra. Se cal ienta a ebullición sobre un baño maría durante 5 minutos. Se

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filtra en caliente con un algodón, procurando que la masa semisólida quede libre del solvente. b. Extracción A la masa semisólida se adiciona un volumen suficiente de diclorometano (también pued e usarse cloroformo) en una campana de extracción y se remueve con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides . Debe tenerse precaución con el manejo de estos solventes pues son bastante volátiles y algunos son muy tóxicos. El extracto se filtra. El residuo sólido se puede reextraer varias veces con el fin de obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se trasvasan a un embudo de separación y se añade si es necesario un volumen de solución de NaCl satur ada. La fase orgánica se recupera, se seca con sulfato de sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un volumen aproximado de 5 ml, mediante aplicación de calor suave (40 -50 °C) y vacío. El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para protegerlo de la luz, la humedad, el calor y el aire. c. Selección de otra fase móvil El extracto de carotenoides se a nalizar por CCF con la serie eluotrópica siguiente: • • • • • •

n-Hexano n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1 n-Hexano/Acetato de Etilo 2:1 n-Hexano/Acetato de Etilo 1:2 n-Hexano/Acetato de Etilo 1:4 Acetato de etilo

Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más precisamente posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores, fluorescencia, manchas : • • • •

A simple vista Luz UV 254 nm Luz UV 366 nm Vapores de yodo

d. Fraccionamiento cromatográfico y análisis espectral Con el mejor eluente seleccionado previamente , proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor

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del extracto por cromato grafía en columna CC ó cromatografía en capa preparativa CCP. Las fracciones coloreadas se recogen (ó se raspan en el caso de la CCP), se enumeran y se les determina su espectro visible en el rango de 3 50 a 550 nm. Es importante tener en cuenta que para de terminar el espectro cada compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes. La Tabla 2 muestra los Rf y los máximos de absorción (en éter de petróleo) de varios carotenoides comunes. La figura 2 muestra el espectro visible d el licopeno obtenido de una muestra de tomate rojo.

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Tabla 2. Valores Rf y máximos de absorción de varios carotenoides CAROTENOIDE Rf SISTEMA 1 MÁXIM0S ABSORCIÓN (nm) 0.80 1 422, 444, 473 α-Caroteno 0.74 1 425h, 451, 482 β-Caroteno 0.41 1 437, 462, 494 γ-Caroteno 0.84 1 419, 444, 475 ε-Caroteno Licopeno 0.13 1 446, 472, 505 Luteína 0.35 2 420, 447, 477 Zeaxantina 0.24 2 423, 451, 483 Violaxantina 0.21 2 443, 472 Criptoxantina 0.75 2 425, 451, 483 Capsantina 0.16 2 ---------------Neoxantina 415, 437, 466 Rubixantina 432, 462, 494 Fucoxantina 425, 450, 478

Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo

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Sistema 1: Benceno/Eter de petróleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1

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INFORME Debe incluir nombre vulgar y científico de la muestra analizada, parte de la planta analizada, familia vegetal, análisis de los valores Rf y los espectros visible comparándolos con los reportados en la literatura. Informar cuáles carotenoides se logró identificar. Reactivos y materiales necesarios por grupo Muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo, pimentón verde rojo, zanahoria, pimentón rojo, ahuyama, mango, pasta de tomate, salsa de tomate, etc.) Erlenmeyer 250 ml Sílica gel para columna 1 columna de cromatografía N-hexano puro (ó éter de petróleo) Acetato de etilo puro Etanol para deshidratar Algodón Papel filtro Sulfato de sodio anhidro 15 g. Capilares Tubos de ensayo limpios y secos reactivo de Carr —Price Lápiz de grafito Frasco para cromatografía Rotavapor Mortero con pistilo Licuadora Espectrofotómetro UV -Vísible Bibliografía 1. Robinson T., "The Organic Constituents of Higher Plants", 5th. ed., Cordus Press, North Amherst MA U.S.A., 1983. Pp. 162 -5. 2. Harborne J.B., "Phytochemical Methods", Chapman & Hall, 1973, 119 -128 pp. 3. Stahl E., “Thin layer Chromatog raphy, 1969. 1.Merck Co. Inc., Reactivos de coloración para cromatografía en capa fina y en papel.

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2. Dalmases, P., Bonet, J. J., “Técnicas de Cromatografía Líquido -Sólido en Columna”, Afinidad 111 -126 (1984).

Cromatograma CCF de un extracto de carotenoide s del pimentón (sílica gel, n-hexano/acetato de etilo 4:1)

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Práctica 4 RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS) El planteamiento sistemático de la identificación de drogas en polvo puede realizarse por var ios caminos; sin embargo, cuando se trata de drogas organizadas, todos los métodos dependen del reconocimiento microscópico de los tipos celulares característicos, así como de los contenidos de las células. Cuando se trata de una mezcla de drogas es impres cindible una mayor experiencia y práctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificación, deben llevarse a cabo posteriores observaciones y ensayos químicos confirmativos; la mayoría de las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su reconocimiento mediante cromatografía de capa fina (CCF). ENSAYOS PRELIMINARES: 1. ANOTAR EL COLOR. Blanco: gomas arábiga, tragacanto. Amarillo: regaliz, jengibre, escila. Marrón claro: Ipecacuana, nuez vomica, opio, hinojo, genciana, cilantro, cardamomo, lino. Castaño canela: canela. Castaño oscuro: clavo, sábila. Rojo: quina. Anaranjado: ruibarbo Verde: sen, digital, estramonio. 2. ANOTAR EL OLOR. Los siguientes son especialmente característicos: Jengibre, hinojo, ge nciana, opio, cilantro, cardamomo, canela, clavo, nuez moscada.

3. ANOTAR EL SABOR: Aromático: Cilantro. cardamomo, canela, clavo. Aromático y picante: Jengibre.

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Amargo: cuasia, genciana, áloes, quina, escila. Dulce: regaliz. Astringente: catecú. 4. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con unas gotas de agua y abandonarlo un tiempo. Los extractos acuosos y jugos concentrados como el aloe se disuelven casi completamente, mientras se pone de manifiesto la naturaleza gomosa o mucilaginosa de drogas como l a goma arábiga, tragacanto y semillas de lino. 5. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con ácido sulfúrico diluido, si existe carbonato cálcico (tiza) tiene lugar una efervescencia seguida de disolución. 6. Comprimir una pequeña cantidad de polvo entre pa pel de filtro. Una mancha oleosa, que se extiende pero que persiste cuando el papel es calentado en una estufa aparece cuando los polvos contienen aceite fijo (Ej.: lino, maní, etc). El aceite esencial desaparece por calentamiento en estufa. (todos los aromáticos) 7. Agitar una pequeña cantidad de polvo en un tubo de ensayo lleno de agua hasta la mitad y si aparece espuma abundante sospechar la presencia de drogas saponinas como el clavo, nuez moscada; hervir suavemente y advertir el olor si hay desprendimi ento de aceite esencial. Filtrar y dividir en dos porciones que pueden ser ensayadas respecto a taninos y derivados antraquinónicos de la siguiente manera: a) Ensayo de taninos: Se agregan gotas de FeCl 3 muy diluido, se producen coloraciones que van desde el azul oscuro hasta el negro pasando por el verde oscuro. También se puede realizar la prueba de la gelatina; en la que precipitan los taninos al agregar una solución de gelatina al 1% que contenga 10% de cloruro sódico. Ausencia de taninos: pimienta, j engibre, cuasia, estrofanto. Presencia de taninos: borraja. salvia, ratania, canela, quina, clavo y ruibarbo. b) Ensayo de antraquinonas: Mediante la agitación del extracto acuoso con HCl diluido, y calentamiento para producir la hidrólisis, las antraqui nonas liberadas se extraen con tolueno y dan un color rosa-rojo cuando la solución se agita con amoniaco diluido. Positivo para: áloes. ruibarbo, cáscara sagrada, sen.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

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Si los ensayos preliminares han demostrado que la droga se d isuelve en agua, deben realizarse ensayos con otros líquidos, como alcohol, aceite de oliva, hasta que se encuentre uno en el que la droga sea insoluble. En la mayoría de los casos, sin embargo, puede adoptarse el siguiente procedimiento:

1. OBSERVACION DE ALMIDON Montar placa en agua, observar y dibujar cualquier gránulo que se observe y ensayar si se trata de almidón o no mediante adición de agua de yodo. 2. OBSERVACIÓN DE TRICOMAS EPIDERMICOS Y OXALATO DE CALCIO Montar en hidrato de cloral (disuelve almidón, proteínas, clorofila,, resinas, aceites esenciales y produce la expansión de células retraídas), hervir suavemente hasta que clarifique y observar. Para estar seguro de que el oxalato cálcico, no ha pasado inadvertido, debe utilizarse luz polariza da. OBSERVACIÓN DE LIGNINA Humedecer el polvo con una solución alcohólica de floroglucina (1% en etanol del 90%) y dejarlo hasta que casi se seque. Añadir HCl concentrado, poner cubreobjetos y observar. Adviértase la presencia o ausencia de vasos lignific ados, fibras, parénquima, esclereidas, pelos. Si los vasos o fibras no se tiñen de rojizo, sospechar presencia de jengibre o ruibarbo. De los ensayos preliminares y de los tres montajes anteriores se obtendrá una considerable información. El examen puede c ontinuarse mediante la aplicación de otros ensayos microquímicos: Cloro yoduro de cinc (Reactivo de Schultze); ensayo para paredes de celulosa. Por lo general es conveniente desengrasar los polvos grasos, decolorar los fuertemente coloreados y preparar una fibra bruta cuando contienen mucho almidón. La aplicación de los conocimientos de anatomía de los órganos vegetales en que se presentan las drogas hará posible el reconocimiento. Esto deberá ampliarse con la utilización de referencias o tablas de caracter es diagnósticos de drogas en polvo. La identidad de un polvo no ha de considerarse como establecida hasta que haya sido comparada con uno de reconocida autenticidad. TABLAS RECOMENDADAS: • Wallis y Mirimanoff.

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• Jacksori Snowcson; Powered Vegetable Drugs. Londres: Thornes (1968) DROGA Aloé

CARACTERÍSTICAS Presencia: Montado en lactofenol, muestra fragmentos amarillentos o cristales aciculares. Parcialmente soluble en agua y completamente soluble en alcohol al 60%. Confirmar con ensayos químicos. Ausencia: T ejido vegetal, almidón, Oxalato de Calcio.

Lino

Presencia: Células epidérmicas isodiamétricas . colénquima, esclerénquima lignificado, células pigmentadas poligonales con contenido pardo -rojizo, abundancia de aceite y granos de aleurona 3-18 microgramos. Ausencias almidón, vasos y súber

Presencia de Oxalato de Calcio y ausencia de almidón y pelos epidérmicos: • clavo • cilantro • alcaravea • escila • cáscara de naranja y limón. Presencia de pelos epidérmicos, ausencia de almidón y oxalato de calcio: • nuez vómica • hoja de digital • catecú • lobelia • azafrán Presencia de almidón, ausencia de oxalato de calcio y pelos epidérmicos. • tragacanto • nuez moscada • jengibre • valeriana Presencia de pelos y oxalato de calcio, ausencia de almidón. • hojas de sen • estramonio • beleño • anís • hammamelis

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• manzanilla romana Presencia de oxalato de Calcio y almidón, ausencia de pelos epidérmicos. a) Detección de vasos lignificados con floroglucina y HCl si los hay. • cuasia • regaliz • jalapa si no los hay • ruibarbo • cardamomo • canela b) Presencia de esencias en c ardamomo y canela. En general: • semillas de cardamomo • cuasia • ruibarbo • regaliz • rawolfia • ipecacuana • genciana • canela • • • • • • •

cáscara sagrada quina podofilo cerezo quilaya ratania jalapa

BIBLIOGRAFIA: 1. Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamerica na McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991. 2. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

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Análisis microscópico de algunas drogas Observaciones: • • •

Las fotografías son tomadas a placas montadas con fluoroglucina/HCl, vistas con ocular 6.3X Solo para montar la placa de lino: presionar con el cubreobjetos hasta lograr que el material quede como una delgada capa La observación de diferentes estructuras de una mis ma planta algunas veces requiere el montaje de varias placas.

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Bibliografía • • •

Deyson, G. Caractères analytiques des poudres végétales. Paris, CDU et SEDES réunis, 1976 Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.

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Práctica 4b CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES ANALISIS MACRO Y MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL OBJETIVO • Identificar los diferentes marcadores taxonómicos descritos en las farmacopeas para el control de calidad de un material vegetal como materia prima para productos fitoterapéuticos utilizando agentes químicos de tinción. • Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus características organolépticas, macro y microscópicas.

BASE DEL MÉTODO El análisis histoquímica del material vegetal en polvo ayuda en el proceso de control de calidad, evi denciándose la presencia de material extraño (arena), adulteraciones o falsificaciones. Este análisis es de apoyo a los demás análisis farmacopéicos. MARCO TEÓRICO El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus características sensoriales, macroscópicas y microscópicas. Un examen para determinar estas características es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para después llevarse a cabo posteriores análisis. Siempre que sea posible, patrones del material o muestras d e calidad farmacopeica debe de estar disponible como referencia. Una inspección visual provee una simple y rápida medida para identificar el material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser significativamente diferente, en términ os de color, consistencia, olor o textura, de las especificaciones, se considera una NO conformidad de los requerimientos. Sin embargo, los juicios deben ser cautelosos con relación al olor y la textura, debido a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la experiencia. La identificación macroscópica de una planta medicinal está basada en la forma, tamaño, color, características superficiales, textur a, características al quebrarla y apariencia superficial de un corte. Sin embargo, mientras esas cualidades son juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy

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parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en anál isis microscópicos y/o fisicoquímicos. La inspección microscópica del material vegetal es indispensable por la identificación del material quebrado o en polvo; el material debe de ser tratado con reactivos químicos. Un examen microscópico solo NUNCA prove e una completa identificación. Solo cuando esta asociado con otros métodos analíticos que frecuentemente suplen invaluable evidencia. Si la comparación con material de referencia revela algunas características no descritas en los requerimientos, estos pue den ser atribuidos a material extraño, antes que un constituyente normal. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO • 10g de muestra vegetal fresca o seca en polvo. • 3 Porta objetos • Tamiz malla #20. • 3 Cubre objetos • Reactivos de coloración • 1 microscópico por cada 3 gru pos A cada grupo de estudiante se le asignará una monografía farmacopéica, la cuál deberán de analizar para el posterior desarrollo en el laboratorio de las técnicas macro y microscópicas descritas. 1. Pruebas o rganolépticas: Anotar el color, olor y sabor de la muestra asignada. 2. Con base en la monografía asignada y el material vegetal entregado, encontrar todos los tejidos descritos dentro de la monografía siguiendo cuidadosamente el procedimiento descrito de coloración o limpieza. Dibujar cada una de las características visualizadas al microscopio. 3. Comparar el material vegetal problema asignado con las monografías disponibles, visualizar los marcadores taxonómicos descritos y concluir. DETECCIÓN HISTOQUÍ MICA DE TEJIDO VEGETAL Y SU CONTENIDO 1. Hidrato de cloral: Una solución de hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 mL de agua) se utiliza como agente clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material

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vegetal y calentar suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y sustancias extracelular (granos de almidón, granos de aleurona) y permite una mejor visualización de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen. 2. Glicerol: Se utiliza como medio para la visualizar material vegetal al microscopio y para prevenir el secado de soluciones acuosas o de hidrato de cloral. Se agregan 2 ó 3 gotas a la muestra en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos. 3. Detección de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de oxalato de calcio: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de ácido clorhídr ico 2M, con la precaución de que el reactivo esté en íntimo contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio está indicada por la aparición de burbujas . Los cristales de oxalato de calcio, que en general tardan más tiempo en disolverse, no desprenden burbujas. 4. Detección de almidón: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de Solución de Lugol diluida (1:5) en agua . Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidón se colorean de azul -violáceo intenso. (Esta reacción en reversible al ser calentado el portaobjetos) 5. Detección de lípidos y aceites esenciales: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III (0.5 g Sudan III calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubr eobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo. 6. Detección de taninos: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de cloruro férrico al 5 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se traduce en la aparición de masas oscuras de color pardo, azul o negro. 7. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solució n de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuos, remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H 2SO 4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se observan en colores desde el azul al violeta. 8. Detección de vasos lignificados (esclereidas, vasos, fibras, parenquima): Colocar 2 a 3 mg de la d roga en polvo sobre un portaobjetos y mezclarlos con un pequeño volumen de floroglucinol, dejar reposar hasta casi sequedad, agregar 1

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gota de HCl 25%. Cubrir con un porta objeto y observar los vasos lignificados en colores desde el rosado hasta el color c ereza (rojo carmin). 9. Detección de suber: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos o calentar suavemente. Los vasos suberizados o cuticulizados se observ al de color rojo al rojo-naranja. 10. Detección de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de yodo/etanol. Los granos de aleurona se observan amarillentos café o café. Agregar luego unas 2 ó 3 gotas de trinitrofenol en etanol y los granos de tornarán amarillos. 11. Detección universal: Solución A – Diluir 20 mL de una solución saturada de Sudan III en ácido láctico con 30 mL de ácido láctico. Solución B – Disolver 0.55 g de sulfato de anilin a en 35 mL de agua. Solución C – Disolver 0.55 g de yoduro de potasio y 0.05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de etanol. Procedimiento – Combinar la solución A, solución B y la Solución C y agregar 2.5 mL de HCl con agitación (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con un porta objeto y observar los elementos lignificados de amarillo, súber de marrón, lípidos de color rojo y almidón de color azul -violeta. 12. Detección de estomas: Los estomas son unas aberturas que regulan la entrada y salida de gases. Estas aberturas están rodeadas por células especializadas llamadas oclusivas que al cambiar de tamaño y forma, modifican el diámetro de la abertura estomátic a y de este modo regulan el intercambio gaseoso.

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Imagen tomada de: British pharmacopoeia, Appendix XI H. Stomata. 2003. 1- Anomocíticos (irregulares): Los estomas están rodeados por un número variado de células. 2 - Anisocíticos (desiguales): Los est omas están rodeados por tres células, de las cuáles una es marcadamente más pequeña que las otras. 3 - Diacíticos (Atravesando): Los estomas están incrustados entre dos células vecinas. 4 - Paracíticos (Paralelos): Los estomas tienen paralelamente a ello s una o más células vecinas. BIBLIOGRAFÍA 1. British Pharmacopoeia, 2003. 2. USP 27, NF 22. 2003. 3. Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998

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Práctica 5 RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae

Introducción La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios amargos (Absinthina y anabsinthina), mientras que las flores cont ienen un 0.15%.

Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60°C sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen aprox. de 2 ml Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador: Rf 0.3-0.4

Sílica gel 60F -254 Cloroformo:Metanol 95:5 Liebermann-Burchard/UV 365 nm SUSTANCIA Absinthina

COLOR amarillo ocre

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae Introducción El bulbo o diente contiene cisteína, cistina, sulfóxido de metionina, cicloaliína, aliína (= Sulfóxido de S -alilcisteína), y deoxialiína (=S -alil-cisteína), junto con otros aminoácidos azufrados y sulfóxidos de cisteína. Extracción 25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en frío (con ayuda de hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografía en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina. Fase estacion aria: Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 n-Butanol : n -Propanol : Acido acético glacial : Agua 30 : 10 : 10 : 10 Ninhidrina

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Rf 0.5

SUSTANCIA Alicina

COLOR Naranja

0.7

Aliína

Azul-violeta

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RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como cinaropicrina, grossheimina y cinarina; ácidos fenolcarboxilicos como 1,3 dicafeoilquínico, clorog énico y neoclorogénico; y luteolina -7-O-glucósido, un flavonoide. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml Fase estaciona ria: Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60F -254 Acetato de etilo:Acido fórmico:Acido acético:Agua 100 : 11 : 11 : 27 Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf 0.7

SIJSTANCIA Cinarina

COLOR Azul fluorescente

0.6

Luteolina-7-0-gluc.

Amarillo

0.45

Acido clorogénico

Azul fluorescente

0.4

Rutina

Amarillo

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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA ALBAHACA, Ocimum basilicum , Lamiaceae Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1 -0.45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62. b) Con Diclorometano 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 10 ml de diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1 ml de Tolueno, y se aplican 50 -100 µL. en la placa crom atográfica. Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina- Acido sulfúrico

Rf 0.3

SUSTANCIA Linalool

COLOR Azul intenso

0.9

Metilchavicol

Rojo violeta

RECONOCIMIEN TO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae Introducción La droga la constituyen las hojas y ramas jóvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite esencial. El aceite contiene principalmente L -Carvona 42 -67%, mentol, ac etato de dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminílico, pineno, limoneno y felandreno.

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Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Se utiliza el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62 con 50 g de muestra, 500 ml de agua, 2 horas d e destilación a un flujo de 3 -3.5 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Como se describió para la albahaca Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vain illina-Acido sulfúrico

Rf 0.25

SUSTANCIA Alcohol dihidrocumínico

COLOR Azul intenso

0.46

Carvona

Rojo-Violeta

0.7

Acetato de dehidrocarveol

Azul intenso

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE HINOJO, Foeniculum vulgare , Apiaceae Introducción La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2 -7% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente anetol (50 -80% en la variedad dulce, 60 -80% en la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehído y fenchona (0.4 -0.8% en la variedad dulce, 12 -22% en la variedad vulgare). Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62, utilizando 10 g. de muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilación a una rat a de 2-3 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Reveladores : 1.Vainillina -Acido sulfúrico 2. PMA-Permanganato de potasio 3. Acido sulfúrico concentrado

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Rf 0.6

SUSTANCIA Fenchona

REVELADOR 3

COLOR Azul oscuro

0.9

Anetol

1 2 3

Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro

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Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el anís, lo que permite diferenciar las dos plantas. RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MALVA, Malva sylvestris , Malvaceae Introducción La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color característico. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 6 ml de Metanol:Acido Clorhídrico (9 partes de metanol, 1 parte de ácido al 25%). Se utilizan 25 µl del filtrado para la cromatografía. Fase estacionaria : Fase móvil: Reveladores :

Rf 0.4

Sílica gel 60F -254 n -Butanol : Acido acético glacial : Agua 40 : 10 : 20 Ninguno

SUSTANCIA Malvina (=Malvidin -3,5-diglucósido

COLOR Violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla , Asteraceae Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10 -25%, bisabolol óxidos A y B (ambos 10 -25%), poliínas 1 -40%, farneseno 15%.

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Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la F. Eur. III pág. 62 con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solución de cloruro de sodio al 1%, 4 horas de destilación a 3 -4 ml/minuto. b) Extracción con Díclorometano Tal como se ha descrito para la albahaca. Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 T olueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina -Acido sulfúrico

Rf 0.2

SUSTANCIA Oxidos A y B de bisabolol

COLOR Amarillo/Verde

0.25

Alcohol terpenoide

Violeta

0.35

Bisabolol

Violeta

0.5-0.6

Poliínas

Pardo

0.95

Azuleno

Rojo violeta

0.99

Farneseno

Azul-Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae Introducción Las hojas contienen 1 -2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 -cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno. Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la Farm. Eur. III pág. 62. b) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina -Acido sulfúrico

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Rf 0.25

SUSTANCIA Borneol

COLOR Azul oscuro

0.45

Cineol

Azul intenso

0.7

Acetato de bornil o

Azul intenso

0.99

Alfa- y beta-pineno

Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae Introducción La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14 -28% de principios antracénicos tal es como aloína, aloesinas A y B, aloinósidos A y B, etc. Extracción 0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un baño de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa cromatográfica. Fase estacionaria: Fase móvil:

Sílica gel 60F -254 Acetato de etilo : Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10

Reveladores :

1) Hidróxido de potasio/ UV 365 nm 2) Poiietilénglicol PN/UV 365 nm

Rf 0.3

SUSTANCIA Aloinósidos A y B

REVELADOR 1y2

COLOR Amarillo

0.47

Aloína

1y2

Amarillo

0.95

Aloé-emodina

1

Rojo

---

1 Aloesinas A y B

Azul fluorescente

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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra , Caprifoliaceae Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicósidos de quercetina 1.5 -3% como hiperósido, isoquercitrina y rutina. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un baño de agua a aproximadamente 60 °C. El filtrado se utiliza para la cromatografía. Fase estacionaria : Fase móvil:

Sílica gel 60F -254 Acetato de etilo : Acido fórmico : Acido acético : Agua 100 : 11 : 11 : 27

Reveladores :

1) R. productos naturales/UV 365 nm 2) Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf 0.4

SUSTANCIA Rutina

COLOR Amarillo

0.7

Isoquercitrina

Amarillo

0.9

Acido cafeico

Azul fluorescente

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis , Lamiaceae Introducción Las hojas contienen 0.01 -0.25% de aceite esencial, el cual está constituido principalmente de Citronelal 39%, Citral 30%, citronelol, linal ool, geraniol y cariofileno. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62, con: 40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2 -3 ml/min durante 2 horas.

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b) Extracción con Diclorometano Como se describió para la albahaca. Fase estacionaria : Sílica gel 60 Fase móvil: Cloroformo Revelador: Anisaldehído/Acido sulfúrico Rf SUSTANCIA 0.7 Citronelal

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COLOR Azul intenso

0.45

Citral

Azul violáceo

0.25-0.4

Geraniol, linalool y Citronelol

Azul violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis , Valerianaceae Introducción La droga la constituyen las raíces o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentración cambia de una variedad a otra. Además contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y ácido valerénico. Extracción 0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a unos 60 0C con agitación ocasional. El residuo de la filtración se lava con otros 2 ml de diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo d e disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de esta solución. Fase estacionaria : Fase móvil: Revelador:

Sílica gel 60 Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 HCl concentrado : Acido acético glacial 2:8

Rf 0.73

SUSTANCIA Valtrato/Isovaltrato

COLOR Azul

0.65

Didrovaltrato

Pardo

0.55

Acevaltrato

Azul

0.4

IVDH-Valtrato

Azul