• Author / Uploaded
• katherine mendez tovar

Citation preview

BIORREACTION THERMODYNAMICS: ARRHENIUS PARAMETERS AND GIBBS FUNCTION TERMODINAMICA DE LA BIORREACCION: PARÁMETROS DE ARRHENIUS Y FUCIÓN DE GIBBS Lidia Alba – Chavez1, Juan De La Rosa-Becerra1, Lili Dluís – Florez1, Yeiny Peñates-Alvarez1, Andrea Rodríguez–Pestana1, Ana Zarza-Banda1 1

estudiantes de ingeniería agroindustrial. Facultad de ingeniería. Universidad de sucre. Sincelejo (Colombia). Correo: [email protected]

Abstract

Resumen

The concept of reaction rate and equilibrium constant has a lot of applicability since they allow to determine what happens with the components of a reactive system during and after the reaction occurs. In this practice the effect of the temperature on the reaction rate and the equilibrium constant was evaluated, taking into account the parameters of the Arrhenius equation and the Gibbs function. For this, a 10% w / w maltose solution was prepared and the respective dilutions were made. An equilibrium constant of 223.29, 1307.49, and 2484.79 was obtained at a temperature of 48, 55 and 62 °C respectively; On the other hand, a ΔH of 154.51 kJ / mol, a ΔG at 55 ° C of - 19, 579 kJ / mol and a ΔS of 530.51 J / mol K was obtained; An activation energy of 7.86 KJ / mol was obtained. The temperature is related to the equilibrium constant of a directly proportional form. Recognizing the importance of this study since considering the thermodynamics and chemical kinetics of a biorreaction allows to understand and predict the behavior of the same.

El concepto de velocidad de reacción y constante de equilibrio tiene mucha aplicabilidad ya que permiten determinar qué pasa con los componentes de un sistema reactivo durante y después de que ocurra la reacción. En esta práctica se evaluó el efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción y la constante de equilibrio, teniendo en cuenta los parámetros de la ecuación de Arrhenius y la función de Gibbs. Para esto, se preparó una solución de maltosa al 10% p/p y se realizaron las respectivas diluciones. Se obtuvo una constante de equilibrio de 223.29, 1307.49, y 2484.79 a una temperatura de 48, 55 y 62°C respectivamente; por otro lado se obtuvo un ∆H de 154,51 kJ/mol, un ∆G a 55°C de - 19, 579 kJ/mol y un ∆S de 530,51 J/mol K; se obtuvo una energía de activación de 7,86 KJ/mol. La temperatura está relacionada con la constante de equilibrio de una forma directamente proporcional. Reconociendo la importancia de este estudio ya que considerar la termodinámica y la cinética química de una biorreacción permite comprender y predecir el comportamiento de la misma.

Keywords: Glucoamylase, equilibrium

Palabras Claves: Glucoamilasa, Constante de

constant, chemical kinetics, activation energy, temperature.

equilibrio, cinetica química, energía de activación, temperatura.

1

biología molecular y la ingeniería de la enzima (Norouzian, Akbarzadeh, Scharer, & Young, 2006), por lo que es importante la determinación de los parámetros cinéticos y termodinámicos.

INTRODUCCIÓN Las propiedades catalíticas de las enzimas son de gran interés industrial debido esencialmente a su elevada especificidad y selectividad, y debido a que son pocos los catalizadores sintéticos que logran reunir en un solo todas las ventajas inherentes a estos biocatalizadores. Las enzimas pueden ser usadas en una gran diversidad de aplicaciones industriales, tales como; desarrollo y producción de nuevos fármacos, producción de biocombustibles, hidrolisis de almidón, en procesos medioambientales, industria de papel, de los detergentes, de producción de alimentos, entre otras (Chaparro, 2009). De las enzimas más utilizadas son las empleadas para la degradación de almidón. La industria del almidón es la segunda consumidora de enzimas, con el 33% de la demanda global, cuyo mercado para 2005-2006 ascendió a 3,75 billones de dólares (Bettín & Quintero, 2010).

Se han realizado diversos estudios para la determinación de los parámetros termodinámicos de las reacciones empleando glucoamilasa. Riaz et. al., (2013) realizo un estudio de las propiedades fisicoquímicas y cinética de la glucoamilasa producida a partir de glucoamilasa obtenida a partir de Aspergillus niger para la hidrólisis del almidón soluble en los cuales obtuvieron una entalpia de reacción, energía libre de Gibbs, entropía de reacción y energía de activación de 41.50 KJ/mol, 65,69 KJ/mol, - 72,62 KJ/mol K y 44,27 KJ/mol respectivamente. De igual forma, Prajapati & Trivedi (2014) en un estudio de la hidrolisis de almidón en glucosa por glucoamilasa de Colletotrichum sp los ∆H, ∆G, ∆S y Ea fueron de 23.973, KJ/mol, 57.851 KJ/mol, −113.68 J /mol y 26.45 kJ /mol respectivamente. Por otro lado, Sierks, Michael, & Svensson (2000), en el estudios energéticos y mecánicos de la glucoamilasa utilizando el reconocimiento molecular de los grupos de maltosa OH acoplados con la mutagénesis dirigida al sitio el cual muestra obtuvo que para glucoamilasa (salvaje), y una maltosa que tenga 4 grupos hidroxilos (4-OH) se presenta un ΔG de -18,8 KJ/mol.

La industria del procesamiento del almidón depende totalmente del uso de enzimas para la producción a gran escala (Crabb & Shetty, 1999). Entre estas enzimas, las amilasas y las glucoamilasas son las más importantes. Catalizan la hidrólisis de varios polisacáridos a azúcares inferiores o glucosa. Estos hidrolizados se utilizan en la producción fermentativa de alcoholes, aminoácidos, biopolímeros, ácidos carboxílicos y enzimas (Koch & Roper, 1998). Por lo tanto, representan un valioso material de partida para síntesis química y bioquímica. Aplicaciones amplias de la glucoamilasa en la industria del almidón motivar la investigación en la mejora de las propiedades de la enzima por métodos de selección de enzimas, la

Debido a la importancia que tiene la enzima la glucoamilasa para su uso industrial y en el diseño de bioreactores, la presente investigación busca evaluar el efecto de la Temperatura sobre la velocidad de reacción y la constante de equilibrio, teniendo en 2

cuenta los parámetros de la ecuación de Arrhenius y la función de Gibbs.

el equilibrio. Teniendo las concentraciones de los productos y reactivos que intervienen en la reacción se procedió a calcular las constantes de equilibrio de la reacción para cada una de las temperaturas de trabajo, por medio de la fórmula:

MATERIALES Y MÉTODOS Esta práctica de laboratorio se llevó a cabo en las instalaciones de la planta piloto de la universidad de sucre ubicada en la granja el perico. Para esto se utilizó maltosa como sustrato y glucoamilasa fúngica como enzima. Inicialmente como medio se preparó una solución de maltosa al 10% p/p, se estabilizó el pH utilizando NaOH al 0,1N dependiendo del pH inicial obtenido en las muestras, hasta lograr un valor de 4,3, así mismo se procedió a estabilizar la velocidad de agitación a 400 rpm y de igual forma la temperatura, las cuales fueron de 48°C, 55°C y 62°C respectivamente durante tres días continuos (una temperatura por día). Se adicionó 1 mL de enzima en cada uno de los biorreactores agitando continuamente. Se tomaron muestras de 2 mL de cada biorreactor cada 30 minutos, desde el tiempo 0 hasta los 270 minutos, se inactivó la enzima y posteriormente se determinó la concentración de glucosa en el equilibrio de cada muestra haciendo uso del glucómetro, sabiendo de antemano que la lectura arrojada por el glucómetro debía estar en un rango entre 20-600 en caso de que pasara de este rango era necesario diluir la muestra para obtener una medición más exacta.

𝐾𝑒𝑞 =

[𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜]𝑒𝑞𝑢𝑖𝑙𝑖𝑏𝑟𝑖𝑜 [𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠]𝑒𝑞𝑢𝑖𝑙𝑖𝑏𝑟𝑖𝑜

Luego, se procedió a estimar los parámetros de la función de Gibbs por medio de la gráfica de las constantes de equilibrio con el inverso de su respectiva temperatura, teniendo en cuenta que: 𝐿𝑛 (𝐾𝑒𝑞 ) =

−∆H° +𝐼 𝑅𝑇

Donde la pendiente es igual a

−∆H° 𝑅

y el

intercepto I es una constante de integración. Teniendo el valor de ∆𝐻, se halló ∆𝐺 tomando una temperatura del rango en el cual se trabajó y utilizando la fórmula: ∆𝐺° = −𝑅𝑇 𝐿𝑛(𝐾𝑒𝑞) Y para el calculó de ∆𝑆 se utilizó la fórmula: ∆𝐺° = ∆𝐻° − 𝑇∆𝑆

Teniendo los datos de la concentración de glucosa en el equilibrio se procedió a determinar la concentración de maltosa en el equilibrio por diferencia entre maltosa inicial y glucosa en el equilibrio, luego se halló la concentración de agua en el equilibrio por balances estequiométricos teniendo en cuenta las concentraciones de maltosa y glucosa en

Teniendo los valores de los parámetros de Gibbs, se procedió a calcular los parámetros de la función de Arrhenius linealizada. Primero se calculó las velocidades para cada una de las temperaturas de trabajo (48°C, 55°C y 62°C) requeridas para el cálculo de la 3

constante de velocidad (K) usando la siguiente formula: 𝑣=

En la cual la concentración de glucosa producida es mayor a medida que aumenta la temperatura de trabajo de la reacción.

[𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛]𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − [𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛]𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜𝐵𝑖𝑜𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛

Teniendo en cuenta la producción de glucosa en cada una de las temperaturas evaluadas, se obtuvieron los valores de las constantes de equilibrio (tabla 1).

Luego, se graficó Ln (k) vs 1/T, partiendo de la fórmula: 𝐿𝑛(𝑘) = −

𝐸𝑎 + 𝐿𝑛(𝐴) 𝑅𝑇

Tabla 1. Valores de las constantes de equilibrio para cada temperatura a la cual se realizó la reacción.

𝐸𝑎

Donde la pendientes es igual a − 𝑅𝑇 y el intercepto es igual a 𝐿𝑛(𝐴)

Temperatura (K)

Keq

1/T

Ln (Keq)

RESULTADOS Y DISCUSION

320,15

223,29

0,0031

5,41

El comportamiento presentado por la reacción se observa en la figura 1 a las diferentes temperaturas evaluadas.

328,15

1307,49

0,0030

7,18

335,15

2484,79

0,0029

7,82

0.6

[gl] (mol/L)

0.5

La constante de equilibrio nos indica en qué sentido se desplaza la reacción, este valor no cambia cuando se presenta temperatura constante, lo que indica que debe aumentar o disminuir, en este caso se presenta un aumento con la temperatura (Quílez & Quílez, 2014). El comportamiento obtenido por el proceso con respecto a la constante de equilibrio en función de la temperatura se observa en la figura 2.

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

100

200

300

tiempo (min)

47 °C

55 °C

62 °C

Figura 1: variación de la concentración de glucosa con respecto al tiempo a las diferentes temperaturas trabajadas.

De la pendiente e intercepto de la figura 2 se obtuvieron los valores de ∆H y ∆S, como se muestran en la tabla 2.

4

Ln (k)

esto se observa en el crecimiento de la constante de equilibrio a medida que aumenta la temperatura, cabe resaltar que estos valores son grandes lo que supone que la reacción transcurre por completo o casi por completo y que los productos son mucho más estables que los reactivos, es decir no ocurre la reacción inversa (Chang & Goldsby, 2002).

9 8 7 6 y = -18583x + 63.447 5 R² = 0.9383 4 3 2 1 0 0.00298 0.003015 0.00305 0.003085 0.00312 1/T (K-1)

Parámetros de Arrhenius Teniendo en cuenta el comportamiento presentado por la reacción en cuanto a la producción de glucosa en función del tiempo, se puede decir que la cinética que presenta es de orden cero por tener una relación lineal (figura 1). Por tanto la constante de velocidad (K) será igual a la velocidad de reacción para cada temperatura evaluada, los cuales se encuentran en la tabla 3. En donde se observa que dicha velocidad va aumentando a medida que aumenta la temperatura por tanto tienen una relación directamente proporcional.

Figura 2. Relación de la constante de equilibrio con la temperatura para el cálculo de los parámetros de la función de Gibbs

Tabla 2. Parámetros termodinámicos para la glucoamilasa. Propiedades ∆H (kJ/mol) ∆G a 55° C (kJ/mol)

Valor 154,51 - 19, 579

∆S (J/mol K)

530,51

Los valores obtenidos mostraron que la reacción es endotérmica (∆H < 0), irreversible (∆S > 0) y espontánea (∆G < 0).

Tabla 3. Valores de las velocidades y constantes de velocidad para cada temperatura a la cual se realizó la reacción.

La constante de equilibrio expresa la tendencia de los reactivos a convertirse en productos y viceversa. Está relacionada con la variación de la energía de la reacción que nos indica su espontaneidad. Debido a que se presenta una reacción exotérmica al aumentar la temperatura, el equilibrio se desplazará hacia la derecha lo que genera mayor formación de productos, 5

Temperatura (K)

V (mol/s)

1/T

Ln (K)

320,15

0,0055

0,0031

-5,2111

328,15

0,0060

0,0030

-5,1086

335,15

0,0062

0,0029

-5,0887

-10.26 0.00294 -10.28

0.00304

valor ΔG más bajo sugiere que la conversión de su complejo de transición en productos es más espontánea que la de Aspergillus niger y Colletotrichum sp utilizando almidón como sustrato. La viabilidad y el alcance de una reacción química se determinan mejor midiendo el cambio en la energía libre de Gibbs (ΔG) para la hidrólisis del sustrato, es decir, la conversión del complejo ES en productos (Prajapati & Trivedi, 2014). Cuanto menor es el cambio de energía libre, más factible será la reacción, es decir, la conversión del reactivo en producto será espontánea. La entropía fue mucho mayor a los valores reportados, lo que explicó que el complejo de transición tenía mayor desorden. En cuanto a la energía de activación se encontró que es menor a las reportadas, esto se debe a que la energía necesaria para que se dé el complejo activado a partir del cual la reacción ocurre de forma normal, es más baja para la maltosa como sustrato que para el almidón.

0.00314

Ln (k) mol/L*s

-10.3 -10.32

-10.34 -10.36 -10.38 -10.4 -10.42

y = -944.92x - 7.4487 R² = 0.8762 1/T (K-1)

Figura 3. Relación de la constante de velocidad con la temperatura para el cálculo de los parámetros de la ecuación de Arrhenius. De la pendiente de la figura 3 se determinó una energía de activación de 7,86 KJ/mol y una constante de Arrhenius de 0,0005822 mol/L*s. Los parámetros termodinámicos difieren de manera significativa por los reportados por Riaz et. al., (2013) los cuales obtuvieron una entalpia de reacción, energía libre de Gibbs, entropía de reacción y energía de activación de 41.50 KJ/mol, 65,69 KJ/mol, - 72,62 KJ/mol K y 44,27 KJ/mol respectivamente, para la hidrolisis del almidón en glucosa a partir de glucoamilasa obtenida Aspergillus niger. De igual forma, los ∆H, ∆G, ∆S y Ea previamente informados para la hidrolisis de almidón en glucosa por glucoamilasa de Colletotrichum sp por Prajapati & Trivedi (2014) fueron de 23.973, KJ/mol, 57.851 KJ/mol, −113.68 J /mol y 26.45 kJ /mol respectivamente. El valor de la entalpía superior a los reportados de la glucoamilasa mostró que la formación del estado de transición o complejo activado entre enzimasustrato era menos eficiente. Además, un

Teniendo los valores registrados por Sierks, Michael, & Svensson (2000), el cual muestra que para glucoamilasa (salvaje), y una maltosa que tenga 4 grupos hidroxilos (4-OH) se presenta un ΔG de -18,8 KJ/mol, este valor es similar al calculado, pero se presentó a 55°C y 4,5 de pH. CONCLUSION Teniendo en cuenta el comportamiento de la reacción, se logró establecer que la concentración de glucosa producida es mayor a medida que aumenta la temperatura de trabajo de la reacción; de igual manera se establece que la cinética que presenta la reacción es de orden cero, todo esto debido a

6

Prajapati, V., & Trivedi, U. (2014). Kinetic and Thermodynamic Characterization of Glucoamylase from Colletotrichum sp. KCP1. Indian J Microbiol, 87 - 93. doi:10.1007/s12088-013-0413-0

la relación lineal existente entre la producción de glucosa y el tiempo. Respecto a la constante de equilibrio, se encontró que está relacionada de una forma directamente proporcional con la temperatura; es decir, a medida que aumenta la temperatura, aumenta la constante de equilibrio. Con base a los parámetros termodinámicos obtenidos de la reacción, se pudo decir que la reacción fue endotérmica (∆H < 0), irreversible (∆S > 0) y espontánea (∆G < 0).

Quílez, A., & Quílez, J. (2014). Definición y cálculo de las constantes de equilibrio. investigación y experiencias didácticas, 187-203. doi:http://dx.doi.org/10.5565/rev/enscie ncias.1046 Riaz, M., Hamid, M., Sawyer, L., Akhtar, S., Rizwan, M., Nadeem, H., & Wear, M. (2013). Physiochemical properties and kinetics of glucoamylase produced from deoxy-d-glucose resistant mutant of Aspergillus niger for soluble starch hydrolysis. Food Chem, 24 - 30. doi:10.1016/j.foodchem.2011.06.037

BIBLIOGRAFIA Bettín, L., & Quintero, J. (2010). Estudio de la Producción de Jarabes glucosados a partir de Maltodextrinas empleando dos enzimas comerciales. Vitae, 17(2), 165 - 172.

Sierks, Michael, & Svensson, B. (2000). Energetic and Mechanistic Studies of Glucoamylase Using Molecular Recognition of Maltose OH Groups Coupled with Site-Directed Mutagenesis. Biochemistry, 8585– 8592. doi:10.1021/bi9925219

Chang, R., & Goldsby, K. (2002). Química. McGraw Hill. Chaparro, L. (2009). Elaboración de derivados inmovilizados de glucoamilasa mediante entrecruzamiento de agregados de enzimas y formación de enlace covalente sobre soporte. Bucaramanga, Colombia. Crabb, W., & Shetty, J. (1999). Commodity scale production of sugars from starches. Curr Opin Microbiol, 252– 256. Koch, H., & Roper, H. (1998). New industrial products from starch. Starch Starke, 121 - 131. Norouzian, D., Akbarzadeh, A., Scharer, J., & Young, M. (2006). Fungal glucoamylases. Biotechnol Adv, 80 - 85.

7

8