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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO 1. DETERMINACIÓN DE BIOMAS

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO 1. DETERMINACIÓN DE BIOMASA

PROFESOR:ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER ALUMNA:MARTÍNEZSALDAÑA, YURICO ELIZABETH CURSO:BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES CICLO:IX-A HORARIO:JUEVES 11-1 PM

TRUJILLO- PERÚ 2012

LABORATORIO N° 01. DETERMINACIÓN DE BIOMASA I. OBJETIVOS Objetivo General:  Determinar la concentración de células por conteo en cámara Neubauer. Expresándolas en unidades de células/mL. Objetivo Específico:  Reconocer la técnica de contaje en Cámara Neubauer.  Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos; de manera general y manera aleatoria, mediante los métodos de variabilidad y desviación estándar. II. FUNDAMENTO TEÓRICO Biomasa es un término general quese refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células. La determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico.Una variedad de análisis están disponibles para la determinación de Biomasa de muestras biológicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomycescerevisae). Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales. A. Métodos directos de determinación de biomasa:Se basan en el número de células o en el peso celular, dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes: 1. Métodosgravimétricos (Peso Seco) La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica

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adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. 2. Métodosespectrofotométricos. Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez.Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de métodos rápidos, Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas. 3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como la cámara de Neubauer. Thoma, Bürker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Mal assez, Petroff H ttrser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células/ml, generalmente). El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra. Además, pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células vivas de células muertas. a. CÁMARA DE NEUBAUER. Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro. Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4). Conteo en cámara de Neubauer, Esta cámara se utiliza para conteo celular.    

Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, este debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.  La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.

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Figura 1. Conteo por Cámara Neubauer. Representación de la cuadricula 10 X. En la figura 1, si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., debemos ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio 4. Métodos microscópicos mediante epifluorescencia La microscopía de epifluorescencia comenzó a emplearse a principios de los 70 y hoy en día se considera como uno de los mejores métodos para la estimación de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adición de algún anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algún componente celular autofluorescente. Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tinción de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observación directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedarían englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actúan específicamente sobre ácidos nucleícos u otros componentes celulares. El segundo incluiría a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad metabólica, son convertidos en moléculas fluorescentes. Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimación de la población total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten distinguir células de partículas e identificar bacterias no sólo por su color, sino también por su forma y tamaño.El naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las células emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los ácidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. EI fluorocromoDAPI es LABORATORIO N° 01. DETERMINACIÓN DE BIOMASA

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un colorante específico del ADN y su pico de excitación se encuentra próximo a la región ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las células muertas, metabólica- mente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en células muertas.El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina o el DAPI, es un colorante específico de ácidos nucleicos. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del ácido 1 -anilino-8 naftalensulfónico (Mg-ANS) tiñen principalmente componentes celulares como proteínas, lípidos o membranas celulares. En cambio, el comportamiento de estos agentes fluorocromos es el comentado anteriormente, sobrestiman el número de células viables al no distinguir células vivas de muertas.

En el segundo grupo quedarían englobados fluorocromos como el cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC) ó el 5 y 6 diacetato de sulfofluoresceína (SFDA) .Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores, distinguen bacterias metabólicamente activas de las que no lo son mediante la observación microscópica del producto fluorescente resultado de la actividad metabólica para la que son específicos. En el caso del CTC 1a actividad metabólica es la respiratoria y en el del SFDA es la actividad esterasa. La epifluorescencia basada en fluorocromos como el CTC y el SFDA pondrá de manifiesto aquellos microorganismos en los cuales estén presentes dichas actividades metabólicas, pero sin cuantificarlas. Salvando este obstáculo se encuentran las medidas bioquímicas de determinación indirecta de la biomasa, que sí cuantifican actividades metabólicas. La epifluorescencia es un método simple y rápido. No obstante, su reproducibilidad está cuestionada y necesita un equipamiento relativamente caro. La fluorescencia mediante anticuerpos marcados con agentes fluorescentes está basada en las propiedades inmunológicas de las células.Es una técnica muy sensible y específica, y puede realizarse in situ. También puede llevarse a cabo mediante hibridación de sondas fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ hybridization, FISH), cada vez más utilizadas en Ecología Microbiana. 5. Métodos de siembra El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas células viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1- 1 ml de la suspensión microbiológica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensión sobre la superficie del medio de cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volumen de la suspensión microbiológica. Para que el recuento sea estadísticamente significativo, el número de colonias deberá estar comprendido entre 30 y 300 colonias. En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear la filtración de membrana, en la que tras la filtración de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente sobre el agar. Otro tipo de recuentos los constituyen aquellos que emplean un medio de cultivo líquido como es el caso de la estimación del número más probable (NMP). El recuento de microorganismos viables se fundamenta en el desarrollo de una colonia visible a partir de cada organismo viable. El principal problema de este método es que no todas las bacterias presentes en una muestra pueden crecer en el medio y las condiciones de cultivo seleccionado. Suelen ser, por tanto, métodos infraestimativos y estadísticamente cuestionables.

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En el método de conteo celular se expresa en cel/mL, en el método de Peso Seco se expresa en g.m. s/mL, en el método de Peso Húmedo se expresa en g. h /mL y en el método de Conteo de Colonias o Recuento en Placa se expresa en UFC/mL.

B. Métodos indirectos de determinación de biomasa. Estos métodos se basan fundamentalmente en la determinación de algún componente celular específico, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formación de algún producto (métodos cinéticos). También se incluyen en este apartado algunos métodos fisicoquímicos. Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan, más que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen más del estado metabólico de los microorganismos que del número de individuos (Arnáiz et al, 2000). 1.

Componentes celulares. Cualquier componente celular seleccionado para la estimación de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente únicamente en células vi vas, ser rápidamente degradado en células vivas, ser relativamente constante en concentración respecto a cambios en el estado fisiológico celular y entre distintas epsecies. Hasta el momento no existe ningún componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin embargo, los más adecuados para estimar biomasa viva (Arnáizet al, 2000), son: Ácidos nucleicos, El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya síntesis es proporcional a la tasa de crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varían considerablemente con el estado fisiológico celular, la cantidad de ADN es relativamente más constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometría, tras su extracción y purificación. Existen diversas técnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificación son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos (Arnáizet al, 2000). Proteínas, Existen varias técnicas para el análisis de proteínas totales de una muestra biológica. Algunos están muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el caso de las técnicas de Lowry et al. y Bradford.La principal desventaja de la determinación de proteínas es que su cantidad en las células está sujeta a fuertes variaciones debido, fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoquímicas y al estado fisiológico celular (Arnáizet al, 2000). Polisacáridos, La mayoría de las células procariotas contienen ácido murámico (un peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias técnicas para 1a determinación del ácido murámico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversión del ácido murámico a lactato, seguida del análisis enzimático o químico de la concentración de lactato. El ácido murámico se extrae de 1as células mediante una hidrolisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico. Otros análisis más sensibles necesitan del uso de cromatografía líquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas estas técnicas son laboriosas. Muy largas y necesitan de un equipamiento caro (Arnáizet al, 2000). Lípidos, Los lípidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinación para la estimación de la biomasa de una población bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros métodos. La principal ventaja es su alto contenido específico y que se encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los lípidos no forman parte de las reservas ceiulares y se degradan rápidamente durante la lisis bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lípidos de las membranas celulares está en forma de fosfolípidos. Las técnicas de análisis se basan, fundamentalmente, en la extracción

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celular de los fosfolípidos con un disolvente orgánico, su posterior hidrólisis ácida para liberar el fosfato y, por último, 1a determinación colorimétrica de éste. Son técnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato) (Arnáizet al, 2000). ATP, El ATP presenta las ventajas de ser un componente bioquímico central presente en todos los microorganismos y específico de los microorganismos vivos, circunstancias ambas que permiten relacionarlo con la biomasa viva. Una de las técnicas más utilizadas para medir ATP se basa en la reacción luciferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las luciérnagas y que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe que intervienen luciferina (fenol heterocíclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de magnesio y oxígeno en un proceso de oxidorreducción que ocurre en doble etapa: Ya que por cada molécula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinación del ATP en una muestra biológica puede hacerse mediante extracción por ebullición en tampón Tris (hipocloruro de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubación con luciferina-luciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotómetro con registro. La mayor desventaja de esta técnica es 1a necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado fisiológico de las células cambia rápidantente tras la toma de muestra. La relación entre el ATP, el ADP y el AMP y el contenido total de desoxirribonucleótidos refleja la carga energética de las células [(ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). Esta relación puede duplicarse en sólo unos segundos. Algunos autores sugieren que la carga energética es un valor mucho más preciso que el contenido absoluto de ATP ya que la composición celular de desoxirribunucleótidos varía con el estado fisiológico de los microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energético disminuye, al disminuir la concentración de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Arnáizet al, 2000). 2. Métodos bioquímicos. Las medidas de alguna actividad enzimática pueden considerarse como una alternativa a los métodos tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rápidamente. Además. El equiparniento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayoría de las medidas de actividad enzimática se realiza mediante la conversión de sustratos específicos a productos coloreados que son cuantificados fotométricamente. La principal desventaja de los métodos bioquímicos es la variación de las actividades enzimáticas celulares con los cambios fisiológicos y que, una vez que los microorganisrnos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas .Entre las distintas medidas de actividad enzimática cabe destacar: Actividad esterasa Actividad deshidrogenasa 3. Métodos cinéticos. La base de estos métodos es la medida del consumo de sustrato o de la formación de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo más típico en microorganismos aerobios es la determinación de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolución a través del consumo de oxígeno del medio. Adaptaciones del Respirómetro de Warburg Tasa de respiración Tasa de desaparición de sustrato Potencial bioquímico de producción de metano

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4. Métodos en continuo. Durante los años 90 se han desarrollado métodos cuantitativos para la determinación on-line de la biomasa de un proceso biológico. Las técnicas más importantes se basan en propiedades eléctricas, microcalorimétricas o espectrofotométricas de los cultivos biológicos. Sin embargo, a pesar del desarrollo tecnológico, no existe un sensor ideal para la monitorización en continuo de la biomasa.

III. MATERIALES Y MÉTODOS A. Materiales e Instrumentos Levadura Saccharomycescerevisae CamaraNeubauer Jeringa Laminilla cubreobjetos Lámina Portaobjetos Tubos de ensayo Microscopio B. Metodología Con una jeringa se tomará una cantidad de la solución previamente preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilución a la 10 -1y se dejará caer unas gotas en la cámara de Neubauer. Se colocará la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona central, para apreciar una zona cuadriculada. Con la ayuda de una jeringa se obtendrá una pequeña muestra del tubo de ensayo, y se colocará en el borde del cubreobjetos. Se dejará que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Una vez que la muestra ingrese por la cámara de Neubauer, se dejará reposar, y posteriormente, se colocará en el microscopio. Se realizará la cuantificación de células en las zonas de los cuadrados más pequeños de 0.05 mm. tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna.Se contarán las células que estén dentro de los cuadrados las que se noten bien y las células que estén en el lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4. Luego de calcular las células en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se deberá calcularel número de células/ mL(por cuadrado), y por medio de la siguiente fórmula, se determinó el número de células por mililitro. A la vez se deberá calcular la desviación estándar de las 25 celdas. Luego tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviación estándar para luego hacer una comparación.

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IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1.Conteo de Células en 25 celdas, en CámaraNeubauer FILAS

NÚMERO DE CÉLULAS EN CADA UNA DE LAS 25 CELDAS.

1 fila 2 fila 3 fila 4 fila 5 fila

8 9 4 10 12

6 5 2 4 7

10 2 6 5 5

10 10 3 7 2

5 6 1 5 6

Tabla 2. Concentración de las células en las 25 celdas, Desviación estándar y coeficiente de Variación

Concentración de células

Desviación estándar

2.9580

Coeficiente de Variación

Tabla 3.Al azar 5 Células de las 25 celdas de la CámaraNeubauer Números al azar

Concentración de Células

Desviación estándar

Coeficiente de Variación

8 4 10

2.2361

7 6

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SegúnAquiahuati, (2004); la cámara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de las células de levadura, sin embargo nopermite distinguir las células viables de las no viables. Esto se puede contrastar en la tabla 1, en donde observamos que hicimos un conteo de 25 celdas. Según Madigan, et al (1998), mediante el método de conteo directo en cámara de Neubauer se debe utilizar fórmulas que expresen la concentración de células, mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio. Esto se observa en los datos hallados en la Tabla 2 donde determinamos la concentración de células , desviación estándar y coeficiente de variación en las 25 celdas, del mismo modo en la Tabla 3 determinamos lo mismo para 5 celdas al azar , de este modo pudimos determinar la diferencia de levaduras en el laboratorio. Según Rodríguez et al, 2005), los métodos para estimar el número de microorganismos medirán la cantidad de células. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales. Según lo expuesto por el autor en nuestra práctica hicimos conteo de levadura de Saccharomycescerevisaepor mililitro, para la determinación de su biomasa utilizando el método directo por recuento en el microscopio. Según Arnaiz, et al (2000),los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de enumeración celular, son método de observación, basados en propiedades físicas o en la actividad biológica. Mientras que los métodos indirectos estiman algún componente celular o alguna actividad metabólicaespecífica, estos no requieren de examen visual de los organismos ni su incubación. Según Silva, et al (2004), los métodos de recuento de células determinan directamente las células vivas y muertas presentes en una muestra esto puede lograse utilizando una cámaraespecial para recuentos como lade Petroff-Hauser, la Cámara de Neubauer, Siendo estos los más conocidos puesto existen otros tipos de métodos decuantificación como los son el UFC, membrana de filtración, Epifluorescenciadirecta, Coulters, Técnica del número más probable (NMP). Es así que en la práctica se desarrolló la medición de la biomasa microbiana de la levadura Saccharomycescerevisae por conteo directo en cámara Neubauer tomando una muestra en dilución de 10 L a la 10-1 por lo que los resultados arrojados en la Tabla 2 de las 25 celdas nos arrojaron una concentración de células de 1.5 x 106 células/mL , es decir que la dilución indica que la muestra original (la muestra madre) cumplió con los aspectos necesarios para un buen conteo de biomasa; en la Tabla 3 vemos que los resultados arrojados en concentración de células es de 1.75 x 106células /mL, tanto en los resultados de la concentración de 25 celdas y las de las 5 celdas al azar vemos que los valores se asemejan por lo que no hay mucho margen de error así no debemos olvidar que la técnica de conteo no permiten distinguir las células vivas de la muertas, por lo que no será útil en un recuento de poblaciones con altas o bajas concentraciones de microorganismos, pero en nuestro caso nuestro margen de conteo de células las que se pueden ver en la Tabla 1 no es ni alta ni baja concentración. SegúnUnam (1986),en la técnica de conteo de células hay que tener en cuenta que en esta técnica uno de los factores que afecta la observación de las células de levadura es la correcta dilución de la muestra empleada se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente69 células la muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de 20 células, la muestra se encuentra muy diluida. En nuestro práctica la muestra nos arrojaron valores de un total de células por las 25 celdas de 150, por lo que podemos que probablemente se encuentra muy diluida ya que es mayor delas 69 células dichas pro el autor.

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Según Valencia (20019, la desviación estándar es el promedio con respecto de la media aritmética, dice cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del promedio en una distribución. El coeficiente de variación indica un método de comparación de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades diferentes. Es así que en la tabla la desviación estándar de las 25 celdas nos da 2.9580 y en la Tabla 3 para 5 celdas al azar nos da un valor de 2.236 en ambos casos su desviación están próximos porque tenemos en ambos una desviación pequeña indicando que los datos están agrupados cerca de la media. Al igual vemos que le coeficiente de variación de las 25 celdas es 0.493 y de las 5 celdas es 0.447 por lo que sus valores son próximos además de las 5 celdas es una parte de la representación de la muestra general de las 25 celdas por lo que la muestra obtenida es una muestra homogénea y representativa. V. CONCLUSIONES Se logró determinar la concentración de células de la levadura Sacharomycescerevisae en las 25 celdas la que nos dio 1.5 x 106 células /mL y en las 5 celdas al azar nos dio un valor de 1.75 x 106 células / mL por lo que nos damos cuenta que la muestra de 5 celdas al azar es una muestra representativa de la general.se pudo determinar las células por mililitro gracias a la cámara Neubauer. Se pudo determinar el promedio de levaduras (Saccharomycescerevisiae) contadas en las 25 celdas, por el método de conteo directo, usando la cámara de Neubauer, que es un método eficaz para el conteo de dichas levaduras. Se comparó estadísticamente los valores de la concentración de la levadura en las 25 celdas y las de las 5 celdas al azar, del mismo modo se compararon su desviación estándar y coeficiente de variación dando valores en las de 25 celdas de desviación de 2.958 y coeficiente de variación de 0.493 y en el caso de 5 celdas desviación de 2.236 y coeficiente de variación de 0.447. Por lo que la muestra de las 5 al azar es representativa. VI. RECOMENDACIONES Se recomienda calibrar bien el microscopio, con la finalidad de poder observar de manera más clara las levaduras, de esta forma facilitaremos el conteo de las células. Se debe agitar la dilución a emplear (10-1), de manera homogénea para que esta se encuentra debidamente preparada y ser llevada adecuadamente a la lámina portaobjetos. Verificar que mediante el uso de la jeringa se pueda hacer un correcto llenado de la muestra en la cámara de Neubauer. Miraren el microscopio y contabilizar bien la células, las cuales no se tomarán las células que estén la parte derecha del cuadro ni las de la parte inferior del mismo cuadro, ya que ellas formaran parte del siguiente cuadro. Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores. VII. BIBLIOGRAFÍA

AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prácticas: Laboratorio de Microbiología Celular, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnología, 1era Edición, Pág. 63-68. ARNÁIZ,C., ISAC,L. LEBRATO, J. (2000).Determinación de la biomasa en procesos biológicos. SevillaEspaña. LABORATORIO N° 01. DETERMINACIÓN DE BIOMASA

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MADIGAN M. et al (1998). Brock Biología de los microorganismos Octava Edición, Prentice Hall, España, P. 155 – 156. RODRÍGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNÁNDEZ, F. GARCÍA, J. (2005). Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. SILVA, C., GARCÍA, J. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Editorial MAD, S.L. Sevilla. UNAM, (1986); “Biología Celular”, Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad autóctona de México. Pág. 20 – 28. VALENCIA, H. (2001). Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Universidad Nacional de Colombia. 2001. ANEXOS Las ventajas de este tipo de recuentos de Conteo, son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es tedioso y no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de bacterias. No se usa en hifas o mohos.

Figura 2. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular de 10X.

Figura 3. Orientación que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando lacámara de Neubauer

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Figura 4. Orientación para el conteo de microorganismos usando lacámara de Neubauer.

Figura 5. Cuadrículas de la cámara Neubauer

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