INMUNOLOGIA

Inm unología e Inm unoquím ica Fundamentos 1. ^ Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos Quinta edición ZZZPHGLOLEUR

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Inm unología e Inm unoquím ica Fundamentos

1. ^

Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos Quinta edición

ZZZPHGLOLEURVFRP Ricardo Aníbal Margni P rofesor Em érito de la U niversidad de Buenos Aires. P rofesor H onorario de la U niversidad del Salvador. Ex-Profesor Titular Plenario de Inm unología e Inm unoquím ica de la F acultad de F arm acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires. M iem bro de la C arrera del Investigador Científico (Investigador clase Superior) del C onsejo N acional de Investigaciones C ientíficas y Tecnológicas (CO N ICET). D irector del ID EH U -Instituto de Estudios d e ia Inm unidad H um oral (CONICET--UBA)

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C^paaamericana^ M A R C E L O T. DE ALV EAR 2145 - BUENOS A IRES B O G O T Á - C A R A C A S - M A D R ID - M É X IC O - S A O P A U L O

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P rim era edición, octubre de 1972 S egunda edición, setiem bre de 1977 T ercera edición, enero de 1982 C uarta edición, ju lio de 1989 Q uinta edición, setiem bre de 1996

ISBN 950-06-1495-2 84-7903-317-7

IM PR E SO EN LA A R G EN TIN A

Q ueda hecho el depósito que dispone la ley 11.723. Todos los derechos reservados. E ste libro o cualquiera de sus partes no po d ráa ser reproducidos ni archivados en sistem as recuperables, ni transm itidos en ninguna form a o por ningún m edio, ya sean m ecánicos o electrónicos, fotocopiadoras, grabaciones o cualquier otro, sin el perm iso previo de Editorial M édica P anam ericana S.A.

© 1996 ED ITO R IA L M ÉD ICA P A N A M E R IC A N A S.A. M arcelo T. de A lvear 2145 - Buenos A ires, A rgentina

E sta edición se term inó de im prim ir en'e.' .mes de setiem bre de 1996 en los talleres de Editorial M édica P anam ericana S.A. A v. A m an d o A lcorta 1695, Buenos A ires

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Colaboradores

Leopoldo F. Abdon

Leonardo Fainboim

D ocente de la C átedra de Inm unología de la Facultad de Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de B uenos A ires M iem bro del IDEHU

Profesor Titular del D epartam ento de M icrobiología, Parasitología e Inm unología, áren Inm unología, de ¡a Facultad de M edicina de la U niversidad de B uenos Aires, M iem b ro de la C arrera del Investigador C ientífico del C O N ÍC E T

Élida Álvarez Profesora A djunta de Inm unología, Facultad de Farm acia y B ioquím ica cíe la U niversidad de B uenos Aires. M iem bro de la C arrera de Investigador Científico del CO N ICET. M iem bro del ID EH U

Angel Basualdo Profesor Titulíu- de M icrobiología de la Facultad de M ed i­ cina de la U niversidad N acional de La Plata

Guillermo Blanco M iem bro de ia Carrera deJ Investigador Científico del C O N IC E T, M iem bro del ID EH U

Marta Braun Profesora T itular de Inm unología de la Facultad de V eterinaria de la U niversidad de B uenos Aires, M iem bro de la C arrera del Investigador Científico del C O N IC E T

Gloria E. Cerrone B ecaria Posdoctoral del CONICFH’, Laboratorio de B io lo ­ gía M olecular, Hospital de C línicas “José de San M artín” , Facultad de M edicina, D ocente de la Cátedra de G enética y B iología M olecular de la Facultad de Farm acia y B io q u í­ mica de la U nivei'sidad de Buenos A ires

Alberto Fossati P rofesor A djunto de Inm unología de la Facultad d e C ie n ­ cias E xactas de la U niversidad N acional de La Plata, M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico del C O N IC E T , M iem bro del IDEHU

Mirta Franco P rofesora A djunta de M icrobiología de la I’acultad d e F ar­ m acia y B ioquím ica de la U niversidad de B uenos A ires

Mirta Giordano Instituto de Investigaciones H em atológicas de la A cadem ia N acional de M edicina, M iem bro de la Carrera del In v e sti­ gador Científico del CO N IC E T

Fernando Goldbaum D ocente de la C átedra de Inm unología de la F acu ltad de F arm acia y Bioquím ica d e la U niversidad de B u en o s Aires M iem bro del ID EH U

Stella M. González Cappa P rofesora Titular del D epartam ento de M icrobiología, P a­ rasitología e Inm unología de la Facultad de M ed ic in a de la U niversidad de Buenos A ires, M iem bro de la C a rrera del Investigador C ientífico del C O N IC E T

Ménica G. Chíaramonte B ecaria Posdoctoral del CO N IC E T. D ocente de la C átedra de Inm unología de la Facultad de Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos Aires. M iem bro del ID EH U

Ramón A. de Torres P rofesor T itular de M icrobiología de la Facultad de F arm a­ cia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires, M iem bro de la C arrera de! Investigador Científico del CO N IC E T

Elvira L. Durante de Isola P rofesora A djunta de) D epartam ento de M icrobiología, I’arasitología e inm unología de la Facultad de M edicina de la U niversidad de Buenos A ires

Silvia E. Hajos P rofesora Titular de Inm unología de la Facultad d e I:^” , CD45RA‘*‘“™son exclusivam ente hnfocitos T, en tanto que las CD45RO“, CD45RA‘'™“ pue­ den ser células T, células B y células “killer” . En la conversión “náíve” a “memoria” se in­ crementa la proporción de CD25 y disminuye ladeC D 38: CD45RO-, CD45RA>“"”'’......CD 25 (5% ); CD 38 (76%) CD451™, C D 45R A '‘“ >......C D 25 (24% ); CD 38 (53%) CD45RO'"™", C D 45RA -......CD 25 (42% ); CD38 (27%)

Las moléculas C D l la, CD2 y CD4 aumen­ tan en las células “con memoria” . Ello ocurriría después de la pérdida de CD45RA y aparición de CD45RO y no durante los estadios interme­ dios como ocurre con CD25 y CD38. Los linfocitos B y T que han adquirido com­ petencia inmunológica pasan a poblar los órga­ nos hnfoides secundarios, en la proporción y distribución ya indicada para cada uno de ellos. En ese conjunto de linfocitos recirculantes están expresados los receptores capaces de reconocer a los diferentes antígenos, cuyo número se esti­ ma en 5 X 10*^’ hasta 1 x 10’, pudiendo cada uno de ellos expresar entre 5 y 10 epitopes diferen­ tes, en promedio. Dado que cada linfocito B o T expresa un receptor capaz de reconocer sola­ mente un epitope antigénico, la población nor­ mal de linfocitos, calculada para el ratón en 10®, es suficiente para cubrir el panorama de especi­ ficidades necesario para que la labor defensiva contra los agentes agresores sea efectiva. Células accesorias Las células con funciones accesorias que pueden presentar epitopes a los LT para su re­ conocimiento dual (CPA) son los macrófagos.

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monocitos, células dendríticas, astrocitos, célu­ las de Langerhans, pudiendo también cum plir esa función los linfocitos B activados y las cé ­ lulas B de origen tum oral. La característica fundamental de estas células es expresar en sus membranas antígenos codificados por el CM H de clase II y además, especialmente en los m a­ crófagos, de sintetizar y excretar factores cono­ cidos con el nombre de monoquinas, siendo el principal de ellos la interleuquina 1 (IL-1), fac­ tor estim ulativo de fundam ental im portancia para que los linfocitos en estado de rep o so (GO) puedan excitarse, pasar a la fase G1 e in ­ gresar al ciclo celular. Las células accesorias son generalmente fagocíticas y por ese m eca­ nismo captan al antígeno, lo procesan y se acti­ van, incrementando la producción de lL-1. A las CPA se las designa “profesio n ales” cuando en condiciones normales expresan an tí­ genos del CMH en su superficie, así co m o otras moléculas de adhesión. Las CPA son “no profesionales”, no clásicas, si sólo bajo deter­ minadas circunstancias expresan en su superfi­ cie antígenos del CMH. El contacto de los antígenos con las células fagocíticas se hace a través de receptores, en especial por intermedio de CRl y CRII, los que tienen como ligandos a C3b y C3bi, co m p o ­ nentes del complemento resultantes de su acti­ vación por la vía alterna. Estos componentes, al estar unidos a los antígenos e interaccionar con los receptores CRl y CRII actúan como puentes entre el antígeno y el macrófago facilitando su en d o cito sis. La adhesión del antígeno a la m em brana del macrófago puede ocurrir ta m ­ bién por interacciones proteína-proteína o por la unión de ciertas proteínas con funciones de lectinas que se fijan a los hidratos de carbono de algunas glucoproteínas aisladas o co m o componentes de membranas celulares, Los antígenos del CMH de clase I, que se ex­ presan en la membrana de todas las células hu­ manas, excepto los eritrocitos y espermatozoi­ des, están constituidos por una cadena a inserta­ da en la membrana celular, asociada no covalen­ tem ente a una cadena del p2 microglobulina. Los antígenos del CMH clase II están formados por dos cadenas peptídicas, a y P y asociadas no covalentemente, y ambas insertadas en la m em ­ brana celular. Dentro del citoplasma celular y antes de su expresión en membrana, los antíge­ nos de clase II tienen una tercera cadena peptídi­ ca llamada y o invariante, que no presenta iso­ formas y cumple un rol importante en el trans­ porte del péptido antigénico (véase cap. 10). Los péptidos resultantes de la degradación de los antígenos fagocitados constituyen los epito­ pes que finalmente reaparecerán en la superficie de las células accesorias, asociados a los antíge­ nos del CMH mediante uniones hidrofóbicas, y

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Aspectos básicos de la Inmunidad

Cambio conformacional CMH-clase I

I

TAP1

TAP2

Péptido CITOPLASMA Proteasoma

Complejo proteasoma-péptido

F ig. 2-4. Procesado por la CPA y expresión en la m em brana celular de péptidos provenientes de antígenos de síntesis en ­ dógena asociados a CM H-L Parte de la figura por debajo de la línea quebrada: visión am plificada del proceso de fragm en­ tación del antígeno (Ag) por interm edio de los proteasom as (PTS) y transporte al lum en del REÍ a través de los transporta­ dores de péptidos insertados en la m em brana del RE, a efectos de su interacción con los antígenos del CM H -clase L Com o consecuencia del proceso éstos sufren cam bios conform acionales, los que aseguran una m ejor unión y transporte al Golgi. P arte superior: pasaje del com plejo péptido-C M H -I a través del aparato vesicular del Golgi y trans-G olgi h asta la m em bra­ na celular para su presentación al receptor antigénico (R C T) de LT.

en ese contexto son presentados a los linfocitos T. La única excepción a la restricción para el re­ conocimiento dual por los LT son los antígenos del CMH extraños (alotípicos), ya que en ese caso particular no es necesaria la participación de los antígenos del CMH propios. Procesado y presentación del antígeno ¿Qué acontece cuando un antígeno penetra por primera vez en el hombre u otro vertebrado que ya ha desarrollado su sistema inmune? Las células que actúan en primer lugar son los m a­ crófagos y otras células presentadoras de antí­ genos. El procesamiento de ese antígeno será distinto según se trate: a) de un antígeno endó­ genamente sintetizado, como lo son las proteí­ nas virales correspondientes a virus que infec­ tan las células, los neoantígenos producto de células que han sufrido transformación malig­ na, etc, o b) que el agente agresor sea un coinponente antigénico externo del tipo de las bac­ terias, parásitos o proteínas extrañas.

En el primer caso, la proteína viral u otra si­ milar de origen citoplasmático es degradada en el citosol por un grupo de proteosomas (PRT), -unidad que contiene sitios catalíticos m últi­ ples-, y se originan simultáneamente y a partir del mismo sustrato diferentes péptidos. Estos sitios proteolíticos múltiples facilitan la p ro ­ ducción preferencial de los pequeños péptidos que habrán de constituir los epitopes antigéni­ cos secuenciales a reconocer por los linfocitos T. Estos péptidos son transferidos a las unida­ des transportadoras (TAP) que residen en la m em brana del retículo endoplásm ico (RE) y que transfieren a su vez los péptidos al lumen del RE, los que en el Golgi se unen a las nue­ vas inoléculas del CMH de clase 1. Esta unión induce cambios conformacionales en las molé­ culas CMH, que habrán de llevar a su estabihzación y facilitar el transporte del com plejo péptido-CMH clase 1 a la superficie celular pa­ ra su reconocimiento por el receptor antigénico del linfocito T (fig. 2-4). Los antígenos extraños adheridos a la super­

La respuesta inmune ficie de la célula que habrá de participar en su presentación serán endocitados por pinocitosis, proceso que consiste en la ingestión de partícu­ las solubles o fluidos, o por fagocitosis cuando se trate de restos celulares, bacterias o produc­ tos de agregación. En ambos casos se forman vesículas o vacuolas que se vierten en los en­ dosomas tempranos, primer compartimento do­ tado de proteasas eficientes a pH ácidos, nece­ sarias para iniciar la degradación del antígeno. Entre éstas, las dos más importantes son la catepsina B y D. El proceso continúa luego en los endosomas tardíos y concluye con la participa­ ción de las vesículas lisosomales, caracteriza­ das por contener un elevado ntímero de enzi­ mas proteolíticas. Las moléculas de antígenos procesadas por la vía endocítica no tienen posibilidades de unirse a los antígenos del CMH clase L Sólo lo hacen a moléculas de clase IL El ensamblado de tas cadenas a y P de los antígenos del CMH clase II para formar el heterodímero tiene lugar en el RE. Durante la biosíntesis de estas molé­ culas una tercera cadena denominada y o inva­ riante (Ii) se une al heterodímero en forma tran­

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sitoria, impidiendo su unión a péptidos endóge­ nos en el RE y asegurándole de este modo su participación en la vía endocítica. Si bien el en­ samblado de la cadena no es un requerimiento absoluto para la expresión del heterodím ero aP , incrementa la eficiencia del proceso. Las inoléculas de clase II transportadas a partir del RE lo hacen bajo la forma de un armazón com ­ plejo constituido por 3 cadenas y en el que se insertan 3 hetrodímeros ap. C u an d o las m o lécu las lleg an al re tíc u lo trans-G olgi (RTG) y como consecuencia de una señal determinada, el complejo aP y se diri­ ge, por alguno de los mecanismos de la v ía en­ docítica cuya localización no ha sido determ i­ nada hasta el presente, a los endosom as que contienen los antígenos procesados. D urante este tránsito la cadena y es degradada y el h ete­ rodímero a p puede entonces unirse a los p ép ti­ dos antigénicos exógenos (fig. 2-5). El tiempo que las moléculas del CMH clase II tardan en atravesar la ruta endocítica y aparecer en la su­ perficie celular es de 1-3 horas. El pH ácido predominante en los endosomas/lisosomas con­ tribuye a una mejor degradación de las m olécu­ Ag exógeno Péptido exógeno CMH-clase ['

Péptido e n d ó g e n o L iJ CMH-clase II

F ig. 2-5. P rocesado p or la C PA y expresión en la m em brana celular de péptidos provenientes de antígenos de sín tesis ex ó ­ gena y endógena, asociados al CM H-II,

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Aspectos básicos de ía inmunidad LINFOCITO Th

CMH-clase II CELULA PRESENTADORA DE ANTIGENO Aminoácidos componentes del epitope

Aminoácidos componentes dei agretope Fig. 2-6. E pitope y agretope. El conjunto de am inoácidos identificados con que contactan con el RCT, constituyen el epitope-, los identificados con (□), que contactan con el CM FI-clase II constituyen el agretope.

las de antígeno endocitadas y a un aumento de la eficiencia de la unión de los péptidos a las moléculas del CMH clase II. Si bien los antígenos del CMH clase II nor­ malmente presentan péptidos provenientes de antígenos exógenos, pueden también, en deter­ m inadas circunstancias, presentar antígenos endógenamente sintetizados. Ello ocurre en las respuestas con formación de anticuerpos de la

clase IgG contra antígenos procedentes de una infección viral, las que sólo tienen lugar si el linfocito B es “ayudado” por un linfocito T “helper” que ha aprendido a reconocer pépti­ dos andgénicos asociados al CMH clase II. Su mecanismo no está bien determinado; podría ocurrir que antígenos endógenos expresados en la membrana celular asociados a CMH cla­ se I para su reconocim iento por las células LINFOCITO Th

Ag procesado

Fig. 2-7. Procesam iento del an tí­ g eno por el m acrófago y p resen ­ ta c ió n d e l c o m p le jo p é p tid o C M H -II a las cadenas a y |3 del R C T de un Th. Se in d ican a d e ­ m ás las cadenas peptídicas cons­ titutivas de CDS y la fam iha zeta, C D 4 y la interacción entre CD28 y B7 y de un par de m oléculas de adhesión (C D 2/LFA -3) com o re­ presentativas de estos procesos.

La respuesta inmune CD8+ fueran luego endocitados. En este caso el proceso seguiría la vía endocítica que lleva a la asociación con antígenos clase II y su ex­ presión en la superficie celular para su recono­ cimiento por los receptores antigénieos de las células CD4+. Otra posibilidad es que se for­ men autofagosomas que incorporen proteínas citoplasmáticas y que después de la fusión con estructuras lisosomales esas proteínas antigé­ nicas sean procesadas por la vía de los antíge­ nos del CMH clase II. La vía endógena de procesamiento del antí­ geno, utilizada cuando los péptidos resultantes se van a unir a antígenos del CMH clase 1, es distinta de la que tiene lugar cuando los antíge­ nos van a ser presentados por moléculas de cla­ se 11. En el primer caso el proceso puede ser bloqueado con inhibidores de síntesis de pro­ teínas o mediante brefeldina A, un inhibidor específico del transporte entre el RE y el Golgi, y no es alterado por cloroquina. Esta droga en cambio, al igual que el NH4C1, impide la acidi­ ficación de los endosomas y produce el conse­ cuente bloqueo del procesamiento del antígeno a ser presentado por moléculas de clase II. Un antígeno extraño, endógeno o exógeno, será procesado por los macrófagos y otras célu­ las presentadoras del huésped, y en el contexto de los antígenos del CMH clase 1 y clase II, pe­ queños péptidos de 8-15 aminoácidos serán ex­ presados en sus membranas. Los complejos es­ tarán en condiciones de ser reconocidos por aquellos linfocitos T maduros que se encuen­ tran en los órganos linfoides secundarios for­ mando parte del conjunto de células T recircu­ lantes, dentro de las limitaciones de su restric­ ción y especificidad. Los pequeños péptidos antigénieos se unen en forma lineal, por uniones no covalentes, a la parte variable de los antígenos del CMH clase I y clase II, que en esa zona presentan una es­ tructura en forma de celdilla que, por estudios de cristalografía de rayos X, se ha demostrado que está form ada por proteína con estructura secundaria de dos a-hélices cruzadas por es­ tructuras en lámina p plegadas (véase cap. 10). Los aminoácidos del péptido que se unen al an­ tígeno del CMH constituyen el agretope y no son necesariamente los mismos que se exponen para ser reconocidos por el RCT (epitope) (fig. 2-6). Experimentalmente se ha demostrado que en el péptido obtenido de mielina de rata y pos­ teriorm ente acetilado, compuesto de 11 am i­ noácidos (A c.A la-Ser-G ln-L ys-A rg-Pro-SerGly-Arg-His-Gly), la Gln que ocupa el lugar 3 y la Pro hacen contacto con el RCT; la Ala y la Lys lo hacen con los antígenos del CMH. Pai'a que la unión CPA-LT se efectivice ade­ cuadamente, además de la unión RCT-péptido otras interacciones entre moléculas de adhesión

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de las membranas de ambas células tienen lu­ gar (véase cap. 11). Sim ultáneam ente las células m acrofágicas sintetizan y secretan lL-1 y TNF, m oléculas que activan a los linfocitos que reconocieron al antígeno por ellas presentado y se encuentran en fase de reposo o GO e inducen su pasaje a las fases G1 y S, o de síntesis, del ciclo de vida celular (fig. 2-7). Si el linfocito T era del serotipo CD8+ y su RCT tenía restricción para antí­ genos CMH clase I, el linfocito excitado habrá adquirido capacidad para reconocer y destruir, como célula citotóxica o linfolítica efectora, a cualquier otra célula que exprese en su m em ­ brana ese producto CMH clase Lpéptido. Si la célula T era CD4+, su RCT poseía restricción para CMH clase II y sintetizaba IL-2, el linfo­ cito T estimulado adquirirá capacidad para in­ ducir respuestas de hipersensibilidad tard ía cuando encuentre al péptido antigénico especí­ fico presentado en el contexto del CMH clase 11. Estos linfocitos, como ya se indicara, son identificados como T H l. Algunas de estas es­ tirpes eelulai'es pueden ejercer efecto coopera­ tivo o “helper”. Si la célula T CD4* que reco­ noce al CMH clase 11-péptido es productora de IL-4, IL-5 e IL-10, identificada como TH2, ejercerá un efecto cooperativo sobre los linfoci­ tos B, asegurando una respuesta efectiva de es­ tas células (fig. 2-8). Un linfocito B reconoce al antígeno en fase fluida, sin necesidad de degradación p revia y sin requerimiento de célula presentadora de an­ tígeno o restricción de antígenos del CM H, Cuando el receptor B (IgM de membrana) cap­ ta al antígeno, el LB se activa, se diferencia en célula plasmática y secreta inm unoglobulinas de la misma especificidad que la de su recep­ tor. Si el antígeno que indujo la respuesta es Tindependiente, ella será con producción de an­ ticuerpos IgM ya que los antígenos de ese gru­ po, por poseer efecto mitogénico o determinan­ tes antigénieos próximos y repetidos, producen agregación de los receptores y transducen las señales que llevan a la activación y diferencia­ ción celular, aparentemente sin la necesidad de otros intermediarios. Hay estudios que parece­ rían indicar que en algunos casos se necesitaría el estímulo de IL-1. Los antígenos T-independientes no inducen cambio o “switch” de clase de inmunoglobulina por lo que la respuesta es siempre de tipo IgM. El cambio de IgM a IgG u otros isotipos de inmunoglobulinas es depen­ diente del antígeno y de las diferentes interleu­ quinas sintetizadas principalmente por los lin­ focitos Th. Si el inmunógeno es un antígeno T-dependiente, el antígeno por sí solo no es suficiente para que la respuesta inmune sea efectiva. Para que ello ocurra necesita de la cooperación de

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Aspectos básicos de la inmunidad

los linfocitos Th. D urante mucho tiem po se consideró que el Th, para ejercer su efecto coo­ perativo reconocía, del antígeno fijado por el LB a través del epitope, a la parte soporte o “carrier” la que actuaba como puente entre am­ bas células. E.ste concepto dejó de ser válido cuando se demostró que el LT sólo reconocía pequeños péptidos resultantes de la degradación del antí­ geno, asociados a antígenos del CMH. El LT había aprendido a reconocer al antígeno pre­ sentado por el macrófago de una manera dife­ rente a la efectuada por el LB, ya que éste lo fi­ jaba por su epitope a través de la IgM de mem­ brana (IgMm). Actualmente esto ha sido clari­ ficado, pues se ha demostrado que el linfocito B cuando fija al antígeno por su receptor espe­ cífico lo internaliza, procesa y expone en su mem brana los diferentes péptidos resultantes asociados a moléculas de antígenos CMH clase II, de modo análogo al que hacen las células presentadoras de antígeno. Este producto es el que reconoce el linfocito Th. Esto implica que el LT no reconoce el mismo epitope cjue el LB, y que el efecto cooperativo lo pueden ejercer los distintos Th capaces de identificar a cada uno de los diferentes péptidos, resultantes de la degradación antigénica, expuestos en membra­ na del LB asociados a antígenos del CMH cla­

se II. Al mismo tiempo el LB expresa recepto­ res para IL-2 e IL-4, los que interaccionan con la IL-2 o IL-4 secretada por el Th. Estas inte­ racciones son las que estimulan al LB y lo lle­ van a diferenciarse en piasmocito y a sintetizar anticuerpos con la misma especificidad que su receptor específico (IgMm) (fig. 2-8). Cuando un antígeno es inoculado por prime­ ra vez en un animal virgen, los eventos que se ponen en marcha son los indicados; la respues­ ta primaria es iniciada por unos pocos linfoci­ tos (células “nai've”) que poseen receptores es­ pecíficos para el antígeno (fig. 2-9). Además, linfocitos T y B que no se transforrnan en célu­ las efectoras, perduran en el huésped por perío­ dos prolongados como células con “memoria” inm unológica. Nuevos estím ulos antigénicos contactarán rápidamente las células con mem o­ ria las que, por el hecho de tener especificidad definida y formar parte de una población celu­ lar más numerosa que las que pudieron recono­ cer al antígeno durante el primer estímulo, in­ ducen una respuesta más acelerada y de mayor magnitud. El clon celular correspondiente a los linfocitos T se habrá incrementado y la produc­ ción de anticuerpos por las células de la línea B será de un nivel superior. En este caso la res­ puesta inmune inducida se denomina “secunda­ ria”, la que resulta mucho más efectiva que la

Ag T-indOTendiente

Diferenciación

Y Y Y IgM

Proliferación y diferenciación IgM; IgG; IgA IgD; IgE Y

C é lu la

'

' plasmática

• Epitope Péptidos • CMH-I « C M H -ll « , ■< Receptor B V ^R e ce p to rT (C M H -I) S r'R s c e p to rT (CM H-ll)

Mastocito ■oliferaclón)

Fig, 2-8. Interacciones entre células presentadoras de antígenos (CPA ), linfocitos B, linfocitos T (Th, Te) y los productos solubles por ellas sintetizados (interleuquinas), ante una estim ulación con antígenos T-independientes (A) y T -dependien­ tes (B)

La respuesta inmune

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MÉDULA ÓSEA

L1‘ Células indiferenciadas BURSAI

LB

TIMO

j J I d O I I ICtLIV

'^ m e m o r i a (

LTCD4+ (Th1)\ (hipersensibi­ lidad tardía)

)

(efectores)

K qmM Respuesta primaria

LT CD8", Te Respuesta primaria

F ig. 2-9. R espuesta inm une prim aria y secundaria. L as células indiferenciadas de la m édula ósea pueden adquirir c o m p e ­ tencia inm unológica a través del tim o o de órganos b u rsa sím ilis, diferenciándose en linfocitos T y B, respectivam ente, los que pasan a integrar la población de linfocitos recirculantes que no ha sido im pactada p o r antígenos. C uando esto ocurre los linfocitos B se replican y diferencian en células plasm áticas sintetizadoras de anticuerpos (IgM ); los linfocitos T o rig i­ nan clones de células efectoras (CD4+ T H l y Te) y reguladoras (CD4+ TH 2). Parte de las células perd u ra por largos p e río ­ dos com o células de m em oria, las que ante nuevos estím ulos antigénicos se m ultiplican y diferencian rápidam ente, con una respuesta secundaria m agnificada respecto de la respuesta prim aria.

respuesta “primaria” . Durante este proceso hay maduración de la respuesta inmune, caracteri­ zada por el cambio de clase de inmunoglobuli­ na, generalmente IgG y una mayor afinidad o capacidad de unión del antígeno a los anticuer­ pos que se sintetizan. En la inducción de este fenómeno participan aspectos propios del antí­ geno inductor usado y distintos tipos de linfo­ quinas sin tetizad as por los lin fo cito s (fig. 2-10). El efecto resultante de las estim ulacio­ nes repetidas es el que se busca cuando se quie­ ren obtener inmunizaciones activas (vacunacio­ nes) exitosas y cuando se intenta lograr inm u­ nosueros de alto título de anticuerpos y buena afinidad.

B IB L IO G R A F ÍA 1. A da GL, N ossal, G. “The clonal selection th e o ry ” . S ci­ entific Am erican, 257(2):62, 1987. 2. B e rg EL , G o ld stein L , J u tila M A , y col. “ H o m in g receptors and vascular addressing: cell adhesión m o le­ cules that direct lym phocytre traffic” . Im m u n o lo g ica l R eview , 108:5, 1989, 3. B la k w ill, F .R ., B u rk e , F. “l ’he cy to k in e n e tw o r k ” . Im m unology Today, 10:299, 1989. 4. B utcher EC. “C ellular and m olecular m echanism s that direct leukocyte traffic” . A m erican Journal o f P athology, 136:1, 1990. 5. D orshkind K. “R egulation of hem atoopoiesis b y bone m a rro w stro m a l c e lls and th e ir p ro d u e ts ” . A n n u al R eview of Im m unology, 8:111, 1990. 6. G erm ain RN, M argulies D H. “T h e bio ch em estry and cell biology of antigen p rocessing and p re se n ta tio n ”. A n n u a l Review o f Im m unology, 11:403, 1993.

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Aspectos básicos de la inmunidad Proliferación de linfocitos i

Síntesis de anticuerpos

Fig. 2-10. D iferentes interleuquinas que participan en la activación del linfocito B y en el cam bio o “sw ich” de clase de inm unoglobulina.

7. G rey H M ., S ette A, B uus S. “tio w T cells see a n ti­ gen” . Scientific Am erican, 2 6 l(5 ):5 6 , 1989. 8. H a m in e rlin g G J, M o re n o .1. “T h e fu n c tio n o f th e invariant chain in antigen presentation by M H C class n m olecules” ./m m M no/og)'7’o day, 11:337, 1990. 9. H arding CV. “Pathw ays o f antigen processing” . C ur­ rent O pinión in Im m unology, 3:3, 1991. 10. Jan ew ay C A , G o ld stein P. “ L y m p h o cy te activ atio n and effector function” . Current O pinión in Im m unolog y 4:241, 1992. 11. K inkadc PW . “Experim ental m odels for understanding B lym phocyte form ation” . A dvances in Im m unology, 41:181, 1987. 12. K in k ad e PW , L ee G, P ie tra n g e li C E, H ay ash i S -t, G im blc JM . .“Cells and m olecules that regúlate B lymp h o p o ie s is in b o n c m a r r o w ” . A n n u a l R e v ie w o f Im m unology, 7:111, 1989. 13. L esley J, H e Q , M iyake K, H am a n n A , H ym an R, K inkade PW . “Requerim ents for hyaluronic acid b ind­ ing by CD 44: a role for the cytoplasm ic dom ain and ac tiv a tio n by a n tib o d y ” . J o u r n a l o f E x p e r im e n th a l M edicine, 175:257, 1992, 14. M ac Lennan I, “The evolution o f B -cell clones” , C ur­ rent Topics in M icrobiology and Im m unology, 159:37, 1990, 15. M e lc h e r F , “ A n n u a l R e p o r t” , B a s e l I n s titu te f o r Im m unologyy, 1992 y 1994, 16. M elcher F,, H aasner D,, G raw under U,, K alberer C,, K arasuyam a H,, W inkler T,, R olink AG, “Roles o f Ig H and L chains and o f surrogate H and L chains in the dev elo pm ent o f cells o f th e B lym phocyte lin eag e” , A n nual R eview o f Im m unology, 12:209, 1994, 17. M o n aco JJ, “A m o le c u la r m o d e l o f M H C c la s s-Ire s tric te d an tig en p ro c e s s in g ” , Im m u n o lo g y Today, 13(.5):I51, 1992, 18. N eefjes JJ, Ploegh H, “Intracellular tra n sp o n o f M HC class II m o lecu les” , Im m u n o lo g y Today, 13(5): 179, 1992,

19, O sm ond DG, “ B cell dev elo p m en t in the bo n e m a r­ row ” , Sem inars in Im m unology, 2:173, 1990, 20, P a rk e r D C , “ T -c e ll d e p e n d e n t B ce ll a c tiv a tio n ” , A nnual Review in Im m unology, 11:331, 1993, 21, P aul W . F u n d a m en ta l Im m u n o lo g y. 3rd Edit, 1993, R aven Press, N, York, 22, Prince, H, E,, York, J,, Jensen, E, R, “Phenotypic co m ­ parison o f the three populations of hum an lym phocytes defined by CD 45R O and C D 45R A expression” , C ellu­ lar Im m unology, 14 5 :2 5 4 , 1992, 23, R eth M, H om liach J, W ienands J, C am pbell KS, Chien N , Jiistem en t L B , C am b ier JC, “T he B -cell an tig en receptor co m p lex’’. Im m unology Today, 12:196, 1991, 24, R oche PA , C ressw ell P, “Invariant chain association w ith H LA -D R m olecules inhibits im m unogenic p e p ­ tide binding” , N ature, 345:615, 1990, 25, R o th b a r d J B , G e f te r M L , “ I n te r a c ti o n b e tw e e n im m u n o g en ic p ep tid es and M H C p ro te in s ” , A n n u a l R eview (if Im m unology, 9:527, 1991, 26, V an Ew ijk W , “T-cell differentiation is influenced by th y m ic m ic r o e n v ir o n e m e n ts ” , A n n u a l R e v ie w o f Im tm m ology, 9:591, 1991, 27, V itetta ES, B erton M T, B urger C, K epron M , Lee W T, Yin X -M . “M em ory B and T cells”. A n n u a l Review o f Im m unology, 9:193, 1991. 28, W illiam s D E, F letch er FA , Lym an SD , D e V ries P, “C y to k in e re g u la tio n o f h em ato p o ietic stem c e lls ” , Sem inars in Im m unology, 3:391, 1991, 29, Zinkernagel R M , D oherty PC, “M H C -restricted cy to ­ toxic T cells: studies on the biological role o f polym orphic m ajor transplantación antigens determ ining T-cell re s tric tio n s p e c if ic ity ” , A d v a n c e s in Im m u n o lo g y , 27:51, 1979, 30, Prince HE, Y ork J, Jensen ER, “Phenotypic com pari­ son o f the trree p o p u la tio n s o f h um an ly m p h o cy tes defined by C D 45R O and C D 45R A expression” C ellu­ lar Im m unology 145: 254, 1992,

La respuesta inmune

29

Compilado por: L. Fainboim Anexo I: Listado de clusters de diferenciación (CD) leucocitarios basado en los resultados del V Taller Internacional realizado en Boston, en noviembre 1993. Referencia sobre los m ism os pueden encontrarse en: Leuiiocyte Typing V.- wlrite cell differentiation antigens. Eds. S. Schlossman y col. Oxford University Press, 1994. CD

O tras denom inaciones P M (kD)

CDl a C D lb D ]c CD2 CD2R CD3

T6 W M 25 M241

T3

49 45 43 50 50 5 cadenas

CD4

T4

55

CD5 CD6 CD7 CDS

TI TI 2

67 100 40 34

^ ,| 1

TS (hom odím eros y heterodím eros)

CD9 CDIO

CA LLA

24 100

C D l la

L FA ^Í

170

C D llb

CR3,M A C-1*

165

C D llc

p l5 0

150

C D I2 CD13

90-120 150

CD14

55 (mo) 64 (B) trisacárido

CD15

Lew is X*

CD15S

sLex,*

CD16

FcR IIIA / FcRIllB FcR lIIB

C D l 6b C D w l7

? Ligando para cél. T y8 Igual que C D l a Igual que CD 1a L igando para CD58 V ía alternativa de activación T A sociado al TCR. T ransducción de señales T Interactúa con M HC clase II T ransducción de señales Ligando para CD72 7 7 Interactúa con M H C clase I T ransducción de señales A ctivación plaquetaria? Idéntica a la endopeptidasa neural (enkefalinasa) CD 11 a/C D 18 ligando IC A M -I e lC A M -2 C D l lb /C D 1 8 interactúa con pro­ teínas de la m atriz y es el re­ ceptor para iC3b C D l Ic/C D l 8 ligando de fibrinógeno 7 A m inopeptidasa

R eceptor del com plejo de LPS y la proteína que une LPS El A cM inhibe fagocitosis y efecto m icrobicida en N E form a siali- Ligando para CD 62E tada R eceptor baja afinidad para IgG 50-65 agregada Unión a m em brana po r G PI. No 48 envía señales LacC er de los N e involucrado en LacC er exocitosis 0 em paquetam iento granular 95 V éase C D l l

CD 19 CD20

cadena |32 de las inte­ grinas B4 Bl

CD2I

CR2

145

CD22

BL-CA M

130/I40Í

CD23 CD24

F ceRII, Blast-2

45 35-45

CD25

IL-2R

55

CD18

95 33-37

R egulación proliferación B R egulación activación y prolife­ ración B R eceptor para C3d y EBV activa­ ción B C adena (3 ligando para C 45R 0 y C D 72 R eceptor baja afinidad IgE ? Induce activación y proliferación cel. T ,B ,tim ., N K, M a. P roteasa de superficie celular

CD26

110

CD27

55 hom odí­ L igando de CD70, señal coestim uladora cél. T vírgenes mero 44 hom odí­ L igando de CD 80 (señal coesti­ m ulatoria) m ero H eterodím eros C D 29/C D 49 me­ 130 dian adhesión célula-célula y a m atriz

CD28 CD29

subunidad p i integri­ nas

D Lnribución celular

P apel biológico

Tim ocito, CL Igual que C D l a Igual que C D l a, Subpob. B T, N K T activados T T que reconocen M H C clase II T, subpob. B (B la ) A lgunos T y algunos B T T que reconocen M H C clase I Pre-B, B inm aduros, M o, Pl Pro, algunos Pre-B, algunos B m ad u ro s, Gr L Cél. M ié y NK

Cél. M ié, altos niveles en Ma, m a rcad o r de LCV M o, G r, Pl Prec. m ielom onocíticos, Mo, Eo, N e, CEp, intestino delgado, túbulos ren ., m em b. sinápticas, F i, Oc M o, M a, algunos Gr, B N e, Eo Igual a C D l5 N K, M a Ne Ne, M o, Pl

V éase C D l 1 Pro- B hasta B activadas, CFD Pre-B hasta B activadas B m aduras, CFD, subpoblación tim ím ica, epitelio faríngeo B m aduras (60-80% ), I.CV citop. d e pro-B , pre-B, B F cella: B. Fcellb: M o Pro-B , pre-B y B, Gr, Ti (2%), n eu ro blastom a, T act. Cél. activadas T, B y Mo T y B en reposo y activadas. C E p ren al e intest., canal, biliar T, Ti m edulares, B activ,, Pl T C D 4 (95% ), T CDS (50%) L e en reposo y activados

C o n tin ú a

30

Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación) CD

Otras denom inaciones

C D 30

Ki^ 1

105

CD31 C D 32

PECA M FcyRIIA

130-140 40

CRl

67 105-120 250

CD33 C D 34 CD 35

88

CD 36 CD 37 CD 38 C D 39 C D 40

TIO

P apel l)iológico

P M (Ií D)

40-45 43 78 50

R eceptor baja afinidad IgG

M ediador de fagocitosis por su unión a C 3b y C4b ? R eceptor eritrocitario para Plasm odium falciparum

7

C ooperación T-B a través de unión a gp39 en T activados C adena a del heterodím ero con C D 6 I, involucrado en adhesión y agregación plaquetaria. Une fibrinógeno, fibronect, vitronect. P arte del com plejo CD 42 U nión a factor de von W illebrand. R eceptor a trom bina Parte del com plejo CD42 Parte del com plejo CD42 Ligando de CD 54

C D 41#

G PIlb

125/22

C D 42a C D 42b

G PIX G P IB ,a

23 135,23

C D 42c C D 42d CD43

G PIB ,p GPV Sialoforina

C D 44

Pgp-1

22 85 95 (T) 115-135 (Ne) R eceptor para ácido hialurónico. 80-95 por el cual une Li a HEV

210

C D 45

LCA ,B 220

V ariante de CD 44 con condroitín sulfato A ctividad fosfo-tirosino-fosfata180-240 sa. C D 45R O ligando de CD 22 240 (cél B) a 180 (Ti)

C D 46

M CP,TLX

51-58 y 59-

C D 44R

68 C D 47

C o 'facto r proteico de m em brana (M CP) que al unir C3b o C4b perm ite que el factor I degrade C3b o C4b

47-52

C D 48

Blast-I

40-47

C D 49a

VLA-1 (cadena a l )

210

C D 49b

V LA -2 (cadena a 2 )

160

C D 49e C D 49d

V LA -3 (cadena a 3 ) V LA -4 (cadena a 4 )

125 150

C D 49e CD 49f C D 50 CD51

V LA -5 (cadena a 5 ) V LA -6 (cadena a 6 ) ICA M -3

135,25 120,25 124 140 cadena a v

C D 52 CD 53

Cam path-1

21-28 32-40

H eterodím eros C D 49/C D 29 ad­ hesión a m atriz extrace-m ediada por la secuencia Arg-GlyA sp (RG D ). C olágeno (CD 49a,b), Lam i-(C D 49a,b,c), fibronectina (CD 49c,d,e), HEV de placas P eyer (CD 49d) A diferencia de otras integrinas C D 49/C D 29 m edia adhesión célula a célula por su unión al ligando VCAM -1 Ligando LFA-1 R eceptor para vitronectina, (C D 51/C D 61). R econoce RGD en m atriz extracelular, (von W illcbrand, fibrinógeno, vitro­ nectina)

D istribución celular T y B activ. Cél. R eed-Stem berg, linfo­ mas a cél. grandes anaplásticas, Pl, M o, Gr, CE M o, Pl, Gr, Ce y sus uniones Todas las form as en Mo, C E y trofo­ blasto. FcyRIIA y C en Ne. FC^RIIB en B Prec. M ié (luego de CD 34), M o Cél. hem atopoyéticas inm aduras y CE Ne, Eo, subp T, B, M o, podocitos glom erulares G licoproteína m ayor de Pl, M o, CE, v e­ na um bilical B. B aja expresión céls. M ié Prec. T y B tem pranos, T y B activ, P B activ, N K activ, Subp. T, Ma, CD, C L CD, B, algunas CEp Pl, m egacariocitos

Pl, m egacariocitos Pl, megacariocito.s Pl, m egacariocitos Pl, m egacariocitos Ti, T, Gr, M o, Ma, NK, Pl, B activ, P, stem cells de M O y timo T, B, M o, Gr, Ti m edulares, Er, CEp, cél m em oria Sustancia b lan ca de SNC, miisculo esquelético, tum ores Li Excepto Er, todas las células hem atopo­ yéticas. Las isoform as C D 45RA, CD 45RB , CD 45RC y C D 45R O se ex ­ presan diferencialm ente en distintas células (véase texto) Ti, T, B, M o, Gr, NK, Pl, CE, C Ep, F, placenta, esperm a

Todas las cél. hem atopoyéticas, CEp, CE, F, esperm a T, B, Ti, M O (30% ), Eo, CEp bronquial y salival T reposo (CD49d) T m em oria aum enta C D 49e,f Ti (CD 49d,f), B (CD 49b,c,d) M o (CD 49b,e,f), Pl (C D 49b,e,t) C Ep (C D 49f a.sociado a cadena (34)

Ti, T, B, M o, Gr Pl, m egacariocitos

T i , T , B , G r ( l 5 % ) , E o (30% ) Ti, T, B, M o, Pl, Gr, Oc, Ob

La respuesta inmune

31

Anexo I. (Continuación) CD CD 54

IC A M -I

80-114

CD55

DAF

70

CD56

N^CAM M ol. de adhesión neural HNK-1 LFA -3 M IR L

17.5-185

CD57 CD58 CD59

CD w 60* U M 4D 4 CD61 G P Illa CD 62E

ELAM 4

CD 62L C D 62P

LAM-1 PAD G EM

CD63 CD64

FcyRI

CDw65''‘ V lM -2 C D 66a BG P CD66b CD 67 CD66c N CA CD66d C G M l C D 66e CEA CD67 actual C D 66b CD68 CD69

MLR^3

CD70 CD71

CD72 CD73 CD74 CDw75 C D w76 antes CD76 CD77*

BLA

CDw78 A ntígeno Ba CD79a

lg a ,ra b -l

CD79b CD80 CD8)

Igp,B 29 B7,BB1 T A PA -I

CD82 CD83

R 2 JA 4 HB15

CD w84 267,152-1D5 V M P-55 CD85 B 7.2, FUN ^l CD86

P apel biológico

P M (kD)

Otras denom inaciones

lio

7 L igando para CD2 R egula la acción del C ’ por su unión a C8 y C9 7 Trisacárido Es la cadena (3 que se asocia a 110 CD41 Ligando del epitope sLe* 115 R eceptor para N e y T Unen linfocitos a HEV 75-80 M edia la interacción de plaq. ac­ 150 tiv. con neu. y mo. U ne sLex 7 53 R eceptor de alta afinidad IgG 75 U nico que une m onóm eros oligosacárido A ctivación de neutrófilos Los C D 66 pertenecen a la fila, de 180-200 A gs carcino-em brionarios de 95-100 m oléculas de adhesión involu­ 90-95 crada en adhesión hom otípica 30 180-200 55-70 18-20

no

D istribución celular

A m plia. Cél. hem atopoyéticas y n o h e­ L igando para L F A -1 m atopoyéticas (C D I I a /C D 1 8 ) y M a c - l. R e­ ceptor para R inovirus P rotege a los tejidos del daño por A m plia. Cél. hem atopoyéticas y n o h e­ m atopoyéticas el C ’ autóiogo, im pide el arm a­ do de la C3 convertasa N K, alg. tejidos neurales A dhesión hom otípica

7

NK, 25% T y B, algunos Mo A m plia en cél. hem atopoyéticas, C E Le, C E, CEp, Pl T (25-45% ), Pl, M o Pl, M eg, IVla, cél. no hem atopoyéticas C E activadas L vírgenes Pl activadas, IVIeg, CE Pl activ., Mo, M a, débil en Gr, B, T Mo y Ma G r y algunos M o Ne, precursores m ieloides, ribete en ce­ pillo de epitelio colónico

G ránulos citoplásm icos y su p erficie de M o, M a, N e, Ba, L grandes C onstitutiva en Pl, Ti CD4-^/CD8-^- T activadas B y T activ.

Es la m olécula que se expresa 28,32 m ás tem prano en la activ. cel. hom odím ero 55,75,95,110, L igando de CD27 120 T y B activ., Ma R eceptor para transferrina 95 M etabolism o del hierro y creci­ m iento y proliferación celular Pro-B a B activada, M a 42 L igando para CD5 hom odím ero Ti, CD4-^ (10% ). C D 8+ (50%), B Ecto. 5 ’nucleotidasa 69 (70% ), CEp, CE C adena invariante (Ii) H L A clase B, M o, Ma, subp T act., CEp 43/41/35/53 II. P resentación Ag. (4 form as) 9 T (20% ), B (aum enta con activ.) C E p , 53 precurs. eritroides 7 7 Subp. T , B. M elanocitos, CE, C E p , (he­ patocitos, tub. renales) 7 B de centro germ inal. M arcador epitope Lin fo m a de B urkitt carbohidrato 7 Pre-B a B (aum enta con activación), M a, CEp Pre-B hasta B Parte del com plejo recep to r de 33,40 antígeno B . Form a un heterodí­ m ero con CD79b Pre-B hasta B V éase C D 79a 33,40 Cd, subp. B y todas las B activ. Ligando para CD28 y C T L A -4 60 A cM o anti-T A P A -l tien e efecto L, líneas de neuroblastom a y m e la n o ­ 22 mas anti-proliferativo 43

7

73 120 80

7 7 Señal coestim ulatoria en CPA

Alta: CID , CD, C L Baja: L i activados M a, Pl, B y T activados B, M o, LCV , m ielom as CD, B y M o activados C ontinúa

32

Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación) CD

Otras denotninaciones

P M (kD)

P apel biológico

CD 87

U PA -R

50-65

CD 88 C D 89 C D w 90 CD91

C5aR F caR Thy-1 a2 m R (heterodí­ m ero)

C D w 92 CD93 C D 94 CD95

p70 V1MD25 KP43 A P O -l,F a s

42 55-75 25-35 600 515 85 70 120 43 42

C D 96

T A C TIL E

160

CD 97 CD 98

VIM3 4F2

74,80,89 80,40

Receptor para el activador del plasm inógeno tipo-urokinasa que prom ueve actividad fibrinolítica R eceptor de la anafilotoxina C 5a U ne IgA sérica y secretoria ? Receptor a2-m acroglobulina. M edia endocitosis del receptor unido a proteinasa 7 7 A dhesión de NK con integrinas A sociado con la inducción de apoptosis A dhesión de T y N K en fase tar­ día de respuesta inm une 7 7

CD 99 C D 99R C D l 00

E2, M IC2 B B I8,A 8

32 32 150

? (form ación de rosetas con Er) 7 7

C D w lO l C D 102

BB27, BA27 IC A M -2

140 60

C D l 03

HML-1

150,25

7 Ligando para L F A -1 (no para M ac-1) ? C adena a E de integrinas Se asocia con integrina p7 ? C adena (34 de integrinas A sociada con a ó (CD 49f) une lam inina y epiligrina 7 Ligando para V LA -4 Posible rol en adhesión

C D l 04

205

C D l 05 C D l 06 C D l 07a

Endoglin VCAM -1 LAMP-1

95

C D l 07b C D w l0 8 C D w l0 9 C D l 15

L A M P-2 8A 3,7D 1 C S F -IR ; M -CSFR

120 80 170-150 150

C D w ll6

G M -C SFR

150

C D l 17

c-K it

145

CD w 119 C D I 20a

IFNyR T N FR; 55kd

90 55

C D l 20b C D w l2 1 a C D w l2 1 b C D l 22 C D w l2 4 C D l 26 C D l 27 C D w l2 8

T N FR; 75kD IL -IR tipo 1 IL - 1R tipo 2 1L-2RP 1L-4R IL-6R IL-7R IL8R

75 80 68 75 140 80 75 58,67

C D w l3 0

g p l3 0 ,S IG

130

100, l i o lio

D istribución celular Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acüvadas, ti­ mo fetal

Gr, M a, M astocitos, m. liso Mo, Gr, Ma, subp. B y T Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sinciciotrofoblasto, neuronas Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I N K, subpob. T. Aum. con activ. Linaje T y m ieloide T y N K activadas T y B act., M o, NK, Gr, Pl Baja en T, B, N K, Gr. A lta en: M o, T y N K act,, m. cardíaco, queratinocitos b a­ sales Ti, Li periféricos Form a más restringida de CD99 A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti­ van por CD28 Gr, M o L, M o, C E (alta expresión no m odulada por la inflam ación) Li intraepit. de intestino H em idesm osom as epitehales, cél, Schw an, CE, neuro, trofoblasto

CE, M a activados CE A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T ^ citotóxicos ? 60% hom ología con LA M Pl ídem 7 Li, leucem ias agudas 7 Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ. La unión de M -C SF induce la di­ M o, M a y sus precursores m erización del receptor C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl CSF. Junto a la cadena |3 gene­ ra receptor alta afinidad R eceptor para factor de creci­ ,Stem cells, m astocitos m iento de stetn cells U ne IFN y con alta afinidad M ac, M o, B, fibro., epit., endo. C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayoría de las cél, expresan uno o am ­ con relativa alta afinidad. Cobos TN FR s m odulan con el antígeno Fas V éase C D I2 0 a V éase C D l2 0 a R eceptor IL -1 A m plia R eceptor IL -1 A m plia C adena P del 1L-2R T ,B R eceptor IL-4 A m plia R ec ep to rIL -6 A m plia R ec ep to rIL -7 Precur, hem atopoyéticas R eceptor de IL-8 Ne, M o, queratinocitos, basófilos, sub­ pob, T S ubunidad p del receptor de IL6, transduce señal

(*): ep ito p e h id ro ca rb o n a d o , ($): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d ím e ro 120/63, q u e fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re sió n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos; Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac ró fa g o s; E o: eo sin ó filo s; N e: n eu tró filo s; Er: eritro cito s; M O : m éd u la ósea; M eg; m eg a cario c ito s; C E p: células ep iteliales; C E; cé lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i: tim o cito s; C D ; cé lu la s d endríticas; C L; cé lu la s de L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b iaslo s; C ID : cé lu la s in terd ig itad as; M ié: cé lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c é lu la s vellosas.

Bases celulares de la respuesta inmune. Órganos linfoides primarios y secundarios

MARTA BRAUN

CONCEPTOS PRELIMINARES El ingreso de un antígeno no propio dentro de un organismo induce una respuesta inmune específica dirigida contra ese mismo antígeno que, por la adaptabilidad del sistema inmune, puede tomar distintas modalidades: producción de inmunoglobulinas de diferentes clases, res­ puesta celular con activación de macrófagos, efectos citotóxicos, etc. Es el antígeno quien “elige” los clones de linfocitos específicos, precomprometidos para reconocerlo, a los que va a activar y que van a producir alguna de esas respuestas. Pero, para que sucedan todos esos mecanismos efectores específicos, no sólo de­ ben preexistir linfocitos que reconozcan al antí­ geno, sino que deben interactuar varias pobla­ ciones celulares, que colaboran entre ellas, an­ tes de que sea patente uno o más de esos meca­ nismos efectores. De estas poblaciones, la única que reconoce específicamente a los antígenos es la de los lin­ focitos. Pero aunque éstos aparezcan morfoló­ gicam ente idénticos entre sí, son funcional­ mente muy diferentes, no sólo por su especifi­ cidad, para la cual ya están com prom etidos desde su maduración, sino también por sus fun­ ciones. Existen dos grandes poblaciones de linfoci­ tos: los linfocitos B y los linfocitos T. Los pri­ meros son los encargados, casi exclusivamente, de la síntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci­ tos T tienen, por el contrario, una serie de fun­ ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co­ laboración y regulación, que ejercen sobre los linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T. Además, para que se inicie una respuesta inm u­ ne deben colaborar otras células'no linfoides.

3 muy especialm ente las de la serie m onocitomacrófago. Así, para que se produzca una respuesta hu­ moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue­ den reconocer por sí mismos el antígeno para el cual están comprometidos, pero para que se es­ timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten anticuerpos, deben recibir la colaboración de una subpoblación de linfocitos T, los linfocitos T colaboradores o “helper” (Th). Para que los Th reconozcan al antígeno para el cual están ' pre-comprometidos, éste debe haber sido proce­ sado y presentado, junto con un antígeno de histocompatibilidad (CMH) propio, por otra cé ­ lula, ya sea un m acrófago u otro linfocito B (véase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune efectora casi siempre se ejerce con la colabora­ ción de células o factores inespecíficos: por ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un efecto de protección contra el antígeno extraño, salvo contadas excepciones, como puede ser la neutralización de virus o toxinas, deben interve­ nir otras células, como fagocitos o células ki­ ller, o factores, como el complemento. Por todo esto, se comprende que la respuesta inmune provocada por un antígeno extraño es un proceso complicado en el cual intervienen, en forma de cascada exquisitamente regulada, una serie de células y factores de los que no to­ dos pertenecen al sistem a específico p ro p ia ­ mente dicho, constituido por los linfocitos. Las células, tanto específicas como inespecí­ ficas, que intervienen en la respuesta inm une tienen un origen común, las células troncales (“stem cells”) de la médula ósea, pero luego tienen diferentes vías de diferenciación, lo que da por resultado poblaciones celulares con di­ ferentes funciones. Esta diferenciación se inicia

32

Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación) CD

Otras denominaciones

P M (IcD)

P apel biológico

CD 87

U PA -R

50-65

CD 88 C D 89 C D w 90 CD91

C5aR F caR Thy-1 a2 m R (heterodí­ m ero)

C D w 92 CD93 C D 94 CD95

p70 V1MD25 KP43 A P O -l,F a s

42 55-75 25-35 600 515 85 70 120 43 42

C D 96

T A C TIL E

160

CD 97 CD 98

VIM3 4F2

74,80,89 80,40

Receptor para el activador del plasrainógerro tipo-urokinasa que prom ueve actividad fibrinolítica R eceptor de la anafilotoxina C 5a U ne IgA sérica y secretoria ? Receptor a2-m acroglobulina. M edia endocitosis del receptor unido a proteinasa 7 7 A dhesión de NK con integrinas A sociado con la inducción de apoptosis A dhesión de T y N K en fase tar­ día de respuesta inm une 7 ?

CD 99 C D 99R C D l 00

E2, M IC2 B B I8,A 8

32 32 150

? (form ación de rosetas con Er) 7 7

C D w lO l C D 102

BB27, BA27 IC A M -2

140 60

C D l 03

HML-1

150,25

7 Ligando para L F A -1 (no para M ac-1) ? C adena a E de integrinas Se asocia con integrina p7 ? C adena (34 de integrinas A sociada con a ó (CD 49f) une lam inina y epiligrina 7 Ligando pitra V LA -4 Posible rol en adhesión

C D l 04

205

C D l 05 C D 106 C D l 07a

Endoglin VCAM -1 L A M P -1

95

C D l 07b C D w l0 8 C D w l0 9 C D l 15

LAMP~2 8A 3,7D 1 C S F -IR ; M -CSFR

120 80 170-150 150

C D w lló

G M -C SFR

150

C D l 17

c-K it

145

CD w 119 C D l 20a

IFNyR T N FR; 55kd

90 55

C D l 20b C D w l2 1 a C D w l2 1 b C D l 22 C D w l2 4 C D l 26 C D l 27 C D w l2 8

T N FR; 75kD IL -IR tipo 1 IL - 1R tipo 2 1L-2RP IL-4R IL-5R IL-7R IL8R

75 80 68 75 140 80 75 58,67

C D w l3 0

g p l3 0 ,S IG

130

100, l i o 110

D istribución celular Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acüvadas, ti­ mo fetal

Gr, M a, M astocitos, m. liso Mo, Gr, Ma, subp. B y T Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sinciciotrofoblasto, neuronas Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I Gr, M o, CE, U -937,T H P-1 N K, subpob. T. Aum. con activ. Linaje T y m ieloide T y N K activadas T y B act., M o, NK, Gr, Pl Baja en T, B, N K, Gr. A lta en; M o, T y N K aet,, m. cardíaco, queratinocitos basales Ti, Li periféricos Form a más restringida de CD99 A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti­ van por CD28 Gr, M o L, M o, C E (alta expresión no m odulada por la inflam ación) Li intraepit. de intestino H em idesm osom as epiteliales, cél, Schw an, CE, neuro, trofoblasto

CE, M a activados CE A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T ^ citotóxicos ? 60% hom ología con LA M Pl ídem 7 Li, leucem ias agudas 7 Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ. La unión de M -C SF induce la di- M o, M a y sus precursores m erización del receptor C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl CSF. Junto a la cadena |3 gene­ ra receptor alta afinidad R eceptor para factor de creci­ ,Stem cells, m astocitos m iento de stem cells U ne IFN y con alta afinidad M ac, M o, B, fibro., epit., endo. C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayoría de las cél. expresan uno o am ­ eon relativa alta afinidad. Cobos TN FR s inodulan con el antígeno Fas V éase C D l2 0 a V éase C D l2 0 a R eceptor IL -1 A m plia R eceptor IL -1 A m plia C adena P del IL-2R T ,B R eceptor IL-4 A m plia R ec ep to rIL -6 A m plia R ec ep to rIL -7 Precur, hem atopoyéticas R eceptor de IL-8 Ne, M o, queratinocitos, basófilos, sub­ pob, T S ubunidad p del receptor de IL6, transduce señal

(*): ep ilo p e h id ro ca rb o n a d o , (:¡:): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d ím e ro 120/63, q u e fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re sió n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos; Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac ró fa g o s; E o: eo sin ó filo s; N e; n eu tró filo s; Er: eritro cito s; M O : m éd u la ósea; M eg; m eg a cario c ito s; C E p: células ep iteliales; C E; cé lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i; tim o cito s; C D ; cé lu la s d endríticas; C L: cé lu la s de L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b lasto s; C ID : cé lu la s in terd ig itad as; M ié; cé lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c é lu la s vellosas.

Bases celulares de la respuesta inmune. Órganos linfoides primarios y secundarios

MARTA BRAUN

CONCEPTOS PRELIMINARES El ingreso de un antígeno no propio dentro de un organismo induce una respuesta inmune específica dirigida contra ese mismo antígeno que, por la adaptabilidad del sistema inmune, puede tomar distintas modalidades: producción de inmunoglobulinas de diferentes clases, res­ puesta celular con activación de macrófagos, efectos citotóxicos, etc. Es el antígeno quien “elige” los clones de linfocitos específicos, pre­ comprometidos para reconocerlo, a los que va a activar y que van a producir alguna de esas respuestas, Pero, para que sucedan todos esos mecanismos efectores específicos, no sólo de­ ben preexistir linfocitos que reconozcan al antí­ geno, sino que deben interactuar varias pobla­ ciones celulares, que colaboran entre ellas, an­ tes de que sea patente uno o más de esos meca­ nismos efectores. De estas poblaciones, la única que reconoce específicamente a los antígenos es la de los lin­ focitos. Pero aunque éstos aparezcan morfoló­ gicam ente idénticos entre sí, son funcional­ mente muy diferentes, no sólo por su especifi­ cidad, para la cual ya están com prom etidos desde su maduración, sino también por sus fun­ ciones. Existen dos grandes poblaciones de linfoci­ tos: los linfocitos B y los linfocitos T, Los pri­ meros son los encargados, casi exclusivamente, de la síntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci­ tos T tienen, por el contrario, una serie de fun­ ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co­ laboración y regulación, que ejercen sobre los linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T. Además, para que se inicie una respuesta inm u­ ne deben colaborar otras células'no linfoides.

3 muy especialm ente las de la serie m onocitomacrófago. Así, para que se produzca una respuesta hu­ moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue­ den reconocer por sí mismos el antígeno para el cual están comprometidos, pero para que se es­ timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten anticuerpos, deben recibir la colaboración de una subpoblación de linfocitos T, los linfocitos T colaboradores o “helper” (Th). Para que los Th reconozcan al antígeno para el cual están ' pre-comprometidos, éste debe haber sido proce­ sado y presentado, junto con un antígeno de histocompatibilidad (CMH) propio, por otra cé ­ lula, ya sea un m acrófago u otro linfocito B (véase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune efectora casi siempre se ejerce con la colabora­ ción de células o factores inespecíficos: por ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un efecto de protección contra el antígeno extraño, salvo contadas excepciones, como puede ser la neutralización de virus o toxinas, deben interve­ nir otras células, como fagocitos o células ki­ ller, o factores, como el complemento. Por todo esto, se comprende que la respuesta inmune provocada por un antígeno extraño es un proceso complicado en el cual intervienen, en forma de cascada exquisitamente regulada, una serie de células y factores de los que no to­ dos pertenecen al sistem a específico p ro p ia ­ mente dicho, constituido por los linfocitos. Las células, tanto específicas como inespecí­ ficas, que intervienen en la respuesta inm une tienen un origen común, las células troncales (“stem cells”) de la médula ósea, pero luego tienen diferentes vías de diferenciación, lo que da por resultado poblaciones celulares con di­ ferentes funciones. Esta diferenciación se inicia

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Aspectos básicos de la inmunidad

en los órganos primarios del sistema inmune, en ausencia de antígenos externos, y luego se continúa en los órganos secundarios, a conse­ cuencia de la entrada de esos antígenos. ÓRGANOS LINFOIDES PRIMARIOS Y SECUNDARIOS Concepto Se entiende por órganos primarios (también llamados centrales) del sistema inmune a aque­ llos que proveen un microambiente en el cual los linfocitos maduran y adquieren inm unocompetencia. Los linfocitos inmaduros provie­ nen de células troncales (“stem cells”) de la m édula ósea (véase ontogenia) y, al salir de ella, ya están precom prom etidos para la fun­ ción T o B, o sea, son linfocitos pro-T y pro-B, respectivamente. El microambiente de los ór­ ganos primarios se caracteriza no sólo por la presencia de células y factores que estimulan la maduración de los linfocitos, sino también por la ausencia de antígenos provenientes del me­ dio externo. El órgano primario para la madu­ ración de los linfocitos T es el timo en todos los vertebrados superiores. Para los linfocitos B, en las aves es la bursa de Fabricius y en los m am íferos, sus equivalentes (véase cap. 2, fig. 2-1). A estos órganos llegan lin fo cito s p ro v e ­ nientes de la médula que, pese a ser m orfoló­ gicam ente iguales a los maduros, no son in­ munocompetentes, es decir, son incapaces de reconocer antígenos. Los linfocitos, en gene­ ral, no salen de los vasos, pero llevan en su superficie moléculas de adhesión (véase cap. 11) que les perm iten adosarse a las vénulas p o scap ilares del órgano p ara el cual están comprometidos y así penetrar en la intimidad de su tejido. Los órganos secundarios o periféricos del sistema inmune son aquellos que proveen un microam biente donde los linfocitos maduros, tanto B como T f provenientes de los órganos primarios, pueden interactuar tanto con los an­ tígenos externos como entre ellos y con otras células accesorias, muy especialmente con las células presentadoras de antígenos de las línea monocito-macrófago. Esta interacción o cola­ boración intercelular es la que permite el com­ plicado proceso de la respuesta inmune especí­ fica. Los principales órganos secundarios son los ganghos linfáticos, el bazo y el tejido linfático asociado a las mucosas: amígdalas, placas de Peyer, tejido linfático asociado al intestino grueso y delgado, etc. y células linfoides libres de la submucosa.

TIMO Origen y desarrollo El timo es un órgano bilobulado y es el pri­ mer órgano linfoide en aparecer durante el de­ sarrollo fetal. Deriva del endodermo de la ter­ cera y cuarta bolsas branquiales: el endodermo de dichas bolsas, con parte del ectodermo, pe­ netra en el mesodermo que lo rodea para iniciar la formación del timo y las glándulas paratiroides; más tarde, el rudimento tímico se separa y penetra dentro de la cavidad torácica. La población celular tímica es variada, pues está compuesto por células provenientes de los procesos branquiales, sobre todo de origen epi­ telial, y células que penetran en oleadas sucesi­ vas de migraciones a partir de la sangre: son las de la serie monocito-macrófago y los linfoci­ tos, que aquí son llamados timocitos. En la m a­ durez de un individuo, el 99% de las células tí­ micas son timocitos. Luego de migrar al tórax, el rudimento tími­ co recibe una primera oleada de hnfocitos, que es seguida rápidamente de otra oleada de pre­ cursores de linfocitos T. A partir de ese m o­ mento, en condiciones fisiológicas, ya no pene­ trarán al timo nuevas oleadas de células inma­ duras provenientes de la médula ósea, pero su función se conserva y podría actuar como re­ servorio para una regeneración masiva del ti­ mo, si fuera necesaria en etapas posteriores de la vida. Durante el desarrollo fetal y las etapas tem­ pranas de la vida extrauterina, el timo aumenta de tamaño absoluto y llega a su máximo en la pubertad, cuándo comienza su involución hasta llegar a una marcada atrofia. Pero debe remar­ carse que, en la mayoría de las especies inclui­ da la humana, antes del nacimiento, desde el segundo tercio del desarrollo fetal, comienzan a salir del timo hnfocitos T maduros inmunocompetentes, que migrarán hacia los órganos secundarios y los poblarán. Además, la vida media de los linfocitos T es muy larga y sus clones podrían durar incluso más que la vida del individuo; de hecho, el establecimiento in vitro de líneas celulares T es muy fácil y mu­ chas han perdurado durante tiempos muy pro­ longados. Estos dos hechos hacen que, en el momento del nacimiento, en la mayoría de las especies (salvo en la especie experimental por antonom asia de la inm unología - e l ra tó n - y otras pocas excepciones), la función del timo ya esté cumplida y pueda ser extirpado sin in­ convenientes. De hecho, en los albores de la ci­ rugía cardíaca correctora de m alform aciones fetales, cuando aún el timo era “un órgano en­ docrino de función desconocida”, los cirujanos extirpaban el timo de los recién nacidos some­

Bases celulares de la respuesta Inmune tidos a operaciones cardíacas, pues les impedía un acceso fácil al tórax; esos niños no padecie­ ron después deficiencias notables de su sistema inmune. Organización El timo presenta una corteza periférica, una corteza profunda y una región medular. Es de hacer notar que en la corteza, tanto profunda como superficial, existe ima barrera hemato-tímica que impide, o por lo menos disminuye en gran medida, el paso de proteínas sanguíneas hacia la intim idad del tejido; esta barrera no existe en la médula (véase cap. 2, fig. 2-3), En la corteza superficial, el endotelio de las vénulas poscapilares presenta una zona más densa con estructura particular. Los linfocitos pro-T reconocen estas estructuras por sus m o­ léculas superficiales, se adosan a ellas y de esa forma llegan a la corteza, donde forman una delgada capa de pocas células de espesor. Allí se dividen activamente y dan origen a todos los otros timocitos. En esta región, los timocitos son grandes, de aspecto inmaduro y presentan un alto índice de mitosis. En condiciones nor­ males, esta capa representa menos del 5% del total de timocitos. Los timocitos de la corteza superficial migran hacia la corteza profunda, que contiene un 85% de los timocitos. Esta región se caracteri­ za por la presencia de células de tipo dendrítico, de origen epitelial y de aspecto estrellado, que contactan con otras células similares por medio de pequeños desmosomas. Hay además células originadas en precursores hematolinfoides, de la serie monocito-macrófago, como cé­ lulas dendríticas y macrófagos, éstos más abun­ dantes en la médula tímica. En esta región, los timocitos tienen menor tamaño y están en ínti­ mo contacto entre sí y, especialmente, con las células de tipo dendrítico, que han sido deno­ minadas células nodrizas, en cuyos repliegues se alojan en forma tal cjue hasta parecen pene­ trar en ellas. En esta región los linfocitos inm a­ duros sufren una nueva etapa de maduración y de .selección, para pasar luego a la médula. En la región m edular, los tim ocitos están raenos compactados que en la cortical; algunos son ya linfocitos T maduros, listos para pasar a la sangre. Aquí también se encuentran células epiteliales, organizadas a veces en corpúsculos de Hassall, y un número importante de macró­ fagos. Los vasos de esta zona son altam ente permeables a las proteínas plasmáticas; los lin­ focitos en su última etapa de maduración en­ tran en íntimo contacto con las proteínas pro­ pias y sufren aquí el último proceso de selec­ ción, que hace a la población migrante alta­ mente tolerante hacia las proteínas propias.

35

Los tim ocitos inm aduros de la co rteza no sintetizan la enzima 20-hidroxil-esteroide dehi­ drogenasa y son muy sensibles a las hormonas esteroides. Durante la pubertad, a consecuencia de la secreción aumentada de estas hormonas, disminuyen en forma notable, lo cual origina la involución tímica típica de esa edad. En la mé­ dula, los timocitos más maduros ya expresan esa hormona y son corticoide resistentes. Como veremos más adelante, en el tim o no sólo se producen y maduran los linfocitos T, si­ no que también sufren una rigurosa selección, por la cual los linfocitos no aptos son elim ina­ dos. Esta selección hace que menos del 1% del total de los linfocitos producidos emigren del tim o: el 99% restan te m uere por ap o p to sis (m uerte programada) en el mismo timo. Este gasto aparentemente enorme tiene una im por­ tancia biológica también enorme: por una par­ te, sólo emigran los linfocitos capaces de reco­ nocer los antígenos de histocompatibilidad pro­ pios (selección positiva) y los que no reaccio­ nan ni contra éstos ni contra los otros antígenos propios (selección negativa), lo que hace que la producción del timo no sólo sea funcionalmen­ te apta, pues reconoce los antígenos de histo­ com patibilidad propios (base de la respuesta inmune T, véase cap 10), sino también autotolerante, pues no agrede a los tejidos propios. ORGANOS PRIMARIOS DEL SISTEMA B Como se dijo antes, existe en la aves un ór­ gano primario de maduración de los linfocitos B, que es la bursa de Fabricius: si se extirpa química o quirúrgicamente la bursa durante el desarrollo fetal, su sistema B no se desaiTolla. Sin embargo, la ablación quirúrgica de este ór­ gano en un animal adulto no impide la produc­ ción constante de linfocitos B maduros, lo que indica cjue esta función cambia de sitio en eta­ pas posteriores al nacimiento. En los m am íferos, el órgano prim ario del sistema B puede variar según la especie. E n los ovinos, la maduración de los linfocitos B suce­ de en el tejido linfoide asociado al intestino delgado; en el ratón y en el hombre no se ha encontrado un órgano similar, y se admite que la producción y maduración de los linfocitos B se realiza íntegramente en la médula ósea. Las placas de Peyer han sido propuestas com o ór­ ganos primarios B en otras especies y, en algu­ nos casos, la m aduración de los linfocitos B podría lograrse en órganos, como el bazo, en los que los linfocitos pro-B estén en contacto estrecho entre sí. Sea cual fuere el órgano de m aduración de los linfocitos B, éstos tienen una vida media corta y, a diferencia de lo que

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Aspectos básicos de la inmunidad

sucede con los linfocitos T, su producción y maduración continúa durante toda la vida del individuo. ÓRGANOS SECUNDARIOS Organización de los ganglios linfáticos Los ganglios linfáticos son pequeños órga­ nos redondeados u ovoides, que se encuentran generalmente en grupos, en el tejido adiposo que rodea a los grandes vasos sanguíneos del abdomen y el tórax, el de la nuca, el cuello, las axilas, las ingles y el hueco poplíteo. Dentro de una cápsula que rodea al órgano y se prolonga en trabéculas en un estrom a reticular, se en­ cuentra un gran número de linfocitos y células de las serie monocito-macrófago, no sólo m a­ crófagos sino también células propias de los ganglios, las células dendríticas. La circulación de los ganglios linfáticos pro­ viene tanto de la sangre como de los vasos lin­ fáticos y tiene una gran importancia en la mi­ gración de los linfocitos y en la provisión de un microambiente adecuado para la interacción de los antígenos con las distintas células inmunocompetentes y con los anticuerpos (véase fig. 3-1), importante no sólo en la inducción de res­ puestas inmunes sino también en su regulación. La sangre penetra por el hilio por una arteria cuyas ramas llegan hasta la corteza superficial. En esa zona se incurvan y se forman las vénulas que luego se juntan para formar una vena que sale por el hilio. En la zona de la curvatura, su endotelio presenta un aspecto ensanchado parti­ cular y es la región que permite el paso de los linfocitos de la sangre al interior del gangho. Los vasos linfáticos tienen su origen en los diferentes tejidos del organismo y forman una red de canales, paralelos a la circulación san­

guínea, que recogen el fluido extravasado de los capilares que, en los vasos linfáticos, recibe el nombre de linfa. La linfa contiene también células provenientes de la sangre o los tejidos, muy especialmente linfocitos y células veladas. Estas últimas se originan de las células de Lan­ gerhans de la piel y son las encargadas, junto con los macrófagos, de llevar los antígenos a los ganglios locales: en éstos se convertirían en células dendríticas residentes, capaces de cap­ tar antígenos y de mantenerlos in situ por tiem ­ pos prolongados. La linfa llega al ganglio local por los vasos aferentes que desembocan en un seno que ro­ dea a la corteza, en la periferia del ganglio. De allí filtra por el interior del ganglio, en un ca­ mino paralelo al de la sangre, y luego sale por el hilio, por un linfático eferente. Los linfáticos eferentes de varios ganglios se juntan entre ellos y, eventualmente, desembocan en la san­ gre, a través del conducto torácico u otros co­ lectores linfáticos. De esta forma se establece una recirculación constante entre la sangre y la hnfa, que permite el pasaje no sólo de los flui­ dos sino también de las células, a través de los ganglios linfáticos. Esta recirculación permite la migración permanente de los linfocitos entre la sangre y los órganos linfoides secundarios y, eventualmente, los tejidos. Los ganglios linfáticos están divididos en tres áreas principales; la corteza superficial, la corteza profunda y la región medular (fig. 3-1). En las dos primeras predominan los linfocitos, y entre ellos corre esa red de canales linfáticos que van de la corteza a la médula. En la corteza superficial, los linfocitos están en íntimo contacto, muchos de ellos organiza­ dos en nódulos o folículos, compuestos en gran proporción por linfocitos B; entre los folículos hay linfocitos repartidos sin organización parti­ cular; la mayoría de ellos son T. Si, a partir de Vénulas

F ig . 3 -1 . E s q u e m a de un ganglio linfático. N ó­ te n se las d ife re n te s r e ­ giones tim odependientes y tim o in d e p e n d ie n t e s (véase el texto) y la cir­ c u la c ió n d e lin fa y d e lin fo c ito s p ro v e n ie n te s de la sangre.

Bases celulares de la respuesta inmune la zona que drena ese ganglio penetra un antí­ geno y se estimula la respuesta, los folículos se agrandan y dan lugar a los llamados folículos secundarios; en ellos aparece un área central con células grandes y en mitosis: son los llama­ dos centros germinativos. Los linfocitos T predominan entre los folícu­ los y en la zona medular: es la llamada zona ti­ mo-dependiente pues no se desarrolla en ani­ males timoprivos o en pacientes con deficien­ cias tímicas, en los que sólo se aprecian los fo ­ lículos primarios bien desarrollados. En la zona que rodea a los folículos, además de los linfocitos T y entre las células del estro­ ma, se encuentran numerosas células dendríti­ cas, cuya importante función es retener y pre­ sentar los antígenos a los linfocitos: se han en­ contrado determinantes antigénieos sobre célu­ las dendríticas mucho tiempo después que el antígeno fuera inyectado. Es interesante tener en cuenta que, pese a que en el caso de una estimulación antigénica se producen mitosis en los ganglios regionales, la gran mayoría de los linfocitos que están en un momento dado en los ganglios no son de producción local, sino que provienen de la sangre. Los vasos sanguíneos son normalmen­ te impermeables a los linfocitos, pero en la re­ gión subcapsular de los ganglios, las vénulas poscapilares ya m encionadas expresan m olé­ culas de adhesión que son reconocidas por glu­ coproteínas superficiales de los linfocitos, tan­ to los T como los B de memoria. Éstos se ado­ san a la pared del vaso, lo atraviesan y pene­ tran en el tejido linfático, pero sólo permane­ cen unos pocos días en el ganglio, pues van migrando hacia la médula, para salir luego por la linfa y comenzar un nuevo ciclo de recircu­ lación. Es de hacer notar que existe una importante selectividad en la recirculación de los linfoci­ tos: si se marcan e inyectan linfocitos prove­ nientes del conducto torácico o de ganglios su­ perficiales, la gran mayoría se encontrará luego en los ganglios superficiales mientras que, si se inyectan linfocitos de bazo, se hallarán en el bazo en grandes proporciones. Los hnfocitos de los órganos linfoides asociados a las m uco­ sas tienen también sus rutas propias de recircu­ lación (véase cap. 17). Todas estas rutas están dirigidas por una serie de moléculas superficia­ les, muchas de ellas ya conocidas (véase cap. 11), que permiten el pasaje de los linfocitos de la sangre al tejido. Organización del bazo El bazo es un órgano abdominal cuya fun­ ción inmune en el adulto es filtrar partículas de la sangre y concentrar antígenos circulantes; en

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efecto, la respuesta inmune frente a antígenos circulantes se hace principalmente en el bazo. Tiene además función de reservorio sanguíneo, poco importante en el hombre pero muy im por­ tante en algunas especies, es el encargado de la hemocatéresis (destrucción de eritrocitos enve­ jecidos) y en ciertas patologías puede retom ar funciones de hemopoyesis propias del feto. Es­ tas últimas funciones se cumplen en la pulpa roja, rica en capilares sinusoides y con alto contenido en eritrocitos, que forma la m ayor parte del bazo. La pulpa blanca, donde se cumplen las fun­ ciones inmunes del bazo, forma pequeños hu­ sos alrededor de las pequeñas arterias y las ar­ teriolas. Cada huso rodea a una arteriola, que termina en una vénula, que nace al final de la arteriola y se vuelve hacia atrás, formando el seno marginal, que separa la pulpa blanca de la roja. Por este seno los linfocitos penetran direc­ tamente de la sangre al tejido linfoide y luego, a semejanza de lo que sucede en los ganglios, migran lentamente a través del tejido del m an­ guito. Pasan después a la pulpa roja y abando­ nan el bazo por su vena y por sus vasos linfáti­ cos. En los husos, al igual que los ganglios, hay regiones timodependientes y timo independien­ tes: la primera, rica en linfocitos T y en células dendríticas y macrofágicas, es un manguito arteriolar de tejido linfoide difuso que rodea in­ mediatam ente a la arteriola; la segunda com ­ prende folículos y nódulos que rodean a ese manguito. Tejido linfoide asociado a las mucosas Todas las mucosas presentan acúmulos subepiteliales de tejido hnfoide, que en estas regio­ nes tiene la particularidad de no estar rodeado por una cápsula de tejido conectivo. Este tejido linfoide puede presentarse como colecciones difusas de linfocitos, plasmocitos y macrófagos dispersos en la lámina propia de los órganos, o bien como acúmulos más organizados con folí­ culos semejantes a los de otros órganos secun­ darios: en el hombre éstos incluyen las am ígda­ las, las placas de Peyer y el apéndice cecal. En su superficie mucosa, estos acúmulos presentan células epiteliales especializadas capaces de captar antígenos. Los hnfocitos que fueron esti­ mulados en los acúmulos pasan a la linfa y de allí a los ganghos mesentéricos y a la sangre. Del torrente sanguíneo migran a la lámina p ro ­ pia de las mucosas, donde aparecen dispersos y se transforman en células productoras de IgA o IgE. La importancia de este sistema, la migración especializada de los linfocitos que lo com po­ nen y su papel en la protección del individuo se verán con más detalle en el capítulo 17.

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Aspectos básicos de la Inmunidad

La médula ósea como órgano secundario Si bien en el ratón y en el hombre la médula ósea actúa como órgano primario del sistema inmune, también tiene función de órgano se­ cundario; los linfocitos B estim ulados en los ganglios periféricos migran a la médula donde se diferencian a plasm ocitos. La m édula se convierte así en un importante sitio de síntesis de Igs, sobre todo en los períodos tardíos de la respuesta inmune primaria y en las respuestas secundarias. Captación de los antígenos en los órganos secundarios Los antígenos que penetran del exterior se­ rán tomados por los distintos órganos secunda­ rios según sea su vía de entrada y su estructura físico-química. En general, los antígenos solu­ bles, salvo que sean captados por alguna célu­ la, no van a quedarse en un órgano secundario: por esta razón, es raro que induzcan respuestas inmunes positivas y tendrán tendencia a indu­ cir tolerancia (véase cap. 18). Generalmente, las sustancias extrañas, muy especialmente si son particuladas, y más aún si están opsonizadas, son captadas por las células fagocíticas. Estas los van a digerir y procesar, para luego presentar sus determinantes antigénicos en la superficie unidos a los antígenos de histocom­ patibilidad de clase II. Si penetran a los espa­ cios intercelulares de cualquier tejido y son captados por macrófagos, éstos migran a los ganglios drenantes. En la piel, pueden ser to­ mados por células de Langerhans, que luego migran hacia el ganglio en form a de células veladas. En el caso de antígenos que no hayan sido englobados por un fagocito, pueden toda­ vía ser captados en los órganos secundarios, siempre que exista por lo menos una pequeña cantidad de anticuerpos contra ese antígeno y se formen complejos; en este caso, las células dendríticas, que tienen receptores para el Ec de las inmunoglobulinas, pueden fijar el complejo sobre su superficie. En algunos tejidos existen macrófagos fijos (células de Kupffer del híga­ do, macrófagos alveolares). A quí el antígeno queda en el lugar y no interviene en la estim u­ lación del sistema inmune, pero podría actuar como reservorio y estimularlo más tarde, pues­ to que se ha comprobado que el antígeno del interior de estas células está en equilibrio con el antígeno circulante. Los antígenos que penetran en los ganglios junto con un macrófago, por la particular circu­ lación en los ganghos pueden llegar hasta las zonas tim odependiente y tim oindependiente. Dado que los linfocitos están migrando perma­ nentemente por estas zonas, la posibilidad de

que cada determinante se encuentre con un lin­ focito que lo reconozca aumenta notablemente. En el caso de que penetre un antígeno libre por la zona cortical, puede interactuar con célu­ las dendríticas, siempre que exista suficiente proporción de anticuerpos. La concentración del antígeno va disminuyendo de la corteza a la médula y la de los anticuerpos va aumentando paralelamente, en razón de la particular circula­ ción del ganglio; en esta forma aumentará las posibilidades de que sea fijado por células den­ dríticas. Estas diferencias en las concentracio­ nes de los antígenos y los anticuerpos en la di­ ferentes zonas de los ganglios tiene también importancia en la regulación de la respuesta in­ mune. En el bazo sucede un fenómeno parecido a partir de la sangre, pues allí también los antíge­ nos penetran a contracorriente de la migración de los linfocitos, lo que favorece la interacción entre ambos. M ADURACIÓN DEL SISTEMA INMUNE Las células que intervienen en las respuestas inmunes provienen de los órganos hematopo­ yéticos, donde células troncales darán origen a los distintos elem entos formes de la sangre. Provengan de una misma célula troncal o de células diferenciadas para precursores de linfo­ citos T o B, los linfocitos que migran de la m é­ dula ósea ya son pro-B o pro-T pero, para con­ vertirse en células inmuno-competentes, nece­ sitan (sobre todo los T) del microambiente pro­ picio que les ofrece el órgano primario. Como ya se mencionó, éste es elegido por el linfocito inmaduro circulante mediante sus moléculas de adhesión superficiales. En estos órganos, los linfocitos inmaduros comenzarán a sintetizar y expresar en su superficie una serie de molécu­ las que les permitirán, por una parte, reconocer a un determinante antigénico particular y, por la otra, interactuar con las otras células involu­ cradas en la respuesta inmune (véase cap. 2, figs. 2-2 y 2-3). De todas las moléculas superficiales, la más indispensable es el receptor para el antígeno. Este se adquiere durante la maduración, m e­ diante un reacomodamiento del material gené­ tico en células somáticas, que implica pérdida de su ADN. Este proceso, que se describe en detalle en los capítulos 6 y 7, se realiza en au­ sencia de antígenos extraños e implica que ca­ da linfocito que maduró y sus descendientes tengan una secuencia particular y única en la zona que codifica para su receptor antigénico, que le da una especificidad fija. En los linfoci­ tos T, esta secuencia no varía para nada durante toda la vida de la célula, que es larga, ni varía

Bases celulares de la respuesta inmune tampoco durante sus mitosis, de modo que ca­ da linfocito maduro formará un clon, capaz de reconocer un único determ inante antigénico. Debe tenerse muy en cuenta que estos clones existen independientem ente de la entrada del antígeno que serán capaces de reconocer. Si uno o más de los linfocitos de ese clon interac­ ciona con el antígeno para el cual están com ­ prometidos, sucederán nuevas mitosis, sin cam ­ bios nuevos para los linfocitos T pero con la posibilidad de mutaciones puntuales para los linfocitos B (véanse caps. 6 y 7). Es de hacer notar que, en la mayoría de las especies, en el momento del nacimiento el pro­ ceso de maduración de los linfocitos y su m i­ gración a los órganos secundarios ya se ha rea­ lizado, es decir, que el individuo es inmunológicamente maduro. Maduración de los linfocitos B La maduración y activación de los linfocitos B se cumple en una serie de etapas; comienza durante la vida fetal y se continúa durante toda la existencia del individuo, pues los linfocitos B tienen vida corta y son renovados constante­ mente. En el órgano primario, los linfocitos B adquieren esa molécula importantísima que, no sólo los distingue de otros linfocitos no B, sino que es fundamental para su funcionalidad, que es la inmunoglobulina (Ig) de superficie y que actúa como receptor para el antígeno (véase cap. 2, fig. 2-2). La existencia de Ig sobre la superficie de los linfocitos B y sólo de los B, se conoce desde hace tiempo, y se la considera, como el princi­ pal marcador de la serie B, Luego se demostró que esta Ig es sintetizada por el propio linfocito y que, si bien puede cambiar en la región cons­ tante, es prácticam ente idéntica en su región variable a la Ig que secretará ese linfocito y sus descendientes luego de su estimulación por el antígeno. A este respecto, cabe remarcar que la Ig de superficie es algo más larga que la circu­ lante, puesto que en el extremo C terminal tie­ ne dos dominios más, uno hidrofóbico, que es el que atraviesa la membrana y un último h i­ drofílico, que permanece en el citoplasma. La capacidad del sistem a inm une para producir tantos clones con tantas especificidades distin­ tas se debe al reacomodamiento del ADN que codifica para la región variable de esta Ig. Dado que la membrana celular es fluida, las moléculas superficiales pueden moverse. La in­ teracción de las Igs superficiales con ligandos polivalentes, ya sean antígenos o anticuerpos ,dirigidos contra ellas, que puedan form ar un enrejado sobre su superficie, lleva a la form a­ ción de casquetes (“capping”) o sea, a la acu­ mulación de todas las moléculas sobre un polo

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de la célula. Estas m oléculas y sus ligandos pueden ser luego interiorizados por pinocitosis, lo cual tiene gran importancia en la capacidad del linfocito B de presentar antígenos a los lin­ focitos T, o para eliminarlos. N um erosos experim entos han dem ostrado que la Ig superficial es la que actúa com o re­ ceptor antigénico del linfocito B y que la unión de una ligando a esta Ig inicia una serie de eventos que culmina con el envío de una señal activadora del linfocito. Si bien la Ig es la en­ cargada de reconocer específicamente al antí­ geno, para su función receptora no está sola si­ no t]ue forma un complejo multimolecular su­ perficial, pues está acompañada por otras molélulas que no sólo la fijan sobre la membrana si­ no que contribuyen al envío de la señal al inte­ rior de la célula. En una primera etapa, el linfocito en m adu­ ración reacomoda el ADN que codifica para la cadena pesada y comienza a sintetizar cadenas de clase p,. Estas no se expresan en la m em bra­ na, pero pueden ser detectadas en el citoplas­ ma; es la etapa de linfocito pre-B. Luego reaco­ moda la cadena liviana y, ahora sí, esta m olé­ cula puede expresarse en la membrana. A partir de este momento, el linfocito B pue­ de reconocer al antígeno, pero es un linfocito B inmaduro, que tiene la particularidad de que el encuentro con el antígeno específico lo lleva a la tolerancia. Si bien se discute aún cuáles son los m ecanism os que llevan a la tolerización de los linfocitos B inmaduros, su efecto fisioló­ gico es la eliminación funcional de los linfoci­ tos autorreactivos, pues los Ags propios entran en contacto con ellos durante esta etapa. En un paso siguiente, por empalmado (“sphcing”) alternativo del ARN de la cadena pesa­ da, el linfocito com ienza a sintetizar Ig D e IgM. Se trata ahora de un linfocito maduro, al cual el encuentro con su Ag específico llevará a la activación. Estos linfocitos maduros, que sintetizan simultáneamente IgM e IgD y expre­ san ambas en la membrana, salen de los órga­ nos primarios y migran a los órganos secunda­ rios donde formarán los folículos prim arios. Algunos linfocitos expresan también IgA en la superficie desde esta etapa y se encuentran en el tejido linfoide asociado a las mucosas (véase cap. 17). De no mediar un estímulo antigénico, este linfocito maduro virgen tiene vida corta, no recircula y muere en menos de 30 días en la m ayoría de las especies. Si hay un contacto con el Ag y con factores de los linfocitos T (véanse caps. 2 y 13), suceden una serie de nuevas eta­ pas de mitosis y diferenciación, que converti­ rán al linfocito B maduro en plasmocitos, p ro ­ ductores de Igs, también de vida corta, o bien en linfocitos B de memoria, de vida más larga y recirculantes. Esta diferenciación está gene-

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raímente acompañada de otros dos fenómenos: por una parte, puede haber una nueva pérdida de ADN, y el linfocito ya no podrá sintetizar IgM e IgD y sólo sintetizará otras clases de Igs: es el llamado “sw itch” o cambio de Igs; por otra parte, por empalme o “splicing” alternati­ vo del ARN, se pueden perder los dominios intramembrana e intracitoplasmático de la Ig, de modo que ésta no queda fijada a la membrana sino que se secreta; las células que sufren este proceso son las que se diferencian a plasmoci­ tos (véase cap. 2, fig. 2-2). Plasmocitos En el caso de diferenciación a plasmocito, la célula sufre varios procesos, entre los que se incluye una diferenciación morfológica, pues adopta el típico aspecto de célula ovoide, de abundante citoplasma y núcleo excéntrico y en rueda de carro. La iniciación de la diferencia­ ción a plasmocito se hace en las regiones timoindependientes de los órganos secundarios, y muchos de los plasmocitos se encuentran en folículos de bazo, ganglios o tejido linfoide asociado a las mucosas. Una proporción impor­ tante de ellos migra y puede establecerse en otras regiones del ganglio o bazo, en la médula ósea o como células linfoides no organizadas en las submucosas. El plasmocito es una célula terminal, que vi­ ve pocos días y cuya única función es la secre­ ción de Igs. Toda la Ig que produce es de tipo circulante, sin región intram em brana ni cito­ plasmática. Esta célula ha perdido la Ig de su­ perficie, así como otros receptores funcionales de linfocitos B. Por lo tanto, ya no podrá ser activada ni ser pasible de regulación negativa. Maduración de los linfocitos T Las primeras observaciones que permitieron comprobar que el sistem a inm une posee dos grandes tipos de respuestas, humoral y celular, adjudicaron sólo la función de inmunidad m e­ diada por células al sistema T y a ésta, casi ex­ clusivamente la de vigilancia inmunológica antitumoral. Poco después, se comprobó que la función de las células derivadas del timo era muchísimo mayor, pues se vio que su colabora­ ción es indispensable para prácticamente todas las respuestas humorales. Al adjudicársele tam­ bién una importante función de regulación, por medio de los linfocitos T supresores, el timo pasó a ser considerado como “el director de la orquesta inmunológica”. Ninguno de estos con­ ceptos ha perdido vigencia hoy, pero debe te­ nerse en cuenta que no es el timo, p er se, el que dirige la orquesta, sino las células que en él maduraron, que poblaron los órganos secunda­

rios y que permanecerán recirculando durante ■ la vida del individuo. A este respecto, en vista de la dispensabihdad del timo desde el naci­ miento en la mayoría de las especies incluida la humana, muchos autores han postulado que existirían órganos extra-tím icos que cum pli­ rían la función de maduración de los linfocitos T durante la vida extrauterina. Sin embargo, en vista de la larga vida de los linfocitos, cuyos clones pueden perdurar in vitro indefinidamen­ te, muchos autores aceptan hoy que tales órga­ nos no son necesarios y que los clones m adu­ rados en el timo durante la época fetal pueden acompañar al individuo durante toda su vida. Otra consideración que conviene hacer al res­ pecto, es que existen mecanismos, aún no co­ nocidos, que mantienen más o menos estable la población total de hnfocitos T de un indivi­ duo. Después de cada estimulación antigénica se produce una im portante expansión de los clones que reconocen al inmunógeno y, a dife­ rencia de lo que pasa con los plasmocitos, un gran número de los hnfocitos T no mueren lue­ go de cumplir su función, sino que se diferen­ cian a células T de memoria. Ello no significa que la población total de linfocitos T aumente indefinidamente durante toda la vida a conse­ cuencia de los estímulos antigénieos repetidos que recibe cualquier individuo normal. Si bien existen mecanismos homeostáticos que inter­ vienen para mantener constante la población T total, muchos de esos mecanismos no son co­ nocidos aún. Así como el conocimiento sobre la im por­ tancia del timo se logró mediante estudios en el ratón, una de las pocas especies en que la ti­ mectomía neonatal lleva a la desaparición de la función T, la maduración de los linfocitos T se estudió también en el ratón y luego en el hom ­ bre. Si bien no se ha estudiado en todas las es­ pecies, los datos obtenidos hasta ahora en es­ pecies dom ésticas de vertebrados superiores sugieren que seguirían pasos similares en to­ dos éstos. Durante su maduración, los hnfocitos T ad­ quieren la molécula principal para su función, el receptor antigénico o TCR, en una forma si­ milar a la adquisición de la Igs por parte de los linfocitos B, es decir, por reacomodación con pérdida del ADN que codifica para el receptor. Pero también adquieren y pierden otra serie de moléculas, con importantes funciones, cuya lis­ ta y modo de detección se detallan en el capítu­ lo 2 (fig. 2-3). Como ya se mencionó, los linfocitos pro-T provenientes de la médula, se alojan en la cor­ teza superficial del timo y comienzan a sufrir varios ciclos de mitosis. Durante estos ciclos, se hace el reacomodamiento del ADN que co­ difica para las diferentes cadenas del TCR.

Bases celulares de la respuesta ¡nmune En los primeros estadios de maduración, las ca­ denas que se reacomodan son las j y 5, que dan origen a linfocitos j/5 positivos. Estos, por lo menos en el hombre, tienden a disminuir en pe­ ríodos posteriores de la vida, y se los encuentra especialmente en los tejidos linfáticos asocia­ dos a las mucosas. Luego comienza la reaco­ modación del ADN de las cadenas (3 y a , según se datalla en el capítulo 7. El TCR se expresa en la membrana en un complejo polimolecular, unido al CD3, cuya función será, no sólo la de anclar el TCR a la membrana, sino también la de contribuir para el envío de la señal de acti­ vación del linfocito T. También comienzan a sintetizarse y expresarse otras dos moléculas importantes en la activación del linfocito T: el CD4 y el CD8. Estos linfocitos CD4+-CD8^ positivos se en­ cuentran en gran cantidad en la corteza profun­ da del timo. En estos momentos el linfocito en maduración es capaz de reconocer antígenos, pero conviene tener en cuenta desde ya que lo único que puede reconocer un linfocito T ma­ duro son los antígenos de histocompatibilidad propios, de clase I o IL unidos a un péptido propio o extraño. Comienza ahora el proceso que en una época se llamó aprendizaje tímico, pero se trata más bien de una selección tímica, pues los linfocitos no seleccionados mueren. Esta selección tiene dos etapas: una selec­ ción positiva y una negativa. La primera, es la que permite vivir a aquellos linfocitos inmadu­ ros que sí reconocen antígenos propios de Cla­ se I o II. En efecto, el reordenamiento de las cadenas a y P del TCR se hace al azar, por lo que sólo una proporción relativamente pequeña de los linfocitos que reacomodaron su TCR re­ conocerá los alelos propios, ya sean de Clase I o II. Las células de origen epitelial del timo ex­ presan ambas clases de antígenos de histocom­ patibilidad. En esta etapa, el timocito en madu­ ración ha activado su sistema de muerte pro­ gramada o apoptosis: si en este momento no es capaz de reconocer algunas de las proteínas de clase I o II que las células le muestran, muere por apoptosis. Si en cambio reconoce alguna de esas moléculas de histocompatibilidad, recibe una señal que anula la muerte program ada y continúa su ciclo. Este linfocito así rescatado pasa entonces a alojarse entre los repliegues de la membrana de las células nodrizas, dónde puede continuar su maduración. La clase del antígeno que ha reco­ nocido también es importante; si reconoció una molécula de Clase I, se reprime el gen que co­ difica para CD4 y el linfocito continúa sinteti­ zando sólo CD8, Por el contrario, si reconoció Clase II, se reprime el gen para el CD8 y el lin­ focito sólo sintetizará CD4, La consecuencia fi­ siológica de esta selección positiva es que sólo

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saldrán del timo linfocitos funcionales, es de­ cir, linfocitos capaces de reconocer los antíge­ nos de histocompatibilidad propios (véase cap. 2, fig. 2-3). D ado que el reacom odam iento se hace al azar, pueden surgir linfocitos capaces no sólo de reconocer sino también de reaccionar contra antígenos de histocompatibilidad propios uni­ dos a péptidos propios, es decir, capaces de ini­ ciar reacciones autoagresivas. Este hecho ha llevado a que evolucione una segunda form a de selección, una selección negativa, que se lleva a cabo mayoritariamente en la médula del timo. No está demostrada cuál es la diferencia entre reconocim iento simple y reconocim iento con reacción, pero muchos autores la atribuyen a una diferencia en la afinidad de unión del TCR con su antígeno específico. Sea por interacción de alta afinidad o por otra causa, un reconoci­ miento de antígenos propios seguido de reac­ ció n , lleva al lin fo c ito en m ad u ració n a la muerte, en este caso a cargo de los macrófagos medulares. Debe tenerse en cuenta que, en la médula, la barrera hematotímica ya no existe, y las proteí­ nas plasmáticas pueden penetrar allí. P o r otra parte, las células propias del timo sintetizan un gran número de moléculas típicas de otros ór­ ganos. Esto perm ite que, para casi to d o s las proteínas propias del organismo, cuyos pépti­ dos sean presentados junto con antígenos tanto de clase I como II, exista tolerancia, pues los clones capaces de reaccionar contra ellos han sido eliminados por esta selección negativa. Los linfocitos que han terminado su madura­ ción y han sido así seleccionados están en con­ diciones de abandonar el timo y dirigirse a los órganos secundarios, a través de los cuales, co­ mo ya se explicó, recirculan en forma de linfo­ citos maduros vírgenes, hasta tanto encuentren al antígeno para el cual están precomprometi­ dos para reconocer y reaccionar. Subpoblaciones funcionales de los linfocitos T De lo expresado antes, se d esp ren d e que ex isten dos grandes clases de lin fo cito s T: aquellos que reconocen antígenos de C lase I y expresan CD8 y los que reconocen los de Cla­ se II y expresan CD4, La distribución y fun­ ciones de estas dos moléculas se detallan en el capítulo 10, pero conviene tener desde ya en cuenta que los de Clase I se expresan en casi todas las células del organismo y salen a la su­ perficie unidos a péptidos de proteínas sinteti­ zadas en la mism a célula; en cambio, los de Clase II, se expresan casi exclusivam ente en los linfocitos B y las células de la línea mono­ cito-macrófago, que son células especializadas

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Aspectos básicos de la Inmunidad

para la presentación de antígenos a los linfoci­ tos T, y salen a la superficie unidos a pépfidos de proteínas que han sido fagocitadas o pinocitadas por la célula. Es de comprender entonces que los linfoci­ tos T CDS positivos pueden interactuar con ca­ si cualquier célula del organismo y pueden re­ conocer y reaccionar con cualquiera de ellas que esté sintetizando proteínas no propias, co­ mo pueden ser las proteínas de un virus. La función de estos linfocitos es principalm ente citotóxica, pero también producen factores de colaboración y regulación. T am bién en esta subpoblación se ha determinado la presencia de función supresora, muy discutida en este mo­ mento. Por el contrario, los linfocitos CD4-I- sólo pueden interactuar con células presentadoras de antígeno y reconocen y reaccionan contra antí­ genos que hayan sido internalizados y procesa­ dos previamente por una de ellas. Esta pobla­ ción CD4-H no tiene en general función efectora directa sino que produce factores solubles de colaboración y constituyen la población de Th. No se han encontrado diferencias entre los linfocitos CD4+ vírgenes, es decir entre los que atin no han encontrado a su antígeno. Pero en­ tre los Th previamente sensibilizados o de me­ moria, pueden reconocerse dos subpoblaciones: los Thl y los Th2, que se diferencian por la concentración en que expresan un biotipo de la molécula CD45. No hay acuerdo en si los lin­ focitos Th están precomprometidos para dife­ renciarse a una de estas dos subpoblaciones an­ tes de la estimulación por el antígeno, pero evi­ dencias recientes apuntan a que el m icroam ­ biente y las señales que reciben al ser estimula­ dos por el antígeno son esenciales para que se conviertan en una u otra subpoblación luego de su primer contacto con el mismo (véase cap. 18). Sea cual fuere el origen de estas dos sub­ poblaciones, sus funciones son diferentes. Los Thl son efectores y capaces de llevar a la agresión: al ser estimulados por el antígeno producen y secretan al medio una serie de lin­ foquinas, cuyo efecto es activar a los macrófa­ gos y aumentar su capacidad citolítica, lo que da por resultado una reacción inflamatoria cró­ nica, cuyo exponente más típico es la hipersensiblidad tardía. Por el contrario, los Th2, al ser estimulados, producen y secretan al medio una serie de interleuquinas, cuya función es colabo­ rar con los linfocitos B, lo que da por resultado una respuesta humoral. Además, ambas supoblaciones pueden ser también regulatorias e in­ cluso citotóxicas. Como se verá en detalle en otros capítulos, los linfocitos T ejercen realmente un número grande de funciones muy diferentes y son, ver­ daderamente, directores de la orquesta inmuno-

lógica. Lo que no es real es dividirlos, como se hace muy a menudo, en subpoblaciones funcio­ nalmente rígidas, y atribuir a los CD8-H las fun­ ciones citotóxicas y supresoras y a los CD4, las de colaboración e hipersensibilidad tardía, pues todas estas funciones son influenciables por las señales que va recibiendo cada linfocito T du­ rante su larga vida. Linfocitos no-T no-B Además de las dos grandes poblaciones de linfocitos T y B, existe otra población de linfo­ citos que no presenta moléculas superficiales propias de los linfocitos T ni de los B. Estos linfocitos “nulos” no pertenecen al sistema in­ mune específico, pues no tienen receptores pa­ ra el antígeno, por lo que no se los puede consi­ derar funcionalmente como linfocitos propia­ mente dichos, sino que son células pertenecien­ tes a los sistemas inespecíficos de protección. Estas células son además distinguibles morfo­ lógicamente de los linfocitos específicos, pues son más grandes que ellos y presentan granula­ ciones en su citoplasma, por lo que se los ha llamado linfocitos grandes granulares (LGL). Su función es principalm ente citotóxica: son las encargadas de la citotoxicidad espontánea, es decir, son las células citotóxicas naturales o NK y también ejercen función de citotoxicidad celular anticuerpo dependiente (véase cap. 21). Células de la línea monocito-macrófago Los linfocitos T y B son las únicas células capaces de reconocer y distinguir entre sí a los diferentes antígenos y de reaccionar contra ellos, es decir, son las únicas células específi­ cas. Pero para ejercer su función inmune nece­ sitan de la colaboración de otras células, tanto en la fase aferente de la respuesta como en su fase eferente o efectora. Las principales células que colaboran con ellos son las de la línea monocito-m acrófago, pertenecientes al llam ado sistema reticuloendotelial. Estas células también se originan en la mé­ dula, a partir de células troncales, que por dife­ renciación producen monocitos que salen a la circulación sanguínea (véase cap. 2, fig. 2-1). Estos abandonan la sangre y, en los diferentes tejidos, se diferencian tomando formas distin­ tas pero manteniendo, en general, funciones si­ milares. Una gran proporción se diferencia a macrófagos residentes (por ej., macrófagos al­ veolares en el pulmón, células de Kupffer en el hígado), de vida larga, con función macrofági­ ca pero que, como ya se dijo, no intervienen activamente en la presentación de antígenos y no expresan normalmente antígenos de histo­ compatibilidad de clase II.

Bases celulares de la respuesta inmune Los macrófagos propiamente dichos son cé­ lulas migratorias que se encuentran en todo el tejido conectivo, en especial rodeando la m em ­ brana basal de los pequeños vasos sanguíneos; como ya se mencionó, se encuentran también en los órganos linfoides primarios y secunda­ rios. Estas células tienen vida larga y presentan un retículo endoplásmico bien desarrollado y m itocondrias. Una proporción im portante de estas células expresa antígenos de histocompa­ tibilidad de clase II y son capaces de presentar antígenos a los linfocitos Th. También ejercen funciones efectoras, pues son fagocíticos y pueden lisar la m ayoría de las partículas que han ingerido. Como veremos en otro capítulo, son activados por las linfoquinas de los hnfoci­ tos T hl, lo que los hace mucho más activos en su función lítica. En otros tejidos, los monocitos se diferen­ cian en otros tipos celulares: células de Langer­ hans en la piel, células veladas en la linfa y cé­ lulas dendríticas de los ganghos, que ya fueron mencionadas. En los glomérulos renales, cons­ tituyen las células mesangiales, en el sistema nervioso central, la m icroglia y en el tejido óseo, los osteoclastos. Todas estas células tienen características su­ perficiales propias, reconocibles por anticuer­ pos monoclonales dirigidos contra sus molécu­ las de superficie y, además de los antígenos de histocompatibilidad de clase I y II, expresan re­ ceptores comunes, funcionalmente muy im por­ tantes, como son los receptores para el Ec de las Igs y para el C3b del complemento. Estos receptores, que actúan sinergísticamente, p er­ miten la fijación de partículas opzonizadas so­ bre su superficie, lo cual produce un importan­ te aumento de su capacidad fagocítica. Fagocitosis y lisis La fagocitosis es un mecanismo inespecífico de defensa, pero es a menudo el primer paso que llevará a la iniciación de una respuesta in­ mune. Es una función ejercida por los macrófa­ gos y también por los leucocitos polimorfonu­ cleares o neutrófilos. Estos últimos son células también provenientes de la médula, pero son de vida corta y no expresan antígenos de h isto ­ compatibilidad de clase II, por lo cual no ejer­ cen función de presentación antigénica. Tienen abundante cantidad de glucógeno y poseen tres tipos de gránulos: los primarios o azurófilos, que contienen m ielopero x id asa, liso zim a y otras proteínas catiónicas; los secundarios, que poseen lactoferrina y lisozima, y los terciarios, parecidos a los hsosomas convencionales, que contienen hidrolasas ácidas. Tanto los macrófagos como los neutrófilos ingieren partículas no solubles, no por recono­

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cerlas como antígenos extraños, sino en forma mecánica, al envolverlas con sus seudopodios. La fagocitosis es más eficiente si, por alguna ra­ zón, la adherencia entre la membrana del fago­ cito y la partícula se ve aumentada. Esto puede suceder por cargas eléctricas diferentes y com ­ plementarias y, muy especialmente, cuando la partícula está recubierta por Igs y/o C3b; los fa­ gocitos, que tienen receptores que ligan ambas sustancias, se pegan en ellas, con lo cual la ad­ herencia de la partícula está asegurada. La partícula adherida a la membrana celular es rodeada por los seudopodios de la célula, que la abrazan y terminan uniéndose entre sí, dejando englobada la partícula en un fagosoma, dentro del citoplasma. La fagocitosis de partí­ culas viables, como las bacterias, es seguida muy a menudo (pero no siempre) de lisis. Esta se lleva a cabo por dos mecanismos. Por una parte, los gránulos se unen al fagosoma, que pasa a convertirse en un fagolisosoma, en el cual vuelcan sus enzim as preformadas. Estas enzimas tienen acción bactericida o hacteriostática, sobre todo a pH ácido, y tienen tam bién acción proteolítica, por lo que se digieren los microorganismos muertos. Este mecanismo no es oxígeno dependiente. Por otra parte, la ingestión de una partícula aumenta la actividad de la vía de las hexosas monofosfato, lo que genera NADPH, el cual, en última instancia, reduce el citocromo b245 propio de la membrana plasmática, con un au­ mento explosivo del consumo de oxígeno, co­ nocido como estallido metabólico. Este oxíge­ no se convierte en anión superóxido, peróxido de hidrógeno, o libre o naciente y radicales hi­ droxilo, todos ellos de potente acción m icrobi­ cida. Además, la mieloperoxidasa actúa sobre el peróxido y sobre iones haluro, dando como resultado un sistem a halogenante de p otente acción bactericida. Finalmente, el consumo de iones hidrógeno eleva el pH de manera que se permite la función óptima de las proteínas caüónicas de los gránulos (véase cap. 21). Ambos mecanismos, oxígeno dependiente e independiente, dan por resultado la lisis de las bacterias fagocitadas, constituyendo así un im­ portante mecanismo de defensa inespecífico. Interacción con el sistema inmune específico Si bien el sistema inmune específico es filogenéticamente más avanzado que todos los sis­ temas inespecíficos de defensa, al igual que en otros casos de la evolución, por ejemplo el sis­ tem a nervioso central, el sistem a n u ev o no reemplazó al más antiguo sino que pasó a ac­ tuar en íntimo acuerdo con él. En la rama aferente de la respuesta inmune, las células fagocíticas tienen un importante pa-

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peí, no sólo en la eliminación del exceso de antí­ geno y su digestión, sino también en la produc­ ción de factores quimiotácticos e inflamatorios, que acumulan células específicas en el siüo de entrada del agente extraño. Además, la función de presentación antigénica de los macrófagos a los linfocitos T es esencial para la iniciación de una respuesta inmune T, sin la cual la respuesta humoral tampoco puede existir. En la rama efectora de la respuesta inmune también juegan los fagocitos un papel esencial y son muchas veces los encargados de eliminar al invasor que ha sido “marcado” como blanco por los anticuerpos. Einalmente, la acum ula­ ción y la activación de los macrófagos, con au­ mento de su poder lítico, es el resultado de una reacción de inmunidad mediada por los linfoci­ tos T hl. Todo esto ejemplifica una vez más la com­ pleja relación intercelular que implica una res­ puesta inmune, pues abarca no sólo las células específicas sino también los sistemas inespecí­ ficos. DETECCIÓN E INDIVIDUALIZACIÓN DE LAS CÉLULAS QUE COMPONEN EL SISTEMA INMUNE La inmunología, sobre todo en sus aspectos celulares, es una ciencia muy joven y en cons­ tante expansión, que ha estado durante muchos años muy atrasada con respecto a otras ramas de la fisiología y la biología. Este atraso se de­ bió, en gran parte, a las dificultades para identi­ ficar diferentes poblaciones de linfocitos que, pese a parecer todos iguales, cumplen funcio­ nes distintas. Además, el sistem a inm une no cuenta con un órgano fijo, como casi todos los otros sistemas de un individuo, sino que está repartido por diferentes regiones del vertebra­ do. Para terminar de hacer difíciles las cosas, las células que componen el sistem a inmune muestran una tendencia a la migración no com­ parable con la de ninguna otra célula, pues pa­ san de los órganos primarios a la sangre, al ór­ gano secundario que les corresponde, a la linfa, a la sangre, a un tejido o nuevamente al órgano secundario, etc., en una sucesión constante y mediante vías y sistemas regulatorios no todos completamente conocidos. Por otra parte, son capaces de cam biar su m igración fisiológica habitual obedeciendo a factores quimiotácticos que se producen en zonas de inflamación. Nin­ guna de estas migraciones es al azar, sino que van siendo reguladas y dirigidas por las molé­ culas superficiales de cada linfocito y por las m oléculas presentes en cada uno de los microambientes para los que está comprometido el linfocito.

Desde hace muchos años se conoce la exis­ tencia de factores protectores en el suero, los anticuerpos, y de otras reaccioties inmunes no transferibles por el suero. Pero para conocer la base de la dualidad del sistema inmune, debió recurrirse a la ablación de órganos primarios de animales inmunológicamente inmaduros: el ti­ mo en ratones recién nacidos y la bursa de em­ briones de pollos. Esto dio lugar a un gran avance, pues permitió el estudio de animales T o B privos, pero también indujo a confusiones, porque ni todos los vertebrados parecen tener órganos equivalentes a la bursa de Eabricius, ni todos nacen con su sistema T inmaduro. Otro avance muy importante fue la detección de un aloantígeno, presente en el cerebro y en los linfocitos T de los ratones, que fuera deno­ m inado 0 (theta) y actualm ente es llam ado Thy. 1, que permitió identificar los linfocitos T murinos mediante inmunofluorescencia. Ade­ más, con anticuerpos anti-Thy.l más comple­ mento, pudieron prepararse poblaciones despro­ vistas de linfocitos T, lo que permitió trabajar in vitro o inyectar ratones previamente irradiados con poblaciones desprovistas de linfocitos T ; de esta manera pudo descubrirse la necesidad de colaboración entre los linfocitos T y B. Pero también la necesidad de trabajar in vi­ tro para establecer la mayoría de los conoci­ mientos sobre la respuesta inmune ha traído otros inconvenientes a la inmunología. En la mayoría de los casos no se tiene en cuenta el resto del organismo y la interrelación del siste­ ma inmune con los otros sistemas del indivi­ duo, muy especialmente con el sistema nervio­ so central y con el endocrino. Estas interaccio­ nes tien en gran im p o rtan c ia en la fu n ció n homeostática del sistema inmune y recién en estos últimos años se están empezando a cono­ cer (véase cap. 17, 2da. parte). La identificación de las subpoblaciones lin­ foides es útil, no sólo para el m ejor conoci­ miento de la maduración, diferenciación, fun­ ciones y otras características fisiológicas del sistema inmune, sino también desde un punto de vista aplicado o clínico, para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades linfoproliferativas o con compromiso inmunológico. En una primera instancia, se utilizaron sue­ ros inmunes, generalmente producidos en co­ nejos o cabras, dirigidos contra moléculas ais­ ladas de la superficie de los linfocitos o, en el caso de las Igs, del suero sanguíneo. Luego se pasó a la producción de anticuerpos monoclo­ nales, generalmente a partir de esplenocitos de ratones inyectados con células enteras de esa u otra especie. Los diferentes grupos que produ­ jeron estos anticuerpos intercam biaron infor­ mación, y esto permitió la identificación de una serie de grupos o acúmulos (clusters) de mono-

Bases celulares de la respuesta inmune clónales dirigidos contra una misma estructura de diferenciación, lo que definió las diferentes moléculas superficiales, que llevan ahora, en el hombre y otras especies pero no en el ratón, el nombre de CD (“cluster of differentiation”) se­ guido de un ntimero. A ctualm ente se cuenta con una batería de anticuerpos monoclonales contra los CD humanos. En el Apéndice del cap. 2, se da la lista de los CD conocidos hasta hoy y sus funciones. Para individualizar cada célula se las puede incubar con el anticuerpo marcado con sustan­ cias fluorescentes y luego observarlas en m i­ croscopio con luz ultravioleta. También se pue­ de usar este mismo tipo de reactivo para apre­ ciar las proporciones de cada subpoblación en una suspensión dada mediante el uso del cito­ fluorómetro. Este método permite también te­ ñir una célula con dos o más sustancias dife­ rentes y medir simultáneamente otras caracte­ rísticas de cada una de las células de la pobla­ ción, como tamaño, cantidad de ADN, etc., lo que puede aportar mucha información sobre la población celular estudiada. Además, permite separar subpoblaciones por diferencias en bri­ llo, equivalente a la concentración de la molé­ cula marcada en la superficie celular, u otra ca­ racterística. También se puede aislar una población m e­ diante el uso de estos anticuerpos absorbidos sobre superficies, ya sea fondos de recipientes o gránulos, sobre las que se pegarán las células con la molécula en cuestión, y pueden ser res­ catadas en pureza. Por fin, se puede eliminar una población con esos mism os anticuerpos más complemento. La identificación y aislamiento de los linfo­ citos B se hace, principalmente, por la Ig de la membrana; dado que los otros linfocitos no sin­ tetizan ni expresan Ig superficial, su presencia es el mejor marcador para reconocer los linfo­ citos B. Para identificarlos, los mejores m éto­ dos están basados en la incubación de pobla­ ciones mixtas, viables o fijadas, con anticuer­ pos anti-Ig marcados con sustancias flu o res­ centes, que luego pueden ser detectadas por microscopia de fluorescencia o citofluorome­ tría. Como se comprende, para visualizar los linfocitos B se deben incubar con anti-Ig de modo que no se formen casquetes, ya sea im pi­ diendo el metabolismo celular con temperatura baja o antimetabolitos, o fijando el sistema de microtúbulos y microfilamentos celulares. Mediante estas técnicas no sólo se pueden identificar los hnfocitos B, sino que se pueden determinar las clases de Igs que sintetizan y ex­ presan, utilizando anticuerpos, monoclonales o polielonales, específicos para una clase de Ig de la especie. Así se pudo determinar la secuencia de expresión de diferentes clases de íg durante

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la maduración de los linfocitos B y su diferen­ ciación a plasmocitos o linfocitos B de m em o­ ria. M ás aún, utilizando anticuerpos dirigidos contra dos o más clases de Igs, marcados con diferentes sustancias, se pudo demostrar la exis­ tencia de células doble y triplemente positivas, lo cual llevó a la demostración del fenómeno de “splicing” alternativo en los linfocitos. La identificación de los linfocitos T en los ratones se hizo mediante el uso de sueros antiT hy.l, como se dijo antes. En el hombre no se encontró un antisuero similar y durante mucho tiempo se utihzó la particular tendencia a la ad­ hesión a otras células que tienen los linfocitos T, que forman rosetas con los eritrocitos de carnero; estas rosetas permitieron tam bién la purificación de poblaciones T hum anas m e­ diante centrifugación en gradientes. Hoy se sa­ be que estas rosetas se hacen a través del C D 2. Actualmente, para identificar, aislar o eliminar poblaciones de linfocitos T humanos, se utili­ zan anticuerpos dirigidos contra moléculas co­ munes a todos los hnfocitos T (anti-pan T), co­ mo CD2 o CDS. La identificación de la subpo­ blación Th se hace, generalm ente, con anti CD4 y de la población citotóxica/supresora, con anti CDS. Aquí también, la medición de las proporcio­ nes relativas de las subpoblaciones T puede te­ ner gran importancia clínica. Por ejemplo, un d e sc e n s o en la re la c ió n de lin fo c ito s CD4+/CD8+ es índice de avance de la enferm e­ dad en el SIDA. Otras moléculas superficiales Todos los hnfocitos expresan moléculas de histocompatibilidad de Clase I en alta concen­ tración y otras moléculas sumamente im portan­ tes para su función inmune. Los linfocitos B expresan también antígenos de histocom patibi­ lidad de clase 11; estos últimos, que aumentan con la estimulación antigénica, permiten al lin­ focito B presentar antígenos al linfocito T, co­ mo se indica en el capítulo 10. Los linfocitos T no expresan, en reposo, antígenos de clase II, pero pueden hacerlo cuando están activados. La m ayor parte de los linfocitos B tien en también en su superficie receptores capaces de ligar la región Ec de las Igs modificadas por unión con el antígeno. Su función está relacio­ nada principalm ente con la regulación d e la respuesta inmune. Los linfocitos T activados tam bién expresan a veces receptores para Fe. Aproximadamente un 50 a 75% de los linfoci­ tos B expresan receptores para la fracción C3b del com plem ento, de tipo CRI y CR2, cuya función está relacionada con la regulación. La identificación de estas moléculas, que se realizaba mediante la formación de rosetas con

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eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones del complemento (rosetas EAC), hoy se hace con anticuerpos monoclonales dirigidos contra estos receptores. B IB L IO G R A FÍA G eneral C entner, J., de W eck, A. L. A tlas o f Imm uno-AU ergology. Llogrefe & tíu b e r Publishers, Bern, 1995. (H ay versión en castellano.) Fainboin, L ., Satz, M . L.: Introducción a la Inm unología H um ana. 3“ edición. E dición del autor, B uenos A ires, 1995. A bbas, A. K., Lichtm an, A. H., Pober, J. S. C ellular and M olecular Im m unology, 2“ edición. W .B. Saunders Co., U .S.A ., 1994.

E special Picker, L. I., Burcher, E. C.: Physiological and m olecular m echanism s o f lym phocyte hom ing. A nnual R eview o f Im m unology, 10, 561, 1992. Ik u ta , K ., U c h id a , N ., F rie d m a n , J., W e is sm a n j, I. L. L ym phocyte developm ent from Stem Cells, A nnual R e­ view o f Im m unology, 1 0 ,7 5 9 , 1992. Jorggensen, I. L. y col. M o lecu lar com ponents o f T-C ell reco g n itio n . A n n u al R eview o f im m u n o lo g y , 10, 835, 1992. Janew ay, Ch. A. T he T. Cell receptor as a m ulticom ponent signalling m achine: CD 4/C D 8 coreceptors and CD45 in T cell activatio n . A nnual R eview o f Im m unology, 10, .561, 1992. M acL ennan, I. C. M . G erm inal Centers. A nnual R eview o f Im m unology, 12, 117, 1994. Pfeffer, K., M ak, T. W . Lym phocyte ontogeny and activ a­ tion in gene targeted mice. A nnual Review o f Im m unology, 12, 367, 1994. Robey, E., Fow lkes, B. J. S elective events in T cell developmenL A nnual R eview o f Im m unology, 12, 635, 1994.

Antígenos

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RICARDO MARGNI

GENERALIDADES Son antígenos las sustancias que introducidas en el organismo de un vertebrado adulto indu­ cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro­ ducción de otras sustancias denominadas anti­ cuerpos o a la proliferación de células sensibili­ zadas con las que específicamente reaccionan. La palabra antígeno, que significa formador de anticuerpos, es una contracción de aní/somatógeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899. Por definición, antígeno significa capacidad para inducir la producción de anticuerpos y es­ pecificidad para reaccionar con ellos. En la na­ turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de ciertas sustancias- fracciones capaces de reac­ cionar con los anticuerpos (especificidad), pero no de engendrarlos (poder inm unogénico) y que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno­ minó haptenos. Estos a su vez pueden ser hap­ tenos complejos cuando la reacción haptenoanticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap­ tenos simples cuando ella no origina un fenó­ meno deteetable a simple vista. A la zona restringida de la molécula antigé­ nica que determina la especificidad se la deno­ mina determinante antigénico. Dado que pue­ den existir varios determinantes antigénieos di­ ferentes en una molécula, la inoculación de és­ ta originará en el receptor anticuerpos con dis­ tinta especificidad (fig. 4-1). Un hapteno o grupo hapténico definido, tal como: O^N

^

C1

0 NH,

d)

puede conjugarse covalentemente a una m olé­ cula proteica que, al ser inoculada a un Verte­ brado, induce la formación de anticuerpos con especificidad para aquél. Un hapteno sim ple, dentro de la molécula antigénica, constituye un “determinante antigénico estructural” (véase fig. 4-2). En proteínas complejas resulta difícil diluci­ dar cuál es la estructura del determinante anti­ génico. No obstante, estucüos llevados a cabo con proteínas de las que se conoce su estructu­ ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li­ sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c ó cic a y otras, han demostrado que en algunos casos el determinante antigénico está íntimamente rela­ cionado con uno o pocos aminoácidos c o n ti­ guos presentes en la secuencia primaria (deter­ m inante continuo), m ientras que en otros es responsable de la conformación de una restrin­ gida zona de la molécula (determinante confor­ macional) (fig. 4-3 1), Actualmente se sabe que en muchas m acro­ m oléculas, entre ellas lisozim a de huevo, la parte del antígeno que interacciona con el sitio de combinación del anticuerpo está constituida por residuos aminoacídicos localizados distan­ tes dentro de la secuencia de su estructura p ri­ maria pero próximos uno a otros como conse­ cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria. Estos determinantes antigénieos topográficos sólo funcionan mientras la molécula conserve su estructura nativa (fig. 4-3 11). Se los identifi­ ca tam bién con la denom inación de determ incmtes antigénieos discontinuos (para m ayor información, véase cap. 5). Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o área del determinante antigénico el nombre de epitope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia

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eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones del complemento (rosetas EAC), hoy se hace con anticuerpos monoclonales dirigidos contra estos receptores. B IB L IO G R A FÍA G eneral C entner, J., de W eck, A. L. A tlas o f Imm uno-AU ergology. H ogrefe & H uber Publishers, Bern, 1995. (H ay versión en castellano.) Fainboin, L., Satz, M . L.: Introducción a la Inm unología H um ana. 3“ edición. E dición del autor, B uenos A ires, 1995. A bbas, A. K., Lichtm an, A. H., Pober, I. S. C ellular and M olecular Im m unology, 2“ edición. W .B. Saunders Co., U .S.A ., 1994.

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RICARDO MARGNI

GENERALIDADES Son antígenos las sustancias que introducidas en el organismo de un vertebrado adulto indu­ cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro­ ducción de otras sustancias denominadas anti­ cuerpos o a la proliferación de células sensibili­ zadas con las que específicamente reaccionan. La palabra antígeno, que significa formador de anticuerpos, es una contracción de aní/somatógeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899. Por definición, antígeno significa capacidad para inducir la producción de anticuerpos y es­ pecificidad para reaccionar con ellos. En la na­ turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de ciertas sustancias- fracciones capaces de reac­ cionar con los anticuerpos (especificidad), pero no de engendrarlos (poder inm unogénico) y que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno­ minó haptenos. Estos a su vez pueden ser hap­ tenos complejos cuando la reacción haptenoanticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap­ tenos simples cuando ella no origina un fenó­ meno detectable a simple vista. A la zona restringida de la molécula antigé­ nica que determina la especificidad se la deno­ mina determinante antigénico. Dado que pue­ den existir varios determinantes antigénicos di­ ferentes en una molécula, la inoculación de és­ ta originará en el receptor anticuerpos con dis­ tinta especificidad (fig. 4-1). Un hapteno o grupo hapténico definido, tal como: O^N

^

C1

0 NH,

d)

puede conjugarse covalentemente a una m olé­ cula proteica que, al ser inoculada a un Verte­ brado, induce la formación de anticuerpos con especificidad para aquél. Un hapteno sim ple, dentro de la molécula antigénica, constituye un “determinante antigénico estructural” (véase fig. 4-2). En proteínas complejas resulta difícil diluci­ dar cuál es la estructura del determinante anti­ génico. No obstante, estudios llevados a cabo con proteínas de las que se conoce su estructu­ ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li­ sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c ó cic a y otras, han demostrado que en algunos casos el determinante antigénico está íntimamente rela­ cionado con uno o pocos aminoácidos c o n ti­ guos presentes en la secuencia primaria (deter­ m inante continuo), m ientras que en otros es responsable de la conformación de una restrin­ gida zona de la molécula (determinante confor­ macional) (fig. 4-3 1). Actualmente se sabe que en muchas m acro­ m oléculas, entre ellas lisozim a de huevo, la parte del antígeno que interacciona con el sitio de combinación del anticuerpo está constituida por residuos aminoacídicos localizados distan­ tes dentro de la secuencia de su estructura p ri­ maria pero próximos uno a otros como conse­ cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria. Estos determinantes antigénicos topográficos sólo funcionan mientras la molécula conserve su estructura nativa (fig. 4-3 II). Se los identifi­ ca tam bién con la denom inación de determ incmtes antigénicos discontinuos (para m ayor información, véase cap. 5). Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o área del determinante antigénico el nombre de epitope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia

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Aspectos básicos de la inm unidad

'' 3

3

inoculación a vertebrado adulto



B = antígeno poliespecífico 1, 2, y 3 = determinantes antigénicos

Reacción Ag - Ac

R eacción Hp - Ac

entre un antígeno monoespecífico y su corres­ pondiente anticuerpo

entre el determinan­ te antigénico y el anticuerpo originado por el antígeno monoespecítico

a, b, c = anticuerpos con especificidad para los determinantes antigénicos 1, 2 y 3 respectivamente

Reacción Ag - Ac entre un antígeno poliespecífico y los diferentes anticuerpos formados

Fig. 4-1. R eacciones antígeno-anticuerpo y iiapteno-anticuerpo.

0,N .(CH,),

NO, Hapteno

Determinante antigénico

Antígeno

de epitopes relacionados. Al sitio conaplementario de la estructura del determinante antigéni­ co ubicado en el anticuerpo lo llama paratope. Esta denominación resulta litil en algunos ca­ sos, como ocurre con los antígenos somáticos de las salmonelas, o con los constituyentes an­ tigénicos de los hematíes correspondientes al sistema ABO, en que todos poseen un poliósido comiin y sólo difieren por la naturaleza del azijcar no reductor terminal. Esta nomenclatura ha tenido gran aceptación y en estos momentos la mayoría de los inm u­ nólogos la ha adoptado, identificando el deter­ m inante antigénico como epitope, cualquiera que sea su naturaleza. Los determinantes antigénicos o epitopes por unidad de antígeno, sea ésta una tnolécula o una partícula, varían grandemente, y la periodi­ cidad de su repetición es función del número de determinantes antigénicos diferentes presen-

Fig. 4-2. R epresentación esquem ática de una m olécula de antígeno, su determ inante antigénico estructura! y e! grupo haptém ico.

Antígenos

49

F ig . 4 -3Í. Estructura hipotética de un fragm ento proteico. Las zonas A y B, deUmitadas por h'neas de puntos, señ alan áreas que podrían constituir determ inantes antigénieos conform acionales, de los que form an parte m uy pocos re sid u o s y que afectan a una o a las dos cadenas peptídicas. La reducción del puente S-S de la zona A o el desplegam iento de la B p o ­ drían hacer perder la especificidad de los determ inantes antigénieos allí locahzados. La zona C podría corresponder a un determ inante antigénico estructural.

tes en la misma. Se ha comprobado que una m olécula de ovoalbtim ina posee 30 epitopes efectivos y 62 epitopes potenciales sobre su su­ perficie, cifras que contrastan con las halladas en una partícula enormemente mayor, un bacilo tífico, en el que se han calculado 5,6 x 10* epi­

F ig . 4 -3 II. L os residuos id e n tifi­ cados con círculos rojos dentro de la zo n a d elim itad a por líneas de p u n to s, co n stitu y en un d e te rm i­ nante anigénico topográfico h ipo­ tético.

topes, los cuales, segtin diferentes iiavestigadores, no se encuentran aislados sobre la superfi­ cie bacilar, sino dispuestos en placas. La valen­ cia total del antígeno está dada por el número de determ inantes antigénieos presentes en la molécula, expuestos y ocultos. La valencia fu n ­

50

Aspectos básicos de la inmunidad

cional corresponde a los determinantes antigé­ nicos expuestos, capaces de reaccionar directa­ mente con los anticuerpos. Existen ciertos hechos relacionados con la definición de antígenos que conviene dejar aclarados. Sustancias de peso m olecular no muy elevado pueden ser excretadas rápidamen­ te y por esta circunstancia estimular deficiente­ m ente la producción de anticuerpos; pero, si aquéllas son inoculadas junto con adyuvantes, los resultados pueden m odificarse favorable­ mente. Por otra parte, macromoléculas que reú­ nan todas las condiciones para la antigenicidad pueden ser buenos agentes inmunizantes para algunos anim ales y m alos para otros, como ocurre con los polisacáridos neum ocócicos, que inducen buena respuesta inmunológica en el hombre y el ratón, no así en el conejo. He­ chos similares suelen ocurrir en animales ino­ culados con antígenos para cuyas especificida­ des pueden tener cierta tolerancia inmunológi­ ca como consecuencia de poseer antígenos em­ parentados, lo que hace que su reactividad sea escasa o nula. Por este motivo se prefiere reservar el nom­ bre de inmunógeno para las sustancias capaces de inducir respuesta inmune y el de antígeno para aquellas que interaccionan con los produc­ tos de dicha respuesta. No obstante, son térmi­ nos que frecuentemente se emplean como sinó­ nimos. CARACTERÍSTICAS DE LAS QUE DEPENDE LA ANTIGENICIDAD O CAPACIDAD PARA INDUCIR RESPUESTA ¿A qué se debe que ciertas macromoléculas al ser introducidas en el organismo induzcan respuesta inmune y otras en cambio no tengan capacidad inmunogénica? Para que una sustan­ cia pueda actuar como antígeno, aun cuando ella reúna todas las condiciones para la antige­ nicidad, es indispensable que su concentración sea la óptima cuando se la inocula al huésped, pues pequeñas dosis podrían ser inefectivas y un exceso podría actuar como inhibidor. Tamaño molecular Los antígenos completos son proteínas o hi­ dratos de carbono, pero para que puedan en­ gendrar anticuerpos deben tener un peso mole­ cular exageradamente grande, como la albúmi­ na; 70 kD, globulinas; 150 a 900 kD, polisacá­ ridos de los neumococos: 150 kD. Se admite que para que una sustancia pueda actuar como antígeno, su peso molecular debe ser superior a 10 kD. No obstante ello, hay algunas de peso

m olecular bajo, como el glucagón (P.M. 3,8 kD), y las insulinas (P.M. 6 kO), que inocula­ das junto con adyuvantes originan anticuerpos. Por copulación de cupleína con isocianato de fenilo se obtiene un complejo de peso molecu­ lar no superior a 4,5 kO, que inoculado a cone­ jos da lugar a la formación de anticuerpos pre­ cipitantes. Los polipéptidos de síntesis han sido muy útiles para los estudios de antigenicidad. Han sido empleados con tal fin homopolímeros (po­ límeros de un solo aminoácido); pequeños pép­ tidos de secuencia conocida unidos a bloques de copolímeros; copolímeros obtenidos al azar, en los que se conoce su composición, pero no su secuencia; copolímeros con multicadenas, con un péptido funcionando com o colum na vertebral con sitios de recepción múltiples a los que pueden unirse cadenas peptídicas. Han sido elaborados exclusivamente con D-aminoácidos o L-aminoácidos o con mezcla de ambos. Esta variedad de productos ha servido para tener una información más acabada de las exigencias que rigen en la inducción de la respuesta inm u­ ne. Se ha comprobado que los polímeros de Daminoácidos generalmente no inducen form a­ ción de anticuerpos, cosa que hace la mayoría de las preparados con L-aminoácidos. Sela, Maurer, Benacerraf y otros han puesto en evidencia que polipéptidos de síntesis de pe­ so molecular aproximado de 4 kD, y aun me­ nos, pueden form ar anticuerpos cuando son inoculados a vertebrados adultos, pero ese peso molecular debe ir asociado a una estructura es­ pacial determinada, ya que algunos polipépti­ dos hneales de bajo peso molecular no forman anticuerpos, en tanto que lo hacen los ramifica­ dos. Por otra parte, existen proteínas de peso molecular elevado, como la histona, las protaminas, la gelatina, etcétera, que normalmente no inducen la producción de anticuerpos. Grupos químicos activos No sólo el tam año m olecular es un factor preponderante en la capacidad inmunitaria de las moléculas antigénicas, sino que muchas de ellas, fundamentalmente las proteínas, necesi­ tan de la preponderancia de ciertos radicales, sobre todo los ácidos, para que ella se cumpla. La no antigenicidad de la gelatina, cuando se la inyecta en solución sin adyuvantes, se debe­ ría a la ausencia de aminoácidos tales como la tirosina y la fenilalanina, que serían factores preponderantes. Proteínas copuladas con los diazoderivados de los ácidos p-am inobencenoarsénico (ácido arsalínico) y p-aminobencenosulfónico (ácido sulfanílico), cuando son inoculadas, originan anticuerpos específicos para dichos radicales, lo que nos habla de la

Antígenos importancia de éstos en la estructura de la m o­ lécula. Un hecho análogo ocurre con proteínas a las que se les han fijado grupos dinitrobence­ no o trinitrobenceno. Grupos básicos fuertes dentro de la molécula proteica tienen una acción efectiva, al igual que los grupos ácidos, en la dirección de la especi­ ficidad. Otro prerrequisito para la antigenicidad es la rigidez en la estructura para los grupos de­ terminantes; la alta especificidad de los grupos aromáticos en los antígenos de síntesis obteni­ dos por diazotación y copulación es debida pre­ cisamente a la rigidez del benceno. En cambio, la inactividad com o grupo antigénico de las grandes moléculas de los ácidos grasos se debe a que las largas cadenas de los hidrocarburos son fácilmente distorsionadas y sufren altera­ ciones constantes. Con respecto a la de los determinantes anti­ génicos de los polisacáridos, generalmente es consecuencia de combinaciones de dos o más unidades de hexosas. Ha podido establecerse que en el dextrano los grupos determ inantes consisten en unidades de, por lo menos, tres aD-glucopiranosa, las que se repiten. Para es­ tos antígenos, el determ inante antigénico d e­ penderá de la secuencia de los azúcares que lo componen y su modo de unión, más que de su conformación. Posición de los radicales en el núcleo aromático Cuando el determinante de un antígeno es un grupo aromático sin radicales ácidos, la especi­ ficidad es menos precisa que en estos últimos casos y depende en gran parte de la posición que los diferentes radicales ocupan en dicho núcleo. Si se inoculan conejos con un antígeno obtenido por diazotación de la p-cloroanilina y copulación con albúmina bovina, se obtienen anticuerpos específicos para la p-cloroanilina, pero que también reaccionan con la p-nitrosoanilina y la p-metilanilina. Esta especificidad, en cambio, está enormemente reducida o anulada cuando se varía la posición del radical determi­ nante, como ocurre al hacer reaccionar estos

anticuerpos con la o-cloroanilina, m-cloroanilina o cualquiera de los otros derivados m encio­ nados en posición orto y meta. En estos casos las reacciones cruzadas son menos m arcadas que las o b servadas cuando los an ticu erp o s reaccionan con los otros derivados, con radica­ les diferentes, pero ubicados en la misma posi­ ción del núcleo aromático (cuadro 4-1). Influencia de la estructura espacial del determinante antigénico Ya hemos visto en el caso anterior la im por­ tancia que tiene la posición de un determinado radical o grupo aromático con respecto a la es­ pecificidad, lo que nos está indicando que la posición de éstos en el espacio es significativa para aquélla. Landsteiner pudo diferenciar serológicam ente los ácidos D- y L-paminobenzoilfenilaminoacético. Del mismo modo, copulando con proteínas los ácidos levo, dextro y meso-p-aminotartranílico e inoculándolos a conejos, se obtienen anti­ cuerpos capaces de reaccionar específicamente con los respectivos ácidos tíu-táricos, ya sea uni­ dos a la proteína a la cual fueron copulados para transformarlos en antígenos y emplearlos en la inm unización de los conejos, ya sea unidos a otras seroproteínas de diferente origen animal. El cuadro 4-2 esquematiza lo expuesto ante­ riormente. Sela y col. demostraron en materia de anti­ genicidad la im portancia de los am inoácidos que contienen grupos aromáticos y de su posi­ ción en las cadenas proteicas. Estos autores, trabajando con polipéptidos de síntesis, p(Tyr,G lu)-pA la-pL ys, pA la-p(T yr-G lu)- -p (L y sAla), han llegado a la conclusión de que, para los polipéptidos lineales y ramificados de peso molecular 4 kDa, la posición que el am inoáci­ do aromático ocupa en la cadena polipeptídica es factor preponderante en la antigenicidad. Por otra parte, han llegado a establecer que p o li­ péptidos lineales de ese peso molecular, p o r re­ gla general, no son antigénicos, en tanto que los m ism os, como polipéptidos ram ificados, adquieren poder inmunogénico. Ello indica que

Cuadro 4-1. Posición de los radicales en el núcleo aromático.

cc

ra

'(D 2 N=N ( o

Cl ) NH2

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52

Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 4-2. Especificidad inmunológica de diferentes ácidos tartáricos A N T ÍG E N O S C O O H — ^ (R)

I

H— C — O H COOH A cido ]-tartárico

Á cido 1-tartárico Á cido d-tartárico Á cido m -tartárico

ho - - c ^ h

I

CO O H A cido d-tartárico

CO O H -— (R) H— C— OH

I

H— C— OH

I

C O OH A cido m -tartárico

+++ +

los núcleos aromáticos y la posición espacial de las cadenas constitutivas de las proteínas o de los determinantes antigénieos son factores

------ p (Glu, Tyr) •< ------ p-DL-Ala = - < • - p-Lys

-p-DL-Ala — p (Glu, Tyr) ^ p -L y s

Fig. 4-4. Polipéptido.? A y C antigénieos. P olipéptido B: no antigénico.

(R)

H-^C^OH

Í-ÍO— C — H Suero inm une contra

CO O H

de suma importancia en lo relativo a la antige­ nicidad de la sustancia. Resultados similares con otros tipos de experiencias han sido obteni­ dos por otros investigadores, entre ellos Maurer y Benacerraf. Mediante el empleo de copolímeros con multicadenas se ha podido comprobar que es indis­ pensable que la región “antigénicamente impor­ tante” de la molécula sea accesible al mecanis­ mo que induce la formación de los anticuerpos, pero ello no significa que dicha región antigéni­ ca deba encontrarse al final de las cadenas pep­ tídicas, según se deduce del siguiente hecho ex­ perim ental. Se prepararon copolím eros con m ulticadenas de la mism a composición y un péptido de polilisina como columna vertebral. En un caso las cadenas laterales unidas a la lisina fueron polialanina, con sustituciones termi­ nales de poliglutamiltirosina. En el otro fue in­ vertido el orden de unión. Sólo el primero de los polímeros fue antigénico en el conejo. Se pudo comprobar además que, cuando el péptido que funcionaba como columna vertebral era un copolímero de lisina y alanina, la unión de la cadena peptídica p (Glu, Tyr)-pAla le confería antigenicidad, cosa que no ocurría en el caso anterior. Ello probablemente se deba al mayor espacio existente entre los e-aminogrupos de la lisina a los que se unen las cadenas peptídicas, lo que permite una mejor exposición de la re­ gión antigénicamente importante; esto demues­ tra que no necesita ser terminal en todos los ca­ sos. La figura 4-4 esquematiza lo expuesto. Es de hacer notar que lo anteriormente dicho es válido cuando se inmuniza con un solo antí­ geno o determinante antigénico ya que, si se utilizan varios a la vez, por fenómenos de com­ petición puede estar inhibida la actividad de al­ guno de ellos. Esto significa que, al inmunizar con varios antígenos simultáneamente, debe re­ gularse su concentración para conseguir buena respuesta inmune para todos.

Antígenos Hidrofíliddad y predicción de epitopes El desconocim iento de la estructura trid i­ mensional de muchas proteínas ha hecho que se buscaran otros parám etros que perm iten predecir si las superficies expuestas de estas m oléculas hacen que sean antigénicas o no. Dado que los sitios hidrofílicos son general­ mente hallados en la superficie de la proteína expuesta al agua, se considera que los mismos podrían ser “blanco” de los anticuerpos. Los análisis de numerosas proteínas han dem ostra­ do que estos sitios son componentes de deter­ minantes antigénicos. Sin embargo, una gran parte de los sitios de la superficie son no pola­ res, y en varios casos se ha demostrado que re­ siduos aromáticos e hidrofóbicos forman parte del epitope. Predicción de epitopes El interés de predecir y definir sitios antigé­ nicos de una proteína comenzó en parte con la producción de vacunas sintéticas. Los mayores avances sobre los conocimien­ tos del sitio antigénico fueron realizados con­ siderando la carga y polaridad de los am inoá­ cidos involucrados. Esto no descarta que inte­ racciones hidrofóbicas puedan estabilizar la unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Sin em ­ bargo, es probable que la naturaleza direccional carga-carga y otras interacciones polares (p. ej., uniones hidrógeno) contribuyan como

F ig. 4-5. P erfil de hidrofilicidad de la m ioglobina. A daptada de V an Reg e n m o rte l M . H . V. I m m u n o lo g y Today, 10:266, 1989.

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elemento crítico de la especificidad geométrica de los sitios de unión. Los residuos polares son necesarios en las interacciones proteicas; los grupos no polares ayudan, pero no son absolu­ tamente necesarios. La reciente literatura indica que muchos la­ boratorios, para localizar sitios antigénicos so­ bre una proteína, se basan en la predicción de sitios hidrofílicos como probables regiones de alta antigenicidad, lo que puede incluir, ade­ más, consideraciones sobre la estructura se­ cundaria (p. ej., a-hélice, hoja plegada en p, curvaturas en (3). Métodos para determinar hidrofilicidad y estructura secundaria Es apropiado determinar simultáneamente la predicción de la estructura secundaria e hidrofi­ licidad, ya que la estructura secundaria depen­ de de la hidrofóbica e hidrofílica de los seg­ mentos de aminoácidos considerados. La representación del perfil hidrofílico de una proteína se ha estandarizado con una escala en la que se indican las secuencias hidrofílicas hacia arriba y las hidrofóbicas hacia abajo (fig. 4-5). Si se superponen las secuencias secunda­ rias con la hidrofilicidad/hidrofobicidad se ob­ serva una significativa correlación entre ambas. Los valles profundos generalmente ocurren en las zonas a-hélices más largas o cerca de las zonas de hojas plegadas en |3, las que constitu­ yen el fino paquete hidrofógico del centro de la

100

50

Aminoácidos

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Aspectos básicos de la Inmunidad

molécula. Las a-hélices más cortas son las zo­ nas más expuestas de la molécula y, por lo tan­ to, están relacionadas con los sitios antigénicos de la misma. Para los estudios de predicción de epitopes en base a estructuras secundarias, se han elaborado métodos com putacionales que usan la información proveniente de unas pocas proteínas bien definidas y en las que se encuen­ tran determinadas las escalas de giro o torsión. Un giro es la secuencia de la columna vertebral de un polipéptido involucrada en el cambio de dirección de la cadena principal. Papel de la movilidad atómica en la antigenicidad e inmunogenicidad de proteínas El mecanismo de la especificidad depende de la complementariedad entre el epitope anti­ génico y el sitio de combinación o paratope del anticuerpo, estando comprometidos en ello los puentes de hidrógeno, uniones polares, fuerzas de Van der Walls, etc., que puedan originarse entre ambos (véase cap. 5). Su eficiencia de­ pende de un buen acomodamiento entre ambas estructuras. Para determinantes antigénicos conformacio­ nales o discontinuos (topográficos) es difícil determinar si la movilidad estructural que invo­ lucra residuos distantes, ubicados en la secuen­ cia aminoacídica, y que pueden diferir signifi­ cativamente en la movilidad relativa, juega un papel im portante en la determ inación de la complementariedad de la interacción antígenoanticuerpo. Incluso, en este caso, el desplaza­ miento de alguno/s de los residuos comprome­ tidos puede dar lugar a cambios en la superficie de contacto originada por los residuos vecinos. En el caso de los determ inantes antigénicos contiguos (secuencia continuada de un niimero determinado de residuos), la interpretación de la movilización local en el mencionado fenó­ meno es menos ambigua. La información sobre movilidad relativa de diferentes átomos en proteínas, llamado “factor de temperatura atómica”, proviene de estructu­ ras moleculares refinadas, y es sumamente útil para entender aspectos dinámicos de estructu­ ras proteicas, en especial acerca de la flexibili­ dad de residuos aminoacídicos individuales y elementos estructurales. Han sido muy útiles en este sentido estudios de difracción de rayos X desarrollados con proteínas cristalizadas. Esos factores de temperatura atómica indivi­ duales no representan diferencias térmicas lo­ cales dentro de la molécula, sino que son lla­ mados así por la temperatura dependiente de la velocidad del movimiento atómico y la corres­ pondiente energía térmica disponible para su­ perar esas barreras de energía potencial confor­

macional. Generalmente, cuando se hace refe­ rencia a péptidos localizados en regiones de una proteína, se emplea el término “caliente” para identificar una zona muy móvil (factores de temperatura altos) y “frío” para las regiones bien ordenadas (factores de temperatura bajos). Los datos provenientes de anticuerpos antipéptidos y del “mapeo” de epitopes proteicos sugieren que el reconocimiento antigénico en general involucra la interacción de anticuerpos con zonas de la proteína que puede adoptar for­ mas múltiples, distintas de la estructura prome­ dio observada por cristalografía de rayos X. Todo perm ite suponer que la interacción del paratope del anticuerpo con el epitope antigéni­ co es suficiente en primera instancia para el re­ conocimiento, pero que luego, debido a la m o­ vilidad atómica, hay una inducción a la estruc­ tura del epitope que mejor se adapte. En el caso de las interacciones entre péptidos de proteínas y sus correspondientes anticuerpos, el péptido se une al paratope cuando su conformación se asemeja a la que le corresponde en la proteína nativa, acomodándose luego, como consecuen­ cia de movilización atómica, a la estructura que reaccione m ejor con el sitio de combinación del anticuerpo. En este sentido resulta muy interesante que en diferentes proteínas relativamente pequeñas, como la neurotoxina alfa de escorpión, mioglobina, lisozima nativa, citocromo c, etc., las zo­ nas de antigenicidad de la molécula (epitopes) estén relacionados, en su mayoría, con regiones de alta movihdad o “cahentes”, con factores de tem peratura atómica altos. En el citocromo c los residuos 44, 60/62 y 89/92, integrantes de los tres epitopes detectados en esa molécula, están asociados con áreas identificadas como móviles en los factores de temperatura cristalo­ gráficos. Lo mismo ocurre con los tres epitopes de la ribonucleasa, en cuya estructura partici­ pan los residuos 1/10, 63/75 y 98/104. No obstante lo expuesto, esa relación no de­ be ser considerada como un hecho general, ya que en algunos casos no se ha podido demos­ trar que dicha relación exista. A LT E R A C IÓ N D E LOS A NTÍG EN OS Desnaturalización Los antígenos, en su gran mayoría proteínas, pueden sufrir alteraciones derivadas de la ac­ ción que algunos agentes físicos o quím icos pueden ejercer sobre ellos. El proceso por regla general es progresivo, se cumple en dos o tres etapas, y determina que esa proteína desnatura­ lizada, cuando es inoculada a un animal, esti­ mule la producción de anticuerpos, que en al­

Antígenos gunos casos pueden reaccionar con la proteína primitiva, no así en otros. Ello se debe a las profundas modificaciones que pueden sufrir los determinantes antigénieos originales a causa de la desnaturalización de la proteína. La desnatu­ ralización suele producirse ya sea por trata­ miento con ácidos y bases fuertes, por calenta­ miento a altas temperaturas o por otros proce­ dimientos. Oxidación M ediante el empleo de peróxidos como el permanganato de potasio, pueden modificarse las proteínas antigénicas, las que una vez ino­ culadas al animal dan lugar a la formación de anticuerpos, que presentan la particularidad de no precipitar con otras proteínas modificadas, ni aun con la proteína primitiva no oxidada. Reducción Por este mecanismo pueden alterarse algunasproteínas, pero generalmente las modificaciones son ínfimas y los anticuerpos que se originan al inocular animales exhiben reactividades cruza­ das para la proteína primitiva y la reducida. Digestión Las enzimas, actuando en medio ácido o en medio alcahno, según sus condiciones óptimas, pueden producir escisiones profundas en las moléculas proteicas antigénicas haciendo que las mismas se desdoblen en varios polipépti­ dos, algunos de los cuales, si bien no reaccio­ nan aparentemente con el anticuerpo respecti­ vo, pueden llegar a neutralizarlo, lo cual indica que esta digestión muchas veces libera deter­ minantes antigénieos con capacidad reactiva. A cidificación y alcalinización Los ácidos y los álcalis pueden reaccionar con las proteínas formando metaproteínas áci­ das o alcalinas. La actividad antigénica de éstas disminuye menos en las metaproteínas alcahnas que en las ácidas, y estas últimas presentan frecuente reactividad cruzada con otras proteí­ nas como consecuencia de las modificaciones experimentadas. Desaminación La remoción de los grupos aminos libres en las proteínas no produce modificaciones gran­ des en la antigenicidad y características de és­ tas. La remoción de más o menos un tercio de los aminogrupos de la caseína y la albúmina de huevo no provoca alteraciones manifiesta.s.

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Esterifícación La esterifícación de proteínas origina altera­ ciones que hacen que pierdan su capacidad pa­ ra reaccionar con los anticuerpos producidos por la proteína no modificada. Por su parte, la acilación, halogenación, diazotación, tratam iento con gas de m o staza y otros agentes químicos dan lugar a m odifica­ ciones de resultados análogos. Algunos proce­ dimientos físicos, como los ultrasonidos, pue­ den también provocar modificaciones y liberar a veces grupos antigénieos de la m olécula no evidenciados anteriormente. C O M P O S IC IÓ N Q U ÍM IC A DE LOS ANTÍGENOS La mayor parte de los antígenos son proteí­ nas de alto peso molecular que contienen algu­ nos aminoácidos particulares, sobre todo po­ seedores de núcleos aromáticos, y una estructu­ ra espacial definida. Carbohidratos de alto peso molecular pueden también actuar como antíge­ nos y habitualmente la antigenicidad está dada por la condensación de grupos hexosas. Estas distintas estructuras moleculares hacen que los antígenos puedan inducir respuesta in­ mune directa sobre los linfocitos B (antígenos T-independientes: poliósidos, lipopolisacári­ dos, flagelina polim erizada), sin la participa­ ción de los linfocitos T, o que necesiten de di­ cha cooperación (antígenos T-dependientes: antígenos proteicos, haptenos fijados a soportes proteicos). Los ratones nude -q u e por padecer de una aplasia tímica carecen de linfocitos T -, cuando son inoculados con el antígeno T-dependiente T N P-proteína (proteína trinitrofenolada), no dan respuesta anti-TNP, pero lo hacen si el inó­ culo es T N P-dextrano (antígeno T -independiente). Los antígenos T -independientes h a n sido agrupados en dos categorías; los de tipo I y los de tipo II. Los de tipo I son mitogénicos de los linfoci­ tos B e inducen respuesta policlonal de anti­ cuerpos. Forman parte de este grupo los lipo­ polisacáridos (LPS) componentes de la pared celular de las bacterias. Estos antígenos son tam bién activadores de macrófagos e inducen producción de interleuquinas (IL -1, IL-6, IL8), factor necrosante de tumores (T N F -a), in­ terferón a (IFNa), prostaglandinas, etcétera. Los antígenos de tipo II son polím eros de polisacáridos; poseen secuencias repetidas que actuando como epitopes favorecen la polimeri­ zación de los receptores antigénieos de los lin­ focitos B (Ig de membrana), iniciando la trans-

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Aspectos básicos de la inmunidad

ducción de señales que llevan a la activación de la célula. Las células B purificadas no responden in vitro a los antígenos tipo IL lo que sugiere la necesidad de algiín requerimiento, aunque mo­ desto, de alguna citoquina. Las células B en reposo (“resting cells”) estim uladas con antí­ genos T-independientes de tipo II no secretan anticuerpos hapteno-específicos o policlonales, pero lo hacen si al medio se le añade IL-2 o IL-5, respectivamente. Los polisacáridos antigénicos más simples son dextrano y levano, los cuales se obdenen por acción enzimática bacteriana sobre sacaro­ sa. La dextransucrasa origina el dextrano, y la levansucrasa, el levano. El primero resulta de la condensación de moléculas de glucosa y el segundo, de moléculas de fructosa. La unión glucosídica es principalmente a (1 —> 6) en el dextrano y a (2 ^ 6) en el levano. Hay cepas microbianas que pueden originar otros típos de uniones, tales como a ( l - » 3 ) o a ( l A). En algunas oportunidades, sustancias sim­ ples de bajo peso molecular al ser inoculadas pueden originar anticuerpos, pero ello no sig­ nifica que por sí solas tengan antigenicidad si­ no que, por combinación con las proteínas pro­ pias del huésped, se trasform an en antígenos complejos capaces de dar lugar a la formación de anticuerpos. Se ha dado el caso de que el plasma extraído de una persona y conservado por el añadido de M erthiolate, cuando le fue reinoculado produjo un choque anafiláctico después de la tercera inoculación. Ello se de­ bió a que la sal mercurial orgánica se combinó con las proteínas séricas originando un antíge­ no que sensibilizó en las primeras inoculacio­ nes, desencadenando finalm ente la reacción alérgica. Algunas enzimas pueden formar anticuerpos cuando son inoculadas a vertebrados adultos. No todas ellas tienen capacidad inmunogénica e incluso, cuando forman anticuerpos, éstos pueden tener especificidad para la función en­ zimática, neutralizándola, o para otros deter­ minantes antigénicos presentes en la molécula, sin que la actividad enzim ática específica de ésta se vea modificada. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) pue­ den, en determinadas condiciones, inducir la formación de anticuerpos, pero generalmente con reactividad cruzada para algunas de las ba­ ses o azúcares relacionados. En general, los ácidos nucleicos desnaturali­ zados por calentamiento y enfriamiento rápido con el objeto de romper la doble hélice, fun­ cionan m ejor com o inm unógenos, esp ecial­ mente cuando se los inocula mezclados con se­ roalbúm ina bovina metilada, la que funciona como adyuvante. Al esterificarse los grupos

carboxilos de la albúmina, los grupos aminos rem anentes, positivam ente cargados, forman complejos con los grupos fosfato cargados ne­ gativamente, existentes en los ácidos nucleicos desnaturalizados, los que, por esta circunstan­ cia, resultan accesibles a la complejación. Los ácidos grasos no son antigénicos, pero sí lo son algunos lípidos complejos, sobre todo cuando se encuentran asociados a glúcidos y proteínas, como ocurre con algunos constitu­ yentes m icrobianos y componentes de m em ­ branas celulares. La cardiolipina y la citolipina H son ejemplos al respecto. A ntígenos m odificados químicamente Por diferentes procedimientos es posible in­ troducir grupos químicos en proteínas. Muchas veces los compuestos fijados inducen respues­ ta específica y tienen capacidad para neutrali­ zar a los anticuerpos form ados. Son grupos hapténicos entre los que figuran anillos aromá­ ticos esteroides, pequeños péptidos, drogas, etc. Otras veces, el objeto de la modificación del antígeno es el de introducir marcas capaces de ser detectadas, como lo son las sustancias fluorescentes del tipo de la rodamina y la fluo­ resceína, materiales densos al flujo de electro­ nes como la ferritina, o átomos radiactivos. Los fundamentos de los métodos más usa­ dos para la introducción de grupos químicos en proteínas son los siguientes: Diazotación y copulación Se utiliza para haptenos con grupos -NH li­ bres, como los ácidos sulfanílico, arsanílico, paminobenzoico, etc. El producto de diazota­ ción se copula a la tirosina, en posición orto, pudiéndolo hacer también, en menor grado, a la lisina e histidina. Véase esquema pág. 57, parte A. Dinitrofenil derivados Se obtienen por reacción entre el fluordinitrobenceno y los grupos amino libres de las proteínas, en especial los residuos de lisina. Véase esquema pág. 57, parte B. Reacción con carbodiimidas Su fórmula general es RN = C = NR y son muy usadas para la fijación, a temperatura am­ biente, de grupos carboxilos a aminos libres de proteínas, form ando uniones p eptídicas. El grupo a fijar debe tener un carboxilo libre o lo­ grárselo por oxidación, como ocurre con el hi­ droxilo prim ario de los nucleósidos. V éase esquema pág. 57, parte C.

Antígenos

CO-NHR;, Residuo tirosina

t

Residuo histidina

Residuo lisina pH 9,5

4“ C

O

OI

OH

H

\ /

o

NSERT.YS^GLN-SER-ASN-ASN-I.YS 175

180

185

190

THR-TYR-SER^LEU-SER-SER-THR-LEU-THR-LEU-SER-LYS-ALA-ASP-TYR-GLU-LYS-HlS-I.YS^j''g¿'^TYR-ALATYR-ALA-ALA-SER-SER-TYR-LEU-SER-LEU-THR-PRO-GLU-GLN^TRP^LYS-SER-HIS-ARG^SER-TYR-SER

195

200

205

210

C Y S -G L U -V A L -T H R -H IS -G L N -G L Y -L E U -S E R -S E R -P R O -V A L -T H R -L Y S -S E R J> H E -A S N -A R G -G L Y -G L U -C Y S C Y S -G L N -V A L -T H R -H IS -G L U -G L Y -

'E E l

S E R -T H R -V A L -G L U -L Y S -T H R ^ V A L -A L A -F R O ^ T H R -G E U -C Y S -S E R

Anticuerpos Fragmento variable

F ig . 5 -1 2 . E s ­ q u e m a d e la e s ­ tr u c tu r a d e u n a c a d e n a H (y).

Fragmento constante

minal, constitutiva del fraginento Fv, es muy variable y participa en la formación del sitio de combinación, en tanto que la otra mitad consti­ tutiva del fragmento Fb, es estable. El fragmen­ to Fd presenta hom ología con la cadena L. Análisis estructurales han permitido comprobar que en las cadenas H existen cuatro bucles o anillos similares a los observados en las cade­ nas L, denominados Vj_j, C „l, C,_,2 y C,_,3, los dos primeros ubicados en el fragmento Fd y los dos restantes en el Fe (fig. 5-12). El cuadro 5-9 define los diferentes fragmen­ tos constitutivos de una molécula de inmunoglobulina, los que se encuentran representados en las figuras 5 -13a y 5 -13b. La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas (Vj.,) de las in­ m unoglobulinas hum anas, p ro v en ien tes de mieloinas, fueron clasificadas originalm ente por Kabat en tres grupos, de acuerdo con la ho­ mología en la secuencia aminoacídica. E stu ­ dios posteriores han hecho posible el reordena­ miento de éstos, sobre la base del 80% por lo menos de homología a nivel de secuencia de nucleótidos, en 6 fam ilias ( V h I , V h2, V h 3 , Vh4, V h5 y V h6), de manera similar a lo que ocurre con las cadenas L. Las seis secuencias prototipos de dichos subgrupos figuran en el cuadro 5-lOa. Recientemente la familia V h I ha C uadro 5-6. Cadenas H (humanas) inm uno- D enom inación globulinas de la cadena H Subtipos

IgG

Y

Yl Y2

y. y.

Ig M IgA

a

IgD IgE

8 e

«1 «2 -

85

D enom inación del subtipo de inm unoglobulinas Ig G l lg G 2 Ig G 3 Ig G 4 Ig A l Ig A 2 -

sido reclasificada en V H I y V H 7, quedando estas familias conformadas por 11 y 1 genes V h funcionales, respectivamente. Por otro lado, estas fam ilias, sobre la base de su filogenia, han sido agrupadas en 3 clanes. El clan I con­ tiene las famihas V h I , V h5 y V h7; el clan 2 contiene las familias V h2, V h4 y V h6; el clan III contiene la fatnilia Vh3. De los aproximadamente 95 genes VH cono­ cidos (véase cap. 6), sólo 51 tienen reordenado el marco de lectura (“open reading frame”) por lo que son funcionales y participan en la crea­ ción de la variabilidad de las cadenas H; los res­ tantes no tienen abierto el marco de lectura, son seudogenes o no han sido secuenciados (cuadro 5 -10b). Estos fragmentos variables de cadenas H son comunes a las diferentes inmunoglobuli­ nas, de lo que se deduce que las distintas cade­ nas H resultan de la recombinación de un frag­ mento H variable (V^,) común y un fragmento H constante (Cj^) propio para cada inmunoglobuli­ na, aspecto que se discutirá más adelante. Proteínas de mielomas, completas, han sido analizadas con el objeto de obtener péptidos constituidos únicamente por fragmentos de ca­ denas L, de cadenas H y mezcla de ambas uni­ das por puentes S-S. Después de la reducción de dichos puentes con mercaptoetanol se hicie­ ron los anáhsis de los péptidos, algunos de los cuales coincidieron con los ya conocidos en los estudios efectuados separadamente en las cade­ nas L y H de dichas proteínas. Esto ha perm iti­ do determinar la ubicación de los puentes S-S dentro de las cadenas FI y las uniones L-H, así como del hidrato de carbono ligado a las inm u­ noglobulinas. Del análisis de inmunoglobulinas de mielomas, que son homogéneas, se ha concluido que hay cuatro subclases de IgG. En la Ig G l, la unión H-L se produce entre la cisteína C-terminal o preterminal de las cadenas L y la cisteína de la cadena H ubicada en el residuo 220. Po­ see además dos puentes disulfuro intercadenas H-H. En las Ig02, IgG3 e IgG4 la unión H-L

86

Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 5-7. Secuencia de los aminoácidos constitutivos de una cadena H (y¡) de Ig G l humana 1

10

20

PC A -V al-G In-L eu-V al-G ln-Ser-G ly-A la-G lu-V al-L ys-Lys-Pro-G ly-Ser-Ser-V al-Lis-V al30

40

Ser-C ys-L ys-A Ia-Ser-G ly-G ly-T hr-Phe-Ser-A rg-Ser-A la-Ile-Ile-Trp~V al-A rg-G ln-A la50

60

Pro-G ly-G ln-G ly-Leu-G lu-Trp-M et-G ly-G ly-Ile-V al-Pi'o-M et-Phe-G ly-Pro-Pro-A sn-Tyr70

80

A la-G ln-Lys-Phe-G ln-G ly-A rg-V al-Thr-IIe-T hr-A la-A sp-G lu-Ser-Thr-A sn-T hr-A la-Tyr90

100

M et-G lu-L eu-Ser-Ser-L eu-A rg-Ser-G lu-A sp-T hr-A la-Phe-T yr-Phe-C ys-A la-G ly-G ly-T yr110

120

G ly-Ile-Tyr-Ser-Pro-G lu-G lii-Tyr-A sivG ly-G ly-Leu-V al-T hr^V al-Ser-Ser-A la-Ser-T hr130

140

L ys-G ly-P ro-Ser-V al-Phe-Pro-L eu-A la-P ro-Ser-Ser-L ys-Ser-T hr-Ser-G ly-G ly-T hr-A la150

160

A la-L eu-G ly-C ys-L eu-V al-L ys-A sp-T yr-Phe-Pro-G lu-P ro-V al-T hr-V al-Ser-T rp-A sn-S er170

180

G ly-A la-lxu-T hr-Ser-G ly-V al-H is-T hr-Phe-Pro-A la-V al-L eu-G ln-S er-S er-G ly-L eu-T yr190

200

Ser-Leu-S er-S er-V al-V aL T hr-V al-P ro-S er-S er-Ser-L eu-G ly-T hr-G ln-T hr-T yr-Ile-C ys210

220

A sn-V al-A sii-H iS'Lys-Pro-Ser-A sn-Thr-Lys-V al-A sp-L ys-A rg-V al-G lu-Pro-Lys-Ser-C ys230

240

A sp-L ys-T hr-H is-T hr-C ys-Pro-Pro-C ys-Pro-A la-Pro-G lu-L eu-L eU 'G ly-G ly-Pro-Ser-V al250

260

Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-L ys-A sp-Tlir-Leu-M et~ lle-Ser-A rg-T hr-Pro-G lu-V al-T hr270

280

C ys-V al-V al-V al-A sp-V al-Ser-H is-G lu-A sp-Pro-G ln-V al-Lys^^Phe-A sn-Trp-Tyr-V al-A sp290

300

G ly-V al-G ln-V al-H is-A sn-A la-L ys-T hr-L ys-Pro-A rg-G lu-G ln-G ln-T yr-A sx-S er-T hr-T yr310

320

A rg-V al-V al-S er-V al-L eu-T hr-V al-L eu-H is-G ln-A sn-T rp-L eu-A sp-G ly-L ys-G lu-T yr-L ys330

340

C ys-L ys-V al-S er-A sn-L ys-A ia-L eu-P ro-A la-Pro-Ile-G lu-L ys-T hr-Ile-Ser-L ys-A la-L ys350

360

G ly-G ln-P ro-A rg-G lu-P ro-G ln-V al-T yr-T hr-L eu-P ro-Pro-S er-A rg-G lu-G ln-M et-T hr-L ys370

380

A sn-G ln-V al-Ser-L eu-T hr-C ys-L eu-V al-L ys-G ly-Phe-T yr-Pro-S er-A sp-lle-A la-V al-G lu390

400

Trp-G Iu-S er-A sn-A sp-G ly-G lu-P ro-G lu-A sn-T yr-L ys-T hr-T hr-P ro-Pro-V al-L eu-A sp-S er410

420

A sp-G ly-S er-P he-P he-L eu-T yr-S er-L ys-L eu-T hr-V ai-A sp-L ys-S er-A rg-T rp'G ln-G lu-G ly430

440

A sn-V al-Phe-Ser-C ys-S er-V ai-M et-H is-G lu-A la-L eu-H is-A sn-H is-T yr-T hr-G ln-L ys-S erLeu-Ser-L eu-Ser-Pro-G ly

Anticuerpos

87

C uadro 5-8. Secuencia del octadecapéptido carboxiterminal de cadena,s pesadas de diferentes inmunoglobulinas IgG / i , (Humíina): ^G^ (H um ana): (Conejo): (Caballo):

(M et) - HLS - G L U - A LA ^ LE U ^ HiS ^ ASN - HLS ~ T Y R - TH R - G L N ^ LY S ^ SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H ) (M et) - HLS - G LU - ALA - LE U - HIS - ASN - A R G -

PHE - T H R - G L N - LYS - SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H )

(M et) - H IS - G LU - ALA - LEU - HiS - ASN - HLS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER -

ILE - SE R - A R G - SER - PRO - GLY - (C O O H )

(M et) - HLS ^ GLU ^ A LA ^ LE U - HÍS ^ ASN - H IS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER - V A L - SE R - LYS - SER - PRO - GLY - (C O O H

C u a d ro 5-9. D efinición y características de los diferentes fra g m en to s constitutivos d e las inmunoglobulinas Fragm ento H

Cadena peptídica pesada, con caracteres propios para cada clase de inm unoglobulina. Existen dos cad en as H idénticas po r m olécula de inm unoglobulina.

L

C adena peptídica liviana, com partida p or las diferentes clases de inm unoglobulinas. Existen dos ca d en as L idénticas po r m olécula de inm unoglobulina.

Fab

C onstituido po r una cadena L y el fragm ento H y-C ^l de u n a cadena pesada. Se lo obtiene por d ig e stió n papaínica. Se com porta fi'ente al antígeno com o ligando univalente.

Fe

D ím ero constituido por dos fragm entos de ca d en a pesada unidos por los puentes disulfuro c o rres­ pondientes a la zona de la bisagra. Se obtiene por digestión papaínica. N o expresa actividad anticuerpo.

F(ab’)2

C onstituido p or dos fragm entos F ab ’ unidos por puentes disulfuro. Se lo obtiene por digestión p ép sic a d u ­ rante 18 hs. Se com porta frente al antígeno com o ligando bivalente. T iene capacidad p ara p recip itarlo p e­ ro no expresa otras propiedades del anticuerpo com o fijación del com plem ento, pasaje placentario, etc.

F ab’

Se obtiene por reducción del fragm ento (F (ab’)2 con m ereaptoetanol y bloqueo de los grupos-SH co n io ­ doacetam ida. Está constituido por el fragm ento Fab y restos de la región bisagra.

F e’

Es un dím ero del fragm ento Cj_j3 de ca d en a H. Se obtiene por digestión p rolongada con papaína.

Fd

E stá form ado por el fragm ento V jj-C^l de cadena H. Se lo obtiene por reducción y desnaturalización del fragm ento Fab,

Fv

Constituye la parte variable del fragm ento Fab. Es un dím ero de V h-V, .

p F c’

Es sim ilar al F e ’, R esulta de digestiones cortas con pepsina,

Fb

Constituye la parte constante del fragm ento Fab, Es un dím ero de Cj^,l-C,,

C uadro 5-lOa. Secuencia de los primeros 30 aminoácidos N-terminales (F R l) correspondientes al fragmento variable de las 6 familias de cadenas H humanas V H l (É’í / I g G l ) P ca-V a l-G ln -L e v i-V a l-G to -S e r-G ly -A la ~ G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G iy -S e i-S e i-V a l-L y s-V a l-S e r-C y s-L y s-A la -S e r-G ly -G ly -T h r-P h e -S e r(;) V H 2 (COR I g G l ) P ca-V al-T Iir-L e u -A rg -G lu -S er-G ly -P ro -A Ia-L e u -V a l-L y s-P ro -T h r-G ln -T h r-L eu -T h r-L eu -T h r-C y s-T lir-P h e-S er-G ly -P h e-S e r-L e u -S er('2 ) V H 3 ( I g G A l) G lu -V a l-G ln -L e u -L e u -G lu -S er-G ly -G ly -G ¡y -L e u -V a l-G ln -P ro -G ly -G ly -S e r-L e u -A rg ~ L eu -S er-C y ,s-A la-A la-S er-G ly -P h e-T lir-P h e -S er (3) V H 4 (X A C /lg M ) P ca-V al-G ln -L eu -G ln -G ln -T rp -G iy -A la-G ly -L eu -L eu -L y s-P ro -S er-G lu -T h i‘-L eu -S er-L eu -T h r-C y ,s-A la-V al-T y r-G ly -G ly -S e r-P h e-S e r (4) V H 5 (gen 5 J R f) G lu -V a l-G ln -L e u -V a l-G ln -S e r-G ly -A la -G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G ly -G lu -S e r-L e u -L y s-V a l'S e r-C y s-L y s-G ly -S e r-G Iy -T h r-S e r-P h e -T h r (5)

V m ig e n lG l) G ln-V al-G Jn -L eu -G ]n ~ G ln -S er-G ly -P ro -G ly -L eu -V al-L y s-P ro -S e r-0 1 n -T h r-L e u -S e r-L eu -T h r-C y s-A la-l)e-S er-G ly -A ,sp -S e r-V a l-S erí6 )

(I), (2), (3): S eq u en c es o f p ro te in s o f im m u n o lo g ica l in tere st, F o u rth E dil,, 1987 (K a b a t E, y col,) (4): J. Biol. Chem., 2 6 6 :2 8 3 6 -2 8 4 2 , 1991 (5): EM BO J., 7:727-738, 1988 (6¡: Eur. J. Immun., 20:351-3,56, 1990 P C A es el s ím b o lo p a ra cl re s id u o deriv a d o del ácido p irro l¡d -2 -o n e-5 -ca rb o x ílic o

88

Aspectos básicos de la Inmunidad

C u ad ro 5-lOb. Contenido en genes Vh del locus funcional en cromosomas 14 Vh I

Con m arco de lectura reordenado C on m arco de lectura no reordenado Pseudogenes N o secuenciados Total

II 1 4 1 17

Vh 2

V h3

Vh 4

Vh 5

Vh 6

3 0 1

22 6 21 2 51

11 0 ) 1 13

2 1 O

1

0 4

0 3

0 O 0 1

Vh 7

Total 51 9 30 5 95

E lab o rad o con datos to m ad o s d e G. P, C o o k e l.M .T o n iliso n . Immunology Today, 16: 237, 1995.

se produce entre los residuos cisteína de las ca­ denas L en las posiciones indicadas y los de las cadenas H ubicados al comienzo de la porción constante del fragmento Fd (aproxiinadamente residuo 140). Además, el número de puentes disulfuro intercadenas FI-H es cuatro, once y dos, respectivamente. La zona de la bisagra de la IgG3 es de mayor tamaño que en las restan­ tes subclases, a causa de que un fragmento del ADN del gen que codifica para Cy (véase cap. 6) se ha cuadruplicado. Tiene 62 residuos re­ sultantes de la unión de un segmento de 17 re­ siduos seguidos en posición C-terminal de tres F (a b ’)2

fragmentos idénticos de 15 residuos cada uno. Ello hace que su peso m olecular sea de 170 kD. La IgG4 no fija el complemento, la IgG2 no se fija a piel heteróloga, y sólo las IgGl e igG3 tienen capacidad opsonizante y son sensi­ bles a la acción proteolítica de la papaína en ausencia de cisteína (fig. 5-14). La subclase con mayor actividad fijadora del complemento es la IgG3, que a su vez es la de menor vida media (8 días). La relación cadenas k/X para las diferentes subclases de IgG es la siguiente: IgG l = 2,4; IgG 2= l,l;Ig G 3 = l,12;IgG 4 = 5.

Anticuerpos

89

F ig . 5 - 1 3 b . D ib u jo s d el esqueleto de los earbonos a co rresp o n d ie n tes a una m olécula de IgG com pleta, su fragm ento Fv, la región de la bisagra y el fragm en­ to Fe. (C o m p o sic ió n e la ­ borada con partes de las fi­ guras publicadas p or P ad ­ lan E A , A n a to m y o f lite antibody m olecule. M o le ­ cular Im m unology, 31: 169,

1994.)

Bisagra

CH2

Fe

Todas estas investigaciones efectuadas sobre estructuras primai'ias de inmunoglobulinas han llevado a la formulación de la hipótesis de una evolución estructural de las cadenas L tipo K o X, a partir de un gen ancestral común. La ho­

mología estructural observada entre las cadenas L y H sostiene la hipótesis de una evolución común y una diferenciación primaria de los ge­ nes que gobiernan esta síntesis (fig. 5-15). Es posible que el ancestro sólo tuviera 300

90

Aspectos básicos de la inmunidad

IgG,

IgG,

C/3 íi L

lgG4

F ig . 5-14. E squem a estructural de las diferentes subclases de IgC hum ana.

K

ERA

AÑOS (millones)

nucleótidos y que codificara para un péptido de 100 aminoácidos (un bucle); por duplicación génica y plegadura intragénica se originaron los genes que gobiernan la síntesis de las distintas cadenas L y H. Ello habría surgido con la evo­ lución. De las cadenas H, las primeras en dife­ renciarse fueron las jj. y luego lo habrían hecho las restantes. En la figura 5-15 puede verse esa evolución en el curso del tiempo y las especies. Cada m olécula de IgG es bivalente, o sea que tiene dos sitios de combinación para el de­ terminante antigénico específico, que está si­ tuado en el dominio formado por las regiones variables de las cadenas L y H, y ambas contri­ buyen a la formación del sitio de combinación. En la naturaleza sólo han sido hallados anti­ cuerpos bivalentes para un solo determinante antigénico. No se conocen anticuerpos heteroligados naturales. Todos estos estudios sobre productos de de­ gradación de IgG y su reactividad han llevado a la esquematización de su molécula. Una de las más aceptadas ha sido la propuesta por Por­ ter (fig. 5-4). Se han analizado con el microscopio electró­ nico los productos de interacción de la IgG an­ ticuerpo antidinitrofenol con el dihapteno co­ rrespondiente unido por cadenas de -C H ^ -. Igualmente han sido examinados los productos de reacción del anticuerpo completo y los obte­ nidos por digestión pépsica (Eab^’) y papaínica (Eab). Se pudo comprobar que, cuando el que reacciona es el anticuerpo completo, se forman

A, X

|J,,

Ii^a,

ttj Y, Yj, Y3 Y4 8

e

ESPECIES Primates

Kenozoica

-6 0

Aves

-200

IVIesozoica

Reptiles Anfibios Peces Paleozoica

-5 0 0

^

plegadura intragénica duplicación génica

F ig . 5-15. E volución de las cadenas L y H de las inm unoglobulinas a partir de un gene ancestral comiin. (Tom ado de E. V an Loghem . A nn. N . Y ork A cad. Sci. 190: 137, 1971.)

Anticuerpos

91

Fig. 5-16. Microscopía clcclróiiiica. A: l"Ci de concjo ainidiiiilriilv-iuil al ínlcr.iccíoiiar cdu IXNI’- M l - i ( '!Ij;, N(I l)X I'. H: La misma imnunoglobulina previamente tratada con pepsina. (Tomado de Valentine, R.A. y Green, N. iVI. J. M ol. Biol., 27:615, 1967.)

predom inantem ente figuras triangulares con mamelones en los extremos, los cjue desapare­ cen si el anticuerpo ha sido sometido previa­ mente a digestión pépsica (fig. 5-16). Si el trata­ miento fue papamico no se forman figuras geo­ métricas. De ello se dedujo que la IgG se ase­ meja a una Y con los dos sitios reactivos en los extremos superiores (fig^. 5-17). Su tamaño ha sido calculado en 200 Á de ancho. La figura 5-18 representa los triángulos formados por la interacción de tres moléculas de IgG con tres moléculas del dihapteno, que corresponden a las figuras observadas al microscopio electróni­ co. Los trabajos mencionados han servido, ade­ más, para poner en evidencia que la formación de figuras geométricas triangulares sólo tiene lugar cuando el puente que une los dos radicales difenilo tiene un mínimo de seis -CH^-. Si bien la estructura en Y es la que se observa cuando la IgG ha reaccionado con el ligando, no se tie­ ne seguridad sobre su conformación cuando se encuentra libre en solución. Hay quienes sostie­ nen que la indicada en la figura 5-4 podría ser la correcta, en tanto que otros, basados en estudios de diferentes tipos, consideran que la estructura de la IgG libre es una T, la que dada su flexibi­ lidad adquiriría la forma de Y al reaccionar con un ligando, exponiendo de este modo ciertos re­ ceptores ocultos como serían los que facilitan la fijación del componente C lq del sistema com­ plemento (fig. 5-19). Estudios de difracción de rayos X efectuados con inmunoglobuhnas mo­ noclonales cristalizadas parecieran confirmar la estructura en forma de Y. Todas las inmunoglobulinas contienen hidra­ tos de carbono, pero ellos no molestan en el es­

tudio de sus estructuras-, pues se encuentran uni­ dos a sus moléculas a través de restos de aspa­ ragina y son fácilmente separables por hidróli­ sis. Las fórmulas representativas de la IgG se­ rían Y2K2 y 72^2IN M U N O G L O B U L IN A M (Ig M )

Sinonimias: yM globulina: 19 S inm unoglo­ bulina; macroglobulina. Representa la m ás pe­ sada de las globulinas del sistema gamma. Desde hace tiempo se conocía la existencia de anticuerpos de alto peso molecular, pero sus características fisicoquímicas y relaciones in­ munológicas y genéticas con las otras globuli­ nas inmunes han sido determinadas con poste­ rioridad a los estudios reahzados con IgG. Su concentración en el suero normal es esca­ sa, pero en los últimos tiempos se ha logrado conocerla m ejor com o consecuencia d e una profundización en los estudios sobre algunas p ato lo g ías, com o la m a cro g lo b u lin em ia de Waldenstrom y el hallazgo del factor reum atoi­ deo. Este y la globulina aislada de la enferm e­ dad citada son 19Sy globulinas y se encuentran en altas concentraciones. La designación de 19Sy globuhna se hace con el objeto de recor­ dar su velocidad de sedimentación equivalente a 19 unidades Svedberg. Su peso molecular es 970 kD y ha sido calculado por ultracentrifuga­ ción. Exámenes de este tipo evidencian hetero­ geneidad de ¡a IgM y ello se debe a que, si bien el componente más importante tiene una cons­ tante de sedimentación de 19 unidades Sved-

92

Aspectos básicos de la inmunidad

/

Fig. 5-19. Representación esquem ática de la m olécula de IgG según Edelm an. ®; hidratos de carbono.

F ig . 5-17. Estructura propuesta para la IgG por V alentine y O reen de acuerdo con observaciones hechas a nivel de m icroscopia electrónica.

berg, existen siempre fracciones adicionales que se encuentran en menor proporción y po-

seen velocidades de sedimentación de 29 S y 35-40 S, que constituyen polímeros de la 19 S gammaglobulina. Esta proteína tiene una movilidad electrofo­ rética que va desde la zona media de las gam­ ma hasta las betaglobulinas. Su contenido en hidratos de carbono es apro­ ximadamente del 12% con un 5,2% de hexosa

NOg F ig . 5-18. Esquem atización de las figuras triangulares con m am elones en los extrem os observadas al m icroscopio electró­ nico cuando interaccionan anticuerpos (IgG ) de conejo anti-D N P y el dihapteno correspondiente. Si la reacción se realiza con los productos de digestión pépsica y el dihapteno, se form an figuras triangulares carentes de m am elones, de lo que se deduce que los m ism os corresponden al fragm ento Fe de la IgG. Para que la reacción se produzca, el núm ero de - d i z ­ que unen los dos grupos dinitrofenol (D NP) debe ser superior a seis.

Anticuerpos

o

T ~T

t/5

X

o

I

- 88-

SS

-88h é b h h h b b

93

-S 9 ~

-

88-

Ii b i

ü X

aCOOI

O co

-S S

■coo-

nK

SS

/ 00

\ i

n

f

F ig. 5-20. Estructura esquem ática de IgM m onóm era (A) e IgM polim érica (B).

y 2,9% de hexosamina, lo que determina una relación hexosamina/hexosa de 0,55. Por ultracentrifugación preparativa, crom atografía en columnas de D EA E-celulosa o filtración por geles se la puede obtener pura. C antidades apreciables se pueden conseguir a partir de sue­ ros de pacientes con m acroglobulinem ia de Waldenstróm.

Cuando su peso molecular es el indicado, se ha determinado que su valencia es predom inan­ temente pentavalente, aun cuando posee otras cinco valencias de menor afinidad. Su fórm ula sería (iJ-jKj), y (M-25^2)5- Recientemente se h a de­ mostrado en el plasma humano la presencia de IgM constituida por la polimerización de 6 uni­ dades monoméricas, lo que estaría relacionado

94

Aspectos básicos de ia inmunidad

F ig . 5-2 1 . M icro sco p ia e lectró n ica de u n a m o lécu la de IgM en la que se puede apreciar su estructura en form a de estrella. (T om ado de F einstein, A. y col.: A nn. N. York A cad. Sci., 190: 104, 1971.)

con la cantidad de cadenas J que sintetiza el plasmocito (véase más adelante). Aquellas cé­ lulas con bajos contenidos de cadenas J secre­ tan IgM-exámero (igM)6, secretando IgM-pentámero (IgM)5 las células plasmáticas que tie­ nen alto contenido de cadenas J. Los mitógenos y polisacáridos de la pared celular de bacterias, con subunidades de carbohidratos repetidas, in­ ducen en los linfocitos B producción de IgM en ausencia de linfocitos Th cooperadores y sin la participación de IL-2. En estos casos la síntesis de IgM-exámero se ve favorecida. Fija el com­ plem ento y su capacidad de com binación es mayor con antígenos particulados que con los solubles (fig. 5-20). Observada al microscopio electrónico por el método de la tinción negati­ va, tiene aspecto estrellado, con un centro en forma de pentágono y cinco prolongaciones la­ terales (fig. 5-21). Cuando la IgM es tratada por mercaptoetanol, se disocia en subunidades 7 S, que conser­ van las características de antigenicidad de la molécula total, no así la actividad de anticuer­ po plurivalente, si es que la molécula la poseía. La recom binación de las 7 S subunidades se consigue si el mereaptoetanol es eliminado por diálisis. Estas 7 S subunidades son estables si después del tratamiento con mereaptoetanol se impide la reoxidación con iodoacetamida. Se comportan como anticuerpos univalentes aun cuando están constituidas por dos cadenas L y dos cadenas H (P.M. 65 kD). Ello se debe a que al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para precipitar o aglutinar, como consecuencia de algún im pedim ento estérico. Que se trata de anticuerpos bivalentes, no obstante su aparente com portam iento de univalentes, ha sido de­ mostrado mediante la preparación de híbridos y por estudios de interacción primaria.

La IgM da reactividad cruzada con la IgG, siendo responsable de ello el péptido L. La trip­ sina d iv a la molécula de IgM por encima del puente disulfuro in tercadena H, originando Fab|i monomérico y Fc|0.5 (pentamérico). Si la IgM es reducida por mereaptoetanol en presen­ cia de urea, se obtienen cadenas L similares a las que se encuentran en las IgG, siendo esta fracción de la molécula, al igual que en el caso anterior, el lugar donde se encuentran locahza­ dos los determinantes antigénieos comunes y los factores genéticos Km. Las cadenas H tie­ nen características propias y particulares. Se co­ noce el análisis secuencial de cadenas jj, com ­ pletas. Fi logenéti camente se considera que éstas son las cadenas H más antiguas, de las que se diferenciaron las cadenas y hace 200 millones de años y las a hace 300 millones de años. Los factores genéticos Gm, específicos de la inmunoglobulina, no se encuentran en la IgM. Algunos anticuerpos, que se forman por in­ m unización con antígenos T -independientes (poliósidos, antígenos somáticos de Salmonella typl%i) y algunas isohemoaglutininas, son IgM globuhnas. En algunos animales de experimen­ tación e incluso en el hombre, en el curso ini­ cial de una inmunización con antígenos T-dependientes, se forman anticuerpos IgM, pero nuevas estimulaciones con los mismos antíge­ nos dan lugar a IgG inmunes. Las característi­ cas de estas variaciones en el curso de la res­ puesta inmune se exponen en el capítulo 8. Hasta el momento no se ha podido demostrar fehacientem ente que la IgM atraviese la p la­ centa. Algunas pocas comunicaciones sobre el hallazgo de esta proteína en la sangre del cor­ dón umbilical deben ser tomadas con cuidado, hasta tanto no se conozca bien la capacidad de síntesis de aquélla por parte del feto, ya que el aporte de datos acerca de la síntesis temprana de esta globulina es cada vez mayor. La cadena polipeptídica designada cadena J (joining) se encuentra asociada con las formas poliméricas de IgA y con el pentámero de IgM (19S). Es un producto de síntesis de las células p lasm áticas, tiene un peso m olecular de 15 kDa, es rica en restos -S H y se une a las men­ cionadas inmunoglobulinas mediante uniones disulfuro. Cuando la cadena J no es detectada en los polímeros no tratados, puede ser eviden­ ciada por la adición, previa al análisis inmunoelectroforético o a la inm unodifusión, de agentes reductores. Es interesante destacar que en los diferentes polímeros de IgA y en IgM 19S sólo se ha de­ tectado una cadena J por polímero. La cadena J desempeña un papel muy impor­ tante en el proceso de polimerización. Hay for­ mación de uniones covalentes de una cadena J a dos unidades monoméricas vecinas, indepen-

Anticuerpos dientemente de los monómeros que compongan el polímero. El hallazgo de péptidos a - J - a es un argumento de valor en ese sentido. Estos es­ tudios han servido también para demostrar que la cisteína preterminal de la región C-terminal de las cadenas a y probablemente de las ja. se une a las cadenas J. La figura 5-22 muestra la estructura esquemática de la cadena J. En células plasmáticas elaboradoras de IgG no polimériea se ha demostrado la presencia de cadenas J, lo que indica que su hallazgo no siempre significa polimerización. En los polí­ meros su presencia es constante. La IgMs (subunidad monomérica) intracelu­ lar aislada no polimeriza espontáneamente, si­ no con previa reducción; esto hace suponer que los residuos de cisteína responsables de las interuniones de las subunidades están bloqueados dentro de la célula. Inmediatamente antes de la secreción se in­ corporan la cadena J y los hidratos de carbono terminales. Si bien la cadena J participa en la polimeriza­ ción, no se tiene una idea clara de cómo ocurre ello, ya que la IgM es siempre un pentámero, en tanto que las células que sintetizan IgA, dispo­ niendo de toda la maquinaria para la polimeri­ zación, dan productos constituidos por m onó­ meros, dímeros, trímeros y aun tetrámeros. INMUNOGLOBULINA A (IgA) Sinonimia: 7-13 S y globulina; p^A globuli­ na; Y, A globulina.

95

SH Met —

"r“

-----.A s p COOH

S

S

S

S

J _ _ _ ------- L _ pca

SH

F ig . 5-22. C adena J, estructura esquem ática.

Durante mucho tiempo ha sido inexplorada y la mayor parte de la información que se tiene proviene del estudio de mielomas de tipo IgA. Se ha demostrado su actividad anticuerpo y com probado que se encuentran ubicados en ella algunos autoanticuerpos, tales como el an­ tinúcleo, antitiroglobulina y antiinsulina. N o es fijadora del componente Clq del sistema com­ plem ento y el monóm ero no es precipitante. Fue considerada en un comienzo como porta­ dora de la reagina alérgica, sensibilizante de la piel, pero hoy sabemos que ello es patrimonio de la IgE. Una característica muy particular de la IgA es su marcada heterogeneidad, la que se debe a un conjunto de componentes con constantes de sedi­ mentación que van de 7 S a 13 S, que se forman por polimerización y son disociables por mercaptoetanol y urea en medio ácido (fig. 5-23). Su contenido en hidratos de carbono ocupa un lugar interm edio entre la IgG e IgM . Los valores son algo superiores al 7% y la relación hexosamina/hexosa es de 0,8. La IgA, al igual que la IgM, no atraviesa la placenta.

Dímero (IgA)j

Fig. 5-23. Inm unoglobulina A (IgA).

96

Aspectos básicos de ia inmunidad F ig. 5-24. Estructura pro-, puestci para la IgA.

La degradación enzimática con papaína pro­ duce subunidades 3,5 S constituidas por pépti­ dos Fab y pequeños péptidos resultantes de la degradación enzimática del fragmento Fe. Por reducción y alquilaeión se obtienen péptidos L y H. Las cadenas L son similares a las de otras inmunoglobulinas: contienen los factores gené­ ticos Km y los determinantes antigénicos co­ munes. Las cadenas H, en cambio, tienen ca­ racterísticas propias. En cadenas (IgA^) se ha demostrado la presencia de factores genéti­ cos, a los que se denomina Am. Dada la dificultad en la obtención de frag­ mentos proteolíticos de esta inmunoglobulina, similares a los logrados con IgG, las investiga­ ciones inmunoquímicas se han hecho más difí­ ciles, en especial las relacionadas con su estu­ dio secuencial. Se admite que su estructura es la indicada en la figura 5-24. La separación y purificación de una enzima p roteolítica elaborada por el Streptococcus sanguis, una bacteria aislada de heces hum a­ nas, ha significado un aporte im portante al es­ tudio de la IgA. Esa proteasa d iv a a la inm u­ noglobulina en la zona de la bisagra, por enci­ ma de los puentes S-S intercadenas H-H, dan­ do origen a los péptidos F a b a y F ea, similar este último a los péptidos Fe de las otras inm u­

Fig. 5-25.

noglobulinas. La separación de ambos se con­ sigue por filtración a través de Bio-gel P-200. El F e a obtenido por este procedimiento puede aislarse como monómero, con una constante de sedimentación 3,0 S y P.M. de 41,5 kDa, o como dímero con un coeficiente de sedimenta­ ción de 5,3 S. Por reducción con ditiotreitol, el dímero se transforma en monómero. La men­ cionada enzima ha resultado efectiva en el elivado de IgA sérica e IgA secretoria, perm itien­ do en ambos casos obtener F ea. Según algu­ nos autores es efectiva sobre la Ig A l, no así sobre la IgA2. Se conocen dos subclases de IgA (IgA l e IgA2), que difieren antigénicamente y por su contenido en galactosamina, aminoazúcar que sólo está presente en la primera. Los pesos mo­ leculares de las cadenas a , y son de 58 kDa y 52 kDa, respectivamente. En una forma alotípica de lgA2 (AmJ) se ha observado la ausencia de puentes disulfuro intercadenas L-H, lo que hace presumir que la integridad de la molécula se debe a fuertes uniones no covalentes. La otra forma alotípiea (Am^O tiene una estructura si­ m ilar a la IgA l y en ambas las uniones L-H son por puentes disulfuro (fig. 5-25). En todos los casos su estructura normal es Kj o

Subtipos de IgA.

Anticuerpos Resulta interesante conocer que, si bien el contenido de IgA es bajo en el suero sanguíneo normal (1,5-2,0 mg/ml), es relativamente alto en otros fluidos tales como la saliva, lágrimas, secreción intestinal, fluido prostático y calos­ tro, especialmente en este tiltimo. Puede sepa­ rarse de éstos por filtración a través de Sepha­ dex G-200 o por cromatografía en DEAE-celu­ losa. A esta inmunoglobulina se la conoce co­ mo IgA secretoria y difiere en ciertos aspectos de la sérica. Es predominantemente 11 S y está asociada a un fragmento antigénicamente dis­ tinto de las cadenas L y H, llamado componen­ te secretorio (S). El peso molecular de la IgA secretoria es de 385 kD y consiste en dos subu­ nidades monoméricas de IgA (7 S) y el compo­ nente secretorio de P.M de 70 kD, el que pare­ ce estar unido covalentemente a sólo una de las unidades m onom éricas (fig. 5-26). La unión entre las unidades 7 S es por puentes disulfuro y en ella participa la cadena J de manera simi­ lar a lo que ocurre en la formación de los polí­ meros 19 S de la IgM. La fijación al com po­ nente S es por uniones covalentes de puentes disulfuro y uniones no covalentes. La IgA secretoria, cuya fórmula genérica es (a^ k ^)2 S o ( a ^ ^ 2)2 S, es sintetizada por las cé­ lulas plasmáticas ubicadas en el subepitelio, de donde una pequeña parte puede pasar a la cir­ culación general, mientras que el resto durante el transporte a través del epitelio glandular o de la superficie intestinal fija el componente se­ cretorio, previo a la secreción. Este componen­ te, que es elaborado por las células epiteliales, le confiere a la inm unoglobulina propiedades particulares, entre eUas una marcada resistencia a la acción de las enzim as proteolíticas (fig. 5-27). Actualmente se sabe que el componente S está constituido por los cinco dominios extracelulares del RPolylg (receptor de IgM e IgA poliméricas, que normalmente transporta estas formas de IgM e IgA a través del epitelio intes­ tinal y hepático) liberados por proteólisis. Para mayor información véase más adelante Super­ familia de las inmunoglobulinas y cap. 17. La re s iste n c ia c o n fe rid a p ro b ab lem en te constituya una necesidad biológica, ya que se considera que la IgA de las secreciones desem­ peña un papel importantísimo en los m ecanis­ mos de defensa de las m ucosas frente a los agresores, especialmente bacterias y virus (in­ munidad local). Para mayor información, véan­ se caps. 24 y 27.

97

el suero normal es de 0,03 m g.m f’. M igra en la zona de las beta lentas o gamma rápidas. Su constante de sedimentación es 7S. Por digestión con papaína y cisteína da Ec y Fab. Por reducción y alquilación con mercaptoetanol y iodoacetam ida libera cadenas L y H(5) (P.M. 69,7 kD). Las cadenas L son comu­ nes a las de las otras inmunoglobulinas y perte­ necen a los tipos K y (fig. 5-28). La relación cadenas k/X es 0,25. No posee determinantes específicos de las IgG, IgM, IgA e IgE, pero en cambio posee de­ terminantes específicos propios correspondien­ tes a sus cadenas H. Responde a la fórmula y y ha sido identificada en otras especies animales. En la superficie de linfocitos B del ra­ tón se ha identificado una IgD similar a la hu­ mana, con la que presenta reactividad cruzada. Actividad específica relacionada con esta in­ munoglobulina ha sido demostrada en anticuer­ pos antipenicilina, antiinsulina y antitoxina dif­ térica. De su importancia fisiológica se conoce muy poco. Ha sido hallada como inmunoglobu­ lina de membrana en linfocitos B, donde fun­ ciona como unidad de reconocimiento de antí­ geno en la respuesta inmune.

IN M U N O G LO BU LIN A D (IgD) En el hombre, inicialmente fue hallada en un caso de mieloma. Constituye el 1% de las in­ munoglobuhnas totales y su concentración en

IN M U N O G LO BU LIN A E (IgE) Investigaciones efectuadas en la década de los 60’, han demostrado que el hasta entonces

98

Aspectos básicos de ¡a inmunidad F ig . 5-2 7 . B io sín tesis de IgA secretoria.

a circulación general

% i (igA),S

Epitelio glandular

Célula plasmática

denominado anticuerpo reagínico humano, res­ ponsable de la alergia atópiea, estaba localiza­ do en una nueva inmunoglobulina, a la que se denominó IgE o gamma E la que migra en la zona de la IgA. Su velocidad de sedimentación en gradiente de sacarosa es 7,8 S y su P.M. 185 kD. Por re­ ducción y alquilaeión se liberan cadenas H(e) específicas (P.M. 72,5 kD) y cadenas L de tipo K y A, de características similares a las otras ca­ denas L ya conocidas. Su estructura es y y predominan las que contienen cadenas K (fig. 5-29). Se fija a piel homóloga, no así a piel heteróloga, y es la responsable de la anafi­ laxia activa y pasiva homóloga en el hombre. Se fija a tejidos de primates, hecho que ha sido aprovechado para numerosos estudios experi­ mentales.

ss-

M ielom as identificados como de tipo IgE han provisto material adecuado para completar estos estudios. Anticuerpos similares han sido reconocidos en otras especies animales pero debido a su pe­ queña cantidad no han podido ser estudiados inmunoquímicamente. Una inm unoglobulina del cobayo que re s­ ponde a esas características ha sido aislada y purificada por nosotros. La IgE reducida con mercaptoetanol pierde su propiedad de inducir reacción anafiláctica, no porque haya modificado su capacidad para unirse al antígeno, sino porque la reducción de los puentes S-S intercadenas H-H altera la capacidad del fragmento Ec pai'a fijarse al receptor presente en el mastocito o basófilo sanguíneo. La IgE ca­ lentada a 56°C se comporta de manera similar.

_

0 1 ü

o X

ü

o X o

H(5). SS

-S S

OHC

-SS .

-SS

o X o

Fig. 5-28. P robable estructura de IgD.

o X o

Anticuerpos Mayor información sobre el comportamiento de la IgE podrá hallarse en el capítulo 32. Proteína de Bence-Jones Sinonimia: gam m aglobulina microm olecular, yL globulina; 1,0-3,5 S y globulinas. En la orina de mielomatosos se encuentra la proteína de B ence-Jones, de peso m olecular aproximadamente 40 kD y constante de sedi­ mentación 3,5 S, que da reacciones inmunoserológicas cruzadas con las inmunoglobulinas. Se ha encontrado también que la orina normal contiene vestigios de IgG y de gammaglobuli­ na de bajo peso molecular, de aproximadamen­ te 1,6 unidades de sedimentación, que antigéni­ camente y por sus propiedades fisicoquímicas, aun para el ensayo del calor, se comportan co­ mo la proteína de Bence-Jones. Fueron halla­ das también en sueros humanos normales y se las denomina y^ globulinas o microglobulinas. Se han identificado dos tipos diferentes de proteínas de Bence-Jones, con cuyos antisueros pudo clasificarse a las inm unoglobulinas en dos grupos. La profundización de estas investi­ gaciones ha permitido establecer que las proteí­ nas de Bence-Jones están constituidas por ca­ denas L y que contienen factores genéticos Km y los determinantes antigénieos comunes pre­ sentes en las inm unoglobulinas. Se conocen formas monoméricas de P.M. 23 kD, dímeros de P.M. 45 kD y aun tetrám eros de P.M. 85 kD. Experiencias efectuadas con radioisótopos indican que el aum ento de las proteínas de Bence-Jones en la orina, en los casos de mielomas, no es una consecuencia de la exagerada metabolización de la IgG mielomatosa sérica; serían productos secundarios, colaterales, de la síntesis globulínica. Su aumento en la orina en estos casos se explicaría como una consecuen­ cia de la exagerada síntesis de la globulina m ielom atosa por parte de clones de células plasm áticas que han sufrido degeneraciones

t l 's s ^

o X O

H (e ).

L s s —I co

malignas y han adquirido la capacidad de pro li­ ferar sin tasa, sin haber perdido el poder de sin­ tetizar la globulina normal. Las proteínas de Bence-Jones son cadenas L libres que pueden escapar como producto colateral y, como con­ secuencia de su bajo peso molecular, ser excre­ tadas por la orina, donde las formas diméricas son las halladas con más frecuencia. D ada su homogeneidad, estas proteínas han sido m uy utilizadas para los análisis secuenciales de las cadenas L (fig. 5-30). Últimamente se ha demostrado que el amiloide de las amiloidosis está constituido por el dominio V ,, mezclas de V, y C; y cadenas L enteras. Esto aclara una serie de hechos, en es­ pecial los relacionados con la aparición de am i­ loidosis en los mielomas, ya que el amiloide no sería más que producto de la degradación enzi­ mática de cadenas L. En el cuadro 5-11 se encuentran resumidas las propiedades más significativas de las inm u­ noglobulinas del hombre. LOS HIDRATOS DE CARBONO DE LAS MOLÉCULAS DE INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas contienen hidratos de carbono (heteropolisacáridos), que norm alm en­ te están localizados en las cadenas H. Las cade­ nas J, participantes de la polimerización de la IgM e IgA, y el componente secretorio (CS) de la (IgA)^S están glucosilados; no lo están, en cambio, las cadenas L. El contenido en hidratos de carbono v aría para las diferentes clases de inmunoglobulinas, o scilando esos valores entre 2% y 3% p ara IgG, 7% y 11% para la IgA, 12% para la IgM , 9% y 14% para la IgD y 12% para la IgE. La unión de los hidratos de carbono puede tener lugar por iV-glucosilación u 0-glucosilación, siendo ésta muy poco frecuente en las in­ munoglobuhnas. En el primer caso ocurre por

O

O O

o

0 o 1 1

X

L s s —J 1' l—s's —1

-SS

X

X

1—ss -J

co co w co co co

o X ü

I m

m

99

ü X o

Fig. 5-29. Inm unoglobulina E (IgE).

r T

0 1 o

o o

I

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L s s —1

100

Aspectos básicos de ía inmunidad cd >

o O 'O

ó hir¡ O

o Fluidos en los que está p resente

O

‘3 o (U

oUt O 1— i

.2 1 g '& o 'c^3 00

Fijación a proteína G

+ + , + + + + +

+ +

+

Fijación a proteína A

+ + 1+ + + ' +

+ +

+

F ijación a polim orfonucleares neutrófilos

+ 1+ +

+ +

4-

Reacción con proteína A del S. aureus

+ + 1+

Fijación a m acrófagos

+ í + í

1 1

1

Fijación a m astocitos heterólogos

+ 1+ +

1 1

1

1 1

1

*

Fijación 0 m astocitos hom ólogos P asaje placentario

+ +

+

Fijación del com plem ento (vía alterna)

l i l i

Fijación del com plem ento (vía clásica)

í+

C antidad sintetizada (m g/kg/día) Vida m edia fdías) % de intravascular cataboUzada p o r día D istribución intravascular (%) C oncentración sérica (m g %)

D om inios de la cadena Fl

Peso m olecular de la cadena H (kD)

í

1

+ +

1

1 1

1

m co

CN 'O

r- r- r-- r-

-o

1 1

^ O r-- -H CN r j (N

CN

o o o o (N On0^ 00 (N

O O r- ^

L I» 65 H (“) + L » + LW sis de cadenas L y H aisladas de IgG anti-p-azoH w L < > ’) 20 fenil-p-lactósido y hapteno monovalente desa­ C om petitivo rrollados por Karush en los que se demostró una H . Por este procedimiento es posible, además, calculíu' « (valencia o número máximo de mo­ léculas de ligando monovalente que se fijan por molécula de anticuerpo), ya que en el punto en que la proyección de la curva experimental in­ tercepta a r corresponde al valor r/c - O y r oo, o sea aquel en que el anticuerpo está total­ mente saturado por el ligando. Que r = n s t de­ duce de la ecuación:

cuando

luego r K = n K y por lo tanto r

n

Esta graficación perm ite tam bién calcular Kav o “constante de afinidad media pesada o ponderada”, que corresponde al promedio de

las afinidades pesada o ponderada por la. con­ centración de los anticuerpos con cada afini­ dad. La pendiente de la recta que une los pun­ tos en que la curva intercepta a r/c y r constitu­ ye Kav, y experimentalmente se calcula deter­ minando el cociente entre esos dos valores de r/c y r. Si Kq se calcula graficando log r/n-r versus log c (fig. 8-2B), para lo cual es necesario co­ nocer previamente la valencia y concentración del anticuerpo en análisis, cuando r/2 = 1 (mi­ tad de los sitios de combinación saturados), log r/n-r = 0. Trazando una perpendicular a log r/ n-r en el valor O, dicha recta cortará a la traza­ da con los valores experimentales, lo que per­ mitirá determinar el log c en ese punto. Con ese dato se calcula c, y 1/c = K(>. La graficación de Sips (fig. 8-2B) permite además calcular a o índice de heterogeneidad de los anticuerpos. Dado que éste no es más que el valor de la pendiente de la recta grafica­ da, puede hallarse determinando A y

----- = a AX El valor a puede también calcularse a partir de la ecuación (16) o de la siguiente: (27) Act K“c»

Act

deducida a partir de la (7’), pero adaptada para un sistema policlonal, elevando K y c a la po­ tencia a, y con la nomenclatura utilizada en la ecuación (11) Los estudios de interacción primaria liganteligando pueden servir también para determinar el número de receptores y determinantes anti­ génicos existentes en una membrana celular, así como su constante de afinidad. En estos ca­ sos, la graficación que mejor resulta es l/b ver­ sus 1/c (fig. 8-1), derivada de la ecuación de Langmuir adaptada (11). 1

1

1

L.K.c.

L

donde L es el ligante, b y c las concentraciones de ligando combinado y libre, respectivamente. Si se quiere determinar, por ejemplo, el nú­ mero de receptores para Fe en la superficie de un eritrocito, es necesario hacer interaccionar cantidades iguales de una suspensión de un nú­ mero conocido de células ■mh* con el ligando específico (en este caso ÍgM monomérica mar­ cada con = “ ‘^^'LIgM.7S”) a concentracio­ nes variables. Transcurrido el tiempo suficiente para que la reacción se equilibre se centrifugan los tubos y se determina la radiactividad del so­

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro brenadante (ligando libre = c) y del sedimento (ligando combinado = b), las que se transfor­ man en molaridades conociendo previamente la relación c.p.m./concentración molar del ligan­ do usado. Con los resultados obtenidos se gra­ fica 1/b versus 1/c y la curva obtenida, linearizada por análisis regresivo o por el método de los cuadrados mínimos, es extrapolada hasta interceptar 1/b. Este valor corresponde a la in­ versa de ligando combinado ('^'I.ÍgM.7S, PM = 180 kD ), que satu ra to talm en te al lig an te (FcR), y con los datos obtenidos se calcula la concentración molar del ligando y el número de moles en el volumen usado. Asumiendo que a cada FcR se une una molécula de ‘^‘LIgM.7S, multiplicando los moles fijados por 6,02 x 10^^ (número de Avogadro) se obtiene el número de moléculas fijadas por la totalidad de las células reaccionantes cuando el ligante está saturado, valor que equivale al número total de FcR exis­ tentes. Dividiendo ese valor por el número de eritrocitos usados en el ensayo se obtiene el nú­ mero de FcR por célula. Por este procedim iento hemos podido de­ mostrar que la densidad de receptores hemáti­ cos para Fe por célula es 1,2 x 10^ en los eritro­ citos de carnero y 1,2 x 10^’ en los de pollo. Los valores de la constante de afinidad entre ligante y ligando se calculan en la forma ya in­ dicada (fig. 8-1).

-t- B F Ka La “capacidad fijadora de antígeno” ,

(28) [H] [S] Si sustituimos [HS] por B (ligando unido o bound y [H] por F (ligando libre o fre e ), la ecuación (28) puede escribirse Ka

B

1

F

So - B

(31)

ABC puede expresarse también en términos de sitios de fijación: So (no diluido) ABC = -------- ------------- B So

(32)

donde So (no diluido) es la concentración total de sitios de combinación en el suero sin diluir y So la concentración total de sitios de combina­ ción en la dilución del suero en la que B sitios están combinados; es decir. So (no diluido) So

1 dil. suero

Se ha observado que la ABC de u n suero, medida a diferentes concentraciones de ligando total, está relacionada con la avidez de los anti­ cuerpos contenidos en ese suero. Para deducir una expresión que describa esa relación, se ha definido un nuevo término; ABCx (33)

en la que ABCi es la capacidad de fijación de antígeno con una concentración total de ligan­ do referida com o concentración ín d ice (i) y ABCx es la capacidad de fijación de antígeno con una concentración de ligando diferente, ge­ neralmente menor, llamada concentración en análisis o experimental (x). Sustituyendo en la ecuación (33) los equiva­ lentes de la (32), resulta; So (no diluido) -----^-------------- B (x) So (x) So(i) B(x) R = .---------------------------- = --------------- (34) So (no diluido) Soíx) B(i)

Usando ia expresión (30), la ecuación (34) pue­ de escribirse; [(B/F)i (1/Ka) 4- Bi] Bx R = ^--------- ^------------- (35) [B/F)x (1/Ka) + Bx] Bi

(29)

La concentración de [SJ libres es igual a la concentración total de So menos la concentra­ ción de sitios combinados B, luego [S] = So - B. La ecuación (29) puede reordenarse para re­ solver So

(30)

1 ABC = ------------ B dil. suero

R =

jHS]

l

So =■

Capacidad fija d o ra de antígeno

En 1975, W. E. Paul y G. J, Elfenbein des­ cribieron un método que permite calcular afini­ dades relativas, utilizando la técnica de Farr de precipitación con sulfato de amonio. En los en­ sayos tipo Farr, los resultados generalm ente son expresados en términos de “capacidad fija­ dora de antígeno” o ABC {antigen binding ca~ pacity). Cuando un hapteno H interacciona con un anticuerpo que tiene S sitios de combinación con el ligando y el sistema se equilibra.

167

de donde (B/F) X Bi - (B/F)i Bx Ka = --------- ^ ^ ------(36) (l-R )B i Bx

168

Aspectos básicos de la inmunidad

La expresión (36) permite calcular Ka sin re­ querir el valor de la concentración de los sitios totales (So). Para estas determinaciones de afinidades re­ lativas, es conveniente comparar sólo ABC ob­ tenidos cuando el 33% del ligando está unido (ABC33), en cuyo caso B/F 0,5. En estas con­ diciones, la ecuación (36) se simplifica: Ka =

R B i-B x 2(1 -R ) Bi Bx

(37)

Es conveniente señalar que Ka (37) corres­ ponde a la afinidad relativa Kr o Ka 33%, lo que no significa Ko o constante de asociación intrínseca mediana. Parte experimental: 10 jj,l de ligando específico radioisotópieamente marcado, a concentraciones 10 M (con­ centración índice) y 10 ’ M o 10 M (concen­ tración experimental) se mezclan con 10 |u,l de diluciones seriadas del antisuero. Las mezclas se dejan 30-60 minutos a 4°C y se les añade a cada una de ellas 20 [xl de solución saturada de sulfato de amonio. Se incuba 30 minutos a 4“C, se centrifuga a 2.500 r.p.m. por 30 minutos a la misma temperatura. En 20 jul de los sobrena­ dantes (si el radioisótopo em ite radiaciones gamm a) o en las m ism as cantidades p revia­ mente mezcladas con 6 ml de Aquasol (si el ra­ dioisótopo emite radiaciones beta) se mide la radiactividad, utilizando en cada caso el conta­ dor de radiaciones correspondiente. Se incluye una serie testigo en la que el anti­ suero es sustituido por suero normal de la mis­ ma especie. El porcentaje de ligando unido se define co­ mo:

100- 100

APENDICE Cuando para estudios de interacción prima­ ria se grafican resultados, en especial ///? ver­ sus 7/ t', muchas veces resulta difícil trazar la línea que une esos puntos experimentales. Co­ mo la ecuación matemática que representa a di­ cha curva es y = a + bx, puede lograrse el traza­ do de una línea corregida mediante la aplica­ ción de análisis regresivo, o bien, por el méto­ do de los cuadrados mínimos. Tomemos como ejemplo el cuadro 8-2 y la curva resultante de la graficación de dichos da­ tos experimentales (fig. 8-2). En ella x = 1/c, y = I/b, siendo N = número de determinaciones. Para dichos datos experimentales S X = 2,67 E x2 = 1,4867 x = 0,38 (Ex)2 = 7,13 Exy =159 N=7 Conociendo las varianeias (S^) de x e y, y la co­ variancia, esos datos pueden ser computados y usados luego para la elaboración de la recta. / (2 x)2 \ S2(x) = ■ (z x = - - - ) = 0 .0 * N -l 1

La dilución de anticuerpo requerida para tal unión (ABC33) se determina experimental mente graficando “porcentaje de ligando fijado” con­ tra “logaritmo de la dilución del suero” . Ello permite determinar

dil.

B

y con los resultados obtenidos calcular R de acuerdo con la ecuación (33) y Ka mediante la ecuación (37).

(Z y f \ \ = 705

/

S 2 ( y ) = ------ / X y 2 ---- ^

N-l Covariancia (xy) =

1

N -l g

< radiactividad del sobrenadante ' en presencia de antisuero radiactividad del sobrenadante \ en presencia de suero norm al ,

Zy = 304 Sy^ = 17.384 y = 43,39 (Ey)2 = 92,416

X )(£ y)

N El coeficiente de correlación r = covariancia (xy) ~ 1 s (X )

Siendo S (x) =

S (yT

(x) y S (y) =

= 0,97

(y )

El resultado obtenido es un buen valor para una correlación ya que r está matemáticamente restringido a estar situado dentro del rango -1 a -1-1. La ecuación de la línea regresiva de la figu­ ra 8-1 es y = a + bx

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro covariancia (xy) b = ---------------- ^ =91,3 (X )

siendo: a = y - bx = 8,7 por lo tanto, la ecuación que m ejor une los .puntos experimentales de la figura 8 -1 es y

= 8,7 + 91,3

X

Para dos diferentes valores de ;c, dentro de la escala de la gráfica, se obtienen otros tantos va­ lores de y, con los que puede trazarse la recta deseada. Ello puede lograrse también calculan­ do un solo valor de 3; para determinado valor de X ya que el otro punto de la recta sería a pues ésta es la ordenada al origen. La recta que une los puntos experimentales de la figura 8 - 1 lia sido trazada con los valores antes indicados. Otro método que puede usarse para hallar los valores de a y ¿> en la ecuación (28) es el de los cuadrados mínimos. En este caso se determinan de la siguiente manera: Z x^ • Ey ^ Lx • i: xy N Í x 2 ^ (X x y b =

N 2 : xy - E X • E y N E x2 - (E

X) 2

ALGUNAS R EA C C IO N ES DE INTERACCIÓN PRIMARIA USADAS PARA LA D ET E C C IÓ N DE ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS En los últimos 25 años se han descrito una serie de métodos de interacción primaria para la detección de antígenos y anticuerpos, de gran sensibilidad y marcada especificidad, en­ tre los que merecen destacarse el radioinm u­ noanálisis, el enzimoinmunoanálisis, la inm u­ nofluorescencia y, muy recientemente, el inm u­ noanálisis por quimioluminiscencia. Por regla general se designan con siglas: RIA (radioinmunoanális; IRMA (análisis radioinm unom é­ trico); ELISA (análisis con reactivo inm une marcado con enzima); IF (inmunofluorescencia directa); IFI (inm unofluorescencia indirecta). Algunas de estas técnicas han sido modificadas y no obstante constituir simples variantes de ellas, se han usado siglas para su identificación, las que muchas veces se prestan a confusiones. Todas ellas se caracterizan porque la identi­ ficación del antígeno o del anticuerpo tiene lu­ gar por una interacción simple, sin la participa­ ción de fenómenos asociados, como ocurre en las reacciones de interacción secundaria.

169

INMUNOFLUORESCENCIA (IF) Los métodos serológicos comunes resultan inapropiados para investigar la presencia de an­ tígenos en la superficie de células, bacterias y parásitos, así como su distribución, o cuáles son las células comprometidas en la biosíntesis de los anticuerpos. Para estas investigaciones, así como para la identificación de microorganismos en m ateria­ les infectados y algunas reacciones antígenoanticuerpo desarrolladas con cantidades m íni­ mas de reactivos, ha sido descrito un m étodo de alta sensibilidad y que ha permitido resolver problem as insolubles hasta el momento. L la­ mado inmunofluorescencia, se basa en el em ­ pleo de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes como el isotioeianato de fluores­ ceína o lisamina-rodamina. Estas sustancias, al ser excitadas eon longitudes de onda del rango ultravioleta, emiten luz de mayor longitud, la que se demuestra por fluorescencia am arilloverdosa o anaranjadorrojiza, respectivamente. La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. En el primer caso lo que se m arca es el anticuerpo que habrá de interaccionar direc­ tamente con el antígeno. En la forma indirecta se emplea como reactivo marcado un suero anügam m aglobulina (contra la gam m aglobulina de la especie animal de la que proviene el anti­ cuerpo). Se lo hace actuar sobre el com plejo antígeno-anticuerpo no marcado que ha reac­ cionado en una primera etapa. La metodología consiste en colocar sobre un portaobjetos el material que contiene el antíge­ no para analizar. En la técnica directa, éste se cubre con el antisuero marcado con fluoresceína y, después de lavado para eliminar el m ate­ rial fluorescente no fijado específicamente, se hace la observación microscópica, utilizando una fuente de luz ultravioleta y los filtros ade­ cuados. Cuando se emplea la técnica indirecta, lo que se añade al portaobjetos que contiene el m aterial antigénico es el antisuero específico sin marca. Luego de cierto tiempo de contacto el preparado se lava, se cubre con suero anti­ gammaglobulina marcada, se deja reaccionar y se lava nuevamente. Se observa con el m icros­ copio en la forma ya descrita. En el prim er ca­ so, si el antígeno ha fijado el anticuerpo con marca, el complejo emite fluorescencia. En el segundo caso, el antígeno fija el anticuerpo sin marcar, pero sobre éste se acopla la antigam ­ maglobulina marcada, que es la que emite fluo­ rescencia (figs. 8-7 y 8 - 8 ). C om o en toda reacción inm unológica, son necesarios controles adecuados. El tratamiento previo del material antigénico con antisuero es­ pecífico sin marcar debe inhibir la fijación del mismo anticuerpo con marca y, por otra parte.

170

Aspectos básicos de la inm unidad Fig. 8-7. In m u n o flu o re s c e n c ia d irecta e i,udicecta.

Anticuerpo marcado

Antígeno sin marca

Complejo Ag-Ac marcado

I: Esquema de reacción de inmunofluorescencia directa

Primera etapa

¥

.

Anticuerpo sin marca

Antígeno sin marca



Complejo Ag-Ac sin marca

Segunda etapa

^\U/, si/-4; ~Vs'* Complejo Ag-Ac sin marca

'/ a'' Complejo Ag-Ac marcado

Anticuerpo marcado (antigammaglobulina)

II; Esquema de reacción de inmunofluorescencia indirecta

la adición de antígeno soluble en exceso al an­ ticuerpo marcado debe inhibir su fijación pos­ terior al antígeno fijado al portaobjetos. Se obtiene un buen reactivo cuando el anti­ cuerpo ha fijado dos o tres grupos fluorescentes por molécula. Si está muy marcado puede teñir inespecíficamente tejidos. Para reducir al míni­ mo este inconveniente, y con el objeto de eli­ minar la mayor parte de la proteína muy mar­ cada, es necesario filtrar por Sephadex G-25, resinas intercam biadoras o adsorber el suero con polvo de tejidos, en especial hígado de ra­ tón desecado con acetona. Si el suero tiene un alto título de anticuerpos (3-5 mg/ml), la dilu­ ción para su uso minimiza las tinciones inespe­ cíficas. La inmunofluorescencia ha sido muy utiliza­ da, sobre todo para la investigación rápida y es­ pecífica de agentes infectivos en m ateriales sospechosos. Empleando anticuerpos con mar­ cas diferentes, ha sido posible investigar más de un antígeno en un mismo preparado micros­

cópico. E sta m etodología es la que proveyó una de las evidencias de que las células plas­ máticas son las principales elaboradoras de los anticuerpos, y que en los linfocitos B existen inmunoglobulinas de superficie. De las técnicas descritas, la directa tiene el inconveniente de que debe disponerse de anti­ cuerpo m arcado con especificidad para cada antígeno. La indirecta, en cambio, solamente utiliza antigammaglobulina marcada con fluo­ rocromo. Para detalles metodológicos véase el capítu­ lo 34. RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) Y A N Á LISIS RADIOINMUNOMETRICO (IRMA) La cuantificación de pequeñas cantidades de antígenos, no detectables por los métodos con­ vencionales, puede lograrse sin inconvenientes

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

171

B’ig. 8-8. Epim astigotes de T ripanosom a cruzi, visualizados por inm unofluorescencia indirecta.

si están marcados con átomos radiactivos. M e­ diante su em pleo ha sido desarrollado el ra­ dioinmunoanálisis, método sensible y específi­ co, muy utilizado sobre todo en endocrinología para Ja cuantificación de hormonas peptídicas. Se ha usado también con éxito en estudios de interacción hapteno-anticuerpo y en el análisis de hormonas esteroides. El hecho más significativo del radioinm u­ noanálisis es el de que utiliza una marcación radioisotópica para discriminar entre antígeno unido al anticuerpo y antígeno libre. El radioi­ sótopo es un átomo inestable que se va desinte­ grando y em ite partícu la s subatóm icas y/o energía en la forma de radiación, que pueden ser medidas en aparatos apropiados. Cada isó­ topo radiactivo tiene una vida media (t 1/2) es­ pecífica, factor limitante para su uso en algu­ nos casos. Los átomos radiactivos más utiliza­ dos con 3H (t 1 /2 = 1 2 años), '^'C (t 1/2 = 5.730 años), 57Co (t 1/2 = 270 días), (t 1/2 = 60 días), (t 1/2 = 8 días); la energía emitida es­ tá constituida por radiaciones P en los dos pri­ meros y Y en los restantes. El marcado de los antígenos con radioisóto­ pos puede hacerse por diferentes métodos.

Para la separación del antígeno libre y com­ binado, valores que se usarán para las graficaciones, pueden emplearse métodos fisicoquími­ cos como la electroforesis, adsorciones cromatográficas, resinas intercarabiadoras, filtración por geles, precipitación salina o con polietilen­ glicol, etc., o métodos inmunológicos mediante el em pleo de un anticuerpo con especificidad para la especie animal del anticuerpo q u e en prim era instancia reaccionó con el antígeno (método del doble anticuerpo). Uno de los radioinmunoanálisis más utiliza­ dos es el de competición que se basa en el si­ guiente principio; si a una serie de tubos que contienen una mezcla de anticuerpo y antígeno radiactivo en cantidad suficiente para saturar el 50% de los sitios de combinación, se le añade cantidades crecientes de antígeno sin m arca, habrá competición por la ocupación de esos si­ tios. Se producirá una caída secuencial del antí­ geno marcado combinado a lo largo de la serie. Con los datos obtenidos puede graficarse antí­ geno marcado combinado (escala lineal) versus antígeno sin marcado añadido (escala lo garít­ mica). Dentro de cierto rango, la curva regresi­ va es lineal, lo que permite por interpolación de

172

Aspectos básicos de la Inmunidad

los resultados obtenidos en un ensayo similar con un antígeno sin marca, de concentración desconocida, hacer su cuantificación. El análisis radioinm unométrico (IRMA), o inmunoanálisis utihzando anticuerpo marcado con un átomo radiactivo, es cada vez más utili­ zado y con frecuencia es más sensible y especí­ fico que el RIA. El fundamento es similar al del RIA, pero invariablemente usa una técnica . de separación en fase sóhda del anticuerpo li­ bre, para discriminar entre éste y el anticuerpo unido al ligando. En este ensayo, la cantidad de antígeno es medida en función de la cantidad de anticuerpo marcado que se ha unido. Para más detalles sobre el tema véase el capítulo 38. ENZIMOINMUNOANÁLISIS (ELISA) La histoquím ica ha provisto los principios que han servido de base para el desarrollo de una nueva metodología inmunológica, la inmu­ noenzimología, que en forma directa o indirec­ ta permite identificar antígenos. Los fundamen­ tos son similares a los de la inmunofluorescen­ cia, de la que se diferencia en que emplea anti­ cuerpos (método directo) o antigammaglobuli­ na (método indirecto) marcados con una enzi­ ma capaz de desarrollar una reacción colorea­ da. La enzima usada con más frecuencia para el marcado es la peroxidasa y el sustrato la o-fenilendiamina y H , 0 2 . A provechando la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse a pH 9-10 a tubos, es­ feras, discos o concavidades en placas de plás­ tico (poiiestireno y polipropileno), se han desa­ rrollado métodos de ELISA que perm iten la cuantificación de pequeñas cantidades de antí­ genos, con una sensibilidad próxim a a la del RIA, y tiene la ventaja de no tener que usar m aterial radiactivo ni aparatos especiales de medición de radiactividad. El m étodo puede desarro llarse fijando al plástico cantidades limitantes de anticuerpo, el cual se hace interaccionar con diferentes con­ centraciones del antígeno que se ha de valorar y la cantidad adecuada del m ism o antígeno marcado con la enzima. La fijación de ésta es­ tará en proporción inversa a la del antígeno no marcado. Existiendo una fase sólida que retiene al antígeno combinado, la discriminación entre éste y el antígeno libre, será fácil, datos funda­ mentales para la graficación y cuantificación. El ELISA puede hacerse también con anti­ cuerpo al que se ha fijado la enzim a o anti­ gammaglobulina (segundo anticuerpo) marca­ da. En el primer caso, a cantidades variables de antígeno fijadas al plástico se le añaden concentraciones constantes de anticuerpo enzi­

ma marcado. Por lavado se elimina el anticuer­ po que no se fijó, y el anticuerpo fijado se de­ tecta añadiendo el sustrato correspondiente, que desarrollará color en forma proporcional a la de anticuerpo presente. Como en la inmunofluorescencia indirecta, el ELISA puede desa­ rrollarse usando antigammaglobulina contra la especie animal a la que pertenece el anticuerpo usado en la primera etapa, hecho que lo hace más general y evita el uso del antisuero especí­ fico marcado para cada una de las oportunida­ des. En este caso se fijan al plástico diferentes c o n cen tracio n es de antígeno que se hacen reaccionar con anticuerpo específico sin m ar­ ca. D espués de lavar se añade la correspon­ diente antigammaglobulina marcada con la en­ zima, y transcurrido el tiempo conveniente y luego de lavar se adiciona el sustrato adecuado para el desarrollo de color y lectura de los re­ sultados. Para detalles técnicos véase el capítulo 37. INMUNOANÁLISIS CON REACTIVOS M ARCADOS CON SUSTANCIAS LUMINISCENTES La luminiscencia es un fenómeno similar al de la fluorescencia. La diferencia radica en que en la fluorescencia la energía excitante es luz ultravioleta, mientras que en la luminiscencia es provista por una reacción química. Existen dos tipos de luminiscencia. La “bioluminiscencia” es una reacción en la que parti­ cipa un organismo viviente, tanto del reino ani­ mal como vegetal. Lo hacen a través de un sis­ tema enzimático, el de la luciferasa. Algunas luciferasas son específicas para el ATP, casi siempre con producción de un fotón por cada molécula de ÁTP que reacciona. Otras lucifera­ sas, especialmente las de origen bacteriano, son menos eficientes y tienen especificidad para NADH o NADPH. La reacción de “quimioluminiscencia” produce luz a partir de reacciones químicas simples, que involucran la acción del oxígeno o de peróxidos en la oxidación de sus­ tratos orgánicos. Como consecuencia de la ex­ citación, algunas moléculas del sustrato lumi­ n iscente em iten fotones m ientras que otras emiten calor. Los sistemas más eficientes son aquellos en los que la emisión de fotones es máxima. En los sistemas bioluminiscentes, esa eficiencia puede variar entre un 10% y un 90%, m ientras que en los quim iolum iniscentes los valores oscilan en alrededor del 1%. Recientemente se han desarrollado métodos de inmunoanáhsis que utilizan este principio, especialmente la quimioluminisceneia por ser de menor costo, no obstante la mayor eficien­ cia de los sistemas bioluminiscentes.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

173

«y

Biotina Ac

F ig . 8-9. Inm unoanálisis po r form ación de com plejos avidina-biotina.

Una de las reacciones de quimioluminiscencia más estudiada es la producción de luz por el lum inol en presencia de peróxidos, reacción que requiere pH alcalino y algunos metales o

heminas como catalizadores. La reacción pue­ de ser catalizada también por peroxidasa a pH neutro. La luz producida puede ser medida y su in­

174

Aspectos básicos de la inmunidad

tensidad depende de la cantidad de sustancia lum iniscente presente. Si el lum inol u otras sustancias quimioluminiscentes como el isoluminol, pirogalol, derivados del luminol y ésteres ele acridinio, entre otras, son unidas cova­

lentem ente a antígenos o anticuerpos, estos productos pueden ser usados para inmunoanáli­ sis de quimioluminiscencia. La reacción de quimioluminiscencia del lu­ minol es la siguiente; O II C — O-

NH - Luz

+ 2 H ,0 , + OH---------—

ilH

^ ^

catalizador

X máx. 430 nm)

C — O' NH.,

NH,

‘ O Luminol

FORMACION DE COMPLEJOS AVID IN A-BIOTIN A La avidina es una glucoproteína que fija la biotina con una unión de muy alta afinidad (K^ = 10^-“^ M). Ambos reactivos pueden ser fijados en forma covalente a anticuerpos, antígenos, enzimas, sustancias fluorescentes, células, etc., productos que pueden obtenerse en el com er­ cio. Esto ha hecho que la formación del com­ plejo avidina-biotina sea usado con buenos re­ sultados en estudios de interacciones anticuer­ po-ligando, facilitando el desarrollo de enzi­ moinmunoanálisis, radioinm unoanálisis, estu­ dio de interacciones antígeno-anticuerpo a n i­ vel celular, etcétera. La biotina es un factor soluble del complejo vitamínico B y actúa como coenzima de enzi­ mas involucradas en mecanismos de carboxilación. Se puede copular fácilmente a anticuer­ pos o enzimas sin pérdida de su actívidad. Esta unión, de tipo covalente, se produce entre el grupo carboxilo de la biotina -p rev ia activa­ ción- y los grupos amino libres de las proteí­ nas. La avidina, compuesto proteico de la clara de huevo, es muy estable y presenta varios si­ tios de unión por lo que puede actuar como puente entre dos moléculas biotiniladas o unir­ se covalentemente a enzimas formando un con­ jugado capaz de reaccionar con anticuerpos o antígenos biotinilados. Los enzimoinmunoanálisis que aprovechan la formación del complejo avidina-biotina ge­ neralmente se desarrollan fijando el anticuerpo específico sin marca a una fase sólida. Después de interaccionar con su correspondiente antíge­ no el complejo se lava y se le añade el mismo anticuerpo al que previamente se le ha fijado

a-aminoftaiato + N ,+ 3H ,0

biotina covalentemente. Después de producida la reacción se lava y se añade avidina marcada con peroxidasa, y luego se continúa la reacción añadiendo el sustrato correspondiente, como se indicó en enzim oinm unoanálisis (fig. 8-9A). También ha dado muy buenos resultados para la identificación de anticuerpos monoclonales (de origen murino). En este caso, al antígeno fijado a una fase sólida se le añade el material que contiene los anticuerpos monoclonales que se han de valorar. Los complejos formádos se hacen interaccionar luego con suero antiinmunoglobulina de ratón, obtenido de otra especie animal, al que previamente se le fijó biotina. Después de lavar se añade avidina marcada con peroxidasa y luego se desarrolla la reacción co­ loreada mediante el añadido del sustrato co­ rrespondiente (O-fenilendiamina y H^O,) (fig. 8-9B), Han sido descritas diferentes variantes de los dos mecanismos generales señalados. B IB L IO G R A F ÍA 1. B erz o fsk y , J A y S ch ec h ter, A N: T h e co n c ep ts o f crossreactivity and specificity in im m unology. M ol h n ­ munol, iS :7 5 1 , 1981. 2. Chase, M Kuhns, W J (Ed): S pecificity o f S erolo­ gical reactions: L andsteiner C entenial, A n n N Y A ca d Seo, 169:1-293, 1970. N York A cad Sci Publ; N York. 3. D ay, E D: A d va n ced Im m unochem istry. C hurchill-L evingstone, 1972. 4. E dw ards, 1^: Im m unoassay. An introduction. W illiam H einem ann M edical B ooks, Londres, 1985. 5. Eisen, H N y K arush, F: The interaction o f purified an­ tibody with hom ologous hapten. A ntibody valence and binding eonstant. J A m Chem Soc, 7 /:3 6 3 , 1949. 6. E isen, H N: D ete rm in atio n o f an tib o d y activ ity fo r haptens and antigens by m eans o f fluorescence quen­ ching. En; M ethods in M edical Reserarch. E isen, H N (Ed). V ol X, pág 115. Y ear B ook M ed Publ. C hicago, 1964.

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Reac^íión antígeno-anticuerpo in vitro Interacción secundaria

9

■RICAF^DO MARGNI

Dada Ja especificidad de la reacción antíge’no-anticuerpo, ésta ha sido utihzada con m ag­ níficos resultados en "a diferenciación e identi­ ficación de microor£ mismos, hematíes, antíge­ nos solubles, así como en la investigación y cuantificación de anticuerpos séricos, sobre to­ do con fines de diagnóstico. En este sentido han sido muy útiles las diferentes metodologías aportadas por la serología. En un principio se creyó que los diferentes fenómenos visuaiizables de las reacciones antígeno-anticuerpo, como ya se señaló al comien­ zo del capítulo 5, dependían exclusivamente de las características propias y particulares de és­ tos. Hoy se sabe que en ello participan distintos factores. En la interacción in vitro de un antígeno con su correspondiente anticuerpo se distin­ guen dos etapas, la reacción prim aría no visualizable y la reacción secundaria, que sigue a !a anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la aglutinación, la precipitación, etc. Cuando la reacción ocu­ rre in vivo, como consecuencia de esta inte­ racción pueden aparecer fenóm enos b iológi­ cos colaterales como la necrosis en la reacción de Arthus; los fenómenos vasógenos y de coníractura de la musculatura lisa en la anafilaxia como resultado de la liberación de histam ina y otros mediadores quím icos, etc. Estas m ani­ festaciones se consideran com o reacciones terciarias. Los mecanismos que regulan la reacción pri­ maria ya han sido expuestos en el capítulo 8. Los complejos iniciales que se forman rápi­ damente y sobre los que, dentro de ciertos lími­ tes, las variaciones de temperatura y concentra­ ción salina tienen poca influencia, se agregan luego para dar diferentes fenóm enos visibles

cuyas características dependen en gran parte del estado físico del antígeno. Esta etapa se acelera con la tem peratura, la agitación y es electrólito-dependiente. Es importante separar las etapas de la reac ­ ción antígeno-anticuerpo. Puede ocurrir que se demuestre la presencia de anticuerpo por inte­ racción primaria, pero que éste no sea detectable por interacción secundaria o terciaria. Esto puede ser consecuencia de variaciones cuanti­ tativas, ya que para conseguir fenómenos visi­ bles son indispensables deternrinadas concen­ traciones de anticuerpo, y cualitativas inheren­ tes a las propiedades de la clase de inmunoglo­ bulina comprometida en la respuesta inmune, así como de las características del ligando. Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interacción primaria, como ya se ha visto, ello no significa cjue siempre deban ocu­ rrir reacciones secundarias o tei'ciarias. Las diferentes m anifestaciones de tipo se eundario serán estudiadas en sus pormenores, en tanto que las terciarias podrán ser halladas en los distintos capítulos, en especial en el refe­ rente a m anifestaciones de hipersensibilidad. Las metodologías utilizadas para el desarrollo de las diferentes reacciones secundarias figuran en el capítulo 35. P K E C IP IT A C IÓ N Cuando un anticuerpo, excepción hecha de los bloqueantes y no precipitantes, es puesto en contacto con una solución de la macromolécula que lo originó, se form an com plejos Ac-Ag que se insolubilizan luego en su mayor part: dando una reacción de precipitación, que p u e­ de ser total o zonal (fig. 9-1).

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro Como expresáramos al comienzo del libro, ésta es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos y no una característica particular de un determinado tipo al que originalmente se lo llamó anticuerpo precipitante. Precipitación en medios líquidos Precipitación cualitativa E^sta reacción se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla rápidamente y es in­ fluida muy poco por la temperatura y los elec­ trólitos, se forman los complejos Ac-Ag prima­ rios. A medida que el tiempo transcurre, .esos complejos iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaños, las que finalmente precipitan. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solución. La velocidad de sedimentación es proporcional a V-((p-(po) g, siendo V el volumen de la partícula, (p y cpo las densidades de las partículas y el solvente, res­ pectivamente, y g, el campo gravitacional. La'tem peratura acelera esta segunda etapa, siendo además electrólito-dependiente. Cloruro . sódico al 0,85% (0,15 M) es la concentración óptima en la mayor parte de los casos, excep­ ción hecha de los anticuerpos de origen aviario, en que se eleva al 8%. Es rnucho más lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que se complete. La form ación de agregados es una co n se­ cuencia de la bivalencia de los anticuerpos y multivalencia de los antígenos. Con haptenos monovalentes o antígenos que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la preci­ pitación no se produce. Experiencias muy inte­ resantes sobre el particular se han realizado con ribonucleasa pancreática marcada con dinitro­ fenol (D NP-RNAsa) en la que las relaciones molares eran 1:1. Los sueros de animales in­ munizados por DNP-BSA no precipitan con ri­ bonucleasa monodinitrofenilada, pero sí lo ha­ cen los de animales inm unizados con ribonu­ cleasa.; Ello es consecuencia de la presencia de uú solo grupo DNP y de varios determinantes aátigéñjcos específicos para ribonucleasa por molécula de DNP-ARNsa. Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos m onoclonales, que en su m ayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos de los casos, especial­ mente cuando están dirigidos contra macromo­ léculas en solución, reconocen a un único epito­ pe no repetido, lo que les impide formar agrega­ dos. Con los sueros inmunes obtenidos de ani­ males inoculados con macromoléculas, ¡a preci­ pitación tiene lugar, pues en esos sueros hay una mezcla de anticuerpos capaces de interac­ cionar con diferentes epitopes del mism.o antí­

177

geno, lo que posibilita la formación de com ple­ jos mixtos Ac-Ag, insolubles (fig. 9 -Ib). Si se utiliza un antígeno marcado fácil de d e­ mostrar en el precipitado, es posible conocer la composición de los complejos Ac-Ag que p re­ cipitan, y si se analizan los precipitados que se forman en una serie de tubos en los que se han colocado cantidades iguales de anticuerpo y variables de antígeno, se verá que las relacio­ nes molares Ac/Ag son aproximadamente 1 en la zona de exceso de antígeno, 4 en la zona de equivalencia o proporciones óptimas y 7 en la de exceso de anticuerpo. El peso molecular del antígeno ejerce marcada influencia en esa rela­ ción. Siendo el peso molecular y la valencia del anticuerpo constantes, mayor número-de m o lé­ culas de éste podrán interaccionar con moléctllas de antígeno grandes que con pequeñas. En la zona de exceso de anticuerpo la relación es 40 para el sistema tiroglobulina-antitiroglobulina (tiroglobulina PM, 700 kD) y 5 para ovoal­ búmina-antiovoalbúmina (ovoalbúmina PM , 43 !cD). Con otras proteínas de diferentes pesos m oleculares esas relacio n es varían. P a ra la gammaglobulina humana (PM, 150 kD) es 7, para la ribonucleasa pancreática bovina (PM , 13,6 kD) es 3 y para si virus del mosaico del tabaco (PM, 40.000 kD) es 650. Estos valores están influidos por la especie animal de donde proviene el anticuerpo y su grado de inm uniza­ ción, ello como consecuencia de la calidad de los anticuerpos elaborados. Es conveniente re­ cordar que, en el curso de una inm unización, los anticuerpos que aparecen primero son IgM y luego IgG, si el inmunógeno es T-dependien­ te y no debe olvidarse además la existencia de anticuerpos no precipitantes capaces de origi­ nar uniones Ac-Ag, pero no de precipitar, por ser funcionalmente univalentes. La formación de estos diferentes complejos ha sido exphcada mediante la llamada teoría dél enrejado, que considera que la composición del precipitado formado es una consecuencia del modo en que anticuerpo y antígeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y m ul­ tivalencia del antígeno, las posibilidades de com binación varían según que en la m ezcla exista exceso de antígeno, exceso de anticuerpo o equivalencia de ambos (fig. 9-2). Las fórm u­ las de dichos complejos son; Ac^Ag, Ac^Ag pa­ ra la zona de exceso de anticuerpo; ACjAg, Ac^Ag para la zona de equivalencia; y AcAgj, Ac^Agj para la zona de exceso de antígeno, constituyendo complejos solubles, que se for­ man en la zona de marcado exceso de Ag. Precipitación cuantitativa Si bien la precipitación en medios líquidos es muy útil para ia identificación de antígenos

178

Aspectos básicos de la inmunidad F ig. 9 - la . P recipitación en m edio líquido. T ubos a y d, precipitación zonal con form ación de un precipitado anu­ lar. Tubo b, precipitación total con enturbiatniento. Tubo c, testigo.

A n tígen o

A nticuerpo m on oclon al

S u e ro inm une

V Y VV V anti-a

anti-a

anti-b

anti-c

V y C om plejo A g-A c n o precipitable

C om plejo insoluble

Fig. 9 - lb . Interacción de un antígeno que presenta m últiples epitopes (a, b, c) no repetidos, con un anticuerpo m onoclo­ nal (anti-a) y con un suero inm une que contiene anticuerpos anti-a, anti-b y anti-c. Sólo el suero inm une puede originar com plejos A c-A g insolubles.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro Fig. 9-2. F orm ación de precipita­ dos o com plejos solubles segíin las concentraciones de antígeno y an­ ticuerpo presentes en la mezcla.

179

Precipitados

Ac/Ag = 3

Ac/Ag = 2

Complejos solubles formados en exceso de antígeno

O O aAc/Ag = 0,5 = 0 ,6 7

Complejos formados en exceso de anticuerpo

Antígeno ■( )

Anticuerpo Ac/Ag = 5

Ac/Ag = 6

y anticuerpos, teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, en lo relativo a la formación de los precipitados, ella puede usarse con fines cuantitativos y constituye un buen método, para la medida de la concentración de los anticuer­ pos presentes en un suero. Puede usarse tam ­ bién para medir niveles de antígeno. Si suponemos que se desea valorar un suero antineumocócico tipo III y disponemos del polisacárido antigénico suficientemente purifica­ do, el método que se ha de seguir es el siguien­ te: en una serie de tubos se colocan voliimenes iguales del suero para valorar y cantidades cre­ cientes del poiisacárido. Después de la incuba­ ción, y producida la precipitación, todos los tu­ bos son centrifugados y los precipitados lava­ dos con solución salina tamponada (NaCl 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,6) para elim inar las proteínas séricas no específicas contaminantes. Si por cualquier procedim iento sensible (microKjeldahl, Folin-Ciocalteau, espectrofotometría) valoramos la proteína de los precipitados, ella corresponderá al anticuerpo, ya que el antí­ geno no tiene carácter proteico (cuadro 9-1 y fig. 9-3), Cuando se hacen estas valoraciones es necesario añadir EDTA al suero para evitar la copreeipitación del complemento.

Un hecho que llama la atención, y que pare­ cería que está en desacuerdo con lo expresado respecto de la formación de. los precipitados, es que la cantidad de anticuerpo no aum enta con el incremento de antígeno, sino que existe una zona óptima, llamada zona o punto de equiva­ lencia, ubicada entre las zonas de exceso de an­ ticuerpo y exceso de antígeno, donde la preci­ pitación es máxima. Si se analiza el sobrena­ dante de ese tubo, recurriendo a métodos sufi-

C u a d ro 9-1. Valoración de anticuerpos antipolisacáridos neumocócico tipo III

Suero mi 1 1 1 1 1 1 1 1

Poiisacárido neum ocócico Proteína tipo III del ppdo^ Hg/0,5 rnl (Ac) mg 25 50 75 100 150 200 300 400

1,61 3,32 4,15 4,75 4,96 4,07 3,19 2.53

A n á lisis del sobi'en a d a n te Exceso E xceso de Ag d e Ac

....

+ +

-

-1-

-

+

-

-h + +

-

-

180

Aspectos básicos de la inm unidad Sobrenadante E

|j,g de Ag añadido Fig. 9-3. Curva de precipitación correspondiente al sistem a polisacárido neum ocócico tipo Ill-antipolisacárido, elaborada con los datos del cuadro 9-1.

cientemente sensibles, se observa que en él no hay exceso de anticuerpo ni de antígeno. Ello significa que el anticuerpo contenido en ese precipitado corresponde a la totalidad de él, existente en el suero para valorar. Este hecho se explica si se tiene en cuenta que la reacción de precipitación es reversible y que tiene lugar bajo rigurosas condiciones de equilibrio:

DNP-SAB (dinitrofenil seroalbúmina bovina), por lectura espectrofotom étrica a 360 nm se puede determinar la concentración de antíge­ no y a 280 nm su contenido proteico. C ono­ ciendo este hecho de antemano es posible, por simple sustracción, calcular la proteína anti­ cuerpo del precipitado (véanse cuadro 9-2 y fig. 9-4). En caso de que el antígeno no tuviese marca, ovoalbúmina por ejemplo, es necesario por el Ag . Ac análisis de los sobrenadantes frente a antígeno : + Ac y frente a anticuerpo, por separado, determinar (precipitado) la zona de equivalencia. Como en ese punto la En exceso de Ag el equilibrio se desplaza, precipitación del antígeno es total, restando del formándose complejos solubles, y disminuye precipitado la cantidad de él añadida conocere­ por lo tanto la cantidad de anticuerpos en el mos la cantidad de proteína anticuerpo (véase precipitado: cuadro 9-3). Cuando en la valoración de anticuerpos por Ag Ac + Ag Agj Ac precipitación el punto de equivalencia se deter­ (precipitado) (soluble) mina mediante la investigación de exceso de Ac El mismo efecto anterior puede lograrse aña­ o de Ag en el sobrenadante, es indispensable diendo exceso de hapteno al precipitado. En es­ que el antígeno empleado en este examen sea de tas condiciones pueden form arse com plejos la máxima pureza. Si no fuese así, la mayor pre­ Hp^ Ac solubles, hecho éste que se emplea con cipitación podría corresponder a mezcla de anti­ suma frecuencia cuando quieren disociarse pre­ cuerpos y además podría ocurrir que anticuer­ cipitados para la purificación de anticuerpos. pos contra la im pureza, que se encuentran a La mayor o menor cantidad de Hp^ Ac formado concentraciones distintas de las del anticuerpo dependerá de la afinidad de aquél por el antíge­ para valorar, tengan zonas de equivalencia dife­ no y el hapteno. rentes y dificulten el análisis (fig. 9-5). Si el anticuerpo para valorar fuera específi­ Si el antígeno empleado en la inmunización co contra un antígeno proteico, el método de y en la valoración es una proteína con varios valoración para emplear sería el mismo, pero determ inantes antigénicos, ovoalbúm ina por en este caso la proteína del precipitado no se­ ejemplo, el título obtenido corresponderá a más ría exclusivaiíiente anticuerpo. Si el antígeno de un anticuerpo que han precipitado simultá­ tuviera una m arca identíficable, por ejem plo neamente. El problema se complica aun más si

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

181

ng de Ag añadido

F ig . 9-4. C urva de precipitación correspondiente al sistem a D N P -anü-D N P, elaborada con los datos del cu a d ro 5-3.

se tiene en cuenta que cada uno de los determi­ nantes puede tener una heterogeneidad distinta con respecto a la afinidad. Inhibición de la precipitación po r haptenos Siendo el hapteno la parte de la molécula an­ tigénica que le confiere la especificidad, es ló­ gico que el anticuerpo originado reaccione con ambos. Si bien la interacción directa anticuerpo-hapteno (A c-H p) no puede v isualizarse, puede ponerse de manifiesto mediante la inhi­ bición de la precipitación cuando es añadido el antígeno. Durante la primera etapa, los sitios de

com binación del anticuerpo son bloqueados por el hapteno, imposibilitando la interacción posterior del antígeno. Mediante este método ha sido posible tener m ejor información sobre la especificidad del anticuerpo que cuando se emplea la precipita­ ción cualitativa. El método también puede hacerse cuantitati­ vo y generalmente se elige como punto final de la reacción el 50% de inhibición. Tiene la ventaja de permitir la medición de la capacidad inhibitoria de haptenos relaciona­ dos y establecer comparaciones entre ambos, en especial sus afinidades con relación al antí­ geno inmunizante (fig. 9-6).

C u ad ro 9-2. Valoración de anticuerpos antidinitrofenol (anti-DPN) DO Suero mi

A ntígeno ¡lg/0,2 m i

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

40 75 100 125 150 175 200

360

280 (a)

0,290 0,385 0,502 0,611 0,740 0,796 0,737

1.060 1,221 1.305 1.542 1,634 1.609 1,530

D O (360) x 0 ,6 2 (b)

DO (280) corregido (a-b)

0,180 0,238 0,311 0,379 0,458 0,493 0,457

0,880 0,983 0,994 1,163 1,176 1,116 1,073

A c en ppdo. - mg 1,10 1,22 1,25 1,45 1,47 1,39 1,34

A g en ppdo. fíg

Relación Ac/Ag

53 70 92 112 136 145 135

20,7 17,4 13,4 12,9 10,8' 9.5 9,9

S u ero valorado: su ero de co n e jo in m u n iz ad o con g am m a g lo b u lin a h u m a n a d in itro fen o la d a (D N P -H G G ). A n tíg en o em p lea d o : alb ú m in a b o v in a din itro fen o la d a (D N P -B S A ). P ara D O (3 6 0 nm ) = 1 c o rresp o n d e n 93 }Xg d e antígeno (fig . 35-1). Inc u b ació n : 1 h o ra a 37"C y 24 h o ra s a 4 ‘'’C. í.ec tu ras: esp e ctro fo to m étric as (v o lu m en final d e lo s tu b o s 2 m i). 10/E^^i^, p ara la Ig G d e conejo: 0,625. C álculos: A n ticu e rp o en el p p d o .: D O (280 n m ) (a-b) x 2 x 0 ,6 2 5 : m g/ppdo. A n tíg en o en el p p d o .: D O (360 nm ) x 2 x 93: )ig/ppdo. R elación A c/A g: [ig A c en p p d o /|ig A g en ppdo. T ítu lo d e an ticu e rp o s anti-D Ñ P : m á x im a cantidad d e A c en ppdo. x 2. P ara el ca so de an alizado: ] ,5 x 2 = 3 m g - mi"' de suero.

182

Aspectos básicos de la inmunidad Fig. 9-S. C urva de precipÍT tación efectu ad a con suero d e o v e ja in m u n iz a d a con H G G -D N P. En los solwenad a n te s se o b s e rv a n tu b o s c o n e x c e s o d e A g y A c. Ello es debido a que se trata de un sistem a m ultiespeeífico, constituido por anticuer­ pos anti-H G G (-------) y an­ ti-DN P

|ig de Ag añadido -Precipitación con HGG - DNP -Precipitación con HGG -Precipitación con BSA - DNP

Reacción de floculación Un hecho no bien entendido es la llam ada reacción de floculación. Ésta se caracteriza por no formar precipitados hasta que la cantidad de antígeno añadido no exceda de ciertos límites, cosa que no ocurre con la precipitación. Aquí hay formación de agregados que sedimentan con el añadido de cantidades mínimas de antígeno. En la floculación, los complejos formados se agregan y sedimentan en un rango nruy estre­ cho de la relación Ac/Ag; en la zona de exceso de antígeno y exceso de anticuerpos sólo se forman complejos solubles. En la precipitación esto es bien manifiesto en la zona de exceso de antígeno (fig. 9-7).

Parecería que es una propiedad dependiente más de los anticuerpos que de los antígenos. Los sueros que dan floculación son los que se obtienen por inmunización de caballos con al­ gunos tipos de proteínas, en especial toxinas m icrobianas, como la diftérica y la tetánica. Los sueros de los mismos animales inoculados con polisacáridos se comportan como precipi­ tantes y no como floculantes. Los conejos, ca­ bras y ovejas dan sueros precipitantes, cual­ quiera que sea el tipo de antígeno empleado. En el hombre se ha observado que algunos sueros provenientes de enfermos con tiroiditis de fíashimoto, enfermedad en la que aparecen autoanticuerpos antitiroglobulina, se com por­ tan como floculantes.

C u ad ro 9-3. Valoración de anticuerpos antio­ voalbúmina

|iM de hapteno añadido

F ig. 9-6. G raficación de los resultados obtenidos en la in­ hibición de la precipitación por un hapteno. Sistem a reacti­ vo: D N P-anti-D N P. A nticuerpo: 0,5 m l de suero de oveja anti-D N P (inm unizada con D N P-H G G ). A ntígeno: 150 lig D N P-BSA (dosis óptim a). H apteno: dinitrofenol (D NP).

Suero ml

O voal­ búm ina llg/0,2 ml

DO (280 nm,}

Proteína del ppdo. mg

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

50 75 100 125 150 175 200 225

0,820 1,150 1,350 1,550 1,795 1,725 1,610 1,525

1,03 1,44 1,69 1,94 2,24 2,16 2,01 1,90

Análi'sis d el sobrenadante Exceso Exceso deA g cleA c _ _

+ + + + _

+ + +

_

-

C álculos; D O (280) X 0 ,625 x 2: P ro teín a del pre cip ita d o . (P roteína del ppdo. en zo n a d e eq u iv a le n cia) - (A g a ñ a d id o en zona de eq u iv a le n cia) = A n ticu e rp o en ppdo. en zo n a de eq u iv a le n cia. P ara el caso analizado: 2 ,2 4 - 0,15() = 2 ,09 m g/0,5 m l d e suero.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

183

Fig. 9-7. Curvas de p recip itació n y floculación. En la p re ­ cip ita c ió n sólo hay fo rm a c ió n de c o m ­ p le jo s s o lu b le s en exceso de antígeno, en ta n to q u e en la f lo c u la c i ó n e llo ocurre en exceso de an tíg en o y de a n ti­ cuerpo.

P R E C IP IT A C IÓ N

Los sueros con anticuerpos que dan precipi­ tación se identifican como de tipo R, y como de tipo H los que producen floculación. Esta denominación se ha adoptado teniendo en cuenta que los sueros de conejo (rabbit) y los de caballo (horse) son los que tienen esas características. Precipitación en medios con geles Las macromoléculas pueden difundir libre­ mente a través de geles; esta difusión está limi­ tada por la concentración del gel. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrólitos, es posible hacer migrar antígenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. Pue­ den utilizarse también geles con base de pectina, alginatos, poliacrilamida y aun tiras de ace­ tato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visuali­ zan como nítidas bandas de precipitación, que permanecerán estables mientras un mayor aflu­ jo de moléculas de los reactivos no provoquen redisolución. Se han descrito numerosas técnicas cualitati­ vas y cuantitativas basadas en este principio, entre las que pueden citarse la difusión simple monodimensional, doble difusión monodimensional, doble difusión bidimensional, difusión radial, inmunoelectroforesis.

trando, creando un gradiente de concentración. En la interfase gel-líquido no se form an preci­ pitados, dada la alta concentración antigénica, y aparecen con la forma de bandas cuando la concentración del antígeno que ha difundido es la óptima. Si en el suero había más de un anticuerpo y en la solución añadida más de un antígeno que se correspondan, se formarán tantas bandas de precipitación como sistemas hayan interaccio­ nado. Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta que estas separaciones dependen de las veloci­ dades de difusión de las diferentes moléculas antigénicas, sólo será cierto si aquéllas son dis­ tintas. El número de bandas de precipitación nos indica la cantidad mínima de sistem as reac­ cionantes presentes. Esto también es relativo, ya que es indispensable que los reactivos no es­ tén a concentraciones inferiores a las necesarias para que la reacción ocurra. Teniendo en cuenta que la velocidad de mi­ gración depende del coeficiente de difusión del antígeno y de su concentración, Oudin trató de aplicar las leyes de la difusión con el objeto de transform ar el m étodo en cuantitativo, estu­ diando los factores que influyen en la forma­ ción de los precipitados. Las fórmulas para la cuantificació n p ropuestas por él son las si­ guientes:

1) Difusión simple monodimensional M étodo conocido también como técnica de Oudin simple, por ser éste el autor que lo des­ cribió; consiste en colocar en un tubo de ensa­ yo pequeño agar fundido (solución al 1% en NaCl 0,15 M) mezclado con un volumen igual del antisuero para analizar. Producida la solidi­ ficación, se añade la solución de antígeno. Por difusión a través del gel el antígeno va pene­

2)

ÍL

VF ,

h =K VT =

y lo g

^

Ago

h Ag — = a log —

VF

Ago

184

Aspectos básicos de la inmunidad

h es la distancia desde el borde del gel a la ban­ da de precipitación en un tiempo t; y y a son constantes y Ag y Ac las concentraciones ini­ ciales de antígeno y de anticuerpo. Agg y ACg son los correspondientes valores extrapolados para h — = O VT La fórmula 2 se aplica cuando el anticuerpo es constante y el antígeno variable, y la 3, en el caso contrario. Posteriormente, el mismo autor pudo com­ probar que hay una relación lineal entre K y lo­ garitmo de la concentración antigénica (log C) para valores bajos de ~

y entre

Solución de Ag en S.F.

Ag + agar ai 1%

r 0,5%

Solución de Ac en agar

Ac + agar ai 1%

Difusión simple

Difusión dobie

y el mis-

h mo logaritmo para valores altos de — . En conVF secuencia, para bajas concentraciones antigénih se aproxima a log C, mientras que a al­ VT tas concentraciones lo hace a — VT Han sido propuestos otros métodos de cuan­ tificación incluso el empleo de densitómetros especialmente diseñados, pero a pesar de ello actualmente sólo se utilizan como metodología cualitativa, ya que para la cuantificación de Ag y Ac existen otros métodos más eficientes. Difusión simple bidimensional En este caso, la reacción se efectúa colocan­ do en la parte inferior del tubo un volumen de agar al 1% fundido, mezclado con partes igua­ les del antisuero. Producida la gelificación, se agrega agar al 0,5% en solución salina, en un volumen igual a la mitad del anterior. Después de la solidificación se cubre todo con un volu­ men de agar al 1% fundido, mezclado con igual volumen de la solución antigénica. Antígenos y anticuerpos migrarán hacia la zona media y, cuando los que son equivalentes se encuentren, interaccionarán desencadenán­ dose la precipitación cuando las concentracio­ nes sean las óptimas. Si las cantidades de Ag y Ac añadidas son las que corresponden a la zona de equivalencia, la precipitación se producirá en la parte central de la zona de reacción y las bandas formadas serán nítidas y estables, en tanto que estarán desplazadas hacia los extre­ mos cuando estas condiciones no se cumplan, y en parte se redisolverán. Estando la difusión en relación directa con la concentración de la sus­ tancia que difunde, la banda de precipitación estará m ás próxim a a la zona del antígeno

Ag

Ag

Ac

Ac

Precipitación en exceso de Ac

Precipitación en zona de equivalencia

Ac

Precipitación en exceso de Ag

F ig. 9-8. A . Esquem atización de la inm unodifusión sim ­ ple y doble. B . Los tubos indican las características de la banda de precipitación en la inm unodifusión doble, la que es nítida y está ubicada en el centro cuando se form a en la zona de equivalencia, y d ifusa y desplazada cuando io h a­ ce en p resen cia d e exceso de an tígeno o an ticu erp o . La banda se desplaza hacia la zona del antígeno, y la red iso lu ­ ción del precipitado (zona difusa) se produce del lado don­ de está ubicad o el an ticu erp o cu ando h ay exceso d e él; ocurre lo contrario cuando el antígeno es el que se encuen­ tra en m ayor concentración.

cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrirá lo inverso en caso contrario. Éste es un buen método cualitativo que per­ mite demostrar varios sistemas reactivos simul­ táneos, cosa que no ocurre en la precipitación en medios líquidos (figs. 9-8 y 9-9). Pueden detectarse hasta 10 |J,g por mi de anticuerpo. Doble difusión bidimensional Un método interesante de doble difusión en placas fue descrito por Ouchterlony, que luego fue transformado en micrométodo al emplear portaobjetos cubiertos con agar al 1,5% en so­ lución salina como base de la reacción. Consis­ te en enfrentar en pequeñas perforaciones efec­ tuadas en el agar, y a distancias convenientes, las soluciones de antígeno y anticuerpo.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

185

F ig . 9 -9 . In m u n o d ifu sió n d o b le en exceso de antígeno (1), zona de equi-v alen cia (2) y ex c eso de an ticuerpo (3). L as ban d as de p re c ip ita c ió n de los tubos 4 y 5 corresponden a ia inte^ racció n de distintos sistem as a n tíg e­ no--anticuerpo.

Al difundir ambos y ponerse en contacto, producirán una banda de precipitación cuando estén en la relación óptima. Si la concentración de Ag y Ac colocados en los reservorios es la que corresponde a la zona de equivalencia, la banda de precipitación estará situada aproxima­ damente en la distancia media que separa esos reservorios. Cuando hay exceso de Ag o de Ac, la banda de precipitación formada estará próxi­ ma al reservorio del anticuerpo o del antígeno, respectivamente. Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antígenos y anticuerpos reaccionantes. Tra­ bajando con concentraciones óptimas de Ag y Ac, si la banda de precipitación formada es rec­ ta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy próximos. Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular de éste es superior al del an­ ticuerpo, siendo m enor en el caso en que la banda presente convexidad. Todo esto es una consecuencia de las leyes generales de la difusión, que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su concentración y en rela­ ción inversa con su peso molecular. Mediante esta metodología es posible identificar varios sistemas reaccionantes simultáneamente, pues cada uno de ellos dará una banda de precipita­ ción específica y, además, investigar reaccio­ nes cruzadas, pues en estos casos habrá fusión de bandas. Teniendo en cuenta ello se han idea­ do distintos modelos de matrices con las que pueden elaborarse diferentes esquemas reacti­ vos (fig. 9-10). Este método resulta muy interesante porque permite identificar las bandas de precipitación

m ediante el empleo simultáneo, en el mismo esquema de reacción, de antígenos y anticuer­ pos conocidos. O riginariam ente O uchterlony describió, de acuerdo con este hecho, tres tipos de reacciones y el esquema correspondiente a ellas puede verse en la figura 9-11. Fueron de­ nom inadas como reacciones de identidad, no identidad e identidad parcial. En el primer caso, los dos sistemas reactivos se funden en una única banda de precipitación. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada uno reacciona independien­ tem ente originando bandas de precipitación que se cruzan. Cuando uno de los antígenos analizados tiene algún com ponente capaz de dar una reacción cruzada con el anticuerpo ela­ borado por el otro (identidad parcial), las ban-

F ig . 9-10. D istin to s esquem as para inm unoprecipitación en p lacas de agar (técnica de O uchterlony).

186

Aspectos básicos de la Inmunidad F ig . 9-11. E squem as de rea c c iO '

das de precipitación de ambos sistemas se unen y funden parcialm ente en una banda, apare­ ciendo una prolongación o espolón en la co­ rrespondiente al antígeno que se empleó para la obtención del antisuero. Esto indica que en este antígeno hay componentes antigénicos no com­ partidos con el restante. Las reacciones descritas son las que respon­ den a los lincamientos generales de los esque­ mas expuestos y muy especialm ente cuando Ag y Ac están en relaciones óptimas. Variacio­ nes en sus concentraciones pueden influir en los resultados, hechos éstos que deben tenerse muy en cuenta para su interpretación correcta. La figura 9-12 muestra algunos de ellos. La difusión doble en placa es un excelente método cualitativo para el estudio de la homo-

10

A

íá

F ig . 9 -1 2 . In m u n o p re c ip ita c ió n en p la c a (m é to d o de O uchterlony). Pueden apreciarse sistem as sim ples y m últi­ ples, bandas de identidad, y de no identidad.

geneidad de antígenos y anticuerpos purifica­ dos. Resulta muy útil también para la búsqueda de impurezas, lo cual está limitado por la con­ centración en que ellas se encuentren presentes, ya que la precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. Para obviar este inconveniente, en la práctica se em ­ plean generalm ente altas concentraciones de Ag y Ac que, si bien no resultan útiles para el sistema principal, pues deja de estar en las con­ diciones óptimas, perm iten aumentar la con­ centración de la impureza y asegurar su preci­ pitación. Difusión simple en placa o difusión radial Es un método que resulta poco útil desde el punto de vista cualitativo, ya que la doble difu­ sión descrita por Ouchterlony provee mayor in­ formación. En líneas generales, consiste en la preparación de una placa con agar al 3% en so­ lución salina, al que previa fusión se le añade un volumen igual del suero inmune que contie­ ne los anticuerpos. Producida la soUdificación, se practican orificios en la placa y en cada uno de ellos se colocan los antígenos para analizar. Si los sistemas son equivalentes rodeará al ori­ ficio un círculo de precipitación, pero pueden aparecer varios si se encuentra presente más de un sistema reaccionante. Este método ha dado magníficos resultados para la cuantificación de antígenos; permite de­ tectar en mezclas cantidades mínimas, proble­ ma que no había sido resuelto hasta ese m o­ mento. Cuando un antígeno es colocado en el orificio circular practicado en la placa de agar adicionado de anticuerpo m onoespecífico di­ funde en form a radial y, de acuerdo con los principios básicos de la difusión, el diámetro del halo de precipitación está en relación direc­ ta con su concentración. Si esta operación se efectúa colocando en varios orificios de la pla­ ca cantidades variables conocidas del antígeno específico para el antisuero m ezclado con e! agar y se deja a tem peratura am biente hasta que el halo de precipitación no se modifique.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

187

F ig . 9 - 1 3 . C u rv a p a r a la cuantificación de antígenos por in m u n o d ifu sió n radial. El s is te m a u s a d o p a ra su elaboración ha sido seroal­ búm ina hiim ana-antiseroalbúm ina hum ana. P arte infe­ rior: fo to g ra fía de los d iá ­ m etros de los halos de p re­ cipitación.

Antígeno (mg/ml)

con los resultados obtenidos se puede confec­ cionar una curva relacionando la superficie de los círculos de precipitación o sus r^ con las co­ rrespondientes concentracio n es an tigénicas (fig. 9-13). Esta curva permite calcular la con­ centración de ese mismo antígeno en cualquier inuestra desconocida, ya que estableciendo cuál es el diám etro del halo de precipitación para un volumen añadido se puede determinar r^ y, con el auxilio de la curva de precipitación, establecer la concentración antigénica en él. Por simple cálculo podrá determinarse luego su concentración por ml. La confección de la cur­ va y la valoración del desconocido conviene h acerlas sim ultáneam en te con el o b jeto de igualar las condiciones de la reacción. La difusión radial se utiliza con muy buenos resultados en la valoración de proteínas que se encuentran presentes en mezclas complejas co­ mo lo son los componentes del suero humano. Es indispensable disponer para ello de antisue­ ros monoespecíficos destinados a los antígenos que se quieren valorar.

Reoforesis Es un método de inmunodifusión que se basa en los siguientes hechos: si en una p la c a de agarosa o agar purificado que contiene anti­ cuerpo en un orificio central y antígeno en los circundantes, o viceversa, se confecciona sobre el gel una canaleta periférica en la que se colo­ ca buffer y se perfora centralmente la tapa de la placa, como consecuencia de la evaporación a través de este orificio se originan corrientes del líquido que obligan al material contenido en los orificios periféricos a desplazarse hacia el cen­ tro, con lo que se logra una interacción antíge­ no-anticuerpo más efectiva y por lo tanto mejo­ res arcos de precipitación. La figura 9-14 es­ quematiza lo expuesto. Inmunoelectroforesis Grabar y Williams tuvieron la feliz id ea de concebir un método analítico de proteínas aJ que llamaron análisis inmunoelectroforético y

188

Aspectos básicos de la inmunidad Base

Tapa

conteniendo buffer F ig . 9-14. E squem a de re o fo re s is ,------- ^ indican el senti­ do de la corriente líquida originada por la evaporación a través del orificio central de la tapa.

que resulta de extraordinario valor para los exámenes inmunoserológicos e inm unoquími­ cos. Si se efectúa la separación electroforética de los constituyentes de una mezcla de antíge­ nos, en gel de agar como soporte, y aprove­ chando la técnica de Ouchterlony se hace di­ fundir lateralmente un inmunosuero específico para los constituyentes de la mezcla en estudio, en las zonas correspondientes a la interacción de cada antígeno con su anticuerpo aparecerá una banda de precipitación. Su ubicación de­ penderá de la movilidad electroforética y velo­ cidad de difusión del antígeno, lo que permite hacer las diferenciaciones (figs, 9-15 y 9-16). Algunos antígenos, incluso, pueden ser identi­ ficados mediante reacciones particulares sobre las bandas de precipitación, aprovechando la presencia en el antígeno de algún grupo reacti­ vo especial que pueda ser demostrado por una reacción química o enzimática. Para su puesta en marcha no son necesarios dispositivos complicados. Solamente hace falta una fuente de poder capaz de proveer el voltaje y miliamperaje indispensables, agar purificado, cubas de material plástico, soluciones regula­ doras, inmunosueros y algunos reactivos colo­ rantes. El agar que se utilizará debe ser de muy bue­ na calidad, libre de impurezas, ya que si éstas son de carácter antigénico pueden incidir en los resultados. El gel se prepara disolviendo el agar al 1,25% en el buffer adecuado; el más usado es el de veronal sódico de fuerza iónica 0,05, ajus­ tado a pH 8,4 con ácido clorhídrico IN. Las placas inicialm ente usadas por Grabar para las corridas elec tro fo réticas eran muy grandes, lo que significaba largos tiempos de corrida e inm unoprecipitación y consum o de apreciables cantidades de antisuero. Scheidegger propuso luego el empleo de portaobjetos

como placas de corrida y desarrolló un método llamado microinmunoelectroforesis, que es el que se emplea actualmente. En el comercio existen diferentes modelos de aparatos con sus correspondientes fuentes de poder, cubas y matrices para la confección de las placas, lo que facihta las tareas. Como el agar no es una sustancia absoluta­ mente neutra, un fenómeno secundario, la elec­ troendósm osis, acompaña a la eleetroforesis, que consiste en un movimiento de la totalidad del líquido que em bebe el gel en el sentido opuesto al de la corriente eléctrica. En efecto, los diferentes soportes (agar, agarosa, acetato de celulosa) cuando se impregnan en el buffer alcalino, dada su naturaleza, exhiben cargas ne­ gativas. Ello hace que el agua se cargue positi­ vamente dando una unión muy débil con aqué­ llos. Como los soportes no pueden m overse cuando se aplica la corriente eléctrica, las mo­ léculas de agua se disocian y se dirigen al polo negativo (cátodo). El efecto será más o menos intenso según la naturaleza del soporte; en el caso de los medios gelosados, el efecto es má­ ximo para el agar y mínimo para la agarosa. In­ fluyen tam bién en este fenóm eno el pH , la fuerza iónica y el potencial aplicado. Este mo­ vimiento es regular y no interfiere en los des­ plazam ientos por eleetroforesis. Si estas dos migraciones son iguales tendremos la im pre­ sión de que la sustancia no se ha movido; en cambio su movilidad será la del sentido de la corriente, aunque más reducida, si sus molécu­ las están fuertemente cargadas. Las moléculas poco cargadas son desplazadas por electroen­ dósmosis en sentido contrario al de su migra­ ción electroforética real. Las sustancias neutras sólo son movilizadas por la corriente endosmótica y ocuparán, después de la corrida electro­ forética, una posición que correspondería al punto cero de migración. Este hecho obliga a depositar la sustancia para analizar, si es desco­ nocida, en un reservorio confeccionado en el centro de la placa para evitar que algunos cons­ tituyentes se desplacen fuera de ella. Para sus­ tancias conocidas, la siembra podrá efectuarse en el punto más conveniente, de acuerdo con su comportamiento. Cuando se trabaja con el material indicado, una corriente de 6 volts/cm permite una buena separación en 75 minutos. La inmunoprecipita­ ción tiene lugar en las 24 horas siguientes. El examen de las bandas obtenidas puede hacerse directamente o por coloración con negro am i­ do, nigrosina, fucsina ácida, azocarmín u otro colorante, previa desecación del ge! de agar. Pueden emplearse otros soportes diferentes del agar, y merecen destacarse las tiras de ace­ tato de celulosa gelatinizado, por su gran poder de resolución (fig. 9-17).

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

A

189

B

A = esquema para inmunoelectroforesis con un antígeno (a) y dos inmunosueros (1 y 2) B = esquema para inmunoelectroforesis con dos antígenos (a y b) y un inmunosuero (1)

A = electroforesis en agar B = esquema de la inmunodifusión posterior a la electroforesis C = inmunoprecipitación

F ig . 9-15. Inm unoelectroforesis.

“Crossing-over” electroforesis o contrainmunoelectroforesis Durante la electroforesis en medios gelosados a pH 8, las gammaglobulinas y por lo tanto los anticuerpos, no obstante estar cargados ne­ gativamente, se desplazan hacia el cátodo co­ mo consecuencia del flujo endosmótico origi­ nado en el proceso. Otras proteínas antigénicas en esas condiciones migrarán en dirección anó-

dica. Haciendo un estudio de las distancias a las que pueden sembrarse los antígenos y los anticuerpos, puede lograrse que el desplaza­ miento sea convergente y, como consecuencia, que en la zona de interacción se produzca una banda de precipitación (fig. 9-18). Este método se desarrolla en corto tiempo, 20-30 minutos, y perm ite identificar antígenos y anticuerpos en m uestras de sueros desconocidos. H a tenido gran aplicación, especialmente en la investiga­

190

Aspectos básicos de la inmunidad

I^ig. 9-lí». Inm unoelectroforesis en agar de suero hum ano.

ción del agente causal de la hepatitis viral (an­ tígeno Au). Electroinmunodifusión o “rocket” electroforesis Es un método que sirve para cuantificar pro­ teínas. Cuando una partícula antigénica se des­ plaza bajo la acción de un campo eléctrico, en un medio soporte que contiene el correspon­ diente antisuero, durante la migración electro­ forética el antígeno y su correspondiente anti­ cuerpo van formando líneas de precipitación en el sentido de la corrida; el frente de ella experi­ menta sucesivas precipitaciones y redisolucio­ nes, y concluye en un pico delimitado por un precipitado estable formado cuando la concen­ tración del antígeno remanente es mínima. Es­ tos arcos de precipitación, dada su forma pun­ tiaguda (fig. 9-19), han sido denominados rockets y su altura depende de la concentración del antígeno en cuestión. Como soporte de co­ rrida puede usarse agarosa o acetato de celulo­ sa gelatinizado. El método, descrito por Laurell, tiene ciertas limitaciones. Proteínas antigénicas como las in­ m unoglobulinas no puede ser cu antificadas adecuadamente ya que por su movilidad elec­ troforética similar a los correspondientes anti-

Fig. 9 -Í8 . C ontrainm unoelectroforesis. Sistem a analizado alb ú m in a h u m an a (d erecha); a n tialb ú m in a h u m a n a (iz ­ quierda). Soporte: agar.

cuerpos, el efecto de electroforesis cruzada no se cumple en condiciones óptimas. Cuando se hacen estas determinaciones es ne­ cesario correr simultáneamente una muestra del mismo antígeno de concentración conocida, ya que la cuantificación se hará relacionando las al­ turas de los picos de precipitación obtenidos. Electroforesis cruzada Laurell describió una modificación de la in­ munoelectroforesis, que puede ser utilizada con fines cualitativos y cuantitativos. Resulta su-



B’ig. 9-17. Electroforesis (parte sup erior) e inm unoelectro­ foresis (parte in ferior) en acetato de celulosa de suero hu­ mano.

Fig. 9-19. “R ocket” electroforesis desarrollada en acetato de celulosa gelatinizado.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro mámente útil para estudios de proteínas séricas y puede desarrollarse sobre agarosa u otros ge­ les, incluso acetato de celulosa. Cuando se utiliza agarosa como soporte, so­ bre una placa de 1,5 mm de espesor preparada con ella y usando buffer de veronal pH 8,6, se hace una corrida electroforética de 3 horas, em­ pleando un potencial de 10 V/cm. Terminada ésta, se corta una tira longitudinal del gel de corrida y se deposita en otra placa, en la que a la agarosa se le ha añadido una dilución conve­ niente de antisuero que contiene anticuerpos para los antígenos en estudio. Haciendo girar la placa 90° sobre la cürección de la corrida ini­ cial, se le aplica un potencial similar al ante­ rior. El tiempo de corrida varía entre 30 y 90 minutos, de acuerdo con las proporciones rela­ tivas de antígeno y anticuerpo. En esta segunda corrida, los antígenos de la tira de agarosa así como los anticuerpos incorporados al gel migran según su movilidad electroforética. Para cada sistema antígeno-anticuerpo se forman zo­ nas de precipitación, las que m igran rápida­ mente influidas por el exceso de antígeno, y así se originan arcos de precipitación que se esta­ bilizan cuando este exceso no ocurre. Los arcos formados difieren de los logrados por inm u­ noelectroforesis clásica y los resultados obteni­ dos pueden ser utilizados con fines cualitativos y cuantitativos, ya que las áreas de precipita­ ción formadas pueden ser cuantificadas (fig. 920 ). La intensidad de las bandas de precipitación puede magnificarse si se recurre al siguiente ar­ tificio: después de la corrida en segunda dimen­ sión, la placa es lavada por 24 horas con buffer de fosfatos 0,01 M. Sobre la zona correspon­ diente a las bandas de precipitación se coloca un trozo de papel de filtro seco y se deja en contacto, a temperatura ambiente, por 2-3 ho­ ras. Su finalidad es la deshidratación parcial de la zona para que se forme una concavidad te­ nue, sobre Ja que se esparcirán 200 fxl de anti­ suero con especificidad para la especie animal de la que provienen las inmunoglobulinas espe­ cíficas usadas en la inmunoprecipitación inicial. Dejar 24 horas a temperatura ambiente y lavar. El método puede simplificarse. Una vez ter­ minada la corrida en la segunda dimensión y efectuado el lavado de las placas por 24 horas, éstas se cubren con papel de filtro impregnado en la dilución conveniente del inmunosuero es­ pecífico para las inmunoglobulinas, ya señala­ do. Después de 2-3 horas de contacto, a tempe­ ratura ambiente, se retira el papel de filtro y las placas se incuban a la misma temperatura, en cámara húmeda, por 24 horas. Lavar las placas convenientemente, finahzada la incubación. Si se desea, las bandas pueden ser coloreadas si­ guiendo para ello el método ya descrito.

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F ig . 9-20. Inm unoelectroforesis cruzada o bidim ensional. M edio de soporte: acetato de celulosa.

Cuando la técnica se desarrolla sobre acetato de celulosa, la prim era corrida electroforética se hace sobre un extremo de la p laca y la se­ gunda sobre la misma placa girada en ángulo de 90°, pero antes se ha recubierto el resto de su superficie con una dilución conveniente de antisuero. Radioinmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis puede ser desarro­ llada usando antígenos o haptenos marcados con radioisótopos, especialm ente [q que permite por autorradiografía visualizar una in­ teracción ligando-anticuerpo que por sus carac­ terísticas no puede ser detectada directamente. Es lo que ocurre con las uniones anticuerpohapteno, pequeñas cantidades de antisuero y li­ gando de gran tamaño o las originadas por anti­ cuerpos no precipitantes y sus correspondientes antígenos. Para la investigación de anticuerpos, el sue­ ro en ensayo es corrido en una p laca de gel co­ mo se hace norm alm ente. Cuando la separa­ ción de las proteínas se ha completado, en la canaleta longitudinal se coloca u n a mezcla de antígeno radiactivo y antisuero contra la frac­ ción globulínica del suero en ensayo. El antí­ geno se combina con el anticuerpo específico formando complejos, que luego son precipita­ dos por el suero antigammaglobulina. Después de lavar para eliminar las proteínas no precipi­ tadas, el preparado es secado y previa colora-

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Aspectos básicos de la inmunidad INMUNOFIJACIÓN Es una técnica que ha sido introducida con éxito para estudios diferenciales de proteínas hom ogéneas, en especial inm unoglobulinas monoclonales, tanto para la identificación de la clase de inmunoglobulina comprometida, como para establecer el tipo de cadena L. Consiste en efectuar varias corridas electro­ foréticas paralelas, usando acetato de celulosa como soporte, preferentemente no gelatinizado pues éste consume mayor cantidad de inmunosuero específico. Terminada la corrida, una de las tiras es coloreada con el objeto de ubicar la banda m onoclonal. Inm ediatam ente después, en esa zona, se cubre cada una de las corridas restantes con los diferentes sueros monoespecí­ ficos para determinar la clase de inmunoglobu­ lina y el tipo de cadena L. Se dejan actuar los inmunosueros durante 5-10 minutos, se lavan las tiras con solución salina para eliminar las proteínas que no han formado complejos AgAc insolubles, y se procede al teñido. La proteína monoclonal sólo se fijará al so­ porte de corrida cuando al interaccionar con los anticuerpos específicos forme complejos inso­ lubles. Conociendo la especificidad de los in­ munosueros puede establecerse la identidad de la proteína analizada. Este método resulta muy útil para identificar y establecer la movilidad electroforética de un antígeno presente en una mezcla compleja, en especial cuando se analizan productos de ex­ tracción de m em branas celulares. El método adquiere m ayor sensibilidad si se usan anti­ cuerpos marcados con átomos radiactivos, es­ pecialm ente '^’I, y la revelación se hace por métodos autorradiográficos. Actualmente otras variantes y nuevos méto­ dos se usan para la investigación de antígenos y anticuerpos por inmunoprecipitación (véanse caps. 35 y 42).

F ig . 9-21. Esquem atización de la radioinm unoelectroforesis. 1, electroforesis. 2, inm unodifusión con una m ezcla de hapteno (*) y anticuerpos antigam m aglobulina (o). 3, inm unoelectrof'oresis. 4, autorradiografía.

ción o sin ella las placas son puestas en con­ tacto con Una película sensible a los rayos X como la NS-54T de Kodak u otra similar. D es­ pués de una exposición conveniente la película es revelada. La coloración previa de las placas permite comparar los resultados obtenidos por inm unoelectroforesis y radioinmunoelectroforesis. La figura 9-21 esquematiza esta metodoloeía.

AGLUTINACIÓN Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico, si éste se encuentra al estado particulado (hematíes, bacterias, célu­ las), las partículas se agruman y aglutinan. Los principios que regulan esta reacción son los mismos que para la precipitación. La ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de si el antíge­ no es particulado (suspensión) o está en solu­ ción. En un comienzo se creyó que el hecho es­ taba regido por el anticuerpo al que se denomi­ naba aglutinina. Hoy sabemos que un mismo anticuerpo puede dar aglutinación con una sus­ pensión bacteriana y precipitación con un lisado obtenido a partir del mismo microorganismo.

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro La aglutinación se lleva a cabo en medio sa­ lino. La concentración óptima de electrólitos es 0,15 M. Concentraciones mayores pueden neu­ tralizar las cargas superficiales negativas que las bacterias y otros antígenos particulados po­ seen a pH neutro y provocar aglutinación es­ pontánea no específica. C oncentraciones de NaCl inferiores a 0,001 M son inefectivas. El mecanismo de la aglutinación ha sido ex­ plicado de diferentes maneras. Bordet y Eagle consideraron que inespecíficamente el electró­ lito era el responsable de la aglutinación, sobre la base del siguiente mecanism o: durante la reacción el antígeno se rodearía de una capa monomolecular de globulina anticuerpo; si en el medio no hay electrólitos, la ionización de la proteína sería suficiente como para mantener la dispersión, pero la presencia de electrólitos im­ pediría esa ionización, y al disminuir las cargas por debajo de ciertos límites se originaría el fe­ nómeno de aglutinación. Esta interpretación es criticable, ya que si dos antígenos particulados bien diferenciables a la observación e incapa­ ces de dar reacciones cruzadas, son puestos en contacto con una mezcla de sus respectivos an­ ticuerpos, en presencia de electrólito se produ­ ce la aglutinación y al microscopio se observan grumos originados por cada uno de los antíge­

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nos y no mezcla de ambos (fig. 9-22). Este he­ cho está en total acuerdo con la teoría del enre­ jado expuesta antes. Lo que probablemente de­ be ocurrir es que los iones opuestos del electró­ lito neutralizan en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas evitando el recha­ zo entre ellas y asegurando la aproximación in­ dispensable para que una molécula de anticuer­ po, al reaccionar con dos de ellas, pueda iniciar la form ación de los grum os que llev an a la aglutinación específica. Si la interpretación de Eagle fuera la correcta, los grumos microscópi­ cos de la experiencia anteriormente expuesta deberían ser mixtos. Reacciones de aglutinación M étodos cualitativos Son muy utilizados en serología diagnóstica con el objeto de identificar bacterias, en las de­ term inaciones de grupos sanguíneos, etc. En estos casos, es indispensable disponer de sue­ ros monoespecíficos obtenidos mediante adsor­ ciones cruzadas. Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando suspensiones de las bacterias o hematíes para identificar con anti­ sueros diferentes. La formación de grum os in­

Fig. 9-22. Izquierda: O bservación m icroscópica de la reacción de aglutinación efectuada m ezclando glóbulos rojos de carnero dinitrofenolados y Salm onella typhi, con suero de conejo antidinitrofenol y am i-Salnionella typhi. S e observan grum os de eritrocitos y grum os de bacterias aislados y no grum os m ixtos. D erecha: T estigo constituido por u na m ezcla de am bos antígenos en ausencia de anticuerpos. (V éanse explicaciones en el texto.)

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Aspectos básicos de la inmunidad

F ig. 9-23. A y B, aglutinación m acroscópica de una suspensión de Salm onella lyphi por diferentes diluciones de su anti­ suero específico. C, control negativo.

dicará la especificidad del sistema reaccionante (fig. 9-23). No obstante que las bacterias o célu­ las en el huésped (inyección, infección) se de­ gradan y originan anticuerpos contra los antíge­ nos superficiales y citoplasmáticos, en las reac­ ciones de aglutinación sólo interaccionan los primeros, dada la imposibilidad de penetración de los anticuerpos al interior de las células. Valoración de antisueros Los métodos son semicuantitativos y consis­ ten en determinar cuál es la máxima dilución del suero para analizar capaz de aglutinar al an­ tígeno específico. Las diluciones generalmente se hacen en razcin 2 y el título se expresa por la inversa de la máxima dilución aglutinante. Si la dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilu­ ción 1/2048, el título será 1024. Los valores obtenidos son groseros y pueden aproximarse efectuando diluciones intermedias. No obstante ello, es una metodología de singular importan­ cia diagnóstica, ya que, efectuada en forma se­ riada, la variación del título de anticuerpos puede ser muy útil para seguir la evolución de una infección bacteriana o de una isosensibilización por antígenos hemáticos. El dosaje de anticuerpos por aglutinación puede hacerse mediante reacciones de lectura lenta o rápida. En el prim er caso se emplean suspensiones diluidas de antígeno, que se mez­ clan con voMmenes iguales de las diferentes diluciones del suero para valorar, empleando como diluente cloruro de sodio 0,15 M. Los tu­ bos son incubados en baño de agua a 37°C du­ rante dos horas y dejados luego en la refrigera­ dora hasta el día siguiente para que la reacción se complete. El título se determina buscando cuál es el líltimo tubo de la serie que presenta aglutinación. La aglutinación rápida es muy usada en sero­ logía diagnóstica (reacción de Huddleson para brucelosis, reacción de Widal para las salmonelosis, etc.). En este caso, la reacción se efectúa

en placas, el antígeno que se emplea es veinte veces más concentrado que el usado en la aglu­ tinación lenta y la lectura de los resultados se hace a los 3-5 minutos. Los fundamentos del método y determinación del título son similares a los indicados anteriormente. Fenómeno de prozona. Cuando se valora un antisuero, la dism inución de los anticuerpos por dilución hace que decrezca la aglutinación hasta hacerse nula. No obstante ello, en algu­ nos sueros se observa un comportamiento par­ ticular, caracterizado por ausencia de aglutina­ ción en los primeros tubos de la serie, en los que la concentración de anticuerpos es m áxi­ ma, con aglutinación positiva a diluciones ma­ yores. A este fenómeno se lo llama prozona. Mediante el empleo de anticuerpos marcados y otras metodologías, se ha podido demostrar que en esos tubos, aun en ausencia de aglutinación, el anticuerpo está unido al antígeno. Existiendo un marcado exceso de anticuerpo con respecto a los determinantes antigénicos de la superficie celular, estadísticamente es muy poco probable que los dos sitios activos del anticuerpo puedan unirse a grupos receptivos específicos ubicados en células diferentes. Teniendo el anticuerpo suficiente flexibilidad, las moléculas pueden bloquear pares de determinantes de la misma célula, inhibiéndose de este modo la formación de grumos. No hay que olvidar tampoco que se han des­ crito anticuerpos “incompletos” o bloqueantes, similares a los anticuerpos coprecipitantes y no precipitantes (cap. 19), y que su presencia en el suero, sim ultáneam ente con los anticuerpos normales, puede incidir en ef fenómeno de pro­ zona. Valoración de anticuerpos “incompletos” o bloqueantes Estos anticuerpos, además de no aglutinar, al ser puestos en presencia de las correspondien­ tes partículas antigénicas las bloquean e impi­

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro den su aglutinación por el anticuerpo específi­ co bivalente. En un comienzo se supuso que eran univalentes pero algunas experiencias he­ chas con híbridos y estudios sobre equilibrio de diálisis, hacen que deban considerarse como bi­ valentes. Impedimentos estéricos o fenómenos de carga deben determinar el comportamiento particular de estos anticuerpos. Su investigación y valoración son muy co­ rrientes en clínica hematológica, en especial en isosensibilizaciones maternofetales por antíge­ nos del sistema Rh. Su presencia ha sido de­ mostrada también en algunas infecciones bac­ terianas, en especial brucelosis y salmonelosis. La valoración puede hacerse por bloqueo, c o n g lu tin a c ió n o m e d ia n te el m é to d o de Coombs o test de la antiglobulina. a) Bloqueo. Para ello, en una batería de tu­ bos se colocan volúmenes iguales de la suspen­ sión antigénica con especificidad para el anti­ cuerpo que se analiza. A todos los tubos se añade un volumen igual de cada una de las di­ luciones en razón 2 del suero a valorar. Se in­ cuban a 37°C durante una hora y luego se cen­ trifugan; se lava el sedimento tres veces con solución salina tam ponada. Se resuspende el antígeno en la misma solución hasta igualar el volumen original y luego se añade a todos los tubos, en un mismo volumen, anticuerpo biva­ lente específico en concentración suficiente co­ mo para aglutinar el antígeno presente. Se in­ cuba a 37°C durante una hora y se determina cuál es la dilución máxima del suero capaz de inhibir la aglutinación. La inversa de ella cons­ tituye el título del anticuerpo bloqueante en la muestra examinada. b) Método de Coombs o de la antiglobulina. Para esta determinación es necesario disponer de un antisuero específico contra la gamm aglobulina de la especie animal de la que pro­ vienen los anticuerpos que se han de investi­

Glóbulos rojos

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gar. Si los anticuerpos bloqueantes fuesen hu­ m a n o s , la a n tig a m m a g lo b u lin a (s u e ro de Coombs) será específica para la gammaglobu­ lina humana. El método consiste en m ezclar el antígeno con diluciones del suero que contiene los anticuerpos “incom pletos” e in cu b ar las mezclas a 37°C durante una hora. Si bien no hay aglutinación, hay fijación dei anticuerpo al antígeno, lo que significa que éste se cubre de moléculas de gammaglobulina. Si después de lavar tres veces con solución salina tamponada se añade a todos los tubos suero de Coombs, como éste es específico para los determinantes antigénieos de la gam m aglobulina, en todos aquellos tubos en que exista anticuerpo “in­ com pleto” fijado al antígeno habrá aglutina­ ción. El título corresponderá a la inversa de la máxim a dilución del suero en examen que dé aglutinación (fig. 9-24). c) Conglutinación. Si la suspensión antigéni­ ca se prepara en albúmina bovina al 20% y las diluciones del suero para valorar se hacen en el m ism o diluyente, los anticuerpos “incom ple­ tos” pueden aglutinar al antígeno después de una hora de incubación a 37°C correspondien­ do el título a la inversa de la máxima dilución aglutinante. Ello se debería a que, como conse­ cuencia de la interacción antígeno-anticuerpos “incompletos” , el complejo formado fija algu­ nos de los componentes del complemento, en especial C3. En la albúmina bovina existe una sustancia llamada conglutinina, capaz de fijarse a los hidratos de carbono presentes en las mo­ lécu las de dicha fracción, originando como consecuencia de ello la aglutinación. La neutralización de cargas por parte de la al­ búmina, lo que facilitaría la aproximación de las partículas y por consiguiente su aglutinación, es un mecanismo que no puede descartarse, así co­ mo posibles interacciones entre la albúm ina y el fragmento Fe de la inmunoglobulina.

Anticuerpos incompletos

Anticuerpos anti-gamma globulina (Suero de Coombs) Complejos Ag-Ac no aglutinables

Complejos Ag-Ac aglutinables

F ig. 9-24. E squem atización de la reacción de Coom bs para la identificación d e anticuerpos incom pletos.

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Aspectos básicos de la Inmunidad

Aglutinación cuantitativa Es un método que no se emplea rutinaria­ mente, no obstante lo cual puede servir para determinar los mg de anticuerpo específico pa­ ra un antígeno particulado existentes en un sue­ ro inmune. Para ello se determina por microKjeldahl el nitrógeno correspondiente a un vo­ lumen de antígeno puesto en contacto con el suero inmune y el de un volumen igual del an­ tígeno puesto en contacto con suero normal de la misma especie animal que contenían los an­ ticuerpos. Las determ inaciones de N deben hacerse previo lavado de los sedimentos con solución salina para eliminar toda proteína no fijada es­ pecíficam ente, y la reacción de aglutinación debe efectuarse en presencia de EDTA para in­ hibir la fijación del C. La cantidad de proteína anticuerpo se calcula multiplicando el N halla­ do por diferencia entre los dos ensayos, por el factor de conversión 6,25. Aglutinación pasiva Cantidades de anticuerpos contra un antíge­ no soluble no pueden detectarse por precipita­ ción si su concentración no excede los 20 )J,g • m i '. Teniendo en cuenta que la aglutinación es más sensible (cuadro 9-4), se ha procurado fijar antígenos solubles a partículas, de m odo de transform ar la precipitación en aglutinación. Ello se ha logrado, y con magníficos resulta­ dos, mediante su fijación a hematíes y partícu­ las inertes como el poliestireno, la bentonita y el colodión. A la reacción que resulta del em ­ pleo de glóbulos rojos como soporte se la llama hemoaglutinación pasiva, y simplemente aglu­ tinación pasiva cuando se utilizan otros. Gene­ ralmente las uniones de los antígenos a los so­ portes son no covalentes y la fijación se obtie­ ne por mezcla directa o previo acondiciona­ miento de la superficie de las partículas. En el caso de los hematíes, la fijación de hidratos de carbono no necesita intermediarios; en cambio para las proteínas es necesario el tañado previo o tratam iento con aldehidos simples como el fórmico, piriívico o glutárico. Mediante el em­ pleo de ciertos reactivos, tales como la bencidi­ na bis-diazotizada o el toluene-2-4-isocianato, con dos grupos funcionales por molécula, se consiguen uniones covalentes de proteínas a la superficie de los hematíes. Es posible también, teniendo en cuenta que en la membrana celular hay restos de lisina, fijar grupos DNP utilizan­ do como reactivo FDNB (fluordinitrobenceno) (fig. 9-25). Los hematíes frescos marcados se conservan poco tiempo, pero éste puede pro­ longarse mediante la formalización de los eri­ trocitos.

C u ad ro 9-4. Valores aproximados de la con­ centración mínima de anticuerpos detectables por los diferentes métodos inmuno serológic os M étodo Precipitación (m edio gelosado) Precipitación (m edio líquido) F ijación del com plem ento (100% de lisis) Fijación del com plem ento (50% de lisis) A glutinación H em aglutinación pasiva IFI E LISA R IA

Anticuerpo ng ■m f 20 10 5 0,2 0,4 0,15 0,05 0,01 0,001

Sensibilidad relativa 1 n 4 100 50 ' 133 400 2.000 20.000

P ara los cálculos d e sensibilidad re la tiv a se asig n ó el v a lo r 1 a la c o rresp o n d ien te a p re cip ita ció n en m ed io g eíosado.

La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que, al igual que la aglutinación, perm ite determ inar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima di­ lución aglutinante. Es cuatro veces más sensi­ ble que la aglutinación y mucho más aun que la precipitación. Ello es consecuencia del tamaño de las par­ tículas antigénicas que intervienen en la reac­ ción. En la precipitación, el antígeno es mole­ cular y se necesitan muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la aglutinación pasiva se lo ha transformado en una partícula de gran tamaño, capaz de dar aglutinados con pocas de ellas. El número de moléculas de anticuerpo que inter­ vienen en uno y otro caso difiere muchísimo, de ahí la distinta sensibilidad. La reacción se efectúa colocando en tubos 0,5 mi de las diluciones del suero para valorar y 0,05 mi del antígeno fijado al soporte, que se agitan para mezclar. Se dejan a temperatura am­ biente 18-24 horas y se observan los tubos sin centrifugar por la parte inferior, para determinar si ha habido aglutinación (fig. 9-26). Existen dispositivos que mediante el empleo de espejos e iluminación indirecta permiten ver reflejados sobre aquéllos los fondos de los tubos. Esta técnica es muy utilizada en serología diagnóstica, ya sea bajo la forma de aglutina­ ción pasiva directa o midiendo su inhibición. Esto sirve para investigar hormonas y antíge­ nos solubles diversos en sangre, orina y otros fluidos y especialm ente para el diagnóstico tem prano del embarazo, puesto que en estos casos hay marcado aumento de gonadotrofina urinaria: si se mezcla un antígeno constituido por partículas inertes a las que se les ha fijado la gonadotrofina y suero antigonadotrofina bi­ valente, habrá aglutinación. M ezclando dicho

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro suero con la orina a analizar, en caso de que és­ ta contenga gonadotrofina, el anticuerpo será neutralizado, y si luego se añade el antígeno fi­ jado al soporte inerte, no habrá aglutinación. Ello significa que el anticuerpo fue totalmente neutralizado en la primera etapa y que por lo tanto la concentración de gonadotrofina urina­ ria es alta, lo que perm ite hacer diagnóstico temprano de embarazo. La aglutinación hubie­ se hecho descartar esa posibilidad. Actualmen­ te la aglutinación pasiva en tubo ha sido susti­ tuida por la aglutinación en policubetas de poliestireno u otros tipos de plásticos. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO En el capítulo 22 se ha indicado la cinética de la inmunohemólisis por acción del comple­ mento (C) y el efecto que él ejerce sobre las m em branas si los antíg en o s son c elu lares. Cuando el sistema Ag-Ac sobre el que actúa son hem atíes-hem olisina, produce hem ólisis, originando citólisis o bacteriólisis cuando lo hace sobre sistemas en que los antígenos son células o bacterias. El C se inactiva tam bién con complejos originados por antígenos solu­ bles, pero aquí el fenómeno no es demostrable en forma directa o por microscopia como ocu­ rre en cambio en los casos anteriores. Teniendo en cuenta la hemólisis que produce cuando se fija a hematíes sensibilizados, en es­ pecial glóbulos rojos de carnero, se ha ideado una reacción serológica denominada/yacfów del complemento, la que mediante un sistema indi­ cador permite determinar la fijación de C a cual­ quier complejo Ag-Ac, esté el antígeno en solu­ ción o en suspensión. El reactivo indicador es el sistema hemolítico -hem atíes de carnero y he­ molisina-, el que añadido en segunda instancia al tubo que contiene la cupla que se analiza y C dará hemólisis o no según que exista C libre. De haber C libre, significa cjue no hay correlación entre el antígeno y anticuerpo analizado, en tan­ to que la ausencia estaría indicando que el C ha sido fijado por el primer sistema y que en este caso Ag y Ac se relacionan (fig. 9-27). Para que una reacción de fijación del com­ plemento funcione correctamente, es indispen­ sable que la cantidad de C añadida al primer sistema reactivo sea igual a la necesaria para producir el 100% o 50% de lisis del sistema he­ molítico, según se utihcen como punto final de la reacción lecturas del 100% o 50% de hemó­ lisis. De añadirse un exceso de C, la fijación de parte de él en la primera etapa de la reacción podría no ser detectada por los glóbulos rojos sensibilizados. Las reacciones de fijación del complemento pueden ser cualitativas o cuantitativas. En este

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último caso sólo se valoran cantidades relativas de anticuerpo, pues al igual que en la aglutina­ ción, el título del suero estará dado por la in­ versa de la m áxim a dilución que, puesta en contacto con el antígeno, tenga capacidad para fijar el complemento. Además, su em pleo está limitado por la calidad del anticuerpo, ya que, como se indicó en el capítulo 5, hay algunos que no fijan el C. Algunas muestras para analizar presentan la particularidad de fijar el complemento en au­ sencia de antígeno. Estos sueros se denominan anticomplementarios, y ello se debe a que con­ tienen gammaglobulina desnaturalizada y agre­ gada, que tiene capacidad fijadora del C (véase cap. 22). Para evitar estos inconvenientes es n ecesario que los sueros para an a liz a r sean frescos y mantenidos en refrigeradora por no más de 48 horas. En caso de que deban conser­ varse por más tiempo, para evitar los agregados de gammaglobulina por desnaturaUzación físi­ ca o contaminaciones, es conveniente añadirles 0,1% de cisteína o glicina y 0,01% de Merthio­ late. Estas sustancias, a las concentraciones in­ dicadas, no interfieren en la reacción. Para las reacciones de fijación del comple­ mento es necesario disponer de glóbulos rojos de carnero, hem olisina antiglóbulos rojos de carnero, complemento (suero fresco de cobayo) y soluciones salinas tamponadas. Todos estos reactivos deben estar estabihzados y valorados, ya que para cada sistem a hay una dosis óptima. Las reacciones cualitativas de fijación del complemento con lecturas del 100% de hemo­ lisis se efectúan colocando en pequeños tubos cantidades adecuadas de antígeno y suero para valorar y la dosis de C que es capaz de produ­ cir el 100% de lisis del sistem a hem olítico. Después de una hora de incubación a 37°C se agrega la cantidad correspondiente de glóbulos rojos sensibihzados y se vuelve a incubar por 30 minutos. La ausencia de hemólisis indicará especificidad entre el sistem a A g-A c que se analiza. Esta mism a reacción puede transfor­ marse en cuantitativa si se hace en varios tubos con distintas diluciones del suero para valorar. Teniendo en cuenta que la curva sigmoidal obtenida cuando se relaciona porcentaje de lisis con cantidades de complemento demuestra que la sensibilidad es m áxim a para lectu ras del 50% de hemólisis, actualmente las reacciones de fijación del complemento se hacen utilizan­ do la dosis de éste capaz de producir este efec­ to. En estos casos, como se trabaja entre límites muy estrechos, es indispensable determ inar, para las condiciones en que se realiza la prueba (fijaciones a 37°C o 4“C, tiempo de incuba­ ción), cuántas unidades de com plem ento se consum en inespecíficamente, de m odo que la

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Aspectos básicos de la inmunidad

F ig. 9-25. Representación esquem ática de la hem aglutinación pasiva. A, lo,s hem atíes son sensibilizados por tratam iento previo con solución de ácido tánico. B, la bencidina bis-diazotizada actúa com o ligante del antígeno al hem atíe. C, la fija­ ción de hapteno al hem atíe se consigue directam ente com o consecuencia de la reacción que se produce entre el FD N B y los restos de lisina de la m em brana de los eritrocitos.

cantidad para añadir en la reacción no sea insu­ ficiente. Los diferentes sistemas fijan inespecí­ ficam ente entre 2 y 4 unidades CRj,,; de ahí que las dosis que se han de emplear en las reac­ ciones varían entre 3 y 5 unidades. Para las reacciones cualitativas, las lecturas se hacen directamente o por simple compara­ ción con testigos correspondientes a diferentes grados de hemólisis del sistema hemolítico. En

F ig . 9-26. H em aglutinación pasiva. E! tubo de la izquier­ da corresponde a una reacción negativa; en los restantes tubos pueden observarse distintos grados de positividad.

las cuantitativas, la determinación de la dilu­ ción que da 50% de hemólisis y su inversa, se hace de manera similar a la indicada en valora­ ción de compilemento, ya sea graficando los re­ sultados obtenidos -dilución del suero versus

y 1 - y

, o mediante el empleo de tablas con-

feccionadas sobre la base de x =

y

que 1 - y. dependerán del valor de 1/n. Éste está influido por la concentración de hematíes del sistem a hem olítico y volumen de la reacción; de ahí que cuando se utilicen estas tablas deberán res­ petarse las condiciones de la reacción para la que fueron calculadas. Para establecer si un anticuerpo activa el .sis­ tema complemento por la vía alterna, se hace interaccionar el com plejo A g-Ac con suero fresco de cobayo (fuente de complemento de tí­ tulo conocido) en presencia de etilenglicol diam in o tetraacético (EGTA) 10 mM y Mg^+ 2 mM, estableciéndose después de 1 hora de in­ cubación a 37°C y previa recalcificación con Ca^+ hasta 4 mM, el título del complemento re­ sidual. Como el EGTA bloquea Ca^+ pero no

Reacción antígeno-anticuerpo in vitro

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A gl

KC1

+

1

NO LISIS

SH

Reacción Ag-Ac específica

Fig. 9-27. R epresentación esquem ática de una reacción de fijación del com plem ento. A g l y A g2 antígenos.- A c l , anti­ cuerpo. C , com plem ento, S H , sistem a hem olítico.

Mg^+, si hubo consumo de complemento signi­ fica que su activación tuvo lugar por la vía al­ terna, ya que el Ca^“' es indispensable para que la vía clásica fimcione. OTROS TIPOS DE REACCIONES USADAS Inmunoadherencia Hace algo más de medio siglo se describió la reacción de la trombocitobarina, que resultaba de la fijación de bacterias a plaquetas. Hoy co­ nocemos algo más sobre ese fenómeno, deno­ minado inmunoadherencia, que consiste en una aglutinación basada en la capacidad que tienen com plejos antígeno-anticuerpo-com plem ento de adherirse a la superficie de partículas no sensibilizadas, tales como glóbulos rojos, leu­ cocitos, plaquetas y gránulos de almidón. Este mecanismo fue utilizado para la investigación de anticuerpos específicos contra el Treponema pallidum. Ha sido observado in vivo y se lo relacionó con la fagocitosis. Se considera que microorga­

nismos sensibilizados por sus correspondientes anticuerpos pueden fijarse a hematíes en e! to­ rrente circulatorio y ser fagocitados m ás fácil­ mente. Hoy se sabe que en este proceso inter­ vienen receptores celulares para componentes del complemento, en especial para C3b. Opsonización Cuando un elemento particulado, ya sea una bacteria, hematíe, etc., penetra en un vertebra­ do adulto, es fagocitado por las células fagocí­ ticas. Las bacterias patógenas tienen en su su­ perficie estructuras que hacen que se vuelvan resistentes a dicha acción. Los neumococos pa­ tógenos como consecuencia de la cápsula de naturaleza poliosídica que los recubre, son difí­ cilmente fagocitados, a menos que previamente hayan estado en contacto con su anticuerpo es­ pecífico, Esta acción previa del anticuerpo se denomina opsonización, estando su acción fa­ cilitada por C3b, componente del complemento derivado de C3. Existen evidencias de que sueros de muchos anim ales presentan anticuerpos opsonizantes para numerosás bacterias. Probablemente ello

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Aspectos básicos de la inmunidad

se deba a contactos previos con esos agentes infectivos. La sugerencia de que una opsonina específica es indispensable para la fagocitosis de cualquier elemento particulado es objetable, ya que, si bien su presencia es comprensible en el caso de las bacterias, resulta difícil de expli­ car para partículas inertes. En los capítulos 3 y 5 se ha indicado la im portancia que los recep­ tores para Fe y C3b expresados en la membra­ na de los macrófagos, tienen en los m ecanis­ mos de opsonización. Se ha descrito la existencia de proteínas séri­ cas no específicas opsonizantes. Una de ellas, sensibilizante de bacterias, no es una gammaglobulina, no actúa a 0“C, no es dependien­ te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento y es inactivada por amoníaco o hidrazina. La cantidad de opsonina presente en un sue­ ro determ ina su capacidad opsónica o índice opsonocitofágico, que se establece estudiando comparativamente la fagocitosis inducida por dicho suero y uno normal. Los anticuerpos citofílicos, con capacidad para fijarse a receptores particulares de los ma­ crófagos, son opsonizantes. For este m ecanis­ mo logran que los antígenos retenidos a nivel de la membrana de estas células sean incorpo­ rados al citoplasma. NEUTRALIZACIÓN O INHIBICIÓN DE EFECTO Cuando un antígeno tiene una actívidad de fácil medición, puede ser identificado y cuantificado mediante su neutralización por el anti­ cuerpo específico. Las exotoxinas bacterianas de alto poder toxigénico en los animales receptivos no ejercen su efecto si previam ente han sido mezcladas con su correspondiente antisuero. Lo mismo ocurre con los antígenos virales, capaces de aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani­ males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos por el anticuerpo específico, lo que permite la identificación y cuantificación del número de partículas virales por unidad de volum en del material analizado. Uno de los métodos más sensibles para la detección de anticuerpos es el de la neutraliza­ ción de bacteriófagos por sus correspondientes anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti­ va, no form an placas de lisis cuando se los siembra en placas de agar juntam ente con la bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones

de antisuero puede establecerse cuál es la que produce una disminución del 50% de las placas de lisis. La inversa de esa dilución expresará el título de anticuerpos en el suero. Otro ejemplo de cuantificación de anticuer­ pos por este método es el dosaje de antiestrep­ tolisina O por la inhibición de la actívidad líti­ ca que la estreptolisina tiene sobre los glóbulos rojos de conejo. BIB L IO G R A FÍA 1. A xelsen, N. H. "H igh resolution electrophoresis and im m unofixation. Butterw orths. B oston, 1987. 2. B ennett, C W : C linical serology. C harles C Thom as Springfield, III, 1964. 3. Boguslasky, R. C., M azzio, E. T. and R. M. N akam ura (eds.). Clinical Im m unochem istry: principies o f m ethod and applications Little Brow n an d Co. Bo.ston, 1984. 4. Cam pbell, D H; G arvey, J S; C reiner, N E y Sussdorf, D H: M ethods in Im m unology. W A B enjam in Inc. N Y ork, 1963. 5. C row le, A J: Im m u n o d iffu ssio n . A cad em ic P ress. N Y ork, 1962. 6. Chase, M W , K uhns, W J (Ed): S pecificity o f serologi­ cal reactio n s: L a n d stein er C en ten ial. N Y A c a d Sci, 169:1-293, 1970. N York A cad Sci Publ. N Y ork. 7. Eisen, H N: Im m unology. H arper and Row . N Y ork, 1976. 8. G rabar, P y B urtin, P: A nalyse Im m uno-E lectrophorétique. M asson. París, 1960. 9. H eer, E E y M argni, R A: Electro e im m unoelectroforesis. G Fernández. Buenos A ires, 1971. 10. H udson, L y H ay, F C: Practical Im m unology. B lack­ w ell Sientific Publ, O xford, 1979. 11. Johnstone, A., Thorpe, R. “Im m unochem istry in Practic e ” B lackw ell Scientific Publicantios, 1987. 12. Kabat, E A y M ayer, M M: K abat an d M a y e r’s E xp e­ rim ental Im m unochem istry. Charles C Thom as S pring­ field, 111, 1962. 13. K abat, E A: S tructural Concepts in Im m unology and Im m unochem istry. H olt, R iiiehart y W inston. N York, 1976. 14. K eren, D. E. “H igh resolution electrophoresis a n d im ­ m unofixation". B utherw orths. B oston, 1987. 15. K w apinski, J B G: M ethodology o f Im m u n o ch em ica l and Serological Research. W iley, 1972. 16. Eeflcovitz, I y Pernis B (Eds): Im m unological M ethods, vol III. A cadem ic Press, 1985. 17. O uchterlony, O: D iffusion in gel m ethods for im m uno­ logical analysis. Prog Allergy, 5:1, 1958. 18. O udin, J: Specific precipitation in geis and its application to im m unochem ical analysis. En: M ethods in M e ­ dical Research. Vol 5, pág 335. Y ear B ook M ed Publ. C hicago, 1962. 19. Rose, N R y B igazzi, P E (Ed): M ethods in Im m unod ia g n o sis.'H 'ú ty , 1973. 20. R o se, N R , C o n w ay d e M a c a rio , E ,, F a h e y , J. L ., F riedm an, H .. Pen, G .M . "M anual o f clinical la b o ra ­ tory Im m u n o lo g y" 4 “ ed. Amer. Society for m icrobiol. W ashington DC, 1992. 21. W eir, D M (Ed): Hcmdbook o f Experim ental Im m unology. Vols I-II. B lackw ell Sci Publ. O xford. 1986. 22. W illiam s, C A y Chase, M W (Ed): M ethods in Im mun o lo g y a n d im m u n o c h e m is tr y . V o ls l - l l - l l l , IV , V. A cadem ic Press. N Y ork, 1967, 1968, 1970.

El complejo mayor de histocompatibilidad y su relación con la respuesta inmune

i n M. LEONARDO SATZ

CONCEPTOS GENERALES El complejo mayor de histocom patibilidad (CMH) es un locus genético muy polimórfico que codifica la expresión de una serie de gluco­ proteínas que presentan péptidos antigénicos para su reconocimiento por los linfocitos T. El CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el ratón, está presente en todos los vertebrados su­ periores estudiados hasta el presente. El CMH fue identificado originalmente por el papel que juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando se injertan tejidos de un individuo a otro de la misma especie, la presencia de alelos idénticos o distintos en los productos codificados por el CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy se sabe que las moléculas de histocompatíbilidad (MHC) presentes en la superficie celular participan directamente del reconocimiento de un Ag por parte de los linfocitos T colaborado­ res y citotóxicos. En este capítulo se describe la estructura y organización del sistema H-2 y los fenóm enos inm unológicos asociados con el CMH. En el capítulo 29 se describe el sistema HLA, su importancia en los trasplantes y las en­ fermedades asociadas con él. La historia del CMH com ienza en 1903, cuando Jensen logró propagar 19 veces un car­ cinoma murino en su laboratorio, pero fracasó cuando intentó trasplantar el mismo tum or a ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu­ so la existencia de genes dom inantes como responsables de la susceptibilidad al trasplante tumoral y que su rechazo era consecuencia de mecanismos activos de defensa del huésped. H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie­ ron que la inm unidad estaba dirigida contra aloantígenos presentes en los tejidos, similares

a los de grupos sanguíneos, más q u e contra Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en 1936 a investigar los Ags presentes en los eri­ trocitos de ratón. Mostró la presencia de cuatro grupos sanguíneos, uno de los cuales, el Ag 2, correlacionó su presencia en tumores con cier­ tas cepas de ratones que poseían el m ism o Ag 2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu­ mor tenían altos títulos de Acs hemaglutinantes contra el Ag 2. En la década del ’40, Medawar y col. demostraron las bases inmunológi­ cas del rechazo de trasplantes, comparando in­ jertos de piel entre animales alogeneieos. Un ratón de raza A rechaza un injerto de piel de raza B en aproximadamente 12 días. Si luego del rechazo se lo desafía nuevamente con piel B, se produce un rechazo acelerado (7 días). Esta memoria inmunológica es específica: un desafío con piel C se rechaza a los 12 días y además es sistémica: el injerto se rechaza ace­ leradam ente con independencia d el sitio de implante. M edawar demostró tam bién que se produce el rechazo acelerado si se inyecta pre­ viamente al animal con células de otros tejidos (por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison (1957) mostró que la respuesta inm une respon­ sable del rechazo acelerado puede ser transfe­ rida de ratones vírgenes de tratam iento me­ diante células linfoides de animales que pre­ viamente han rechazado un injerto. H oy se sa­ be que el rechazo se produce por una reacción inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y p o r linfocitos T citotóxicos CDS. P o r esos años, Snell propuso designar como genes y an­ tígenos de histocompatibilidad a los responsa­ bles del rechazo de tejidos y llamó H -2 al lo­ cus que codifica para el Ag 2. Emprendió, ade­ más, la tarea de generar cepas de ratones sin-

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Aspectos básicos de la inmunidad

se deba a contactos previos con esos agentes infectivos. La sugerencia de que una opsonina específica es indispensable para la fagocitosis de cualquier elemento particulado es objetable, ya que, si bien su presencia es comprensible en el caso de las bacterias, resulta difi'cil de expli­ car para partículas inertes. En los capítulos 3 y 5 se fia indicado la im portancia que los recep­ tores para Fe y C3b expresados en la membra­ na de los macrófagos, tienen en los m ecanis­ mos de opsonización. Se ha descrito la existencia de proteínas séri­ cas no específicas opsonizantes. Una de ellas, sensibilizante de bacterias, no es una gammaglobulina, no actúa a 0“C, no es dependien­ te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento y es inactivada por amoníaco o hidrazina. La cantidad de opsonina presente en un sue­ ro determ ina su capacidad opsónica o índice opsonocitofágico, que se establece estudiando comparativamente la fagocitosis inducida por dicho suero y uno normal. Los anticuerpos citofílicos, con capacidad para fijarse a receptores particulares de los ma­ crófagos, son opsonizantes. Por este m ecanis­ mo logran que los antígenos retenidos a nivel de la membrana de estas células sean incorpo­ rados al citoplasma. NEUTRALIZACIÓN O INHIBICIÓN DE EFECTO Cuando un antígeno tiene una actividad de fácil medición, puede ser identificado y cuanti­ ficado mediante su neutralización por el anti­ cuerpo específico. Las exotoxinas bacterianas de alto poder toxigénico en los animales receptivos no ejercen su efecto si previam ente han sido mezcladas con su correspondiente antisuero. I_^o mismo ocurre con los antígenos virales, capaces de aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani­ males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos por el anticuerpo específico, lo que permite la identificación y cuantificación del número de partículas virales por unidad de volum en del material analizado. Uno de los métodos más sensibles para la detección de anticuerpos es el de la neutraliza­ ción de bacteriófagos por sus correspondientes anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti­ va, no form an placas de lisis cuando se los siembra en placas de agar juntam ente con la bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones

de antisuero puede establecerse cuál es la que produce una disminución del 50% de las placas de lisis. La inversa de esa dilución expresará el título de anticuerpos en el suero. Otro ejemplo de cuantificación de anticuer­ pos por este método es el dosaje de antiestreptolisina O por la inhibición de la actividad líti­ ca que la estreptolisina tiene sobre los glóbulos rojos de conejo. BIB L IO G R A FÍA 1. A xelsen, N. H. “H igh resolution electrophoresis and im inunofixation. Butterw orths. B oston, 1987. 2. B ennett, C W : C linical serology. C harles C Thom as Springfield, 111, 1964. 3. Boguslaslcy, R. C., IVlazzio, E. T. and R. M. N akam ura (eds.). Clinical Itnmiinochern.i.Htry: principies o f tnethod and applications Little Brow n arui Co. Boston, 1984. 4. Cam pbell, D H; G arvey, J S; C rem er, N E y Stissdorf, D H: M ethods in Im m unology. W A B enjam ín Inc. N Y ork, 1963. 5. C row le, A J: h n m u n o d iffu ssio n . A cad em ic P ress. N Y ork, 1962. 6. Chase, M W , K uhns, W J (Ed): S pecificity o f serologi­ cal reactio n s: L a n d stein er C en ten ial. N Y A c a d Sci, 169:\~Z93, 1970. N York A cad Sci Publ. N Y ork. 7. Eisen, H N: Im m unology. H arper and Row . N Y ork, 1976. 8. G rabar, P y B urtin, P: Analy.s-e Im m uno-E leetrophorétique. M asson. París, 1960. 9. H eer, E E y M argni, R A: Electro e im m unoelectroforesis. G Fernández. Buenos A ires, 1971. 10. H udson, L y H ay, F C: Practical Im m unology. B lack­ w ell Sientific Publ, O xford, 1979. 11. lohnstone, A., Thorpe, R. “immunochemi.'itry in P ra c­ tic e ” B lackw ell .Scientific Publicaiztios, 1987. 12. Kabat, E A y M ayer, M M: K abat an d M a y e r’s E xp e­ rim ental Im m unochem istry. Charles C Thom as S pring­ field, III, 1962. 13. K abat, E A: S tructural Concepts in Im m unology and Immunochemi.'itry. H olt, R inehart y W inston. N York, 1976. 14. K eren, D. F. “H igh resolution electrophoresis a n d imm unofixation". B utherw orths. B oston, 1987. 15. K w apinski, J B G: M ethodology o f Im m u n o ch em ica l and Serological Research. W iley, 1972. 16. Leflcovitz, I y Pernis B (Eds): Im m unological M ethods, vol III. A cadem ic Press, 1985. 17. O uchterlony, O: D iffusion in gel m ethods for im m uno­ logical analysis. Prog Allergy, 5:1, 1958. 18. O udin, I: Specific precipitation in gels and its ap p lica­ tion to im m unochem ical analysis. En: M ethods in M e ­ dical Research. Vol 5, pág 335. Y ear B ook M ed Publ. C hicago, 1962. 19. Rose, N R y B igazzi, P E (Ed): M ethods in Im m unodiagn o sis.'H W ty, 1973. 20. R o se, N R , C o n w ay d e M a c a rio , E ,, F a h e y , I. L ., F riedm an, H .. Pen, G .M . “M anual o f cliitical la b o ra ­ tory Im m u n o lo g y" 4 “ ed. Amer. Society for m icrobiol. W ashington DC, 1992. 21. W eir, D M (Ed): Hcmdbook o f Experim ental Im m u n o ­ logy. Vols LII. B lackw ell Sci Publ. O xford. 1986. 22. W illiam s, C A y Chase, M W (Ed): M ethods in Im mun o lo g y a n d ¡m m u n o ch e m istry . V o ls l - l l - l l l , IV , V. A cadem ic Press. N Y ork, 1967, 1968, 1970.

El complejo mayor de histocompatibilidad y su relación con la respuesta inmune

i n M. LEONARDO SATZ

CONCEPTOS GENERALES El complejo mayor de histocom patibilidad (CMH) es un locus genético muy polimórfico que codifica la expresión de una serie de gluco­ proteínas que presentan péptidos antigénicos para su reconocimiento por los linfocitos T. El CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el ratón, está presente en todos los vertebrados su­ periores estudiados hasta el presente. El CMH fue identificado originalmente por el papel que juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando se injertan tejidos de un individuo a otro de la misma especie, la presencia de alelos idénticos o distintos en los productos codificados por el CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy se sabe que las moléculas de histocompatíbilidad (MHC) presentes en la superficie celular participan directamente del reconocimiento de un Ag por parte de los linfocitos T colaborado­ res y citotóxicos. En este capítulo se describe la estructura y organización del sistema H-2 y los fenóm enos inm unológicos asociados con el CMH. En el capítulo 29 se describe el sistema HLA, su importancia en los trasplantes y las en­ fermedades asociadas con él. La historia del CMH com ienza en 1903, cuando Jensen logró propagar 19 veces un car­ cinoma murino en su laboratorio, pero fracasó cuando intentó trasplantar el mismo tum or a ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu­ so la existencia de genes dom inantes como responsables de la susceptibilidad al trasplante tumoral y que su rechazo era consecuencia de mecanismos activos de defensa del huésped. H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie­ ron que la inm unidad estaba dirigida contra aloantígenos presentes en los tejidos, similares

a los de grupos sanguíneos, más q u e contra Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en 1936 a investigar los Ags presentes en los eri­ trocitos de ratón. Mostró la presencia de cuatro grupos sanguíneos, uno de los cuales, el Ag 2, correlacionó su presencia en tumores con cier­ tas cepas de ratones que poseían el m ism o Ag 2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu­ mor tenían altos títulos de Acs hemaglutinantes contra el Ag 2. En la década del ’40, Meda­ war y col. demostraron las bases inmunológi­ cas del rechazo de trasplantes, comparando in­ jertos de piel entre animales alogeneieos. Un ratón de raza A rechaza un injerto de piel de raza B en aproximadamente 12 días. Si luego del rechazo se lo desafía nuevamente con piel B, se produce un rechazo acelerado (7 días). Esta memoria inmunológica es específica: un desafío con piel C se rechaza a los 12 días y además es sistémica: el injerto se rechaza ace­ leradam ente con independencia d el sitio de implante. M edawar demostró tam bién que se produce el rechazo acelerado si se inyecta pre­ viamente al animal con células de otros tejidos (por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison (1957) mostró que la respuesta inm une respon­ sable del rechazo acelerado puede ser transfe­ rida de ratones vírgenes de tratam iento me­ diante células linfoides de animales que pre­ viamente han rechazado un injerto. H oy se sa­ be que el rechazo se produce por una reacción inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y p o r linfocitos T citotóxicos CDS. P o r esos años, Snell propuso designar como genes y an­ tígenos de histocompatibilidad a los responsa­ bles del rechazo de tejidos y llamó H -2 al lo­ cus que codifica para el Ag 2. Emprendió, ade­ más, la tarea de generar cepas de ratones sin-

202

Aspectos básicos de ia inmunidad

geneicos o consanguíneos, m ediante aparea­ mientos repetidos entre hermanos en genera­ ciones sucesivas. Utilizando este método de endocría por más de 20 generaciones, los anima­ les terminan siendo idénticos para todos sus cromosomas. También se produjeron cepas de ratones congénicos, es decir cepas que sólo di­ fieren en su H-2 y poseen idéntico el resto de su genoma. La disponibilidad de cepas congénicas y singeneicas permitió, en las décadas si­ guientes, mapear el sistema H-2, identificar sus genes, sus productos y sus funciones. Permitió tam bién describir la presencia de genes que mapean fuera del H-2, cuya disparidad también conduce al rechazo de injertos, aunque en ge­ neral el rechazo es más lento; se los denomina loci menores de histocompatibilidad. En la década del ’70 (más de 50 años luego de su descripción original como antígenos de trasplante) surgieron las prim eras evidencias experimentales que mostraron que los linfoci­ tos T requieren para su activación, del recono­ cimiento simultáneo del antígeno junto a MHC presente en la superficie de células presentado­ ras. Este fenómeno se denominó restricción en el reconocimiento T p o r el CMH. En la década del ’80 se demostró que, a diferencia de los Acs, el receptor T (véase cap. 7) interactúa con epitopes secuenciales del antígeno (péptidos cortos -d e 8 a 20 am inoácidos- generados por procesamiento intracelular) acarreados por las MHC. Existen dos tipos de MHC que cumplen esta función de presentación antigénica, llama­ das M HC de clase 1 y de clase II, que presentan péptidos antigénieos a los linfocitos T CD8 y a los T CD4, respectivamente.

O RG A N IZA C IÓ N G EN ÉTICA DEL SISTEMA H-2 El sistema H-2 está ubicado en el cromoso­ ma 17, a unos 15 centimorgans (cM) del centrómetro (fig. 10-1). Al principio se creyó que el H-2 codificaba para un solo producto. Los estudios posteriores mostraron la presencia de recombinaciones dentro del sistema H-2 y hoy se conocen varios productos y un gran número de genes presentes en él. Se divide en cuatro regiones, designadas con las letras mayúsculas K, 1, S y D. M ediante inmunizaciones aloge­ neicas, se obtuvieron Acs capaces de reconocer los productos codificados por las diferentes re­ giones del PL2 {aloanticuerpos). Estos Acs fueron utilizados para identificar la expresión de las MHC en la superficie celular por inm u­ nofluorescencia y citotoxicidad m ediada por complemento, y para su caracterización bioquí­ mica y funcional. Las regiones K y D codifican para MHC de clase I y las regiones LA e LE codifican para MHC de clase IL La región S codifica para algunos de los componentes del sistema complemento y aun cuando sus funcio­ nes inmunológicas no tienen nada que ver con la de las MHC, algunos autores las denominan moléculas de clase III. Los extremos del H-2, definidos por las regiones K y D, están separa­ dos por aproximadamente 0,5 cM, que corres­ ponderían a unas 1.500 kilobases (kb) de ADN. A causa del estrecho ligamiento que poseen en­ tre sí, los alelos presentes en cada locus se here­ dan en bloque durante la segregación de los cro­ mosomas homólogos. Es así como la descen­ dencia hereda lo que se denomina un haplotipo;

I Productos

K

A|3AaE[3

Ecx

C4 SIp

Qa^

TL Q a,

C. Bf Clase

II II II

Fig. 10-1. Productos de los genes de las regiones Q, T y M (véase inform ación en el texto).

Hmt

El complejo mayor de histocompatibilidad

203

C uadro 10-1. Designación de los productos de clase / y clase II en diversas cepas endocriadas de ratones Cepa Balb/c AKR BIO B 10.D 2 BIO .BR B IO .HTG B IO .AQ R

H aplotipo

K

H -2‘'

H -2‘‘

H -2K ‘¡ H-2K'-' H-2K'> H -2K"

B-2'‘

H-2K^

H~2*

H -2K “ H -2K “

H-2»

H-2y'

Regiones H -2 I

D

]-A‘' I-A" I-A^'

1-E"

I-A ‘' 1-A‘

I-&'

EE'-

H-2Dk

I-A^'

I-E"*

H -2 D '’ H -2 D ‘'

I-A “

1-Ek EE»

I-Ek

H -2 D ‘' EI-2D'' H -2D » H -2 D ‘'

En las ce p as re cornbinantes, la letra m inúscula que d e s ig n a el ale lo p re sen te en ca d a p ro d u c to es la co rresp o n d ien te de a c u erd o c o n su ori­ gen, au n q u e la d esig n ac ió n d el hap lo tip o hl-2 de d icha c e p a llev a una letra o d e n o m in ac ió n p ro p ia diferente.

0 sea, un conjunto de especificidades que se he­ redan juntas. Por otra parte, cabe destacar que la expresión de estos genes es codominante. El haplotipo H-2 de una cepa endocriada de ratones se designa con una letra minúscula superscripta al término H-2. Por ejemplo, las ce­ pas Balb/c y DBA/2 son H-2^ las cepas AKR y C3H son H-2'‘, la cepa BIO es H-2^ etc. Hay muchas cepas congénicas construidas sobre el “b a c k g ro u n d ” B IO . P or eje m p lo , la cep a B10.D2 es H -2^ la BIO.BR es H-2^ etc. Los alelos de los productos codificados por las dife­ rentes regiones del H-2 también se denominan con una letra m inúscula superscripta (véase cuadro lO-l). Existen cepas recombinan tes que poseen alelos de un aplotipo en algunos de sus productos y alelos de otro en los productos res­ tantes. Por ejemplo, la cepa BIO.HTG, congénica del BIO, posee alelos d en las regiones K, 1 y S y alelo b en la región D. Hay cepas que poseen más de un suceso de recom binación (véanse ejemplos en el cuadro 10-1). Existen en el cromosoma 17, en posición telomérica a la región D, otros loci que codifican para molé­ culas estructuralmente similares a las de clase I [en las regiones Q, T y M (véase fig. 10-1)]. A lgunos de los productos de estas regiones pueden presentar péptidos antigénicos (véase más adelante). ESTR U CTU RA Y EX PR ESIÓ N DE LAS M O L ÉC U LA S D E CLASE I Dentro del H-2, la región K codifica para la expresión de una molécula de clase 1 llamada H-2K. La región D también codifica para la ex­ presión de moléculas de clase I, aunque su nú­ mero varía de acuerdo con la cepa de ratón: to­ das poseen al m enos una p roteína llam ada H-2D, mientras que sólo algunas cepas expre­ san además proteínas llamadas H-2L. La distri­ bución de las MHC de clase I en el organismo es muy amplia y están presentes en práctica­ mente todos los tejidos incluidos los eritrocitos

y las plaquetas. La densidad de expresión no es homogénea: es más alta en células de tejidos linfoides y muy baja, por ejemplo, en el híga­ do. Están ausentes en los espermatozoides, en los primeros estadios embrionarios y en el tro­ foblasto, En el hombre no se expresan en los eritrocitos. Las MHC de clase I están constituidas por dos p o lip ép tid o s: una caden a p esad a a , de aproxim adam ente 340 aminoácidos d e longi­ tud, glucosilada, de alrededor de 44 kD de ta­ maño molecular, asociada no covalentemente a una cadena liviana llamada p2-microglobulina, no glucosilada, de aproxim adam ente 12 kD (fig. 10-2). La cadena a está codificada por ge­ nes dentro del CMH, mientras que el gen para la P2-microglobulina está ubicado en un cro­ m osoma distinto (2 en el ratón). La cadena pe­ sada posee tres dominios proteicos globulares, llamados a l , a 2 y a3, que se exponen en la su­ p erficie externa de la mem brana plasm ática (fig. 10-2). Cada dominio posee aproxim ada­ m ente 90 aminoácidos de longitud, siendo el dominio a l el que contiene el extremo aminoterminal y el dominio a3 el más cercano a la m em brana plasm ática. La molécula continúa con un segmento transmembránico hidrofóbico de alrededor de 30 a 40 aminoácidos de longi­ tud y finalmente termina en el interior de la cé­ lula eon un segmento hidrofílico de unos 20 a 30 aminoácidos, que contiene el carboxilo ter­ minal. Los dominios globulares a 2 y a 3 po­ seen su estructura estabilizada por la presencia de puentes disulfuro de cisteínas separadas en­ tre sí por aproxim adam ente 60 aminoácidos. Las moléculas de clase I murinas tienen dos re­ siduos de hidratos de carbono, uno en la aspa­ ragina de posición 86 (dominio a l ) y el otro en la asparagina de posición 176 (domino a2 ). Só­ lo el primero está presente en las moléculas hu­ manas. La [32-microglobulina es un polipéptido globular, estabilizado por puentes disulfuro in­ ternos, unido no covalentemente a! dominio a3 de la cadena pesada. No sólo es idéntica en to­ das las moléculas de clase I, sino que también

204

Aspectos básicos de ia inmunidad

C la s e I

\\

I

I

\\

L

//

Exterior M em brana p lasm ática

P éptido

F ig . 10-2. Estructura de las m oléculas de histocom patibilidad. A. Esquem a sim plificado de la organización de los dom i­ nios estructurales de las m oléculas de clase I y clase II. B. Sitio de presentación de péptidos en una M H C de clase I, según la interpretación de los estudios cristalográficos, tal coino sería visto por el receptor T. L a flecha indica el extrem o N -ter­ minal. L a porción a -h élice superior y las cuatro lám inas ^ plegadas de la izquierda provienen del dom inio a l ; las otras cuatro lám inas (3 y el a hélice inferior corresponden al dom inio a l . C. Interpretación artística de la m olécula de clase 1 en la superficie celular.

lo es en todos los individuos de una especie y es muy conservada entre varias especies. L os p ro d u cto s H -2K y H -2D p o seen un enorme polimorfismo poblacional: se conocen más de 50 alelos para cada uno de ellos en la naturaleza. Las especificidades antigénicas presentes en las MHC de clase I fueron originahnente carac­ terizadas por serología, es decir, m ediante aloantisueros y posteriorm ente mediante Acs monoclonales. Tanto los Acs policlonales co­

mo los monoclonales, se obtuvieron inm uni­ zando apropiadamente diversas cepas de rato­ nes con células linfoides o injertos de piel pro­ venientes de anim ales que difieren en uno o más loci del CMH. Los análisis serológicos de­ mostraron la presencia de determinantes anti­ génicos o epitopes comunes a varias moléculas de clase 1 distintas (ya sea derivadas de distin­ tos loci en un haplotipo dado o de un mismo locus en distintos haplotipos) a las que se llamó “especificidades públicas”. También se demos-

El complejo mayor de histocompatibilidad C u ad ro 10-2. Homología de la secuencia p ro ­ teica de diversos antígenos de clase I murinos (expresada como %) H -2D ‘' H-2D'' H-2D'’ H-2K'’ H-2K"

H-2L‘i

H -2D ‘’

H-2K'’

83 81

84

84 80 85

tro la presencia de epitopes tínicos o exclusivos de una molécula determinada, a los que se lla­ mó “especificidades priv ad as” . La inm ensa mayoría de los aloanticuerpos reconocen estas especificidades aloantigénicas en los dominios a l y a 2 de la cadena pesada. El análisis bio­ químico de la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas de clase I y el análisis de las secuencias de ADN de los genes de clase I, de­ mostraron la existencia de una homología glo­ bal entre los diversos productos, que oscila en­ tre el 75% y el 99% a nivel de las proteínas. Precisamente en los dominios a l y a 2 es don­ de aparece la mayor variabilidad entre los di­ versos productos, mientras que el dominio a3, que une la (32 micro-globulina, es el más con­ servado. En el cuadro 10-2 se comparan las se­ cuencias de aminoácidos de varios productos de clase I murinos. Como se ve claramente, no existe m ayor hom ología entre los productos alélicos de un mismo locus (H-2K'’ y H-2K‘*) que la homología existente entre los productos de distintos loci de un mismo haplotipo o dis­ tinto. Así, por ejem plo, H-2K'^ y H-2K'* son 84% homólogos mientras que H-2L^' y H-2D’* H -2K ‘’ H -2K ‘'* H -2L“ H-2K'' Q a-2“ H -2M 3

I/L L/M L 1/L/V

N F/Y

y P E

r H

L/I

péptidos N -form ilados

P ara los alelo s in dicados con {*), un 2 0 % d e los pép tid o s son 10-12 am in o ác id o s de longitud. E n esto s casos, se o b s e rv a el m ism o am i­ n o ác id o esp e cífico en la P 10-P 12, en lu g ar de P9- E n el re s to de las p o sicio n es (P4, P 7, etc.) hay cie rta flex ib ilid ad en cu a n to ai am i­ n o ác id o q u e p u e d e usarse, a u n q u e hay algunos estric ta m en te p ro h i­ b idos; su p re sen cia in h ib e to lah iren te su u n ió n a ia M H C .

determinante importante en la especificidad de la unión. Interactiia con el bolsillo F, cuyo resi­ duo 116 es extrem ad am en te p o lim ó rfico y afecta a la naturaleza de la unión. Los péptidos típicos de cada alelo de clase 1, también poseen un am inoácido conservado en la posición 2, que interactiia con el bolsillo B. Ocasionalmen­ te, algunos alelos exhiben sitios de anclaje complementarios en la posición 3 del péptido, mientras que en otros hay una fuerte selectivi­ dad en la posición 5; curiosamente en estos úl­ timos no hay restricción en la posición 2. El cuadro 10-3 muestra los motivos estructurales conservados de los péptidos específicos para diversas MHC clase I murinas. Considerando la flexibilidad que permiten ciertas posiciones de los péptidos, resulta claro que un alelo HLA dado tendrá la capacidad de unir miíltiples pép­ tidos (se refiere a uno por vez). La totalidad potencial de péptidos capaces de ser unidos por un alelo de clase I resultará de aplicar combina­ toria de los diversos aminoácidos que puedan ocupar posiciones flexibles. Se estima que un determinado alelo de clase I puede tener en la superficie celular, unos 1000 péptidos diferen­ tes, con cientos de copias de c/u. La superficie de una célula tendría unos 10.000 péptidos di­ ferentes (exhibidos por diversos alelos de clase I), de los que 2.000 serían las especies más abundantes. Las restricciones estructurales que poseen los péptidos en ciertos residuos para poder inte­ ractuar con un determinado alelo (así como la flexibilidad en los aminoácidos que pueden ex­ hibirse en las otras posiciones) fue confirmada en muchos casos, preparando péptidos sintéti­ cos, los que usaron en ensayos de “binding” a MHC de clase I purificadas. Todos estos traba­ jos permiten identificar y predecir epitopes inm unogénicos de antígenos m icrobianos, que

El complejo m ayor de histocompatibilidad

207

GENES DE CLASE I

pueden ser reconocidos por Hnfocitos T citotó­ xicos; son muy útiles por lo tanto, para el desa­ rrollo de vacunas. B iosíntesis. La biosíntesis y ensamblado de una MHC de clase I ocurre en el retículo endo­ plasmático. El correcto plegamiento de la mo­ lécula de clase I no .sólo requiere de la cadena liviana p2-microglobulina, sino de la unión de un péptido en su sitio de presentación. Ciertas células mutantes con defectos en la capacidad de generar o traslocar péptidos hacia el retícu­ lo endoplasmático (véase cap. 2), expresan ba­ jos niveles de MHC de clase I en la superficie; estas moléculas son inestables (corta vida me­ dia) y carecen de péptidos en su sitio de pre­ sentación. El origen de los péptidos que se incorporan durante el ensamblado de la molécula de clase I puede ser básicamente de tres tipos: (a) Deri­ vados de la degradación de proteínas endóge­ nas propias de las células; (b) en el caso de cé­ lulas infectadas con patógenos intracelulares, péptidos derivados de proteínas extrañas o aje­ nas a la célula. Así, por ejemplo, se ha eluido e identificado de células normales, péptidos co­ rrespondientes a proteínas celulares abundan­ tes, tales como histonas, proteínas ribosomales y de estrés térmico. A partir de células infecta­ das con determinados virus, se logró eluir y ca­ racterizar epitopes peptídicos virales. Los pép­ tidos descritos en (a) y (b) utilizan la llamada vía endógena de procesamiento y presentación antigénica (véase cap. 2). (c) En pequeña pro­ porción, los péptidos señal (leader peptide) ge­ nerados durante la traslocación de proteínas al retículo endoplásmico, también pueden unirse a las MHC de clase I.

Estructura Con el advenimiento de las técnicas de inge­ niería genética, a principios de la década de] ’80 se ai.slaron los primeros ADNc de molécu­ las de clase I murinas y humanas. Estos clones fueron utilizados inm ediatam ente p ara aislar los primeros clones genómicos de clase 1. La estructura y organización de estos g enes fue determinada al obtener su secuencia de nucleó­ tidos. Se han secuenciado varias decenas de ge­ nes de clase I y todos ellos poseen la organiza­ ción que se muestra en la fig. 10-4. Están cons­ tituidos por ocho exones separados entre sí por siete intrones. Los exones se corresponden con los dominios estructurales presentes en la mo­ lécula de clase I (fig. 10-4). El primer exón co­ difica para el péptido señal; los exones 2, 3 y 4 codifican los dominios externos a l , a 2 y a3 respectivamente; el exón 5 codifica para el seg­ m ento hidrofóbico transmembránico y los exo­ nes 6, 7 y 8 codifican el dominio intracitoplásmico. Organización genética Además de los genes que codifican para las clásicas m oléculas H-2K, D y L, el genoma m urino contiene unos 30-40 genes de clase I (fig. fO-5). La mayoría de ellos m apea en las regiones Q, T y M. La organización molecular de estos genes está bien estudiada en varias ce­ pas de ratones y muestra que el número de ge­ nes de clase I en las diversas regiones del H-2, varía en las mismas (véase más adelante). La

4kb

E4 GEN

u3

Cadena pesadal de clase I Aminoácidos

E5

E6

E7 E8

3 ’UT

13

^

/TM ■r"

183

275 / \ 348 315 326 339 CIT

F ig. 10-4. E structura de un gen de histocom patibilidad dé clase I. L os exones (E) se indican con rectángulos verdes y los intrones (I) con rectángulos blancos. En la proteína se indican los tres dom inios externos a l , a 2 y a 3 , el transm em bránico (TM ) y el citoplasm ático (CIT). El exón 1 codifica para el péptido señal (L). El segm ento 3 ’U T (rectángulo azu l) contiene secuencias presentes en el A R N m pero ausentes en la proteína.

208

Aspectos básicos de la inm unidad

caracterización de cada uno de estos genes se realizó mediante diferentes tipos de estudios. En primer lugar, el ADN de los clones genómi­ cos fue introducido en fibroblastos de ratón y su eventual expresión se evaluó mediante reac­ ciones serológicas con Acs de la especificidad apropiada. En segundo lugar, y como se men­ cionó antes, se determinó la secuencia nucleotí­ dica de muchos de ellos, la que pudo ser com­ parada con datos parciales de secuencias aminoacídicas. Finalmente, la posición relativa de estos genes en el genoma se determinó compa­ rando los polimorfismos presentes en cepas de ratones congénicas recombinantes para las dis­ tintas regiones. La figura 10-5 muestra un esquema de la or­ ganización de los genes de clase I identificados en los ratones Balb/c (H-2d). En la región K se han identificado dos genes de clase 1, separa­ dos unas 15 kb entre sí. Uno de ellos corres­ ponde al gen que codifica para la molécula H2K. El gen vecino no parece ser funcional. A unas 75 kb del gen H-2K se halla un gen de clase II denominado A(33. Este gen fue mapeado en la región I del H-2 por lo que el gen H-2K fue orientado hacia la región 1 y su veci­ no hacia el centrómero (fig. 10-5). La presencia de estos dos genes de clase l en la región K fue verificada en varias cepas de ratones. La región D del sistema H-2 posee un ntimero variable de genes de clase I. Por ejemplo, las cepas H-2*’ y H-2'‘ poseen sólo el gen que codi­ fica para H-2D, mientras que la cepa H-2'“ po­ see en dicha reg ió n cin co genes; uno para H-2L, otro para H-2D, y otros tres genes no funcionales (fig. 10-5). Por su posición homó­ loga en el genoma (vecino a la región Q), H-2L se corresponde con el gen llamado H-2D en las cepas que sólo poseen un sólo gen en esta re­ gión. La región H-2Q A menos de 100 kb comienzan los genes de la región Q, cuyo número oscila entre 5 y 10 según las cepas de ratones. Se numeran conse­ cutivamente y se designa en superscripto la ce­ pa correspondiente; por ejemplo, Q P , Q2*’, etc. El haplotipo H-2*’ posee diez miembros, el H-2‘^ tiene nueve (carece del Q3) y los ratones H-2*‘ poseen cinco. Todos ellos están orientados en el mismo sentido de transcripción. Para investi­ gar la naturaleza de los productos codificados por estos genes, éstos fueron introducidos en células L de ratón y su expresión se evaluó m e­ diante antisuerós anti Q a2,3. Sólo los genes Q6, Q7, Q8 y Q9 inducen la síntesis de proteí­ nas reconocidas por dichos sueros en estos fi­ broblastos. Algunos de los genes de la región Q se presentan de a pares de genes cercanos y ho­

mólogos entre sí. Por ejemplo, el par Q6-Q7 es muy similar al par Q8-Q9, no sólo en los genes sino en las regiones que los flanquean. Por ejemplo, la secuencia nucleotídica de Q7 y Q9 muestra que son 99% homólogos. Se postula que esta región ha evolucionado duplicando pares de genes de clase 1. Por otra parte, las se­ cuencias que flanquean a los genes K2-H-2K en la región K, son similares a los pares Q6-Q7 y Q8-Q9; esto sugiere que los genes de la re­ gión K se generaron por la translocación de un par de genes de la región Q. Cabe recordar que el ratón es la única especie de todas las estudia­ das que posee genes de clase I a ambos flancos de los genes de clase II, y que en todas las otras, los genes de clase II están en orientación centromérica, los de clase I en posición telomérica y los de clase III entre ambos. Por otra par­ te, los alelos de un gen en varias cepas (por ej., Q7 en H-2'’ y H-2‘') muestran un 99% de homo­ logía, consistente con la noción de escaso poli­ morfismo en los productos de esta región. Los genes Q5^ Q6^ Q6'‘, Q 7^ Q 7‘' y 0 9 ^ codifican para una molécula de clase I denomi­ nada Qa-2, extremadam ente conservada, que puede ser reconocida por aloantisueros y por linfocitos T citotóxicos (CTL). Se expresan en una variada gama de linfocitos y precursores hematopoyéticos. Los genes pueden producir por “splicíng ” o empalme alternativo, dos for­ mas; una de ellas se secreta y la otra se expresa en superficie anclada por enlaces glicofosfatidil-inositol (GPI). El papel biológico de Qa-2 se desconoce, aunque la molécula posee un si­ tio de presentación de péptidos de naturaleza sim ilar al de las MHC de clase I “clásicas” ; además, de ella se han eluido y caracterizado péptidos endógenos, perm itiéndose definir el patrón estructural de los mismos (cuadro 10-3). Q4 codifica para una m olécula denom inada Qb-1, que también es secretada, o expresada en supert'icie mediante enlaces GPI. QIO codifica para una proteína soluble, sintetizada funda­ mentalmente por el hígado. La función de estas moléculas se desconoce. La región H-2T Posee entre 15 y 20 genes, según el haploti­ po H-2. Se los designa en forma similar a los de la región Q: TL', T2‘*, etc. Los antígenos TL, descritos originalmente en timocitos de algunas cepas y en leucemias tímicas, son producto de los genes T3'’ y TI 8'*. Asimismo, el antígeno Qa-1 es producto del gen T23'’. Ambos se de­ tectan mediante aloantisueros; Qa-1 también puede ser identificado por CTL. Todas las ce­ pas de ratones expresan TL en epitelio intesti­ nal, donde pueden presentar péptidos antigénicos a linfocitos T gama/delta y activar su cito-

El complejo m ayor de histocompatibilidad

D

O

D2

D3

D4

L

Q1

Q2

Q4

Q5

Q6

Q7

0 8 /9

Q10

...

■VA -

209

' 1500

R e g ió n I

T3 T4

T20 T21 T I6T17T 18T 19

T22T23

T24

TI

T6 T6

j / T7 T8 T9

M5 M4 M6

r

o

i

10

20

i

60

8ii J i

60

70

F ig. 10-5. Esquem a de la organización de los genes de clase I m urinos (véase texto).

toxicidad. Los productos de otros genes T tam­ bién pueden ser reconocidos por linfocitos T gama/delta. ÍM región H-2M Posee ocho genes, designados en form a si­ milar a los de las regiones Q y T. C uatro de ellos son funcionales. H -2M 3“ codifica para una molécula que presenta un péptido del ex­ tremo N-terminal de una NADH deshidrogena­ sa mitocondrial; esta enzim a tiene cuatro v a­ riantes alélicas y sus expresión sigue la heren­ c i a materna. Se demostró luego que M3 puede unir y presentar eficientemente una variada gaiT ia de péptidos con formil-metionina en su ex­ tremo N-terminal, típicos de procariontes. Al­ gunos de estos péptidos pueden ser inmunodo­ minantes en la respuesta inmune murina de lin­ focitos T CD8 alfa/beta frente a Listeria m o­ nocytogenes. La expresión superficial de H-2M es norm al­ mente muy baja y parece deberse a la poca dis­ ponibilidad de péptidos endógenos con formilmetionina. La infección por bacterias intracelu­ lares incrementaría la oferta de estos lo que fa­ cilitaría la expresión superficial de H-2M. EV O L U C IÓ N D E LOS GENES DE CLA SE I Como se mencionó antes, los productos de clase I H-2K y H-2D poseen un enorme pohmorfismo poblacional. En las variantes aléli­ cas, los cambios se concentran en los dominios a l y a 2 de la proteína. Asimismo, los epitopes reconocidos por los Acs fueron identificados analizando su reactividad sobre productos codi­ ficados por genes de clase 1 “quiméricos” ; me­ diante técnicas de ingeniería genética se reem­

plazó el segundo o tercer exón de un gen dado (p. ej, L‘‘) por el exón correspondiente de otro gen de clase 1. Estos genes quiméricos se pue­ den expresar en el sistema de las células L de ratón, sobre las cuales se estudió la unión de los Acs. La inm ensa mayoría de estos mapea epitopes en el prim ero o segundo dom inio y una minoría en el tercer dominio. Los alelos difieren entre sí en varios residuos consecutivos o cercanos y por eso se los desig­ na alelos o alotipos complejos, a diferencia de los alotipos simples presentes en los genes de globina o citocromo c, que, en general, difieren en sustituciones puntuales de aminoácidos. A pesar de estas sustituciones múltiples, todas las moléculas conservan un 80-90% de homología entre sí y no existen secuencias “típicas” de lo­ cus H-2K o de H-2D. Sobre la base de estas observaciones, varios investigadores han suge­ rid o la existencia de mecanism os especiales que aseguran un rápido intercambio de la infor­ mación entre los genes de clase I de form a tal de “mezclar” las secuencias entre sí y evitar así que los genes H-2K y H-2D evolucionen con características propias en forma independiente. Un mecanismo del tipo de la conversión génica perm itiría la copia de secuencias de un gen a otro dentro de la familia multigenética y man­ tener así la homogeneidad global de las secuen­ cias. En la conversión génica (un mecanismo sólo demostrado hasta el presente en eucariotes inferiores), un gen A interactúa con un gen B en forma tal que una parte (o toda) de la se­ cuencia del gen A se hace idéntica a la secuen­ cia del gen B (fig. 10-6). En esta interacción, los genes A y B conservan su tamaiio e integri­ dad y sus localizaciones originales; sólo ocurre una alteración no recíproca en la estructura de uno de ellos. Los genes A y B pueden ser genes alelos en crom osom as hom ólogos, genes no alélicos en un m ism o crom osom a, genes no

210

Aspectos básicos de la inmunidad A

B

C c Segregación

EIZZMD

Apareamiento

rzE A

B

Segregación

A/B

A A/B

B/A

B

A/B

B

A

/VB

HUZM D

__ D I ^

Segregación.

B

3zznnzaD ~a¡— r

MD

A

A/B

B

A/B

Segregación

c = r:-A c iiz z iz z m A

A/B

8

A

A/B

B

F ig. 10-6, Ejem plo hipotético de la interacción de dos genes no alélicos relacionados, por conversión génica o Crossing over desigual.

alélicos en crom átides herm anas o un par de genes relacionados ubicados en distintos cro­ mosomas; la interacción podría ocurrir durante la meiosis o mitosis. En la figura 10-6 se mues­ tra un ejemplo hipotético de la interacción de dos genes de una misma familia ubicados en el brazo largo de un cromosoma. La interacción mostrada es la que ocurriría entre cromátides hermanas. Hay diversos modelos moleculares para explicar estos mecanismos de copia. El otro mecanismo posible para mantener la hom ogeneidad de secuencias en una fam ilia multigenética es el llamado Crossing over des­ igual (fig. 10-6). Aquí, los sucesos involucran un Crossing over entre dos genes no alélicos de una fam ilia durante la meiosis o mitosis; los genes que interactúan pueden estar en dos cro­ mátides hermanas (como en la fig. 10-6) o en cromosomas homólogos. Como resultado de un Crossing over desigual, además de la modifica­ ción de secuencias, hay un aumento o una dis­ minución en el número de genes de la familia. La existencia en el sistema H-2 de números va­ riables de genes de clase I en las distintas cepas de ratones constituye una evidencia en favor de la existencia de mecanismos del tipo de Cross­ ing over desigual que permitirían la expansión y la contracción de la familia. Un sisteiTta que ha permitido evaluar el papel de la conversión génica en la generación de po­ limorfismo en las moléculas de clase 1 es aquel de los ratones portadores de mutantes de la mo­ lécula H-2K'’. Estos mutantes fueron identifica­ dos cuando, en una cepa endocriada, ocasional­ mente un ratón rechaza un injerto de piel de un hermano. La caracterización de estos animales

mostró que con frecuencia hay catnbios en la secuencia de aminoácidos de las MHC de clase 1 o clase IL Los mutantes de H-2K'’, denomina­ dos Kb™, poseen varias características destacables: a) ocurren con una frecuencia relativa­ mente alta; b) por lo general involucran a dos o más aminoácidos vecinos o cercanos entre sí, siendo improbable que dos o más sucesos de mutación puntual ocurran en forma indepen­ diente en posiciones tan cercanas; c) a menudo se observan mutantes idénticos que surgen in­ dependientem ente; d) por últim o y quizá lo más importante, casi todos los mutantes poseen en las posiciones alteradas, residuos presentes en otras moléculas de clase 1. Por ejemplo, en las posiciones 23 y 24 (dominio a l ) la molécu­ la K’’ posee los aminoácidos Met-Glu, mientras que los mutantes K*”" poseen lle-Ser en su lu­ gar; precisam ente, lle-Ser están presentes en esas posiciones en los genes Q7*^, L'*, y D'’. En posición 89, la molécula Kb posee una Lys y la mulante K'”"’ tiene Ala en su lugar, al igual que L‘*, D'" y D'*. Cabe destacar que el codón para Lys difiere en por lo menos dos nucleótidos del codón para Ala, por lo que es improbable que los cam bios hayan ocurrido por m utaciones puntuales. Estos y otros ejemplos sugirieron que en el genoma de la cepa H-2'’ podrían existir otros genes de clase I que poseen estas secuencias comunes a otras moléculas de clase I y que ser­ virían de donantes de ellas para “corregir” o cambiar la secuencia del gen H-2K*’. Para in­ vestigar esta posibilidad, Flavell y col. estudia­ ron en detalle la secuencia del gen K’”"' y en­ contraron que difiere de K'’ en siete nucleóti-

El complejo mayor de histocompatibilidad C u a d ro 10-4. Comparación de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de varios genes de clase /. Los guiones representan identidad de la secuencia en esa posición Secuencia

Gen H-2K'>

150 157 GCT GGT CAA GCA GAG AGA CTC AGG Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg ................... -CT .................... TAT TA-

y Q lO '’ 1-1^2 L'

................... Ala ................... -CT ................... Ala

................ ....Tyr Tyr .................... TAT TA................ ....Tyr Tyr

dos, que causan el cambio de tres aminoácidos. Luego observaron que uno de los 26 genes de clase I presentes en el genoma H-2*’, el QIO'", posee exactamente esta secuencia y podría ser el generador de este cambio, por un mecanismo del tipo de conversión génica (cuadro 10-4). Estos 7 nucleótidos sustituidos (que son idénti­ cos a los presentes en el gen L'*) están ubicados en un tramo de, como máximo, 57 nucleótidos, ya que las secuencias de QIO'’ y K"®difieren por fuera de este tramo. El gen QIO está ubicado a una distancia considerable del gen H-2K; por lo tanto, estos sucesos podrían involucrar seg­ mentos pequeños de ADN y ocurrir a través de grandes distancias en el genoma. Una observa­ ción similar se hizo en el caso de la mutante que posee Phe y Arg en lugar de Tyr y Cys en las posiciones 116 y 121 respectiva­ mente. La secuencia del ADN mostró cambios de un nucleótido en cada codón, separados en­ tre sí por 15 nucleótidos. Se encontró que el gen Q4’’ posee exactamente esa secuencia en esas posiciones y por lo tanto constituye el do­ nante potencial para la generación del mutante J^bmó Los genes de histocompatibilidad de clase I (así como también los de clase 11) pudieron ha­ ber surgido de un ancestro común a los genes de inmunoglobulinas, B2-microglobulina y los antígenos de diferenciación ThyL CD8 (Lyt2) y otras moléculas pertenecientes a la superfa­ milia de las Igs. Las evidencias son las siguien­ tes: el tamaño de los dominios externos y la presencia de un puente disulfuro de igual longi­ tud es común a todos estos genes. Las reglas que gobiernan el splicing o empalme de exones durante la maduración del ARNm es la misma en los genes de Igs y de histocompatibilidad. Finalmente, las secuencias de ADN del exón 4 (dominio a3 ) de las moléculas de clase 1, los dominios a2 y ¡32 de las moléculas de clase IJ, la p2-microglolDulina y los exones constantes de las inm unoglobulinas poseen algunos tra­ mos de homología ancestral.

211

MOLÉCULAS DE CLASE II La región I del sistema H-2 (denominada así por la presencia de genes de respuesta /nmune y no de clase 1) está ubicada entre las regiones K y S y codifica para la expresión de las molé­ culas de clase II, I-A e I-E (fig. 10-1). Las mo­ léculas de clase II murinas se denominan tam­ bién la (asociadas con la región I). Am bas mo­ léculas están constituidas por heterodímeros, con una cadena a y una cadena (3 unidas entre sí p o r unio n es no co v ale n tes (fig s. 10-2 y 10-7). Las cadenas que las componen y sus ge­ nes respectivos, se ilustran en la figura 10-7 e incluyen; se designan A a, A(3, E a y E¡5, y el alelo de origen se designa con una letra minús­ cula superscripta (ej. Aa^*). Las cadenas A a y E a poseen un tam año mo­ lecular de aproximadamente 31-33 kD a. Están constituidas por 230 aminoácidos, distribuidos de la siguiente forma; dos dominios globulares extracelulares de 84 y 94 aminoácidos, un pe­ queño tramo hidrofílieo de 10 aminoácidos que lleva al segmento transmem bránico (30 ami­ noácidos) y el segmento intracitoplásmico (carboxiterminal) de aproximadamente 12 aminoá­ cidos. El segundo dominio posee su estructura estabilizada por un puente disulfuro de cisteí­ nas separadas entre sí por 56 residuos. Existen dos sitios de glucosilación unidos a asparaginas, en las posiciones 78 y 118, de! primero y segundo dominio, respectivamente. Las cadenas A(3 y E|3 poseen aproximada­ mente 240 aminoácidos, distribuidos de la si­ guiente forma: dos dominios extracelulares de 95 aminoácidos cada uno, un segm ento hidro­ fóbico transm em bránico de alrededor de 35 aminoácidos, y el extremo carboxiterminal de aproximadam ente 12 residuos. Poseen un solo sitio de glucosilación asociado a u n a Asn en la posición 20 del primer dominio. E n ambos dominios externos hay puentes disulfuro entre cisteínas ubicadas unos 60 residuos entre sí. El tamaño m olecular de las cadenas p oscila entre 28 y 29 kO; por lo tanto, la diferencia entre los tamaños de las cadenas a y ¡3 se debe fundam entalmente a diferencias en la glucosi­ lación. Durante su biosíntesis, las cadenas a y ¡3 se asocian intracelularm ente entre sí y con una tercera cadena, de alrededor de 31kD, glucosi­ lada, denominada cadena Ii o invariante, codi­ ficada por fuera del H-2. Las tres cadenas son transportadas a través del Golgi y posterior­ m ente hacia los endosom as, en don d e el pH ácido y ciertas proteasas disocian la cadena íi del dímero a[3; facilitan así la unión de pépti­ dos antigénicos generados por la v ía exógena (véase cap. 2). Finalmente las MHC de ciase II migran a la superficie celular.

212

Aspectos básicos de la inmunidad

Región

----------------------------

A -----------

Ab

Pb

Aa

Eb2

Genes

Productos

A ( i|

Ao

l-A F ig. 10-7. M oléculas de histocom patibilidad de clase 11. Cadenas que las com ponen y sus respectivos genes.

Las moléculas I-A e I-E pOvSeen una distribu­ ción tisular muy limitada: linfocitos B, macró­ fagos (y sus equivalentes en varios tejidos) cé­ lulas de Langerhans, algunas células T activa­ das. Se ha demostrado que, en la superficie ce­ lular de un individuo heterocigota para dos ha­ plotipos H-2 distintos, puede ocurrir la trans asociación entre las cadenas a de un haplotipo con las cadenas (3 del otro, tanto para las molé­ culas I-A como para las I-E. Así, por ejemplo, un ratón El (H-2‘*x H-2'^) podrá expresar en la superficie de una célula dendrítica ocho MHC de clase II diferentes: I-A: I-E:

A a7A|3‘*, AaVA13\ A tfV A p\ AaVA(3‘> E a ‘'/E(3^ EaVE(3\ E a “/E|3k, EaVE(3‘'

Los determinantes aloantigénicos en las mo­ léculas de clase II fueron establecidos por m e­ dio de aloanticuerpos monoclonales y pohclonales. Gran parte de los epitopes fueron identi­ ficados en las cadenas |3, aunque muchos de ellos dependen de una interacción apropiada con la cadena a correspondiente. A causa de la trans asociación de moléculas mencionadas an­ tes, los individuos F l pueden expresar en las moléculas de clase II determinantes aloantigé­ nicos ausentes en ambos padres.

Los estudios bioquímicos y moleculares de las MHC de clase II mostraron que el mayor polimorfismo reside en las moléculas A a , A(3 y Ep. La comparación de las secuencias de los genes E a de los haplotipos k, d u muestra una homología > del 98% a nivel de las proteínas. El análisis comparativo de las secuencias de la cadena A a de los haplotipos k, d, b, f, u y q, muestra que éstas exhiben una homología que oscila entre el 82% y el 93% (cuadro 10-5), con la mayor parte de los cambios presentes en el primer dominio ( a l ) de la proteína. La com­ paración de las secuencias de la cadena A|3 de los haplotipos b, d y k, revela una homología global de 90-95%, siempre con la mayor parte

C u ad ro 10-5. Comparación de las secuencias de aminoácidos de varias cadenas A a prove­ nientes de diversos haplotipos (expresada co­ mo % de disparidad)

b n

k q f

u

k

q

f

d

7

11

14 13 15

12 13 13 8

16 18 14 14 11

7

E l complejo mayor de histocompatibilidad de los cambios en el dominio (31. Por último, la comparación de las secuencias de los genes E|3 de los haplotipos k, d, b, u j; s, muestra una ho­ mología global del 95%, con los cambio.s con­ centrados en el primer dominio. Cuando se comparan las cadenas E a y A a , se observa una homología de aproximadamente 50%, y entre las cadenas A(3 y EP 60-65%. En ambos casos existe una sorprendente conserva­ ción (~ 80%) en la región transm em bránica, cosa que no ocurre en esa porción de las molé­ culas de clase I. Se ha especulado que esta ho­ mología en la región transmembránica de las moléculas de clase II sería importante en las in­ teracciones de las cadenas a y |3 entre sí o con otras proteínas. G E N E S DE C LA SE II

El análisis de las secuencias nucleotídicas de numerosos genes de clase II, permitió estable­ cer homologías entre las diversas moléculas, ya descritas en el punto anterior, y reveló además que los genes E a y Ep son análogos de los ge­ nes D R a y DRp humanos, mientras que los ge­ nes A a y Ap son la contraparte de los genes D Q a y DQP humanos (véase cap. 29). En los genes de clase II, al igual que en los de clase I, hay una estrecha correlación entre los exones y los dominios proteicos (fig. 10-8). Los genes a poseen un exón para el péptido se­ ñal; un primer intrón significativamente largo, de más de 2kb (similar al gen de P2-microglobulina) y a continuación los exones para los dominios extremos a l y a2 ; un tínico exón de 175 n u cleótidos co d ifica para el segm ento transm em bránico y citoplásm ico. E x iste un cuarto intrón ubicado dentro de la región 3 ’ no traducida, dividiéndola en dos. Los genes P po­

213

seen un exón para el péptido señal, dos exones para los dominios externos, exones individua­ les para los dominios transmembránicos y citoplásmicos y no hay intrones en la región 3 ’ no traducida. Al igual que lo encontrado con las moléculas de clase I, la genética molecular describió la presencia de otros genes de clase II, además de aquellos que codifican para las moléculas I-A e I-E. La organización de estos genes fue estudia­ da en varias cepas de ratones y está esquemati­ zada en las figuras 10-7 y 10-9. En orientación centromérica a Ap, se hallan los genes Pb (pre­ viamente designado Ap3) y Ob (antes llamado AP2). Pb se halla a tan sólo 75 kb de H-2K. Re­ cibió la designación de Pb por tener 83% de ho­ mología con el gen humano DPp. Este gen po­ see una deleción de 8 nucleótidos en el medio del dominio P2 que produce un corrimiento en el marco de lectura de los codones durante la traducción. Esto provoca la presencia de nume­ rosos codones de term inación, por lo que se considera que Pb es un seudogén. Esta deleción está presente al menos en las cepas H-2'’ y H-2'‘. La mayor parte de los genes de clase II han sido mapeados en un tram o de aproxim ada­ mente 200 kb. Ob (antes llamado A p2) posee un 49-56% de homología con otros genes p y se observó su expresión a nivel de A RN m en los mismos tipos celulares que expresan I-A e I-E, aunque no se conoce su producto proteico ni su respectiva cadena alfa. Com parado con los genes p humanos, en su segundo dominio es un 83% homólogo con el gen DOp, un pare­ cido similar al existente entre los pares I-A/DQ y DR/I-E. Esto sugiere que han existido ances­ tros comunes para cada uno de estos pares, an­ tes de la especiación hombre-ratón. A unas 20 kb de Ob se halla Ap y a 15 kb de éste, el gen A a. Estos codifican para el dímero

3’UT

TM/CIT 12

- A a, Ea

8kb

TM

CIT ■A|3. Ep

Fig. 10-8. Estructura de ios genes a y P de las m oléculas de histocom patibilidad de clase 11. Los rectángulos llen o s re­ presentan los exones. t^ = exón que codifica para el péptido señal, a l y ¡il = dom inios externos distales (am inoterm inal). a 2 y |32 = dom inios externos próximo.s a la superficie. TM = transm em bránico, C IT = intracitoplásm ico. 3 ’U T = región 3 ’ presente en el A RN m pero ausente en la proteína; I = intrones.

214

Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 10-6. Comparación de las secuencias de parte del dominio ¡3J de los genes A fí’, y E p ’. Los guiones representan identidad en la secuencia. La secuencia subrayada muestra el tra­ mo mínimo y la línea de puntos el tramo máximo involucrado en el suceso de conversión génica 60

AP»

Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu lie Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp GAG TAC TGG AAC AGC CAG CCG GAG ATC CTG GAG CGA ACG CGG GCC GAG CTG GAC

AP*» Ep'’

70

Asn A..

l-A (fig. 10-7) y poseen direcciones de trans­ cripción opuestas, al igual que los otros genes a y p. A unas 20 kb se ubica el gen Ep, en cuyo intrón 2 se localiza un “punto caliente” de re­ combinación; numerosas cepas de ratones que poseen genes H-2K e I-A de un haplotipo y ge­ nes H-2D de otro, y se mapeó el sitio de recom­ binación exactamente en este intrón. En orienta­ ción telomérica, le sigue el gen Eb2, cuyo pro­ ducto proteico se desconoce, aunque se transcri­ be en algunos tipos celulai'es. Finalmente se ha­ lla Ea y este último está a unas 90 kb del gen C4 (ya dentro de la región S del H-2). Más recientemente, entre los genes Pb y Ob, se han identificado otros genes, cuyos produc­ tos juegan un papel importante en los mecanis­ mos de procesamiento y presentación antigéni­ ca (fig. 10-9). Los genes LMP2 y LM P7 codifi­ can para subunidades catalíticas de los proteasomas, implicados en el catabolismo de proteí­ nas en el citosol celular (véase cap. 2). Los ge­ nes TAP] y TAP2 codifican para un heterodí­ mero que transporta péptidos desde el citosol h acia el interior del retículo endoplásm ico, donde ocurre su ensamble con las MHC de cla­ se I. Finalmente, los genes Ma y Mb (equiva­ lentes de los humanos DMA y DMB) codifican para moléculas que facilitan en los endosomas la disociación de la cadena li de las MHC de clase II y la unión de péptidos generados por la vía exógena (véase cap. 2). Existe una notable conservación evolutiva en la organización de estos genes entre el humano y el ratón. Como hemos mencionado antes, las MHC de clase II poseen una distribución tisular muy restringida. Se ha demostrado, tanto in vitro co­ mo in vivo, que el IFN gama induce la expre­ sión de novo de moléculas de clase II en célu­ las que carecen de ellas. Todas las especies de IFN producen un aumento de la expresión de moléculas de clase 1 en células que ya las ex­ presan. Ambos efectos involucran un aumento en los niveles de transcripción de los respecti­ vos genes.

Phe T..

Gln A..

Lys ■A.

Phe

Gln A..

Lys A.

T.

Val .G.

Las cepas de ratones de los haplotipos b, f, q y s no expresan moléculas I-E en la superficie y, aunque sí poseen cadenas EP en el citoplas­ ma, carecen de cadenas E a. Se demostró que, al menos en la cepa H-2'’, esto se debe a una deleción de aproximadamente 600 bases en el gen E a, que involucra el péptido señal y parte de la región 5 ’ que flanquea al gen (región pro­ motora). P O L IM O R F IS M O Y EV O LU C IÓ N DE LA R E G IÓ N I D EL H-2 Hay evidencias de que en los genes de clase II también operarían mecanismos del tipo de la conversión génica para generar polimorfismo en sus secuencias. Estas provienen de los estu­ dios hechos con los matantes de las cepas H-2'’. Se ha determinado la secuencia nucleotídica del mutante Ap'””'^ y se halló que difiere A p'’ en tres nucleótidos ubicados en un tramo de 14 ba­ ses, lo que resulta en el cambio de tres aminoá­ cidos. La secuencia cambiada es la misma que está presente en ese tramo en el gen Epb, lo que sugiere que Epb pudo haber sido la secuencia donante, en un evento evolutivo del tipo de la conversión génica. El tramo mínimo involucra­ do en la transferencia sería de 14 bases y el má­ ximo de 44 bases (véase cuadro 10-6). Como ya se mencionó, existe una homología entre todas las cadenas a entre sí y las P entre sí. Esto ha sugerido que los diversos productos génicos pudieron haber surgido a partir de un ancestro a y p común, a partir de los cuales ha­ brían evolucionado independientem ente cada locus. Las subregiones l-A e I-E del H-2 habían si­ do separadas por estudios de genética clásica, con la obtención de cepas recombinantes de ra­ tones que poseen alelos distintos en las molécu­ las I-A e I-E. Como se mencionó antes, el análi­ sis molecular de varias de estas cepas recombi­ nantes demostró que en todas ellas el sitio de

El complejo m ayor de histocompatibilidad recombinación involucra el gen Ep, cuya por­ ción 5 ’ mapea dentro de I-A y su porción 3 ’ dentro de 1-E (fig. 10-7) y que el sitio caliente o “hot spot” en la recombinación ocurre en el se­ gundo intrón, que separa los dominios p l y p2. Este hallazgo tiene importantes implicaciones en l o s mecanismos evolutivos que operan en la generación de polim orfism o en estos genes. Steirnmetz y col. compararon las secuencias de A D N dentro de la región I de las cepas Ji, d y una cepa salvaje mediante la ubicación de sitios reconocidos por nucleasas de restric­ ción. Observaron un alto grado de polimorfismo en el ADN desde el gen Ep hacia el centrómero (hacia la “izquierda” del mapa) y una gran con­ servación de las secuencias desde Ep hacia la región S (“derecha” del mapa). Esto es consis­ tente con el conocido escaso polimorfismo del gen E a , Slp y C4 (de la región S; véase más adelante). Nuevamente, estas observaciones su­ gieren la existencia de mecanismos especiales para la evolución de estas secuencias. Entre las subregiones I-A e I-E del H-2, la genética clásica mapeó la presencia de la lla­ mada subregión I-J. La inmunización cruzada entre cepas dispares en esta región, genera Acs que reconocen una sub población de linfocitos T supresores y factores solubles con activida­ des supresoras, derivados de ellos. Ya que el punto de recom binación entre I-A e I-E fue ubicado en el segundo intrón del gen Ep, no existe espacio físico para localizar la subregión I-J. Cuando se usó ad gen Ep para evaluar la presencia de ARNm complementarios a él en células T supresoras (I-J+), no se los halló. For lo tanto, el m apa físico no concuerda con el mapa genético de la subregión; alternativamen­ te los genes para I-J mapean por fuera del H-2. Evidencias en favor de esta posibilidad surgen del reciente hallazgo que las cepas originales que permitieron definir esta subregión, difieren en otras porciones del genoma, además de la región H-2. Una mejor caracterización bioquí­ mica de estas moléculas permitirá aclarar estas discrepancias.

REGIÓN S La región S (también denominada región de clase III) está ubicada entre las regiones I y D del sistema H-2 (fig. 10-1). Esta región ha sido bien caracterizada por clonado molecular y es similar en el humano y en el ratón (fig. 10-10). En un tramo de alrededor de 200 kb se hallan los genes que codifican para los componentes del complemento C2, Bf, C4, Slp y para la 21 hidroxilasa (210H). C4, uno de los com ponentes del sistem a complemento (véase cap. 22) y Slp, una molé­

215

cula estructuralm ente relacionada a C 4, son glucoproteínás que circulan en sangre periféri­ ca. Su actividad biológica es diferente. C4 está presente en la circulación de todas las cepas de ratones, es activa su participación en la activa­ ción de la cascada del complemento (C3 con­ vertasa y sustrato para C lq ) y es sintetizada en el hígado y macrófagos. Slp sólo está presente en determinadas cepas de ratones, en algunas de las cuales sus niveles dependen de los nive­ les de testosterona. No participa en la cascada del complemento y su función exacta se desco­ noce. Los genes para C4 y Slp ocupan aproxi­ madamente 15-20 kb, están separados p o r unas 70 kb y son 96% hom ólogos entre sí. En el hombre estas dos formas de C4 son activas y corresponden a los isotipos Rodgers y Chido. Vecinos a cada uno de los genes C4 y Slp (a 4 kb de distancia) se hallan los genes 210HA y 210HB, respectivamente. Codifican p a ra una proteína de 52 kD con actividad de citocromo P450, que participa en la hidroxilación de este­ roides adrenales. El gen 210HA es transcripcio n alm en te m ucho más activo que el gen 210HB en la adrenal murina. La presencia de un gen 21 OH vecino a cada gen C4 sugiere que éstos se originaron a partir de la duplicación de dos genes ancestrales. Los P450 comprenden una familia amplia de enzimas conocidas como monooxigenasas especializadas en la oxidación de sustratos hidrofóbicos. El ligamiento de ge­ nes absolutamente no relacionados, com o los de 21 OH y C4, pareciera que es accidental y no posee alguna implicancia funcional obvia. Cercanos a la región H-2I, se hallan los ge­ nes para C2 y Bf. Son glucoproteínás de 102 kD y 90 kD respectivamente, con estructura y función similares. Son serina proteasas respon­ sables de la actividad proteolítica de las C3 y C5 convertasas de las vías clásica y alterna de activación del com plem ento (véase cap. 22). Los genes poseen cierta homología (37 %) y se postula que pudieron haber surgido de un an­ cestro común, por una duplicación m uy ante­ rior a la que originó a los pares de C4 y 210H, Se ha especulado que la estrecha cercanía de ambos (menos de 1 kb) les ha permitido evolu­ cionar juntos y adquirir la especialización fun­ cional que poseen en ambas vías del comple­ mento. RESPUESTA INMUNE CONTRA MOLÉCULAS DE

HISTOCOMPATIBILIDAD Como vimos antes, si se trasplanta piel (o cualquier órgano) entre dos animales histoin­ compatibles (que poseen alelos de histocompa­ tibilidad diferentes), los linfocitos T CD4 y

21 6

Aspectos básicos de la inmunidad

Región

Pb

Ob

Ab

Aa

Eb

Eb2

Ea

Genes

Mb2

Mbl

LMP2

TAP1

LMP7

Genes

l'J F ig. 10-9. O tros genes de clase II ubicados entre los genes Pb y Ob.

CDS reconocen como extrañas a las MHC del donante, producen una intensa reacción infla­ matoria y destruyen a las células extraña.s. Las células T CD4 y CDS reconocen a las molécu­ las de clase II y clase I extraña.s, respectiva­ mente. La respuesta inm une contra las MHC extrañas se denomina respuesta alogeneica. In vivo, la respuesta incluye además la síntesis de anticuerpos contra las MHC ajenas (aloanticuerpos). Esta reacción puede evidenciarse y reprodu­ cirse in vitro, en el llamado cultivo mixto linfo­ citario (cuadro 10-7). Si se mezclan en un sis­ tema de cultivo, linfocitos proveniente de dos animales alogeneieos, las células T CD4 res­ ponden con una intensa proliferación y libera­ ción de mediadores al reconocer moléculas de clase II extrañas, presentes sobre la superficie de células que estimulan (linfocitos B, células dendríticas). Además, las células T CDS se ac­ tivan al reconocer moléculas de clase I extrañas sobre la superficie de todas las células ajenas. Además de este reconocimiento directo de las MHC extrañas por el receptor T, se ha demos­ trado que las MHC ajenas pueden ser procesa­

das y presentadas por MHC propias: esto se de­ nomina reconocimiento indirecto de aloantíge­ nos. En el cultivo mixto, si las cepas sólo difie­ ren en MHC de clase I, la proliferación será es­ casa, aunque sí se generarán efectores citotóxi­ cos CDS (cuadro 10-7). La frecuencia de linfocitos T que responden en un cultivo mixto linfocitario es de alrededor de 0.2%, varios órdenes de magnitud mayor que los que responden a un antígeno conven­ cional. Esto explica la magnitud de la respuesta en el cultivo mixto. En numerosos y elegantes experimentos se ha demostrado que un mismo clon de linfocitos T que responde específicamente ante un pépti­ do presentado por una M HC propia, puede eventualmente responder y proliferar ante una célula alogeneica, en ausencia aparente del péptido específico. Más aun, se ha demostrado Ibrmalmente, que es la misma molécula del re­ ceptor T la responsable del reconocimiento en ambos casos. Se ha hipotetizado la existencia de una suerte de reactividad cruzada entre el re­ conocimiento de la MHC propia + péptido y la molécula de histocompatibilidad ajena. Sin em-

C u a d ro 10-7. Respuestas en el cultivo mixto linfocitario p or M H C alogeneicas de clase I y clase 1¡ D isparidad en las M H C entre las células que e.nimulan y las que responden Clase I

Cla.se II

Proliferación

Sí SÍ NO

SÍ NO SÍ

++++ + +++

Las cé lu la s efectoras son de fe n o tip o C D 4 y re co n o ce n M H C d e c la se II alo g en eicas Las cé lu la s efecto ras son de fe n o tip o C D S y re co n o ce n M H C de clase I alogeneicíKs

Producción de citocinas

E fectores citotóxicos

+ ++ + “

++++'=

+ ++“'

+>’

E l complejo mayor de histocompatibilidad

C2

20

SIp

BF

40

60

217

I21OHBI

100

120

140

160

180 Kb

Fig. ÍO-10. O rganización genóm ica de la región S del sistem a H -2. L os genes están representados por rectán g u lo s y sus tam años y distancias que los separan están en escala. El gen C2 lim ita con la región H-21 y el gen 2 1 0 H B con la región H-2D. Las flecha.s indican las direcciones de transcripción.

bargo, han surgido en los últimos años numeros'ds evidencias que sugieren que el TCR no re­ conoce MHC “desnudas” o vacías, sino MHC que acarrean péptidos. En el reconocimiento alogeneico directo, estos péptidos derivarían de p roteínas endógenas de la célula y podrán eventualmente ser específicas de un tejido. Se ha demostrado que algunos clones de linfocitos T CD4 aloreactivos proliferan ante una molé­ cula de clase II alogeneica expuesta en la su­ perficie de linfocitos B, pero no cuando la mis­ ma molécula está sobre monocitos o fibroblas­ tos. Esto implica que la especificidad fina de este clon T reconoce la molécula de clase II junto a un péptido específico de linfocitos B y derivado de una proteína que estaría ausente de monocitos o fibroblastos. Otros clones T res­ ponden igualmente cuando el aloantígeno está sobre diversos tipos celulares y en este caso se reconocería un péptido derivado de una proteí­ na celular presente en varios linajes. Estas y otras evidencias son consistentes con la hipótesis que la respuesta alogeneica directa se produce contra antígenos celulares (por ej., estructurales) presentados por moléculas aloge­ neicas, asociaciones contra las cuales un indivi­ duo no es tolerante, pero que sí es tolerante a esos autoantígenos presentados por moléculas propias. La gran magnitud de la respuesta en el cultivo mixto se explicíiría según esta noción, por la enorme cantidád de clones T que tendrían la capacidad de reconocer las diferentes combi­ naciones entre péptidos tisulares -1- moléculas HLA alogeneicas (com binaciones co ntra las cuales uno no es tolerante). Más aun, por el pro­ pio polimorfismo de las MHC, las moléculas alogeneicas no necesariam ente acarrearán los mismos péptidos tisulares que aquellos presen­ tes en las MHC propias; a éstas últimas seremos tolerantes, pero no a las primeras! Esto aumenta la magnitud de la respuesta. Finalmente, a esto debe agregarse la contribución de la respuesta indirecta donde los aloantígenos procesados son re-presentados por las MHC propias. FUNCIONES DE LAS MOLÉCULAS D E HISTOCOMPATIBILIDAD Es evidente que la función biológica esencial de las MHC no es la de impedir trasplantes alo­

geneicos. A com ienzos de la década del ’70 surgieron varias evidencias independientes que demostraron la participación de las mism as en el reconocimiento de antígenos convencionales por parte de los hnfocitos T (el fenómeno lla­ mado restricción por el complejo mayor de his­ tocompatibihdad). Hoy está claro el papel de las M H C en la presentación de péptidos generados por el pro­ cesam iento intracelular (cap. 2). Más aun, es p o sib le incubar in vitro M HC con péptidos apropiados, m edir su afinidad, su cinética de asociación y ensayar su actividad biológica por su capacidad para activar linfocitos T. Se ha demostrado que la unión tiene lugar con cinéti­ cas de asociación y sobre todo disociación len­ tas (tl/2 = 30 hs), con constantes de afinidad moderadas del orden de 10'" M *. Las cinéticas de asociación obtenidas al ensayar la unión de péptidos a células, revelaron ser más rápidas. La lenta disociación sugiere que, una vez uni­ do, el complejo péptido-molécula de histocom­ patibilidad de clase II sería relativamente esta­ ble; si se garantiza la presencia de este comple­ jo sobre la superficie de la célula presentadora durante un tiempo prolongado, se favorece el encuentro con un linfocito T de especificidad apropiada. Para modelos en donde una misma molécula de clase II es capaz de unir diversos péptidos, los estudios de com petición han sugerido la existencia de un sólo sitio de unión. Las imáge­ nes cristalográficas de las MHC han confirma­ do esta noción. En num erosos sistem as se ha dem ostrado que determinados alelos de clase I o clase 11 “sirven” o “no sirven” para presentar ciertos péptidos antigénieos. Esto explica los primeros estudios in vivo que mostraron que ciertas ce­ pas de ratones son “buenos” respondedores y otros “malos” respondedores a un antígeno da­ do y que los genes que regulan esto mapean en el sistema H-2. Esto ha permitido asignarle a los genes de histocompatibilidad el nombre de genes de re.spuesta inmune. La caracterización de ligandos peptídicos naturalm ente hallados en las MHC y los ensayos de unión in vitro a M H C purificadas, confirm an que u n a buena respuesta depende en primer lugar de la capaci­ dad del péptido de unirse a una determinada MHC.

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Aspectos básicos de la inmunidad

En la mayoría de las especies donde fue es­ tudiado, el sistema mayor de histocompatibili­ dad es extremadamente polimórfico. En aque­ llas especies donde el p o lim orfism o de las MHC es [imitado, las proteínas implicadas en el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte (Tapl/2) de péptidos antigénicos hacia el inte­ rior del retículo, contribuyen con un moderado polimorfismo, en la selección de los epitopes presentados. Se ha postulado que todo este po­ limorfismo y la rápida evolución de este siste­ ma, evitaría la aparición de un patógeno “per­ fecto” que pueda evitar una adecuada presenta­ ción por una MHC, o que pueda mimetizar uno de ellos y evadir así el reconocimiento inmune. La presentación antigénica sobre superficies celulares m ediada por las MHC, pudo haber evolucionado como un mecanismo especializa­ do de los hnfocitos T, ya que la función de es­ tas células siempre está asociada a la interac­ ción con células presentadoras de antígeno: la activación de linfocitos B y la activación de células inflamatorias por la acción directa de citoquinas. La utilización de dos MHC dife­ rentes (clase I y clase II) quizá haya surgido como consecuencia de una especialización de las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden eliminar bacterias y sus toxinas (función reser­

vada a los T CD4 inductores y su efecto poste­ rior sobre linfocitos B) sino que deben focali­ zar su respuesta citotóxica sobre cuakjuier cé­ lula del organismo que exhiba en sus MHC de clase I péptidos tumorales o de patógenos in­ tracelulares. BIBLIOGRAFIA RM Ziiikernagel & PC D oherty. C ontenip T o p Im m unobiol 7; 179, 1977. EH Wei.s.s y coi. EJVJBO J 2: 453, 1983. LR Pease y col. Proc N ati A cad Sci 80: 242, 1983. EH Wei.s.s y co!. N ature 310: 650, 1984. M Steinm ctz. N ature 14, 1985. R H Schw artz. A n n R e v Im m unol i : 237, 1985. M Steiiim etz y col. C ell 44: 895, 1986. J G overm an y col. Cel! 4S: 475, 1986. O ’N eill y col. Im m unogenetics 24: 368, 1986. SG N athenson y col. A n u R e v Im rautiol 4: 471, 1986. I Stroynowslci. A nn Rev Im m unol S: 501, 1990. K Ito y col. Cell 62: 549, 1990, F K Lindhal y col. A nn Rev Im m unol 9: 351, 1991, S Cho y col. N ature SS3: 573, 1991. CK IVIartinez & JJ M onaco. N ature 353: 664, 1991. D H F rem o n ty col. Science 257: 919, 1992. 0 R otzchke y col. N ature 36J: 642, 1993. CR W ang y col. Proc N ati A cad Sci 90: 2784, 1993. SM Shaw ar y col. A nn Rev Im m unol 12: 839, 1994, V H Engelhard. C urr O p Im m unol 6: 13, 1994. 1 Stroynow .ski & K F L in d h al. C u rr O p Im m u n o l 6: 38, 1994.

Moléculas de adhesión

MARCELA A. MANGHI

IN TRO D U C CIÓ N Hasta hace poco tiempo, el endotelio vascu­ lar era considerado como un tejido que cubría los vasos sanguíneos cuya función sólo era la de prevenir la coagulación sanguínea y separar el espacio vascular de los tejidos. Las células endoteliales fueron consideradas menos acti­ vas, menos complejas y menos interesantes que muchos otros tipos celulares. Hoy se sabe que el endotelio vascular parti­ cipa activam ente en una amplia variedad de procesos fisiopatológicos que incluyen infla­ mación e inmunidad. El intenso estudio de los mecanismos moleculares de la adhesión de los leucocitos al endotelio permitió identificar, ca­ racterizar y clonar múltiples moléculas acceso­ rias en la superficie de la célula endotelial que soportan la adhesión a través de una interac­ ción con ligandos específicos sobre los leucoci­ tos facilitando su tráfico. MOLECULAS ACCESORIAS La superfamilia de las integrinas La familia de las integrinas incluye más de 20 heterodímeros de superficie celular, diferen­ tes pero estructuralm ente relacionados, com­ puestos de cadenas a y |3 unidas en forma nocovalente. Estas moléculas intervienen en la adhesión de células a proteínas de la matriz ex­ tracelular (ECM) y en las interacciones célulacélula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu­ nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca­ dena p, han sido denominadas antígenos VLA (very late after activation) dado que dos de los primeros miembros de este grupo aparecen so­

bre los linfocitos después de su activación. Sin em bargo, dado que la m ayoría de las células del cuerpo expresan por lo menos una de las in­ tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que algunas de las cadenas pueden estar combina­ das con otras subunidades p, la nomenclatura VLA dejó de ser apropiada y ha sido reempla­ zada por la nomenclatura a P (véanse cuadros 11-1 y 11-2). La función general de los miembros de la fa­ m ilia de las integrinas es interactuar con una amplia variedad de ligandos incluidos glucoproteínas de la ECM , componentes del comple­ m ento, y otras células “integrando” el medio ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podrían teóricamente dar origen a más de 100 heterodí­ meros, la diversidad real es mucho m ás restrin­ gida dado que muchas cadenas a se asocian con una única cadena p y que otras cadenas a (por ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen­ tes. Las integrinas individuales pueden unir más de un ligando, y los ligandos individuales pue­ den ser reconocidos por más de una integrina (cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden reconocer proteínas integrales de m em brana pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar la adhesión directa célula-célula. Las integrinas intervienen en la adhesión cé­ lula-célula y célula-matriz en muchos procesos fisiológicam ente importantes: desarrollo em­ brional, hemostasis, trombosis, cicatrización de heridas, mecanismos de defensa inm une y noinmune, y transformación oncogénica. De acuerdo a sus características estructura­ les, las integrinas pueden ser divididas en va­ rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje postranslacional de la cadena a , y otro grupo que

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Aspectos básicos de la inmunidad

En la mayoría de las especies donde fue es­ tudiado, el sistema mayor de histocompatibili­ dad es extremadamente polimórfico. En aque­ llas especies donde el p o lim orfism o de las MHC es [imitado, las proteínas implicadas en el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte (Tap 1/2) de péptidos antigénieos hacia el inte­ rior del retículo, contribuyen con un moderado polimorfismo, en la selección de los epitopes presentados. Se ha postulado que todo este po­ limorfismo y la rápida evolución de este siste­ ma, evitaría la aparición de un patógeno “per­ fecto” que pueda evitar una adecuada presenta­ ción por una MHC, o que pueda mimetizar uno de ellos y evadir así el reconocimiento inmune. La presentación antigénica sobre superficies celulares m ediada por las MHC, pudo haber evolucionado como un mecanismo especializa­ do de los hnfocitos T, ya que la función de es­ tas células siempre está asociada a la interac­ ción con células presentadoras de antígeno: la activación de linfocitos B y la activación de células inflamatorias por la acción directa de citoquinas. La utilización de dos MHC dife­ rentes (clase I y clase II) quizá haya surgido como consecuencia de una especialización de las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden eliminar bacterias y sus toxinas (función reser­

vada a los T CD4 inductores y su efecto poste­ rior sobre linfocitos B) sino que deben focali­ zar su respuesta citotóxica sobre cualcjuier cé­ lula del organismo que exhiba en sus MHC de clase I péptidos tumorales o de patógenos in­ tracelulares. B IB L IO G R A F IA RM Ziiikernagel & PC D oherty. C ontenip T o p Im m unobiol 7; 179, 1977. EH Wei.s.s y col. E M B O J 2: 453, 1983. LR Pease y col. Proc N ati A cad Sci 80: 242, 1983. EH \N d a s y co!. N ature 310: 650, 1984. M Steinm ctz. N ature 14, 1985. R H Schw arlz. A n n R e v Im m unol 3: 237, 1985. M Steiiim etz y col. CeU 44: 895, 1986. J G overm an y col. Cel! 4S: 475, 1986. O ’N eill y col. Im m unogenetics 24: 368, 1986. SG N athenson y col. A n n R e v Im rautiol 4: 471, 1986. I S troynow ski. A nn Rev Im m unol 8: 501, 1990. K Ito y col. Cell 62: 549, 1990. F K Lindhal y col. A nn Rev Im m unol 9: 351, 1991, S Cho y col, N ature 3S3: 573, 1991, CK ¡Martínez & JJ M onaco, N ature 353: 664, 1991, D H F rem o n ty col. Science 257: 919, 1992. 0 R otzchke y col. N ature 36J: 642, 1993. CR W ang y col. Proc N ati A cad Sci 90: 2784, 1993. SM Shaw ar y col. A nn Rev Im m unol 12: 839, 1994. V H Engelhard. C urr O p Im m unol 6: 13, 1994. 1 Stroynow .sk¡ & K F L in d h al. C u rr O p Im m u n o l 6: 38, 1994.

Moléculas de adhesión

MARCELA A. MANGHI

IN TRO D U C CIÓ N Hasta hace poco tiempo, el endoteUo vascu­ lar era considerado como un tejido que cubría los vasos sanguíneos cuya función sólo era la de prevenir la coagulación sanguínea y separar el espacio vascular de los tejidos. Las células endoteliales fueron consideradas menos acti­ vas, menos complejas y menos interesantes que muchos otros tipos celulares. Hoy se sabe que el endotelio vascular parti­ cipa activam ente en una amplia variedad de procesos fisiopatológicos que incluyen infla­ mación e inmunidad. El intenso estudio de los mecanismos moleculares de la adhesión de los leucocitos al endotelio permitió identificar, ca­ racterizar y clonar múltiples moléculas acceso­ rias en la superficie de la célula endotelial que soportan la adhesión a través de una interac­ ción con Hgandos específicos sobre los leucoci­ tos facilitando su tráfico. MOLECULAS ACCESORIAS La superfamilia de las integrinas La familia de las integrinas incluye más de 20 heterodímeros de superficie celular, diferen­ tes pero estructuralm ente relacionados, com­ puestos de cadenas a y |3 unidas en forma nocovalente. Estas moléculas intervienen en la adhesión de células a proteínas de la matriz ex­ tracelular (ECM) y en las interacciones célulacélula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu­ nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca­ dena p, han sido denominadas antígenos VLA (very late after activation) dado que dos de los primeros miembro,s de este grupo aparecen so­

bre los linfocitos después de su activación. Sin em bargo, dado que la m ayoría de las células del cuerpo expresan por lo menos una de las in­ tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que algunas de las cadenas pueden estar combina­ das con otras subunidades p, la nomenclatura VLA dejó de ser apropiada y ha sido reempla­ zada por la nomenclatura a P (véanse cuadros 11-1 y 11-2). La función general de los miembros de la fa­ m ilia de las integrinas es interactuar con una amplia variedad de ligandos incluidos glucopro­ teínas de la ECM , componentes del comple­ m ento, y otras células “integrando” el medio ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podrían teóricamente dar origen a más de 100 heterodí­ meros, la diversidad real es mucho m ás restrin­ gida dado que muchas cadenas a se asocian con una única cadena p y que otras cadenas a (por ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen­ tes. Las integrinas individuales pueden unir más de un ligando, y los ligandos individuales pue­ den ser reconocidos por más de una integrina (cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden reconocer proteínas integrales de m em brana pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar la adhesión directa célula-célula. Las integrinas intervienen en la adhesión cé­ lula-célula y célula-matriz en muchos procesos fisiológicam ente importantes: desarrollo em­ brional, hemostasis, trombosis, cicatrización de heridas, mecanismos de defensa inm une y noinmune, y transformación oncogénica. De acuerdo a sus características estructura­ les, las integrinas pueden ser divididas en va­ rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje postranslacional de la cadena a , y otro grupo que

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Aspectos básicos de la inmunidad

Cuadro 11-1. Nombres alternativos _yligandos de las integrinas C adena a

C adena ¡i

N om bres alternativos

al al a2 a3 a4 a4 aS a6 a6 a7 a8 aL aM aX a l lb

pl pl pi pl ¡57 p) pi p4 pi pi P2 P2 P2 p3 p3

C D 49a/C D 29, VLA-1 C D 49b/C D 29, V LA -2, [a/IIa C D 49c/C D 29, LV A -3 C D 49d/C D 29, V LA -4, LPAM ^2 C D 49d/-,L P A M -l C D 49e/C D 29. V LA -5, Ic/Ha CD49Í7CD29, VLA-6, Ic/Ila C D 4 9 f/-. -/C D 2 9 -/C D 2 9 C D H a /C D 18, LFA-1 C D Ilb /C D l8 , M A C-1, CR3 C D Ilc /C D lS , P150/95, CR4 C D 4 I/C D 6 I CD 51/CD 61

aV aV aV aV a lE L

pi P5 p6 ps p7

C D 51/C D 29 C D 5 1 /C D 5 1 /C D 5 1 /H M L -I,M 2 9 0

Ligando Colágeno, lam inina Colágeno, lam inina Fibronectina, lam inina, colágeno F ibronectina, V C A M -1 Fibronectina, V C A M -1, H EV cercanas a las placas de P eyer Fibronectina Lam inina L am inina (?) L am inina (?) íCA M -1,2,3 C 3bi, fibrinógeno, factor X, lCAM -1 C3bi, fibrinógeno F ibrinógeno, fibronectina, vitronectina, throm bospondina V itronectina, fibrinógeno, throm bospondina, fibronectina, osteopontina V itronectina, fibronectina V itronectina Fibronectina

9

H EV cercanas a las placas de Peyer

contiene dominios de 180 a 200 aminoácidos, llam ado dom in io s I (in se rtiv o -in te ra c tiv o ) (cuadro 11-2). Las cadenas a clivadas están compuestas por un dominio transmembrana de 25-30 KD unido por unión disulfuro a una ca­ dena más larga totalmente extracelular. En ca­ da cadena a hay 18 a 24 cisteínas, y 14 a 16 de ellas están conservadas en todas las subunida­ des a conocidas. El dominio I está compuesto por 180 a 200 aminoácidos insertados a partir del aminoácido 130.

Las cadenas p i, ¡52 y ¡53 humanas han sido clonadas y completamente secuenciadas. Ellas son semejantes en un 44% a 47% y conservan las 56 cisteínas. Hay una alta conservación de las cadenas p, a través de las especies. La P4 es claramente diferente de las otras cadenas P de las integrinas, es más grande (210.000 PM) y s?u dominio citoplasmático supera los 1.000 aa. La asociación de las cadenas a y p es requerida para la expresión en la superficie celular y apa­ rentemente la velocidad de expresión estaría li­

C uadro 11-2. Propiedades moleculares de las integrinas Cadena al a2 a3 a4 aS a6 a.1 a8 aL aM aX a l lb aV a lE L 81 P2 33 34 P5 S6 P7 P8

Tam año reducido 210.000 16,5.000 130.000/25.000 150,000 135,000/25.000 120.000/30.000 95.000 140,000 180,000 170,000 150,000 120,000/25,000 125,000/24,000 150.000/25.000 130.000 95.000 105,000 220.000 110.000 106.000 (estim ado) 130.000 97.000

D om inio / de las integrinas

Clivado

200.000 160.000 150.000 140.000 155.000 140.000 120.000 160.000 170,000 165.000 145.000 145.000 150,000 175.000 110,000 90,000 90.000 210,000 100,000

Sí Sí No No No No No No Sí Sí Sí No No 7 No No No No No No

No No Sí No Sí Sí Sí Sí No No No Sí Sí Sí No No No No No No

105,000 95,000

No No

No No

T am año no-reducido

Moléculas de adhesión mitada por la síntesis de la cadena a , la cual re­ gula la maduración y la aparición de la cadena p en la superficie celular. Se acepta que en cada integrina los dominios N-terminal de las cadenas a y p se combinan para formar una cabeza que une al ligando y que los dominios citoplasmáticos pueden inte­ ractuar con proteínas del citoesqueleto. La pre­ sencia en cada cadena a de los dominios cito­ plasmáticos, que son estructuralmente únicos, origina la posibilidad de que estos receptores puedan interactuar con diferentes componentes de! citoesqueleto. Es importante destacar que una integrina par­ ticular en una célula dada puede no unirse a to­ dos los ligandos listados en el cuadro 11-1, Por ejemplo, la a2 p 1 de las plaquetas une colágeno pero no laminina, mientras que en otros tipos celulares puede reconocer a ambos ligandos. L a fam ilia de las integrinas (32

Las leucointegrinas Las leucointegrinas constituyen una familia de tres glucoproteínas de la superficie celular que usan la cadena P2 de la familia de las inte­ grinas y que median la interacción célula-célula en la inflamación. Estas glucoproteínas son tam bién com únm ente d enom inadas LFA-1 (aL , (32 o C D lla /C D 1 8 ), Mac-1 (a M , [32 o C D llb /C D lB ) y p l5 0 /9 5 (a X , (32 o C D c/ CD 18),

La familia de las selectinas Esta familia de moléculas de adhesión está compuesta de 3 glucoproteínas de la superficie

221

celular presentes en células endoteliales (E-selectina), plaquetas (P-selectina) y linfocitos (Lseleetina), A partir de estudios de secuencia se pudo predecir la estructura de cada una de estas 3 moléculas: una proteína transmembrana con un dominio N-terminal semejante a una lectina, un mismo factor de crecimiento epidemial (EGF), y un número variable de módulos (de aproxi­ madamente 60 aa, cada uno) similares a los en­ contrados en ciertas proteínas que unen com­ plemento (fig, 11-1), El término selectina fue propuesto para resaltar el dominio lectina N~ terminal y para indicar la función y expresión selectiva de estas moléculas (cuadro 11-3), La relación encontrada entre la región N-ter­ minal de estas tres moléculas y los dominios de reconocimiento de carbohidratos presentes en las lectinas animales dependientes de Ca^^ dio lugar a una búsqueda intensiva de los ligandos carbohidratos involucrados, E-,P-, y L- selectinas se unen a uno o más ti­ pos de carbohidratos, incluyendo estructuras re la c io n a d a s al an tíg en o L ew is’' sialid ad o (s L e’'), polisacáridos sulfatados (heparina, fucoidán), y monosacáridos y pohsacáridos fosfa­ tados. Además, las proteínas celulares específi­ cas pueden participar en la presentación de li­ gandos para selectinas. Si bien los detalles mo­ leculares de las interacciones ligando-selectina no han sido aún determinados, se presume que la unión de las selectinas individuales a diferen­ tes tipos de carbohidratos puede involucrar o no el mismo mecanismo. Para conocer estas inte­ racciones se requerirá determinar las afinidades de unión y las constantes de velocidad, así co­ mo del análisis cristalográfico por rayos X.

E-selectina

NH2 Lectina EGF

NH2

P-selectina i

/ 1

■■ 2

i!

.

7

8

i,

0

y

'C O O H

Lectina EGF

L-selectina NH2 Lectina EGF F ig. 11-1. Esquem a de las estructuras de E P y L - .selectina. N6te.se e) dom inio lectina am ino term inal, el EG F, el nú­ m ero variable de m ódulos sim ilares a los encontrados en proteínas que unen com plem ento, el dom inio transm em brana y el eitoplasm ático.

222

Aspectos básicos de ia inmunidad

Cuadro 11-3. Moléculas de adhesión de la fam ilia de las selectinas: expresión y función N om enclatura anterior

E xpresada por:

Se une a:

E-selectina

ELAM -1

Endotelio

N eutrófilos M onocitos A lgunas células T

P-selectina

PA D G EM G M P -140

Plaquetas Endotelio

N eutrófilos M onocitos A lgunas células T

L-selectina

m L H R ,L e u 8 ,T Q -l,g p 9 0 « ® S L am -],L ec an j-l

L infocitos M onocitos N eutrófilos

V énulas endoteliales supe­ riores de los nódulos lin fá­ ticos

M oléculas de adhesión intercelular (ICAMs) ICAM-1, ICAM-2, e ICAM-3 son moléculas de la superficie celular que pertenecen a la su­ perfamilia de las inmunoglobulinas (véase cap. 5) y están distribuidas en diferentes tipos celu­ lares (endoteliales, epidemiales, fibroblásticas). Estas moléculas intervienen frecuentemente en las reacciones de adhesión y transmigración de los leucocitos sanguíneos a través de la unión directa a las integrinas de la superficie celular de los leucocitos. E structuralm ente, las ICAM s varían en el número de dominios de inmunoglobulina en el fragmento extracelular (fig. 11-2). Si bien estas porciones extracelulares presentan un alto gra­ do de homología entre sí, las porciones intracitoplásmica y transmembrana presentan una ho­ mología mucho más baja. Sin embargo, el gra­ do de homología entre los dominios extracelu-

lares de las moléculas ICAM es variable. Por ejemplo, ICAM-3 tiene una homología de se­ cuencia total del 48% con ICAM-1 y de sólo 31% con ICAM-2, aunque la homología entre los dominios individuales varía marcadamente. La gran similitud entre las diferentes moléculas ICAM sugiere que todas ellas podrían derivar de una misma molécula ancestral. Suponiendo que fuera así, el grado de diversidad de estas moléculas es ¡o suficientemente grande como para determinar en ellas diferentes funciones, ya que presentan diferencias en: la distribución celular, su actividad de unión a LFA-1, y las regiones citoplasmáticas. VCAM-1 / INCAM-110 Si bien se conocía el rol de ICAM-1 y E-se­ lectina en la adhesión de los leucocitos a las cé­ lulas endoteliales, se presumía de la existencia

iir v c Dominios ig-“like” iJ U iiiM ir u o l y -

7 7°L

^L

m

9T7°L

20%

11

o/„

ICAM-1 (CD54) (510 aa)

ICAM-3 (CD50) (518 aa)

lCAM-2 (GDI 02) (256 aa)

F ig . 11-2. H om ología entre las p roteínas ICA M . N ótese la porción transm em brana (TM ) y la porción citoplasm ática (Cyt).

Moléculas de adhesión de una tercera molécula de adhesión endotelial inducible por citoquinas, dado que: I) la adhe­ sión de la mayoría de los linfocitos sanguíneos periféricos al endotelio activado no podría ser explicada totalmente por lCAM-1 y E-selecti­ na, y 2) ciertas células funcionales linfoides (por ej., melanomas) se adhieren al endotelio activado por mecanismos aparentemente inde­ pendientes de ICAM-1 y E-selectina. Mediante el empleo de un anticuerpo mono­ clonal generado contra el endotelio activado con TNF, se identificó una glucoproteína endo­ telial de 110 KD inducible por citoquinas que es inm un o q u ím icam en te d istin ta de las ya nombradas; se la denominó molécula de adhe­ sión celular inducible -110 (INCAM-110). Por otra parte, empleando un c-DNA aislado de cé­ lulas endoteliales activadas con citoquinas, otros investigadores identificaron una molécula que participaba en la adhesión de los linfocitos y la llamaron molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1). Poco después se demostró que se trataba de la m ism a m olécula IN CAM -110. A ctualm ente, el nom bre VCAM-1 es el más empleado para esta proteína, que pertenece a la superfamilia de las Igs y está compuesta de 1 dominio extracelular que contiene 7 dominios de Ig, una región transmembrana y una región citoplásmica corta. La expresión de VCAM-1 sobre las células endoteliales es inducida rápidamente por IL-1 y TN F-a en 6-12 horas. VCAM-1 está también expresada en diversos tipos celulares no-vascu­ lares, incluidas células dendríticas en nódulo linfático y piel, células estromales en m édula ósea, y células sinoviales en articulaciones in­ flamadas. La molécula VCAM-1 interviene en la adhe­ sión de las células endoteliales a linfocitos y monocitos (pero no neutrófilos) a través de una interacción con la in teg rin a a 4 [3 (V L A -4; CD49d/CD29), la que también se une a la fi­ bronectina. La expresión de VCAM-1 no está restringida a las células endoteliales activadas, ya que esta molécula es expresada por las células dendríti­ cas linfoides en amígdalas, bazo y nódulos lin­ fáticos periféricos, y por ciertos m acrófagos presentes en bazo y timo. En consecuencia, es posible que VCAM-1 juegue un rol como mo­ lécula coestimulatoria sobre la superficie de las células accesorias durante la activación de las células T específicas en ciertos sitios anatómi­ cos. CD 44 CD44 (Pgp-1, Ly-24, ECMR-III) es una glu­ coproteína de membrana de naturaleza acídica sulfatada de PM variable (80 kD - 200 kD) se­

223

gún el grado de glucosilación y de asociación de condroitín sulfato. Se expresa en las células epiteliales, linfocitos T y B, queratinocitos y una variedad de tumores, presentando diferen­ tes isoterm as. También se ha encontrado una form a so lu b le en sangre y fluido sin o v ia l. CD44 interactúa con diferentes superficies ce­ lulares y componentes de matrices, que inclu­ yen fibronectina, colágeno, y un glucosaminoglucano no-sulfatado llamado hialuronato. CD 31 (PECAM-1, endoCAM) CD31 Es una glucoproteína transmembráni­ ca de aproximadamente 130 kD que se halla en células endoteliales, plaquetas, neutrófilos, m o­ nocitos y subpoblaciones de células T, E s un miembro de la superfamilia de las Igs que, se­ gún estudios de predicción de secuencia efec­ tuados a partir de su c-DNA, contendría 6 do­ minios de Ig. Esta molécula podría m ediar la adhesión célula-célula a través de interacciones h o m o fílic a s (C D 3 1 -C D 3 1 ) y h e te ro fílic a s (CD31-contrarreceptor desconocido). C D 3 1 está constitutivamente expresada y en form a abundante en el endotelio. C uando las células endoteliales entran en contacto para for­ mar una monocapa, C D 31 se redistribuye hacia los bordes celulares y participa en las interac­ ciones célula endotelial-célula endotelial que limitan la permeabilidad vascular. Es probable que en los procesos inflam ato­ rios, la retracción celular del endotelio produci­ da por mediadores como la trombina y la hista­ m ina se deba a un efecto sobre CD31. Estos mediadores estimulan la fosforilación de los re­ siduos de serina en la región citoplasmática de CD31 modulando ias interacciones producidas en el citoesqueleto. Las interacciones de unión homofílicas entre CD31 del leucocito y CD31 endotelial podrían ser p artic u larm e n te im p o rtan tes d u ra n te la transmigración, cuando el leucocito debería en­ contrar la mayor densidad de moléculas CD31 endoteliales. CD 45 CD45 consiste de un grupo de glucoproteínas integrales de m em brana cuyo PM oscila entre 180 y 220 kD, y que sólo son expresadas en linfocitos inmaduros y maduros, incluyendo células T y B, tim ocitos, fagocitos m ononu­ cleares y leucocitos polimorfonucleares. L a fa­ milia del CD45 está constituida por múltiples miembros que son todos productos de un único gen complejo. Este gen contiene 34 exones, 3 de los cuales son alternativamente olivados a nivel de la transcripción del RNA prim ario pa­ ra generar hasta 8 RNAm diferentes y 8 pro­

224

Aspectos básicos de la inmunidad

ductos proteicos diferentes. Según las secuen­ cias de aminoácidos, las proteínas predecibles incluyen dominios externos de 391-552 am i­ noácidos, una región transmembrana, y un do­ minio eitoplasm ático muy conservado. A de­ más, ios diferentes patrones de glucosilación de la misma estructura peptídica también contri­ buyen a ia lieterogeneidad de los miembros de esta fam ilia de proteínas. Varios anticuerpos monoclonales diferentes que reconocen miem­ bros individuales han sido de gran utilidad en el estudio de la distribución y de las funciones de las proteínas CD45. Las isoformas de las proteínas CD45 que son expresadas en un grupo restringido de tipos ce­ lulares son denominadas CD45R y su expre­ sión sobre las células T es de interés por varias razones. En primer término, la expresión de di­ ferentes formas de CD45R es regulada por el desarrollo durante el proceso de maduración de las células T. Las distintas subpoblaciones de células T que expresan CD4 en diferentes esta­ dios de maduración o con diferentes capacida­ des funcionales in vitro han sido diferenciadas por la e x p re sió n de d ife re n te s fo rm a s de CD45R. Las células T nativas expresan una forma de CD45R llamada CD45RA, y las célu­ las T con memoria inducidas por la exposición al antígeno expresan otra isoforma denominada CD45RO. En segundo término, el dominio citoplasmático largo de CD45 tiene una actividad fosfatasa tirosina intrínseca, la que puede ser importante en la regulación de los distintos ca­ minos de activación que involucran actividad tirosina quinasa (véase cap. 13). La migración transendotelial de las células T en la inflamación crónica Si bien muchas veces no se conocen los estí­ mulos etiológicos iniciadores de las respuestas inflamatorias en la enfermedad clínica, un cua­ dro característico de la inflamación crónica ya establecida es la persistente extravasación de células mononucleares dentro del tejido. A un­ que en los tejidos inflamados se encuentran cé­ lulas de diversos tipos, incluidas las células T, B, y presentadoras de Ag, parece ser que las células T son las que orquestan la iniciación y persistencia de muchas enfermedades inflama­ torias crónicas. Por ejemplo, la artritis reuma­ toidea (AR), que es una enfermedad inflamato­ ria crónica de etiología desconocida, se carac­ teriza por inflamación persistente del tejido si­ novia!, destrucción local de hueso y cartílago, y muchas otras m anifestaciones sistémicas. La activación de las poblaciones específicas de cé­ lulas T que han infiltrado la sinovia reumatoi­ dea, es el eje central de la evolución de esta en­ fermedad. Por consiguiente, para entender los

mecanismos inmunopatogénicos de tales enfer­ medades inflamatorias, es necesario entender los mecanism os com plejos que gobiernan la migración y acumulación de las células T en las lesiones inflamatorias. La capacidad de las células T para acceder a los sitios inflam atorios está influenciada por distintas propiedades de estas células, inclu­ yendo la expresión en su superficie de una va­ riedad de moléculas de adhesión, su movihdad intrínseca y su capacidad para alterar su funcio­ nalidad m ediante interacciones con células, moléculas de matriz extracelular y otras seña­ les de activación. Las células T, mediante inte­ racciones de adhesión mediadas por receptor, pueden interactuar con las células endoteliales que cubren las vénulas poscapilares que pue­ den potencialmente facilitar la entrada de célu­ las T en los tejidos. Dichos eventos mediados por receptor son necesarios para la localización celular, pero no son suficientes para la extrava­ sación, dado que no todas las células T que ex­ presan receptores de adhesión pueden tener ac­ ceso a todos los tejidos. Es decir, la extravasa­ ción exitosa de las células T en los tejidos in­ flamados parecería estar gobernada por otros factores que incluyen la capacidad migratoria de estas células. Por otra parte, ei endotelio, que normalmen­ te funciona como una barrera a la extravasa­ ción celular, puede ser inducido a expresar contrarreceptores para las moléculas de adhe­ sión de las células T, los cuales intervienen en la unión y transmigración de las células T espe­ cíficas. Además, el endotelio puede tam bién producir sustancias quemotácticas (quemoquinas) proinflamatorias que pi'omueven la trans­ migración de las células T específicas. Por lo tanto, la extravasación de las células T dentro de los ciclos inflamatorios es la resultante de un número de mecanismos fisiológicos distin­ tos. (Para mayor información véase cap. 23.) M ecanism os de adhesión que median el tráfico de linfocitos En general, la extravasación de hnfocitos in­ volucra las actividades concertadas de una va­ riedad de receptores de adhesión. C om o se muestra en la figura 11-3, la migración de las células T dentro del tejido perivascular es un proceso de adhesión de múltiples pasos que in­ volucra el contacto inicial de las células T a la superficie de las células endoteliales, la induc­ ción o activación de receptores de adhesión de la superficie celular para mediar uniones firmes y estables con el endotelio, y luego el despegue de las células unidas de modo tal que ellas pue­ dan transmigrar a través de la capa de células endoteliales. La transmigración de los linfoci-

Moléculas de adhesión

225

Linfocito T

Contacto inicial

Unión estabilizada

Desadhesión

Trans­ migración

F ig. 11-3. E squem a de la migración transendotelial de los linfocitos com o un proceso de m últiples pasos.

tos unidos es también un proceso mediado por receptores que involucra pares receptor-contrarreceptor específicos que pueden haber estado implicados en la unión inicial o no. Las células transmigrantes deben poseer una capacidad mi­ gratoria intrínseca, de modo que ellas se m ue­ van a través de la capa de células endoteliales en vez de retornar nuevamente a la circulación. No todas las células T circulantes pueden mi­ grar hacia los sitios inflamatorios. Las que lo hacen in vivo tienen un fenotipo distintivo y son subpoblaciones de células T con memoria. R ecirculación n o rm al de los linfocitos Durante la generación de las respuestas in­ munes efectivas, los linfocitos recirculan nor­ malmente a través de los tejidos linfoides y nolinfoides. Varios estudios han demostrado que el sitio hacia el cual los linfocitos recirculan es dependiente en parte de su estado de diferen­ ciación. Las células T nativas que no se han en­ contrado previamente con el antígeno recircu­ lan predominantemente desde el torrente san­ guíneo hacia los tejidos linfoides secundarios, mientras que las células T con memoria extra­ vasan dentro de los tejidos no-linfoides. Tanto es así que cuando las eélulas T con mem oria entran a los nódulos linfáticos de los sitios de inflamación, lo hacen principalmente a través de los linfáticos aferentes. La extravasación de las células T en los nó­ dulos linfáticos periféricos involucra la unión mediada por L-selectina, que es responsable de las interacciones débiles de los linfocitos con las vénulas endoteliales superiores especializa­ das. Los ligandos que intervienen en esta unión son ohgosacáridos cargados que están expresa­ dos en los receptores superficiales de las célu­ las e n d o te lia le s (C D 34 y G LY C A M e n tre otros). Además, los linfocitos usan L-selectina para unirse a otros contrarreceptores que tam­ bién expresan oligosacáridos apropiados. Tal

es el caso de la adresina vascular m ucosal (MAdCAM-1) expresada por las vénulas endo­ teliales superiores del tejido mucosal. N o se conocen bien los eventos de adhesión que ocurren en las interacciones firmes célula endotelial-célula T y en la migración transen­ dotelial a los nódulos linfáticos periféricos. La inducción de la firme adhesión de los linfocitos al endotelio de los nódulos linfáticos periféri­ cos parecería iniciarse con el disparo de una se­ ñal mediada por proteínas G, que puede ser in­ hibida por toxina pertussis. Las integrinas co­ mo LFA-1 (C D lla , CDl 8) pueden tam bién ju­ gar un rol, dado que se ha observado que los anticuerpos monoclonales contra LFA-1 inhi­ ben parcialmente la unión de los linfocitos a las vénulas endoteliales superiores de los nódulos linfáticos periféricos. Los neutrófilos también emplean L-selectina para su anclaje en el endotelio y, luego, usan L F A -1 en la estabilización de la adhesión y en la migración transendotelial. Reclutamiento de los linfocitos en los sitios inflamados Contrastando con los caminos norm ales de recirculación de las células T, hay otros meca­ nismos que intervienen en el reclutamiento de las poblaciones de las células T en los sitios extravasculares. Durante las respuestas inflam ato­ rias, las células T con memoria se acumulan en los tejidos. El endotelio del tejido inflam ado crónicam ente expresa receptores de adhesión involucrados en la extravasación de células T, muchos de los cuales, incluidos VCAM-1, Eselectina, y P-selectina, no son expresados por las células endoteliales del tejido hnfoide se­ cundario ni por el tejido normal no-inflamado. La expresión de estos receptores de adhesión resulta de la exposición del endotelio a citoqui­ nas pro-inflamatorias como el TN F-a e inter­ leuquina 1(3 (IL-lp). Estos receptores se unen a

226

Aspectos básicos de la inmunidad

sus contrarreceptores presentes en las células T y pueden facilitar así el reclutamiento selectivo de estas células en los sitios inflamados. La acumulación de células T se lleva a cabo siguiendo una serie de pasos. Primero, éstas se adhieren al endotelio, inicialm ente en form a débil y después más fuertemente. Luego, algu­ nas de las células T unidas transmigran entre las uniones celulares del endotelio. Estos pro­ cesos están controlados en forma separada por moléculas de adhesión, que contribuyen a la acumulación selectiva de subpoblaciones parti­ culares de células T en la lesión inflamatoria. Unión de las células T Es probable que la función de un número de receptores de adhesión sea la de facilitar la in­ filtración de las células T en los sitios de infla­ mación. Tales pares de receptores-contrarreceptores están esquem atizados en la figura 11-4. Como en el caso de L-selectina, las molé­ culas de adhesión CD44 y CD31 parecieran no requerir un paso de activación y, por consi­ guiente, estos receptores de adhesión constitu­ tivam ente activos podrían in iciar p o ten cial­ mente la unión de las células T en reposo a las células endoteliales. La m olécula CD44, una glucoproteína ex­ presada en diversos tipos celulares (células T, B, granulocitos, macrófagos, eritrocitos, célu­ las neurales, epiteliales y fibroblastos), une el citoesqueleto de ciertas células con la m atriz extracelular (colágeno, fibronectina, ácido hia­ lurónico) y, además, tiene otros ligandos como la adresina vascular específica de tejido mucosal (MAd CAM -1). Los contrarreceptores para C D 31 no son co­ nocidos, aunque se ha demostrado que pueden unirse a la heparina. D uran te la m igración transendotelial, la molécula C D 31 presente en las células inflamatorias puede también inter­ venir en adhesiones homotípicas por dimeriza­ ción a CD31 de las células endoteliales. Es probable que los receptores de adhesión cons­ titutivamente activos, al unirse a sus contrarre­ ceptores en las células endoteliales, disparen señales intracelulares que conduzcan a la acti­ vación de las integrinas y, luego, a la estabili­ zación de la unión célula endotelial-célula T. Por ejemplo, la unión de CD44 estimula un au­ mento en el calcio libre intracelular, la asocia­ ción de CD44 con el citoesqueleto, la agrega­ ción homotípica de las células T dependientes de L F A -1, y la unión celular a células endote­ liales en cultivo. En general, las uniones más estables entre los hnfocitos y las células endoteliales son las mediadas por las integrinas. Las m oléculas VLA-4 y LFA-1, que intervienen en esta unión

en condiciones estáticas, requieren ser activa; das para poder unirse a sus contrarreceptores. La unión no resulta de un aumento en la expre­ sión de estas moléculas por parte de los hnfoci­ tos, sino que parecería estar relacionada con cambios conformacionales en la estructura de las mismas. La m olécula de LFA-1 puede ser activada funcionalmente in vitro por estimulación de los linfocitos con ésteres de forbol, que activan la proteína quinasa C, así como por la ligazón de CD3 o por cultivo in vitro. En forma similar, VLA-4 puede ser activada por la ligazón de CD31 y presumiblemente por otras señales. Si bien VLA-4 y LFA-1 median la adhesión de los linfocitos a las células endoteliales, no todas las uniones pueden ser explicadas por las actividades de estas dos moléculas. El recono­ cimiento de VLA-4 por parte de VCAM-1 es el más importante en la unión de las células T a las células endoteliales activadas por citoqui­ nas. Si bien el receptor a 4 p7 es importante en la recirculación de las céluias T, no se conoce su rol en el reclutamiento de las células T en los sitios inflam atorios. Recientem ente se ha demostrado que el tejido sinovial inflamado, en comparación con la sangre periférica y el flui­ do sinovial, está enriquecido en células T que expresan a 4 ¡37. No se sabe aún si hay un re­ clutamiento selectivo de células T a 4 |37-t- des­ de la sangre periférica hacia el tejido sinovial, o si hay inducción de la expresión de este re­ ceptor sobre las células T extravasadas por un proceso de activación local. Tampoco se cono­ ce si las células endoteliales sinoviales expre­ san MAdCAM-1, un contrarreceptor de a 4 (37. La molécula LFA-1 de las células T activa­ das y de las en reposo, interviene en la adhe­ sión a las células endoteliales no estimuladas uniéndose a las moléculas de adhesión interce­ lular ICAM -1, ICA M -2 y, potencialm ente a ICAM-3. En la unión de los linfocitos interven­ drían también las moléculas de E-selectina y Pselectina, las que son expresadas por las células endoteliales activadas. La adhesión de una sub­ población de células T con memoria a E-selectina está mediada por el antígeno linfocitario cutáneo (CLA). En el caso de la unión del lin­ focito a P-selectina, no se conoce la naturaleza del contrarreceptor del linfocito si bien es muy p ro b ab le que esté re la c io n a d o al an tíg en o Lewis’^ sialidado. Otros receptores de adhesión, como la proteína vascular-1 (V A P-I) y CD2, podrían ser mediadores en las interacciones de la célula T con el endotelio en los sitios de in­ flamación. La molécula VAP-1 interviene en la unión de los linfocitos y está expresada en el endotelio de muchos tejidos tales como los nó­ dulos linfáticos periféricos normales y los in­ volucrados en la inflamación crónica.

Moléculas de adhesión La unión de los linfocitos al endotelio puede también ser facilitada por la unión de CD2 a sus contrarreceptores CD58 (LFA-3), CD59 o CD48. CD2 está expresada en todas las células T y cumple un rol accesorio durante la activa­ ción de la célula T, mientras que las células en­ doteliales expresan los tres contrarreceptores de CD2. Transmigración de la célula T En contraste con lo que sucede en la unión de la célula T a las células endoteliales, sólo un número limitado de receptores de adhesión intervienen en la migración transendotelial de las células T (fig. 11-4). El hecho de que no todas las células T adheridas transmigren a tra­ vés de la capa celular del endotelio indica que la adhesión y la migración son fenómenos se­ parados que estarían regulados por diferentes señales intracelulares. Por ejemplo, los agentes que elevan los niveles de AMPc, tanto en la células T como en las células endotehales, in­ hiben la migración transendotelial pero no la unión célula T-célula endotelial. Si bien no se sabe cuáles son las señales que conducen la m igración tran sen d o telial, es probable que ellas involucren la acción de proteína quinasa C, ya que el tratamiento de las células T con ésteres de forbol estim ula la m ovilidad y la migración transendotelial. Las señales que re­ gulan la migración transendotelial pueden ser inducidas por la unión de los receptores de ad­ hesión, como es el caso de LEA-1 y de VLA4, que envían señales coestimulatorias a las cé­ lulas T. En consecuencia, la ligazón de los re­ ceptores involucrados en la unión célula T-célula endotelial podría ser importante no sólo en el contacto célula-célula, sino también en la transmisión de las señales que alteran la capa­ cidad funcional de las células. Se ha demostrado, en experimentos de blo­ queo con anticuerpos monoclonales, que en la migración transendotelial de las células T uni­ das a las células endoteliales, intervienen LEA1 e ICAM-1, pero no VLA-4, VCAM-1, LEA3 ni E-selectina. Más aún, esto fue observado en células endotehales activadas con IL -ip en las cuales la interacción inicial estuvo mediada por uniones VLA-4 - VCAM-1. Estos resulta­ dos implican que un número de receptores de adhesión que intervienen en la adhesión inicial entre las células T y las endotehales no juegan necesariamente un rol principal durante la m i­ gración transendotelial subsiguiente. Resultados de experiencias in vivo indican que la molécula ICAM-1 interviene en la infil­ tración de los linfocitos dentro de la sinovia reum atoidea. En efecto, la administración de anticuerpo monoclonal específico para ICAM-

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1 a pacientes con artritis reumatoidea provoca una marcada modificación en la actividad de la enfermedad, presumiblemente por la alteración del tráfico de las células T en los tejidos. Por otra parte, la extravasación de los linfo­ citos en los sitios de inflamación, además de ser facilitada por la acción de las moléculas de adhesión, es aumentada por la elaboración de mediadores quemotácticos. Ciertas quemoquinas, que inducen específicamente la quemotaxis de poblaciones específicas de células T, también pueden activar receptores de la adhe­ sión de linfocitos. Marcadores de las células T migrantes La naturaleza de las células T que han extra­ vasado en los sitios inflamatorios ha sido objeto de diversos estudios. El tejido sinovial reum a­ toideo contiene poblaciones de células T que tienen el fenotipo de la célula con m em oria (CD4VCD45 ROVCD45 RA7CD29/L-selectina/CD7), y además expresan mayor número de ciertos receptores de adhesión. Estas células también expresan cieitas moléculas característi­ cas de las células T activadas. La acumulación perivascular de células T con memoria activa­ das también se ha encontrado en una variedad de procesos inflamatorios crónicos que involu­ cran a otros órganos. En tejidos inflamados y en fluidos sinoviales en la artritis reum atoidea, además de células T CD4+ se han encontrado células T CD8*. Por otra parte, las células T y8, aunque en un menor número, están significati­ vamente enriquecidas. Por lo tanto, los tejidos inflamados crónicamente, tales como la sinovia reumatoidea, están infiltrados por una variedad de diferentes poblaciones de células T. La acumulación de poblaciones específicas de células T en los tejidos inflamados podría ser explicada por el reclutamiento específico, retención, o la activación local y posterior dife­ renciación, o ambos. Tanto las subpoblaciones de células T CD4+ como las CD4^ tienen capacidad para m igrar a través del endotelio. Las células T yS son las que tienen m ayor capacidad m ig rato ria, si­ guiendo en la frecuencia de migración las célu­ las T a p CD8+ y luego las células T a p CD4+. La figura 11 -5 muestra los distintos fenotipos de las diferentes poblaciones migratorias de las células T. Las células T CD4“^ migratorias expresan el fe n o tip o CD45 R O V C D 29 (a u m .)/L E A -l (aum.)/VLA-2VVLA-4 (aum.)/VLA-5 (aum .)/ CD 44 (aum .)/L F A -3 (aum .)/C D 27 (d ism .)/ CD26 (aum.)/CD31 (dism.)/L-selectina-. Aparentemente las células T del torrente cir­ culatorio normal no requieren ser activadas pa­ ra migrar, dado que la mayoría de las células T

228

Aspectos básicos de la inmunidad

LFA-1/1CAM-1 # lCAM-2 VLA-4/VCAM-1 P-selectina / oligosacárido cargado Fig. 11-4. Izares de receptor - contrarreceptor que facilitan la extravasación de las células T hacia los sidos de in flam a­ ción.

CD4+ migratorias no expresan los marcadores de activación HLA-DR, CD25 y CD69. Es no­ table como todas, las células CD4+ migratorias expresan densidades igualmente aumentadas de VLA-4, CD44 y CD26, mientras que ninguna, o muy pocas, de las células T no-migratorias

expresan este fenotipo. Salvo en la falta de ex­ presión de los marcadores de activación, las cé­ lulas T CD4+ m igratorias tienen un fenotipo que recuerda al de las células T identificadas en los tejidos inflamados crónicamente. Es pro­ bable que la expresión de los m arcadores de

L-SDlcclina CD4-

GD45RO*

CD7dis

CD8-

CD45RA VLA-4ini

CD45RO+ VLA-5int CD26int CD58in

y/8RcT+

CD8-

Seleetina

I CD2r

CD 44ínt

CD8-f

CD44int^l^

lA - l in t :D 3 d is

> /

V

VLA-4* FLA-1int

C D45RO

/

VLA-5* RcTo/p CD4*

CD29+ VLA-4*

VLA-5*

CD45RA

RcTy/5 CD26int

F LA -lin t CD44int RcTo/p CDS*

F ig. 11-5. M igración transendotelial de las células T.

L-selectina

Moléculas de adhesión activación y la retención dentro de los tejidos sean consecuencia de fenóm enos posteriores que ocurren en los sitios de inflamación. Si bien la migración de las células T norma­ les, aparte de la interacción con el endotelio, no requiere activación específica, la estimulación puede aumentar la capacidad migratoria de al­ gunas células T adicionales. Sin embargo, sólo hay diferencias modestas en los fenotipos de las células T que migran después de haber sido activadas. Los resultados de investigaciones recientes insintian que las células T CD4+ con memoria m igran en form a p re fere n c ial sin ten er en cuenta su estado de activación. Si bien la acti­ vación aumenta el número de las células que migran, parecería no ser necesaria para que la mayoría de las células crucen las barreras en­ doteliales. En concluisión, la capacidad para la m igra­ ción transendotelial es una propiedad intrínseca de las células con memoria que está algo au­ mentada por las señales de activación. Transmigración de las células jb En los tejidos inflamatorios crónicos, además de las células T CD4+, hay un número reducido de células CD4". Entre las últimas están las que son TCR ap-^/CDS* como las TCR yS/CDS^ y CD 8 “. Todas estas poblaciones contienen célu­ las migratorias en mayor frecuencia que las cé­ lulas T a p CD4+. Se ha establecido el fenotipo de estas células migratorias CD4 . La mayoría (> 80%) de las células T TCR aP-h/CD 8 + con una capacidad m igratoria transendotelial son CD45 R0+, no obstante algunas células T CD45 RA+ (< 40%) también migran. Las células mi­ gratorias también poseen estas características: C D 29 (a u m .)/C D 2 6 + /L -s e le c tin a -/L E A -l (aum .)/C D 44 (aum .)/V L A -4V V L A -5" (fig. 11-5). Además, como ocurre con la subpobla­ ción CD4+, el fenotipo de las células T C D 8 -Imigratorias no es afectado por la activación o por la estimulación del endotelio por citoqui­ nas. La intensidad de la expresión de las p l in­ tegrinas (VLAs) en las células T CD 8 + migra­ torias es menor que en las células T CD4+. Da­ do que las p i integrinas son importantes m e­ diadores de las in teraccio n es celulares con componentes de matrices extracelulares, la lo­ calización preferencial de las células T CD4+ en muchos tejidos inflamados podría reflejar su retención selectiva en los tejidos que poseen expresión aumentada de los receptores de pi integrinas. A este respecto, se ha observado que las células T a p CD 8 + no son retenidas en los sitios de hipersensibilidad de tipo retardada, com o efe c tiv a m e n te lo son las c élu las a P CD4+. La expresión diferencial de las pl inte­

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grinas sobre las células T aP CD4+ y CD 8 + po­ drían contribuir a este fenómeno. Aunque el rol de las células T TCR 7 8 “^ no es totalm ente conocido, estas parecen ser funda­ mentales en la vigilancia inmune. En el hombre, estas células, que recirculan preferencialmente a través de los órganos no-linfoides, se acumulan en los tejidos inflamados, incluyendo la sinovia reumatoidea. No se sabe aún si la presencia de las células T TCR 7 8 ' en los diferentes tejidos es debido al aumento de la capacidad migratoria transendotelial de estas células. Las células T TCR y8 ^ contienen una pobla­ ción principal CD4 /C D 8 “, y una menor CD4/CD 8 *, y también expresan CD45 RO y CD45 RA (fig. 11-5). Todas las células T yS expresan intensamente CD29 (aum.). Algunas de las cé­ lulas T yS migratorias expresan tanto CD45 RO como CD45 RA, sugiriendo que ellas pueden haber sido recientemente activadas y están en el proceso de diferenciación. Por consiguiente, para las células T y5, las células T CD45 RA pueden migrar efectivamente, a diferencia de las células T aP migratorias, las cuales son en su mayoría CD45 RA“. Esto es consistente con la observación de que la sinovia reum atoidea contiene células T TCR y8+/CD45 RA+. Las cé­ lulas T y 8 de la sangre periférica también ex­ presan en forma intensa y uniforme LFA-1 y CD44; por lo tanto estos dos m arcadores no distinguen a las células migratorias de las otras poblaciones. A diferencia de otras poblaciones migratorias de células T, muchas células T yS migratorias expresan intensamente L-selectina. Si bien en el bovino las células T y 8 usan L-selectina al unir­ se a las células endoteliales de los nódulos lin­ fáticos periféricos, no se sabe si en el hombre las células T y8 pueden utilizarla para la m igra­ ción transendotelial. Las células T TCR y5+, de­ bido a la expresión de L-selectina, podrían estar involucradas en la iniciación de las respuestas inflamatorias. Mediante un mecanismo similar al usado por los neutrófilos, la m olécula de L-selectina podría mediar las interacciones ini­ ciales de las células T y8 con el endotelio cuan­ do la inflamación no está acentuada, y el flujo sanguíneo está intacto. Subsiguientemente, la estabilización de la adhesión por los receptores de adhesión para las integrinas podría permitir la migración transendotelial de las células T y5 hacia el tejido. La presencia de estas células en el tejido y la activación de las mismas, podría inducir alteraciones fenotípicas y funcionales en el endotelio, resultando en una disminución del flujo sanguíneo, un aumento en la expresión de las moléculas de adhesión, o en la elaboración de quemoquinas, o ambos. Tales condiciones podrían permitir la extravasación de las células T TCR a p “^ con capacidad migratoria y la acu­

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Aspectos básicos de la inmunidad

mulación de las mismas en el tejido inflamado y en los compartimentos fluidos. En resumen, la migración transendotelial es una propiedad intrínseca de distintas subpobla­ ciones de células T que tienen características fe­ notípicas específicas. Una variedad de recepto­ res de adhesión desempeña un papel central en el reclutamiento selectivo de estas poblaciones celulares en los sitios inflamatorios y, por con­ siguiente, en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias crónicas. Durante las condiciones inflamatorias, las moléculas de adhesión inter­ vienen en las interacciones de los linfocitos con las células endoteliales y con las moléculas de la matriz extracelular durante la migración tran­ sendotelial, y en el envío de señales coestimulatorias involucradas en la activación de estas cé­ lulas, Las poblaciones específicas de las células T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar a medida que evoluciona la lesión inflamatoria. La perpetuación de las respuestas está dada por

la orquestación de la entrada de subpoblaciones específicas de células T en los sitios inflamato­ rios, y ofrece muchos blancos para las potencia­ les intervenciones terapéuticas. BIBLIOGRAFÍA O ppenheim er- M arks N, Lipsky PE. Transendothelial migration of T cells in chronic inflam m ation, Im m unol, T o ­ day 1994; 2: 58-64, Bevilacqua MP, Endothelial - leukocyte adhesión m o lecu ­ les. In Annu. R ev. Im niunol,, ed. Paul W E , 1993, 11:767804. A nnual R eview s Inc. Shevach EIM. A ccesory m olecules. In Fundam ental Im m unology, third edition, ed. Paul W E, 1993, 15: 531-575. R aven Press Ltd., N ew York. A bbas AK, Lichtm an AH, Pober JS. M olecular basis o f T cell antigen reco g n itio n and activation. In C ellu lar and M o lec u lar Iram u n o io g y , ed. W o nsiew ics M J, 1991, 7: 138-167. W S S aunders C o., Philadelphia. W ard PA , M arks R M . T he acute in flam m ato ry reactio n . C urrent O pinion in Im m unol,, 1989, 2: 5-9, M iiller-E berhard HJ, Innata im m unity. C urrent O pinion in Im m unol, 198 9 ,2 : 3-4.

Citoquinas

ELIDA ALVAREZ

INTRODUCCIÓN La respuesta inmune es el fruto de la interac­ ción entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B (LB) y los monocitos/macrófagos. Esta coope­ ración conduce a la proliferación celular, la producción de anticuerpos (Ac), la diferencia­ ción de células citotóxicas, el aumento de la ac­ tividad microbicida y la diferenciación hematopoyética. La regulación de esta compleja red de res­ puestas inm unitarias e inflamatorias depende sobre todo de la comunicación entre las células participantes e interactuantes, la cual se logra por medio de moléculas proteicas solubles que se denominan citoquinas. En la inmunidad natural la mayoría de estas proteínas son elaboradas por monocitos y fue­ ron por ello denominadas monoquinas. En este caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co­ mo respuesta directa a los microorganismos o también como consecuencia de estímulos indu­ cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a su vez estimulan la secreción de factores solu­ bles por parte de los monocitos/macrófagos. La mayoría de las citoquinas producidas en la respuesta inmune específica son elaboradas por los LT y por ello tales moléculas son cono­ cidas como linfoquinas. Las células T produ­ cen una serie de moléculas que sirven en pri­ mera instancia para regular el crecimiento y la diferenciación de varias poblaciones linfocita­ rias y por ello son factores esenciales de la res­ puesta T dependiente. También producen sus­ tancias que activan y regulan las células que participan de las respuestas inílamatorias/efectoras ejercidas por macrófagos/mononucleares, neutrófilos y eosinófilos.

12 Adem ás, se producen otras citoquinas que estimulan el crecimiento y la diferenciación de células indiferenciadas de médula ósea las que son denominadas factores estimulantes de co­ lonias (CSFs). Por lo expuesto, es necesario tener presente que las interacciones de las citoquinas deben ser analizadas como un todo integrado en el que se incluyan las relaciones de las células del sistema inmune con células ubicadas fuera de dicho sistema y también con las células que di­ rigen y controlan el proceso hematopoyético. Los prim eros estudios sobre citoquinas se extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la descripción de num erosos factores proteicos producidos por varios tipos celulares. C ada uno de ellos m ediaban alguna función b iológica particular definida por ensayos realizados “in vitro”. Una segunda fase de la investigación, desa­ rrollada a partir de 1970, involucró la purifica­ ción parcial y la caracterización de m uchas ci­ toquinas individuales junto con la producción de antisueros neutralizantes de su acción. En este período, distintos investigadores estudia­ ron diferentes efectos biológicos, los cuales en realidad eran mediados por las mismas molécu­ las. Por ejem plo, el interferón j (IFN y) fue descubierto por equipos de virólogos com o un producto derivado de los LT, el cual poseía propiedades antivirales e independientem ente fue descubierto por los inmunólogos también como un factor producido por los LT, el que actuaba como un activador de las funciones del macrófago. Hechos similares acontecieron con la IL-1, descubierta como un estimulador endó­ geno, mediador del aumento de la temperatura corporal el cual se producía en respuesta a in-

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Aspectos básicos de la inmunidad

mulación de las mismas en el tejido inflamado y en los compartimentos fluidos. En resumen, la migración transendotelial es una propiedad intrínseca de distintas subpobla­ ciones de células T que tienen características fe­ notípicas específicas. Una variedad de recepto­ res de adhesión desempeña un papel central en el reclutamiento selectivo de estas poblaciones celulares en los sitios inflamatorios y, por con­ siguiente, en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias crónicas. Durante las condiciones inflamatorias, las moléculas de adhesión inter­ vienen en las interacciones de los linfocitos con las células endoteliales y con las moléculas de la matriz extracelular durante la migración tran­ sendotelial, y en el envío de señales coestimulatorias involucradas en la activación de estas cé­ lulas, Las poblaciones específicas de las células T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar a medida que evoluciona la lesión inflamatoria. La perpetuación de las respuestas está dada por

la orquestación de la entrada de subpoblaciones específicas de células T en los sitios inflamato­ rios, y ofrece muchos blancos para las potencia­ les intervenciones terapéuticas. BIBLIOGRAFÍA O ppenheim er- Marlcs N, Lipsky PE. Transendotlielial migration of T cells in chronic inflam m ation, Im m unol, T o ­ day 1994; 2: 58-64, Bevilacqua MP, Endothelial - leukocyte adhesión m o lecu ­ les, In Annu, R ev, Im niunol,, ed. Paul W E , 1993, 11:767804, A nnual R eview s Inc. Shevach EM . A ccesory m olecules. In Fundam ental Im m unology, third edition, ed, Paul W E, 1993, 15: 531-575, R aven Press Ltd,, N ew York, A bbas AK, Lichtm an AH, Pober JS, M olecular basis o f T cell antigen reco g n itio n and activation. In C ellu lar and M o lec u lar Iram u n o io g y , ed. W o nsiew ics M J, 1991, 7: 138-167, W S S aunders C o,, Philadelphia. W ard PA , M arks R M . T he acute in flam m ato ry reactio n . C urrent O pinion in Im m unol,, 1989, 2: 5-9, M iiller-E berhard HJ, Innate im m unity. C urrent O pinion in Im m unol, 198 9 ,2 : 3-4.

Citoquinas

ELIDA ALVAREZ

INTRODUCCIÓN La respuesta inmune es el fruto de la interac­ ción entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B (LB) y los monocitos/macrófagos. Esta coope­ ración conduce a la proliferación celular, la producción de anticuerpos (Ac), la diferencia­ ción de células citotóxicas, el aumento de la ac­ tividad microbicida y la diferenciación hematopoyética. La regulación de esta compleja red de res­ puestas inm unitarias e inflamatorias depende sobre todo de la comunicación entre las células participantes e interactuantes, la cual se logra por medio de moléculas proteicas solubles que se denominan citoquinas. En la inmunidad natural la mayoría de estas proteínas son elaboradas por monocitos y fue­ ron por ello denominadas monoquinas. En este caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co­ mo respuesta directa a los microorganismos o también como consecuencia de estímulos indu­ cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a su vez estimulan la secreción de factores solu­ bles por parte de los monocitos/macrófagos. La mayoría de las citoquinas producidas en la respuesta inmune específica son elaboradas por los LT y por ello tales moléculas son cono­ cidas como linfoquinas. Las células T produ­ cen una serie de moléculas que sirven en pri­ mera instancia para regular el crecimiento y la diferenciación de varias poblaciones linfocita­ rias y por ello son factores esenciales de la res­ puesta T dependiente. También producen sus­ tancias que activan y regulan las células que participan de las respuestas inflamatorias/efectoras ejercidas por macrófagos/mononucleares, neutrófilos y eosinófilos.

12 Adem ás, se producen otras citoquinas que estimulan el crecimiento y la diferenciación de células indiferenciadas de médula ósea las que son denominadas factores estim ulantes de co­ lonias (CSEs). Por lo expuesto, es necesario tener presente que las interacciones de las citoquinas deben ser analizadas como un todo integrado en el que se incluyan las relaciones de las células del sistema inmune con células ubicadas fuera de dicho sistema y también con las células que di­ rigen y controlan el proceso hematopoyético. Los prim eros estudios sobre citoquinas se extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la descripción de num erosos factores proteicos producidos por varios tipos celulares. C ada uno de ellos m ediaban alguna función b iológica particular definida por ensayos realizados “in vitro”. Una segunda fase de la investigación, desa­ rrollada a partir de 1970, involucró la purifica­ ción parcial y la caracterización de m uchas ci­ toquinas individuales junto con la producción de antisueros neutralizantes de su acción. En este período, distintos investigadores estudia­ ron diferentes efectos biológicos, los cuales en realidad eran mediados por las mismas molécu­ las. Por ejem plo, el interferón j (IFN y) fue descubierto por equipos de virólogos com o un producto derivado de los LT, el cual poseía propiedades antivirales e independientem ente fue descubierto por los inmunólogos también como un factor producido por los LT, el que actuaba como un activador de las funciones del macrófago. Hechos similares acontecieron con la IL -I, descubierta como un estimulador endó­ geno, mediador del aumento de la temperatura corporal el cual se producía en respuesta a in­

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Aspectos básicos de la inmunidad

fecciones bacterianas mientras que los inmunó­ logos lo revelaban como un factor co-estimulante de la proliferación de células tímicas. Es importante destacar que en esta etapa la carac­ terización biológica y química fue un logro de las investigaciones inmunológicas. Cabe agre­ gar que, como consecuencia de los estudios realizados en estos tiempos, surgió la idea de que las citoquinas eran principalmente produci­ das por leucocitos con el fin de m antener en prim era instancia relaciones intercelulares y por ello surgió la idea de denominarlas interleuquinas(IL). La era de mayores avances en la investiga­ ción de las citoquinas com enzó en 1.980, las mismas fueron entonces caracterizadas a través del clonado molecular, la expresión en forma individual de cada una de ellas y por la obten­ ción de anticuerpos monoespecíficos (frecuen­ temente monoclonales) contra las mismas, los que permitieron neutralizar su acción. Con es­ tos reactivos y el desarrollo de nuevas estrate­ gias se logró la identificación de la estructura y propiedades de cada citoquina en particular. El entendimiento global de los complejos patrones de estímulos inducidos, así como la participa­ ción en las diferentes fases y mecanismos de la respuesta inmune en los que estos factores par­ ticipan podrá obtenerse gracias al desarrollo de nuevas estrategias de estudios con la utiliza­ ción de citoquinas recom binantes, anim ales transgénicos para la expresión de sus genes y animales obtenidos por tecnología “knock-out” en los cuales se consigue la falta de expresión de dichas moléculas. Los estudios emprendidos en los últimos 25 años han permitido reconocer que estas sustan­ cias no sólo afectan la respuesta inmune, la he­ matopoyesis y la integración del sistema inm u­ ne con el sistem a neuroendocrino, sino que también están im plicadas en la fisiopatología de un gran número enfermedades entre otras el cáncer, las inmunodeficiencias, las enfermeda­ des autoinmunes y los procesos infecciosos. Un mejor entendimiento de su accionar permitirá el uso de las citoquinas como potenciales agen­ tes bioterapéuticos así com o tam bién lo p o ­ drían ser la utilización de formas solubles de sus receptores o anticuerpos monoclonales es­ pecíficos y el desarrollo de biomoléculas ago­ nistas o antagonistas de sus efectos. Propiedades generales Si bien las citoquinas representan un conjun­ to de moléculas muy diversas comparten una serie de propiedades que las definen desde el punto de vista biológico. Estas sustancias son glucoproteínas o proteínas de bajo peso mole­ cular (PM), generalmente 8-75 kD, las que son

producidas durante la fase efectora de la res­ puesta inmune tanto natural como de la especí­ fica, con el fin de mediar y regular la amplitud y duración de las respuestas inmune e inflama­ toria. La producción de las citoquinas está caracte­ rizada por producirse en un evento breve y autolimitado. No se encuentran preelaboradas en compartimentos celulares sino que la síntesis se inicia como consecuencia de acciones bre­ ves que implican la transcripción y obtención del ARN mensajero (ARNm), el cual es muy inestable. Las secuencias ricas en poli UAUU en las regiones 3 ’no traducidas de los ARNm de muchas citoquinas se relacionan de manera directa con una rápida degradación por aumen­ to de la sensibihdad a la acción de nucleasas. Estos hechos aseguran que la producción de las citoquinas sea un hecho trasciente. Se observó además que algunas citoquinas poseen un me­ canismo postranscripcional que permite el con­ trol de su producción, por ejemplo, la libera­ ción de enzimas que transforman los productos activos en inactivos. La síntesis de una citoquina en particular puede estar influenciadas por la síntesis de otras produciéndose entonces una reacción en cascada. Se generan así una serie de circuitos regulatorios tanto para el sistema inmune como también para el sistema inflamatorio. Otro hecho que caracteriza a estas moléculas es que una misma citoquina pueden ser produ­ cidas por múltiples tipos celulares y a su vez cada una de ellas pueden actuar sobre células d ife re n te s, e sta p ro p ie d a d es d e n o m in a d a pleiotropismo. Las acciones de las citoquinas pueden resul­ tar aún sobre el mismo blanco en diferentes efectos según el tiempo y la concentración del factor secretado. Existe una considerable su­ perposición y redundancia entre las mismas da­ do que ciertos efectos son compartidos entre ellas. La acción de una citoquina puede en algunos casos interactuar con la de otra produciéndose efectos sinérgicos en algunas ocasiones y an­ tagónicos en otras. Tal como ocurre con las hormonas, la acción de las citoquinas se produce por unión a recep­ tores específicos (R) presentes en las superfi­ cies celulares. Sin embargo, a diferencia de las hormonas las citoquinas ejercen su acción a ni­ vel local, activando receptores presentes en las mismas células elaboradoras, ejerciéndose una acción autocrina o interactuando con recepto­ res de células que se encuentran en la cercanía ejerciendo una efecto paracrino. Sólo en cier­ tas ocasiones puede hallarse un efecto sobre cé­ lulas distantes en el caso en los que las concen­ traciones liberadas hacia el torrente circulatorio

Citoquinas son muy altas, pudiendo ejercer entonces una acción endocrina. Los receptores para citoquinas pertenecen a diferentes familias, pero todos ellos se caracte­ rizan por ser específicos y de muy alta afini­ dad po r sus lig a n d o s, p resen ta n K d e n tre Como consecuencia de ello sólo muy pequeñas cantidades de citoquinas (con­ centraciones femtomolares) son requeridas para gatillar el efecto biológico. La expresión celu­ lar de estos receptores es regulada a través de señales específicas que pueden ser generadas por otra o aún la misma citoquina, lo cual per­ mite amplificar una señal positiva o generar un efecto de retroalimentación negativa. La respuesta celular a las citoquinas es lenta (hs) dado que requiere de la form ación del ARNm y de la posterior síntesis de las proteí­ nas. Luego la señal generada parece ser que es­ timula la unión de factores nucleares específi­ cos que a su vez regulan la transcripción. D ife­ rentes mecanismos llevan a la transcripción ge­ nética y a la síntesis de las proteínas, aunque hasta el presente para la mayoría de ellas sigue siendo desconocido el verdadero camino de ac­ tivación celular. Clasificación funcional de las citoquinas De acuerdo con lo expuesto en el desarrollo de la introducción y las propiedades generales de las citoquinas, se deduce que los roles fisio­ lógicos atribuibles son de singular importancia. Todos ellos se encuentran interconectados de manera tal que, a pesar del amplio éxito logra­ do en la clonación y el conocimiento de las se­ cuencias nucleotídicas y aminoacídicas de cada factor en particular y de muchos de sus recep­ tores, aún permanecen muchos interrogantes en relación con las vías a través de las cuales se integran las células blanco y la manera en que los múltiples estím ulos recibidos se transfor­ man en una respuesta eficiente. Desde el punto de vista de una mejor inter­ pretación de sus efectos, podemos agruparlas en diferentes categorías teniendo en cuenta las principales acciones ejercidas por cada una en especial pero en realidad la mayoría de ellas puede ser incluida en más de una de las catego­ rías indicadas, - Citoquinas m.ediadoras de la respuesta in ­ m une innata, secretadas en respuesta a agen­ tes infecciosos capaces de activar a los fa g o ci­ tos mononucleares. Este conjunto de citoquinas tiene fundam entalm ente acción contra las in ­ fecciones virales y/o aquellas que se inician por procesos inflamatorios y que confieren protec­ ción contra las infecciones bacterianas, - Citoquinas reguladoras de la activación, el crecimiento y la diferenciación linfocitaria,

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las que son producidas en la respuesta in m u n e específica. Ejercen una acción reguladora sobre el crecimiento y la diferenciación de los linfo­ citos a la vez que son mediadores de las fases de activación de la respuesta específica, tanto de la respuesta inmvme humoral como celular. - Citoquinas reguladoras de las respuestas efectoras e inflamatorias producida como con­ secuencia de una respuesta inm une específica. Estas citoquinas derivan fundamentalmente de los LT CD4+ y CD8+, permiten activar los m e­ canismos efectores no específicos. Tienen un rol importante en la fase efectora mediada por células. - Citoquinas que actúan como factores estim ulatorios de la hem atopoyesis y del cre c i­ miento y de la diferenciación de los leucocitos inmaduros. Dado que en las respuestas inm une e inflamatoria se pi'oduce una utilización y con­ sumo de células, éstas deben ser continuamente reemplazadas. Las nuevas células son produci­ das como consecuencia de una progresiva ex­ presión y diferenciación a partir de células plu­ ripotenciales {stem cells). Las citoquinas que participan de este accionar (CSFs) estimulan la formación de colonias celulares en la m édula ósea (MO). La denominación de cada u n a de ellas refleja el tipo de colonias que son capaces de inducir in vitro. Es interesante observar que la mayoría de los CSFs están localizados en un conjunto de genes ubicados sobre el crom oso­ ma 5 humano y II nmrino. En el cuadro 12-1 se ejemplifica cada una de las categorías enun­ ciadas. Receptores de citoquinas Las propiedades y efectos producidos p o r las citoquinas se explican por la estructura y la dis­ tribución celular de los receptores de m em bra­ na capaces de unirlas específicamente. A pesar del hecho de cjue los mecanismos im plicados en las señales de transducción no están aún aclarados, existe abundante información en re­ lación a las estructuras de la mayoría de estos receptores. La principal función del receptor es recono­ cer específicam ente a una citoquina d a d a y convertir esa interacción en una señal intracelu­ lar adecuada. Todos los receptores de citoquinas co n o ci­ dos son glucoproteínás, constituidos por lo m e­ nos por tres regiones. Un dominio extracelular' el cual provee de la región de reconocimiento para la citoquina y genera la especificidad de unión para el ligando; una región transmembra­ na expandido a lo largo de ía biocapa lipídica de la membrana plasmática y el dominio intra­ c e lu la r resp o n sab le de g en erar la se ñ a l de transducción; esta íiltim a región puede tener

234

Aspectos básicos de la inmunidad

Cuadro 12-1. Clasificación funcional de las citoquinas que participan de la respuesta inmu­ ne e inflamatoria l 'i iiu i p ü ie s circiiin c.M e d i a d o r e s t l e li! r o s p u e s u i i n i i a l a

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R egulación de la activación, del crecim iento y de la diferen­ ciación de los linfocitos B y T .

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A ctivación de m ecanism os efectores

IFN-y, TN PP, IL-.5, IL-12

Estim ulación del crecim iento y la diferenciación de células inm aduras

IL-3, IL-7, IL-9, I L - I l , G M -G SF, G -C SF, M -C SF

actividad enzimática intrínseca o, en otros ca­ sos, puede tener capacidad para unirse a otras moléculas que son responsables de crear la se­ ñal intracelular en respuesta a la unión de la ci­ toquina al dominio extracelular del receptor. En la actualidad es bien conocido que algunos receptores de citoquinas están constituidos por una simple cadena polipetídica, la cual cumple todas las funciones y en cambio otros pueden ser receptores constituidos por complejos multicatenarios, donde algunas cadenas efectúan la unión específica del ligante y otra es la encar­ gada de producir la señal de transducción que lleve a la respuesta celular, por lo general esta última cadena es compartida por diferentes uni­ dades receptoras (fig, 12-1). Dado que los genes de un gran número de receptores para citoquinas han sido clonados, lográndose la expresión de las proteínas y obte­ niéndose la secuencia de las mismas, se llegó a determ inar las similitudes estructurales entre ellas y se estableció la existencia de secuencias conservadas. En base a tales unidades estructu­ rales o secuencias homólogas los receptores de citoquinas fueron agrupados en cinco superfamilias (fig. 12-2). El primer grupo lo constituyen los receptores que pertenecen a la su p erfa m ilia de las Igs. Estos receptores están caracterizados por un número variable de dominios Ig. símil y pre­ sentar actividad tirosin quinasa. A esta familia pertenecen los receptores de IL-1 de tipo I, MCSF, la subunidad a del IL-6R, la subunidad P del PDGE y varios miembros de los EGE. La segunda familia es la más numerosa, de­ nominada superfamilia de receptores hem a­ topoyéticos o receptores de tipo I. Estos recep­ tores están caracterizados por la presencia de residuos conservados de cisteína y de una se­ cuencia de hom ología constituida por cinco aminoácidos característicos, la unidad Trp-Ser~ X-Trp-Ser (WSXWS), secuencia referida como unidad “WS”, donde X es variable y representa a cualquier aminoácido. Esta unidad WS se en­ cuentra localizada próxim a al dominio trans­

membránico. Esta región funcionaría como el principal sitio de unión para el ligando.Todos los receptores de citoquinas que utilizan esta unidad interactúan con citoquinas que compar­ ten en su secuencia cuatro regiones a hélice e incluyen a los receptores de EPO, cadenas |3 y Y del IL-2R, cadenas a y p del IL-3R, cadena a del IL-4, cadenas a y p del IL-5R, IL-6R, ca­ dena a y 7 del IL-7R, cadena P y y del IL-I5R, GM-CSER, G-CSER, cadena gp 130, LIE, etc. En el caso particular del receptor de IL-6 se da el hecho de que en una misma cadena pohpetídica se establece un dominio similar a las Igs. y otro de unidad WS. El tercer grupo fue denominado de la super­ familia de los IFN s o receptores de Tipo II, incluye a los IFN de tipo I y de tipo II. Su rela­ ción estructural ha sido definida en relación con la secuencia aminoacídica. Los miembros de esta familia comparten una organización si­ m ilar, con un dom inio que presenta una se­ cuencia de 210 aa, el cual contiene un par de cisteínas conservadas en la región N terminal y otro en al región C terminal. Esta familia pare­ cería estar distancialmente relacionada con los receptores de tipo I. Estudios de transfección de los distintos genes para receptores de IFN humanos indican que probablemente el recep­ tor funcional para IFN requiera de cadenas adi­ cionales (IFNRT: cadena transductora del re­ ceptor de IFN ), lo que gen eraría un nuevo ejemplo de receptores multicatenarios. La cuarta familia corresponde a aquellos re­ ceptores relacionados estructuralmente con los dos receptores del TNF, tanto p55 como p75, razón por la cual se denominan superfamilia de receptores del TNF. A ella pertenecen ade­ más del TNFR, el receptor de baja afinidad pa­ ra el NGF (factor de crecimiento neuronal), la proteína codificada por el gen Fas y glucopro­ teínas transmembránicas que incluyen a CD40, CD27, CD30, 0X 4 0 y 4-lB B . Esta fam ilia está caracterizada por la presencia de cuatro domi­ nios ricos en residuos repetitivos de cisteínas, la localización de los mismos está altamente

Citoquinas conservada sugiriendo que habrían derivado de un gen ancestral común. Son también denomi­ nados de Tipo III. Finalmente, los integrantes de la quinta famiha presentan homología estructural con pro­ teínas transmembránicas caracterizadas por la presencia de siete regiones a hélice que actúan como receptores de alta afinidad para quim io­ quinas e IL-8. Esta unidad funcional fue origi­ nalmente encontrada en los receptores adrenérgicos y en la rodopsina de la retina, está am­ pliamente compartida por receptores unidos a proteínas heterotrim éricas que se acoplan a proteína G {G-copulatedproteins). De manera similar, estudios de secuencia­ ción del dominio intracitoplasmático ha perm i­ tido encontrar regiones altamente conservadas. Por ejemplo, existen estrechas regiones consti­ tuidas por tres residuos aminoacídicos que es­ tán altamente conservados entre los receptores para el G-CSF y la cadena gpl30 del receptor de IL-6, de los cuales uno o dos son críticos pa­ ra la señal de transducción. Otra característica de los receptores de citoquinas es la aparición de formas solubles, las que aparecen por clivaje proteolítico del recep­ tor de membrana o por empalme (“splicing”) alternativo de los ARNm. Estas formas poseen capacidad para asociarse a sus ligandos especí­ ficos pudiendo regular sus efectos biológicos. De los hallazgos encontrados hasta el pre­ sente es de esperar que la mayoría de los recep­ tores para citoquinas estén constituidos por dos o m ás cadenas polipeptídicas y constituyan complejos multicatenarios. Entre los distintos complejos multicatenarios encontramos las si­ guientes asociaciones; a. com plejo IL-2R: las acciones de la IL-2 son iniciadas por unión a receptores de su­ perficie que están constituidos por tres cade­ nas a , ¡3 y y. Las cadenas fi y y pertenecen a la superfam ilia de receptores ele tipo I, en cambio la cadena a no pertenece a ninguna familia de las hasta ahora establecida. La ca­ dena y se asocia a los receptores de 11-4, IL7, IL-9 e I L l5 y es requerida para enviar la señal de transducción intracelular. b. complejo IL -6R ; está constituido por una cadena de SOkD que actúa como receptor propiamente dicho la cual interactúa con un segundo componente la gp 130 kD, molécu­ la de transmembrana que contiene dominios Ig símil y la unidad WS (de igual manera que el Re de IL-6 propiamente dicho). La segunda cadena es requerida para generar el receptor de alta afinidad y la señal de trans­ ducción intracitoplasmática. Está comparti­ da por otros receptores por ejemplo, IL -ll, CNTF, oncostatína M (OSM) y LIE.

235

complejo IL-3R, IL-5R y GM-CSFR: los receptores para estas citoquinas consisten en dos componentes, a y ¡3, ambos miembros de la superfamilia de tipo I. Cada una de ellas )osee una cadena a específica y una cadena 3 de 150 líD que permite la respuesta celu­ lar. Esta estructura m ulticatenaria permite explicar los resultados de com petencia de unión y la similitud en las acciones biológi­ cas ejercidas por las citoquinas indicadas. Con excepción del M-CSF y c-kit, factores de crecimiento cuyos receptores poseen tirosin-quinasas, los eventos moleculares involucrados en generar las señales intracelulares por acción de las citoquinas no están completamente entendi­ dos. Dado el esfuerzo de numerosos laboratorios es de esperar que en un futuro cercano sean completamente esclarecidos. Las similitudes es­ tructurales entre los receptores de citoquinas po­ dría imphear que los mismos utilicen mecanis­ mos comunes o estrechamente relacionados para medial' la señal de transducción intracelular. Ma­ yores consideraciones estructurales y funciona­ les serán expuestas en los próximos párrafos. A continuación se describirán las caracterís­ ticas estructurales y funcionales más importan­ tes de las citoquinas de mayor interés que parti­ cipan de las distintas fases de la respuesta in­ mune, cuyas principales propiedades inmunobiológicas se presentan en el cuadro 12-2. INTERLEUQUINAS Interleuquina 1 (IL-1) Originalmente se pensó que la IL-1 era pro­ ducida por la serie monoeítica/macrofágica. No obstante, la IL-1 puede ser producida por una variedad de otros tipos celulares que incluyen queratinocitos de la piel, células endoteliales, células mesangiales renales, astrocitos, células gliales, células ciliares neuronales, células NK, células del epitelio córneo, células dendríticas y células de Kuffer. Sin embargo, la principal fuente de produc­ ción de la IL-1 son los monocitos/macrófagos en respuesta a una variedad de estím ulos que van desde productos bacterianos ta le s como LPS, la acción de otras citoquinas por ejemplo, TNF o la misma IL-1, el efecto de adyuvantes hasta cristales de urato o síhca. Dado que esta citoquina posee una variedad muy amplia de órganos “blanco”, desencadena una serie muy amplia de efectos. Inicialmente la IL-1 fue descrita acorde con sus funciones, de allí que fuese denom inada anteriorm ente Factor activador de leucocitos (LAF), Pirógeno endógeno (EP), Factor de células mononuclea-

236

Aspectos básicos de la inmunidad

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Superfamilia de re cep to res h em a to p o y ético s

Superfam ilia del TNF

Superfam ilia d e r e cep to res d e IFN

Superfam ilia d e recep to res u nid os a p roteína G

Fig. 12-2. R epresentación esquem ática de las diferentes fam ilias de receptores para citoquinas.

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•rf CN| Ó "‘, PTK72 y ZAP-70 probable­ mente participen tam bién en forma activa en los procesos de fosforilación de proteínas que intervienen en la activación del linfocito B. Un mecanismo de fosforilación que ju eg a un rol importante en la transmisión de señales me­ diadas por el receptor del linfocito B, cuando se produce su entrecruzamiento por antígeno o anticuerpo anti-inmunoglobulina, es el que se inicia con la hidrólisis de fosfatidil inositol di­ fosfato (PIP2) por fosfolipasa C (PLCyl), que lleva a la producción de inositol trifosfato (IP3) y diacilglieerol (DAG). El IP3 formado estim u­ la la salida de Ca^+ del retículo endoplasmático e influjo de Ca^+ desde el exterior de la célula a través de canales transmembránicos y activa a su vez una proteinquinasa dependiente de Ca^+ y calmodulina (Ca^VCaM quinasa). Este Ca^+, juntam ente con el DAG que actúa como cofac­ tor, provocan una translocación de proteinqui­ nasa de serina/treonina (PKC) a la m em brana citoplasmática, la que así activada fosforila su sustrato, modificando el pH y alterando la acti­ vidad de estructuras responsables del transporte de varios iones, entre ellos Na+, H+, Ca^+ y K+ (fig. 13-5) La activación de estas cascadas le permite al linfocito B progresar a la fase S del ciclo celular, caracterizada por la síntesis de ADN. Durante este proceso hay aumento de la e x p re s ió n en m em b ra n a de a n tíg e n o s del CMH-clase II, facilitándose la presentación al linfocito Th de los péptidos antigénieos resul­ tantes de la degradación del antígeno y de re­ ceptores para IL-2 e IL-4. Con posterioridad a esa interacción hay aumento de AMPc prom o­ viéndose la diferenciación celular que llega hasta el estado de plasmocitos, sintetizadores de una inmunoglobulina o anticuerpo estructu­ ralmente igual a la del receptor antigénico, la que es secretada.

262

Aspectos básicos de la inmunidad ^C D 8

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anti-CD8 anti-CD3

F ig. 13-3. D em ostración m ediante el em pleo de anticuerpos rnonoclonales unidos a una fase sólida o hibridizados por m é­ todos quím icos de que la agregación de R C T/CD 3 con otras m oléculas es indispensable p ara la activación celular. L a reac­ ción A es negativa (control). El entrecruzam iento con anticuerpos anti-CD 3 y anti-CD 8 no resulta efectivo, si uno de los anticuerpos está en solución (B, C ), Las reacciones D , E y F son positivas, en los tres casos hay entrecruzam iento de CD3 con CD8 por estar am bos anticuerpos unidos a una fase sólida (D), agregados por un F (ab ’)2 anti-IgG (E) o heterodim erizados por m étodos quím icos (F). Las reacciones G , H e ! son negativas por no e.xistir entrecruzam iento. (A daptada de Em m rich F, Im m unology Today, 90: 296, 1988.)

Mecanismos de transducción en el linfocito T Un mecanismo de fosforilación similar al in­ dicado en la activación del linfocito B ocurre

cuando el linfocito T, a través del RCT/CD3 in teractú a con el co rresp o n d ien te p éptidoCMH. Este hecho, al igual que el entrecruza­ miento del RCT/CD3 con un anticuerpo mono­ clonal específico, induce cambios conformaDominio con actividad de quinasa

Sitio de miristilación

SH3

SH2

Tyr 394 sitio regulador positivo

Tyr 505 sitio reguiador negativo

F ig. 13-4. Representación esquem ática dé p56'‘’' com ponente de la fam ilia Src de tirosin quinasas de proteínas.

El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T

263

Fig. 13-5. E.squem atización de la activacióji de una célula B por agregación del receptor (IgM m ) con un antígeno. Una fosfolipasa C activada (PLC*) hidroliza derivados polifosfoinosínicos (PiP2) en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). H ay m ovilización de Ca^*, el que junto con el DAG induce la translocación de proteinquinasa de serina/treonina (PKC) del citoplasm a a m em brana (PKC*). El IP3 activa a su vez u n a proteinquinasa dependiente de Ca^+ y calm o d u lin a (Ca^VCaM). Estas enzim as fosforilan sus sustratos proteicos y se ponen en m archa los m ecanism os de activación celu lar.

cionales en una o varias de sus unidades y la consecuente fosforilación por una o más quina­ sas de proteínas. Así como la función del heterodím ero a /p del' RCT es la de reconocer el ligando específi­ co, la función de los péptidos constitutivos de CD3 y de las cadenas ^ es la de acoplar RCT a los componentes celulares que transducen las señales. Las dos principales quinasas de proteí­ nas asociadas a R C T y a los co-receptores CD4/CD8 son pSó'*'* y p59^'", las que surgen como fosforilantes de diferentes sustratos en­ dógenos. La primera de ellas está directamente asociada a los dom inios citoplasm áticos de CD4 o CDS, o ambos.

L a cadena C, es el único co m p o n en te del RCT/CD3 que experimenta fosforilación de ti­ rosinas y ha podido demostrarse que su región citoplasm ática es capaz de transducir señales correspondientes a eventos relacionados con el RCT. Recientemente se ha descrito otra proteína que por inmuno-precipitación coprecipita con las cadenas ^ a partir de materiales provenien­ tes de linfocitos T activados. Se la denomina ZAP-70 por ser una proteína de 70 kD asociada a la cadena que experimenta in vivo fosfori­ lación de tirosinas a continuación de la estimu­ lación del RCT. La asociación de ZAP-70 y ca­ denas producida con posterioridad a la esti-

264

Aspectos básicos de la inmunidad

muJación del RCT se correlaciona con un au­ mento de la actividad de quinasa de proteína que se detecta en los inmunoprecipitados. Ello hace que se considere que ZAP-70 debe estar asociada con transducción de señales que tie­ nen lugar cuando un linfocito T es estimulado, aunque la naturaleza de la función que esta PKT cumple in vivo es desconocida. Un posi­ ble rol sería el de unir el RCT, a través de la cadena ^ a moléculas adicionales que funciona­ rían en otras etapas del camino que lleva a la transducción de señales. En los linfocitos T activados la PLC experi­ menta una rápida y transiente fosforilación de sus tirosinas. Ello ocurre porque la molécula posee un dominio SH2 que le permite asocia­ ción con quinasas de proteínas. Cuando el RCT fija su ligando específico se activan algunas de las fosfotirosin quinasas de proteína asociadas a este evento, siguiendo Ju eg o la fosforilación y activación de PL C yl. Ésta hidroliza PIP2 pa­

ra formar los segundos mensajeros IP3 y DAG, que activan a PKC, la que fosforila una varie­ dad de substratos que contienen serina o treoni­ na siguiendo la cascada ya indicada en activa­ ción del linfocito B. Otras quinasas han sido identificadas en lin­ focitos, entre ellas: quinasas dependientes de AMPc (PKA), quinasas dependientes de GMPc (PKG) y quinasas de proteínas activadas por mitógenos (MÁP-quinasas), se considera que éstas deben también participar en los eventos que llevan a la activación celular. El estado de fosforilación de las proteínas es debido a un equilibrio dinámico entre la acción de quinasas y fosfatasas, las primeras fosforilando y las segundas desfosforilando. Una acti­ vidad de fosfotirosin fosfatasa ha sido identifi­ cada en la porción citoplasmática de CD45, un antígeno de diferenciación común para los di­ ferentes linfocitos. Se estima que podría inter­ venir regulando el balance fosforilación/des-

CPA CMH-II

péptido CD45

ATP

F ig. 13-6. Reconocim iento antigénico del com plejo CIVIH-II-péptido por el R C T y puesta en m archa de los m ecanism os de fosforilación y desfosforilación de proteínas que llevan a la activación celular.

El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T fosforilación de las tirosinas de proteínas del linfocito T comprometidas en la puesta en m ar­ cha de señales de activación celular. Otras fosfotirosin fosfatasas, entre ellas las denominadas PEP y SHP que presentan un dominio citoplas­ mático de gran tamaño y se expresan en Hnfo­ citos, podrían participar también en los meca­ nismos regulatorios de desfosforilación (fig. 13-6). Eventos que se ponen en marcha por estimulación antigénica En el linfocito B C uando un antíg en o in teraccio n a con la IgMm, en el linfocito B ocurren una serie de hechos, algunos de expresión inmediata y que tienen lugar a los segundos o pocos minutos de ocurrido el contacto, en tanto que otros sólo se expresan después de cierto tiempo. La producción de segundos mensajeros, co­ mo IP3, DAG e incremento de Ca^+, provenien­ tes de la hidrólisis de PIP2 por P L C yl, y la fos­ forilación de tirosinas por diferentes quinasas inducen en las células B en reposo (GO) la en­ trada a la fase G l del ciclo celular. Esta se ca­ racteriza por un aumento del tamaño del linfo­ cito e incremento de la síntesis de ARN, espe­ cialmente el correspondiente a los proto-oncogenes c-fos y c-myc que codifican para factores de transcripción, los que son inducidos en dife­ rentes sistemas celulares por interacciones re­ ceptor-ligando. Por otra parte el aumento de Ca^+ juega un rol muy importante en la regula­ ción de genes y en el aumento de complejos de unión a ADN. La agregación de IgMm induce la transcrip­ ción de genes del CMH-II. El aumento de la expresión de m oléculas del CM H-II es muy importante ya que esas moléculas, siguiendo la ruta endocítica se ponen en contacto con los péptidos procesados por los endosomas y los transportan a la membrana celular para su reco­ nocimiento por los linfocitos Th. Durante este proceso hay también activación de los genes que codifican la síntesis de los receptores de IL-2 (RlL-2) e IL-4 (RIL-4). La proliferación celular y la síntesis de anti­ cuerpos por los linfocitos B dependerá en pri­ mera instancia de los diferentes mecanismos expuestos que llevan a la expresión de genes y síntesis de proteínas reguladoras y, en segundo lugar, a su reconocim iento por los linfocitos Th. Estos habrán de actuar por contacto directo a través de su receptor antigénico, el co-i'eceptor CD4, los diferentes pares de moléculas de adhesión y por intermedio de distintas interleu­ quinas por él sintetizadas, especialmente IL-2 e IL-4. Las interleuquinas podrán ejercer su fun­

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ción por interacción con los correspondientes receptores, expresados en la membrana de los linfocitos B como consecuencia de la agrega­ ción inicial del receptor Ig-a/Ig-p-IgM m por interacción con un ligando adecuado. En el linfocito T La unión del péptido-CMH al RCT/CD3 ge­ nera señales al interior de la célula que, al igual que en linfocito B, incrementan la transcripción de genes y la síntesis de proteínas esenciales para la mitosis y ei funcionamiento celular. Los eventos que se originan pueden ser de ex p re­ sión inmediata o tardía. Entre los de expresión inmediata está la fos­ forilación de proteínas, entre ellas las cadenas y y 5 de CDS, que fosforilan residuos de serina de Ja porción intracitoplasmática y las cadenas ^ que fosforilan sus residuos de tirosina. Se fosforilan tam bién, y así pueden cum plir su función, proteínas reguladoras de transcripción o factores nucleares, que se fijan a determina­ das secuencias de ADN de las regiones corres­ pondientes a mejoradores de la expresión (“enhancer”) o promotores de genes. Como y a se indicara, participan activamente en este proce­ so diferentes quinasas de proteínas y el D A G e IP3 provenientes de la hidrólisis de fosfolípi­ dos de la membrana plasmática por incremento de la actividad catalítica de la fosfolipasa C (PLCyl). Estas fosforilaciones ocurren pocos segundos después de la interacción RCT/CD3péptido/CM H, al igual que un aumento de la actividad intercambiadora NaVH^ por parte de la mem brana citoplasmática, resultante en un aumento de! pH intracelular. Otro evento que ocurre es la transcripción de genes, cuyos productos proteicos son fu n d a­ m entales para la activación celular. N o rm al­ m ente estos procesos requieren más tiem po, pueden oscilar entre m inutos y horas. E ntre esos genes están los proto-oncogenes ya seña­ lados c~fos y c-myc, así llamados porque una superexpresión o productos de mutaciones pue­ den inducir en las células transformaciones ma­ lignas. En condiciones normales los productos de estos genes actúan dentro del núcleo regu­ lando el crecimiento celular. La transcripción de los genes de las interleu­ quinas es un hecho muy importante, en espe­ cial el de la lL-2, así como la correspondiente a los genes que transcriben a sus receptores. En el linfocito T la expresión del receptor de IL-2 (RIL-2) es un hecho significativo, ya que ello permitirá que la IL-2 sintetizada por ¡a misma célula pueda interaccionar con su receptor y funcionar como factor de crecimiento endocri­ no. (Para más detalles sobre interleuquinas y sus receptores véase cap. 12.)

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Aspectos básicos de ¡a inmunidad

Cuando una célula inmunológicamente com­ petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte­ racciona con un ligando a través de su receptor específico, se activa una serie de mecanismos bioquímicos que hacen que una célula en repo­ so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro­ duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse­ cuencia de ello la célula sintetizará moléculas funcionalm ente activas las que le perm itirán cum plir funciones específicas. C uando ello ocurra, en términos estrictamente inm unológi­ cos diremos que una respuesta inmune se ha puesto en marcha. BIBLIOGRAFÍA A lexander D.R., Cantrel D .A. et al. “K inases and phosphatases in T-cell activation” . Im m unology Today, 10:200, 1989. C am bier I.C ., Pleim an C.M ., C lark M .R. “S ignal transduc­ tion by the B cell antigen receptor and its correceptors” . A nnual Review o f Im m unology, 12:459, 1994. Chan A.C., Desai D .M ., W eiss A. “T he role o f protein ty­ rosine kinases and protein tyrosine phosphatases in T-cell

antigen receptor signal transduction” . A nnual R eview C)f Im m unology, 12:555, 1994. G ergely J. et al. (E dts). “ S ignal tran sd u ctio n p ath w a y s” . Progress in Im m unology, vol VJII, 1993. Springer-H ungaria. H arnett M ., Klaus G .G .B . “G protein regulation o f receptor signaling” . Im m unology Today, 9:315, 1988. Isakov N. “T hyrosine phosphorilation and dephosphorylation in T ly m p h o cy te ac tiv atio n ” . M o lec u lar Im rau n o logy, 30:197, 1993. Parker, D.C. “T cell-dependent B cell activation” . A nnual R eview o f Im m unology, 11:331, 1993. Paul W . (Ed). F u n d am en tal Im m unology, Cap. 13 y 14. 3ra. Edic, 1993. Perm ulter R .M ., Levin S.D et al. “Regulation o f lym phocy­ te function by protein phosphorylation” A nnual Review o f Im m unology, 11:451, 1993. R udd C .E ., Jan sen O. et al. “Tw o step T C R í;/C D 3 -C D 4 and CD 28 signaling in T cells: SH 2/SH 3 dom ains, prote in -ty ro s in e and lip id k in a se s. Im m u n o lo g y T o d a y , 15:225, 1994. Plim an C M et al. “T he B cell antigen recep to r com plex; structure and signal tran sd u ctio n ” . Im m unology Today, 15:393, 1994. K ovaskovics-B ankow ski M , R ock KL. “A p h ag o so m e to cy to so l p ath w ay fo r ex o g en o u s a n tig en s p re se n te d on M H C class I m olecules”. Science, 267:243, 1995. S em inars in Im m unology “C onserved signaling m o tifs in antigen and Fe receptors” . Vol. 7, N° 1, 1995.

Evolución del sistema inmune

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GUILLERMO BLANCO

INTRODUCCIÓN Durante muchos años la inmunidad fue con­ siderada como la resistencia de un organismo a la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er modelo experimenta] en el cual se hizo eviden­ te que la resistencia a la enfermedad no era la única razón de ser del sistema inmune. Sus ex­ periencias con transplantes hicieron evidente que el sistem a inm une estaba involucrado en respuestas que no tenían una relación aparente con la infección y la enfermedad. El reconoci­ miento específico, la memoria y una segunda respuesta aumentada fueron las evidencias fun­ cionales que definían la presencia de un siste­ ma inmune clásico. En la década del ’50 Bur­ net propone que la propiedad funcional que de­ fine la presencia de un sistema inmune es la ca­ pacidad de distinguir lo propio y lo no propio. Si bien todas las especies del reino animal son capaces de distinguir lo propio y lo no propio, no todas requieren del poder de discriminación y adaptación de los vertebrados. Los invertebrados comprenden el 95% de las especies conocidas. Poseen sistemas inmunes no adaptativos que, pese a su relativa simplici­ dad, han permitido a muchas especies sobrevi­ vir satisfactoriamente durante cientos de millo­ nes de años sobre la superficie terrestre. EL SISTEM A IN M U NE DE L O S IN V ER TEB R A D O S Sobre la base de diferencias embriológicas, los invertebrados celomados se dividen en dos grandes líneas evolutivas; los protostomados y los deuterostomados. De estos últimos se origi­ na a su vez la línea evolutiva que da origen a los vertebrados (fig. 14-1),

El conocimiento actual del sistema inm une de los invertebrados deriva en su mayor parte del estu d io de los protostom ados d ado que entre los artrópodos y moluscos se cuentan es­ pecies de gran importancia económica y sani­ taria. La primera línea de defensa frente la infec­ ción es la barrera fisicoquím ica conform ada por el exoesqueleto en los artrópodos, la cu­ bierta calcárea en los bivalvos o la abundante secreción mucosa externa de los anélidos y mo­ luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en marcha repuestas de defensa celulares y hum o­ rales tales eomo fagocitosis, coagulación, for­ mación de nódulos, encapsulación, activación de enzimas y/o liberación de factores de opso­ nización. Existen variaciones entre los distintos grupos pero es posible reconocer características esenciales compartidas por todos ellos, que re­ sumen una buena parte del conocim iento que se tiene de estos sistemas. Fagocitosis La fagocitosis es la respuesta celular m ás co­ mún y se considera que no es un proceso auto­ mático dependiente de! contacto entre fagocito y partícula a endocitar, sino que existe una se­ lección basada en el reconocimiento del agente extraño por medio de moléculas de superficie de membrana. En muchas especies se han iden­ tificado leetinas para las que se propone un rol similar al de los receptores de fagocitosis para a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci­ tos y macrófagos humanos y murinos. Estos re­ ceptores son los mediadores de la fagocitosis en ausencia de opsonización por medio de Igs o el factor C3 del sistema complemento (véase fig. 14-2).

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Aspectos básicos de ¡a inmunidad

Cuando una célula inmunológicamente com­ petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte­ racciona con un ligando a través de su receptor específico, se activa una serie de mecanismos bioquímicos que hacen que una célula en repo­ so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro­ duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse­ cuencia de ello la célula sintetizará moléculas funcionalm ente activas las que le perm itirán cum plir funciones específicas. C uando ello ocurra, en términos estrictamente inm unológi­ cos diremos que una respuesta inmune se ha puesto en marcha. BIBLIOGRAFÍA A lexander D.R., Cantrel D .A. et al. “K inases and phospha­ tases in T-cell activation” . Im m unology Today, 10:200, 1989. C am bier I.C ., Pleim an C.M ., C lark M .R. “S ignal transduc­ tion by the B cell antigen receptor and its correceptors” . A nnual Review o f Im m unology, 12:459, 1994. Chan A.C., Desai D .M ., W eiss A. “T he role o f protein ty­ rosine kinases and protein tyrosine phosphatases in T-cell

antigen receptor signal transduction” . A nnual R eview C)f Im m unology, 12:555, 1994. G ergely J. et al. (E dts). “ S ignal tran sd u ctio n p ath w a y s” . Progress in Im m unology, vol VJII, 1993. Springer-H ungaria. H arnett M ., Klaus G .G .B . “G protein regulation o f receptor signaling” . Im m unology Today, 9:315, 1988. Isakov N. “T hyrosine phosphorilation and dephosphorylation in T ly m p h o cy te ac tiv atio n ” . M o lec u lar Im rau n o logy, 30:197, 1993. Parker, D.C. “T cell-dependent B cell activation” . A nnual R eview o f Im m unology, 11:331, 1993. Paul W . (Ed). F u n d am en tal Im m unology, Cap. 13 y 14. 3ra. Edic, 1993. Perm ulter R .M ., Levin S.D et al. “Regulation o f lym phocy­ te function by protein phosphorylation” A nnual Review o f Im m unology, 11:451, 1993. R udd C .E ., Jan sen O. et al. “Tw o step T C R í;/C D 3 -C D 4 and CD 28 signaling in T cells: SH 2/SH 3 dom ains, prote in -ty ro s in e and lip id k in a se s. Im m u n o lo g y T o d a y , 15:225, 1994. Plim an C M et al. “T he B cell antigen recep to r com plex; structure and signal tran sd u ctio n ” . Im m unology Today, 15:393, 1994. K ovaskovics-B ankow ski M , R ock KL. “A p h ag o so m e to cy to so l p ath w ay fo r ex o g en o u s a n tig en s p re se n te d on M H C class I m olecules”. Science, 267:243, 1995. S em inars in Im m unology “C onserved signaling m o tifs in antigen and Fe receptors” . Vol. 7, N° 1, 1995.

Evolución del sistema inmune

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GUILLERMO BLANCO

INTRODUCCIÓN Durante muchos años la inmunidad fue con­ siderada como la resistencia de un organismo a la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er modelo experimenta] en el cual se hizo eviden­ te que la resistencia a la enfermedad no era la única razón de ser del sistema inmune. Sus ex­ periencias con transplantes hicieron evidente que el sistem a inm une estaba involucrado en respuestas que no tenían una relación aparente con la infección y la enfermedad. El reconoci­ miento específico, la memoria y una segunda respuesta aumentada fueron las evidencias fun­ cionales que definían la presencia de un siste­ ma inmune clásico. En la década del ’50 Bur­ net propone que la propiedad funcional que de­ fine la presencia de un sistema inmune es la ca­ pacidad de distinguir lo propio y lo no propio. Si bien todas las especies del reino animal son capaces de distinguir lo propio y lo no propio, no todas requieren del poder de discriminación y adaptación de los vertebrados. Los invertebrados comprenden el 95% de las especies conocidas. Poseen sistemas inmunes no adaptativos que, pese a su relativa simplici­ dad, han permitido a muchas especies sobrevi­ vir satisfactoriamente durante cientos de millo­ nes de años sobre la superficie terrestre. EL SISTEM A IN M U NE DE L O S IN V ER TEB R A D O S Sobre la base de diferencias embriológicas, los invertebrados celomados se dividen en dos grandes líneas evolutivas; los protostomados y los deuterostomados. De estos últimos se origi­ na a su vez la línea evolutiva que da origen a los vertebrados (fig. 14-1),

El conocimiento actual del sistema inm une de los invertebrados deriva en su mayor parte del estu d io de los protostom ados d ado que entre los artrópodos y moluscos se cuentan es­ pecies de gran importancia económica y sani­ taria. La primera línea de defensa frente la infec­ ción es la barrera fisicoquím ica conform ada por el exoesqueleto en los artrópodos, la cu­ bierta calcárea en los bivalvos o la abundante secreción mucosa externa de los anélidos y mo­ luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en marcha repuestas de defensa celulares y hum o­ rales tales eomo fagocitosis, coagulación, for­ mación de nódulos, encapsulación, activación de enzimas y/o liberación de factores de opso­ nización. Existen variaciones entre los distintos grupos pero es posible reconocer características esenciales compartidas por todos ellos, que re­ sumen una buena parte del conocim iento que se tiene de estos sistemas. Fagocitosis La fagocitosis es la respuesta celular m ás co­ mún y se considera que no es un proceso auto­ mático dependiente de! contacto entre fagocito y partícula a endocitar, sino que existe una se­ lección basada en el reconocimiento del agente extraño por medio de moléculas de superficie de membrana. En muchas especies se han iden­ tificado leetinas para las que se propone un rol similar al de los receptores de fagocitosis para a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci­ tos y macrófagos humanos y murinos. Estos re­ ceptores son los mediadores de la fagocitosis en ausencia de opsonización por medio de Igs o el factor C3 del sistema complemento (véase fig. 14-2).

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Aspectos básicos de la inmunidad

Se distinguen cuatro fases: quimiotáctica, de adhesión, de ingestión y de destrucción y me­ tabolism o. La prim era ha sido observada en estudios sobre anélidos, moluscos e insectos. La fase de adhesión requiere de la participa­ ción de moléculas del tipo de las lectinas aso­ ciadas a membranas y, en algunos casos, se ha identificado la participación de moléculas si­ milares a los factores del complemento. La fa­ se de ingestión comprende la formación de un fagosom a que luego se une a los lisosom as donde el m aterial endocitado tom a contacto con distintas hidrolasas tales como fosfatasa ácida, esterasas ácidas inespecíficas y peroxi­ dasa. En algunos casos estas enzimas pueden ser simultáneamente liberadas al medio con un objetivo de defensa. La fase de destrucción y m etabolism o, com prende la destrucción por hidrolasas lisosomales. Los artrópodos poseen un sistema de destrucción basado en la produc­ ción de melanina mediado por una fenoloxidasa en presencia de sustratos adecuados tales como L-dopa o tirosina. La melanina u otros intermediarios precursores son altamente tóxi­ cos y responsables de la destrucción de parási­ tos. Se ha observado que en muchas especies el consumo de oxígeno aumenta muy poco du­ rante la fagocitosis por lo que no existiría el estallido respiratorio con la resultante produc­ ción de HjOj propio de muchos fagocitos ver­ tebrados.

en insectos y moluscos pero también ha sidp observada en tunicados, equinodermos, crustá­ ceos, sipuncúlidos, anélidos, celenterados y es­ pongiarios Citotoxicidad La citotoxicidad es una forma de respuesta muy difundida entre los invertebrados y ha si­ do observada en espongiarios, celenterados, si­ puncúlidos, anélidos, moluscos, equinodermos y protocordados. Los espongiarios, celentera­ dos y protocordados son invertebrados colo­ niales y en ellos las reacciones de citotoxici­ dad participan en las funciones de preserva­ ción de la identidad de la colonia. En los gru­ pos no coloniales, la citotoxicidad natural o es­ pontánea estaría destinada entre otras cosas a la eliminación de células transformadas. Expe­ riencias con sipuncúlidos demostraron la pre­ sencia de citotoxicidad alogeneica cuando las especies habitaban regiones separadas por más de 30 km. La citotoxicidad es dependiente del contacto célula blanco-célula efectora, es inde­ pendiente de la exposición previa al antígeno, no ocurre en todas las combinaciones aloge­ neicas y es inhibida por la presencia de varios carbohidratos. Se la considera similar a la citotoxicidad mediada por células NK de los verte­ brados. Respuestas humorales

Formación de nódulos Cuando la cavidad celómica o hemocele de un invertebrado es invadida por una cantidad de microorganismos superior a los que pueden ser eliminados por fagocitosis, se observa la formación de acúmulos celulares denominados nódulos. En algunos casos los nódulos presen­ tan depósitos de m elanina. A lgunos autores consideran a los nódulos hom ólogos de los granulomas de los vertebrados. En su form a­ ción participan fagocitos que luego de la etapa inicial de adhesión sufren un proceso de adel­ gazamiento progresivo que culmina en la con­ formación de una envoltura m ulticelular que encierra una masa de células en degeneración y parásitos secuestrados (fig. 14-3). Encapsulación El proceso de encapsulación permite que los invertebrados sean capaces de inmovilizar pa­ rásitos tales como cestodes, trematodes, nema­ todes, hongos y protozoarios de gran tamaño, encerrándolos con varias capas de células. El m ecanism o de form ación de las cápsulas se considera idéntico al de los nódulos. La encap­ sulación ha sido más frecuentem ente descrita

Los invertebrados no poseen Igs en sus lí­ quidos corporales. Sin em bargo poseen una variedad de factores con capacidad lítica, de aglutinación, y otros efectos antimicrobianos. Estos factores están presentes en forma natural y en algunos casos su formación ocurre luego de una estimulación antigénica. No obstante, se caracterizan por carecer de la propiedad anamnésica de las Igs. Entre estas sustancias se cuentan hsinas, aglutininas, factores simila­ res a citoquinas y otros factores antimicrobia­ nos. Sin embargo, esta separación es artificial y muchas sustancias poseen más de una de las propiedades señaladas. Lisinas En los vertebrados, el papel más activo en la lisis humoral de agentes extraños, está a cargo de los componentes del sistema complemento. En los invertebrados se ha postulado la exis­ tencia de un sistema similar a la vía alterna del complemento. Su existencia ha sido sugerida a partir de la observación de lisinas termosensibles y calcio-dependientes, supresión de la he­ mólisis con el uso de inhibidores del com ple­ mento como hidrazina y suramina y opsoniza-

Evolución del sistema inmune ción de la fagocitosis de macrófagos de ratón. Sin embargo aún es prematuro trazar homolo­ gías entre ambos sistemas. La lisozima, una li­ sina capaz de hidrolizar los enlaces entre el ácido N -acetil-neuramínico y la N-acetil-glucosamina presentes en la pared de algunas bac­ terias, ha sido identificada en moluscos, insec­ tos y equinodermos. A glutininas/opsoninas M uchos invertebrados poseen factores h u ­ morales capaces de aglutinar bacterias, protozoarios, eritrocitos de vertebrados, linfocitos y parásitos metazoarios. Se considera que estas sustancias, también presentes en plantas y en el suero de vertebrados, han evolucionado va­ rias veces y cumplen distintas funciones m u­ chas de ellas no relacionadas con la inm uni­ dad. La mayoría de las aglutininas de inverte­ brados han sido estudiadas en base a su capa­ cidad para aglutinar eritrocitos de vertebrados. Estas h em ag lu tin in as actúan por m edio de unión a carbohidratos específicos de la super­ ficie de membrana del eritrocito y pertenecen a una categoría más general de moléculas cono­ cidas como leetinas. En algunas especies se ha demostrado su participación como factores de opsonización de la fagocitosis o promotores de la formación de nódulos y cápsulas. C itoquinas Se han descrito varios factores con propieda­ des similares a citoquinas en equinodermos (As­ teria forbesi y Asteria rubens), insectos y tuni­ cados. Evaluadas en sistemas mamíferos estas sustancias reproducen muchas de las caracterís­ ticas de las citoquinas de los vertebrados. Recientemente se ha aislado y caracterizado la interleuquina-1 (IL -l)a y P de un tunicado utilizando un ensayo de proliferación de tim o­ citos murinos. La IL-1 de tunicado comparte muchas de las características de la IL-1 de m a­ míferos. En los invertebrados esta citoquina estim ula la fagocitosis en hemocitos y es un promotor de la primera etapa de la formación de nódulos y de la encapsulación, dado que au­ menta la adhesión y agregación de los hem oci­ tos. En los invertebrados deuterostomados se han caracterizado factores con actividad sim i­ lar a IL-2. Inmunoproteínas no inmunoglobulinas Las p e n trax in as, fam ilia de p ro teín a s C reactivas, constituyen parte de un sistema ge­ neral de reconocimiento extremadamente pri­ mitivo. Este sistema se originó tempranamente en la evolución y fue conservado en especies

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tan distantes filogenéticam ente como los an­ cestros de los artrópodos (el fósil viviente Limulus polyphemus) y los mamíferos. Si bien no existen evidencias de que las pentraxinas tengan un ancestro com ún con las Igs, estas moléculas pueden expresar sitios de com bina­ ción muy similares a aquellos presentes en las Igs y pueden interactuar con componentes del sistema complemento y otras moléculas inmunorreguladoras en form a análoga a los a n ti­ cuerpos. Estas moléculas probablemente repre­ senten un sistema de reconocimiento muy anti­ guo y primitivo que se ha mantenido a través de la evolución de los vertebrados, a pesar de que éstos hayan desarrollado un sistema más complejo de reconocimiento antigénico. Reconocimiento alogeneico Todos los invertebrados estudiados m u es­ tran capacidad de rechazo de injertos xenogeneicos en tanto que el reconocimiento aloge­ neico tam b ién está presente en m uchos de ellos incluyendo espongiarios, celenterados, anéhdos, sipuncúhdos, equinodermos y tunica­ dos. No se lo ha observado en nemertinos, mo­ luscos y artrópodos. Curiosamente los artrópo­ dos y moluscos exhiben la mayor incidencia de neoplasias y contienen la mayoría de los hospedadores intermediarios y vectores d e pa­ rásitos protozoarios y helmínticos. Sin em bar­ go no existe una correlación entre la presencia de alorreactividad y la eficiencia de la respues­ ta contra la infección ni con la evolución de inm unidad adaptativa como la de los v e rte ­ brados. Los experimentos de transplantes realizados con esponjas y corales, invertebrados de hábi­ tos coloniales, demostraron la presencia de re­ conocimiento alogeneico y sugieren la presen­ cia de un complejo de genes de histocom pati­ bilidad conformado por varios loci con m últi­ ples alelos. En tunicados coloniales se h a de­ mostrado que el reconocimiento alogeneico y el control de la fertilización son caracteres li­ gados y controlados por un mismo locus con múltiples alelos. Linfocitos Los anélidos, sipunciilidos y nemertinos po­ seen células con características m orfológicas similares a linfocitos. En algunos casos se las ha observado involucradas en las reacciones de rechazo de aloinjertos o de citotoxicidad alogeneica por lo que han sido consideradas células T primitivas. Sin embargo se observa respuesta de proliferación con lipopolisacári­ dos bacterianos (LPS), concanavahna A (Con A) y fitohemaglutinina (PHA) por lo que se ha

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Aspectos básicos de la inmunidad

aves

: YHC (

reptiles

ciclóstomos

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crustáceos

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C

mamíferos j YHILPC

anfibios

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insectos

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tunicados

Deuterostomados

artrópodos

DM

anélidos

■^e q u in o d e rm o s ] L

-X . sipuncúlidos

T moluscos

Protostomados

celomados nemertinos celenterados

plathelmintos

acelomados LUÜIUIlIcK. esp o n g la rio sjprotozoarios

Y anticuerpos H complejo mayor de histocompatibilidad I moléculas de adhesión de la superfamilia de Igs L leetinas tipo C asociadas a membrana o libres P pentraxinas (proteína C reactiva) C sistema complemento DM evento de duplicación masiva de genes

Fig. 14-1. Las modificaciones de estructura (m oléculas, células, órganos y tejidos) constituyen un proceso continuo en la evolución de las especies en el que es posible reconocer hom ologías, En cam bio, las ftinciones no se conservan y evolucio­ nan en form a discontinua. Por esta razón el estudio evolutivo de un sistem a biológico requiere la identificación y com para­ ción de estructuras más que de funciones. La figura m uestra un árbol filogenético donde las relaciones evolutivas fueron or­ ganizadas segtín m ecanism os de desarrollo em briológico. Sobre este árbol se ilustran las moléculas de reconocim iento iden­ tificadas en los diversos phyla. Los protostom ados y deuterostom ados se separaron hace aproxim adam ente 500 a 600 m illo­ nes de años. Los m ecanism os de recom binación, esenciales para la respuesta inm une anticipada m ediada por anticuerpos (y) y receptor de célula T, surgieron en la línea evolutiva de los deuterostom ados que conduce a los vertebrados, luego de un evento de duplicación m asiva (D M ) del cual se originó el sistem a m ultigénico VJC. Este evento pudo haber tenido lugar an­ tes de la divergencia de los tunicados contem poráneos o después de esta divergencia, pero antes del surgim iento d e los ci­ clóstom os ancestrales. Las m oléculas que participan en funciones de adhesión celular y regulación (I) están am pliam ente distribuidas en la filogenia al igual que las m oléculas de reconocim iento hom ólogas a las leetinas tipo C de los vertebrados (L). Las pentraxinas (P) constituyen ejem plos extraordinarios de estructuras de reconocim iento conservadas a lo largo de la evolución de las especies. Se las ha identificado en artrópodos, tunicados y mam íferos. La proteína C reactiva es específica para ciertas bacterias y para pequeñas m oléculas orgánicas, com o la tosforilcolina, e interactúa con com ponentes del sistem a inm une com o el com plem ento y el receptor Fe a pesar de que no tiene relación estructural con las Igs.

considerado que comparten propiedades de cé­ lulas B y T . Los equinodermos y protocordados poseen células similares a linfocitos que participan en

las reacciones de rechazo de aloinjertos y de citotoxicidad natural. En los protocordados es­ tas células responden a la estim ulación con PHA.

Fig. 14-2. La respuesta de fase aguda es el sistem a de defensa m ás antiguo y frecuente en el reino animal. C onsiste en una com pleja red de reconocim iento y m ecanism os efectores que no tiene el elevado nivel de especificidad de la respuesta in­ m une m ediada por inm unoglobulinas. Las leetinas participan en ia respuesta de fase aguda com o m ediadoras directas o in­ directas de m ecanism os inm unes a través de funciones de opsonización, aglutinación, activación de com plem ento y reco­ nocim iento celular. (A) esquem a que representa el reconocim iento de agentes extraños m ediante leetinas asociadas a m em branas por parte de células fagocíticas. (B) reconocim iento m ediante opsonización por leetinas séricas. Existen co n si­ derables evidencias experim entales que sugieren la exposición por parte de lectinas-opsoninas de sitios glucosídicos crípti­ cos de reconocim iento luego de un cam bio conform acional originado en la unión al agente. Estos sitios tienen afinidad por m oléculas de reconocim iento asociadas a la m em brana de los fagocitos con capacidad de unión a carbohidratos. D e esta form a se produce una transición del estado “m olécula propia” al estado “m olécula no p ropia” .

Evolución del sistema inmune

271

Lectinas asociadas

Microorganismo patógeno

Lectina sérica opsonizante

Microorganismo opsonizado y exposición de residuos crípticos

272

Aspectos básicos de la inmunidad

E L SISTEMA INMUNE DE LO S VERTEBRADOS Los vertebrados form an parte del phylum Chordata junto con los urocordados o tunica­ dos y los cefalocordados. En todas las clases se observa la presencia de los elementos funda­ mentales del sistema (fig. 14-1). Tienen capaci­ dad para producir anticuerpos contra una gran variedad de antígenos, rechazan injertos aloge­ neicos y responden a una segundo injerto en forma específica y más rápida. La especificidad y memoria está asociada a la presencia de lin­ focitos en todos los vertebrados estudiados. En la mayoría de las clases se ha demostrado la presencia de un complejo mayor de histocom­ patibilidad (CMH). Anticuerpos e inm unoglobulinas Los anticuerpos producidos por todos los vertebrados poseen carga polidispersa, eviden­ ciado por múltiples bandas en el espectrotipo de isolelectronfoque (lEF), y están compuestos por cadenas polipeptídicas similares en su peso molecular a las cadenas pesadas y livianas de los mamíferos. Los estudios de genética mole­ cular con vertebrados placodermos son aún in­ completos pero permiten afirmar que las inmu­ noglobuhnas están codificadas por segmentos de genes V, J y C y que los mecanismos de re­ com binación a nivel de estos genes son una parte esencial de la generación de diversidad. Los segmentos de genes que codifican las re­ giones J son los más conservados. Se considera que esto refleja el hecho de que todos los m e­ canism os de recom binación dependen de la presencia del segm ento J para ensam blar el conjunto completo de genes de Igs a ser trans­ cripto. Los segmentos correspondientes a las zonas invariantes (framework) interpuestas entre las zonas de hipervariabilidad de las regiones V son altamente conservadas en la evolución de los vertebrados, tanto cuando se las compara con las Igs clásicas como con el receptor de cé­ lula T. Los segmentos que codifican para la región C de las cadenas livianas de los vertebrados in­ feriores son homólogos de los correspondientes en mamíferos. No obstante, el grado de conser­ vación de la estructura de la región C en la filo­ genia es menor en apariencia al de la región V. Es posible reproducir árboles filogenéticos en base a las regiones C pero no en base a regio­ nes V. Esta generalización surge de numerosos estudios filogenéticos realizados con regiones V de cadenas livianas y pesadas y algunos me­ nos con regiones C. Por ejemplo, la compara­ ción de las secuencias de regiones C de los ti­

burones, ratones, aves y ei ser humano permite construir un árbol evolutivo que reproduce el conocimiento actual de las relaciones filogenéticas entre estas clases. Los elementos de reconocimiento de los an­ ticuerpos han sido conservados a lo largo de la evolución de los vertebrados. Las regiones C muestran el tipo de cambio evolutivo caracte­ rístico de otras proteínas especificadas por ge­ nes de copia individual (transcripción directa sin previa recombinación). La naturaleza multigénica de las regiones V y la necesidad de recombinación con los seg­ mentos J ha establecido presiones selectivas que condicionaron la preservación de la estruc­ tura de las zonas invariantes (framework) e hipervariables (fig. 14-4). Los datos acerca del origen de los segmentos V y J son consistentes con la hipótesis de que un evento de duplicación masiva de genes tuvo lugar luego de la divergencia entre los proto­ cordados y los vertebrados ancestrales, pero antes de la divergencia entre placodermos y ostracodermos. Este evento dio lugar a la adquisi­ ción de un sistema de reconocimiento basado en múltiples genes V, J y C, necesario para la generación de diversidad en los anticuerpos y el receptor de célula T (fig. 14-1). Se ha identificado en la hemolinfa del tuni­ cado Boltenia ovípera una proteína de 26 kD que serológicamente exhibe reacción cruzada con la cadena pesada de tiburón y con la región J. Sin embargo la molécula no posee carga po­ lidispersa. La ausencia de diversidad en el es­ pectrotipo de lEE sugiere la ausencia de meca­ nismos de recombinación en el ensamblado de la molécula. Dado que los tunicados son ances­ tros próximos de los vertebrados, los estudios con estos animales tienen el propósito de cono­ cer el estado y la organización primitiva de los elementos que dieron origen al sistema inmune clásico. El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) El CMH es una región compleja con muchos genes segregados en forma ligada, cuyo origen evolutivo es difícil de conocer. Se han aislado una gran cantidad de genes de clase I y clase II en anfibios, reptiles, aves, peces óseos y carti­ laginosos, pero en muy pocos casos se estable­ ció la correspondencia con las moléculas fun­ cionales del CMH de la especie de la cual fue­ ron aislados. La observación de moléculas de clase I y clase II en los peces cartilaginosos, hace suponer que el surgimiento de los genes del CMH es un evento antiguo, que tuvo lugar a nivel de los invertebrados superiores. Actual­ m ente se investiga la posibilidad de que las

Evolución de! sistema inmune moléculas primitivas hayan sobrevivido en algiin grupo invertebrado en base a técnicas de biología molecular. En los vertebrados más primitivos (ciclóstomos) sólo se han obtenido evidencias funciona­ les de la existencia de un CMH: respuesta pro­ life ra tiv a en el c u ltiv o m ix to lin fo c ita rio (CML) aunque con índices poco significativos y rechazo crónico de aloinjertos. Los peces car­ tilaginosos exhiben rechazo crónico de aloin­ jertos aunque no se ha observado respuesta de proliferación en cultivos mixtos leucocitarios a pesar de la presencia de timo. En los peces óseos, se ha observado el recha­ zo agudo de aloinjertos, el cual es notablemen­ te afectado por la temperatura. En el control de !a respuesta están involucrados varios loci. En algunas especies de esta clase se observó tam ­ bién respuesta proliferativa en el cultivo mixto de linfocitos (CML). El ADN genómico de ge­ nes de clase I y clase II aislados por PCR muestra similitud con los genes de mamíferos. Xenopus, un género de anfibios pertenecien­ te al orden anura, posee un locus denominado XLA (CMH propio de Xenopus) definido p ri­ meramente como una entidad genética. En tér­ minos funcionales en Xenopus se observa re­ chazo agudo de aloinjertos, respuesta citotóxi­ ca de células T ligada al CMH, y colaboración B-T restringida por CMH (la respuesta requiere al menos un alelo compartido). El polimorfis­ mo de las moléculas del CMH de Xenopus es alto y también se ha observado desequilibrio de ligamiento. La cadena pesada de las moléculas de clase I tiene 44 kD, en tanto que las molécu­ las de clase II se componen de dos cadenas de 30 a 35 kD. Existe homología con la secuencia de las cadenas a de mamíferos. Entre los anfibios pertenecientes al orden Urodela los eventos que funcionalmente indi­ can la presencia de un CMH (rechazo agudo de aloinjertos, proliferación en CML y reacción de injerto contra huésped) han mostrado niveles de respuesta inferiores. Sin embargo la re s ­ puesta observada es suprimida por timectomía ’ previa. En Ambistoma mexicanum (axolote) se han identificado moléculas de clase II estructu­ ralmente similares a las de los mamíferos. Todos los reptiles muestran respuestas fun­ cionales com patibles con la presencia de un CMH; rechazo agudo de aloinjertos, prolifera­ ción en CML y reacción de injerto contra hués­ ped. Existe una alta correlación entre el recha­ zo agudo de aloinjertos y la producción de lin­ focitos T citotóxicos. Por inmunoprecipitación con anticuerpos que muestran reacciones cru­ zadas se ha aislado lo que se considera proba­ bles moléculas de clase I, clase II y j32-microglobuhna en caimanes, tortugas, y ofidios. La obtención de numerosos ADNc de clase I en

273

algunas especies sugiere la presencia de m últi­ ples loci y polimorfismo. Sin embargo aún no se ha establecido ninguna correspondencia con la expresión de proteínas. En aves y mamíferos se han identificado y secuenciado moléculas con actividad funcional. En las aves las moléculas de clase I consisten de una cadena pesada de 43 kD unida en form a no covalente a una P2-m icroglobulina de 12 kD. Las moléculas de clase II consisten de ca­ denas a y P de 30 kD y se expresan sólo en cé­ lulas B y monocitos. Los exones que codifican los dominios p i, P2 y de transmembrana tienen un 62 a 66% de homología con la secuencia p de HLA-DQ. En los pollos existen por lo m e­ nos tres genes p distintos. La característica más prominente del CMH de las aves es el tam año reducido, resultado de la presencia de intrones cortos y un número relativamente bajo de ge­ nes de clase I y clase II. Las comparaciones dei CM H de aves y m a­ míferos demuestran similitud en la ubicación de los residuos polimórficos, conservación de los residuos invaiiantes que se unen a p é p ti­ dos, conservación de los residuos de contacto dentro y entre dom inios, y conservación del dominio intracitoplasmático responsable de la unión a quinasas. El nivel de h o m ología es muy diferente en cada uno de los dominios ex­ tracelulares. Este hecho sugiere la existencia de diferentes proceso de selección durante la evolución. Los dominios a-2 y a-3 evolucio­ naron más lentam ente que los dom inios a-1 dado que habrían estado sometidos a mayores restricciones: interacción entre sí y con la P-2 microglobulina. En todas las clases de vertebrados el CM H de clase I y clase II es muy polimórfico. Se ha sugerido que el polimorfismo surgió como res­ puesta a la necesidad de reconocim iento de agentes patógenos, aunque hay muy pocos ca­ sos en los que un alelo de MHC se asocia con resistencia a la infección y, en cambio, hay m u­ chos casos en los que se asocia a la susceptibi­ lidad a una determinada enfermedad. Algunos autores sostienen que el nivel de polimorfismo sería dependiente del número de alelos disponi­ bles en el momento de la especiación y de la longevidad de la especie. Para otros en cambio, la presión selectiva que condiciona la aparición de polimorfismo en el CMH radica en funcio­ nes no relacionadas con la resistencia a la in­ fección, tales como la selección durante el apa­ reamiento sexual. Por ejemplo, los ratones son capaces de distin gu ir com pañeros g e n é tic a ­ mente idénticos excepto en el conjunto d e ge­ nes del CMH en base a su alta sensibilidad ol­ fatoria. Existe una correspondencia e n tre el olor de un ratón y sus genes del CMH. Los ani­ males con el mismo olor se rechazan durante la

274

Aspectos básicos de la inmunidad Leucocitos granulares

Parásito

F ig. 14-3. Los leucocitos de invertebrados son capaces de inm ovilizar parásitos, tales com o cestodes, trem atodes, nem atodes, hongos y protozoarios, que son dem asiado grandes para ser fagocitados, encerrándolos con varias capas d e células. Esta form a de respuesta ha sido observada en tunicados, equinoderm os, crustáceos, sipuncúlidos, anélidos, celenterados y espongiarios. En los insectos el contacto entre el parásito y leucocitos granulares induce la degranulación y form ación de un coágulo localizado. D e este evento se originan señales quim iotácticas que reclutan un segundo tipo celular hialino o am eboide con actividad fagocítica (plasm atocitos). Estas células se agregan en capas, sufren un proceso de adelgazam iento y form an una cubierta m ulticelular que encierra una m asa de m aterial necrotizado y parásitos secuestrados. M ecanism os sim ilares han sido descritos en m oluscos, particularm ente en especies que actúan com o vectores de parásitos que afectan al hom bre. L a form ación de nódulos puede ser iniciada por la presencia de lipolisacáridos bacterianos, glucanos p-1,3 o zymosan.

selección de apareamiento sexual, evitando la endocría, garantizando la herencia de dos ha­ plotipos distintos e incrementando el polimor­ fismo. Se ha demostrado que es suficiente la al­ teración de un único gen del CMH para modifi­ car el olor del ratón. Es decir que CMH provee una serie de estigmas sociales que permiten la distinción de lo propio y lo no propio además de participar de los eventos de reconocimiento célula-célula. En este sentido el CMH del ratón cumple un rol similar a su correspondiente de los primitivos invertebrados coloniales, deter­ minando si dos colonias se fusionan en un caso o si dos ratones se aparean en el otro. En las aves se han obtenido ejemplos similares de co­ rrespondencia entre genes de CMH y selección

durante el apareamiento en base a los colores del plumaje. Linfocitos y órganos linfoides Los linfocitos han sido descritos en todas las clases de vertebrados y se aprecia una gran si­ militud a lo largo de toda la línea evolutiva, desde las lam preas hasta los mamíferos. Los órganos linfoides muestran una com plejidad creciente a lo largo de la misma línea evoluti­ va. En las especies más primitivas sólo se ob­ serva tejido hnfoide asociado al tracto intesti­ nal (TLAI). Los linfocitos, derivados de la capa mesodérmica, colonizan tejido de origen endodérmico. Muchos de los órganos linfoides que

Evolución del sistema inmune

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B Fig. 14-4. L a estructura de los anticuerpos en los distintos vertebrados es similar, pero la organización de los g en e s de ca­ denas pesadas y livianas así com o la regulación de la producción de anticuerpos es diferente en las diversas clases. A. Co­ mo ejem plo se m uestra la secuencia de am inoácidos de cadenas livianas X del tiburón H eterodontus fra n ch e sc h ii en la parte superior y del hom bre en la parte inferior. L a hom ología entre am bas secuencias en la región V es m ayor q u e 50%. B. Los tiburones tienen ocim encias m últiples de segm entos V nJnC n de cadenas livianas X separados entre sí al m en o s por 20 kb. L a secuencia de cada uno de estos segm entos es distinta. E n la línea germ inal, las regiones V y J están separadas por 0.4 kb y contienen los heptám eros y nonám eros necesarios para la recom binación (a). En cam bio, en algunos caso s las regiones V y J aparecen unidas por lo que no existiría recom binación p ara generar diversidad (b). Es decir que la diversi­ dad en los tiburones depende de la ocurrencia m últiple de .segmentos VJC, En (c) y (cl) se m uestra la organización de ge­ nes de cadena liviana X de ratón y hum ana respectivam ente. Se ha postulado que la organización prim itiva de g en e s de Igs hallada en los peces cartilaginosos habría dado origen a la que se observa en teleósteos, anfibios, y m am íferos p o r selec­ ción de segm entos V JC y am plificación por duplicación m asiva en tándem de las regiones V. La organización d e genes en las aves en las que existe una sola región V y m últiples seudogenes y en donde la diversidad se obtiene por co n v ersió n gé­ nica sería una deform ación de la línea evolutiva teleósteos-anfibios-m am íferos.

se observan en las etapas posteriores de la evo­ lución, como el timo, bazo y las placas de Pe­ yer constituyen especializaciones del TLAI que se observa en las especies primitivas (cuadro 14-1).

Los linfocitos de los vertebrados primitivos (ciclóstomos) no han adquirido especialización y muestran simultáneamente características de células T y B (proliferación en CML, capaci­ dad de producción de anticuerpos, participa-

276

Aspectos básicos de la inmunidad

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males por las células T y los macrófagos, res­ pectivamente, produce la necrosis de los teji­ dos, originando una reacción de hipersensibili­ dad mediada por células. Otras reacciones inm unopatológicas causa­ das por infecciones bacterianas incluyen las de­ nominadas enfermedades autoinmunes y la for­ mación de complejos inmunes. En el caso de las enfermedades autoinmunes han sido implicados varios productos del meta­ bolism o bacteriano, como lipopolisacáridos, proteínas, etc. Estos productos inducen reaccio­ nes inmunes no específicas que pueden supri­ mir las respuestas específicas involucradas en la capacidad protectora. A lgunos ejem plos aclararán este concepto. La p ro teín a A de Staphyíococcus aureus tiene la propiedad de combinarse con la porción Ec de la IgG huma­ na. Así, el complejo formado reacciona con el complemento del suero, produciendo su agota­ miento; por este mecanismo una infección esta-

filocócica podría reducir las defensas del hués­ ped contra otros microorganism os invasores. También se ha demostrado que un extracto de poUsacáridos de Bordetella pertussis disminu­ ye la respuesta de hipersensibilidad tardía a la tuberculina, probablemente por inhibición de la proliferación o de la actividad de linfocitos o de ambas. Los complejos inmunes que se forman du­ rante las infecciones bacterianas usualmente no provocan un daño importante. Sin embargo, al­ gunas infecciones pueden producir enfermeda­ des debidas a la formación de complejos inm u­ nes. Uno de los ejemplos más conocidos es la glom erulonefritis aguda post-estreptocóccica. En eUa, los complejos antígeno-anticuerpo de­ sencadenan varios mecanismos locales secun­ darios que contribuyen a la formación de lesio­ nes glomerulares, que se presentan al m icros­ copio electrónico como depósitos electrónica­ mente densos. Mediante técnicas histopatológi­ cas se demostró que estos depósitos contienen comiánmente IgG, C3 y properdina. Aun cuan­ do no esté definido el antígeno específico que provoca la glomerulonefritis post-estreptocóccica, su patogenia parece semejante a la forma aguda de la enfermedad del suero en conejos, segtín se esquem atiza en la figura 24-7. Se piensa que las lesiones glomerulares de la en­ docarditis bacteriana subaguda, la bacteriemia estafilocócica y la neumonía neumocócica obe­ decerían a mecanismos similares.

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Inmunología de las micosis

RICARDO NEGRONI

INTRODUCCIÓN Se agrupan dentro de las micosis sistémicas todas aquellas afecciones cuyo agente etiológi­ co es capaz de diseminarse por vía linfohemática en algún momento de su evolución, provo­ cando la agresión simultánea a diversos órga­ nos con serio riesgo para la vida del pacien^e_26,39 Estas m icosis deben dividirse en dos grandes c a t e g o r í a s , a q u e l l a s ocasionadas por hongos patógenos primitivos como el Histoplasm a capsulatum o el P aracoccidioides brasiliensis, y las producidas por hongos de ba­ ja virulencia, llamadas micosis oportunistas, a causa de que su presentación depende de la existencia en el huésped de una patología pre­ via que disminuye sus defensas, ya sea en el orden local o en el general. Estos dos tipos de afecciones son muy dife­ rentes en lo que atañe a las relaciones huéspedparásito y conviene tratarlas separadamente. I. MICOSIS SISTÉMICAS Caracteres de las micosis sistémicas Generales Reservaremos el nombre de micosis sistémi­ cas para aquellas producidas por hongos pató­ genos primitivos. Éstos viven normalmente en el mundo exterior, donde desarrollan una vida saprofita en el suelo o sobre deyecciones de animales y pueden infectar al hombre y otros vertebrados por medio de sus esporas. La vía de penetración es generalm ente inhalatoria, producen cuadros de primoinfección pulmonar

25 habitualmente benignos que, en su mayor parte curan en forma espontánea. Un reducido nú­ mero de sujetos infectados, uno de cada 500 o 1.000, según la micosis, no se defiende ade­ cuadam ente; su afección pulm onar se torna progresiva y, por último, el agente etiológico se disemina por vía linfohemática y ataca di­ versos órganos llevando al paciente, de no me­ diar un tratamiento adecuado, a la muerte en un lapso variable. A este grupo pertenecen 5 enferm edades: coccidioidomicosis, histoplasmosis, paracoccidioidomicosis, blastomicosis y criptococosis. Se designa con el nombre de micosis-infec­ ción a las formas respiratorias benignas, subclínicas o asintom áticas que curan espontánea­ mente y con el de m icosis-enferm edad a las evolutivas y graves. Una característica importante de estas mico­ sis es que cada una de ellas posee una distribu­ ción geográfica peculiar. Todas son más fre­ cuentes en el continente americano y, salvo la blastomicosis (antes conocida como blastom i­ cosis norteamericana), todas han sido halladas en la Argentina.>3‘->33-'« Otro rasgo distintivo de importancia es que, eon excepción del Cryptococcus neoformans, todos los agentes productores de micosis sisté­ micas son dimorfos, es decir, que se presentan como hongos filamentosos con producción de distintos tipos de esporas en su vida saprofítica y como elementos levaduriformes o esporan­ gios en la parasitaria. Ello se debe probable­ mente a que en el seno de los tejidos parasitados el hongo debe adaptarse a las defensas del huésped y a condiciones de desarrollo constan­ tes en lo que atañe a temperatura y humedad. Este proceso fue llamado “animalización” .'^®

Inmunología de las micosis Epidemiológicos y relaciones huésped-parásito Los estudios realizados sobre la coccidioidomicosis-infección'^''’-’®permitieron establecer una serie de hechos fundamentales que más tarde fueron comprobados en otras micosis sistémi­ cas. Éstos pueden resumirse así: 1 ) la primoinfección pulmonar origina un complejo primario similar al de la tuberculosis; 2 ) los animales do­ mésticos y silvestres de las zonas endémicas se infectan espontáneamente de la misma forma que el hombre; 3) la fuente de infección común para ambos es el suelo; 4) la primoinfección es, en la mayoría de los casos, asintomática o subclínica, cura espontáneamente, deja una sólida inm unidad frente a las reinfecciones y como únicas secuelas produce la alergia cutánea fren­ te a los antígenos del agente causal y, en ocasio­ nes, focos de calcificación pulmonar. Estas m i­ cosis no son contagiosas de hombre a hombre ni de los animales al hombre; sólo se producen pequeñas epidemias cuando un grupo de suje­ tos, por razones diversas, se expone simultánea­ mente a una fuente de infección masiva. Las encuestas realizadas mediante intrader­ morreacciones han demostrado que la micosisinfección es extrem adam ente com ún en las áreas endémicas, en particular en el continente americano. Se calcula que en el sudoeste de los Estados Unidos existen 10 millones de sujetos infecta­ dos por el C. immitis,^^^ y las encuestas realiza­ das en nuestro país acusan un índice de infec­ ción en la población infantil que varía entre el 10,6 y 19,72%.'2s-‘3o En lo referente a histoplasmosis, la población de la zona estadounidense del valle del Mississippi-Missouri presenta un índice de infección del 90% y se calcula que el número total de in­ fectados es de 40 millones. En la pampa húm e­ da argentina el porcentaje de infección es del 33 al 35%,*'^^ lo cual hace suponer la existencia de 6 millones de personas infectadas. Las encuestas similares realizadas con antí­ genos del P. brasiliensis han demostrado, se­ gún las zonas endémicas, índices de positividad de las pruebas cutáneas que varían entre el 9,2 y el Desde hace poco tiempo se cuenta con un reactivo eficaz para reacciones intradérmicas del C ryptococcus neoform ans’,'^'^ un estudio realizado en Oklahoma demostró 19% de reac­ tores positivos entre 477 personas sanas,* 14,1% en Córdoba (Argentina) y 2% en la ciu­ dad de Sao Paulo (Brasil). En contraste con la alta frecuencia de la in­ fección, los casos clínicos evolutivos de estas micosis sistémicas son relativamente raros; por ejemplo, la prevalencia de la paracoccidioido-

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micosis en la zona endémica de la Argentina ha sido calculada en uno de cada 1 0 0 . 0 0 0 habitan­ tes por año.*'”’ Esta desproporción indica, por una parte, deficiencias de diagnóstico y de de­ nuncia y, por otra, la existencia de numerosas infecciones subclínicas. La edad, el sexo, la profesión, la raza y los hábitos constituyen factores predisponentes p a­ ra la presentación de las formas progresivas de m icosis-enferm edad. Es más frecuente en la edad media, entre 30 y 60 años. El sexo m ascu­ lino es más atacado que el femenino; la d ife­ rencia varía según la micosis y las zonas endé­ micas. En la Argentina, la incidencia en el sexo masculino en relación con el femenino es m á­ xima en la paracoccidioidomicosis (70:1), le si­ guen la histoplasmosis (40:1), la coccidioidomicosis (4:1), y la criptococosis (2 : 1 ), La diferente susceptibilidad según el sexo fue atribuida a razones profesionales, pero esta explicación resulta poco plausible ya q u e la proporción de infectados es aproximadamente igual en ambos sexos. Mucho más lógico resul­ ta aceptar la existencia de factores hormonales; al respecto se ha demostrado que los estróge­ nos inhiben el desarrollo del P. brasiliensis y del H. capsulatum, aunque en concentraciones más elevadas que las presentes en los tejidos humanos,'^® Se ha comprobado que en el cito­ plasma de la fase filamentosa del P. brasilien­ sis existen receptores para estrógenos que im­ piden su transformación a la fase levaduriforme, que los fagocitos provenientes de animales hembras son más eficaces,'^'’ y que los hám ster hembras son más resistentes que los machos a la infección por el Blastomyces derm a titid isy Las tareas rurales, por su m ayor contacto con la fuente de infección, constituyen un fac­ tor predisponente, pero cabe destacar la exis­ tencia de casos urbanos de histoplasm osis y criptococosis. La importancia de la raza ha sido señalada en la coccidioidomicosis,*^'' ya que los indivi­ duos de piel oscura presentan formas disem ina­ das con mayor frecuencia; en la histoplasmosis, por el contrario, las formas pulmonares evoluti­ vas son 24 veces más frecuentes en los blancos que en los negros,*^* Aún no han sido confirm a­ do que haya una mayor incidencia de la para­ coccidioidomicosis entre los eslavos y sajones. En relación con los hábitos, cabe destacar una elevada frecuencia de alcohólicos entre los pacientes con micosis sistémicas graves. Ciertas enfermedades preexistentes pueden actuar favoreciendo la diseminación de la histoplasm osís o la aparición de formas m e n ín ­ geas en la criptococosis, como sucede con los lin fo m a s, la e n fe rm e d a d de H o d g k in y el SIDA, La criptococosis es la micosis sistémica asociada al SIDA que se observa con mayor

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frecuencia. A ctualm ente en el Hospital F. J. Muñiz de la ciudad de Buenos Aires, se inter­ nan 90 nuevos casos por año, en tanto que an­ tes de la pandemia sólo se observaban 3 o 4 ca­ sos en igual lapso. En el mismo nosocomio se diagnosticaron en 1994, 48 casos de histoplas­ mosis progresiva diseminada, de los cuales 40 se asociaron al SIDA. Se ha comprobado que la administración de corticoides y drogas citotóxi­ cas pueden exacerbar m icosis laten tes, por ejemplo, histoplasmosis, coccidioidomicosis y criptococosis.’'’ Aspectos inmunológicos de las micosis sistémicas Las pruebas cutáneas; su valor pronóstico y diagnóstico Las pruebas cutáneas en las micosis sistémi­ cas son realizadas en form a sem ejante a la reacción de Mantoux en la tuberculosis. Los antígenos empleados: histoplasmina, eoccidioidina, paracoccidioidina, se preparan según téc­ nicas estandarizadas que han sido descritas por diversos a u t o r e s . Recientemente, se ha insistido en la mayor sensibilidad de los antíge­ nos obtenidos a partir de la fase parasitaria de­ sarrollada in vitro, tanto en C. immitis como en H. capsulatum y P. brasiliensis?'^-'^^’''^'^''^'^'^ La potencia antigénica de cada lote debe ser probada en animales infectados experimental­ mente y en humanos cuya capacidad reactiva sea conocida, ya que se carece por el momento de métodos químicos útiles para tal fin.''^* Las intraderm orreacciones son leídas a las 24, 48 y 72 horas y su resultado se expresa en milímetros del área de induración. Actualmente se aconseja realizar una primera lectura entre las 2 y 6 horas, para excluir cualquier posibili­ dad de fenómeno de Arthus que podría falsear el resultado;’'* asimismo, hay casos raros en que estas pruebas se tornan positivas 4 o 5 días des­ pués de su realización.'®'’ Estas reacciones de hipersensibilidad retar­ dada se hacen presentes entre los 15 y los 40 días siguientes a la infección, se mantienen po­ sitivas muchos años, habitualmente toda la vi­ da, pero con frecuencia declinan después de los 60 años. La reacción cutánea positiva indica, por lo tanto, infección actual o pasada. Es de gran utilidad para el estudio de las áreas endé­ micas, pero su valor diagnóstico de infección actual se limita a los siguientes casos: 1 ) cuan­ do se com prueba en lactantes; 2 ) cuando se asiste al viraje de la reacción de negativa a po­ sitiva, y 3) cuando aparece en una persona que no ha habitado anteriormente en zona endémi­ ca y que no presenta reacciones fuertem ente positivas con otros antígenos fúngicos.^

Se pueden com probar reacciones cruzadas entre los diversos agentes causales de micosis sistémica a causa de la existencia de antígenos semejantes. Sin embargo, las pruebas son más intensas con el antígeno homólogo; por lo tan­ to, es aconsejable realizar las intradermorreac­ ciones con todos ellos y considerar positivo só­ lo a aquel que proporciona la pápula más ex­ tensa. La frecuencia de las reacciones cruzadas disminuye con el empleo de antígenos diluidos; por ello se aconseja utilizar la dilución óptima, que es la m ínim a concentración del reactivo que p ro p o rc io n a un elevado p o rc en taje de pruebas cutáneas positivas en sujetos que su­ frieron la infección y en animales infectados experimentalmente. Los estudios histológicos de las pruebas cu­ táneas positivas han demostrado que el infiltra­ do está constituido por cúmulos de células mo­ n onu cleares, en esp ecial lin fo cito s, que se agrupan alrededor de los vasos sanguíneos y los anexos cutáneos, tanto en la dermis como en la hipodermis; se observa, además, vasodila­ tación y edema. Con la paracoccidioidina''’®y, en algunos casos, con la c o c c i d i o i d i n a , s e comprobó eosinofilia. En las formas evolutivas de las micosis sisté­ micas, el resultado de las intradermorreaccio­ nes tiene gran interés pronóstico, pues su nega­ tividad es índice de gravedad y de tendencia a la diseminación hematógena. En la coccidioidomicosis se ha demostrado que el empleo de diversas diluciones de coccidioidina hace de la reacción cutánea una prue­ ba, en cierta form a cuantitativa, que perm ite m edir la hipersensibilidad, la cual guarda un estrecho paralelismo con la capacidad del suje­ to para resistir la infección.^^' Se ha podido demostrar que el 30% de las histoplasmosis*'*'’ y el 51% de las paracoccidioidomicosis diseminadas graves*” presentan intraderm orreacciones negativas con la dilu­ ción óptima del antígeno homólogo. La mayo­ ría de estos pacientes viraron hacia la positivi­ dad, muchas veces intensa, después de la cura­ ción merced a un tratamiento adecuado. En los casos asociados al SIDA, en los cua­ les este viraje de negativo a positivo es im posi­ ble por la ausencia de un número adecuado de células TCD^ positivas, debe instituirse un tra­ tamiento supresivo para evitar las recaídas. Es­ ta misma conducta se debería adoptar en otros enfermos que sean incapaces de recuperar la positividad de la prueba cutánea específica. La inmunidad mediada por células Se han establecido numerosas alteraciones de la inmunidad mediada por células en los en­ fermos que padecen micosis sistémicas; la gra­

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vedad de aquéllas es proporcional a la severi­ d o s . S e observa, en las formas graves y di­ seminadas, una declinación de los niveles de dad de la afección. Las anormalidades comprobadas son las si­ linfoquinas en respuesta a la interleuquina 2 guientes: 1 ) pruebas cutáneas de hipersensibili­ (IL-2), así como una menor producción del fac­ dad retardadas negativas, tanto con el antígeno tor de necrosis tumoral (FNT) y del interferón-Y específico como con otros a los cuales gran (IFN-y), este último es un importante activEidor parte de la población reacciona positivamente, de los macrófagos^'^“ Se piensa que la dism inu­ como candidina, PPD y tricofitina;^-*’^'"''''*^’ 2) ción de células CD^ en la sangre circulante es, ausencia de respuesta cutánea a la fitohemaglu- al menos en parte, debida a que estas células tinina;'^'*-'^'’ 3) incapacidad para adquirir sensi­ quedan atrapadas en los granulomas. Entre las células que actúan como m ecanis­ bilización frente al dinitroclorobenzeno;"''''^'* ’^’' 4) disminución de la transformación linfoblás- mos defensivos naturales deben destacarse las tica y captación de timidina tritiada frente al asesinas naturales (NK). Estas se unen a la pa­ antígeno específico, la candidina y la fitohema- red celular de algunos hongos patógenos por glutinina;*^-^-"’'''*’ 5) presencia en el plasma de medio de microvellosidades y producen citoliun factor inhibidor de la transformación blásti­ sina y perforinas que destruyen las células fúnca que no está relacionado con los anticuerpos gicas. Estas interacciones han sido particular­ esp ecífico s, se tra ta ría de una a.2 globuli- mente bien estudiadas entre las NK y el C. neona;i24,i6i 5 ^ ausencia del factor inhibidor de la formans."'^’'' Los macrófagos parecen desempeñar un pa­ migración de monocitos en tubo capilar (MIF) frente al antígeno específico y la candidina;’^'* pel relevante en la defensa contra la m icosis. 7) disminución del porcentaje de linfocitos T Se ha comprobado que los macrófagos del exu­ en sangre periférica, determinado por la técnica dado peritoneal de ratones inmunizados con H. capsulatum poseen una fagocitosis mucho más de form ación de rosetas en casos graves puede haber una inversión de la propor­ activa que los de animales no inmunes y que ción de linfocitos T cooperadores CD^supreso- dicha propiedad es mediada por los linfocitos T res CDg, y 8 ) prolongación del tiempo de su­ sensibilizados.®’ ® Estos actúan por m edio de pervivencia de los injertos cutáneos no autólo- algunas citoquinas, particularm ente el IFN -y gos,‘- disminución del numero de linfocitos T que es un potente activador de los maerófagoen el área paracortical de los ganglios linfáticos s 212a Lqj, mononucleares inhiben el desarrollo del H. capsulatum al provocar alteraciones en y reducción del tamaño de sus folículos."'’ La pérdida de funciones de los linfocitos T la síntesis de sus proteínas, pero el mecanismo parece seguir un orden progresivo. Inicialmen­ íntimo por el cual actúan es desconocido.’®Por te se pierde la capacidad de sensibilización al el contrario, es sabido que los polimorfonuclea­ dinitroclorobenzeno; más tarde se tornan nega­ res ejercen su acción deletérea sobre estos gér­ tivas las pruebas cutáneas de hipersensibilidad menes mediante diversos elementos: pH ácido, retardada con antígenos microbianos, en parti­ lisozima, mieloperoxidasa, fagocitina, histona cular con el específico de la micosis que aqueja y otras proteínas catiónicas. El estudio de la ca­ al paciente; luego se comprueba depresión de pacidad fagocitaria y lítica de los leucocitos de la transformación linfoblástica frente a la fito- sangre periférica obtenidos de 17 pacientes con hemaglutinina, y la última función en alterarse paracoccidioidomicosis frente al P. hrasiliensis es la capacidad para rechazar injertos heterólo- y R hodotorula spp., dem ostró que aq u éllas eran adecuadas y que el suero de los enfermos gos.'*-^-'^^ Algunos pacientes pueden modificar su esta­ poseía opsoninas estim ulantes de dicha fun­ do inmunológico desde una inmunodeficiencia ción.'*-"’ El estudio de la capacidad fagocitaria y acentuada a una inmunocompetencia satisfac­ lítica de los macrófagos y leucocitos polim or­ toria por medio del tratamiento adecuado. T o­ fonucleares de sangre periférica en pacientes das las alteraciones de la respuesta celular, tan­ portadores de formas graves de paracoccidioi­ to in vivo como in vitro, son más acentuadas domicosis e histoplasmosis, ha perm itido ob­ con el antígeno específico’'"* y la recuperación servar que estas funciones están deterioradas de la reactividad cutánea frente a éste se asocia durante la progresión activa de la enfermedad y que se recuperan parcialm ente con el trata­ con la remisión de la enfermedad. Todo parece indicar que el déficit de la inm u­ miento exitoso de estas micosis."-*’ nidad mediada por células se debe a varios fac­ tores: formación de com plejos antígeno-anti- La inmunidad humoral, cuerpo-complemento; exceso de antígeno libre las inmunoglobulinas y las reacciones que estimula las poblaciones de linfocitos T su­ serológicas presores CDg y aumento de las globulinas a que Los estudios de la inmunidad humoral han actúan como un factor inhibidor de la transfor­ mación blástica de los linfocitos T sensibiliza­ demostrado que los pacientes con micosis sis-

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témicas no exhiben deficiencias en cuanto a la producción de anticuerpos y que la realización de pruebas serológicas presenta un importante valor diagnóstico y pronóstico en estas enfer­ medades. Las reacciones serológicas más frecuente­ mente empleadas son la precipitación en tubo, la aglutinación de partículas de látex sensibili­ zadas con antígenos fúngieos, la fijación de complemento, la inmunodifusión, la contrain­ m unoelectroforesis y las pruebas de ELISA (enzimoinmunoensayo); el empleo conjunto de dos o más de estas técnicas permite el diagnós­ tico serológico de más del 90% de los procesos evolutivos. Los antígenos empleados son diversos: fil­ trados del desarrollo en medios líquidos, des­ pués de 6 a 9 meses de incubación estática"®® o de 4 semanas en agitador mecánico,'® sobrena­ dante de células levaduriformes rotas por ultra­ sonidos o procedimientos mecánicos de ruptu­ r a , U s a d o s de m icelio joven con toluol al 3%,"’'* exoantígenos, que son extractos acuosos de levaduras o hifas sin romper, obtenidos des­ pués del contacto de agua destilada con mertiolato de sodio l/1 0.000, durante 24 horas con las colonias fúngicas, o fracciones parcialmen­ te purificadas por precipitación con alcohol, acetona u otras técnicas, que consisten por lo general en polisacáridos n i t r o g e n a d o s . E n realidad, estos preparados son un mosaico del cual pueden separarse numerosas parcelas por eleetroforesis, algunas de ellas dotadas de gran e s p e c i f i c i d a d . P o r ejemplo, de la paracoc­ cidioidina pudo purificarse una glucoproteína de 43kD que ha sido exitosamente empleada en varias pruebas serológicas, incluso en una de unión inmunológica en gota (“dot immunobiding assay”) que resultó muy económica y efi­ caz,220a De la histoplasmina se han obtenido 2 gluco­ proteínas de gran especificidad, la M posee 55% de carbohidratos y su PM es de 150 kD, en tanto que la H pesa 120 kD y contiene 32% de carbohidratos. En las prim oinfecciones sintom áticas, las reacciones de precipitación en tubo (PT) se tor­ nan positivas 4 a 7 días después del contacto infectante. Alcanzan su título máximo a las 2 o 3 semanas y se negativizan entre 1 y 5 meses más ta rd e .G e n e ra lm e n te no tienen valor pro­ nóstico pues se tornan negativas en el plazo in­ dicado, aun en aquellos casos que evolucionan hacia la diseminación.’^'* En la paracoccidioidomicosis la PT es positi­ va en el 1 0 0 % de los casos con menos de 1 año de evolución; es la primera reacción serológica en negativizarse después de la curación clínica y la más precoz en tornarse positiva en las reci­ divas.^'’ Su principal inconveniente lo constitu­

ye la difícil lectura a causa del fino precipitadoproducido. Las reacciones de aglutinación de partículas de látex (AL), sensibilizadas con antígenos fil­ trados (histoplasmina y coccidioidina), son más sensibles y de lectura más fácil que la PT. Se las ha empleado como sustituto de la precipita­ ción, pero producen con mayor frecuencia re­ sultados falsos positivos.’^ Las pruebas de fijación de com plem ento (PFC) se positivizan más tardíamente, después de. 1 mes o más del contacto infectante. En las primoinfecciones leves, la PFC permanece ne­ gativa y se torna positiva sólo en las moderadas o graves. En las formas diseminadas, su título aumenta en proporción a la severidad de la en­ fermedad y cae gradualmente al producirse la curación clínica por el tratamiento adecuado, hasta negativizarse varios meses o un par de años después.^®' En general, estos anticuerpos son persistentes y pueden quedar cicatrices se­ rológicas, con títulos bajos, en pacientes clíni­ camente c u r a d o s . E n los casos no controla­ dos por el tratamiento, los anticuerpos aumen­ tan hasta alcanzar niveles muy elevados y, fi­ nalmente, descienden en forma brusca poco an­ tes de la muerte.*'*^ La técnica de esta prueba ha sido estandari­ zada, **° y para confeccionar curvas serológicas se aconseja su repetición cada 8 semanas. En algunas oportunidades, la interpretación de los resultados de la PFC es difícil a causa de la existencia de reacciones cruzadas con antíge­ nos de otros hongos; también se pueden obser­ var pruebas positivas en sujetos sanos que han sido sometidos recientemente a pruebas cutá­ neas, en especial con histoplasmina.**"” En es­ tos casos, los títulos son habitualmente bajos, 1 /8 o 1/16, y casi siempre se los com prueba con los antígenos de la fase levaduriforme.®^ En la p a ra co ccid io id o m ico sis in fa n til la prueba de fijación de complemento suele ser negativa, aun en casos muy graves. La inmunodifusión en gel de agar (ID) es el método serológico más empleado en las mico­ sis a causa de su técnica sencilla y resultados específicos;®^'’*' ha sido estandarizada por la Oficina Sanitaria Panamericana. Sus resultados coinciden con los de la PFC, y el empleo simultáneo de ambas reacciones es aconsejable ya que la ID está dotada de una mayor especificidad a causa de su menor sensi­ bilidad, en tanto que la PFC permite una mejor cuantificación. La frecuencia de reacciones cruzadas con otros antígenos fúngieos en la ID es sólo del 1 o Los sueros de pacientes con histoplasmosis presentan dos bandas de precipitación con la histoplasmina, llamadas H y M cuyas caracte­ rísticas fisicoquímicas ya han sido comentadas.

Inmunología de las micosis La banda H indica actividad lesiona! y no es in­ fluida por la prueba cutánea, en tanto que la M puede aparecer en el suero de personas sanas que hayan tenido recientemente una prueba cu­ tánea positiva con histoplasmina.®^’*’La paracoccidioidina presenta 3 bandas de precipitación con los sueros de enfermos con paracoccidioidomicosis, una de ellas de reac­ ciones cruzadas con la banda M de la histoplasmina.'**"* Como ya señalamos el principal com ­ ponente antigénico es una glucoproteína de 43 kD (gp 43). La ID ha permitido separar 4 componentes antigénicos en la eoccidioidina, la banda 1 co­ rresponde al antígeno que es responsable de la aglutinación del látex y la 2 al que produce la fijación del complemento.'"* Pudo demostrarse que calentando la coccidioidina a 60°C durante 30 minutos, se elimina la fracción 2 responsa­ ble de la fijación de complemento y que tam ­ bién da resultados positivos frente a IgG espe­ cífica en reacciones de inmunodifusión en gel de agar. E m pleando esta últim a técnica con coccidioidina sin calentar puede ponerse en evidencia la IgM e s p e c í f i c a . S e demostró que la ID puede ser cuantificada mediante el empleo de diluciones de suero y que sus títulos, aunque inferiores, son proporcionales a los de la PFC.'3s.'35.i‘*8 La contrainm unoelectroforesis es una v a ­ riante de la ID que ha sido empleada en el serodiagnóstico de las micosis a causa de la facili­ dad que otorga su rápida lectura.^’''’®-'’'' Su utilización se ha generalizado en los últi­ mos años en virtud de su mayor sensibilidad y gran e s p e c i f i c i d a d . P u e d e utilizársela aisla­ damente o combinada con la inm unodifusión secundaria, lo cual permite demostrar la exis­ tencia de parcelas antigénicas de migración catódica.’-^^^ El agregado de 1% de polietilengli­ col 6 . 0 0 0 al gel de corrida torna a esta reacción muy s e n s i b l e . L a realización de pruebas de inmunodifusión en gel de agar o contrainm u­ noelectroforesis con el empleo de sueros patro­ nes positivos o sueros m onoespecíficos que reaccionan contra parcelas antigénicas de apa­ rición frecuente, ha dotado a estas técnicas de una gran especificidad. Recientemente se han ensayado nuevas téc­ nicas serológicas dotadas de mayor sensibili­ dad, como el ELISA. También en esta micosis se han ensayado la inmunodifusión radial y la aglutinación de partículas de látex.*’®'**’ El radioinm unoensayo para detectar a n ti­ cuerpos antiantígeno M en histoplasmosis ha sido empleado con éxito.*''* Se necesita aún una mayor experiencia para valorar la utilidad definitiva de estas pruebas. La inmunodifusión radial y la inmunodifusión com parativa con antisueros m onoespecíficos

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parecen destinados a tener una amplia aplica­ ción en el serodiagnóstico de estas micosis. Los resultados de las pruebas de ELISA y RIA en las micosis sistémicas son aún difíciles de interpretar debido a que su mayor sensibili­ dad va en desmedro de su especificidad. Los resultados de las reacciones serológicas en la criptococosis han sido bastante equívocos a causa de la existencia de un estado de no res­ puesta inmunológica, producido por exceso de antígeno polisacárido liberado por C. neoform ans.'^' M ediante una com binación de tres pruebas se ha conseguido alcanzar el diagnósti­ co serológico del 92% de los casos comproba­ dos por cultivos.*'’•**■**•*-'’ Para detectar la p resen­ cia de anticuerpos circulantes se emplean la in­ munofluorescencia indirecta y la aglutinación en tubo; la primera es más sensible y la últim a más específica. La presencia de polisacárido capsular en el suero, líquido cefalorraquídeo u otros fluidos se demuestra por la aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con suero de conejo anticriptococo.*^ También se puede utilizar con este propósito un ELISA cuyos re­ sultados coinciden con los de la aglutinación del látex en más del 95% de las muestras. En los casos en los cuales la investigación de anticuerpos es negativa y la de polisacárido capsular positiva, el pronóstico es malo; p o r el contrario, la negativización de la prueba del lá­ tex para polisacárido capsular es índice de m e­ joría. Se han podido demostrar antígenos espe­ cíficos en el suero y la orina concentrada de en­ fermos graves con histoplasmosis y paracocci­ dioidomicosis. Para la primera se emplea un ra­ dioinmunoensayo con anticuerpos m onoclona­ les contra una glucoproteína de la pared del H. capsulatum, esta reacción es positiva en el 90% de los casos asociados al SIDA^^*“ En la para­ coccidioidom icosis se comprobó la presencia de la gp 43 en el suero de enfermos graves, m e­ diante el empleo del “Western blott”.**'>'' Las micosis sistémicas graves muestran alte­ raciones del proteinograma, que consisten en dism inución de la albúm ina y aum entos del porcentaje de globulinas a expensas de las a ,, y y-globulinas, en tanto que las ¡3-globulinas y la cifra total de proteínas séricas se m antie­ nen norm ales. Estas alteraciones son p ro p o r­ cionales a la gravedad y la extensión de la enferm edad.7'‘>-«-**>3.*s«>,i38,)58

Los niveles de IgM determinados por medio de inmunodifusión radial están elevados en las primoinfecciones moderadas o graves de histo­ plasmosis y su tenor guarda relación con los tí­ tulos de la PT y la AL.^^ La positividad de estas reacciones depende de un anticuerpo específico 19 S. En un estudio realizado en B rasil por Mota y Franco"’ no fue posible demostrar va­ lores elevados de IgM en la paracoccidioidomi-

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cosis y no hubo relación entre el nivel de esta inmunoglobulina y la forma clínica presentada por el paciente. Por lo tanto, el significado de anticuerpos IgM en esta afección necesita aiín ser establecido. Por el contrario, el anticuerpo responsable de la ID y la PFC es una IgG; los niveles de esta inmunoglobulina están elevados en las formas crónicas y guardan correlación con los títulos de las re a c c io n e s s e r o l ó g i c a s m e n c i o n a ­ d a s . E n las histoplasm osis crónicas, particularmente las que presentan participación pulmonar, hay aumento de la IgA.^^ Aspectos histopatológicos vinculados a la reacción huésped-parásito Los estudios histopatológicos realizados en la paracoccidioidomicosis, tanto experimental como humana, han demostrado que las carac­ terísticas del proceso inflamatorio, así como la morfología del parásito, están influidos por el estado inmunoalérgico del huésped.’-'**’'^^-'-’* *® En la fase aguda, cuando aún no se ha instala­ do la inmunidad adquirida, y en los procesos evolutivos graves, predominan las lesiones su­ purativas y necróticas, y no existe una adecua­ da barrera conjuntivo-histiocitaria. En estos casos, el P. hrasiliensis se m ultiplica lib re ­ mente y se observa la brotación múltiple acele­ rada (criptoesporulación) que le confiere el as­ pecto típico de rueda de timón. Por el contra­ rio, en las formas crónicas cuando el huésped ofrece una mayor resistencia, predominan los procesos productivos con formación de granu­ lomas foliculares, de células epitelioides y gi­ gantes, con los que pueden coexistir áreas de supuración. Las células gigantes y los macró­ fagos engloban al hongo y retardan su evolu­ ción o lo destruyen: se comprueban en estos casos formas catenuladas o de brotación sim ­ ple y aun parásitos con alteraciones morfológi­ cas visibles y sin brotes. La etapa final de este proceso es la cicatrización fibrosa y, más rara­ mente, la calcificación.'’ Hace poco tiempo se comprobó la presencia de IgG y C3 en los granulomas productivos. Lo que parece indicar que la formación de comple­ jos antígeno-anticuerpo-compleraento desem ­ peña un papel im portante en la formación de estos granulomas. En realidad el papel desem­ peñado por las inmunoglobulinas y el comple­ mento, así como el de ia inmunidad humoral en general, ha dado lugar a varias hipótesis. Po­ drían cooperar con la destrucción de los hongos in situ al opsonizar las eélulas fúngicas y po­ drían im pedir el escape de antígenos h acia afuera de los granulomas. En la coccidioidom icosis experim ental se han comprobado las mismas alteraciones infla­

matorias en relación con el estado defensivo del huésped. El C. immitis form a esporangios grandes, con endosporos pequeños, am eboides y d is­ puestos en una franja de citoplasma periférico (esporangio de primoinfección), en el seno de las lesiones supurativas, cuando las defensas son nulas. A la inversa, cuando se encuentra dentro de un proceso inflamatorio productivo con células gigantes y macrófagos, el esporan­ gio es más pequeño, posee una pared celular más gruesa, y todo su interior se encuentra ocu­ pado por endosporas menos numerosos pero de mayor tamaño (esporangio quístico); también puede verse una corona de radiaciones acidófilas que rodea el esporangio y cuya aparición coincide con la de los anticuerpos circulan­ tes. En la histoplasmosis, los casos graves con escasas defensas presentan una hiperplasia histiocitaria simple con numerosos parásitos o hay necrosis caseosa masiva. Como en las afeccio­ nes anteriores, en los procesos más defensivos aparece el granuloma tuberculoide, disminuye el número de hongos y hay una tendencia a la cicatrización fibrosa.’'-'^’’'’^ Inmunógenos vacunantes e inmunoterapia en las micosis sistémicas No se dispone en la actualidad de vacunas para uso humano, pero todo parece indicar que se contará con ellas en un futuro no muy leja­ no. En la coccidioidomicosis se han ensayado diversos tipos de inmunógenos: los esporangios muertos poseen un poder protector satisfactorio.‘^-’ Recientemente se ha comprobado que los ribosomas de la fase levaduriforme del H. cap­ sulatum aumentan la tasa de sobrevida en los ratones som etidos a la infección experim en­ tal.'*'’ Los efectos del factor de transferencia obte­ nido de leucocitos de sujetos coccidioidina-positivos sobre las pruebas de hipersensibilidad retardada, realizadas tanto in vivo como in vi­ tro, demostraron que es capaz de transmitir el estado de sensibilización a sujetos vírgenes de i n f e c c i ó n . H echos sim ilares fueron comprobados en histoplasm osis y paracocci­ dioidomicosis Una revisión de los efectos de la aphcación del factor de transferencia en la coccidioidomi­ cosis disem inada-" mostró que, sobre 40 pa­ cientes tratados, 80% recuperó la capacidad de producir linfoquininas, 75% adquirió respues­ tas blastogénicas norm ales de sus linfocitos, 50% presentó pruebas cutáneas que viraron ha­ cia la positividad y 60% exhibió mejorías clíni­ cas. El factor de transferencia dejó de producir­ se por el peligro de transmitir el HIV.

Inmunología de las micosis La aplicación de inmunoestimulantes como el levamizol ha demostrado que puede recupe­ rarse la capacidad reactiva de los linfocitos T tanto in vivo como in vitro, pero su efecto so­ bre la evolución de la enfermedad necesita aún más pruebas. El mayor interés se ha centrado en el IFN-y que ha demostrado su utilidad en el tratam ien­ to de varias infecciones debidas a microorga­ nismos intracelulares con patogenia y m eca­ nismos defensivos semejantes a los de las m i­ cosis sistémicas endémicas. Su eficacia en va­ rias micosis experim entales ha sido com pro­ bada, pero resta aún por establecer en forma definitiva su acción en las micosis humanas, así como la dosis y la frecuencia de su aplicaC i0 n .1 4 ii.2 1 2 a

La inmunoterapia de las micosis sistémicas constituye pues un promisorio campo de inves­ tigación clínica que debe ser más explorado. Conclusiones De lo expuesto se deduce que el principal mecanismo defensivo contra las micosis sisté­ micas lo constituye una adecuada inmunidad celular, ya que la depresión de ésta condiciona la aparición de m icosis-enferm edad. Por el contrario, la inmunidad humoral no parece con­ tribuir en forma clara como mecanismo defen­ sivo, pues los pacientes portadores de formas clínicas severas presentan niveles normales o aumentados de inmunoglobulinas y la produc­ ción de anticuerpos se encuentra exaltada; por otra parte, los sujetos con agam m aglobuline­ mia pero con inmunidad celular normal no es­ tán más predispuestos que los normales a pade­ cer micosis diseminadas. La depresión de los linfocitos T puede pro­ ducirse por diversos factores, en especial por la carga antigénica excesiva en primoinfecciones severas; causas individuales como edad, sexo, profesión, raza, condiciones socioeconómicas y hábitos del paciente parecen también influir. Ciertas enfermedades que producen depresión de la inmunidad celular, como los linfomas, la enfermedad de Hodgkin y el SIDA, favorecen la aparición de micosis diseminadas graves. De la misma forma actúan los corticoides, citostá­ ticos y las radiaciones. Pese al avance de los conocimientos inm u­ nológicos, se ignora la razón por la cual se pro­ duce la falla de los mecanismos defensivos só­ lo en uno de cada 1 .0 0 0 infectados. El sistem a de linfocitos tim odependientes actúa sensibilizando a los macrófagos y tornán­ dolos más aptos para la fagocitosis; éstos, a su vez, interfieren en la síntesis de proteínas por parte del parásito, retardan su crecimiento y fi­ nalmente lo destruyen.

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El pronóstico de las micosis sistémicas p u e­ de establecerse sobre la base de cuatro elem en­ tos de juicio: 1 ) histopatología de las lesiones; 2 ) pruebas cutáneas con antígeno homólogo y otros antígenos microbianos de uso común, co ­ mo PPD y candidina; 3) reacciones serológicas, y 4) proteinograma. En las formas graves, la histopatología muestra predominio de los p ro ­ cesos exudativo-necróticos con abundantes p a ­ rásitos, las pruebas cutáneas son negativas, las reacciones serológicas se presentan positivas con títulos elevados y el proteinograma m ues­ tra aumento de la proporción de globulinas, a ,, y y. Lo inverso sucede en las formas más b e ­ nignas. Resulta interesante consignar que estas alte­ raciones dependen, sobre todo, de un exceso de antígeno, así como el atrapado de las células CD^ en los granulomas epitelioides, ya que es posible que el sujeto, al ser tratado adecuada­ mente, retorne a una inmunocompetencia n o r­ mal con la disminución de los hongos parásitos. Seguramente la utilización de vacunas en la profilaxis de esas afecciones, y el empleo de inmunoterapia para favorecer el control de las formas diseminadas, son las metas que ofrecen para el futuro los estudios inmunológicos de las micosis sistémicas. IL MICOSIS OPORTUNISTAS Se conocen con el nombre de micosis o por­ tunistas las afecciones producidas por hongos que se comportan como saprófitos o com ensa­ les del hombre y forman parte de su flora n o r­ mal en el intestino, boca o árbol traqueobronquial o que integran la flora m icótiea del ai­ r e . E s t o s hongos aprovechan las oportunida­ des que les ofrece el huésped al disminuir su capacidad defensiva, para invadir los tejidos y producir alteraciones patológicas que pueden llegar a provocar la muerte. Esta definición lleva implícitos los siguien­ tes conceptos; 1 ) los hongos productores de m i­ cosis oportunistas poseen una amplia distribu­ ción en la naturaleza y pueden ser cultivados frecuentem ente de materiales de personas sa­ nas; 2 ) su aislam iento no im plica de p o r sí diagnóstico de enferm edad m icótiea, y 3) la disminución de las defensas del huésped, que se transform a prácticam ente en un medio de cultivo, y no el aumento de la virulencia del microorganismo constituye la causa principal que determina la aparición de la enfermedad.'*® Las micosis oportunistas presentan caracte­ rísticas que las diferencian de las micosis sisté­ micas producidas por hongos patógenos prim i­ tivos; son cosmopolitas. La edad, el sexo y la profesión no constituyen causas predisponentes

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de importancia; no existe un estado de micosisinfección sin enfermedad, y sus agentes causa­ les son hongos monomorfos que poseen carac­ teres semejantes en Los cultivos y en los tejidos parasitarios.'3'“’ Los factores predisponentes más frecuentes son: diabetes, acidosis m etabólica (urém ica, diabética, etc.), linfomas, leucemias, agranuloeitosis, SIDA, anem ias graves, tratam ientos con antibióticos antibacterianos, corticoides, inm unosupresores, c ito stático s y rad iacio 26 ,1 35 ,17 4

Las m icosis oportunistas de presentación más común son: candidiasis, aspergillosis y mucormicosis (cigomicosis);^' mucho menos habituales son las micosis producidas por Can­ dida glahrata'''-''^^''^'^, Nocardia asteroides^' Trichosporon beigelii,'^'^\ Fusarium spp., Geotrichum candidium'^^^-'^'''’ y varias especies de hongos negros. Sólo nos referiremos a las tres primeras por ser las de mayor importancia y las mejor estu­ diadas. Micosis oportunistas más comunes Candidiasis Los hongos del género Candida son comen­ sales habituales de la superficie de la piel y las mucosas. La especie más patógena, C. albicans, es habitante frecuente de las mucosas del hom­ bre sano. Ha sido cultivado de las secreciones de sujetos normales, en la boca y el intestino (20 a 50%), en la vagina de la mujer no gestante (10 a 17%) y de las embarazadas (25 a 34%). Ei simple hecho de tomar antibióticos eleva el nú­ mero de portadoras vaginales de C. albicans de 10 a 34%."®''^^ Las otras especies de! género, como C. tropicalis y C. parapsilosis, son culti­ vadas a partir de piel y uñas sanas.'** Como consecuencia de causas predisponen­ tes locales, como humedad, maceración y tem­ peratura próxima a los 37“C, estos hongos son capaces de producir micosis superficiales como el muguet, estomatitis crónicas atróficas o hi­ pertróficas del adulto por el uso de prótesis dentarias, boqueras, intertrigos de grandes y pequeños pliegues cutáneos, onixis con perionixis, onicolisis, vulvovaginitis, etc. A lgunas causas de orden general pueden también facilitar la aparición de estos procesos; en primer término la diabetes subclínica, el uso de anticonceptivos, de antibióticos de amplio espectro y de dosis moderadas de corticoides. En estos casos, y a pesar de las causas predis­ ponentes generales mencionadas, el huésped no es un inmunodeficiente, tiende a limitar su in­ fección y responde al tratam iento local satis­ factoriamente.

Tanto en los individuos sanos como en los que presentan candidiasis superficiales, están intactos los mecanismos defensivos que perm i­ ten confinar las inspecciones producidas por estos hongos a la superficie de los tegumentos. En tal sentido, ha sido demostrado un factor anticándida en el suero humano normal, cuyo tenor es escaso o nulo en los pacientes afecta­ dos por linfomas, leucemias o neoplasias.'**^-''’'^ La transferrina,''® y en particular la relación entre el hierro plasmático y ia transferrina li­ bre,^'* desempeñan un importante papel defensi­ vo. Shiraishi y col.™ demostraron que la acti­ vidad anticándida de la transferrina está rela­ cionada a su capacidad de unirse al hierro no saturado y es estimulada por un factor sérico. Se consideran además indispensables una buena formación en cantidad y calidad de in­ munoglobulinas, tanto séricas como secreto­ rias, una adecuada respuesta inflam atoria, un sistema de inmunidad celular íntegro, la pre­ sencia de factores quim iotácticos en el suero (fracciones del complemento C3 y C4), opsoni­ zación satisfactoria y buena capacidad candicida de los polimorfonucleares neutrófilos'’'-'** y los macrófagos.* Más recientemente se ha des­ tacado el papel desempeñado por las citoquinas producidas por las células CD^ en respuesta a la ÍLj, estas son especialmente el F N T -a y el IFN -7 , el último un poderoso estimulante de la actividad fungicida de los m acrófagos y los neutrófilos.' 22“ Una de las afecciones de este grupo que ha sido objeto de numerosos y detenidos estudios inmunológicos es la candidiasis mucocutánea crónica. El granuloma candidiásico fue la pri­ mera forma clínica reconocida de esta enferme­ dad.'’' Su aspecto clínico difiere del resto de las candidiasis cutaneomucosas ya que las lesiones se presentan como pápulas vascularizadas, cu­ biertas de gruesas escamocostras ubicadas en las partes salientes del cuerpo (uñas, cuero ca­ belludo, región frontal, pómulos, etc.). Los pa­ cientes son habitualmente niños, con diversos defectos inmunológicos y la muerte se produce como consecuencia de infecciones sobreagregadas. Las otras candidiasis mucocutáneas crónicas predominan también en la infancia, las lesiones son extensas, miíltiples, de curso crónico y res­ ponden pobremente a los tratamientos locales. Su aspecto clínico es idéntico al de una candidiasis común en cada una de las localizaciones, excepto por su persistencia, extensión y falta de respuesta al tratamiento,*'^ Se locahza en las mucosas de boca, faringe, laringe y vagina, en los pliegues cutáneos y en las uñas; no hay ata­ que visceral, ni se produce sepsis. Las candi­ diasis mucocutáneas crónicas han sido dividi­ das en los siguientes grupos,"®

Inmunología de las micosis C a n d id ia s is m u c o c u t á n e a c r ó n ic a ASOCIADA A INMUNODEFICIENCIAS

1. A gam m aglobulinem ia de tipo suizo; es una alteración hereditaria, ligada al cromosoma X, de tipo autosómico recesivo. Presenta defec­ tos de la inmunidad celular y ausencia de for­ mación de inm unoglobulinas. Los pacientes mueren muy pronto presa de infecciones seve­ ras. 2. Síndrome de Di George; falta de form a­ ción del 3®' arco branquial con agenesia dei ti­ mo y las paratiroides. Se producen signos de ausencia de inmunidad celular e hipoparatiroidismo. 3. Síndrom e de N ezelof-A llibone; es una displasia tímica hereditaria con carácter autosó­ mico recesivo. 4. Enferm edad granulom atosa crónica; es una afección hereditaria ligada al cromosoma X, se presenta con carácter autosómico recesivo y se traduce en defectos funcionales de los leu­ cocitos polimorfonucleares.^'* ( Para más deta­ lles véase cap. 23.) Podrían incluirse aquí a los pacientes con SIDA, que presentan con frecuencia candidiasis orales y esofágicas muy severas, recidivantes y que retroceden lentam ente con antimieóticos. Igualmente ha podido comprobarse que las can­ didiasis vaginal recurrente, afección muy co ­ mún entre la menarca y la menopausia y que consiste en al menos cuatro episodios documen­ tados de candidiasis vaginal por año, es debida a una alteración de la inmunidad mediada por células. Esta parece consistir en una deficiente capacidad fagocitaria y lítica de los macrófagos de sangre periférica producida por la formación insuficiente de IFN -a en las células CD^.*"

C a n d id ia s is m u c o c u t á n e a c r ó n ic a , COMO e n f e r m e d a d PREDOMINANTE

1. C andidiasis m ucocutánea crónica fam i­ liar; afecta a ambos sexos, predominan las m a­ nifestaciones orales y ungueales, y se encuen­ tran alteraciones de la inmunidad celular. 2. Candidiasis mucocutánea crónica difusa; presenta las típicas alteraciones del granuloma candidiásico; los pacientes padecen con fre­ cuencia infecciones por otros gérmenes tales como tiñas por Microsporum catiLs y procesos piógenos de las vías aéreas superiores y del oí­ do. 3. Síndrome endocrino-moniliásico; es una afección hereditaria con carácter autosómico recesivo y los defectos endocrinos son hipoparatiroidism o, hipotiroidism o e hipocorticalismo, que se presentan ya sea en forma aislada o en conjunto.

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4. Candidiasis mucocutánea crónica de p re­ sentación tardía; son los casos que aparecen después de los 35 años; ias causas predisponen­ tes son diabetes, corticoterapia, inm unosupre­ sores o tumores malignos. Se ha destacado par­ ticularmente su asociación con timomas.^^'* E s­ tos enfermos no presentan una falla de la inm u­ nidad celular selectiva sino global y se co m ­ prueba con frecuencia la presencia de autoanti­ cuerpos. En la mayor parte de los casos de candidiasis mucocutánea crónica, la iniciación se produce antes de los 20 años. Los enfermos presentan diversas alteraciones de la inmunidad celular, pero la formación de inmunoglobulinas es nor­ mal; es común la aparición de infecciones bac­ terianas del árbol traqueobronquial, displasias dentarias, enfermedad poliquística del pulmón, esteatorrea, hepatitis crónica, queratoconjuntivitis, defectos ectodérmicos diversos, endocrinopatías y la presencia de autoanticuerpos, en particular factor reumatoideo.*^’ Cón frecuencia la muerte se produce antes de los 30 años, y si bien se consiguen remisiones importantes con la aplicación de anfotericina B por vía venosa y la 5-fluorocitosina o el ketoconazol p o r vía oral, las recidivas son muy comunes y las cura­ ciones definitivas son raras. Los defectos inmunológicos deben ser per­ fectamente diagnosticados a fin de proporcio­ nar al paciente la terapéutica sustitutiva ade­ cuada. Para ello se debe seguir el p lan que enunciam os a continuación; 1) pruebas cutá­ neas con candidina, PPD, estreptoquinasa-estreptodornasa (Varidasa), antígeno de saram ­ pión e histoplasmina;^^-^^’’^'’'^^® 2) prueba de sen­ sibilidad al dinitroclorobenceno; 3) recuento de linfocitos periféricos (número total) y porcenta­ je de linfocitos T determinado por el m étodo de las rosetas E,^^” así como de las subpoblaciones de linfocitos T por inm unofluorescencia con anticuerpos monoclonales CD^ y CD^; 4) inhi­ bición de la migración de macrófagos en tubo capilar frente a candidina (MIF); 5) prueba de transformación linfoblástica con timidina mar­ cada frente a fitohemaglutinina, candidina y PPD, y 6) estudio de la función fagocitaria y candicida de los leucocitos polimorfonucleares y m a c r ó f a g o s . R e s p e c t o a estos últimos hay que estudiar su número total, movilidad en cámara de Rebuck, fagocitosis de partículas de látex, Staphylococcus aureus y Candida alhicans, reducción del nitroazultetrazolium, efecto candicida y quim iotaxis. Los defectos de las enzimas intracelulares, como la mieloperoxida­ sa, pueden producir candidiasis crónica. La mayor parte de los defectos inmunológi­ cos encontratlos en 26 casos de candidiasis mu­ cocutánea crónica^^^ se ajusta a cuatro patrones

Inmunopatología fundam entales: tipo I, buena transform ación linfoblástica, pruebas cutáneas negativas y au­ sencia de MIF; tipo II, aceptable secreción de MIF in vitro por parte de los linfocitos del pa­ ciente, pero pruebas cutáneas negativas posi­ blemente por una falla de los macrófagos y co­ mo consecuencia del sistema amplificador que hace posible la visualización in vivo de la reac­ ción; tipo III, el suero de los pacientes posee un factor inhibidor de la transformación blástica, en especial para cándidas, las pruebas de trans­ form ación linfoblástica y M IF son negativas así como las intradermorreacciones con candi­ dina, y pueden ser positivas las practicadas con otros antígenos; tipo IV, sin déficit de su inmu­ nidad celular deteetable. En la enfermedad que nos ocupa se han señalado éxitos terapéuticos con tratamientos sustitutivos como transfusión de leucocitos con antígenos de histocompatibi­ lidad comunes entre el dador y el receptor,^^2 aplicación del factor de t r a n s f e r e n c i a * ® ' y trasplante de timo.*® Se prefieren los dos prim e­ ros por ser habitualmente mejor aceptados por el receptor. Estos tratamientos han conseguido remisiones prolongadas de 5 años o más, im po­ sibles de obtener con drogas antimicóticas.^^^ Aunque las alteraciones de la inmunidad hu­ moral son menos frecuentes en la candidiasis mucocutánea crónica, no se debe descuidar su estudio. Es aconsejable efectuar un proteino­ grama electroforético, dosaje de inmunoglobu­ hnas por inmunodifusión radial y dosaje de an­ ticuerpos específicos por inmunofluorescencia i n d i r e c t a . C o n esta última técnica se ha podi­ do demostrar que, por lo general, los enfermos portadores de este tipo de candidiasis presentan aumento del título de anticuerpos específicos; los ligados a la IgM están incrementados du­ rante la fase aguda seudomembranosa, los vin­ culados a la IgA, en las formas crónicas hiper­ tróficas, y los relacionados con la IgG, en cual­ quiera de las form as clínicas de candidiasis mucocutánea.'^' La frecuencia de las candidiasis diseminadas graves, como sepsis, endocarditis, meningoencefalitis e infecciones urinarias altas, aumentó desde la aplicación de los antibióticos de am ­ plio espectro, citostáticos y corticoides; otro factor predisponente ha sido la cirugía cardio­ vascular, particularm ente las operaciones de válvulas. Con todo, su aparición continúa sien­ do esporádica, pero su pronóstico es muy serio ya que, con frecuencia, conducen a la muerte sin tratamiento a d e c u a d o . La puerta de en­ trada suele ser el aparato digestivo o directa­ mente el sistema venoso periférico, como suce­ de en los sujetos canalizados y en los toxicómanos. Se considera que para que se produzca sepsis es necesaria la presencia de un déficit de ios mecanismos defensivos pues, aun en casos

de trombosis venosas colonizadas por cándi­ das, no se produce la septicemia si el estado inmunitario del enfermo es normal. Las afeccio­ nes del grupo linfomas-leucemias,’’'* la toxico­ manía (morfina o heroína) y las causas favore­ cedoras mencionadas anteriormente alteran los mecanismos defensivos contra Candida. Los estudios serológicos han sido de notable valor como elemento auxiliar de diagnóstico en las c a n d i d i a s i s d i s e m i n a d a s . 3 5 . > i s . i « , i 7 9 .2o s . 2 w ,2 1 5 La reacción de h em o ag lu tin ació n p asiv a puede dar resultados positivos en casi todos los sujetos adultos normales y es negativa en el re­ cién nacido o en personas con defectos de la in­ munidad humoral;®” los anticuerpos que inter­ vienen son del tipo IgM. Las pruebas de inm u­ nofluorescencia indirecta es positiva en un nú­ mero apreciable de portadores sanos de candi­ da o en pacientes con micosis superficiales, pe­ ro sus títulos se elevan por encima de 1:1.280 en los casos de sepsis o endocarditis.'"’ La aglutinación en tubo presenta resultados semejantes a los de la inmunofluorescencia y se considera que los títulos superiores a 1:160 representan un índice de diseminación; en estos pacientes el anticuerpo producido es de tipo IgG.2>® Las pruebas de inm unodifusión en gel de agar y de fijación de complemento, que utilizan como antígenos el sobrenadante de seudomicelios rotos, proporcionan resultados positivos sólo en pacientes con candidiasis visceral o sistémiea que no presenten alteraciones de la in­ munidad humoral primitiva o producida por el em pleo de c o rtico id e s, in m u n o su p reso res, gtc.'«.'79

También se han observado reacciones débil­ m ente positivas en el granulom a candidiásico.60.215 En la aetuahdad se considera que la es­ pecificidad de estas reacciones para el diagnós­ tico de las candidiasis sistémicas es del 90%.^® El empleo simultáneo de la contrainmunoelec­ troforesis y eoncavalina A, que excluye las fal­ sas reacciones producidas por los polisacáridos de la pared celular, aumenta el valor diagnósti­ co de las pruebas serológicas en las candidiasis profundas.*’-^"* Las principales causas de error son: 1) prue­ bas falsas negativas por incapacidad para for­ mar anticuerpos en los inmunodeficientes o en los estadios muy tempranos de la afección, an­ tes de que ellos aparezcmi; 2) reacciones falsas positivas en sujetos con canalizaciones venosas infectadas por cándida y con reiteradas fungemias, pero sin sepsis ni metástasis infecciosas viscerales. La electrosinéresis es un sustituto de la inmunodiñisión que permite obtener resulta­ dos en 2 horas-’^®’” '^ y posee mayor sensibilidad. Todo parece indicar que gran parte de los su­ jetos normales posee anticuerpos naturales an-

Inmunología de las micosis licándida que son del tipo IgM y que la gran producción de anticuerpos observada en las candidiasis sistémicas depende de la acelerada síntesis de IgG específica."* En ciertas circunstancias las pruebas seroló­ gicas en busca de anticuerpos resultan poco efi­ caces, éstas son; las etapas muy tempranas de la infección, en pacientes inmunocomprometidos o cuando las micosis son producidas por agentes endógenos contra los cuales existe, normalmente, una determinada producción de anticuerpos. En las candidiasis estas circuns­ tancias se producen con cierta frecuencia obli­ gando a la búsqueda de antígenos específicos en los fluidos orgánicos (suero y orina) como reemplazante de las pruebas serológicas clási­ cas. Se han detectado galactomananos y enolasa como antígenos dominantes en los fluidos orgánicos. Las pruebas más utilizadas son las aglutinación de partículas de látex sensibiliza­ das con anticuerpos específicos. Existen actual­ mente dos equipos com erciales, el PastorexCandida'^ con anticuerpo monoclonal antimanano y el Cand-Tec, con anticuerpos policlonales de conejo. La sensibilidad de estas reaccio­ nes es del 47 al 52% y su especificidad es muy elevada. La búsqueda de enolasa posee una sensibilidad mayor, cercana al El mayor problema son los falsos negativos, origi­ nados en el hecho que, tanto la antigenemia co­ mo la antigenuria, son transitorias en las candi­ diasis sistém icas. También se ha utilizado la determinación de los niveles sanguíneos de Darabinitol, como una evidencia indirecta de candidiasis invasiva. R equiere el em pleo de crom atografía gas-ííquido y debe tenerse en cuenta, especialm ente, la relación arabinitol/ creatinina, ésta aumenta en las candidiasis sis­ témicas y disminuye con el tratamiento. El va­ lor definitivo de estos dosajes necesita aún ser establecido. Aspergilosis La mayor parte de los autores coinciden en clasificar las aspergilosis broncopulmonares en tres grupos; alérgicas, intracavitarias e invasiVas.26.188 Aun cuando las esporas de ios hongos del género Aspergillus forman parte de la flora del aire, y los hombres de todas partes del mundo inhalan diariamente miles de ellos, no contraen la enfermedad salvo en circunstancias especia­ les. Algunos sujetos atópicos pueden presentar la afección de tipo alérgica por inhalación rei­ terada de esporas, en particular de la especie A. fumigatus. Cuando se presenta la forma asmática, parti­ cularmente en los casos crónicos, además de las crisis disneicas periódicas, suelen aparecer

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lesiones radiológicas de fibrosis pulmonar e in­ filtrados transitorios con predominio en ambos vértices. Son frecuentes, además, febrícula in­ termitente, cefaleas, estornudos, tos y eosinofi­ lia, tanto sanguínea como en la expectoración. El hongo se detecta reiteradamente en el esputo y estos pacientes poseen anticuerpos específi­ cos de tip o IgE, d em o strab les m ed ia n te la transmisión pasiva de la sensibilidad (fenóm e­ no P-K), empleando como receptores a seres humanos o a p r i m a t e s , o por radioinmunoen­ sayo, Se ha podido demostrar que la presencia de esporas de A. fumigatus en las vías aéreas dei hombre es un potente estímulo para la produc­ ción de IgE específica e inespecífica.'''2. El dosaje de IgE posee un valor pronóstico pues su elevación permite anticipar la aparición de las crisis asmáticas. Las aspergilosis broncopulmonar alérgica o bronquitis mucomembranosa es otra de las for­ mas clínicas que presentan los sujetos atópicos. Se caracteriza por crisis de asma, neumonitis o atelectasias migratrices y recurrentes, aparecen tapones o moldes bronquiales, expectoración purulenta, a veces hem optoica, y eosinofilia sanguínea. El examen del esputo muestra cris­ tales de Charcot-Leyden, espirales de Curshm an, eosinófilos y filam entos del A sp ero illusf'^’^ Esta forma clínica presenta simultáneamente dos tipos de anticuerpos, los precipitantes del tipo IgG y los responsables del fenómeno P-K, a los extractos de A. fum igatus, que son el tipo lgE.S7.205 Mediante la inoculación por vía venosa del suero no calentado de paciente con aspergilosis alérgica se ha conseguido hipersensibilizar pa­ sivamente a primates, obteniendo luego la re­ producción de la crisis asmática al hacerles in­ halar esporas del hongo. Este anticuerpo reagínico es menos específico que el precipitante, presenta reacciones cruzadas entre los hongos del género Aspergillus, es termolábil y deja de producirse el fenómeno P-K cuando el suero es tratado con anticuerpos anti-IgE.^®® El tenor de IgE en el suero de estos pacientes está aumentado considerablemente. Esta altera­ ción tiene valor diagnóstico, pues estaría rela­ cionada con el estado atópico de los enfermos, la producción de reacciones cutáneas de tipo inmediato hacia los antígenos del hongo, la eo­ sinofilia y el b ro n co sp asm o .'’2 En las crisis agudas de esta afección, el nivel sérico de IgE llega a 6-30 fig • m f '.'’’ Los anticuerpos precipitantes del tip o IgG son más específicos, termoestables, pueden de­ m ostrarse por pruebas de inm unodifusión en gel de agar, contrainmunoelectroforesis y fija­ ción de complemento, y serían los que deterrni-

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nan la aparición de infiltrados pulm onares y reacciones cutáneas que se tornan positivas en­ tre las 6 y 12 horas después de haber inyectado el a n t í g e n o . E n las dos formas clínicas de aspergilosis alérgica es posible demostrar la exis­ tencia de hipersensibilidad mediante la inocula­ ción intradérmica de antígenos de A. fum igato';'®’*se observa una reacción de tipo inmediata y, en oportunidades, otra más demorada que se hace evidente, como ya fue señalado, entre las 6 y 12 horas de la inyección. Esta última reacción sólo se presenta en sujetos con abundantes anti­ cuerpos precipitantes, e histopatológicamente es idéntica a un fenómeno de Arthus. Se realizan también pruebas de sensibilidad bronquial, nebulizando extractos liofilizados de A. fumigatus; dicho estímulo produce en el en­ fermo una marcada disminución del volumen respiratorio máximo. En las formas intracavitarias, los hongos del género Aspergiílus desarrollan en el interior de una cavidad preform ada, sea ésta bronquial, pulmonar o pleural, formando una masa fúngiea, a veces en forma de bola, que ocupa total o parcialmente su luz y provoca una reacción in­ flamatoria pericavitaria, pero el hongo no inva­ de el parénquima pulmonar vecino. La mayor parte de las cavidades preformadas correspon­ den a tuberculosis curadas y en menor propor­ ción a bronquiectasias, quistes congénitos, mi­ cosis pulmonares, Los enfermos presentan tos con expectoración mucopuruíenta y hemoptisis, a veces tan intensa que conduce a la muerte por hipovolemia. Las alteraciones clínicas son ocasionadas por la liberación de diversas toxinas que posee el A.spergiHus fum igatus, unas obtenidas de ex­ tractos endocelulares y otras, de productos de secreción del micelio. Dichas sustancias tienen efectos citotóxicos, hemohlicos, fibrinolíticos e inactivadores del complemento. Gran cantidad de antígenos de la masa fúngica pasan la pared cavitaria y provocan la for­ mación de anticuerpos específicos. Las reac­ ciones serológicas practicadas con esos antíge­ nos dan resultados intensam ente positivos en pacientes afectados por esta forma clínica y su realización reviste un gran interés para el diag­ nóstico y el control de la curación del proce8,38,149

Las pruebas serológicas que se emplearon son las siguientes: inmunoelectroforesis en gel de a g a r o s a , inmunodifusión en gel de a g a r , f i j a c i ó n de c o mp l eme n t o , 8 9 ,1 4 3 ,149,I7Ü,22.S contrainmunoelectToforesis,'*'^-^'' precipitación en tubo con dosaje de proteínas precipitadas,^' inm unofluorescencia indirecta^36.78,2i7 aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con glucom ananos de la pared celular del Aspergillus,^^^-'^''^ y ELISA. Los antí­

genos utilizados han sido: celulares, obtenidos del sobrenadante de miceho roto, y metabólicos, constituidos por el filtrado de desarrollo en medios lícjuidos o fracciones ricas en polisacá­ ridos, parcialm ente purificados por precipita­ ción con acetona de dichos filtrados. La realización sistemática de las pruebas se­ rológicas ha perm itido extraer las siguientes conclusiones: 1) más del 95% de los pacientes eon aspergilosis intracavitaria presenta an ti­ cuerpos precipitantes contra una o varias parce­ las antigénicas del A. fum igatus, detectables por las pruebas de inmunodifusión, inm unoe­ lectroforesis o contrainmunoelectroforesis;'''^"^'' 2) estas reacciones son negativas en los contro­ les normales así como en los sujetos afectados por otras micosis profundas; su especificidad es tan estricta que presenta resultados negcitivos en pacientes eon aspergi lomas producidos por otras especies de Aspergiílus, haciendo ne­ cesario el empleo de una batería de antígenos que incluyan A. niger, A. flavus, A. nidulans y A. terreus;^^ 3) estas pruebas presentan como causa de error la precipitación de una proteína C existente en el contenido celular de los hon­ gos del género Aspergiílus; estas falsas reac­ ciones se eliminan tratando las placas de inmu­ nodifusión con una solución estabilizada de ci­ trato de sodio pH 8,2;“’'* 4) la aparición de 3 o más bandas de precipitación en el inmunoeleetroforetograma en gel de agarosa permite afir­ mar el diagnóstico de aspergilosis pulm onar activa;^^® 5) se ha establecido que uno de estos arcos tiene actividad catalásica y otro quimiotrípsica, su demostración posee un valor diag­ nóstico casi a b s o l u t o ; 6) existe una evidente relación entre los resultados de las pruebas de inmunodifusión en medios gelificados y los de ia reacción de fijación de complemento, con la ventaja para esta última de ser más fácil su cuantificación; 7) las pruebas de inm unofluo­ rescencia indirecta y de aglutinación de partí­ culas de látex no están dotadas de la especifici­ dad necesaria para tener valor diagnóstico; 8) la extirpación quirúrgica de la cavidad afectada o, más raras veces, la muerte espontánea del aspergiloma, va seguida de la pérdida progre.siva de anticuerpos y, finalmente, la negativización de las reacciones serológicas; si por el contrario éstas continúan positivas después de 6 meses del acto quirúrgico, es índice de infec­ ción residual en los bronquios vecinos,'*” y 9) los anticuerpos que intervienen en las pruebas de precipitación en medios gelificados son del tipo lg G .'‘’‘^-22® Los extractos endocelulares de los hongos de diversas especies del género Aspergiílus produ­ cen inactivación del complemento actuando so­ bre C3;^" en el caso de A. fum igatus se ha podi­ do observar descensos de la complementemia

Inmunología de las micosis in vivo, utilizando cobayos; este efecto va acompañado de una acción citotóxica y hemo­ l í t i c a . A la inversa de lo que se podrá esperar, los pacientes eon aspergilosis intracavitaria presentan complementemia normal o elevada, en general tanto más alta cuanto más extensa sea la infección y cuanto más próximo esté el paciente a sufrir una hemoptisis grave. Las pruebas cutáneas son habitualmente ne­ gativas en este tipo de aspergilosis; sólo en al­ gunos casos se observa reacción de tipo inm e­ diato, como consecuencia de estar sensibiliza­ do el enfermo a los antígenos del hongo. La mayor parte de los sujetos que presentan aler­ gia inmediata sufre de broncospasmo y la inter­ pretación de la prueba cutánea es en este caso idéntica a la ya mencionada para el asma aspergilar. Se ha podido demostrar en esta forma clínica que la presencia de A. fum igatus en el aparato respiratorio actiia como un importante estímulo para la producción de IgE específica e inespe­ cífica, tal como sucede en las formas alérgicas. En las aspergilosis invasivas, los filamentos del hongo penetran en el parénquima pulm o­ nar, invaden y lesionan ía pared de los vasos sanguíneos, provocan trombosis e isquemia, así como lesiones metastásicas en otros órganos. Clínicamente es un proceso subagudo o cróni­ co, de tipo neumónico con tos, expectoración, catarro purulento, hemoptisis, fiebre, disnea y leucocitosis.7»-'3»'2'»-»«.2i3 La frecuencia de este proceso ha aumentado intimamente, en particular como infección sobreagregada en enfermos con leucemias o lin­ fomas que reciben tratam ientos eon corticoi­ des, antimitóticos, inmunosupresores, suero antilinfocitario y radiaciones.'** En su mayor par­ te son enfermos con leucopenia (< 500 leucoci­ tos por mm^). El estudio histopatológieo de las piezas de autopsia muestra la presencia de abundantes hi­ fas del hongo, dispuestas en forma radiada y ro­ deadas de una extensa zona de necrosis y supu­ ración. Se ha sugerido que este cuadro es pro­ ducido por la falta total de respuesta inmunitaria por parte del huésped y por la acción nceró­ tica de las endotoxinas del A. fumigatus. El mecanismo defensivo normal contra estos hongos necesita de factores séricos opsonizantes que favorecen la fagocitosis de las esporas por os neutrófilos; aquéllos, una vez fagocitados, son destruidos por ia mieloperoxidasa, el peróxido de hidrógeno y el ioduro de potasio.*'^ Uno o varios de estos mecanismos se encuen­ tran alterados en los enfermos que padecen las graves hemopatías que actúan como factores predisponentes. Las investigaciones serológicas realizadas en los pacientes que presentan esta forma clínica

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han demostrado con frecuencia reacciones ne­ gativas, especialmente si se trata de sujetos con inm unodeficiencias producidas ya sea p o r la enfermedad de base (leucemia o linfoma) o por los tratamientos recibidos.’* Se han realizado varias pruebas experim en­ tales para efectuar el diagnóstico serológico de esta form a clínica mediante la demostración de antigenem ia con el radioinm unoensayo y la técnica de ELISA.9“-“ 3.22* En la actualidad se están empleando con ma­ yor frecuencia técnicas de aglutinación de látex y ELISA sandwich o inhibición de ELISA. Es­ tas pruebas permiten detectar una glucoproteí­ na de 18 kD, tanto en suero como en orina. La reiteración de las muestras incrementa la sensi­ bilidad de estos métodos.'**' Zigomicosis Las zigomicosis son micosis profundas que poseen la característica común de ser produci­ das por hongos de micelio filamentoso conti­ nuo. Dentro de ellas se incluyen las mucormieosis, producidas por Mucorales de los géneros Rhizopus, Absidia, M ucor y M oríierella, que p resen tan las características de las m icosis oportunistas. Son afecciones de distribución geográfica universal, de curso grave y que con­ ducen frecuentem ente a la muerte de lo s pa­ cientes; la mayor parte de los diagnósticos son realizados por estudios histopatológicos de las piezas de autopsia.'-"’^ Desde el punto de vista clínico, las mueormieosis se dividen en: 1) formas sinuso-órbitocerebrales, cuyas causas predisponentes más frecuentes son la diabetes acidótica, la uremia y las grandes quemaduras; 2) formas pulm ona­ res o diseminadas que se asocian por lo común con leucemias, linfomas, anemias graves, en pacientes que reciben corticoides, citostáticos e inmunosupresores; 3) formas abdominales, cu­ yo punto de partida es intestinal y presentan como factor predisponente la desnutrición gra­ ve y las poliparasitosis, y 4) la mucormicosis cutánea, de presentación menos frecuente y cu­ ya aparición es favorecida por las acidosis me­ tabólicas y los traumatismos. El examen histopatológieo de las mucormi­ cosis m uestra las alteraciones propias de las micosis graves, en las cuales las defensas del huésped están seriamente deterioradas. Se ob­ servan abundantes filamentos no tabicados, an­ chos, de diámetro algo irregular, que tienden a invadir los vasos sanguíneos, producen trom­ bosis y necrosis isquémica de los tejidos veci­ nos. Junto a las lesiones -necróticas puede haber supuración y se comprueba una total ausencia de granulom as defensivos que tiendan a cir­ cunscribir el proceso.

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Inmunopatología

Los estudios inmunológicos han sido esca­ sos. Se han preparado antígenos solubles, obte­ nidos del sobrenadante del micelio roto por ul­ trasonido, a partir de cultivos de Absidia, Mucor y Rhizopus. Dichos antígenos han demos­ trado su utilidad diagnóstica en pruebas de in­ munodifusión. Esta reacción da resultados ne­ gativos en estadios tempranos o cuando la en­ fermedad es controlada muy rápidamente, pero es intensamente positiva en los casos avanza­ dos y se observan reacciones cruzadas entre los tres géneros de hongos p roductores de esta afección.'’O

tienden a la curación espontánea y habitual- ' mente no se cxo n iñ c m }'’™'^^' La otra forma clínica es causada por agentes antropófilos como el Trichophyton ruhrum, Epiderm ophyton floccosum , T. Schoenleinii, etc., muy adaptados al parasitismo de la capa córnea humana y que despiertan escasa reac­ ción inflamatoria. Las lesiones son descamativas, hiperqueratósicas y con frecuencia com ­ prometen las uñas; desde el punto de vista sub­ jetivo, casi no producen prurito y su curso es muy crónico. La prueba de la tricofitina da re­ sultados frecuentemente negativos y jamás cu­ ran espontáneamente. Por lo general su cura­ ción es difícil aun con tratam ientos adecua-

INMUNIDAD EN LAS DERMATOFITIAS

dos.41.127.231

Las dermatofitias son micosis superficiales producidas por un grupo de hongos llamados derm alófitos, que pertenecen a tres géneros, Microsporum, Blpidermophyton y Trichaphyton y numerosas especies. Estos microorganismos atacan la capa córnea de ia piel y sus faneras; producen lesiones inflamatorias en la piel lam­ piña, barba, bigote, cuero cabelludo y otras re­ giones pilosas del cuerpo, y en las uñas deter­ minan hiperqueratosis. A causa de su condición de parásitos de la capa córnea, los derrnatófitos son incapaces de invadir otros tejidos vivos; por lo general su único mecanismo para produ­ cir enfermedad es actuar por medio de sus antí­ genos. Estos son captados por las células de Langerhans de la epiderm is, las que m igran hasta ponerse en contacto con los tejidos linfoi­ des inm unocompetentes; allí los linfocitos T son sensibilizados y desencadenan un proceso de hipersensibilidad mediada por células, con exteriorización principalmente cutánea. Puede decirse, pues, que las dermatofitias son derma­ titis de contacto producidas por los antígenos de los dermatófitos.'" Ha sido reiteradamente señalado que existen dos tipos polares de dermatofitias desde el pun­ to de vista clínico e inmunológico. Unas son producidas por hongos procedentes del suelo (geófilos) o de los animales (zoófilos) y que por lo tanto están poco adaptadas al parasitis­ mo de la capa córnea de la piel del hombre. Es­ tos agentes determinan una intensa reacción in­ flam atoria con vesículas y pústulas, con fre­ cuencia hay infiltración inflamatoria de la der­ mis e hipodermis y los ganglios satélites están infartados. Este cuadro clínico va acompañado de reacciones cutáneas a la tricofitina intensa­ mente positivas y, en oportunidades, se obser­ van erupciones cutáneas deshabitadas llamadas dermatofítides. Esta intensa reacción inflama­ toria elimina gran cantidad del estrato córneo afectado y, por lo tanto, también de dermatófitos; como consecuencia, luego de un tiempo

Se considera que la quinta parte de la pobla­ ción mundial padece micosis superficiales, de las cuales la mayoría son dermatofitias y pitiriasis versicolor. La aparición de una de estas micosis superficiales depende de una serie de factores. Algunos actúan en forma local como la humedad y el grosor de la capa córnea; en general es más frecuente la im plantación de una dermatofitia en zonas húmedas y de capa córnea gruesa. La transpiración excesiva, el uso de calzado cerrado y de suela gruesa, la ro­ pa ajustada, la maceración de la piel, las m ar­ chas prolongadas y la obesidad son factores predisponentes para la aparición de estos pro­ cesos en los pies y los pliegues inguinales. El uso de cabellos largos protege mecánicamente a las niñas contra ios hongos productores de ti­ ñas del cuero cabelludo.^^* La edad es un factor de suma importancia, así las tiñas de cuero ca­ belludo son casi exclusivas de la infancia, en tanto que las dermatofitias de ios piel y el plie­ gue inguinocrural son propias del adulto. El se­ xo masculino presenta estas micosis con una frecuencia discretamente mayor que el femeni­ no, El contacto con animales favorece la im ­ plantación de tiñas inflamatorias y micosis tricofítica y las prácticas deportivas, en particular la natación, predisponen a contraer dermatofi­ tias de los pies. Existe además una acentuada tendencia ge­ nética, en particular para padecer aquellas der­ matofitias crónicas poco inflamatorias; éstas se transmiten dentro de la misma familia siguien­ do una línea genética y no contagian a otros in­ tegrantes del grupo familiar no predispuestos. Por ejemplo, la existencia de contagio m atri­ monial es rara y, por el contrario, es frecuente de padres a h ijo s o en tre otros c o n san g u íneos.'".23‘ Se ha comprobado que el suero normal con­ tiene componentes que frenan el desarrollo de los dermatófitos. Ayres y Anderson (1934)® de­ m ostraron que el agregado de 8% de suero, procedente de pacientes con tiñas inflam ato­

Inmunología de las micosis rias, al medio de Sabouraud, impedía el creci­ miento de estos hongos. Posteriormente, los es­ tudios de Lorincz y Roth'*''-''*^ comprobaron que el suero fresco de la mayor parte de las perso­ nas posee una actividad fungostática frente a los dermatófitos. Estas sustancias condiciona­ rían el ataque restringido a la capa córnea de la piel y sus faneras por tratarse de tejidos no irri­ gados. Se han reconocido dos sustancias plas­ máticas que actúan como factores contrarios a la invasión de los dermatófitos, la transferrina no saturada y una a 2-macroglobulina inhibi­ dora de la queratinasa.^®" En las células sanguíneas tienen importancia los neutrófilos, los mastocitos, los linfocitos y los macrófagos. Ciertas condiciones de la salud general pueden influir en la aparición de las dermatofitias y especialmente en su extensión y cronicidad. La diabetes, el empleo de corticoesteroides, el síndrome de Cushing, los tras­ plantados y los linfomas coexisten con tricofitias extensas y rebeldes al tratamiento causadas por el T. En pacientes jóvenes con defectos de la in­ munidad mediada por células se ha comproba­ do la aparición de tricofitias extensas que afec­ tan uñas, cuero cabelludo y piel, presentando esta última una descamación difusa, ictiosiforme, con escasa o nula reacción inflamatoria. Esta forma clínica ha sido denominada recien­ temente enfermedad dermatofítica'*’ y es produ­ cida habitualmente por Trichophyton antropófilos (T. tonsurans, T. vioíaceum o T. rubrum). Un hecho frecuente que aún aguarda expli­ cación es la tendencia que presentan ciertas tri­ cofitias a permanecer localizadas en una mano o un pie sin afectar el otro. Wilson atribuye es­ te fenómeno a alteraciones locales en el meta­ bolismo de los hidratos de carbono. Otro factor im portante es la velocidad de reemplazo de la capa córnea. Para que un dermatófito pueda sobrevivir e invadir nuevas zo­ nas, su velocidad de crecimiento debe ser m a­ yor que la de eliminación del estrato córneo, pues de lo contrario es expulsado de la piel. Por lo tanto, si la tiña se expande es porque su agente etiológico es capaz de desarrollarse aun contra la corriente de renovación epidérmica. Esto explica las curaciones espontáneas que se producen cuando es eliminada una gran masa de capa córnea, tal como sucede en las tiñas muy inflamatorias, por factores mecánicos co­ mo la depilación (manual o radioterápica) o la extirpación quirúrgica de las uñas enfermas. Plato y Neisser (1902) obtuvieron un antíge­ no de cultivos de dermatófitos por medio de un procedimiento similar al utilizado para preparar la tuberculina vieja de Koch. Este extracto fue llamado tricofitina. La inyección de esta sus­ tancia por vía intravenosa produce en los pa­

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cientes portadores de derm atófitos un cuadro general con fiebre, escalofríos, esplenomegalia y cefaleas. La inyección intradérmica produce una reacción tem prana con urticaria a los 15 minutos y otra tardía con eritema y pápula a las 24 o 48 horas. El estado de hipersensibilidad a la tricofitina se instala a los 7 u 8 días de producida la infec­ ción y persiste por lo general en forma indefi­ nida. Se ha establecido que la aplicación reite­ rada de tricofitina no vuelve positiva esta prue­ ba. En algunos casos, la prueba de tricofitina desencadena fenómenos focales, como aum en­ to de la reacción inflamatoria de la tiña, o ge­ nerales con discreta hipertermia y aparición de erupciones cutáneas a distancia del foco dermatofítico conocidas como “ides”. Desde el punto de vista histológico, la reac­ ción se caracteriza por infiltrados dérmicos de células linfoides y monocitos; éstos se acum u­ lan en torno a los vasos sanguíneos y los ane­ xos cutáneos. En los casos más intensos puede haber necrosis y aflujo de polimorfonucleares. Como ya fue señalado, hay especies que pro­ ducen una mayor sensibilización a la tricofitina como el Microsporum canis, Microsporum. gypseum, Trichophyton mentagrophytes var. yeso­ sa, Trichophyton verrucosum, etc., en tanto que otras parecen no sensibilizar a sus portadores, como sucede con el Epiderm ophyton flo c c o sum , T richophyton rubrum y T rich o p h yto n mentagrophytes var. vellosa. Lewis y Hopper**’ demostraron la especificidad de esta reacción, de tal forma que una prueba de tricofitina posi­ tiva indica infección actual o pasada por un dermatófito. La especificidad es de grupo y en ge­ neral los reactivos que se preparan son poliva­ lentes, con una especie de cada género. Los sujetos atópicos, con altos n iveles de IgE, suelen ser más susceptibles a las derm ato­ fitias crónicas y no desarrollan pruebas tardías de trico fitin a positivas."*' Neves*®® enco n tró 23% de reacciones positivas a la tricofitina leí­ da a las 48 horas en 571 individuos que no pa­ decían derm atofitias en el momento del exa­ men. Esta prueba fue positiva en el 41% de los 170 pacientes con derm atofitias y el 97% de los pacientes tenían tiñas con signos de infla­ mación. La tricofitina es un polisacárido nitrogenado, dializable y que da glucosamina por hidrólisis, así com o enzimas queratinasas. Se considera cjue los componentes dominantes de la tricofiti­ na son los glucopéptidos y la queratinasa, la porción proteica de los primeros y la queratina­ sa estimulan en el huésped la inmunidad me­ diada por células, en tanto que los polisacári­ dos incrementan la actividad de la inmunidad humoral.^’-'*". Con él se han estudiado reaccio­ nes de hipersensibilidad retardada in vitro de

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Inmunopatología

las cuales la inhibición de la migración de m a­ crófagos (MIF) parece la más eficaz.'*' Las dermatofitias inflamatorias generan con cierta frecuencia la aparición de erupciones “segundas” llamadas dermatofítides. Éstas pue­ den presentarse espontáneamente o después de una inyección de tricofitina; igualmente, toda medicación que irrite el foco primario facilitará su aparición. Las tiñas del cuero cabelludo o las tricofitias supurativas de la barba producen dermatofítides liquenoides, foliculares o papulovesiculosas y raramente eritema nudoso, en tanto que las dermatofitias de los pies determi­ nan lesiones vesiculares dishidrosiform es en las manos. Estas manifestaciones cutáneas cu­ ran espontáneamente una vez que el foco pri­ mario es tratado con éxito. Las reacciones serológicas dan resultados poco útiles para el diagnóstico de estos proce­ sos, ello parece deberse a la existencia de antí­ genos com unes entre los derm atófitos y los hongos saprófitos y al escaso poder invasivo de estos microorganismos.'®' Cabrita y Estévez^' comprobaron, sin embargo, que un número sig­ nificativamente elevado de pacientes con tiñas supuradas (querion) presentaban anticuerpos precipitantes demostrables por la reacción de inmunodifut ión en gel de agar. Recientemente se han incorporado reacciones de fijación de complemento y técnicas de ELISA con antíge­ nos más depurados. Por lo general se observan anticuerpos detectables en casos inflamatorios, de larga duración y acompañados de tricofítides. Los anticuerpos corresponden a IgG, y con menor frecuencia a IgM o IgE. Un interesante fenómeno observado en la in­ munidad adquirida en las dermatofitias es el de Bloek. Este autor, y luego otros investigadores, comprobaron que, cuando se inocula un dermatófito por primera vez a un cobayo, éste presen­ ta una tiña experimental después de una sema­ na de incubación; los síntomas alcanzan el m á­ ximo a los 14 a 19 días y luego cura en el plazo de un par de meses. Si este animal es reinocu­ lado con el mismo hongo, la reacción es com­ pletamente diferente; el período de incubación se acorta a 24 o 48 horas, la descamación e in­ flamación van en aumento hasta los 4 o 7 días siguientes y alcanza la curación a los 20 días. Los exámenes micológicos revelan la ausencia de hongos en la reinoculación. Esta tríada del fenóm eno de Block con reacción tem prana, evolución acortada y ausencia de hongos es muy similar al fenómeno de Koch en la tuber­ culosis experimental. Se ha podido comprobar que las reinoculaeiones en el hombre presentan tam bién una evo lu ció n aco rtad a y p reco z, Louste y col.'^’ demostraron un cierto grado de inmunidad a la reinfecciones aun en pacientes portadores de tiñas no inflamatorias.

Se han realizado numerosos estudios para producir inmunógenos contra las dermatofitias. Casi todas las tentativas exitosas emplearon las células fúngicas com pletas, incluyendo los componentes de su pared celular, y casi todos los intentos fallidos usaron extractos de los hongos o subproductos de su desarrollo. Debe señalarse que la técnica de Warton, que utiliza una suspensión de dermatófitos en coadyuvan­ te, resultó ser la más eficaz en cuanto a su efec­ to protector.’' Estos compuestos son inoculados por escarificación cutánea y producen hiper­ sensibilidad e inmunidad locales cuyo grado decrece a medida que se aleja del foco de ino­ culación. INMUNOLOGÍA DE LAS CROMOMICOSIS Las cromomicosis son afecciones de la der­ mis e hipodermis producidas por hongos pig­ mentados (Dematiaceae) pertenecientes a los géneros P hialophora, Fonsecae y Cladosporiiim, caracterizadas por el aspecto verrugoso de las lesiones cutáneas, que habitualmente están ubicadas en las partes descubiertas del cuerpo, en particular en los miembros inferiores. Se ha podido comprobar la presencia de anti­ cuerpos fijadores del complemento tanto en pa­ cientes afectados de cromomicosis como en co­ nejos inm unizados con las diversas especies productoras de esta a f e c c i ó n . E s t a s reac­ ciones presentan títulos elevados con el antíge­ no homólogo y, por el contrario, éstos son ba­ jos o la reacción es negativa con los extractos procedentes de otros hongos productores de la m ism a enferm edad. P rácticam en te, no hay reacciones cruzadas entre los antíg en o s de Phialophora y Fonsecae^-^'^ No se ha estableci­ do aún si existe relación entre el título de las pruebas de fijación de complemento y la seve­ ridad del proceso que aqueja al paciente.'*'^*' En sueros de pacientes con cromomicosis'* se ha obtenido igualmente un alto porcentaje de resultados positivos eon la prueba de inmunodi­ fusión en gel de agar. Se comprobaron reaccio­ nes cruzadas entre antígenos de F. pedrosoi y F. compactum, en tanto que éstas fueron mucho menores entre F. pedrosoi y Ph. verrucosa.'^'’^ Biguel y col.'* y Cooper y Sehmeideu"* estu­ diaron las relaciones antigénicas de los agentes etiológicos de cromomicosis por medio de la inmunodifusión en gel de agar y la microinmunoelectroforesis. Pudo comprobarse que existe cierto grado de reacciones cruzadas entre las tres especies más comunes: Ph. verrucosa, F. pedrosoi y CL carrionii, pero se demostraron algunas diferencias antigénicas que permiten su ubicación en géneros separados.

Inmunología de las micosis Gordon y Al-Doory'’-^^ estudiaron las relacio­ nes antigénicas de diversos hongos pigmenta­ dos, tanto patógenos como saprófitos, mediante pruebas de inm unofluorescencia directa con conjugados específicos preparados a partir de F. pedrosoi, F. compactum y F. dermatitidis. Son muy escasos los datos acerca de la hi­ persensibilidad m ediada por células en esta afección. Se han realizado algunos estudios en Cuba y en la República Dominicana, pero sus resultados no son aún concluyentes. Las prue­ bas cutáneas son positivas en todos los casos de cromomicosis confirmada y en el 25% de los habitantes de zonas endémicas. Este último dato ha hecho pensar a algunos autores'* en la existencia de una cromomicosis-infección asin­ tomática. IN M U N O LO G ÍA DE LAS E SPO R O T R IC O S IS Los estudios inmunológicos en esta afección han perm itido establecer un comportam iento diferente del sistema inmune de acuerdo con la form a clínica de la enferm edad, realizar en ­ cuestas epidemiológicas, determinar la existen­ cia de una infección asintomática y estudiar los antígenos del Sp. schenckií así como sus rela­ ciones con antígenos de hongos vecinos o vin­ culados a él. Las pruebas cutáneas tienen importancia tan­ to en el diagnóstico de casos clínicos de esporotricosis como en la realización de encuestas epidemiológicas. Se han utilizado dos tipos de antígenos; uno de ellos consiste en una suspen­ sión de células levaduriformes muertas por ca­ lor, en solución fisiológica fenicada, en la pro­ porción de 1/1.000 vol/vol y el otro es un poli­ sacárido obtenido por alcohol-acetato de sodio a partir de filtrados del desarrollo en medios lí­ quidos de la fase filamentosa del Sp. schenckii. La técnica de realización y la lectura son sem e­ jantes a las pruebas intradérm icas realizadas con otros a n t í g e n o s . “ .53,54,io5.i.-i4 La suspensión de elementos levaduriformes da resultados positivos tanto en pacientes con esporotricosis com o en personas sin historia clínica de enfermedad que habitan zonas endé­ micas. Al parecer esto se debe a la existencia de una infección asintomática. Por este motivo este antígeno es el preferido en las encuestas epidemiológicas. Por el contrario, el polisacárido de González Ochoa que sólo da resultados positivos en la esporotricosis clínica, constituye un elemento de gran utilidad diagnóstica, pues su negatividad permite excluir el diagnóstico de este pro­ ceso, salvo en casos diseminados que presentan a veces anergia. 52,53,54

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De Britos y col.'"’'* estudiaron las m odifica­ ciones histopatológicas producidas por la esporotriquina y comprobaron la formación de infil­ trados histiocitarios perivasculares, pequeños granulomas y áreas de supuración. La especificidad de esta prueba cutánea es muy grande ya que presenta sólo un débil gra­ do de reacciones cruzadas en los cobayos in­ fectados con N. capsulatum. Flan sido utiliza­ das diversas pruebas serológicas en esta enfer­ medad: aglutinación en tubo de una suspensión de elem entos levaduriformes, aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con un antíge­ no obtenido por filtración del desarrollo del Sp. schenckii en medio líciuido, inmunofluorescen­ cia indirecta, fijación de complemento e inm u­ nodifusión en gel de agar. Las principales con­ clusiones que pueden extraerse es que las reac­ ciones dotadas de m ayor sensibilidad son la aglutinación en tubo y la aglutinación de partí­ culas de látex; la primera de ellas es poco espe­ cífica ya que pueden observai'se reacciones po­ sitivas con títulos de hasta 1/80 en personas sin antecedentes de esporotricosis. Las pruebas más específicas son la inmunodifusión en ge! de agar y la fijación de complemento, éstas son constantemente positivas en los pacientes con formas viscerales; sólo dan 60% de positividad en los portadores de esporotricosis cutánea, los títulos son proporcionales a la extensión de la enfermedad y tienden a negativizarse después que cura el proceso.'’’’’’*®'"’’'*^-^^^^ Recientemente hemos preparado dos antíge­ nos, uno obtenido del sobrenadante de células l e v a d u r i f or me s rotas, y el se g u n d o es un exoantígeno de la fase filamentosa (en form a de extracto acuoso). Con estos reactivos fueron practicadas diversas reacciones serológicas en cobayos y ratones infectados experimentalmen­ te, así como en humanos con esporotricosis cu­ táneas. Las pruebas m ás sensibles fueron la contrainm unoelectroforesis con inm unodifu­ sión secundaria y la aglutinación de células le­ vaduriform es enteras; la especificidad de la contrainmunoelectroforesis fue absoluta cuan­ do se estudió frente a sueros de cobayos sanos, personas sin micosis y pacientes con diversas micosis profundas.^’ IN M U N O LO G ÍA D E LOS M IC E T O M A S Los métodos inmunológicos, en especial las reacciones serológicas aplicadas al diagnóstico de ¡os micetomas, han constituido una valiosa ayuda por la simplicidad de su realización, la especificidad y la rapidez de sus resultados. Su empleo, sin embargo, no se ha generalizado. Murray y Moghraby*^^ emplearon antígenos obtenidos de filtrados de cultivos y antígenos

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Inmunopatología

polisacáridos de diversos agentes productores de m icetom as, tanto A ctin o m yceta les com o Eumycetes. Estos preparados fueron ensayados en pruebas cutáneas practicadas a pacientes portadores de micetomas. Los resultados com ­ probados fueron relativam ente satisfactorios para los actinomicetomas y malos en los maduromicetomas. B ojalil y M agnusson'*’’'-’ prepararon “ una sensibilizina” por medio de un procedimiento similar al de PPD, a partir de cultivos de Nocardia hrasiliensis y Nocardia asteroides. Es­ tos autores comprobaron que las intraderm o­ rreacciones realizadas con 0,002 mg del extrac­ to, en 0,1 mi de volumen, daba resultados fran­ camente positivos (14-35 mm de infiltrado) en los pacientes portadores de micetomas debidos a estos microorganismos. Las pruebas eran es­ pecíficas y no se observaban reacciones cruza­ das entre ambas especies de Nocardia. Con do­ sis diez veces mayores se obtuvieron reaccio­ nes inespecíficas en pacientes tuberculosos o con actinomicosis. Se realizaron ensayos simi­ lares con Actinomadura y Streptomyces sin re­ sultados satisfactorios. Murray y Mahgoub'^^ introdujeron el empleo de la inm unodifusión en gel de agar para el diagnóstico serológico de los micetomas. Co­ mo antígeno se utiliza el sobrenadante de mice­ lio homogeneizado y roto, que luego es dializa­ do y liofilizado. Los resultados obtenidos per­ miten separar con facilidad los actinom iceto­ mas de los maduromicetomas, esto tiene gran importancia pues los primeros responden al tra­ tamiento médico en tanto que en los segundos la terapéutica es siempre quirúrgica. Existen reacciones cruzadas entre microorganismos ta­ xonómicamente relacionados, pero la reacción es siempre mayor con el antígeno homólogo, ya sea por presentar mayor número de bandas de precipitación o por ser éstas más nítidas. Los sueros que presenten pocos anticuerpos pueden ser concentrados por PVP o se puede realizar electrosinéresis cuya sensibilidad es mayor. Otras pruebas serológicas, como la he­ moaglutinación pasiva'® con antígenos polisa­ cáridos de P. hoydii, no han sobrepasado aún la fase experimental al igual que las técnicas inmunoenzimológicas (ELISA).

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Inmunología de las infecciones parasitarias

STELLA M. GONZÁLEZ CAPPA ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA GERARDO A. MIRKIN

Debido a su gran difusión y alta frecuencia las enferm edades parasitarias constituyen un problema médico importante que se acentúa en los países tropicales y subtropicales. Estas in­ fecciones son producidas por protozoarios y helmintos y presentan, como una de las carac­ terísticas más relevantes, tendencia a la cronici­ dad. El parásito rara vez desencadena la muerte del huésped y en general establece con éste una relación de equilibrio. Como consecuencia de la infección crónica la estimulación antigénica es muy prolongada en el tiempo y los estímulos varían desde complejos productos metabólicos, como los antígenos de excreción-secreción de los helmintos y las mudas que eliminan los nematodos en su progresión a diversos estadios larvales, hasta péptidos y proteínas de la super­ ficie parasitaria. La respuesta inmunológica re­ sultante de la interacción huésped-parásito está también condicionada por la localización de los parásitos ya que éstos pueden ser intracelula­ res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp., Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis), intratisulares (Cysticercus cellulosae, Echinococcus granulosas), de cavida­ des (parásitos de localización intestinal), o ex­ ternos (artrópodos). Estas localizaciones pue­ den además ser permanentes o temporarias de­ pendiendo del ciclo evolutivo del parásito. Otra condición que influye en la com pleji­ dad de la estimulación antigénica es que los pa­ rásitos pasan por sucesivos estadios durante su ciclo biológico y cada uno de éstos puede pre­ sentar antígenos distintivos. Los nematodos tie­ nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno adulto, y algunos protozoarios presentan dife­ rentes estadios en ei insecto vector y en el huésped mamífero y, dentro de éste, varían de acuerdo a su localización intra o extracelular

26 (por ej., T. cruzi). Además, y para aumentar la complejidad, algunos parásitos varían sus antí­ genos en el tiempo, aun para el mismo estadio (plasm odios y tripanosom as africanos). Esta p erm an en cia p ro lo n g ad a del parásito , cuya consecuencia es la exposición progresiva del huésped a sus diferentes estímulos antigénieos, conduce a una respuesta inmune que, en gene­ ral, lim ita la infección aunque no la erradica. En ocasiones, el proceso de daño es consecuen­ cia de la misma re.spuesta inmune (esquistosomiasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar­ go, el hecho de que el parásito sobreviva en el huésped y a sus expensas a pesar de la respues­ ta inmune, señala la existencia de mecanismos que le permiten evadir in vivo la acción de los anticuerpos y de las células sensibilizadas. RELACIÓN H U É SP ED -P A R Á S ITO Para estudiar esta relación deben considerarse diversos factores, que se señalan a continuación. 1 - Inmunidad natural del huésped Determina que, dentro de un número de indi­ viduos, algunos sean m ás su sce p tib le s que otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los glóbulos rojos de individuos con grupo Duffy negativo y se ha detectado una asociación sig­ nificativa entre HLA-B53 (molécula de clase I) y resistencia a desarrollar formas severas de paludismo. Experimentalmente se ha com pro­ bado que en leishmaniasis murina la resistencia es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado al MHC, que controla la activación de macró­ fagos; esto determina las diferencias en la sus­ ceptibilidad de distintas cepas de ratones.

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Inmunopatología

21 7 . T h o m a s -A m b ro s e , P; K ie n T r o u n g , T ; B a tte s ti, M R ; G u illo t, B y G o u lU er, A : D ia g n o s tic s e ro lo g iq iie d e l ’a s p e rg illo s e p a r im m u n o flu o r e s c e n c e sui- c o u p e s d e rin,s d e lap in s in o cu lé s a v e c Asp. fum igatus. B ull A ss O ipl M icrobiol Pltarm, //5 ;2 7 -.3 7 , N a n c y , 1969. 2 1 8 . T líu rs to n , J R ; R ic h a rd , J L y M e M ille n , S; C u ltu ra l a n d s e ro lo g ic a l c om p ari.so n o f ten stra in o f A sp erg i­ llus fum igatus. M ycopathologia, 51:327^335, 1 973. 219. T ild e n , E B y H a lto n , E H : P re p a ra tio n a n d p ro p e rtie s o f th e e n d o to x in o f Aspergillus fu m ig a tu s a n d A sp er­ gillus fla va s. Aíycopatfiologia, 14:325-346, 1961. 22 0 a . T r a v a s s o s , L. R .: I m m u n o c h e m is tr y o f P a r a c o c c id io id e s b ra s ilie n s is a n tig e n s In : F ra n c o , M ., L a c a z , C . d a S ., R e s tre p o , A ., D e l N e g ro , G . P a ra c o c id d io id o m y c o s is p p . 6 7 - 8 6 , C R C Pre.ss. B o c a R a tó n Fl. U S A , 1994. 2 2 0 . T r a n V a n K y , P; B ig u e t, J y F ru it, J: L o c a lis a tio n et f re q u e n c e d e s a re s im m u n o e le c tro p h o re to g ra ra e s p ro d u ite p a r le s e ru m d e s m a la d e s a tte in ts d es m y c e to m es a s p e rg illa ite s a p p liq u é s c e n tr e l ’a n tig e n s d e Asp erg illu s fum itagus, Rev Im m unol, .? 0 :1 3 -2 0 , P a r ís , 1966. 2 2 1 . U m e n a i, T y C h ib a , FI: E v a lu a tio n o f th e a n tig e n s p e c if ic to th e m y c e lia l p h a s e o f C andida albicans in th e s e ro d ia g n o sis o f c a n d id ia sis . Tohoku .lournal o f E xp M ed, 123:395-396, 1 9 7 7 . 222. Valiiim arsson, H ; M o s s, P D ; H o lt, P J y H o b b s , J P: T re a tm e n t o f c h ro n ic m u c o c u ta n e o u s c a n d id ia s is w ith l e u c o c y te s f ro m H L -A c o m p a t ib l e s im b lin g . Lancet, 7 :4 6 9 -4 7 2 , 1972. 2 2 3 . V a ld im a rs s o n , H ; H ig g s , J M ; W e lls , R S, Y a m a m u ra, M ; H o b b s , J R y H o lt, P I: I m m u n e a b n o rm a litie s a s s o c ia te d w ith c h ro n ic m u c o c u ta n e o u s c a n d id ia s is . Cell Im m unol, 6 :3 4 8 -3 6 1 , 1973. 2 2 4 . V a lle jo C a s tle jo n , O : E l fa c to r d e tra n s fe r e n c ia c o m o tín ic o re c u r s o te ra p é u tic o e n un c a so d e c o c c id io id o m i c o s i s a n é r g i c a . f í e v L a tin o a m e r iV Iic r o h io l, / ó : 137141, 1974. 225. W a le r, J E y J o n e s, R J: S e ro lo g ic te s t in d ia g n o s is o f a s p e rg illo s is . D is Chest, 53:729-735, 1968. 2 2 6 . W a rn o c ií, D W y E Id re d , G F: Im m u n o g lo b u lin c la s se s o f a n tib o d ie s to A spergillus fu m ig a tu s in p a tie n ts w i t h p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s . S a b o u r a u d ia , y .?:204208, 197.5. 2 2 7 . W e b ste r, B H : B r o n c h o p u lm o n a ry g e o tric h o s is . A re ­ v ie w o f f o u r c a se s . Dis C hest, 35:213-2^1, 1959.

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Inmunología de las infecciones parasitarias

STELLA M. GONZÁLEZ CAPPA ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA GERARDO A. MIRKIN

Debido a su gran difusión y alta frecuencia las enferm edades parasitarias constituyen un problema médico importante que se acentúa en los países tropicales y subtropicales. Estas in­ fecciones son producidas por protozoarios y helmintos y presentan, como una de las carac­ terísticas más relevantes, tendencia a la cronici­ dad. El parásito rara vez desencadena la muerte del huésped y en general establece con éste una relación de equilibrio. Como consecuencia de la infección crónica la estimulación antigénica es muy prolongada en el tiempo y los estímulos varían desde complejos productos metabólicos, como los antígenos de excreción-secreción de los helmintos y las mudas que eliminan los ne­ matodos en su progresión a diversos estadios larvales, hasta péptidos y proteínas de la super­ ficie parasitaria. La respuesta inmunológica re­ sultante de la interacción huésped-parásito está también condicionada por la localización de los parásitos ya que éstos pueden ser intracelula­ res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp., Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis), intratisulares {Cysticercus cellulosae, Echinococcus granulosas), de cavida­ des (parásitos de localización intestinal), o ex­ ternos (artrópodos). Estas localizaciones pue­ den además ser permanentes o temporarias de­ pendiendo del ciclo evolutivo del parásito. Otra condición que influye en la com pleji­ dad de la estimulación antigénica es que los pa­ rásitos pasan por sucesivos estadios durante su ciclo biológico y cada uno de éstos puede pre­ sentar antígenos distintivos. Los nematodos tie­ nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno adulto, y algunos protozoarios presentan dife­ rentes estadios en ei insecto vector y en el huésped mamífero y, dentro de éste, varían de acuerdo a su localización intra o extracelular

26 (por ej., T. cruzi). Además, y para aumentar la complejidad, algunos parásitos varían sus antí­ genos en el tiempo, aun para el mismo estadio (plasm odios y tripanosom as africanos). Esta p erm an en cia p ro lo n g ad a del parásito , cuya consecuencia es la exposición progresiva del huésped a sus diferentes estímulos antigénieos, conduce a una respuesta inmune que, en gene­ ral, lim ita la infección aunque no la erradica. En ocasiones, el proceso de daño es consecuen­ cia de la misma re.spuesta inmune (esquistosomiasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar­ go, el hecho de que el parásito sobreviva en el huésped y a sus expensas a pesar de la respues­ ta inmune, señala la existencia de mecanismos que le permiten evadir in vivo la acción de los anticuerpos y de las células sensibilizadas. RELACIÓN H U É SP ED -P A R Á S ITO Para estudiar esta relación deben considerarse diversos factores, que se señalan a continuación. 1 - Inmunidad natural del huésped Determina que, dentro de un número de indi­ viduos, algunos sean m ás su sce p tib le s que otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los glóbulos rojos de individuos con grupo Duffy negativo y se ha detectado una asociación sig­ nificativa entre HLA-B53 (molécula de clase I) y resistencia a desarrollar formas severas de paludismo. Experimentalmente se ha com pro­ bado que en leishmaniasis murina la resistencia es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado al MHC, que controla la activación de macró­ fagos; esto determina las diferencias en la sus­ ceptibilidad de distintas cepas de ratones.

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Inmunopatología

2 - Especificidad de huésped Los parásitos presentan en mayor o menor grado especificidad con respecto a su huésped por lo que algunos los seleccionan dentro de determinadas especies de una manera muy res­ tringida, como por ejemplo el Enterobius verrnicularis, especie de nerriatodo exclusivo del humano. Otro ejemplo de huésped restringido corresponde a las especies del género Plasmodium, dentro del cual 4 parasitan exclusivamiente al hombre, existiendo otras con especifi­ cidad particular para otras especies de mamífe­ ro y de aves. Hay otros parásitos menos especí­ ficos que pueden infectar una amplia gama de huéspedes, como por ejemplo el T.gondii, pará­ sito de mamíferos y aves, o el T.cruzi que pro­ gresa en diferentes especies de mamíferos in­ cluido el hombre, pero que es incapaz de hacer­ lo en las aves. Una vez alcanzado su huésped,, los parásitos en algunos de sus estadios pueden presentar también alta especificidad por el sitio en que se ubican (por ej. los esporozoítos de las especies de Plasmodium que parasitan al hombre sólo ingresan en el hepatocito, las larvas de esta­ dio de 'Trichinella spiralis, después de una m i­ gración inicial, se alojan intracelularmente en músculo esquelético, los estadios adultos de Cestodes sólo se ubican en la luz del intestino delgado). Esto está en general determ inado porque en ese hábitat particular los parásitos encuentran las señales adecuadas para su desa­ rrollo y/o porque poseen receptores para ingre­ sar a un determinado nicho. 3 - Mecanismos de defensa no específicos Después de una primera exposición al agente infeccioso transcurre un tiempo hasta que se monta una respuesta antígeno específica. D u­

rante este lapso la defensa recae en una serie de mecanismos locales y sistémicos mediados por factores humorales y fagocitos. En el sitio de ingreso de los parásitos, sobre todo si penetran por piel, se registra una reac­ ción local que sirve para lim itar la disem ina­ ción, y a la vez facilita el acceso de células in­ flamatorias y el gatillado de una serie de reac­ ciones sistém icas com o fiebre, leucocitosis, producción de proteínas de fase aguda, activa­ ción de mecanismos microbicidas por los fago­ citos. Entre las proteínas de fase aguda la pro­ teína C reactiva actúa como opsonina colabo­ rando en la fagocitosis del patógeno. El com ­ plemento puede también favorecer la fagocito­ sis de algunos parásitos; además, en algunos de ellos (o en algunos de sus estadios) existen en su membrana externa factores activadores de la vía alterna del complemento que conducen a su destrucción sin requerir anticuerpos. La llave que conecta la respuesta inespecífi­ ca con la específica es la secreción de lÉN-y e IL-4, que inducen y modulan la actividad de los linfocitos T hl y Th2. 4 - Mecanismos efectores de inmunidad El huésped pone en marcha diferentes meca­ nismos para protegerse y limitar la masa parasi­ taria (cuadro 26-1). En la mayoría de los casos se requiere de la acción combinada de diversos eslabones de la respuesta inmune. En este pro­ ceso pueden participar m acrófagos, com ple­ mento, anticuerpos, mecanismos de citotoxici­ dad directos o mediados por anticuerpos, citoquinas, etc., y predominará la acción de unos sobre otros dependiendo del parásito, del perío­ do de la infección y de las características gené­ ticas del huésped. Sin embargo, todos los esla­ bones de la respuesta inmune serán insuficien­ tes para erradicar las parasitosis en las que la

C u ad ro 26-1. Ejemplos de mecanismos inmunes de control de las parasitosis M ecanism o efector A nticuerpo,s lítico,>>

A nticuerpo.s n e u ti'a iiz an te s

C ito to x ic id a d c e lu la r a n tic u e rp o d e p e n d ie n te Linfocito.s c ito tó x ic o s M a c ró fa g o s a c tiv a d o s D e g ra n u la c ió n c e lu la r d e b a s ó filo s (Ig E )

Parasitosis

E stadio/célula blanco

E n f e rm e d a d d e i s u e ñ o P a lu d is m o E n fe rm e d a d d e C h a g a s T o x o p la s m o s is P a lu d is m o E n fe rm e d a d d e C h a g a s T o x o p la s m o s is E n fe rm e d a d d e C h a g a s P a lu d is m o T riq u in o s is E n fe rm e d a d d e C h a g a s

T r ip o m a s tig o te E ritro c ito p a ra s ita d o T rip o m a s tig o te Z o ito c irc u la n te E s p o ro z o ilo -M e ro z o ito T rip o m a s tig o te Z o ito c irc u la n te T r ip o m a s tig o te E ritro c ito p a ra s ita d o L a rv a re c ié n n a id a M io c ito p a ra s ita d o

L e ish m a n ia s is T o x o p la .sm o sis H e lm in tia s is in te s tin a le s

A m a s tig o ie Z o ito L a rv a s - A d u lto s

Inmunología de las infecciones parasitarias multiplicación del parásito se perpetúa en el mismo huésped. Hasta hace poco se afirmaba que la leishmaniasis cutánea, producida por L. trópica, en pacientes con reactividad inmunoló­ gica normal para el parásito, era una excepción; sin embargo, el hecho de que en casos de SIDA se hayan detectado reactivaciones en pacientes supuestamente curados de la parasitosis, hace que deban reverse estos supuestos. El control efectivo es difícil de alcanzar en parte por el complejo ciclo de vida de los pará­ sitos que en los sucesivos estadios pueden pre­ sentar antígenos propios, algunos de ellos nece­ sarios para el reconocimiento del huésped, teji­ do o célula donde el parásito se ubicará y por los diversos mecanismos de escape de la res­ puesta inmune que los parásitos han desarrolla­ do. De la interacción entre la respuesta inmune del huésped y los mecanismos de escape del p a­ rásito surge el estado de equilibrio que lleva a la cronicidad de la mayoría de las parasitosis; si el equilibrio se rompe puede producirse la enfer­ medad parasitaria y aun la muerte de la persona parasitaria y esto dependerá tanto del parásito (tamaño del inóculo, virulencia, etc.) como del huésped (capacidad de respuesta inmune). Los anticuerpos pueden favorecer el control de la masa parasitaria de variadas maneras, por ejem plo, bloqueando receptores parasitarios (proteína CS del esporozoito en diversas espe­ cies de Plasm.odium), destruyendo al parásito o a la célula infectada por activación del comple­ m ento o por A D CC (form as circulantes de T. cruzi o eritrocitos infectados con P lasm o­ dium), opsonizando al parásito y promoviendo su destrucción por fagocitosis (T.gondii, T.cru­ zi), activando mecanismos de degranulación en mastocitos y basófilos, y secreción de mucus por parte de las células caliciformes que, en el caso de los verm es ubicados en el intestino, contribuirían a su deterioro y eliminación. En el hombre, un ejemplo de la participación de los anticuerpos en los mecanismos de pro­ tección se evidencia en la infección por plas­ modios ya que, en área endémica y durante los primeros meses de vida, los hijos de mujeres infectadas presentan resistencia a la infección malárica. Sin embargo, los linfocitos T son las células fundamentales para el control de la masa para­ sitaria; así, en ratones atímicos se ha demostra­ do un empeoramiento del transcurso de algunas enferm edades, como por ejem plo en m alaria murina y enfermedad de Chagas. El tipo de cé­ lula T involucrada depende de la naturaleza del patógeno, de la ubicación del parásito, de las características genéticas del huésped y del esta­ dio de la infección. Además, pueden actuar de manera directa o mediante la secreción de citoquinas.

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En el paludismo, por ejemplo, los linfocitos T C D 8 son células efectoras de citotoxicidad directa cuyo blanco es el hepatocito parasitario; pero además, mediante la secreción de IFN-y, inhiben la multiplicación del parásito en esta célula. La falta de moléculas de clase II en el hepatocito, y la ausencia de expresión de antí­ genos parasitarios en la membrana de estas cé­ lulas, hace que los linfocitos T CD4 sean ine­ fectivos. Éstos, sin embargo, participan en el control de la fase eritrocítica por mecanismos de ADCC, Usando glóbulos rojos que expresan antígenos parasitarios en su superficie. D entro de las células CD4 se reconocen 2 subpoblaciones; Thl y Th2, las que se diferen­ cian por las citoquinas que producen. El tipo de subpoblación estimulada por un parásito es producto de sus características, entre ellas el modo de interacción con su huésped. En fun­ ción de que predomine una u otra población, se estim ulará más eficientem ente un tip o de respuesta que conducirá a una efectiva activa­ ción m acrofágica (T h l), con producción de TNF e IFN-y, o deficitaria en activación m a­ crofágica (Th2) con producción de IL-4, IL-5 e ÍL-IO, inducción de la proliferación de LB, producción exacerbada de IgE, activación de mastocitos y eosinófilos. En general, la resis­ tencia contra parásitos intracelulares está aso­ ciada a T hl y la de parásitos extracelulares, a Th2. Sin embargo, en la mayoría de las parasi­ tosis se estimulan ambos mecanismos, aunque con diferente preponderancia, y la relación en­ tre ambos puede variar con el progreso de la infección, ya que ambas poblaciones se interregulan negativamente. El concepto básico de esta respuesta polarizada se extiende a b acte­ rias {IVlycobacteriun'i tuberculosis y iVI.leprae), a virus y a hongos, pero las evidencias de este fenómeno fueron presentadas en principio por investigadores que trabajaban en modelos pa­ rasitarios. En ausencia de señales claram ente polarizadas, puede aparecer una subpoblación ThO con un perfil de citoquinas menos diferen­ ciado. L a p articipación de estos subtipos d e LT CD4 se ha estudiado muy bien en leishm ania­ sis, donde se ha demostrado experimentalmen­ te que para L.major la resistencia se asocia a la producción de IFNry y que, si se transfieren cé­ lulas Th2 productoras de IL-4, se agrava el cur­ so de la parasitosis. En el caso de leishmaniasis visceral, la estimulación antigénica in vitro de linfocitos de pacientes produce secreción de IL-10, la cual se inhibe después del tratamiento antiparasitario. Una linfoquina probablemente determ inante del subtipo celular que vaya a predominar en una parasitosis dada es la IL-12 que junto con el IFN-y favorecería la diferen­ ciación de Thl.

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Inmunopatología

Las células Thl al activar al macrófago, esti­ mulan el estallido respiratorio y la producción de NO, lo ciue favorecerá el control de los pará­ sitos ubicados en el interior de estas células. Los macrófagos activados secretan citoquinas; una de ellas es el TNF que puede reforzar los mecanismos inmunológicos tendientes a con­ trolar al parásito (¡eishmanias, esquistosómulas), pero tam bién puede ser responsable de parte del daño producido en el huésped, como sucede en malaria cerebral. En las infecciones por helmintos una carac­ terística bastante generalizada es la eosinofilia, consecuencia de la estimulación de eosinófilos por un factor estimulador de colonias y que se asocia con niveles elevados de IgE y mastocitosis, todo ello como consecuencia de una res­ puesta inmune polarizada hacia Th2 por los an­ tígenos parasitarios. Se ha sugerido que la pre­ sentación de antígenos en el contexto de pro­ teasas, que son usadas por los vermes migran­ tes para pasar a través de los tejidos, mediaría la maduración de las CD4 al fenotipo Th2. La participación de las células NK como m e­ canismo efector de control de parasitosis está menos explorada. Sin em bargo, se sabe que funcionan en infecciones por Theileria parva, un protozoario de linfocitos del ganado vacuno. También se ha descrito su acción mediadora de ADCC contra helmintos. 5 - Mecanismos de evasión de la respuesta inmune utilizados por los p arásitos Algunos de los mecanismos que utilizan los parásitos para evadir las defensas del huésped y asegurar así su persistencia, se resumen en el cuadro 26-2. a. Hábitat intracelular Los parásitos de localización intracelular es­ tán protegidos de la acción directa que anti­ cuerpos o linfocitos puedan ejercer sobre ellos, aunque éstos eventualmente puedan actuar so­ bre la célula huésped. Por lo tanto, una adecua­ da y rápida internalización celular les facilita la evasión de la respuesta inmune del huésped. El T. gondii y el P. falciparum secretan pro­ teínas que facilitan su internalización en célu­ las nucleadas y en eritrocitos, respectivamente. El T. cruzi acelera su penetración tisular in vi­ tro en presencia de inmunosueros. Cuando la célula invadida es un fagocito, los parásitos deben desarrollar estrategias que les posibiliten evadir la muerte por fagocitosis. El T.cruzi y el T.gondii son capaces de invadir, además de otras células nucleadas, a los fagoci­ tos, y las leishmanias sólo invaden macrófagos. En estas células estos tres parásitos activan di-

Cuadro 26-2. M ecanism os p a ra sita rio s de evasión de la respuesta inmune M ecanism os

Parásitos en ei que es efectivo

Plasrnodium falciparum Trypatiosonta rhoclesiense M im eti.sm o Shistosom a m ansoni Trypanosom a brucei Trypanosom a vivax “ C a p p in g ” L eishm ania donovani Trypanosom a cruzi E ntam oeha histolytica E v a s ió n d e la a c tiv id a d mi- T oxopiasm a gondii Trypanosom a cruzi c i'o b ic id a d e l m a c ró fa g o L eishm ania sp p In ra u n o d e p re s ió n d e l h u é s ­ P íasm odium fa lcip a ru m p ed T rypanosom a cruzi L eislim ania m exicana pifanoi L o c a liz a c ió n in tra c e lu la r Trypanosom a cruzi Toxopiasm a gondii P íasm odium .spp T oxocara canis L ib e ra c ió n d e a n tíg e n o s R e s is te n c ia a la a c c ió n del Leishm ania sp p c o m p le m e n to Trypanosom a sp p V a ria c ió n a n tig é n ic a

versos m ecanism os que los protegen de los efectores normales de la fagocitosis. El T.cruzi, en su estadio intracelular o amastigote, secreta una hemolisina activa a pH 5,5 que actuaría lisando la vacuola parasitófora y permitiendo el escape del parásito al citoplasma. Estas vacuo­ las son acídicas. Existe una analogía entre la acción de esta hemolisina y la lisis por comple­ mento. El T.gondii al contactar a una célula, primero se orienta y luego sus roptrías secretan diversos componentes entre ellos el PEF (“Penetration enhancement factor”) que facilita la penetración, mientras que una vez en el interior de la célula, proteínas de los micronemas y de los cuerpos densos contribuyen a form ar la m em brana de la vacuola parasitófora que lo protege de la acidificación y de la fusión con los lisosomas, con permeabilidad selectiva que permite la nutrición del parásito. Las leishm anias entran pasivamente en las células macrofágicas y se multiplican en la va­ cuola fagocítica resistiendo a la digestión. Los componentes que actuarían protegiendo al pa­ rásito son un lipofosfoglicano (LPG) que inhi­ be el estallido respiratorio, una superóxido dismutasa que degrada el radical anión superóxido de los peroxisomas del fagocito, una proteasa (GP63) que degrada las enzimas lisosomales, y una fosfatasa ácida. En todos los casos estos parásitos pueden ser fagocitados y destruidos más eficientemente si los macrófagos están activados, lo que explica que en general, con la progresión de la infec­ ción, los m acrófagos puedan participar en el control de la parasitosis.

Inmunología de las infecciones parasitarias h. Variación antigénica Fue descrita como “un fenómeno que se pro­ duce durante la infección de un huésped por una especie única de protozoario patógeno, a partir del la cual se origina una sucesión de po­ blaciones parasitarias, cada una de ellas reco­ nocida como antigénicam ente distinta por la respuesta inmune del huésped. Esto determina la formación de anticuerpos específicos para cada población, los que pueden evidenciarse m ediante pruebas de reconoci­ miento de los antígenos de superficie del parási­ to o de las células parasitadas (aglutinación, Jisis, etc.)” (Doyle, 1975). Este fenómeno que ocurre en un único huésped y en un corto perío­ do (semanas o meses) ha sido comparado con lo que ocurre con el virus de la influenza a nivel de la población mundial y en períodos de años. La capacidad de variación antigénica ha sido probada para diversas especies de tripanosomas africanos y plasmodios. Los antígenos varia­ bles son glucoproteínás de superficie (VSGs) que determinan el tipo de variable antigénica (VATs). El número de genes capaces de codifi­ car VSGs en tripanosomas africanos es extenso (teóricamente más de 1 0 0 0 ), pudiendo expre­ sarse a partir de una infección clonal cientos de VATs; además, el repertorio de VSGs puede variar para diferentes poblaciones parasitarias. En e] caso del género Plasmodium, los eritroci­ tos parasitados expresan la variante antigénica en la superficie. Además se ha demostrado que la CSP (“circum sporozoite surface protein” , proteína de superficie del esporozoito) de algu­ nas especies de este género también manifies­ tan variabilidad clonal. El fenóm eno de variación antigénica debe ser considerado cuando se intenta desarrollar una vacuna, ya que la neutralización de un antí­ geno variable puede ser sumamente ineficiente contrastando con la elevada eficiencia de este mecanismo de escape. c. Mimetismo Consiste en la adquisición o síntesis por par­ te del parásito de com ponentes propios del huésped que lo harán pasar inadvertido para ei sistema inmune o interferirán por acción mecá­ nica en la interacción entre los anticuerpos y/o células y el parásito. Así, en el Trypanosoma vivax, parásito de caprinos y bovinos, se han descrito globulinas alfa y beta, cuyo reconoci­ miento se realizó por lisis del parásito em ­ pleando inmunosueros antiglobulinas de ratón en presencia de complemento. Esto también ha sido descrito para T.brucei. Este fenómeno ha sido observado no sólo en protozoarios sino también en metazoarios. En

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el caso de los esquistosomas se ha demostrado que el parásito en su estadio adulto es capaz de estimular la respuesta inmune sin ser afectado por ella (inmunidad concomitante) ya que es capaz de evadirla enmascarando su superficie con antígenos provenientes del huésped o codi­ ficados por él a semejanza del huésped. E xperi­ mentalmente se ha demostrado que estos antí­ genos suelen presentarse como glucolípidos (grupos sanguíneos, antígenos de Forssm an, etc.) y excepcionalmente como glucoproteína (MHC). También se ha demostrado la presen­ cia de inmunoglobulinas, las que se adherirían por el fragm ento Fe a receptores específicos presentes en la superficie del parásito. d - “Capping" La membrana de la célula eucariota es una estructura dinámica y fluida y, en consecuen­ cia, las proteínas pueden redistribuirse m odifi­ cando su posición. La movilidad de estas p ro ­ teínas puede ser inducida o acelerada por anticuei-pos o por otras sustancias (por ej., conca­ navalina A) constituyendo complejos que tien­ den a agruparse formando un casquete o “cap ”, generalmente cerca del aparato de Golgi; estos complejos luego serán exocitados o endocitados por la célula. El fenómeno, denominado “capping”, se ha descrito para algunos protozoarios como Entamoeba histolytica, T.cruzi, L.donovani, T .gon­ dii, etc. Una rápida redistribución de los co m ­ plejos antígeno-anticuerpo en la superficie de un parásito puede determinar que las inmunoglobulinas que participan de dichos complejos presenten una distribución espacial que im pida la adecuada fijación del complemento, evitán­ dose así la lisis del parásito. El recambio de an­ tígenos de superficie puede también evitar que se e je c u te n otro s m e c a n ism o s eom o el de ADCC o citotóxicos por linfocitos T CD 8 +. í? - Elem.entos distractores de la respuesta inmune En esta categoría podemos considerar la li­ beración de antígenos al medio y la existencia de antígenos inmunodominantes (¿superantíge­ nos?) carentes de la funcionalidad requerida para la sobrevida del parásito. i - Liberación de antígenos Algunos de los mecanismos por los que es­ tos antígenos pueden interferir en la respuesta inmune son; • Combinación con anticuerpos neutralizando su acción.

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Inmunopatología

» Bloqueo de las células efectoras, directamen­ te, o por formación de inmunocomplejos. “ Inducción de tolerancia T o B. ® Activación policlonal en respuesta a compo­ nentes mitogénicos del parásito. ” Activación de células supresoras. Este mecanismo es importante para la persis­ tencia de algunos nematodos, como por ejem­ plo el Toxocara canis, que es capaz de secretar elevadas cantidades de antígeno y cuya larva de segundo estadio puede permanecer viable en el ser humano por largos periodos. En S. mansoni se alcanza la inhibición de los LT citotóxi­ cos por inmunocomplejos, y en la mayoría de las infecciones por protozoarios tisulares se ge­ neran activación policlonal e inmunodepresión relativa (paludism o, enferm edad de Chagas, enfermedad del sueño, etc.). ii - Antígenos inmunodominantes como distractores En el caso del T.cruzi la trans-sialidasa es una proteína que ha sido relacionada con el proceso de invasión celular. Está formada por dos dominios, uno altamente antigénico consti­ tuido por unidades repetitivas y denominado SAPA, y el otro catalítico. El antígeno SAPA genera altos títulos de anticuerpos que no son capaces de inhibir la actividad enzimática. Esta actividad sería requerida por el parásito para transportar sobre su superficie ácido siálico, molécula requerida para interaccionar con las células hospedadoras iniciando así el proceso de internalización. La respuesta inmune al antí­ geno dom inante durante la infección aguda protegería al sitio catalítico permitiendo así la internalización celular del parásito. Pasado el período agudo de la infección por T.cruzi, se detectan anticuerpos anti-trans-sialidasa que podrían participar en el control de la infección. f - Preadaptación y resistencia al complemento El término preadaptación se aplica para defi­ nir el proceso de diferenciación de vm parásito, dentro del insecto vector, que lo habilita para sobrevivir y establecer la infección en el hués­ ped mamífero. Una de las estrategias más im ­ portantes de la preadaptación es el desarrollo de la resistencia al complemento. Este proceso es de gran im portancia en T.cruzi, tripanoso­ mas africanos y leishmanias. El estadio epimastigote de T. cruzi, replicativo y no infectivo, que se encuentra en el intes­ tino de la vinchuca, es sensible al complemen­ to. El estadio tripomastigote metacíclico, no replicativo e infectivo, que se elimina con las de­ yecciones del vector, es resistente al com ple­

mento. Este último es semejante en sus caracte­ rísticas al tripomastigote circulante y al tripómastigote obtenido en cultivos celulares y axénicos. Las evidencias experimentales sugieren claramente que la serorresistencia de este esta­ dio es una consecuencia de la pobre activación del complemento por parte de los estadios in­ fectivos. A diferencia de lo que ocurre en los estadios no infectivos que fijan C3 a un recep­ tor de su mem brana convirtiéndolo luego en C3b. El C3 fijado a los estadios tripomastigotes (infectivos), además de depositarse entre 7 a 8 veces menos, se convierte principalm ente en C3bi, fallando en consecuencia en el gatillado de la cascada que conduce a la formación de C5b-9 y a la lisis del parásito. La ineficacia del C3 fijado al estadio infectivo de este parásito es el resultado de la producción de una molécu­ la funcionalm ente símil al Factor A celerador del Decaimiento (DAF) presente en los huma­ nos. Esto en última instancia es una modalidad de mimetismo ya que el parásito está produ­ ciendo proteínas homólogas a las del huésped para restringir la acción del complemento. En el caso de las leishmanias, se ha demos­ trado que el promastigote en la fase de creci­ miento logarítmico de un cultivo, cuando aún no es infectivo, es sensible a la acción del com­ plemento, mientras que en la fase estacionaria (promastigotes maduros) es infectivo y resis­ tente al complemento. El promastigote maduro, al ser inoculado en el huésped mamífero, activa la vía alterna del complemento con dos conse­ cuencias : a) atrae macrófagos al sitio de entra­ da y, b) facilita la adhesión del parásito a los receptores RC3 del macrófago y su posterior fagocitosis; ambos hechos favorecen la sobre­ vida del parásito ya que su hábitat exclusivo es esta célula. Este parásito tiene sobre su superficie un lipo fosfoglicano (LPG) y una glucoproteína, GP63, ambos implicados en la unión del pará­ sito al macrófago y a su posterior internaliza­ ción; como ya se mencionó, ambos participan en los mecanismos de resistencia a las enzimas lisosomales e inhibición del estallido respirato­ rio de estas células. Los promastigotes maduros fijan C3 que se transforma en C3b, con la con­ siguiente activación de C5b-9; sin embargo, la elongación del LPG impediría la inserción de C5b-9 y produciría su liberación impidiendo la lisis del parásito. 6 - Mecanismos de patogenicidad En ausencia de un patógeno, la respuesta in ­ mune específica está limitada por mecanismos supresores que operan a nivel clonal (redes idiotipo-antiidiotipo) o policlonal (citoquinas supresoras como IL-IO), pero persisten meca­

Inmunología de ¡as infecciones parasitarias nismos de memoria inmunológica, asociados a la presencia de células de memoria en sangre periférica. Las infecciones parasitarias, como ya se ha mencionado, tienen habitualmente evolu­ ción crónica, a diferencia de la mayoría de las infecciones bacterianas y virales. Como resulta­ do de la cronicidad se manifiesta persistencia antigénica, que da lugar a dos fenómenos dife­ rentes desde el punto de vista inmunológico. Por un lado, se desarrollan los mecanismos de inmunidad concomitante y, por otro, se pueden presentar reacciones de hipersensibilidad. En relación a esta liltima posibilidad, debemos con­ siderar que en algunos casos existe, además, identidad antigénica entre macromoléculas del huésped y el parásito (mimetismo molecular) dando lugar a fenómenos autoinmunes. Por otra parte, ciertos antígenos son capaces de activar en forma diferente subpoblaciones de linfocitos T cooperadores (linfocitos Thl y Th2) que pro­ ducen distintas linfoquinas dando lugar a las reacciones de hipersensibilidad por activación de determinadas células efectoras (macrófagos, eosinófilos, mastocitos, etc.). Algunas parasitosis inducen reacciones inmunológicas las cuales, a su vez, desempeñan un papel primordial en la patogenia de la enfer­ medad parasitaria. A continuación describire­ mos algunos ejemplos. Los adultos del helm into S. mansoni viven en las vénulas m esentéricas inferiores. Las hembras ovipositan y los huevos son arrastra­ dos por la circulación portal hacia el hígado, quedando retenidos en el endotelio vascular merced a la presencia de una espíenla y al pe­ queño calibre de algunos capilares. Los huevos poseen gran diversidad de antígenos, que en conjunto se denominan antígenos solubles del huevo (SEA, soluble egg antigens), de carácter proteico con pesos m oleculares desde m enos de 21 kD a más de 200 kD. Algunas de estas proteínas tienen capacidad linfoestimulatoria, com o la p ro teín a m ayor lin fo e stim u lato ria (LMP), cjue es una proteína acídica. Los SEA promueven, además, la formación de un granu­ loma periovular, debido a que desencadenan una reacción de hipersensibilidad retardada. El desarrollo y mantenimiento del granuloma está bajo control de distintas subpoblaciones de lin­ focitos T, que modulan el tamaño del mismo mediante citoquinas. Además de las citoquinas clásicamente descritas, otras más recientemente caracterizadas tienen un papel importante en el desarrollo del granuloma. Por ejemplo, el fa c ­ tor estimulante del los fibroblastos-1 (E sF - 1 , PM 60 kD, pl 6,2), producido por linfocitos T CD4, promueve la multiplicación de fibroblas­ tos y la síntesis de hialuronanos y fibronectina. Esta última es, además, un quimioatractor de fibroblastos. Este factor sería el responsable de

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la fibrosis hepática observada en el curso de la infección. Se ha comunicado que los linfocitos de pacien tes con fibrosis severa responden fuertemente a antígenos del huevo de S. nmnsoni en la fase crónica. Existen evidencias que indican que la intensidad de la resp u esta es controlada por el MHC: individuos con haplo­ tipos HLA-A2 y B12 responden fuertemente y manifiestan fibrosis severa con mayor frecuen­ cia, en tanto que pacientes con haplotipo HLADR2 tienen escasa reactividad y menor in ci­ dencia de fibrosis severa. El análisis de clones de linfocitos T CD4 hu­ manos de pacientes con esquistosomiasis revela que estos pueden ser de tipo ThO, T hl, T h2 y Th3 (estos últimos producen IL-5 disociada de la producción de IL-4). Se ha observado que las distintas poblaciones de Th reconocen antíge­ nos de diferente peso molecular. Los linfocitos Th2 serían responsables de la producción de an­ ticuerpos y de la eosinofilia periférica observa­ das en la fase crónica de esta parasitosis. Los SEA tam bién prom ueven la proliferación de clones CDS supresores (CDllb-h) y citotóxicos (C D llb -), productores de IFN-y, con capacidad regulatoria de la formación del granuloma. Es­ tudios in vitro e in vivo demuestran que esta ci­ toquina es activa en la fase de inducción y cre­ cimiento del granuloma, en tanto que las IL -2 e lL-4 son activas en la fase de mantenim iento del mismo, probablemente mediante m ecanis­ mos de retroalimentación negativa entre los lin­ focitos CD4 Thl y Th2, respectivamente. A es­ tos mecanismos de retroalimentación mediados por citoquinas se agregarían mecanismos de re­ gulación específica mediados por linfocitos T autoantiidiotípicos y la acción de macrófagos in trag ra n u lo m ato so s los cuales pro m u ev en anergia de linfocitos T h l a SEA in vitro. La causa de la anergia sería la modulación de ia molécula B7 en las células presentadoras de an­ tígeno (CPA), con lo cual la señal coestimulato­ ria para la activación de los linfocitos T h l, ejer­ cida a través de la unión de CD28 (o CTLA-4) a B7, no sería posible. Otras citoquinas que ten­ drían un papel preponderante en la generación de la anergia son e\ factor de crecimiento transform ante-p (TGF-p), producido por los m acró­ fagos activados presentes en el granuloma, y la IL-10, producida por linfocitos T CD4 Th2, lin­ focitos B y macrófagos. De hecho, esta citoquima es la responsable de la modulación de B7 en Jas CPA. Por último, se ha observado que pro­ teínas de choque térmico, que serían traducidas durante la inflamación granulomatosa, inhiben la actividad de macrófagos como CPA m edian­ te el mismo mecanismo. Otra parasitosis en la cual se han observado fenóm enos inm unopatogénicos es el p alu d is­ mo. Establecida la invasión de los eritrocitos.

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Inmunopatología

los posteriores fenómenos que llevan a la pato­ logía están ligados con algunos de los siguien­ tes mecanismos: lisis inmune de eritrocitos pa­ rasitados y no parasitados, glom erulonefritis por deposición de inmunocomplejos y, en palu­ dismo por P . falciparum, malaria cerebral. Las propiedades adhesivas de los eritrocitos parasitados, responsables del secuestro de eri­ trocitos parasitados por P. falciparum a nivel visceral y cerebral, están relacionadas con la presencia de receptores específicos en el endo­ telio vascular, conocidos como moléculas de adhesión celular (CAM); gp CD36 en plaque­ tas (formación de un puente entre eritrocitos parasitados y el endotelio vascular), ICAM-1, tro m b o sp o n d in a, E -se le c tin a (E L A M -1) y VCAM-1, entre otros. En la infección por P. falciparum, se ha iden­ tificado un antígeno presente en eritrocitos pa­ rasitados (PfEMP-1) el cual está asociado a la unión de eritrocitos al endotelio. Esta molécula sería la responsable de la form ación de los “knobs”, pequeñas protuberancias en el eritroci­ to, de los cuales depende la adhesión de los mismos al endotelio vascular. La presencia de diversas CAM que promueven la unión de eri­ trocitos parasitados al endotelio es de funda­ mental importancia al considerar la malaria ce­ rebral y su patogenia. La formación de microtrombos que originan focos de isquemia, hipoglucemia y necrosis, daría lugar a un proceso inflamatorio en el que los macrófagos juegan un papel fundamental. La liberación de citoquinas (ÍL-1 y TNF) por estas células induce la pro­ ducción NO. Este factor es producido, además, por los neutrófilos atraídos al foco necrótico, por las células endoteliales y por el mtísculo li­ so vascular. El pasaje del NO desde el torrente circulatorio al parénciuima cerebral sería posible merced al carácter no polar de la molécula. El NO, identificado actualmente como el Factor relajante del endotelio vascular (EDRF) daría lugar, como consecuencia de su liberación lo­ cal, a un aumento del volumen sanguíneo cere­ bral y, por consiguiente, a hipertensión endocraneana. Paralelamente, el aumento sistémico de este mediador sería responsable de la hipoten­ sión sistémica observada en algunos pacientes. Cuadros similares se han comunicado en pa­ cientes sometidos a terapia antineoplásica con TNF, lo que apoya lo observado sobre la acción de esta citoquina en la malaria cerebral. Las parasitosis precedentes presentan como rasgo característico un evidente sesgo hacia m e­ canismos inmunes celulares de daño tisular si bien, como se enunció en el caso de paludismo, los mecanismos pueden ser mixtos, con compo­ nentes tanto humorales como celulares. En con­ traposición, las helmintiasis intestinales presen­ tan como rasgo característico un componente

inmunopatológico primariamente desencadena;do por la respuesta humoral. En las infecciones por nematodos se observa frecuentemente hi­ perproducción de IgE y eosinofilia periférica. Si bien arin no se comprende totalmente la rela­ ción entre la identidad estructural de los antíge­ nos parasitarios y los mecanismos que determi­ nan el “switch” de isotipo de IgM a IgE en los linfocitos B, lo cierto es que esos antígenos pre.sentan algunas características com unes con alérgenos ambientales, responsables de proce­ sos atópicos: punto isoeléctrico acídico y bajo peso molecular (generalmente en el rango de 1 0 kD a 70 kD). Una característica pecuhar de los alérgenos de nematodos es que estos se sinteti­ zan com o proteínas de alto peso m olecular (200-400 kD) formadas por unidades repetiti­ vas, que son olivadas por enzimas proteolíticas. Estas proteínas muestran homología secuencial entre sí pero no con otras proteínas. Sus propie­ dades alergénicas dependerían de la estructura primaria, ya que el sometimiento de las mismas a calor no afecta estas propiedades. Estos alér­ genos serían tanto componentes somáticos co­ mo proteínas de excreción-secreción de los ne­ matodos. Aparte de las características estructu­ rales particulares de estos alérgenos, las caracte­ rísticas genéticas del huésped parecen tener gran importancia: en modelos experimentales se ha demostrado que ratones endocriados con di­ ferente haplotipo de histocom patibilidad res­ ponden generando IgG o IgE contra el mismo alérgeno. Aun más, estudios realizados con ad­ yuvantes demuestran que el sesgo hacia la pro­ ducción de IgE estaría relacionado con diferen­ cias en el procesamiento y presentación antigé­ nicos que determinaría la expansión clonal de células Th2, con la consiguiente producción de citoquinas inductoras del “switch” IgM/IgE. Los ejemplos precedentes ilustran la comple­ jidad de mecanismos inmupatogénicos desen­ cadenados en las parasitosis (cuadro 26-3). La importancia de su conocimiento, a nivel celular y molecular, reside en la posibilidad, a partir de ello, de interferir en el desencadenamiento de la patología sobre la base de terapias racional­ mente fundadas. INMUNODIAGNÓSTICO En parasitología, la detección de anticuerpos específicos es tradicional y se utiliza con fines diagnósticos mientras que la respuesta mediada por células, si bien se ha encontrado positiva pa­ ra muchas de las infecciones parasitarias, sólo ha sido empleada para diagnóstico de unas po­ cas (por ej., toxoplasmosis y leishmaniasis). La incorporación de antígenos definidos, de mayor especificidad, es útil en el diagnóstico diferen­ cial de especies y/o géneros relacionados, como

Inmunología de tas infecciones parasitarias

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Cuadro 26-3. Mecanismos patogénicos dependientes de la respuesta Inmune en algunas infec­ ciones parasitarias P atología

M ecanism o

Parásito S. m ansoni Plasm odium s p p P. fa lcip a rum

H ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a a S E A L is is d e e ritro c ito s p a ra s ita d o s y n o p a ra sita rio s P ro d u c c ió n a u m e n ta d a d e T N F y N O

P. m alariae D e p o s ic ió n d e co tB p lejo s in m u n e s A sca ris lum hricoides y H ip e rs e n s ib ilid a d tip o I a a n tíg e n o s d e excrecióno tro s n e m a to d o s

s e c re c ió n

es el caso de T.cruzi y Leishmania spp. En algu­ nos casos también se realiza la búsqueda de an­ tígenos en sangre, orina, materia fecal y material de biopsias, por técnicas inm unoenzim áticas, utilizando anticuerpos monoclonales o policlo­ nales. Todos estos métodos tienden a lograr una mayor especificidad y sensibilidad diagnóstica y pueden ser sumamente útiles especialmente en los pacientes inm unocom prom etidos. Con el mismo propósito, recientemente se han incorpo­ rado técnicas diferentes del inmunodiagnóstico, como la detección de ADN por sondas específi­ cas (PCR e hibridación). Para el inm unodiagnóstico de rutina deben seleccionarse una o más pruebas según su obje­ tivo. Este puede ser esclarecimiento del diag­ nóstico individual, prevalencia de la enferme­ dad en una población dada, discriminación en­ tre dadores de sangre reactivos y no reactivos, etc. En el cuadro 26-4 se resumen las pruebas más utilizadas en el diagnóstico de diversas p a­ rasitosis.

G ra n u lo m a s h e p á tic o s e in te s tin a le s A n e m ia M a la ria c e re b ra l, h e m a tu ria se v e ra (“b la c ltw a te r f e v e r ”) G lo m e ru lo n e fritis , s ín d ro m e n e fró tic o “R iis h ” e rite m a to s o , s ín d ro m e de L o e f fle r, e n te ritis a lé rg ic a

VACUNAS La manera ideal de realizar profilaxis en en­ fermedades infecciosas es contar con una vacu­ na segura, que estimule la respuesta de m odo persistente, brindando protección duradera a un alto porcentaje de la población que la recibe. En la infección natural por virus, en general se adquiere esta inmunidad duradera, que brinda resistencia a reinfecciones. En el caso de los parásitos, salvo excepciones, la resistencia a in­ fecciones se relaciona con el fenómeno de in­ munidad concom itante y se sospecha fu e rte ­ mente que desaparecida la persistencia del estí­ mulo antigénico los mecanismos efectores de defensa disminuirían hasta hacerse inefectivos. Este fenómeno llega a su máxima expresión en los casos de paludismo, donde la resistencia se adquiere después de años de infecciones recu­ rrentes y se extingue rápidamente a menos que la persona esté expuesta a reinfecciones fre­ cuentes.

C uadro 26-4. Métodos de inmunodiagnóstico utilizados en parasitología In m unidad hum oral Parasitosis

D etección de antígeno

Serología

ID R

Inm unidad c e lu la r IDR

No

No

No No No No ■N o

No Sí No No N o*



No No No No No No

Protozoarios A m e b ia s is

C I E (su e ro ), E L IS A ( m a te ria fec a l) P a lu d is m o E L IS A L e ish m a n ia s is IF I, P A P T r ip a n o s o m ia s is a m e ric a n a IP , P A P T r ip a n o s o m ia s is a fric a n a E L IS A ( a g u d o s o r e a c ti­ T o x o p la sm o s is v a c io n e s )

F C , FIA I, lE F , IP , E L IS A E C , H A I, IF I, E L I S A . R IA F C , IF I, H A I, A D , E L IS A F C , H A I, IF I, A D , E L IS A F C , IF I, IP , H A I, A D , E L IS A E L IS A , D T , IF I, H A I, IS A G A (Ig M )

H elm intos T riq u in o s is T o x o c a ria s is A s c a rid ia s is E squi.stosom iasi,s H id a tid o s is C is tic e rc o s is

E L IS A , I F I

H A I, IF I, IP , T F , T E E L IS A , H A I E L IS A , H A I F C , IF I, IP , T F , E L IS A F C , H A I, lE F , IP , T F , T L C IE , H A I, E L I S A

No No

A D : a g lu tin ac ió n d irec ta, C IE : c o n tra in m u n o e lectro fo resis, D T : d y t-test (S ab i-F cld m an ), FC; fijación d e co m p lem e n to , H A I: h e m o a g lu tin a ­ ción in d irec ta , ID R : in trad e rm o rre acc ió n , lE F : in m u n o elec tro fo re sis, IP: in m u n o p rec ip itac ió n , IS A G A : te s t de in m u n o ag lu tin a ció n e n fase só lid a , P A P : p ero x id a sa-a n ti-p ero x id a sa , R ÍA : ra d io in m u n o an á lisis, T L : test d e látex . * S ólo e x c ep c io n a lm e n te en alg u n o s países.

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Inmunopatología

En el desarrollo de una vacuna también debe considerarse la seguridad de la misma. Esto implica que no pueda revertir en su virulencia (riesgo de las vacunas de microorganismos ate­ nuados ) y que no contenga moléculas nocivas para quien será vacunado. Si consideramos que en numerosas enfermedades parasitarias el da­ ño es de carácter inmunológico, deberá descar­ tarse el riesgo de producir daño con los antíge­ nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a estas dificultades le agregamos ios mecanismos de escape de la respuesta inmune que pueden poner en marcha los parásitos y los cambios antigénicos que los mismos sufren durante sus sucesivos estadios evolutivos, entendemos por qué aún no se han desarrollado vacunas efecti­ vas contra parásitos de interés humano. Sin embargo, el conocimiento molecular de los parásitos está abriendo uno de los caminos posibles para el desarrollo de inm unógenos efectivos. Este conocimiento está permitiendo determinar qué moléculas están implicadas en la selección del huésped y, dentro de él, la se­ lección del tejido o célula en que el parásito se instalará, las señales que se inician desde la membrana del parásito y que son indispensa­ bles para que se gatille su diferenciación a un nuevo estadio (sin esta diferenciación se inte­ rrumpe el ciclo), las moléculas distractoras de la respuesta inmune que se constituyen en antí­ genos mayores y que protegerían a otros de menor antigenicidad pero cuya funcionalidad es indispensable para la sobrevida del parásito. Como los parásitos tienen un ciclo complejo y como en cada parte del ciclo pueden variar las moléculas im plicadas en cada uno de los procesos antes mencionados, es muy probable que para alcanzar una vacuna efectiva deba considerarse el uso com binado de antígenos destinados a interrumpir el ciclo en úna suma­ toria de blancos. Un ejemplo podría ser una va­ cuna anti-palúdica que interfiera tanto con la CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando así su invasión, como en el establecimiento del parásito en el eritrocito, disminuyendo la carga parasitaria y la incidencia de formas clínicas. La eficiencia parcial, por separado, se ha pro­ bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue­ de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda­ vía falten estudios para que la misma se apli­ que sistemáticamente a la población en riesgo, y aunque, por el momento, no se haya pensado

en el uso de ambas moléculas para lograr una vacuna combinada. Actualmente, se está trabajando en diversos laboratorios del mundo con el objeto de identi­ ficar moléculas con capacidad de inducir pro­ tección contra diferentes parásitos tales como Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y T.spiralis, entre otros.

BIBLIOGRAFÍA A s h C , G a tla g h e r R B (E d s ): I m n u n o p a r a s ito lo g y to d a y . (N ú m e ro c o m b in a d o d e Im m unology Today. -V o l. 12, N o. 3 (1 2 9 ) y P a rm ito lo g y Today -V o l.7, N o .3 (6 9 ), M a rz o , 1991. C a m p e te lla O E , U tta ro A D , P aro d i A J, F ra sc h A C C . A re ­ c o m b in a n t Trypanosom a cruzi tra n s -s ia lid a se lac k in g the a m in o ac id re p e a ts re ta in s th e e n z y m a tic ac tiv ity . M o lecu ­ lar and Biochem icai Parasitology, 170: 1 5 7 0 -1 5 7 4 , 1994. C e le n ta n o A M , G o n z á le z C a p p a SM : In d u c tio n o f m a c ro p h a g e a c tiv a tio n a n d o p s o n iz in g a n tib o d ie s by Trypanoso­ m a cruzi. P ar asite im m unology, 1 4 :1 5 5 -1 6 7 , 1992. D a v id JR , H a rn D A : I m m u n o lo g y an d m o le c u la r b io lo g y o f tro p ic a l in fe c tio n s d is e a s e s . P a ra sito lo g y T oday, 9: 3 4 9 -3 5 0 , 1993. L e e T D G , H e lm in th o to x ic re s p o n s e s o f in te s tin a l e o s in o p h ils to T rich in e lla s p ira lis n e w b o r n la rv a e . In fe ctio n a n d lm m u n ity , 59: 4 4 0 5 -4 4 1 1 , 1991. M c R e y n o ld s L A , K k e n n e d y M W , S e ik irk M E : T h e p o ly p r o te in a lle rg e n s o f n e m a to d e s . P a ra sito lo g y Today, 9: 4 0 3 -4 0 6 , 1993. M u rra y FIW , H a rip ra s h a d J: In te rlu k in 12 is e ffe c tiv e tratin e n t f o r a n e s ta b lis h e s s y s te m ic in tr a c e llu la r in fe c tio n : E x p e r im e n ta l v isc e ra l le is h m a n ia s is , Jo u rn a l o f E x p eri­ m ental M edicine, 181: 3 8 7 -3 9 1 , 1995. N u s s e n z w e ig R S , L o n g C A : M a la r ia v a c c in e s : m ú ltip le ta rg e ts . S c ie n c e , 2 6 5 : 1 3 8 L I 3 8 3 , 1994. O.P.S. (E d s .) L a e n fe rm e d a d d e C h a g a s y el s is te m a n e rv io s o . P u b lic a c ió n c ie n tífic a N o .5 4 7 , W a s h in g to n D .C ., U S A , 1994. P e rk in s M E , R h o p try o rg a n e lle s o f a p ic o m p le x a n p a ra s ite s . P arasitology Today, 8: 2 8 -3 2 , 1992. S h e r A , C o ffm a n RÍ^: R e g u la tio n o f im m u n ity to p a ra s ite s b y T c e lls an d T c e ll-d e riv e d c y to k in e s . A n n u a l Review o f Im m unology, 10: 3 8 5 -4 0 9 , 1992. S ta d e c k e r M J , C o lle y D G : T h e i m m u n o b io l o g y o f th e S c h isto s o m e e g g s g ra n u lo m a . 8: 2 1 8 -2 2 0 , 1992. S ta d e c k e r M J: T h e r o le o f T -c e ll a n e rg y in th e im m u n o m o d u la tio n o f s c h is to so m ia s is. 8: 1 9 9 -2 0 4 , 1992. T a n n e r M , T e u s c h e r T , A lo n s o P L : S P f6 6 - T h e firs t m a la ­ ria v a c c i n e . 11: 10 -1 3 , 1995. T s e S K , C h a d e e K : T h e in te ra c tio n b e tw e e n intestiniAl m u c u s g ly c o p r o te in s a n d e n te r ic I n fe c tio n s . P a ra sito lo g y T o d a y , 7: 1 6 3 -1 7 2 , 1991. W a k e lin D M a n d B la c k w e ll JM (E d s): G enetics o f R e sis­ ta n c e,lo bacterial a n d p a ra sitic infections. T a y lo r a n d F ra n c is 1988, L o n d re s. W y le r D J. W h y d o e s liv e r fib ro s is o c c u r in S c h isto s o in ia sis? Parasitology Today, 8: 2 7 7 -2 7 9 , 1992. Z w illin g B S , E is e n s te in T K . (E d s.): M a c ro p a g e -P a th o g e n in te a c tio n s . Im m unology series, v o l. 6 0 , M a rc e l D e k k e r, In c. N e w Y o rk , 1993.

Inmunología en las infecciones virales

RAMÓN A. DE TORRES JUAN ANGEL BASUALDO MARTA C. MINVIELLE

1. Introducción Las características biológicas de los agentes virales, su difícil visualización por microscopía electrónica y el necesario desarrollo de m ode­ los vacunales aplicados al control de las infec­ ciones humanas y anim ales, han generado la necesidad de un estudio profundo de la re s­ puesta inmune en el campo de la virología. Aiin hoy la caracterización de una población viral se basa fundamentalmente en la capacidad de estos viríones de infectar células suscepti­ bles y su reconocimiento posterior está relacio­ nado siempre, en forma directa o indirecta, con cualquiera de las muchas técnicas que se basan en principios inmunológicos. A través de la historia, las vacunas han sido las formas más efectivas e importantes de con­ trolar las infecciones virales. El gran desarrollo científico en los campos de la virología y de la inmunología ha perm iti­ do comprender los mecanismos de protección por los cuales algunas vacunas desarrolladas casi empíricamente hace muchos años, han ser­ vido en el control de las enfermedades virales de alta incidencia en seres humanos y anim a­ les. Este avance, sin embargo, es aún insufi­ ciente para explicar muchos fenómenos de ia relación virus-huésped en infecciones agudas, crónicas, degenerativas y oncogénicas, lo que mantiene la necesidad de una profunda y conti­ nua investigación de estos problemas. El estudio de la respuesta inmune en la in­ fección viral de un individuo incluye fu n d a­ mentalmente los siguientes aspectos; a) establecer la cinética de síntesis de antí­ genos virales y su localización en las células en

las que se inicia la infección y los blancos en tejidos secundarios, cuando los hay; b) establecer cualitativa y cuantitativamente las características de la respuesta inmune h u ­ moral, informando sobre la cinética de síntesis de inmunoglobulinas. Este estudio se completa correlacionando su aparición con mecanismos específicos de reacción con los antígenos vira­ les, como formación de complejos inmunes, in­ ducción de citotoxicidad mediada por com ple­ mento, fenómenos de bloqueo, etc.; c) detectar y cuantificar las modificaciones que se producen en las células inmunocompe­ tentes, en función de la agresión viral, con es­ pecial referencia a la capacidad de células lin­ foides tipo T de reconocer e interaccionar con células infectadas (inmunidad mediada por cé­ lulas); d) estudiar la respuesta general inespecífica, analizando la participación del interferón en el curso de la infección u otros mediadores (linfo­ quinas) asociados al fenómeno de respuesta in­ flamatoria. En este nivel inespecífico la im por­ tancia de células con capacidad citotóxica natu­ ral (NK, natural killer) y células con funciones endocíticas es cada vez más evidente en el con­ trol del inicio de la infección viral. Cuando esta información se correlaciona es­ tadísticam ente con la evolución clínica y los estudios citoanatomopaíológicos, recién enton­ ces se puede construir un cuadro descriptivo completo de la enfermedad, que es la base ne­ cesaria para establecer la correcta aplicación e interpretación de técnicas de laboratorio en función diagnóstica. De una manera fundam en­ tal, la integración de un sólido estudio inmunológico perm itirá com prender los mecanism os

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Inmunopatología

En el desarrollo de una vacuna también debe considerarse la seguridad de la misma. Esto implica que no pueda revertir en su virulencia (riesgo de las vacunas de microorganismos ate­ nuados ) y que no contenga moléculas nocivas para quien será vacunado. Si consideramos que en numerosas enfermedades parasitarias el da­ ño es de carácter inmunológico, deberá descar­ tarse el riesgo de producir daño con los antíge­ nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a estas dificultades le agregamos ios mecanismos de escape de la respuesta inmune que pueden poner en marcha los parásitos y los cambios antigénieos que los mismos sufren durante sus sucesivos estadios evolutivos, entendemos por qué aún no se han desarrollado vacunas efecti­ vas contra parásitos de interés humano. Sin embargo, el conocimiento molecular de los parásitos está abriendo uno de los caminos posibles para el desarrollo de inm unógenos efectivos. Este conocimiento está permitiendo determinar qué moléculas están implicadas en la selección del huésped y, dentro de él, la se­ lección del tejido o célula en que el parásito se instalará, las señales que se inician desde la membrana del parásito y que son indispensa­ bles para que se gatille su diferenciación a un nuevo estadio (sin esta diferenciación se inte­ rrumpe el ciclo), las moléculas distractoras de la respuesta inmune que se constituyen en antí­ genos mayores y que protegerían a otros de menor antigenicidad pero cuya funcionalidad es indispensable para la sobrevida del parásito. Como los parásitos tienen un ciclo complejo y como en cada parte del ciclo pueden variar las moléculas im plicadas en cada uno de los procesos antes mencionados, es muy probable que para alcanzar una vacuna efectiva deba considerarse el uso com binado de antígenos destinados a interrumpir el ciclo en úna suma­ toria de blancos. Un ejemplo podría ser una va­ cuna anti-palúdica que interfiera tanto con la CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando así su invasión, como en el establecimiento del parásito en el eritrocito, disminuyendo la carga parasitaria y la incidencia de formas clínicas. La eficiencia parcial, por separado, se ha pro­ bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue­ de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda­ vía falten estudios para que la misma se apli­ que sistemáticamente a la población en riesgo, y aunque, por el momento, no se haya pensado

en el uso de ambas moléculas para lograr una vacuna combinada. Actualmente, se está trabajando en diversos laboratorios del mundo con el objeto de identi­ ficar moléculas con capacidad de inducir pro­ tección contra diferentes parásitos tales como Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y T.spiralis, entre otros.

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T o d a y ,!: 1 6 3 - m , m i . W a k e lin D M a n d B la c k w e ll JM (E d s): G enetics o f R esista n c e.to bacterial a n d p a ra sitic infections. T a y lo r a n d F ra n c is 1988, L o n d re s. V /y le r D J. W h y d o e s liv e r fib ro s is o c c u r in S c h isto s o in ia sis? Parasitology Today, 8: 2 7 7 -2 7 9 , 1992. Z w illin g B S , E is e n s te in T K . (E d s.): M a c ro p a g e -P a th o g e n in te a c tio n s . Im m unology series, v o l. 6 0 , M a rc e l D e k k e r, In c. N e w Y o rk , 1993.

Inmunología en las infecciones virales

RAMÓN A. DE TORRES JUAN ANGEL BASUALDO MARTA C. MINVIELLE

1. Introducción Las características bioíógicas de los agentes’ virales, su difícil visualización por microscopía electrónica y el necesario desarrollo de m ode­ los vacunales aplicados al control de las infec­ ciones humanas y anim ales, han generado la necesidad de un estudio profundo de la re s­ puesta inmune en el campo de la virología. Aiin hoy la caracterización de una población viral se basa fundamentalmente en la capacidad de estos viríones de infectar células suscepti­ bles y su reconocimiento posterior está relacio­ nado siempre, en forma directa o indirecta, con cualquiera de las muchas técnicas que se basan en principios inmunológicos. A través de la historia, las vacunas han sido las formas más efectivas e importantes de con­ trolar las infecciones virales. El gran desarrollo científico en los campos de la virología y de la inmunología ha perm iti­ do comprender los mecanismos de protección por los cuales algunas vacunas desarrolladas casi empíricamente hace muchos años, han ser­ vido en el control de las enfermedades virales de alta incidencia en seres humanos y anim a­ les. Este avance, sin embargo, es aún insufi­ ciente para explicar muchos fenómenos de la relación virus-huésped en infecciones agudas, crónicas, degenerativas y oncogénicas, lo que mantiene la necesidad de una profunda y conti­ nua investigación de estos problemas. El estudio de la respuesta inmune en la in­ fección viral de un individuo incluye fu n d a­ mentalmente los siguientes aspectos; a) establecer la cinética de síntesis de antí­ genos virales y su localización en las células en

las que se inicia la infección y los blancos en tejidos secundarios, cuando los hay; b) establecer cualitativa y cuantitativamente las características de la respuesta inmune h u ­ moral, informando sobre la cinética de síntesis de inmunoglobulinas. Este estudio se completa correlacionando su aparición con mecanismos específicos de reacción con los antígenos vira­ les, como formación de complejos inmunes, in­ ducción de citotoxicidad mediada por com ple­ mento, fenómenos de bloqueo, etc.; c) detectar y cuantificar las modificaciones que se producen en las células inmunocompe­ tentes, en función de la agresión viral, con es­ pecial referencia a la capacidad de células lin­ foides tipo T de reconocer e interaccionar con células infectadas (inmunidad mediada por cé­ lulas); d) estudiar la respuesta general inespecífica, analizando la participación del interferón en el curso de la infección u otros mediadores (linfo­ quinas) asociados al fenómeno de respuesta in­ flamatoria. En este nivel inespecífico la im por­ tancia de células con capacidad citotóxica natu­ ral (NK, natural killer) y células con funciones endocíticas es cada vez más evidente en el con­ trol del inicio de la infección viral. Cuando esta información se correlaciona es­ tadísticam ente con la evolución clínica y los estudios citoanatomopaíológicos, recién enton­ ces se puede construir un cuadro descriptivo completo de la enfermedad, que es la base ne­ cesaria para establecer la correcta aplicación e interpretación de técnicas de laboratorio en función diagnóstica. De una manera fundam en­ tal, la integración de un sólido estudio inmunológico perm itirá com prender los mecanism os

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Inmunopatología

íntimos de patogenia de la infección, con lo cual se podrán desarrollar racionalmente mode­ los de inmunización preventiva o ensayar trata­ mientos con drogas, ya sean antivirales directos o moduladores de la respuesta inmune. En forma general, puede decirse que los sig­ nos y los síntomas de las enfermedades virales son la culminación de una serie de interaccio­ nes entre los virus y el huésped. Entre muchos otros aspectos quizá ahora sea necesario llamar la atención sobre la gran diferencia que existe en la infección por virus que, una vez que ata­ can a un individuo, son eliminados (polio, sa­ rampión, paperas) y las que producen virus que persisten en el infectado (herpes, HBV, HIV y otros). De manera simple, podemos mencionar que diversos factores participarán en la defensa del huésped. 1) Defensas constitutivas • La edad del huésped. Los neonatos, por ejemplo, son particularmente susceptibles a las infecciones diseminadas severas por el virus herpes simple (HSV). En contras­ te, muchas de las enfermedades exantematosas, la infección por poliovirus y la infección por el virus de E p stein -B arr (EBV) típicamente son más severas en los individuos más viejos que en los niños. ® Estado nutricional. Si el huésped posee un estado nutricional inadecuado tiene mayor susceptibilidad a diversas infecciones vi­ rales, por ejemplo, en el sarampión existe una mayor morbilidad en niños desnutri­ dos. 2) Defensas inducidas Inmunoglobulinas. La mayor parte de los vi­ rus actúan como buenos antígenos, y generan una respuesta de inmunoglobulinas que, por lo común, no desempeñan un papel primario en la terminación de las infecciones virales agudas aunque son muy importantes para prevenir las reinfecciones. Especialmente, la actividad de anticuerpos neutralizantes que pueden inhibir diversos pasos del ciclo de replicación, como la adherencia, la penetración o el desnudamiento de los virus. Además, estos anticuerpos pueden producir la agregación de los viriones, lo que facilita su fagocitosis. Complemento. Los virus pueden desencade­ nar la activación del complemento por vía al­ terna y por vía clásica, aun en ausencia de la respuesta de anticuerpos. Los componentes del com plem ento activado pueden actuar in cre­ mentando la inflamación y pueden producir la lisis de los virus envueltos o de las células in­ fectadas por virus. No es probable que este sis­ tema desempeñe un papel tan importante en la

defensa contra las infecciones virales como, contra las infecciones bacterianas, pues en los estados de hipocomplementemia no se asocian con un aumento de la frecuencia o de la severi­ dad de las enfermedades virales. Inmunidad mediada por células. Es el prin­ cipal factor en la terminación de las infecciones virales y en la patogenia de estas enfermeda­ des. D ebido a que los virus son intracelulares, son susceptibles a la acción de los linfocitos que reconocen antígenos virales en la superfi­ cie celular. Estas células infectadas pueden ser lisadas por linfocitos por vía de la citotoxicidad independiente y dependiente de anticuerpos. De forma independiente de los anticuerpos, la acción de las células “natural killer” (NK) proporciona una de las defensas más tempranas del huésped contra las infecciones virales (2-3 días) y precede a la aparición de anticuerpos (5-7 días). Estas células son activadas inespeeífieamente por los interferones. La cito to x icid ad an ticu erp o -d ep en d ien te (ADCC) está mediada por anticuerpos específi­ camente unidos a los antígenos virales expresa­ dos en la superficie de las células infectadas. Estas inmunoglobulinas interactúan por su por­ ción Ec con los receptores Fe de las células “ki­ ller” (LK) y esta interacción da como resultado la activación de las células LK y la posterior destrucción de la célula “blanco”. Los macrófa­ gos, los linfocitos y los neutrófilos también po­ seen receptores Fe y colaboran en la ADCC, Se agregan los linfocitos T citotóxicos con capacidad lítica específica para destruir células infectadas por virus. Además, como veremos más adelante, se suma la actividad de los linfo­ citos T de hipersensibilidad (L T jJ, especial­ mente en las infecciones virales persistentes, Interferones. Además de la respuesta hum o­ ral y celular, las infecciones virales provocan un mecanismo de defensa inducible: los inter­ ferones, Estos inhiben la replicación viral de forma indirecta, por inducción de la síntesis de proteínas celulares que reducen o bloquean la multiplicación de los virus. La cantidad de interferón producida varía con los diferentes virus. Todos los interferones actúan en concentraciones muy bajas y, en ge­ neral, son muy activos en las células de la es­ pecie en la cual son inducidos (“específicos de especie”) supuestamente, debido a la variación evolutiva de la naturaleza de los receptores de los interferones. Los interferones son producidos por la des­ represión de genes celulares inducida por la presencia de ácido nucleico viral en el citoplas­ ma de la célula huésped. Esto provoca la pro­ ducción de ARN, para los interferones y la p os­ terior síntesis de éstos.

Inmunología en las infecciones virales Los interferones neoproducidos son libera­ dos hacia el líquido extracelular y allí se unen con los receptores específicos en las células ad­ yacentes. Por esto, los interferones tienden a actuar de forma local más que sistémica. Además de bloquear la replicación viral, los interferones aumentan la actividad de las célu­ las NK, de los linfocitos T citotóxicos y de las célu las in v o lu crad as en las reaccio n es ADCC. Como resumen podemos indicar que el m e­ canismo de defensa inducido más im portante contra las infecciones virales es la inmunidad mediada por células. Los pacientes con buena respuesta m ediada por anticuerpos, pero con defectos en su inmunidad celular generalmente se recuperan mal de las infecciones virales. La inversa, buena respuesta celular y anormal res­ puesta humoral, no trae graves consecuencias para el paciente en las enfermedades virales. En el último cuarto de siglo se ha ampliado el concepto de la respuesta inmune en las en­ fermedades virales, individualizando un com ­ plejo repertorio de problem as que deben ser analizados individualmente. Respuestas como las asociadas a polio o viruela, contrastan con las inducidas por rubéola congénita, coriomeningitis, hepatitis B, infección por agentes del grupo herpes o aquellas inducidas por retrovi­ rus humanos. Es necesario entonces revisar conceptos es­ tructurales de algunos virus para comprender su grado de diversidad y, sobre todo, analizar los problemas que se generan cuando algunos agentes infectan a un individuo y su acción no culmina con la destrucción de las células infec­ tadas, sino que se establece un tipo de equili­ brio con subsistencia de la célula huésped y del material genético viral. En estos casos, la per­ sistencia viral se traduce en un número grande de variables que inducen respuestas inm unes altamente complejas. En este capítulo trataremos de dar un pano­ rama general del problema asociado a las res­ puestas inmunes en infecciones virales y m os­ trar sólo algunos ejemplos de relaciones virushuésped en humanos, que derivan de la persis­ tencia de la infección viral. Se procurará poner en evidencia cómo tm mismo agente infeccioso puede condicionar en el mismo huésped enfer­ medades (patologías) muy diferentes, lo cual depende de la relación que se establezca entre el virus y la respuesta inmune. Con la excusa form al de que no son virus verdaderos, pero honestamente por la poca cla­ ridad que existe sobre el problema, aun para quienes trabajan directamente en el tema, no se hace referencia ampliada sobre la respuesta in­ mune en las infecciones por agentes “virales” no convencionales (priones, viroides).

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2. Complejidad estructural de los agentes virales El nivel de conocimiento actual permite re­ conocer que, en el conjunto de los virus, están incluidos agentes infecciosos que difieren n eta­ mente entre sí, no sólo en lo estructural sino también en el ejercicio de sus funciones. C ons­ tituye un objetivo de este trabajo hacer resaltar las diferencias estructurales de algunos m ode­ los, para reforzar el concepto de heterogenei­ dad en virología. Se intenta de esta forma supe­ rar poco a poco la interpretación inexacta con que a veces se engloba a los virus en un grupo taxonómico poco diferenciado. En las figuras 27-1 a 27-5, se presentan dia­ gramas de los modelos estructurales de los vi­ rus de poliomielitis, rubéola, herpes simple h e­ patitis B (HBV) y HIV (Virus de la Inmunodeficieneia Humana). Es de importancia resaltar las diferencias de tamaño de las partículas y las diferencias cuali­ tativas (ARN o ADN) y cuantitativas (funda­ mentalm ente el peso molecular) de los genomas respectivos. El HBV tiene como genom a ADN de doble cadena circular de peso m olecu­ lar 1, 6 X 10® daltons. El herpes, cuyo genoma es ADN, es lineal y tiene un peso molecular de 100 X 10® daltons. El genoma de poho y de ru­ béola es ARN, pero de 2 x 10® daltons el p ri­ mero y de 3,6 x 10® el de rubéola. Esto indica que la capacidad genética de in­ formación de estos agentes varía desde la posi­ bilidad de codificación de unas pocas proteínas estructurales y no estructurales, como es el ca­ so de poliovirus, a la de promover la síntesis de más de 30 polipéptidos distintos como en el ca­ so de herpes virus. La rubéola puede plantearse como un caso cuantitativamente similar a la polio, pero cua­ litativam ente más com plejo (proteínas co m ­ plejas), y la información de que se dispone so­ bre hepatitis indica una capacidad m ayor que la de la rubéola en cuanto a diversidad de po­ lipéptidos. Al final del capítulo se indica la capacidad génica del retrovirus HIV, agente etiológico del Síndrom e de In m unodeficiencia A dquirida. Nótese en este agente la presencia de una enzi­ ma que sintetiza ADN a partir de ARN y que le permite una estrategia infectiva muy compleja. Para el caso del virus de la Hepatitis B, se ha logrado una aproximación muy importante. En la actualidad se conoce en form a muy precisa la secuencia del ADN viral, sus genes y los productos de expresión de éstos. Se identi­ fican perfectamente los polipéptidos de los an­ tígenos de superficie y sus secuencias lim itan­ tes, al igual que aquellos pertenecientes a la in­ formación para core.

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Inmunopatología Fig. 27-1. D ia g ra m a d e p o lio v iru s c o n sii f o r m a ic o s a é d ric a d e s n u d a . L a s p r o te ín a s p rin c ip a le s n o p o s e e n re s id u o s g lu c o s ila d o s .

P r o te ín a s e s tru c tu ra le s p rin c ip a le s

G enom a

A R N m o n o c a te n a ria 2 X 10'’ d a lto n s

P roteína

N" de unidades p o r virión

Peso m olecular en daltons

VP,

34

3 5 .0 0 0

VPj

53

2 8 .0 0 0

VP,

68

2 4 .0 0 0

VP.,

41

8 .0 0 0

Tomando simplemente un concepto estructu­ ral, en función del total de proteínas que están asociadas a los viriones completos de los agen­ tes mencionados, podemos asegurar que la in­ yección de virus inactivado en un huésped inmunocompetente inducirá una respuesta distin­

ta en cada caso. Distinta en función del tamaño del antígeno particulado inicial y de la calidad antigénica; 4 a 5 polipéptidos en el caso de po­ liovirus, 4 a 5 en el de rubéola virus, 8 a 9 en el de hepatitis y 33 en el caso de herpes virus. En este último, así como en rubéola y hepatitis, se

Nucleoproteína interna ARN monocatenario 3,6 x 10®daltons Firmemente unido a VP, (proteína interna) de 35.000 daltons Envoltura Sensible a detergentes y solventes de lípidos Contiene glucoproteínas VP, (62.000 daltons) VP^ (47.500 daltons) Un complejo de la envoltura de la capacidad hemoaglutinante

Proteínas principales Genoma

a.I;»-

VP, 35.000 daltons 3 VP, 62.000 daltons

ARN monocatenario 3,6 X 10® daltons

Ovo, 47.500 daltons

Fig. 27-2. D ia g ra m a d e v irió n c o n -e s p o n d ie n te a ru b é o la en el q u e c ie rta s p ro te ín a s d e la e n v o ltu ra s o n g lu c o p ro te ín a s . L a e s tru c tu ra d e la e n v o ltu ra e s s e n s ib le al tra ta m ie n to c o n d e te rg e n te s y s o lv e n te s d e líp id o s.

Inmunología en las infecciones virales

535

Envoltura Tegumento Nucleocápside

Capsómero

F ig . 2 7 -3 . D ia g ra m a d e l v irió n d e h e rp e s q u e m u e s tra su g ran c o m p le jid a d . E l A D N tie n e u n p e s o m o le c u la r d e 1 0 0 x 10^’, uno d e lo s m a y o re s g e n o m a s v ira le s , a p ro x im a d a m e n te 3 0 p ro te ín a s e s tru c tu ra le s . U n p é p tid o in te rn o f irm e m e n te a s o c ia ­ d o a A D N r ic o e n a rg in in a . G lu c o p ro te ín a s a so c ia d a s a u n a e n v o ltu ra . U n p é p tid o c a p s o m é ric o , re p e tid o 3 v eces p o r c a d a c a p só m e ro . L a e n v o ltu ra es se n sib le a d e te rg e n te s y s o lv e n te s lip id íe o s , Jo q u e re d u c e en fo rm a im p o rta n te la in fe c tiv id a d .

alcanza un alto grado de complejidad cualitati­ va, especialmente en algunas glucoproteínas y lipoproteinas que no han sido detectadas en po­ liovirus. Hay proteínas antigénicas asociadas al virión (estructurales) y otras que se sintetizan sólo cuando el virus se multiplica (no estructurales); esto marca la diferencia entre vacunas de virus “muertos” (antígenos estructurales) y vacunas de virus “vivos” en las que el individuo respon­ de a la constelación total (estructurales y no es­ tructurales). Así la inoculación de un virión de herpes sim ple inactivado, inoculado prom ueve una respuesta a 30-33 polipéptidos mientras que, cuando replica en células humanas, el indivi­ duo se ve expuesto a un nitmero mayor de antí­ genos (alrededor de 59). 3. Breve consideración sobre los distintos tipos de infección viral y su relación con la patogenia Hemos planteado antes ejemplos de diversi­ dad estructural. Es fácil comprender que estos agentes también tengan diferentes mecanismos de replicación, lo cual nos indica que, cuando infectan a un huésped susceptible inmunocompetente, la respuesta inmune tendrá una com ­

plejidad de mecanismos y una cinética también distintas. Existen agentes virales, como el poliovirus, que cu an d o in fe c ta una c é lu la su sc e p tib le cumple con un ciclo de replicación que culm i­ na con la lisis celular. Este tipo de infección se llama genéricamente infección lítica. L a pato­ genia y la respuesta inmune que genera están en función de este mecanismo que define esta clá sic a evolu ció n den o m in ada en ferm ed ad aguda. El virus de rubéola puede inducir una infec­ ción de tipo lítico, pero con facilidad puede re­ plicarse en células que no evolucionan en for­ ma inmediata a la lisis y que pueden continuar produciendo virus por largos períodos. Obvia­ m ente, en este tíltimo caso la patogenia y la respuesta inmune son mucho más com plejas que en el caso de polio. En la rubéola del adul­ to los mecanismos generales de respuesta pue­ den ser explicados por un tipo de infección de resolución aguda, parecido al que genera polio en la enfermedad paralítica. En cambio, en la rubéola congénita, se observa la persistencia de producción de virus por ciertas células del feto y el recién nacido, durante largos períodos, y una respuesta inmune muy particular en la que se ha llegado a manejar la expresión de “tole­ rancia pasajera”.

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Inmunopatología

P artícula de Dañe

20 nm

F ig . 2 7 -4 . D ia g ra m a d e la e s tru c tu ra d e l a g e n te d e la h e p a titis B . L a e n v o ltu ra H B s A g ( a n tíg e n o d e s u p e rfic ie ) e s e n r e a li­ d a d u n a m e z c la d e e s p e c ific id a d e s a n tig é n ic a s d e v a rio s p o lip é p tid o s .

Para ampliar el concepto de distintos tipos de infección viral y su compleja relación con la respuesta inmune y la patogenia, hemos toma­ do las infecciones humanas con el virus herpes simple (HSV) y con el HBV en las que existe una gama de variables en los síndromes que in­ ducen (agudos y crónicos). Se incluye además una brevísim a referencia a la infección con HIV (SIDA) para incorporar un modelo en que la evolución de la enfermedad depende de la relación directa del virus con células del siste­ ma inmune. Es relativam ente fácil asociar la diversidad de la respuesta inmune en función de virus estructuralmente distintos. Se debe tener en cuenta que en el caso de herpes, rubéola, hepatitis y HIV, los diferentes tipos de infección viral que condicionan varia­ das patogenias y, obviamente, distintas cinéti­ cas de respuestas inm une, no son originados por distintas especies virales, sino por diversas relaciones virus-célula, originadas por un mis­ mo tipo de virus, incluso en un mismo hués­ ped. Es bien conocido que el virus herpes sim­ ple (tipo 1 y tipo 2 ), produce enfermedades pri­ maria y recurrente, las que tienen relación con el tipo de infección lítica y el fenómeno de la­ tencia, respectivamente. Esto nos permite reco­ nocer que habrá una infección en la cual el m e­ canismo de replicación inducirá la muerte celu­ lar o alteraciones profundas como formación de sincitios, cariorrexis, inclusiones, etc., y, asociada, una respuesta inflamatoria e inmune localizada que genera las típicas lesiones de la enfermedad herpética aguda.

Habrá, además, otro tipo de infección que no termina con las funciones celulares, pero en el que la producción de viriones está regulada por distintos mecanismos, y este proceso que­ da interrumpido por períodos variables. Efec­ tores físicos o químicos, variaciones en el esta­ do inmune del huésped, reestablecen la síntesis viral y se produce la recurrencia. Esto ocurre en presencia de anticuerpos circulantes neutra­ lizantes y la paradoja se explica en función de que el virus puede invadir nuevas células sus­ ceptibles, pasando de célula a célula, sin salir a los espacios intercelulares. El virus se aloja en neuronas de ganglios del trigémino o sacros y desde éstas alcanza los sitios periféricos, via­ jando por los espacios intraaxonales. Factores emocionales, irradiación, fiebre, etc., producen las típicas recurrencias herpéticas. Los meca­ nismos de latencia, las características de las células donde el virus se acantona, el proceso de reactivación, son motivo de estudio. En los casos anteriores, infección prim aria y recurrencia, el individuo produce anticuer­ pos contra el total de las proteínas inducidas por herpes, las estructurales y las no estructu­ rales. Sobre este problema de la infección herpéti­ ca se brinda más información al final del capí­ tulo. La hepatitis B puede evolucionar bajo for­ mas clínicas anictéricas inaparentes, agudas, crónicas o fulminantes, con lo cual puede su­ ponerse que distintos tipos de infección o res­ puestas las están condicionando. Lamentable­

Inmunología en las infecciones virales

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F ig . 2 7 -5 . V ir u s de l S ID A . E l g e n o ­ m a es A R N , p e ro Ja e n z im a tra n s c rip ­ ta s a in v e rs a s in te tiz a A D N v ira l a p a r ­ tir d e a q u é l, y e s te A D N p u e d e in te ­ g ra rs e al genom a ceJular. D e e s ta f o r ­ m a p u e d e n e s ta b le c e r s e s is te m a s p r o ­ d u c tiv o s (líric o s o n o ) d e v iru s o la in ­ te g ra c ió n determ ina el e s ta d o d e p r o ­ v irus.

m ente, el tínico m odelo v iab le fu era de la in f e c c ió n h u m a n a es el c h im p a n c é , en consecuencia muchos estudios resultan ¡imita­ dos. Es un hecho demostrado que un número de enfermos evoluciona de forma que el antígeno asociado a la hepatitis B persiste en el indivi­ duo por tiempos variados, llegando a años, lo que plantea obviamente una respuesta inmune de alta complejidad. Este modelo será analiza­ do más adelante. En los últimos años se han reconocido infec­ ciones virales cuya característica principal es que las células en las cuales el virus se replica son células del sistema celular inmunocompetente. Es de interés reconocer que dentro de este ti­ po de infección, en una generalización muy elemental, tenemos dos tipos de respuesta dife­ rentes: 1. Virus -f célula; generalmente resulta en proliferación celular limitada o que puede re­ sultar en cierto tipo de anomalías permanentes (caso de citomegalovirus CMV y linfocitos). 2. Virus + célula: destrucción celular (caso de virus HIV, célula T4+ [helper]). En todos estos casos, mediado por m ecanis­ mos bioquímicos diferentes para los virus EBV y CMV con respecto al HIV, la infección se perpetúa en el individuo que queda sujeto a va­ riaciones dei equilibrio que pueden dar diferen­

te s c o n

s ig n o s

y

s ín to m a s ,

e n

f o rm a

p e rm a n e n te

o

re c u iT e n c ia s in te r m ite n te s .

La persistencia vira! parece ser un factor que asocia las funciones genéticas virales con la evolución degenerativa o proliferativa de teji­ dos infectados. La asociación de la infección viral con dis­ plasias severas, carcinoma in situ de cuello de útero y sus variantes invasoras, carcinoma pri­ mario de hígado, leucemias y linfom as, etc., parece reconocer una relación necesaria pero no suficiente. En todos los casos, complejas in­ terrelaciones con el sistema inmune son las que definen la evolución. El objetivo fundamental de introducir la va­ riante “distintos tipos de infección viral” es dejar claros dos aspectos muy generales pero altamen­ te prácticos: a) diferentes tipos de virus inducen distintos mecanismos de infección y obviamente patogenia y respuesta inmune diferentes cuando infectan al hombre u otro huésped. No es posi­ ble hablar de un solo tipo de respuesta inmune en todas las infecciones virales, y b) un mismo tipo de virus en un mismo huésped puede, en función de los mecanismos de relación virus-cé­ lula, inducir distintos tipos de infección que se traducirán en modelos de patogenia diferentes y en respuestas inmunes cuya calidad y cantidad serán función del tipo de infección. Inversamente, puede pensarse que luego de una infección viral primaria la respuesta inmu­ ne será la que condicione el tipo de infección, persistente o no, que se establezca.

Inmunopatología Debemos fijar el concepto de que todos los aspectos relacionados con la respuesta inespe­ cífica, la cinética de síntesis de las distintas in­ munoglobulinas y los procesos de diferencia­ ción celular asociados, no son iguales para todo el conjunto de los virus, y que en la infección de un mismo huésped, por un mismo tipo de virus, pueden obtenerse respuestas distintas se­ gún la relación de equilibrio que se establezca. De lo expuesto surge como conclusión que para efectuar el diagnóstico de laboratorio fun­ dado en estudios de exploración inmunológica debemos analizar y conocer todas las respuestas posibles que las infecciones con un virus deter­ minado pueden originar. Ello plantea una per­ manente búsqueda de nuevos sistemas de estu­ dio, que incluyen el mejoramiento y el desarro­ llo de nuevos reactivos (sueros y antígenos) y técnicas de detección de fácil aplicación y clara interpretación. La toma de muestras apropiadas, en función del tipo de antígeno o inmunoglobu­ linas que se desee detectar, es una exigencia esencial, sobre todo teniendo en cuenta el perío­ do de evolución de la enfermedad. Obviam ente, el diseño de un inm unógeno destinado a prevenir una enfermedad determi­ nada exige conocer todas las variedades posi­ bles de la relación virus-célula en el individuo.

4. Sumario de los síndromes inducidos por infecciones virales en humanos, y breves consideraciones válidas para el diagnóstico serológico de laboratorio En el cuadro 27-1 se presenta un ordena­ miento práctico de las enfermedades virales que nos revela la necesidad de ubicar el panorama general, pero teniendo en cuenta los factores particulares que se plantean en los distintos gru­ pos, con especial referencia a las posibilidades de persistencia del agente viral infectante. Al tener claro el concepto de complejidad real asociado con la respuesta del individuo a los distintos tipos de infecciones virales, es po­ sible formular un enfoque general que nos per­ mita desarrollar actitudes prácticas frente al es­ tudio de los individuos infectados. En el cuadro 27-2 se presenta en forma es­ quemática la secuencia general de hechos que ocurren durante una infección viral aguda. En ella se ve claramente el período de ataque y di­ seminación del virus, del que resulta, luego de un tiempo variable, una patogenia dada que ge­ neralmente se traduce en alteraciones morfoló­ gicas y bioquímicas objetivables por métodos de laboratorio. Este período agudo, rico en sín­ tomas y signos, es por lo general el más propi-

Cuadro 27-1. Agrupamiento de algunas enfermedades virales H e p a titis v ira les P o lio p a ra lític a L o c a liz a d a s

V e rriig a s R e s fria d o c o m ú n

M olluscuin contagiosum S ID A S e g ú n la e x te n s ió n d e lo s te jid o s y /u ó r g a ­ n o s a fe c ta d o s S a ra m p ió n V iru e la D is e m in a d a s

V a ric e la F ie b re h e m o rrá g ic a

A gudas In a p a i'e n te s o su b c lín ic a s S e g ú n el c u rs o d e e v o lu c ió n c lín ic a

L a te n te s re c u rre n te s L a te n te s a s o c ia d a s a la rg o p e río d o d e in c u b a c ió n C ró n ic a s In fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s tá re la c io n a d a co n

S e g ú n el m e c a n ism o d e p a to g e n ia

el e fe c to lític o v ira l I n fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s tá a s o c ia d a c o n la in m u n o rre s p u e s ta

E ste ag ru p am ien to es m uy e m p íric o y d eb e an a liz arse ca d a c a so . Npte.se q u e se re fiere a los sín to m a s y signos m ás im p o rtan tes d e l a e n fe r­ m ed a d y no siem p re a la io ca ü zac ió n d e las células que re p lic a n el virus. E l S ID A re su lta p rin cip a lm e n te de la d estru c ció n de cé lu la s T C D^' p o r ei H ÍV , p ero la en ferm e d ad es un c u a d ro g e n e ra d o p o r la in m u n o d cficic n cia con una variada .signo-sinlojíiatoJogía genem lm enlc en c u ad ra d a en in fec cio n es o p o rtu n istas.

Inmunología en las infecciones virales

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Cuadro 27-2 In fe c c ió n R e s p u e s ta in e s p e c ífic a In fla m a c ió n I n te rfe ró n F ie b re

T e jid o d e a ta q u e P rim e ra a m p lific a c ió n d e m a te ria l v ira l y v irio n e s lib re s

V ire m ia p r im a ria c o m o d ise m in a c ió n c o n ­ v e n c io n a l a p a rtir d e l á re a d e a ta q u e a o tra s á re a s. T ra n s p o rte n o c o n v e n c io n a l: C a n a le s a x ó n ic o s m a c ró fa g o s b r o n c o a s p ira c ió n

A lc a n c e d e tejid o s s u s c e p tib le s se c u n d a rio s

ll I“{

R e s p u e s ta e s p e c ífic a P ro c e s o d e a n tíg e n o s D ife re n c ia c ió n c e lu la r lin fo id e P ro life ra c ió n c e lu la r B io s ín te sis d e in m u n o g lo b u lin a s e s p e c ífic a s C o n d ic io n e s e s p e c ia le s p u e d e n c o rta r el d e s a rro llo d e l p e río d o a g u d o — o d is m in u ir d r á s tic a m e n te lo s s ín to m a s

S e g u n d a a m p lific a c ió n d e m ate ria l v ira l G e n e ra lm e n te p a rtic ip a en los s ín ío m a s , la p a to g e n ia y la re c u p e ra c ió n

__

V ire m ia s e c u n d a ria S u p re s ió n d e c é lu la s in fe c ta d a s . F in d e l p e río d o a g u d o . R e s o lu c ió n A ta q u e d e l ó rg a n o b la n c o P e rs is te n c ia d e c lo n e s c e lu la re s p ro d u c to re s S o b re p a s o d e la r e s p u e s ta in m u n e. M u e rte . E q u ilib rio d e c é lu la s p ro d u c to ra s y re s p u e s ta in m u n e . M o d u la d o c o n p a to g e n ia v a ria b le . P e rs is te n c ia

•o o a 'o 2 3 o § 'S

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c ito h is to -

c e lu la re s .

A partir de la infección y de los fenómenos primarios se desarrolla la reacción del huésped sobre la base de las llamadas respuestas inespe­ cíficas y la respuesta inmune específica. La pri­ mera se caracteriza por la aparición del fenó­ meno de inflamación, con la participación de células con capacidad de endocitosis, de las cuales los m acrófagos p arecen ser los m ás conspicuos, y de linfocitos con capacidad cito­ tóxica inespecífica “natural killers”, síntesis de interferón, fiebre, etc,, y la segunda por activi­ dad de células presentadoras de antígeno y la posterior proliferación de células inmunocom­ petentes, seguida de síntesis de inmunoglobuli­ nas específicas. Con esto queda justificado el tríptico en que se basa la estrategia general del diagnóstico de laboratorio de las enfermedades virales: a) in­ tento de aislam iento y/o caracterización del agente etiológico, fundamentalmente durante el período prodrómico y el episodio agudo de en­ ferm edad; b) observació n en m ateriales de biopsias o necropsias, obtenidos para estudios citológicos o histopatológicos de lesiones, y c)

estudio cinético de las modificaciones cualitati­ vas y cuantitativas de la respuesta inespecífica y de la inmune específica. Esta liltima requiere el estudio comparativo de muestras biológicas obtenidas en el transcurso de la enferm edad (período agudo y convaleciente), sobre todo, estudios en suero. En la figura 27-6 se presenta el esquem a de J. M. Vanella, válido para enfocar el tipo de técnicas aplicables al estudio de laboratorio en virología. Del análisis de éste surge cjue la base operativa más im portante para el diagnóstico etiológico se fundam enta en el estudio de la respuesta inmune específica, que se realiza de­ tectando los cambios cualitativos y cuantitati­ vos de las inm unoglobulinas presentes en el suero del paciente durante la evolución de la enfermedad. Las bases fundamentales del diagnóstico de laboratorio de la infección viral p u ed en ser analizadas de acuerdo con la llamada cadena de Márquez, relacionada con los pasos que deben cumplirse. Éstos son; a) decisión de realizar el estudio de laboratorio; b) toma y transporte de la muestra; c) procesamiento de la muestra; d) informe, y e) interpretación. Analizaremos en conjunto los puntos a y b.

540

Inmunopatología Límite del primer suero

i Area crítica

Segundo suero

para la decisión de iniciar un estudio de laboratorio

1 T

Tercer suero

i

Posibilidad de establecer datos sobre

Tiempo en días

Período de incubación

Período agudo

Período de convalecencia

F ig . 2 7 -6 . D ia g ra m a d e e v o lu c ió n d e m a rc a d o re s esp ecifico .s en u n a in fe c c ió n v ira l a g u d a p rim a ria .

a y b) Decisión de realizar el estudio de labo­ ratorio, toma y transporte de la muestra En función de limitarnos al estudio de la res­ puesta inmune, no analizamos aquí la toma de otros materiales destinados a aislamiento de vi­ rus, análisis citológicos, biopsias, etc. Ante la sospecha de una enfermedad de etio­ logía viral, nunca se dejará de tomar una mues­ tra de suero del paciente en el primer examen del individuo. Si la decisión de iniciar el estu­ dio no se toma a tiempo, todo intento posterior será fatuo. Se deberá asegurar que en el período que abarca de 15 a 2 0 días de iniciada la enferme­ dad, se tome una nueva muestra de suero. La base del estudio de la respuesta inmune humo­ ral es poder demostrar cambios cualitativos y cuantitativos en función del tiempo y relacio­ narlos con la evolución clínica. La mayor cantidad de muestras posible obte­ nidas durante la evolución, sean ellas destina­ das a estudios de la respuesta humoral, celular u otros objetivos, permitirá construir una infor­ mación mucho más precisa acerca del perfil de respuesta y relacionar fehacientem ente estos datos con los mecanismos de patogenia. c) Procesado de la muestra Los sueros recibidos en el laboratorio se pro­ cesarán de acuerdo con las técnicas apropiadas según las sospechas que se desprendan de la fi­

cha epidemiológica, y se tomarán precauciones elementales como la inclusión de todos los sue­ ros que se dispongan del paciente en una mis­ ma prueba de laboratorio, analizados con los mismos reactivos, operador, equipo, etc. La inclusión de sueros y antígenos controles de referencia no deberá obviarse bajo ningún concepto. La incorporación de la actividad diagnóstica a un serio y continuo programa de acreditación y de control de calidad son mandatorios. Se deberán establecer y respetar normas ele­ mentales de bioseguridad ya que todo suero de­ be considerarse de alto riesgo independiente­ mente de una presunción particular. d y e) Informe e interpretación No comentaremos ahora estos puntos ya que se trata de un enfoque general. Sim plem ente diremos que el informe debe ser claro y llevará un comentario sobre los resultados que ayude a la interpretación posterior. Como corolario, queremos condicionar al in­ dividuo que encara la investigación de forma que este concepto operativo del estudio seroló­ gico sea un verdadero dogma inamovible; la to­ ma de una muestra de suero del período de co­ mienzo de la enfermedad y, por lo menos, otra entre 15 y 20 días más tarde. Así se cubrirá con una gran eficiencia la posibilidad de efectuar un diagnóstico preciso de laboratorio, cualquie­ ra que sea el tipo de infección viral en estudio

Inmunología en las infecciones virales y la técnica usada. Diremos, además, que toda vez que se pueda agregar una tercera muestra o más eon intervalos de 30 días, esta serie de sueros ampliará las posibilidades de arribar a un diagnóstico seguro y a un estudio consciente de la evolución de la respuesta inmune que, co­ mo en el caso de la hepatitis B, SIDA y otras, es de absoluto valor pronóstico. La conservación de los sueros permitirá que en un futuro, cuando por distintos adelantos técnicos se disponga de los reactivos, aquéllos puedan ser reestudiados y establecer un diag­ nóstico correcto retrospectivo. Al referirnos a que no se disponen reactivos estamos indican­ do dos posibilidades: que el agente sea desco­ nocido aún, o que sea muy difícil preparar antí­ genos por sus características biológicas. Otro aspecto que tiene que ver con lo ante­ rior es el relacionado con la detección de nue­ vos tipos de infección, en los que es necesario explorar respuestas inmunes con una gama de antígenos purificados, como en el caso de in­ fecciones abortivas, persistentes, etc. Quedan así planteados los problemas de va­ riación de respuesta inmune y un enfoque ge­ neral de cómo abordarlos, que deberá ser usado teniendo en cuenta las limitaciones de toda ge­ neralización. 5. Concepto general de la respuesta inmune en la infección viral aguda Una vez alcanzadas las células susceptibles por un agente viral, éste inicia un ciclo de re­ plicación que culm ina con la producción de nuevos viriones, los que, de disponerlas, atacan nuevas células susceptibles. En ciertos casos este proceso del ciclo de replicación viral pro­ duce la muerte celular. De esta forma se induce en el organismo una cantidad creciente de m a­ teria] antigénico viral, suficiente para provocar una respuesta de los mecanismos inespecíficos y de los sistemas inmunes específicos del indi­ viduo. Éste, m ediante la actividad de células com petentes, procesa en los sitios de activa síntesis de material viral, los distintos antíge­ nos que reconoce como extraños y pone en marcha la diferenciación de clones celulares es­ pecíficamente informados para reconocer estos antígenos y la biosíntesis de inmunoglobulinas específicas. En forma general, y siempre en el ciclo lítico asociado con infección que define a una enfer­ medad aguda, el sistema de información inm u­ nológica toma contacto con la totalidad de los antígenos del virus; antígenos de la superficie viral, porque hay en circulación viriones ente­ ros, y antígenos de las nucleocápsides de los viriones (proteínas internas), porque de las cé­ lulas rotas salen estos antígenos, que siempre

541

son sintetizados en exceso. Además, en virtud de la lisis celular, también el sistema de detec­ ción inmunológica se informa sobre antígenos virales no estructurales, es decir, aquellos que no forman parte del virión. Se produce así, sucediendo o acompañando a toda la respuesta inflam atoria local, la induc­ ción de producción de inmunoglobulinas espe­ cíficas de distribución sistém ica. Estos an ti­ cuerpos estarán dirigidos cualitativamente con­ tra cada una de las especificaciones antigénicas virales (epitopes). Cuantitativamente depende­ rán de factores propios de los antígenos como antigenicidad, cantidad relativa de ellos, rela­ ción y forma de exposición a las células de pro­ cesamiento, mecanismos generales de reg u la­ ción, etc. Los macrófagos son células que procesan el m aterial viral y expresan en sus m em branas plasmáticas los epitopes; por eso se los consi­ dera como células procesadores y presentado­ ras de antígenos. Además de ellos, se encuen­ tran las células dendríticas (CeD en), q u e si bien no procesan al antígeno, tienen la capaci­ dad de fijar epitopes en su superficie, am plifi­ cando así la presentación del antígeno. Se las encuentra en los tejidos linfoides, sobre todo en bazo, nódulos linfáticos y en la piel se denom i­ nan células de Langerhans. Tanto los macrófagos, como las células den­ dríticas, secretan una importante citoquina, la Interleuquina 1, considerada como la segunda señal estimuladora de los linfocitos T (la pri­ mera señal la constituye la presentación del an­ tígeno). El macrófago o la CeDen presentan el antí­ geno viral estrechamente relacionado a las pro­ teínas de clase I o II del CMH (Complejo Ma­ yor de Histocompatibilidad) en sus membranas plasmáticas. Este complejo antigénico (m olé­ cula del CMH + epitope viral) es identificado por los receptores de los linfocitos T, que solo reconocen al antígeno viral si está asociado a una molécula del CMH. Las moléculas del CMH de clase I se enla­ zan con epitopes virales presentes en el com­ partimiento citosólico de la célula infectada y los exponen en la superficie celular. D e esta manera será reconocido por una célula T que pase. Si esta célula porta el m arcador C D 8 CD28 (linfocito T citotóxico) en su superficie, pondrá en marcha una respuesta inmune contra las células infectadas, liberando diferentes sus­ tancias químicas que las destruyen porque es­ tán programadas para destruir células que ex­ presan antígenos virales. Esta respuesta consti­ tuye una forma eficaz de evitar la creación de más virus por las células infectadas. Los linfocitos T citotóxicos son los efectores más importantes en la eliminación de células

542

Inmunopatología

infectadas por virus. Sin embargo, es necesario recalcar que en el caso de virus que no produ­ cen lisis celular manifiesta, por ejemplo, hepa­ titis B, el daño hepático que genera la insufi­ ciencia está dado por el ataque de linfocitos ci­ totóxicos al hepatocito. Como ya se mencionó, estos linfocitos tienen una restricción manifies­ ta para células que exhiben el antígeno viral y antígenos de la clase 1 del CMH, lo que abre una permanente necesidad de búsqueda sobre la posible asociación de diferentes patologías inducidas por virus, que estuvieran condiciona­ das por el perfil de antígenos de histocompati­ bilidad del individuo infectado. Si la m olécula del CMH que acompaña al epitope viral es de clase II, será reconocida co­ mo extraña por las células T CD4+ (T helperTh) que pueden ser T h l, llamadas también cé­ lulas T inflamatorias pues secretan mediadores químicos que atraen células inflamatorias al si­ tio de multiplicación viral. Además secreta in­ terferón y, que intentará bloquear la replicación del virus. Las células Th2, llamadas células co­ laboradoras, también son CD4+ y su rol funda­ mental es aumentar la respuesta B dependiente mediante la secreción de Interleuquina 2 (citoquina que amplifica la respuesta de Linf. B). De esta última respuesta, dependerá la calidad y cantidad de inmunoglobulinas que intentarán, por diversos mecanismos (neutralización, opsonización, fijación de complemento, etc.), des­ truir los viriones extracelulares. Las células T supresoras (CD 8 +), tienen una probable relación con los estados de tolerancia a antígenos extraños y también con la toleran­ cia a autoantígenos. Por ello, se asocia una de­ ficiencia de las células T supresoras con el de­ sarrollo de síndromes autoinmunes. En la práctica podemos identificar anticuer­ pos dirigidos contra antígenos de la estructura externa, que se reconocen por la propiedad de unirse a viriones enteros y de disminuir o abo­ lir su capacidad infectiva in vitro y a los que se llam a “neutralizantes” . La estructura externa depende de que se trate de virus desnudos, en los cuales esta “estructura externa” está inte­ grada por los polipéptidos que forman los capsómeros (p. ej., poho), o que sean virus envuel­ tos, en los que esta “estructura externa” está in­ tegrada por glucoproteínas, lipoproteínas de la envoltura, o ambas. También se forman anticuerpos contra las estructuras proteicas internas virales (nucleoeápsides). La actividad de estos anticuerpos no puede ser medida por su capacidad de abolir la infectividad viral in vitro; por lo general, se es­ tudian por otros sistemas de detección inmunológica, utilizando como antígenos las partes in­ ternas de virus. Se los llama por ello anticuer­ pos contra antígenos internos o “core”.

Una vez puesta en marcha la respuesta inm u­ ne se pueden integrar los siguientes fenómenos que condicionan el escjuema clásico de una in­ fección viral aguda: a) Células infectadas que producen virus, eon lisis celular, respuesta inmune funcional integral contra el virus y partículas subvirales. b) Virus que son liberados al torrente extracelular están ahora expuestos a la acción de an­ ticuerpos neutralizantes, los que, obviamente, contribuyen a reducir el riesgo de infección de nuevas células susceptibles. Los inm unocom ­ plejos formados son rápidamente captados por los sistemas de depuración. Los anticuerpos contra otras estructuras tam­ bién actúan formando complejos inmunes y los mecanismos de eliminación de éstos forman un capítulo aparte en inmunopatogenia. c) La célula que se encuentra infectada e ini­ cia un ciclo de replicación está sometida a esta altura a acciones directas: interferón, tempera­ tura y, si en el ciclo de replicación incluye la síntesis de antígenos virales en la superficie ce­ lular, esta célula es pasible de ataque lítico, por parte de sistem as com o an ticuerpo-com ple­ mento y el de linfocitos capaces de adosarse a ella e inducir su lisis, antes de producir virio­ nes. d) La acción conjunta de los sistemas m en­ cionados culmina con la abolición de la exis­ tencia de células infectadas productoras de an­ tígenos de superficie, las cuales son destruidas. Todo antígeno viral libre será complejado con sus anticuerpos respectivos y seguirá distintos caminos de eliminación según las característi­ cas del inmunocomplejo formado. e) El período agudo de la replicación viral estará terminado y la enfermedad, sus sínto­ mas y sus signos estarán determinados por el daño que este proceso haya inducido; éste se halla relacionado con el tipo de células blanco alteradas o destruidas en el ataque inicial y con las células que se hayan infectado en la diseminación secundaria. En este caso el daño celular está dado por la acción lítica viral per se y la acción lítica asociada a la respuesta in­ mune. El resultado de una infección de este tipo se analiza más adelante, al hablar del virus de la polio. Conviene resaltar aquí que en estos casos, en el tiempo que media entre la infección en los tejidos de ataque en que se inicia la respuesta inmune y el ataque a otros órganos, hay gene­ ralmente un período de viremia. La amplifica­ ción de la replicación viral de los órganos ge­ nera un nuevo episodio de viremia secundaria, que es tan extensa o im portante como pobre

Inmunología en las infecciones virales haya sido la respuesta inmune humoral. Estas infecciones inducen una respuesta inmune ge­ neralmente “de por vida” con persistencia de anticuerpos neutralizantes detectables. 6

. R espuesta inmune en infecciones virales con persistencia de virus

Cabe aclarar que el efectuar esta distinción entre infecciones agudas y aquellas con persis­ tencia de virus tiene un carácter didáctico y el lector deberá tomarlo como un paso necesario hacia la comprensión del problema y deberá es­ tar alertado de que existen variables tan com ­ plejas que no pueden sintetizarse en una apre­ ciación tan simple como la propuesta. Lo que interesa plantear aquí es que, a dife­ rencia de lo detallado en el punto 5, en ciertas infecciones virales el agente alcanza las célu­ las susceptibles, inicia la amplificación de m a­ terial antigénico viral, pero en este caso las cé­ lulas productoras de virus no son destruidas debido al mecanismo de replicación viral y los viriones emergen de ellas por procesos diver­ sos, entre los cuales el de brotación a través de mem branas citoplasm áticas es el más comtín. Veremos cómo es la respuesta en estos ca­ sos, que generalmente corresponden a infeccio­ nes con virus envueltos: a) Al no haber destrucción celular, el proce­ so inflamatorio local es mucho menor. b) El virus liberado, que en su envoltura lle­ va ciertas especificidades antigénicas del hués­ ped, inicia la respuesta. Al ser tomado por ma­ crófagos, si éstos lo procesan, se informan de sus antígenos externos. Recordemos que, al no haber destrucción celular inicial, el organismo no tiene contacto con antígenos internos y me­ nos con los no estructurales, intracelulares. La respuesta inmune es lenta y parcial, c) Se forma escasa cantidad de anticuerpos neutralizantes, que generalmente forman inm u­ nocomplejos con el virus producido, tendiendo a un equilibrio. d) La respuesta inmune celular genera célu­ las que son capaces de reconocer a los clones celulares que están produciendo virus. Si en es­ te caso la respuesta celular y la inmune hum o­ ral condicionan que estos clones sean destrui­ dos, el proceso se comportará como una infec­ ción aguda o mixta. Puede ocurrir que por ambas variables, de­ fectos en las células T o en otros efectores del sistema de inmunidad celular y/o la presencia de anticuerpos bloqueadores que tapicen las membranas de células infectadas y las exclu­ yan del reconocimiento de los linfocitos T, las células infectadas no sean eliminadas y conti-

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niien produciendo virus. En este caso estamos en presencia de una infección con persistencia de clones celulares productores y la instalación de una etapa de cronicidad del proceso. e) La patogenia que ese estado general de equ ilib rio pueda inducir depende del tejid o afectado, la modulación de producción viral, que puede ser perm anente o interm itente, los complejos inmunes que se forman, etc. Un caso particular de este tipo de problema es el que se plantea en células infectadas que no producen virus, porque parte del genoma es­ tá integrado (infección abortiva) y sólo se sin­ tetizan antígenos virales “muy débiles”. En este caso, el organism o no produce anticu erp o s “neutralizantes” de la infectividad viral, pero sí contra estos antígenos que pueden modular es­ tados celulares tales como proliferación celular (oncogénesis). Vemos entonces con claridad cómo u n a in­ fección viral con un mismo tipo de virus podrá, en individuos de la misma especie, establecer infecciones agudas o crónicas según sean la respuesta de este individuo y el equilibrio que se establezca. En esto influyen fundam ental­ m ente estados fisiológicos, tratam ientos con drogas, enfermedades concomitantes, factores psicológicos, etcétera. 7. Concepto de fenómenos de autoinmunidad asociados a infecciones virales Se desprende de lo anterior que ciertos virus no citocidas modifican las membranas de las células del huésped, induciendo especificidades antigénicas mixtas. Se pueden exponer, además de los nuevos antígenos del virus, antígenos propios del huésped, secuestrados durante el proceso embrionario y que resultarán nuevos para el adulto. El huésped puede reconocer es­ tas m odificaciones, por pequeñas que ellas sean, como extrañas y en un proceso lento pro­ ducir ataque directo a estas estructuras desen­ cadenando un fenómeno autoinmune. La relación de un tipo definido de infección viral con cualquiera de los estados autoinm u­ nes detectados en humanos es algo aún no defi­ nitivam ente demostrado. En algunos modelos experimentales la relación de infecciones vira­ les y el ulterior desarrollo de un estado inmunopatoíógico autoinmune es real. En general, existe la posibilidad de que mu­ chos de los fenómenos clasificados com o au­ toinmunes inducidos por virus resulten de un mecanismo de inmunopatología secundaria a la formación y evolución de complejos inmunes generados por antígenos virales o virus-hués­ ped compartidos y anticuerpos del huésped.

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Inmunopa tología

8. Inmunocomplejos en infecciones virales Hemos visto eómo durante la infección lítica se induce la formación de anticuerpos neutrali­ zantes de la infectividad viral y aquellos capa­ ces de reconocer antígenos internos del virión o, en el caso particular de virus envueltos, con­ tra antígenos de envoltura, asociados general­ mente a las membranas de células infectadas (células productoras de virus pero que no se lisan). Los anticuerpos y antígenos circulantes en fase líquida forman com plejos inm unes, que estarán listos para interactuar con otros siste­ mas efectores, de los cuales el complemento es el mejor conocido. Una vez formado el com ­ plejo antígeno-anticuerpo-eom plem ento, au ­ m enta de tam año y puede lleg ar a o rig in ar agregados, por entrecruzamiento de varias uni­ dades con participación de C3 y otras fraccio­ nes de complemento. En el caso de la infección del ratón con virus polioma se ha podido deter­ minar que el complejo virus-anticuerpo tiene un coeficiente de sedimentación de 270S, que aumenta a 450S cuando reacciona con el com­ plemento. En el caso de virus muy complejos como los R etroviridae, el com plejo virus-anticuerpocomplemento, induce daño de la superficie lipí­ dica del virión. Este daño origina la ruptura del virión y la liberación de antígenos internos del virus que inducen, en cadena, la producción de nuevos anticuerpos contra este tipo de estructu­ ra interna, además de aquellos dirigidos contra la envoltura. Esto es compatible con la secuen­ cia de aparición de anticuerpos en la infección con HIV (SIDA). En infecciones persistentes, con producción permanente o intermitente de viriones, la for­ m ación de inm unocom plejos es frecuente y constituye un factor importante de los fenóme­ nos patológicos que condicionan fundamental­ mente depósitos en tejidos donde producen res­ puestas flogógenas. Los síndrom es más fre­ cuentes son nefritis, arteritis y coroiditis. Los complejos virus-antieuerpo-complemento pueden actuar sobre células que tienen re­ ceptores para la fracción Fe, como importantes agentes de daño de membrana. Complejos inmunes de estructuras variables pueden formarse en la superficie de células que están sintetizando antígenos y actúan bloquean­ do factores necesarios para que aquéllas pue­ dan ser eliminadas por fenómenos de inmuni­ dad mediada por células T. Este m ecanism o ha sido observado en las formas crónicas que suceden a la infección saram pionosa (panencefalitis esclerosante subaguda), en las que se ha demostrado un factor que bloquea la inmunidad mediada por células.

la actividad MIE e inclusive la linfoprolifera­ ción. Inmunocomplejos del tipo antes descrito han sido claramente detectados en una serie de in­ fecciones virales en animales. En humanos, és­ tos han sido relacionados con aspectos patoló­ gicos en hepatitis viral tipo B, en infecciones producidas por el agente Epstein-Barr, princi­ palm ente en su asociación eon el linfom a de Burkitt, en el dengue y en la ya m encionada forma encefalítica crónica postsarampionosa. De acuerdo con datos provenientes de algu­ nos modelos experimentales, en especial el de inducción de enfermedad del suero, en las in­ fecciones virales, los síntomas como mialgias, artralgias, “rash”, disturbios de conducta y le­ targía, pueden asociarse al aumento de la res­ puesta inmune humoral y del período de supre­ sión del virus circulante. Esta patogenia puede compatibilizarse con el mecanismo que resulta del depósito de complejos inmunes y la actua­ ción de mecanismos efectores en los que parti­ cipan basófilos recubiertos de IgE, aminas va­ soactivas, perm eabilidad capilar y daño en la trama sinusoide. Por último, conviene recordar que reciente­ mente se han encontrado factores genéticos que pueden influir en las distintas respuestas del huésped a la infección viral, de las cuales tene­ mos, por una parte, una producción de alto títu­ lo de anticuerpos de alta afinidad que facilita la eliminación total del virus generando una sola onda de depósito de complejos inm unes y la eliminación de los clones productores de virus, y, por otro lado, una respuesta con baja canti­ dad de anticuerpos o de baja afinidad que lleva a una prolongada evolución de los fenómenos induciendo una continua circulación de com ­ plejos inmunes. 9. Respuesta inmune en poliomielitis En la figura 27-1, hemos planteado detalles de la estructura del virus de la poliom ielitis. R ecordem os que inm unológieam ente se han demostrado tres tipos de virus diferentes, lla­ mados poliovirus tipo 1, 2 y 3. Si bien difieren en la especificidad antigénica, las característi­ cas morfológicas y funcionales de replicación son prácticam ente idénticas. Por ello, si bien pueden admitirse diferencias, los comentarios sobre respuesta inmune se realizarán en gene­ ral, sin especificar el tipo de virus. Las partículas virales están integradas por cuatro polipéptidos V P l, VP2, VP3 y VP4. Una serie de moléculas proteicas interm edia­ rias son sintetizadas en la célula infectada, cu­ yas características inmunológicas no son cono­ cidas, pero obviamente participan en la conste­ lación de la respuesta inmune productiva. Entre

Inmunología en las Infecciones virales ellas las principales son N C V P l A (non capsid viral protein), que es precursora de las proteí­ nas de la cápside, y la NCVP2 de 77 kD. La P63 (única proteína con actividad polimerásica netamente viral) deriva de NCVP2. Todas ellas contribuyen en la respuesta in ­ mune cuando se produce la infección natural o la inducida con vacunas de virus atenuado. O b­ viamente, en la vacunación con virus inactiva­ do la respuesta está limitada a los polipéptidos estructurales solamente. En la figura 27-7 se presentan diagramas de la respuesta inmune en una infección natural en su tipo de localización faringoentérica y la complicación paralítica. En la figura 27-8 se incluyen los correspondientes a la respuesta in­ ducida por vacuna inactivada y por virus ate­ nuado. Es obvio que la localización faríngea e intes­ tinal constituye la fase inicial de la infección, que genera una sintomatología local de curso variable, desde casi asintomático hasta episo­ dios de faringitis y enteritis agudas. En el individuo virgen de inmunización pre­ via, su estado de defensa general condicionará la intensidad de producción de virus, el cual po­ drá alcanzar el espacio extracelular e inducir vi­ remia. El virus tendrá así posibilidades de con­ tactar todas las células del organismo. Recepto­ res muy particulares, mecanismos de replica­ ción condicionantes, virulencia de la cepa viral, hacen que algunas células del asta motora de la médula sean atacadas y destruidas por proceso lítico. Cuando una cantidad considerable de es­ tas neuronas pierden funcionalidad se estable­

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cen los signos de parálisis fláccida típica de la complicación de la infección poliomielítica. Este mecanismo, en especial la viremia co­ mo factor necesario para el ataque a las células del sistema nervioso, explica la eficacia rotun­ da de la vacunación poliomielítica con vacuna inactivada. Esta vacuna, aunque sólo induce una respuesta de anticuerpos del tipo IgM e IgG neutralizantes, poca respuesta inmune ce­ lular o ninguna y “nada” de IgA secretoria (no deteetable), es suficiente para complejar el vi­ rus que invade el espacio intersticial y circula en la sangre. El éxito individual de cada caso dependerá de la cantidad de anticuerpos dispo­ nible en el momento de la entrada del virus. Es importante recalcar que la inmunidad que con­ fiere la vacuna inactivada es pobre o nula para prevenir la replicación viral en mucosa intesti­ nal y faríngea. En el caso de la infección natural o la induci­ da por vacuna atenuada, la producción de anti­ cuerpos de tipo IgM, IgG e IgA circulantes es mayor y se agrega la síntesis de IgA secretoria en íos tejidos expuestos. La respuesta de inm u­ nidad celular es deteetable también en estas cir­ cunstancias. Reiteramos además que los anticuerpos for­ mados son inducidos por una variedad de antí­ genos mayor que la que tiene la vacuna inacti­ vada. A pesar de todo, la vacuna inactivada tiene un éxito indiscutido en el control epidemiológi­ co de polio y un riesgo menor que la atenuada en casos de niños deficientes en su respuesta inmune.

Tiempo en días F ig . 2 7 -7 . E v o lu c ió n d e m aix a d o re s e n la in fe c c ió n p o lio m ie lític a c o n c o m p lic a c ió n p a ra lític a .

546

Inmunopatología

VIRUS

F ig . 2 7 -8 , R e s p u e s ta a la v a c u n a c ió n c o n tr a p o lio .

10. Respuesta inmune en rubéola En la figura 27-9 se presentan datos sobre la evolución de la excreción de virus, la viremia y la cinética de síntesis de anticuerpos de distin­ tos tipos en la infección primaria del adulto y en la infección del feto en títere por virus de la rubéola. Estos datos refuerzan algunos de los concep­ tos que ya hemos expresado. Queda indicado el corto período a partir de la aparición de los sín­ tomas, en el cual se pueden obtener aislamien­ INFECCIÓN DEL ADULTO

Anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (IgG + IgM)

Virus en fa rin g e /

Anticuerpos fijadores de complemento

Virus en / / sa n g re /' j

- too

tos durante la evolución de la infección prima­ ria del adulto, contrastando con el extenso pe­ ríodo en que puede detectarse virus en el niño infectado durante la gestación y el período pos­ parto, cuando nace con vida. La variación de la cinética de evolución de los distintos anticuerpos que se detectan según el tipo de técnica y los antígenos que se utili­ cen, nos brinda un claro ejemplo de la necesi­ dad de elegir con conocimiento el sistema sero­ lógico que se empleará para llegar a un diag­ nóstico de certeza, según sea el período de evo­ lución de la enfermedad y el tipo de infección que se desarrolla. Fijem os brevem ente la atención en lo que ocurre durante la infección del adulto con los anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (IHA), que son los que pueden ser estudiados por técnicas más comunes y que son compatibilizables con los neutralizantes. Si la primera muestra de suero es tomada correctamente den­ tro de los 3 días de iniciada la enferm edad, cualquiera que sea la época de toma de la se­ gunda (10, 20 o 30 días), permitirá su estudio com parado con la técnica de IHA o con las otras y se podrá demostrar un aumento signifi­ cativo del título de anticuerpos, hecho básico que permite hablar de una infección específica reciente. Sin embargo, si la prim era toma se efectúa entre 5 a 10 días después de la inicia­ ción de los síntomas (decisión tardía), no se p o ­ drá demostrar, mediante la técnica de inhibi­ ción de la hemaglutinación (IHA) común, un aumento significativo de anticuerpos; en este caso se necesitaría obtener nuevas muestras de suero, más adelante, para objetivar la caída del título que ocurre normalmente, o recurrir a la titulación específica de IgG e IgM. No obstan­ te, el mismo tipo de muestras, tomadas entre los 5 o 10 días y otra de 30 días, permite de­ mostrar el aumento de anticuerpos si se utiliza la reacción de fijación de complemento.

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INFECCIÓN FETAL

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100

F ig . 2 7 -9 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ­ ta b le s e n la in fe c c ió n r u b e ó lic a .

Inmunología en las infecciones virales En el caso p articu lar de la infección del adulto por virus de rubéola, si se dispone de una muestra de 5 a 10 días, luego del inicio de los síntomas y se pueden efectuar técnicas de estudio de título de inm unoglobulinas 7S y 19S, con una sola m uestra en la que se detecte un alto títu lo de an ticu erp o s IH A del tipo 19S se podrá inferir una posible infección re­ ciente. La técnica que permite evaluar las globuli­ nas 19S y 7S ha sido la base de la información que hoy se dispone sobre la infección congéni­ ta de rubéola y la evaluación de la respuesta del niño, la cual puede observarse al pie de la figu­ ra 27-9. Se demuestra que durante la persisten­ cia de síntesis de virus en el recién nacido, éste produce IgM específica de rubéola, lo cual in­ dica que el niño es inmunológicamente compe­ tente, pero evoluciona con una lenta madura­ ción, para eliminar finalmente los clones celu­ lares productores de virus. Mientras esto ocu­ rre, en el suero aumenta lentamente el tenor de IgG inmune propia del niño. La detección en este caso de un título alto de IgM específico en los primeros días y durante los primeros meses de vida en presencia de concentraciones muy inferiores de IgG, constituye fuerte evidencia en favor de una infección en útero. En beneficio del tiem po y la claridad no ofrecemos aquí detalles operativos de las prue­ bas de laboratorios desarrolladas. Sólo diremos que la técnica de inhibición de la hemaglutinación puede ser llevada a cabo en laboratorios periféricos, ya que pueden distribuirse antíge­ nos inactivados y sueros apropiados de referen­ cia. R ecientemente se han introducido técnicas de investigación de anticuerpos por inm unofluorescencia y enzim oinm unoensayo de alto valor diagnóstico que prácticam ente han des­ plazado la IHA. La demostrada peligrosidad de la infección por rubéola en el curso de las primeras sema­ nas de embarazo, hacen necesario que en todos los casos de dudas se solicite la información que el laboratorio puede brindar a los efectos de fijar una conducta más racional sobre la in­ dicación médica. Esto justifica que la disponi­ bilidad de este recurso de laboratorio sea exten­ dida a toda la población. 11. Respuesta inmune en la infección herpética humana a) Generalidades Dentro de la familia herpes viridae hay siete agentes que producen infección natural en hu­ manos:

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Herpes simples tipo 1 (facial), HSV I Herpes simples tipo 2 (genital), HSV2 Citomegalovirus, CMV Epstein-Barr, EBV Varicela zoster, VZV Herpes virus humano tipo 6 (HHV 6 ) Herpes virus humano tipo 7 (HHV7) Los dos primeros, H SV l y HSV2, son res­ ponsables de infecciones humanas, cuya form a más común es la inducción de patología en m u­ cosas tanto oral como genital. Otras localiza­ ciones como el ataque a tejidos oculares, piel, sistem a nervioso central, form as sistém icas, etc. son menos frecuentes aunque obviamente de mucho mayor riesgo, sobre todo en recién nacidos. A estos agentes nos referiremos con alguna extensión más adelante. La infección citomegálica es muy frecuente en seres humanos y, en todos los lugares donde se ha explorado, se demuestra que alrededor de un 80% de individuos adultos tienen anticuer­ pos circulantes que revelan una infección p re­ via en algún momento de su vida. La mayoría de las infecciones generalm ente asociadas a distribución sistémica pasan como formas in a­ parentes. Cuando existen, uno de los signos más frecuentes es la inducción de un síndrome ictérico leve, con inflamación hepática. La infección in útero induce variadas r e s ­ puestas que van desde el nacimiento de un niño que excreta virus sin ningún síntoma o signo de enfermedad hasta severas alteraciones acom pa­ ñadas de malformaciones, que pueden ocasio­ nar la muerte fetal. La infección in útero o p o s­ parto induce un estado de persistencia que p u e­ de, en función del estado inmunitario del indivi­ duo, tener reactivaciones a lo lai-go de su vida. Las correlaciones entre el tipo de anticuerpos y su modulación en el estado de actividad de esta infección p ersistente de] hom bre y sus reactivaciones es aún objeto de estudio. El virus de Epstein-Barr ha cobrado una gran importancia en los últimos años. Se lo encuen­ tra asociado a una serie de síndromes, en m u ­ chos de los cuales su etiología directa aún re­ quiere confirmación. Se presum e con fundam ento que el agente EBV tiene un papel etiológico en la m ononu­ cleosis infecciosa. Es frecuente que en la ev o ­ lución de esta infección se induzca una m ode­ rada ictericia que, junto con otros aspectos del síndrome, hacen en ciertos casos relativamente difícil establecer un diagnóstico clínico d ife ­ rencial con las hepatitis virales clásicas. Para enfatizar el problema (tipo de infección viral, estado inmunitario del huésped, reacción del huésped, distintas enfermedades) verem os una serie de síndromes a los cuales se asocian distintos tipos de marcadores antigénieos del

548

Inmunopatología

virus EBV y en los cuales la respuesta inmune humoral revela reacción contra determinados antígenos en especial. Está relacionado con la mononucleosis infec­ ciosa, ya sea en sus formas clínicas convencio­ nales benignas o sus complicaciones a formas fatales, a las agammaglobulinemias posmononucleosis infecciosa y al sarcoma de células B posmononucleosis infecciosa. Su estrecha relación con el linfoma america­ no de Burkitt, el linfoma africano de Burkitt, el carcinoma nasofaríngeo, y una entidad carac­ terizada por un síndrome linfoproliferativo, li­ gado recesivamente al gen, nos ejem phfica la gran variabilidad de estados patogénicos que dependen de distintos equihbrios inmunológi­ cos a los que se llega. Se ha demostrado que el genoma del virus EBV puede integrarse en cromosomas de las células que infecta, induciendo persistencia de fracciones genéticas virales. De todos estos casos de enfermedades distin­ tas originadas por un solo agente viral podemos inferir que las diferentes respuestas que se in­ ducen en individuos determinados son las que condicionan la evolución. El virus varicela zoster es el agente causal de la varicela en su infección primaria, clásico síndrome de amplia distribución en la especie humana, especialmente en niños. Como regla general de los virus de esta familia, establece un estado de persistencia en el individuo infec­ tado. El herpes zoster, forma clínica cuya mayor frecuencia se presenta en individuos de edad avanzada o adultos condicionados, consiste en una reactivación viral en un huésped parcial­ mente inmune. Se explica este fenómeno como asociado a defectos de equilibrio fisiológico de la respuesta inmune integral y es frecuente aso­ ciar la aparición de herpes zoster en individuos con enfermedades neoplásicas, disturbios metabólicos severos y enfermedades degenerativas. Los herpesvirus humanos de los tipos 6 y 7 infectan hnfocitos T. El HHV 6 causa una leve infección eruptiva de la infancia conocida co­ mo roséola o exantema súbito. Ambos (HHV 6 y HHV7) han sido asociados a trastornos linfo­ proliferativos, pero restan aún mayores estu­ dios para confirmar esta asociación. Como hecho general podemos decir que este tremendo nivel de complejidad que se plantea en la infección herpética humana es la causa por la cual aún no se ha podido desarrollar ninguna vacuna eficiente que perm ita controlar cual­ quiera de los síndromes a que hemos hecho re­ ferencia. Por el contrario, la idea general que existe es la de alertar enérgicamente contra la utilización de cualquier tipo de inmunógeno, sin haber comprendido previamente su real acción

en el individuo, aunque una vacuna con virus ' Varicela vivos atenuados es casi inminente. Se sospecha, con muchas probabilidades de certeza, que el camino que separa una infección con HSVI que induce una enfermedad banal de mucosas, su complicación con un estado recu­ rrente y la infección abortiva que genera clones proliferativos pasibles de formar un tumor, son fenómenos en los cuales la modulación del tipo y la cantidad de inmunoglobulinas, células in­ m unocom petentes y toda la constelación de mediadores del sistema inmune desempeñan un papel decisivo y quizá determinante. En distintos grados de complejidad ocurre lo mismo en la infección con el agente de EBV y con el HBV. b) Sumario de aspectos de la respuesta inmune en la infección con virus herpes simple Una serie de evidencias epidemiológicas, inmunovirológicas y de estudios de biología mo­ lecular muestran una estrecha asociación del agente HSV^ (infección genital) y el carcinoma de cuello uterino. Estos estudios en el gran contexto de la inducción de malignidad por in­ fecciones virales, han hecho que en el sistema de la infección herpética humana en general, y para el caso particular de herpes simple, se ha­ ya acumulado una cantidad considerable de in­ formación. Las consideraciones y Jos diagramas que a continuación se presentan tienen un objetivo didáctico de introducción al problema y no el de hacer una presentación exhaustiva y crítica. Es necesario repasar las características es­ tructurales del virus herpes simple, con el obje­ to de tener presente su capacidad genética por la cual es capaz de inducir la síntesis de cerca de 30 polipéptidos codificados por el genoma viral. Esto, cuando el virus produce una infec­ ción productiva, es decir, cuando los mecanis­ mos bioquímicos funcionan de tal manera que se producen nuevos viriones infectivos. Recordemos que el agente del herpes simple (tanto su tipo 1 o 2 ) puede inducir una infec­ ción primaria, de la cual el individuo puede re­ cuperarse y no tener un nuevo problema en el resto de su vida. Otros individuos, con frecuen­ cias y causahdades diversas, repiten periódica­ mente la enfermedad, en el mismo sitio con in­ tensidades variables. A este fenómeno se llama recurrencia. Existen algunos problemas de nomenclatura, pero podemos aceptar recurrencia sin incurrir en ningún error. El problema se genera porque existe pasaje del ganglio a la superficie de la piel (vía axónica), que puede producir excreción de virus con síntomas y signos o sin ellos. Alguien ha pro­

Inmunología en las infecciones virales F ig . 2 7 -1 0 . E v o lu c ió n d e m arcad o re.s d e ­ te c ta b le s en la in fe c c ió n h e rp é tie a p r im a ­ r ia d e m u c o s a s (fa c ia l y /o g e n ita l).

549

Aislamiento y/o caracterización de virus a partir de lesiones externas Anticuerpos contra antígenos internos virales demostrados por fijación de complemento

10,000

-10

Tiem po en días

puesto llamar en forma diferente a la excreción viral sin lesiones y a fa excreción vira! con le­ siones, a la que reconocemos como recurrencia. Lo que importa es aceptar que tanto en in­ fecciones primarias como en reactivaciones a partir del ganglio puede haber excreción de vi­ rus con enfermedad manifiesta o sin ella. Desde el punto de vista de la respuesta in­ mune es de interés hacer algunas consideracio­ nes. En la figura 27-10 se presenta la respuesta inmune clásica de la infección primaria, en la que se ve un aumento típico de anticuerpos. En la figura 27-11 se diagrama lo que ocurre en el estado recurrente. El virus, por un meca­ nismo de traslado por el canal intraaxónico, viaja desde los terminales nerviosos hasta neu­ ronas de los ganglios del trigémino (infección facial) o sacros (en la infección genital). En la neurona, célula que no se divide, se aloja en un estado particular de latencia y fenómenos aún no definitivamente aclarados producen el viaje inverso del virus, desde el ganglio a los term i­ nales nerviosos del sitio original de infección. A llí alcanza células susceptibles y se induce una multiplicación viral que se transmite en su mayor parte por mecanismos de formación de síncicios y fusión de membranas, alcanzando células vecinas. Consecuentemente, se produce el fenómeno de inflamación y una nueva esti­ mulación del sistema inmune (fig. 27-12). Es de gran importancia resaltar que este fe­ nómeno representa una verdadera paradoja in­ munológica. Esto es, la reactivación de la re­

plicación viral con inducción de la patología local o sin ella, se produce en individuos que tienen en su sangre un título importante de an­ ticuerpos neutralizantes contra virus HSV. Las explicaciones que pueden aportarse en función de dar una interpretación de este fenóm eno son: 1. El tránsito del virus en el canal intraaxó­ nico se realiza en ausencia de anticuerpos n eu ­ tralizantes en este compartimiento. 2. El virus a nivel de los terminales nervio­ sos, y antes de acceder a las células suscepti­ bles, interaccionaría con cierto tipo de inmunoglobulina IgG, a la cual bloquearía, protegien­ do los receptores virales que harían a este virus insensible a anticuerpos neutralizantes. El virus así “protegido” por cierto tipo de IgG podría ingresar a las células susceptibles e infectarlas. 3. Una vez que el virus ha penetrado en las células susceptibles y amplificado el número de nuevos viriones infecciosos, el mecanismo de traspaso de célula a célula puede hacerse por mecanismo de fusión de membrana con células contiguas, que lo pone fuera del alcance de los anticuerpos presentes en el espacio extracelular. 4. La inmunidad dependiente de células y el m ecanism o de inflam ación actúan, y nuevas células se informan con antígenos procedentes de las células infectadas destruidas por m eca­ nismos de citotoxicidad dependiente de linfoci­ tos. Ello mantiene una producción casi p erm a­ nente de células B productoras de anticuerpos Anticuerpos neutralizantes

F ig . 2 7 -1 1 . E v o lu c ió n d e m a r c a d o re s d e te c ta b le s e n la i n fe c c ió n h e r p é t ie a p r im a r i a d e m u c o s a s ( fa c ia l y /o g e n i ­ ta l) y r e c u r r e n c ia s p e rió d ic a s an u ales.

-1 0

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Tiempo en días

Recurrencias virales

10.000

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Inmunopatología F ig . 2 7 -1 2 . D ia g ra m a d e l p o s ib le m e c a n is m o de t r a n s p o r te v ira l e n la recuiTencia h e rp é tic a .

Ganglio trigémino

ganglio sacro Viaje intraaxónico de ganglio i receptores periféricos, donde alcanza células de piel y/o mucosas

Neurona ganglionar que alberga el virus

De ganglio trigémino 3° o 4sacros, se ha aislado virus herpes. Siempre que se cultive como explanto y en presencia de células permisivas (cocuitlvo)

Represión y/o inducción de la replicación viral. Puede participar IgG inmune pegada a antígenos de superficie en la neurona

circulantes, del tipo neutralizante, y contra to­ dos los otros antígenos virales que se producen en cantidad suficiente. En este fenómeno intervienen una serie de factores concomitantes, contra los cuales la in­ tegridad de la habilidad de respuesta T depen­ diente a nivel de inmunidad celular, la síntesis de inteferón, la IgA secretoria inmune, etc., de­ sempeñan papeles críticos. Es de importancia, refiriéndonos aJ tema de respuesta inimine en infecciones virales, inser­ tar aquí un refuerzo del concepto de inmuniza­ ción. Obviamente, una vacuna clásica de virus herpes inactivado sólo será capaz de inducir efi­ cientemente anticuerpos contra antígenos de su­ perficie viral (neutralizantes) y muy poco o na­ da contra estructuras antigénicas internas. Una vacuna de este tipo será inútil, como lo ha de­ mostrado la experiencia, para producir un cam­ bio en el fenómeno de recurrencia, ya que estos individuos tienen un alto título de anticuerpos. 12. R espuesta inmune en hepatitis B Se conoce perfectamente la constelación de pruebas de laboratorio inespecíficas (desde el punto de vista de los agentes etiológicos), apli­ cadas al diagnóstico y seguimiento de los en­ fermos con hepatitis infecciosa. Desde el punto de vista epidemiológico, po­ demos reconocer la llamada hepatitis viral in­ fecciosa epidémica o hepatitis A, y la asociada fundamentalmente a transfusiones de sangre y aplicaciones parenterales o hepatitis B.

A fines de la década de 1970, científicos ita­ lianos describieron el virus de la hepatitis D (HDV) o Delta c¡ue sólo afecta a pacientes que también estén infectados con el HBV, existien­ do la co-infección y la sobreinfección. A fines de los años ’80, se describen los vi­ rus de la hepatitis C (HCV) y de la hepatitis E (HEV), ambos ARN virus, pero de diferente vía de transmisión = fundamentalmente parenteral para HCV y oral para HEV. En 1965, Blumberg evidenció la presencia, en la sangre de ciertos individuos, de un antíge­ no al que llamó Australiano. En la actualidad se acepta que este antígeno está asociado a la infección con el agente etiológico de la hepati­ tis B y se trata de la presencia, en la sangre de individuos infectados, de partículas completas (DAÑE) o partículas subvirales de este com­ plejo antigénico (véase fig. 27-4). La era del antígeno de Blumberg, como ha sido dado en llamarse al importante trabajo de investigación desarrollado en los últim os 1 0 años, ha permitido disponer de técnicas de la­ boratorio de discreta simplicidad, que brindan un enfoque específico al estudio de diagnóstico de las hepatitis infecciosas virales. La posibili­ dad de investigar en grandes grupos de pobla­ ción la presencia del antígeno asociado a la he­ patitis producida por el virus de la hepatitis B (HBV) ha permitido establecer la existencia de portadores de antígenos por períodos diversos que pueden alcanzar desde más de seis meses a años. Estudios epidem iológicos bien controlados han demostrado que la transfusión o los contac­

Inmunología en las infecciones virales tos parenterales con la sangre de portadores es capaz de transmitir la hepatitis B a los recepto­ res. El control de la sangre de los donantes, que permite eliminar a aquellos en los que se detec­ ta el antígeno asociado a hepatitis, disminuye drásticamente los casos postransfusionales. Esto justifica ampliamente la aplicación ruti­ naria de técnicas de detección en todos los ca­ sos de transfusión. Es necesario recordar que otros m ecanism os, adem ás de las p rácticas transfusionales y algunas de carácter yatrogénico (prácticas dentales, endoscopias, acupuntu­ ra, etc.), ayudan a mantener la endemia natural del virus en la naturaleza (ritos rehgiosos, ho­ m osexualidad m asculina, heterosexualidad, etc.). Antes de presentar un breve comentario so­ bre los aspectos relacionados con la respuesta inmune en hepatitis B conviene repasar los as­ pectos estructurales del agente (véase fig. 27-4). Recordemos que la infección humana con el HBV puede inducir distintos síndromes (véase gráfico en esta página). Veamos ahora algunos de los aspectos gene­ rales de la respuesta inmune en estos casos: a) Individuos refractarios Se conoce que un reducido número de indi­ viduos han recibido transfusiones de sangre provenientes de personas infectadas con HBV y no han respondido con desarrollo de enfer­ medad ni con la producción de una respuesta inmune detectable. El margen nulo de experi­ mentación en humanos, ya que estas com pro­

baciones provienen de interpretaciones fra g ­ mentarias de casos de accidentes, no perm ite ningún comentario para dar explicación de este hecho. Sin embargo es lícito pensar que, por problemas de receptores u otra causa, el agente no infecta células susceptibles y es degradado por mecanismos del huésped antes de que al­ cance a inducir una respuesta inmune detectable. En otros casos no hay enfermedad, pero sí resp u esta de anticuerpos fundam entalm ente contra HBsAg. b) Hepatitis viral aguda Uno de los hechos que caracteriza esta enfer­ medad por virus B es el largo y variable perío­ do de incubación, que media desde la exposi­ ción hasta la aparición de los síntomas. L a se­ cuencia de la cinética de los principales m arca­ dores se presenta en la figura 27-13. Antes de la aparición de los síntomas clínicos y de la elevación significativa en el suero del paciente de las aminotransferasas, puede detectarse en él HBsAg. Esto, junto con un alto título de ADN polimerasa viral en suero, son indicadores fe­ hacientes de una im portante síntesis de virus por parte de la célula hepática. El virus obviamente se replica en el hepato­ cito sin producir daño celular (Usis) “per se” y en la sangre de este individuo se encuentran partículas de DAÑE (42 nm) y una gran canti­ dad de HBsAg en su forma particulada de 20 nm y agrupaciones filamentosas. La aparición de síntomas clínicos y la elevación de las ami­ notransferasas coincide con la brusca aparición

HBV N a d a d e te c ta b le ( In d iv id u o s re fra c ta rio s ) H e p a titis v ira l a g u d a fu lm in a n te (m u e rte )

P o rta d o r o lig o s in to m á tic o o a s in to m á tic o

H u m a n o s s u s c e p tib le s

t

I n fe c c ió n in a p a re n te a n ic té ric a S in s in to m a to lo g ía c lín ic a su b je tiv a

H e p a titis p e rs is te n te

H e p a titis v i r a l ' aguda

R e c u p e ra c ió n con e lim in a c ió n d e fin itiv a d e m ai-cadores de r e p lic a c ió n v ira l

551

P e r s is te n c ia d e uno o m á s m a rc a d o re s d e r e p lic a c ió n v iral en e l in d iv id u o (d e fin itiv a o i n te rm ite n te )

D is p la s ia d e las c é lu la s -< * h e p á tic a s , h e p a to m a

H e p a titis viral c ró n ic a a g re s iv a

. C irro sis

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Inmunopatología F ig . 2 7 -1 3 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en la in fe c c ió n c o n v iru s d e la h e p a titis B . (C a s o d e h e ­ p a titis v ira l a g u d a re s u e lta .)

y el eJevado aumento en suero de anti-HBc, el anticuerpo contra la m asa antigénica interna del virión (core). En un tiempo poco definido y siempre que la recuperación general del enfer­ mo sea un hecho clínico, cae la concentración de HBsAg en suero. Sigue a esto un perío d o sin antig en em ia (HBsAg) detectable que puede extenderse por semanas y luego comienza a detectarse con una elevación muy lenta el anticuerpo anti-H Bs contra el antígeno de superficie. En una hepatitis viral aguda resuelta, no se detectan marcadores fehacientes de la replica­ ción del virus (ADN polimerasa y HBeAg en suero), y sí se observa una caída del anticuerpo anti-core y un mantenimiento del título de anti­ cuerpos anti-HBs. Este cuadro indica un buen pronóstico de la infección. Los anticuerpos anti-HBc son primero IgM y luego del tipo IgG y los anti-HBs son, en el caso de detectarse, del tipo IgG. El silencio serológico de HBsAg y anti-HBs durante el período de transición no se debe en realidad a una ausencia absoluta, sino a la falta de sensibilidad de las técnicas empleadas en su detección, ya que gran parte de la masa de cada uno de ellos se encuentra formando complejos inmunes. Es muy importante plantear la categórica di­ ferencia de la respuesta de anticuerpos antiHBc y la de anti-HBs. Cada vez se tiene más evidencia de que los antígenos de la estructura del core son realmente nuevos en el organismo humano, mientras que la constelación de poli­ péptidos que constituyen el antígeno HBsAg tendrían especificaciones tanto del virus como de algunas de las proteínas del hepatocito. El antígeno “e” del virus de la hepatitis B (HBeAg) se encuentra en el core de la partícula de DAÑE en forma críptica; es detectable en suero sim ultáneam ente con la aparición del HBsAg o poco tiempo después. El HBeAg per­ siste menos tiempo que el HBsAg en la mayo­ ría de los pacientes. El HBeAg es un marcador de infectividad y su presencia sugiere la conti­ nua actividad del HBV. Además, los inmuno-

complejos HBeAg-IgG se consideran inducto­ res de glomerulonefritis membranosa. La desa­ parición del HBeAg es seguida por la aparición de su anticuerpo, el anti-HBe. Esta seroconversión, que ocurre alrededor del pico de síntomas clínicos, indica que la enfermedad evoluciona favorablemente, pudiendo ser interpretada co­ mo probable recuperación y elim inación de clones productores de virus en el hígado del huésped (fig. 27-13). E stas co n sid eracio n es serán n uevam ente evaluadas al tratar las otras variables de la in­ fección con virus B. Es de importancia trabajar sobre el concepto de que la patología que desencadena el síndro­ me de hepatitis no es inducida por la replica­ ción viral “p er se”, sino por la serie de m eca­ nismos que siguen a la respuesta del individuo y que generan el daño celular del hepatocito. La imagen microscópica de la biopsia hepá­ tica se caracteriza predominantemente por in­ filtración m ononuclear linfocitaria. Los estu­ dios de la respuesta de inmunidad celular en la hepatitis viral aguda no arrojan resultados uni­ formes, pero orientan hacia la comprensión de su importante papel en la inducción de patolo­ gía. Algunos autores han encontrado una pro­ ducción aumentada del factor inhibitorio de la migración de macrófagos, cuando linfocitos de pacientes tomados entre la iniciacióti y el pico de tra n sa m in a sa s fu e ro n e n fre n ta d o s con HBsAg purificado. Otros autores han hallado un aumento de la respuesta celular específica en la iniciación de la convalecencia, cuando el antígeno HBsAg deja de detectarse en suero. Existen resultados que indiean, en enfermos agudos, una respuesta linfocitaria activa contra HBeAg. Esta tuvo una intensidad de aproxima­ damente el doble eon relación a cuándo se estu­ dió la inducida en los mismos pacientes contra HBsAg. Otros autores han relatado que durante la fase aguda y la convalecencia temprana se produce un aumento del número relativo de cé­ lulas hiporreactivas (mull cells) que pueden al­ canzar un valor del 25% del total de linfocitos periféricos en el máximo período de supresión.

Inmunología en las infecciones virales La interpretación de todos estos datos, no siempre discrepantes, semeja un rompecabezas, en el que faltan piezas y el juego consiste en armar lo más posible y diseñar los estudios faltantes para completar la imagen final. c) Hepatitis viral aguda fulminante Algunas hepatitis virales agudas inducidas por virus B, con desenlace fatal, siguen ei cua­ dro general ya planteado con la sola e im por­ tante excepción de que en forma muy tempra­ na, y precediendo a la instalación de los graves signos y síntomas que preceden a la muerte, se detecta un aumento marcado de anti-HBs. El reducido número de casos estudiados no perm i­ te aún correlacionar este aumento de anti-HBs y el desenlace fatal, pero obviamente abre aun más el camino a la hipótesis de que el daño he­ pático estaría relacionado con la exclusión por citóli.sis de células hepáticas nobles afectadas por mecanismos inmunes y no por acción di­ recta del virus. En cuanto a si ese mecanismo es dependien­ te o no de anticuerpo circulante es materia de estudio. d) Infección con persistencia de uno o más marcadores de replicación viral en el individuo Un porcentaje no conocido de los individuos que se infectan (independientemente de que de­ sarrollen o no una hepatitis aguda o una infec­ ción con sintomatología en niveles que no lle­ van al individuo a requerir atención médica) pueden evolucionar en forma que la respuesta inmune y otros parámetros involucrados deter­ minen la no ehminaeión de hepatocitos persis­ tentemente infectados, los que continúan, prpduciendo virus completos y partículas suf)yirales, como la partícula de 2 0 nm correspondien­ te a HBsAg. C asuísticas efectuadas m ediante estudios controlados indican que un 5% de las hepatitis agudas tipo B evolucionan a la persistencia. Este dato es para áreas epidemiológicas deter­ minadas y no puede generalizarse, pero da una idea del problema. Como se presentó en el diagrama, el estado de persistencia viral en el hígado puede estar acompañado de una gama de otros hechos que condicionan polos didácticos de clasificación, y cuya definición es muchas veces imposible. Estos son; dj) Portador oligosintomático o asintomático. d^) Hepatitis persistente. d,) Hepatitis viral crónica agresiva.

d ,)

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P o r t a d o r o l ig o s in t o m á t ic o o a s in t o m á t ic o

Este individuo está definido como aquel que sin sentir ninguna sintomatología, o síntom as muy ligeros que no obligan a la consulta espe­ cífica, y que por razones diversas, pero funda­ mentalmente por su intento de donar sangre, es detectado como portador de HBsAg en su san­ gre. Es necesario añadir, para ampliar la defini­ ción, que no debe ser alcohólico ni drogadicto, y que se demuestre que tiene antígeno HBsAg detectable en sangre por un período mayor de 6 meses. Además del estudio completo deberá te­ nerse en cuenta que una punción biopsia de h í­ gado no revele ningún tipo de patología defini­ ble. Los estudios referentes a otros parámetros como aminotransferasas, otras enzimas, facto ­ res de coagulación, etc. deberán corresponder a límites de normalidad. En la figura 27-14 planteamos el perfil de n i­ veles de antigenemia y otros datos relacionados con la respuesta inmune en un portador. En él se ve como elemento definitorio un alto y con­ tinuo título de anticuerpos anti-HBc, acom pa­ ñando la presencia de HBsAg. Es prácticam en­ te nula la posibilidad de detectar en estos indi­ viduos anti-HBs. Estudios de inmunidad celular han dem ostra­ do que los linfocitos no tienen ninguna re s ­ puesta activa cuando se utiliza HBsAg p u rifi­ cado como antígeno inductor en las pruebas in vitro. En nuestro seguimiento de una serie de p o r­ tadores asintomáticos detectada en el banco de sangre, 80% de los casos estudiados con evolu­ ción favorable presentaron detección de antiHBe y no pudo demostrarse HBeAg. d^ y dj)

H e p a titis p e r s is te n te y h e p a titis v ir a l

CRÓNICA a g r e s i v a

A quí conviene introducir un concepto que tiene que ver con el armado del rompecabezas inmunológico de la infección con virus B. Resulta, como hemos visto, que la infección puede causar una hepatitis viral que va desde el síndrome fulminante, con altos y abruptos te­ nores de bilirrubinemia pre mortem, a formas agudas severas eon franca bilirrubinemia, altos niveles de aminotransferasas y aguda presencia de síntom as subjetivos (anorexia, cansancio, etc.) y, por último, formas muy leves hasta ne­ tamente anictéricas. El concepto a que hacíamos referencia es el que perm ite aceptar que cuanto más leve sea e] cuadro y preferentemente las formas anictéri­ cas, más tendencia tienen estas infecciones a generar el estado de persistencia. La diferencia entre un cuadro de hepatitis vi­ ral p ersisten te y una h epatitis viral cró n ica

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Inmunopatología

F ig . 2 7 -1 4 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s e n la in fe c c ió n co n v iru s d e la h e p a titis B , e n in d iv id u o s o lig o s in to m á tico s o a s in to m á tic o s (p o rta d o re s).

agresiva tiene que ver con las imágenes de pa­ tología del tejido hepático y, en obvia relación con ella, la sintomatología y la signología que se acompaña. Aproximadamente el 5 al 10% de los pacientes con hepatitis viral aguda tipo B desarrollan formas crónicas. El HBeAg y la ADN polim erasa viral en suero (no incluidas en la figura 27-15 por razo­ nes de claridad) también son francamente de­ tectados en el período de enfermedad asinto­ mática, y en realidad es probable que en canti­ dades no detectables se sinteticen en forma per­ manente en este tipo grave de infección. Siempre, en estos casos, altos títulos de antiHBc acompañan la evolución. La incapacidad de desairollar una respuesta policlonal eficiente de anti-HBs en este tipo de pacientes puede ser interpretada como un m e­ canismo de “tolerancia” sobre el que no dispo­ nemos de evidencias experimentales. En cuanto al perfil de la respuesta inmune, y con referencia especial a la hepatitis viral cró­ nica agresiva, vemos en la figura 27-15 un dia­ grama de la evolución de los marcadores más importantes, a manera de ejemplo que refleja los resultados de algunos casos estudiados por nuestro grupo. Lo importante es que la presen­ cia de HBsAg y anti-HBs se alternan de forma que se fluctúa entre la formación de inmunocomplejos en exceso de antígeno y la situación inversa, con la formación de inmunocomplejos en exceso de anticuerpos. Esta es la razón por la cual es necesario utili­ zar técnicas apropiadas para su detección. Por ejemplo la contrainm unoelectroforesis (CIE) no detecta ni antígeno ni anticuerpo en los pe­ ríodos de cantidades equivalentes, mientras que

el radioinmunoensayo sí detecta a ambos. Esto habla claro de la eficiencia de la CIE para de­ tección de HBsAg en portadores. La contrain­ munoelectroforesis, en el seguimiento de pa­ cientes, muestra una eficiencia con respecto al RIA que no pasa del 40%, mientras que en da­ dores de sangre llega al 75% de lo que se de­ tecta con RIA. El cuadro de complejidad de la respuesta in­ mune en la hepatitis crónica agresiva explica “per se” cómo estos casos, en un gran número, evolucionaron a la fibrosis y culm inan como síndromes cirróticos. Como indicador adicional de replicación vi­ ral también encontraremos aquí un alto nivel de anti-HBc. e)

C o r o la r io

Q ueda así aclarado que la p ato g en ia que acompaña a la hepatitis viral inducida por el vi­ rus tipo B tíene un componente fundamental en la respuesta inmune. El agente tiene una acción citopática muy limitada o nula y es común en­ contrar hepatocitos productores de virus (reve­ lados por inmunofluorescencia o microscopia electrónica) perfectamente conservados citológicamente. En portadores asintom áticos, una cantidad de material viral se vuelca al torrente sanguí­ neo, sin indicios de daño celular hepático. Las lesiones hepáticas pueden estar modula­ das por la respuesta inmune celular y humoral. Daño hepático: e,) Ataque a antígenos virales en la superfi­ cie de las células infectadas.

Inmunología en las infecciones virales

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F ig . 2 7 -1 5 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en l a in fe c c ió n c o n v iru s h e p a titis B co n p e rs is te n c ia d e s ín te s is v ira l y s in t o m a t o lo g í a p e r i ó d i c a (h e p a titis c ró n ic a a c tiv a ).

e^) A taque a antígenos modificados (hués­ ped-virus) de la superficie celular. Daño extrahepático: Acción mediada por inmunocompiejos. Existe marcada evidencia de que la respuesta humoral mediada a través de interacciones di­ rectas antígeno-anticuerpo, activación de com ­ plem ento y citotoxicidad anticuerpo-depen­ diente, no .son causa primíiria de lesión de hepatocitos. Este concepto se apoya en datos en­ tre los cuales los más relevantes incluyen el he­ cho de que la inoculación de anticuerpos antiHBs a portadores de HBsAg no induce nin­ gún daño detectable del hepatocito, explorado por técnicas convencionales de laboratorio y un estudio clínico minucioso. Si bien el anti-H Bc aparece concom itante con el daño hepático, el anti-HBs aparece en la convalecencia, en total ausencia de HBsAg, y es sign o de re c u p e ra c ió n del p acie n te. El abrupto aumento de anti-HBs en la hepatitis fulm inante resulta paradójico y aún no tiene explicación. Otro dato que apoya una patogenia no de­ pendiente de anticuerpos lo constituye la obser­ vación de que pacientes con agammaglobuline­ mia que desarrollan hepatitis B, tienden a dar formas más severas, a menudo fatales, cuando se com paran con la evolución de individuos normales. La clara infiltración monocitaria linfocítica de las lesiones hepáticas abre ya camino a pen­ sar en una dependencia de la actividad inmune celular en la destrucción del hepatocito. Ha sido demostrado que individuos con defectos en la inmunidad mediada por células desarrollan he­ patitis inducidas por infección con virus B m u­ cho más leves que las personas normales. La in­ munosupresión resulta en una disminución de la sintomatología en los procesos crónicos.

Por último, linfocitos o factor de transferen­ cia obtenidos de individuos convalecientes de hepatitis B, administrados a pacientes que so­ brellevan una hep atitis crónica, inducen un agravamiento temporal de la severidad del cua­ dro de hepatitis en todos sus parámetros. Lesiones extrahepáticas Durante la hepatitis viral aguda tipo B, y no en la A, los síntomas que siempre acompañan el cuadro general son aquellos derivados de la formación y el procesamiento de inmunocomplejos. Se hacen evidentes en piel con peque­ ñas petequias, exantema, dolores articulares y alteración de los pequeños capilares. También se ha descrito una breve reacción sistém ica comparable con el síndrome de la enfermedad del suero, que es prodróm ico, y que precede hasta en seis semanas a la aparición de los sín­ tomas. La importancia de los inm unocomplejos en el desarrollo de la evolución hacia la persisten­ cia viral o no, es material de estudio. Apéndice de aplicación práctica Existen equipos de laboratorio, fundamental­ mente basados en enzimoinmunodetección, con los cuales se pueden explorar cualitativamente la presencia o la ausencia de los distintos m ar­ cadores. Un estudio completo de una hepatopatía que se sospecha de origen viral incluiría la lógica a p licació n de una can tid ad de p ru eb as. En nuestra experiencia, resulta muy práctico el uso de solamente tres para el inicio de un estudio serológico de un paciente. En el cuadro 27-3 se expone la interpreta­ ción más probable.

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Inmunopatología

Cuadro 27-3 H BsAg

Aníi-H Bc

Ig M anti-H A V

Interpretación

1

)+

H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en in cu b a c ió n

2

)+

H e p a titis v iral a g u d a tip o B p o rta d o r c ró n ic o o h e p a to p a tía c ró n ic a

3)^

H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en la c o n v a le c e n c ia , p e rio d o d e s ile n c io s e ro ló g ic o d e l s is te m a d e s u p e rfic ie o iie p a titis tip o B d e la rg a d a ta

4 )-

H e p a titis v ira l a g u d a tip o A

5 )-

H e p a titis n o A n o B

6

)+

H e p a titis v iral a g u d a tip o A c o n las v a ria n te s d e 2)

13. Respuesta inmune en la infección con HIV (agente desencadenante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida - SIDA) El SIDA (AIDS, notación inglesa) está ca­ racterizado por una deficiencia básica de la in­ munidad celular, sin otra causa primaria cono­ cida que la infección viral, y es acompañado por un conjunto de anormalidades inmunológi­ cas y neurológicas que culminan con un dete­ rioro del sistema linfoide y que, generalmente, puede conducir a la m uerte del paciente por aparición de infecciones oportunistas o neopla­ sias. Agente etiológico El virus causante del SIDA (véase fig. 27-5) fue descubierto en forma casi simultánea por el grupo de Montagnier, en el Instituto Pasteur de París (Francia) bajo la denom inación de LAV (“lymphoadenopathy-associated-virus”), por el equipo de Gallo, en el Instituto Nacional de Cáncer (EE.UU.), con el nombre de HTLVIII (“H uman-T cell lym photropic virus, type III”), y por Levy en San Francisco (EE.UU.), como ARV (“AIDS-related virus”), habiéndo­ se adoptado a partir de junio de 1986 en la n o ­ menclatura internacional las siglas VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) o HIV (nota­ ción inglesa), que es la reconocida en todo el mundo. Recientemente se ha aislado un nuevo retrovirus de pacientes con SIDA que viven en el oeste de África. Este nuevo virus, denominado HIV-II, tiene una glucoproteína de envoltura relacionada con el SIV (virus de la inmunodefi­ ciencia de los simios). Existen grandes diferen­ cias de secuencias entre los dos tipos de HIV. Los anticuerpos contra la glucoproteína de su­ perficie del HIV tipo I tienen una reactividad parcial cruzada con el HIV tipo II. Lo mismo ocurre con los anticuerpos dirigidos contra las

proteínas del core de ambos virus. Por lo tanto, se ha concluido que el SIDA es un síndrome que puede ser causado por uno o más virus di­ ferentes, pero relacionados entre sí. Taxonóm icam ente pertenecen a la fam ilia Retroviridae, género Lentivirus y están consti­ tu id o s por ácido rib o n u cleico (A R N ), una transcriptasa reversa, proteínas estructurales y glucoproteínas de envoltura. Las partículas ma­ duras tienen un diámetro de 1 1 0 a 1 2 0 nm. Se reconocen en el genoma del HIV diferen­ tes genes, gag, que codifica para las proteínas de la n u cleo cáp sid e: p ro teín a de la m atriz (MA), proteína de la cápside (CA) y núcleo proteína (NC); el gen pro codifica para la proteasa (PR); el p o l codifica para la integrasa (IN) y para la transcriptasa reversa (TR) y el env que codifica la glucoproteína de transmem­ brana (TM) y las glucoproteínas de superficie (SU). Además, contiene por lo menos seis genes adicionales que codifican proteínas con funcio­ nes reguladoras, es decir, funciones que afectan ei grado de expresión del HIV y la naturaleza de las partículas virales que se producen. Estos genes se traducen en diversas proteínas, de las cuales las más estudiadas son “tat” y “Rev” . La proteína tat (activador-trans) se une a una se­ cuencia de ARN (elemento tar) y, junto con otras proteínas, incrementa en unas cien veces la cantidad de transcriptos de HIV que se for­ man. La proteína “R ev” se une a otra secuencia y promueve el transporte al citoplasma de canti­ dades crecientes de aquellas especies de ARN mensajeros que codifican las proteínas estruc­ turales del HIV. Las funciones de las proteínas reguladoras son menos claras. El conocimiento alcanzado en la estructura y la biología moleculares del virus, desde su ais­ lamiento a la actualidad, revela la tremenda po­ tencialidad de los científicos para dar respuesta a un problema que emerge a principio de la dé­ cada del ‘80.

Inmunología en las infecciones virales Respuesta inmune humoral a la infección p or H IV Obviaremos datos de epidemiología y trans­ misión que no encuadran en esta presentación y haremos una brevísima referencia a la evolu­ ción de la respuesta inmune. Ésta nos ayuda a rescatar un nuevo modelo y a tener inform a­ ción que permita orientar diagnóstico y pronós­ tico de la infección. Cuando un virus como el HIV penetra en la célula, una enzima exclusiva de los Retrovirus, llam ada transcriptasa inversa, transform a en ADN el material genético (ARN) que éstos p o ­ seen. Ese ADN se integra al material genético celular y a partir de ese momento cada vez que la célula huésped se divida, las células hijas contendrán también genes virales. Estos genes virales, según su estado de expresión, codifican para proteínas virales. En el máximo estado permisivo (replicación viral) inducen la síntesis de: a) proteínas estructurales internas o del core (gag) identificadas como p24, p25, (CA), p. 17 (MA), p7 (NC) y el precursor del gag p55; b) enzim as com o la transcrip tasa reversa (TR, p 6 6 ) y la integrasa (IN, p32); c) proteínas de la envoltura que con diversos azúcares configuran las g lu c o p ro te ín á s id e n tific a d a s co m o SU (gpl20) y TM(tp 41), y d) otras poteínas cu­ yo papel aún se desconoce. Cuando se efectúa el seguimiento de la in­ fección por HIV, el primer marcador serológico detectable es el antígeno p24 (CA) del HIV generado por amplificación viral en las células blanco (fundamentalmente linfocitos TCD^+). La antigenemia aparece de dos a cuatro se­ manas después de la infección y persiste duran­ te ocho a diez semanas como se observa en la figura 27-16.

557

Los anticuerpos contra el core son los p ri­ meros en aparecer, aproximadamente cinco se­ manas a partir de la infección por HIV, y fu e­ ron detectados en el 75-95% de los enfermos con SIDA o síndromes relacionados. Los an ti­ cuerpos contra la envoltura se detectarían a partir de la 5- a 1- semanas posinfección; su declinación constituye signo evidente de d ete­ rioro del estado general del paciente. Junto con la disminución de la concentración de los anti­ cuerpos core, el antígeno vuelve a ser detecta­ do y esta inversión serológica generalm ente precede al comienzo de los síntomas clínicos del SIDA. La interpretación del papel de los anticuer­ pos, inmunocomplejos y el resto de la constela­ ción de hechos asociados a la respuesta inmune son aún difíciles de ordenar. Puede haber individuos portadores del virus con serología negativa, tratándose de portado­ res o enfermos con déficit inmunológico. Este hecho, sin embargo, es excepcional. Durante la fase asintomátiea de la infección por HIV se detectan en suero anticuerpos con­ tra el core y anticuerpos contra la envoltura (fig. 27-16). Anom alías inm unológicas en la infección por H IV El trastorno inmunitario de esta infección se caracteriza por anomalías cuantitativas y cuali­ tativas de la población linfocitaria, esp ecial­ mente en los linfocitos que expresan en su su­ perficie el receptor CD^“^, denominados ta m ­ bién linfocitos T4 (linfocitos cooperadores). Si bien se han comunicado alteraciones fun­ cionales en los distintos componentes del siste­ ma inmune y en otros sistemas del organismo,

Serología del HIV

Fig. 27-16. N iveles séricos de antígenos y anticuerpos en la infección por HIV.

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Inmunopatología

la anomalía básica de la infección por HIV es la destrucción de la población linfocitaria T4 ocasionada por el HIV. Además de infectar las células T se ha demostrado que el HIV puede infectar: mono­ citos de sangre periférica, líneas celulares monocíticas, diversos macrófagos tisulares, célu­ las dendríticas, células microgliales del cere­ bro; todos tipos celulares que expresan el re­ ceptor CD^ en sus membranas plasmáticas. Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in­ ducida por el HIV están relacionados con la particularidad de estos virus de reducir la capa­ cidad funcional de los linfocitos T periféricos y de las células presentadoras de antígenos, e in­ hibir la producción y maduración de precurso­ res de las células T, por lo que afectaría en can­ tidad y calidad el número de células T periféri­ cas. A n o m a lía s c u a n ti ta t iv a s d e l o s T 4

En los casos que concuerdan con la defini­ ción aceptada de SIDA, la anomalía más evi­ dente es la linfopenia, en contraste con el nú­ mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es normal o aumentado. Se utiliza el cociente en­ tre el número absoluto de TCD4+ y el número absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte­ ra c ió n . E s te c o c ie n te o re la c ió n T C D 8 “" TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi­ ficación. Tanto la linfopenia como el descenso de la relación TCD4+n’CD8^, varían según el tiempo de evolución y la gravedad del caso. Por lo ge­ neral, la anom alía se va acentuando, y llega paulatinamente a su expresión más intensa en los pacientes de fase terminal. En los pacientes con SID A los linfocitos TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan­ te. En los pacientes con “complejo relacionado con el SIDA”, la alteración no es siempre tan evidente, y en algunos casos oscila en períodos de mayor o menor intensidad. Conviene destacar que estas anom alías no son específicas de la infección por HIV, y pue­ den encontrarse en otros procesos infecciosos o no. Existe generalmente anergia cutánea a diver­ sas intradermorreacciones, especialmente a la candidina y tuberculina. Como otras anomalías descritas, su presentación se hace con grado variable de intensidad a lo largo de la evolu­ ción, pero en los pacientes con formas termina­

les de la enfermedad, las pruebas cutáneas no detectan ninguna reacción. O t r a s a n o m a l ía s in m u n e s

Se atribuyen generalmente a las anomalías de la población T CD^+. Se han descrito: a) un aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b) una disfunción de la actividad macrofágica y de eitotoxicidad, y c) un aumento de la (32-microglobulina sérica. Esto ha sido comunicado como indicador de evolución a formas graves. Nunca antes había sido producida en tan cor­ to tiempo tal cantidad de publicaciones científi­ cas sobre una enfermedad humana como ha su­ cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos obtenidos sobre la biología molecular, la clíni­ ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de eventuales microorganismos y el problema so­ cial son el resultado de una extraordinaria deci­ sión del hombre para vencer el problema. Como norma para cerrar este capítulo, pode­ mos decir que es necesario conocer aun más la patogenia y la respuesta inm une para actuar con drogas y/o inmunógenos en un desequili­ brio tan complejo como el que genera el HIV.

BIB L IO G R A FIA 1. C o to , C y d e T o rre s , R A: N a tu ra le z a y e s tru c tu ra de lo s v iru s a n im a le s . S e rie d e U ro lo g ía . É D IG E N , B u e ­ n o s A ire s , 1983. 2. F ra e n k e l-C o n ra t, H y Vv'agner, R R (e d s). V ir u s - h o s t in te ra c tio n s . Im m u n ity to v iru s e s . C om prehensive Virology. V o l 15, 1979, P le n u m . 3. S is so n s , J G P y O ld s to n e , M : f to s t r e s p o n s e to v ira l in fe c tio n s. E n : Virology. B e rn a rd E ie ld E d ito r. R a v e n P re ss B o o k . N u e v a Y o rk, 1985. 4. K a rc h e r, D , L o w e n th a l, A y S tro s b e rg , A D: H um oral im m unity in neurologicai diseases. P le n u m P re ss . N u e ­ v a Y o rk , 1979. L e n n e tte , E; S p a u ld in g , E y T ru a n t, J P: M a n u a l o f cli­ nical m icrobiology. 2® ed , A m e ric a n S o c ie ty f o r M i ­ c ro b io lo g y . W a s h in g to n D C , 1974, 6. N o tk in s , A L : V iral im m unology a n d im m unopathology. N a tio n a l In s titu te s o f H ea lt. A c a d e m ic P r e s s , N u e v a Y o rk , 1975. 7. R o s e , N y F rie d m a n , H : M a n u a l o f clinical im m u n o ­ logy. A m e ric a n S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n D C , 1976. 8. E p s te in , A ; V iru s h e rp e s sim p le x , u n v iru s n o tatt s im ­ p le. E n : C o to , C; C a c c h io n e , R y d e T o rre s , R A (ed s). A d e la n to s en M ic ro b io lo g ía y E n fe rm e d a d e s I n fe c c io ­ sas. V o l. 5, B u e n o s A ire s , 1986. 9. N ie d fe ld , G ., M in v ie lle , M . G e n e ra lid a d e s d e l s is te m a in m u n e . F a s c í c u l o 1. C o l e c c i ó n C á t e d r a E d i t o r i a l U .N .L .P . 1994. 10. S c h a e c h te r, M e d o ff y c o l. M ic r o b io lo g ía 2- ed . ííd it. M é d ic a P a n a m e ric a n a , 1994.

Autoinmunidad

CLELIA RIERA JULIANA LEON! NORA YRANZO-VOLONTÉ

AUTOINMUNIDAD Se denomina autoinmunidad a la respuesta inmune contra componentes propios, y es debi­ da a la presencia de linfocitos T o B autorreactivos. En condiciones normales, los m ecanis­ mos de tolerancia a lo propio protegen al indi­ viduo de estas células potencialm ente autorreactivas. Hasta la década del ’60 se creía que los lin­ focitos autorreactivos eran eliminados durante el desarrollo del sistema inmune y que, por una falla en su eliminación, se implantaba la enfer­ medad autoinmune. A fines de los años ’70 nu­ m erosos hallazgos han contribuido a revelar que no todos los linfocitos T y B autorreactivos son eliminados durante su maduración. Por en­ de, individuos normales poseen en su circula­ ción linfocitos autorreactivos, cuya presencia no indica necesariamente un estado patológico autoinmune ya que su actividad seguramente es regulada mediante clones anérgicos o supreso­ res. Una ruptura de esta regulación puede lle­ var a la activación de las células autorreactivas T o B, generando una respuesta humoral o ce­ lular contra antígenos propios. Estas reacciones pueden causar serios daños a células u órganos, que a veces tienen consecuencias fatales. En este capítulo se describirán algunas en­ fermedades autoinmunes humanas y modelos en animales de experimentación, como también los mecanismos que pueden contribuir al de­ sencadenamiento de la autoinmunidad. Las enfermedades autoinmunes se caracteri­ zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin­ focitos T sensibilizados contra diferentes ma­ cromoléculas del organismo, que en individuos normales son reconocidas como propias y por lo tanto no desencadenan respuesta. El recono­

28 cimiento de lo propio es el principio central del funcionamiento del sistema inmune que no se contrapone al desarrollo de enfermedades au­ toinmunes, sino que permite explicar su apari­ ción a través de disturbios en el equilibrio in­ mune, el que se autorregula constantemente en respuesta a señales internas y externas. La capacidad del sistema inmune para discri­ m inar entre lo propio y lo extraño es adquirida en primer lugar en el timo, durante la m adura­ ción de los linfocitos T. Los tim ocitos auto­ rreactivos específicos para antígenos expresa­ dos intratímicamente y presentados en asocia­ ción con moléculas del complejo mayor de his­ tocom patibilidad (MHC) son elim inados du­ rante el desarrollo y maduración del timo. Esto se m anifiesta en la elim inación de clones de linfocitos T que reconocen antígenos propios expresados sobre la superficie de linfocitos T y B, m acrófagos, células dendríticas y células epiteliales. Las células T que reconocen antíge­ nos propios que no están presentes en el timo no son eliminadas y permanecen en el organis­ mo, siendo un peligro potencial para el mismo. L a respuesta inm une a antígenos propios puede observarse en individuos normales, pero la potencialidad para desarrollar autoinm uni­ dad está controlada por diferentes mecanismos: linfocitos T supresores, interacciones idiotipoantiidiotipo, bloqueo de receptores celulares por antígenos circulantes, etc. Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta autoinmune de la enfermedad autoinmune. La respuesta autoinmune es la demostración de la existencia de autoanticuerpos que reconocen antígenos propios o la reactividad de linfocitos sensibihzados contra un antígeno propio; esta respuesta puede estar asociada o no con una en­ fermedad autoinmune. En medicina clínica hay

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Inmunopatología

la anomalía básica de la infección por HIV es la destrucción de la población linfocitaria T4 ocasionada por el HIV. Además de infectar las células T se ha demostrado que el HIV puede infectar: mono­ citos de sangre periférica, líneas celulares monocítieas, diversos macrófagos tisulares, eélu­ las dendríticas, células microgliales del cere­ bro; todos tipos celulares que expresan el re­ ceptor CD^ en sus membranas plasmáticas. Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in­ ducida por el HIV están relacionados con la particularidad de estos virus de reducir la capa­ cidad funcional de los linfocitos T periféricos y de las células presentadoras de antígenos, e in­ hibir la producción y maduración de precurso­ res de las células T, por lo que afectaría en can­ tidad y calidad el número de células T periféri­ cas. A n o m a l ía s c u a n t it a t iv a s d é l o s T 4

En los casos que concuerdan con la defini­ ción aceptada de SIDA, la anomalía más evi­ dente es la linfopenia, en contraste con el nú­ mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es normal o aumentado. Se utiliza el cociente en­ tre el número absoluto de TCD4+ y el número absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte­ ra c ió n . E s te c o c ie n te o re la c ió n T C D 8 “" TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi­ ficación. Tanto la linfopenia como el descenso de la relación TCD4+n’CD8^, varían según el tiempo de evolución y la gravedad del caso. Por lo ge­ neral, la anom alía se va acentuando, y llega paulatinamente a su expresión más intensa en los pacientes de fase terminal. En los pacientes con SID A los linfocitos TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan­ te. En los pacientes con “complejo relacionado con el SIDA”, la alteración no es siempre tan evidente, y en algunos casos oscila en períodos de mayor o menor intensidad. Conviene destacar que estas anom alías no son específicas de la infección por HIV, y pue­ den encontrarse en otros procesos infecciosos o no. Existe generalmente anergia cutánea a diver­ sas intradermorreacciones, especialmente a la candidina y tuberculina. Como otras anomalías descritas, su presentación se hace con grado variable de intensidad a lo largo de la evolu­ ción, pero en los pacientes con formas termina­

les de la enfermedad, las pruebas cutáneas no detectan ninguna reacción. O t r a s a n o m a l ía s in m u n e s

Se atribuyen generalmente a las anomalías de la población T CD^+. Se han descrito: a) un aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b) una disfuneión de la actividad macrofágica y de citotoxicidad, y c) un aumento de la (32-microglobulina sérica. Esto ha sido comunicado como indicador de evolución a formas graves. Nunca antes había sido producida en tan cor­ to tiempo tal cantidad de publicaciones científi­ cas sobre una enfermedad humana como ha su­ cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos obtenidos sobre la biología molecular, la clíni­ ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de eventuales microorganismos y el problema so­ cial son el resultado de una extraordinaria deci­ sión del hombre para vencer el problema. Como norma para cerrar este capítulo, pode­ mos decir que es necesario conocer aun más la patogenia y la respuesta inm une para actuar con drogas y/o inmunógenos en un desequili­ brio tan complejo como el que genera el HIV.

BIB L IO G R A FIA 1. C o to , C y d e T o rre s , R A: N a tu ra le z a y e s tru c tu ra de lo s v iru s a n im a le s . S e rie d e U ro lo g ía . E D IG E N , B u e ­ n o s A ire s , 1983. 2. F ra e n k e l-C o n ra t, H y Vv'agner, R R (e d s). V ir u s - h o s t in te ra c tio n s . Im m u n ity to -virases. C om prehensive Virology. V o l 15, 1979, P le n u m . 3. S is so n s , J G P y O ld s to n e , M : H o s t r e s p o n s e to v ira l in fe c tio n s. E n : Virology. B e rn a rd F ie ld E d ito r. R a v e n P re ss B o o k . N u e v a Y o rk , 1985. 4. K a rc h e r, D , L o w e n th a l, A y S tro s b e rg , A D: H um oral im m unity in neurological diseases. P le n u m P re ss . N u e ­ v a Y o rk , 1979. 5. L e n n e tte , E; S p a u ld in g , E y T ru a n t, I P: M a n u a l o f cli­ nical m icrobiology. 2® ed , A m e ric a n S o c ie ty f o r M ic ro b io lo g y . W a s h in g to n D C , 1974. 6. N o tk in s , A L : V iral im m unology a n d im m unopathology. N a tio n a l In s titu te s o f H ea lt. A c a d e m ic P r e s s , N u e v a Y o rk , 1975. 7. R o s e , N y F rie d m a n , H : M a n u a l o f clinical im m u n o ­ logy. A m e ric a n S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n D C , 1976. 8. E p s te in , A ; V iru s h e rp e s sim p le x , u n v iru s n o tan s im ­ p le. E n : C o to , C; C a c c h io n e , R y d e T o rre s , R A (ed s). A d e la n to s en M ic ro b io lo g ía y E n fe rm e d a d e s I n fe c c io ­ sas. V o l. 5, B u e n o s A ire s , 1986. 9. N ie d fe ld , G ., M in v ie lle , M . G e n e ra lid a d e s d e l s is te m a in m u n e . F a s c í c u l o 1. C o l e c c i ó n C á t e d r a E d i t o r i a l U .N .L .P . 1994. 10. S c h a e c h te r, M e d o ff y c o l. M ic r o b io lo g ía 2- ed . E d it. M é d ic a P a n a m e ric a n a , 1994.

Autoinmunidad

CLELIA RIERA JULIANA LEON! NORA YRANZO-VOLONTÉ

AUTOINMUNIDAD Se denomina autoinmunidad a la respuesta inmune contra componentes propios, y es debi­ da a la presencia de linfocitos T o B autorreactivos. En condiciones normales, los m ecanis­ mos de tolerancia a lo propio protegen al indi­ viduo de estas células potencialm ente autorreactivas. Hasta la década del ’60 se creía que los lin­ focitos autorreactivos eran eliminados durante el desarrollo del sistema inmune y que, por una falla en su eliminación, se implantaba la enfer­ medad autoinmune. A fines de los años ’70 nu­ m erosos hallazgos han contribuido a revelar que no todos los linfocitos T y B autorreactivos son eliminados durante su maduración. Por en­ de, individuos normales poseen en su circula­ ción linfocitos autorreactivos, cuya presencia no indica necesariamente un estado patológico autoinmune ya que su actividad seguramente es regulada mediante clones anérgicos o supreso­ res. Una ruptura de esta regulación puede lle­ var a la activación de las células autorreactivas T o B, generando una respuesta humoral o ce­ lular contra antígenos propios. Estas reacciones pueden causar serios daños a células u órganos, que a veces tienen consecuencias fatales. En este capítulo se describirán algunas en­ fermedades autoinmunes humanas y modelos en animales de experimentación, como también los mecanismos que pueden contribuir al de­ sencadenamiento de la autoinmunidad. Las enfermedades autoinmunes se caracteri­ zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin­ focitos T sensibilizados contra diferentes ma­ cromoléculas del organismo, que en individuos normales son reconocidas como propias y por lo tanto no desencadenan respuesta. El recono­

28 cimiento de lo propio es el principio central del funcionamiento del sistema inmune que no se contrapone al desarrollo de enfermedades au­ toinmunes, sino que permite explicar su apari­ ción a través de disturbios en el equilibrio in­ mune, el que se autorregula constantemente en respuesta a señales internas y externas. La capacidad del sistema inmune para discri­ m inar entre lo propio y lo extraño es adquirida en primer lugar en el timo, durante la m adura­ ción de los linfocitos T. Los tim ocitos auto­ rreactivos específicos para antígenos expresa­ dos intratímicamente y presentados en asocia­ ción con moléculas del complejo mayor de his­ tocom patibilidad (MHC) son elim inados du­ rante el desarrollo y maduración del timo. Esto se m anifiesta en la elim inación de clones de linfocitos T que reconocen antígenos propios expresados sobre la superficie de linfocitos T y B, m acrófagos, células dendríticas y células epiteliales. Las células T que reconocen antíge­ nos propios que no están presentes en el timo no son eliminadas y permanecen en el organis­ mo, siendo un peligro potencial para el mismo. L a respuesta inm une a antígenos propios puede observarse en individuos normales, pero la potencialidad para desarrollar autoinm uni­ dad está controlada por diferentes mecanismos: hnfocitos T supresores, interacciones idiotipoantiidiotipo, bloqueo de receptores celulares por antígenos circulantes, etc. Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta autoinmune de la enfermedad autoinmune. La respuesta autoinmune es la demostración de la existencia de autoanticuerpos que reconocen antígenos propios o la reactividad de linfocitos sensibihzados contra un antígeno propio; esta respuesta puede estar asociada o no con una en­ fermedad autoinmune. En medicina clínica hay

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Inmunopatología

C u a d ro 28-1. E n ferm ed a d es auto in m u n es más comunes Ó rgano-específicas T iro id itis d e H a s h im o to

N o órgano-específic a s (sistém icas)

M ix e d e m a p rim a rio T iro to x ic o s is A n e m ia p e rn ic io s a G a s tritis a tró fic a a u to in m u n e E n fe rm e d a d d e A d d is o n D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te U v e ítis fo e o a n a filá c tic a S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re M ia s te n ia g rav is M e n o p a u s ia p r e m a tu r a (p o c o c o m ú n ) In fe rtilid a d m a s c u lin a (p o c o c o m ú n ) P é n fig o v u lg a r P e n fig o id e O f ta lm ía s im p á tic a E s c le ro s is m iiltip le A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e P ú rp u ra tro in b o c ito p é n ic a id io p á tic a L e u c o p e n ia id io p á tic a C irro s is b ilia r p rim a ria H e p a titis c ró n ic a a c tiv a c o n a n tíg e n o H B s n e g a tiv o C irro s is c rip tó g e n a (p o c o c o m ú n ) C o litis u lc e ro s a S ín d ro m e d e S jo g re n A rtritis re u m a to id e a D e rm a to m io s itis E s c le ro d e rm ia L E cUscoide L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o (L E S )

numerosos ejemplos de producción de autoan­ ticuerpos sin que estén relacionados con una enfermedad autoinmune. Ciertos desórdenes de origen infeccioso y que tienden a la cronicidad, drogas o envejecimiento pueden estar asocia­ dos a una forma controlada de autoinmunidad. Luego de la eliminación del agente infectivo o de la suspensión de la droga las manifestacio­

nes de autoinmunidad desaparecen. En cambio, en las enfermedades autoinmunes, la presencia de autoanticuerpos o linfocitos T sensibilizados producen lesión tisular y disfunciones de los órganos blanco, mecanismos totalm ente des­ controlados y generalmente irreversibles. Existe una am plia gama de enferm edades autoinmunes (cuadro 28-1), en cuyos extremos se encuentran las enfermedades órgano-específicas y no órgano-específicas, y las que quedan comprendidas entre estos dos tipos poseen ca­ racterísticas de ambos. 1. E T IO L O G ÍA Los desórdenes autoinmunes han sido am ­ pliam ente estudiados en seres humanos y en m odelos anim ales. E stas enferm edades son multifactoriales y en cada una de ellas puede estar comprendido más de un mecanismo de in­ ducción. Se conocen numerosos factores que pueden contribuir a la eclosión de las enferme­ dades autoinmunes: 1.1. F actores genéticos Estudios poblacionales realizados en fam i­ lias o hermanos gemelos han revelado clara­ mente que los factores genéticos tienen una in­ fluencia significativa sobre la predisposición a adquirir enfermedades autoinmunes. Los facto­ res genéticos más importantes involucrados en estas enfermedades son los relacionados con los genes del complejo mayor de histocompati­ bilidad (MHC), los genes del receptor de los linfocitos T y los genes del receptor de los lin­ focitos B (Inmunoglobulinas).

C uadro 28-2. Alelos del complejo mayor de histocompatibilidad asociados con el incremento del riesgo en varias enfermedades autoinmunes E nferm edad E s p o n d ilitis a n q u ilo s a n te S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re E n fe rm e d a d d e G ra v e s D ia b e te s m e llitu s in su lin o -d e p e n d ie n te A rtritis r e u m a to id e a ju v e n il E s c le ro s is m ú ltip le M ia s te n ia g rav is A n e m ia p e rn ic io s a A rtritis p s o riá tic a S ín d ro m e d e R e its r A rtritis re u m a to id e a S ín d ro m e d e S jo g re n L u p u s e rite m a to s o sis té m ic o C o litis u lc e ro s a

A lelo del C M H B27 DR2 B 8 /D R 3 D R 4 /D R 3 D R 3 /D Q W 8 D w l4 B 2 7 /D R 5 DR2 DR3 DR5 B27 B27 D w 4 /D R 4 Dw3 DR3 B5

R iesgo relativo* 80 16 3 -4 20

100 Al 4 5 10 5 11 37 10 6 5 4

* P ro b ab ilid ad d e que u n a p erso n a h ete ro cig o ta q u e p o rta el ale lo in d icad o d esa rro lle la e n ferm e d ad , co m p a rad a c o n la p ro b a b ilid ad de la p o b lac ió n general a la cual se le asig n ó un riesg o ig u al a 1.

Autoinmunidad 1.1.1. Relacionados con los genes del complejo mayor de histocompatibilidad La asociación genética más estudiada y más claramente establecida es la relacionada con los antígenos del MHC (cuadro 28-2). Esta asocia­ ción no es sorprendente ya que las enfermeda­ des autoinmunes son dependientes de los linfo­ citos T y las respuestas inmunes que dependen de los linfocitos T están restringidas por el MHC. Por tal motivo, el MHC puede afectar la predisposición a adquirir enfermedades autoin­ munes por varios mecanismos que no son m u­ tuamente excluyentes, e incluyen el haplotipo del receptor del linfocito T (TCR) y la selec­ ción, presentación y transporte de los péptidos antigénicos. Entre los modelos animales estu­ diados hay uno que es muy interesante y es la introducción de la mutación (bm \2) en la cade­ na LA en ratones NZB; estos animales sufrie­ ron una enfermedad autoinmune severa, similar

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al lupus eritem atoso sistémico que presentan los ratones NZB/NZW. La mutación bm i2 d i­ fiere de la secuencia convencional H-2b LA en sólo tres aminoácidos en las posiciones 67, 70 y 71. Los resultados sugieren que estos re si­ duos, localizados en la zona del MHC, respon­ sable de la unión con el péptido, son importan­ tes en la inducción de enfermedad autoinmune en el contexto del baekground genético del NZB. Entre los casos más conocidos se puede citar el de la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) observada en humanos donde el cambio de un único aminoácido en la secuencia de la molécula DQ 1 del MHC de clase II p u e­ de inducir protección o susceptibilidad a la en ­ fermedad. Esta molécula, en individuos norm a­ les o resistentes a la enfermedad contiene ácido aspártico en la posición 57, en cambio, en p a ­ cientes de poblaciones causásicas afectados de IDDM esa posición está ocupada por la valina, serina o alanina (fig. 28-1). El cambio por un

La posición 57 del DQ (o 1-A) de ia cadena (3 modifica ia susceptibiiidad para enfermarse de diabetes mellitus insuiinodependiente (IDDIVI) Asociado con ia resistencia a la IDDM

Asociado con ia susceptibiiidad a la IDDM

Fig. 28-1. E l cam bio de un am inoácido en la secuencia de un C M H de clase II está relacion ad o con la su scep tib ili­ dad de adquirir diabetes. L a s e c u e n c ia d e l C M H -D Q |3 l d e la m a y o ría d e ia p o b la c ió n tie n e a s p á rtic o en la p o s ic ió n .57. L a p o b la c ió n c o n d ia b e te s m e llitu s p r e s e n ta se rin a , v a lin a o a la n in a en d ic h a p o s ic ió n . E l c a m b io d e u n a m in o á c id o c a r g a ­ d o p o r u n o n o c a rg a d o r o m p e el p u e n te sa lin o a lte rn a d o la e s ta b ilid a d d e la m o lé c u la . T o m a d o d e J e n e w a y y T ra v ers.

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Inmunopatología

residuo no cargado rompe el puente salino alte­ rando la estabilidad de la molécula de DQ. En otros modelos animales de enfermedades au­ toinmunes específicas de órgano o sistémicas, que tienen un defecto en los genes I-E, la pro­ tección a la enfermedad se pudo inducir por la introducción de genes lE a o IE(3. 1.1.2. Relacionados con los genes del receptor de los Linfocitos T (TCR) Se ha estudiado la asociación de los genes del TCR con las enferm edades autoinm unes dado que estas enfermedades, como ya dijimos, son dependientes de linfocitos T. Sin embargo, hasta el momento, y con muy pocas excepcio­ nes, no hay evidencias claras en animales o hu­ manos que indiquen una relación entre haploti­ pos particulares de TCR y predisposición a ad­ quirir enfermedades autoinmunes. Sin embar­ go, hallazgos interesantes que, aunque necesi­ tan mayores estudios, indican por ejemplo que la respuesta a péptidos encefalogénicos, prove­ nientes de la pro teína básica de mielina en rato­ nes y ratas, tiene una utilización restringida del TCR V p/V a. Algunos investigadores preten­ dieron aphcar este conocimiento a la produc­ ción de vacunas sintéticas Vp o anticuerpos anti-Vp. Sin embargo, cuando en enfermedades autoinmunes se demostró la existencia de res­ tricciones del gen del TCR, el gen o los genes V dominantes, diferían en los distintos indivi­ duos con la m ism a enferm edad autoinm une, aunque se pudo observar algunos elem entos conservados en ciertos V/D/J. La importancia de determinadas citoquinas en el control del balance de linfocitos T h l y Th2 puede ser un factor importante en la pato­ génesis de enfermedades autoinmunes. Los de­ fectos en la estructura del gen, la transcripción y la función de citoquinas y sus receptores han sido detectados en varias enfermedades autoin­ munes. Además se ha demostrado, en modelos animales, que las citoquinas o sus inhibidores afectan el desarrollo de la autoinmunidad, ya que se observaron signos de autoinmunidad o inflamación en ratones transgénicos para una determinada citoquina o con defectos genéticos para su inducción. 1.1.3. Relacionados con genes de las InmunoglobuUnas Cómo se desencadenan las enfermedades au­ toinmunes es uno de los enigmas de la Inmuno­ logía moderna. El marco principal de la enfer­ medad autoinmune es la presencia de anticuer­ pos circulantes que reaccionan con algunos componentes u órganos del cuerpo. Si estos an­ ticuerpos causan los síntomas de la enferme­

dad, o son el resultado de ésta, depende de cada patología. La asociación de enfermedades autoinmunes con alotipos e idiotipos de inmunoglobulinas fue observada por muchos investigadores, sin em bargo los resultados obtenidos por todos ellos aún son contradictorios. Una cuestión fundamental en este tema es la relacionada al origen de los autoanticuerpos, o sea: si éstos provienen o no de genes de la línea germinal, si son el reordenamiento de genes di­ ferentes de aquellos que codifican para anti­ cuerpos de una respuesta inmune normal, o si son el resultado de mutaciones som áticas de genes de la línea germinal. Muchos investiga­ dores han tratado de resolver estas preguntas a través del estudio de los idiotipos presentes en autoanticuerpos. Estas investigaciones han re­ velado, en autoanticuerpos con diferente espe­ cificidad, la existencia de idiotipos con reacti­ vidad cruzada (cross-reactive idiotypes'. CRI), lo que dem ostraría que todos estos autoanti­ cuerpos provienen de un mismo gen o de genes similares y, por ende, la existencia de una res­ tricción idiotípica. Que la respuesta inmune es altamente restrictiva también fue demostrado en anticuerpos inducidos por polisacáridos y haptenos. Se cree que la restricción idiotípica es el resultado de la respuesta a la estimulación antigénica de un número limitado de clones B. Los estudios de restricción en anticuerpos antiADN en pacientes con Lupus eritematoso sisté­ mico (LES), prototipo de las enfermedades au­ toinmunes sistémicas, han indicado que estos autoanticuerpos presentan un alto grado de CRL Diamond y Solomon mostraron en sus es­ tudios que el 80% de los pacientes con LES, que presentan en su suero anticuerpos antiADNds (ADN de doble cadena), expresan un idiotípo denominado 3L Este idiotipo fue aso­ ciado con la oligoclonalidad de los anticuerpos que unen ADN. Para determinar si los autoanticuerpos pro­ vienen de un determinado grupo de genes de la línea germinal, varios autores han estudiado la secuencia del idiotipo involucrado en la restric­ ción y la compararon con la secuencia de los respectivos genes. Recién en los últimos años se ha comenzado a conocer la secuencia de las regiones variables de algunos autoanticuerpos; gracias a ello ha comenzado a surgir informa­ ción con respecto a la restricción idiotípica en la síntesis de estos anticuerpos. Es claro que el reconocimiento a lo propio es normal, hecho demostrado por la existencia de la red idiotipo-antíidiotipo y la presencia de au­ toanticuerpos naturales. Los autoanticuerpos naturales aparentemente son de tipo IgM, polireactivos y de baja afinidad. Fundamentalmen­ te difieren de los IgG monoespecíficos en que

Autoinmunidad estos últim os son de alta afinidad y general­ mente están asociados con la patología autoin­ mune. Los autoanticuerpos naturales también exhiben un alto grado de reacción idiotípica cruzada y son el producto de la estimulación de las células B CDS’^. También se sabe que los autoanticuerpos naturales son el producto de genes no mutados de la línea germinal, m ien­ tras que los asociados a enfermedades autoin­ munes presentan gran número de mutaciones, tanto en el segmento como en el V^. El in­ cremento de mutaciones en los autoanticuerpos patogénicos hace que se incremente su afinidad por el autoantígeno, y por lo tanto presentan una mayor selectividad antigénica. En contras­ te, los anticuerpos polirreactivos naturales son la expresión de genes no mutados de la línea germinal. Es importante destacar que la m ayo­ ría de los investigadores opinan que, tanto los autoanticuerpos patogénicos como los autoanti­ cuerpos naturales y los anticuerpos contra antí­ genos extraños, se originan por el reordena­ miento de los mismos genes, ya que no se ha demostrado de manera fehaciente la existencia de una restricción genética para la síntesis de autoanticuerpos. Sin embargo, en el caso de los autoanticuerpos presentes en la anemia hemolí­ tica denominada crioaglutinemia, se ha obser­ vado una restricción en el uso del gen V,:,4-21, perteneciente a la fam ilia de genes Vjj4 (ver más adelante). La pregunta que cabe hacer es si los autoan­ ticuerpos naturales son o no los precursores de los autoanticuerpos patogénicos y cómo apare­ cen. La respuesta aún no existe. El estado ac­ tual de los conocimientos indica que autoanti­ cuerpos naturales y autoanticuerpos que causan patologías se originan a partir de diferentes lí­ neas celulares, por lo menos en el sistema m u­ rino. Aún no se sabe si las células CD5^ se ori­ ginan a partir de las CD5+; tampoco si los au­ toanticuerpos IgG sintetizados por las células CDS'" son patogénicos. Por lo tanto, ¿qué fun­ ción cumplen las células CD5"' y los autoanti­ cuerpos naturales que ellas producen? Algunos autores han sugerido una función de defensa prim aria que, debido a su polireactividad, se unirían a un vasto repertorio de organismos in­ vasores. Otros autores han postulado que los autoanticuerpos son parte de la red idiotipo-anti-idiotipo que contribuye a la homeostasis del organismo. Por ejemplo, se vió que estos anti­ cuerpos unen a autoanticuerpos de tipo IgG in­ hibiendo su reactividad, lo que sugiere que la red idiotípica es responsable de la regulación y mantenim iento de la m em oria inmune de las células en ausencia del antígeno. La pregunta crucial, aún sin respuesta, es có­ mo se producen los autoanticuerpos patogéni­ cos, ya que el estímulo para su formación no se

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conoce. El evento inicial parece ser la activa­ ción policlonal de las células B o su estim ula­ ción por un organismo invasor que da reacción cruzada con un componente propio (similitud antigénica). En ambos casos, la producción de un autoanticuerpo de alta afinidad, monoespecífico y patológico puede ser debida a una selecti­ vidad antigénica a través de un proceso rautacional que no puede ser iniciado o exacerbado por inm unización exógena de antígenos p ro ­ pios, aunque algunos casos de autoinmunidad experimental parecerían demostrar lo contrario. Es evidente que la respuesta autoinmune es un complicado proceso que requiere una serie de factores, que incluyen activación de células T, pérdida de la supresión, efectos hormonales y factores genéticos. 1.2. Liberación de antígenos secuestrados o ubicados en sitios privilegiados Los antígenos asociados con tejidos periféri­ cos, especialmente aquellos secuestrados detrás de barreras anatómicas, no se ponen en contac­ to con el repertorio de linfocitos T que se está desarrollando, por lo tanto, la tolerancia central para estos antígenos no puede ser inducida. La inducción de enfermedades autoinmunes d es­ pués del contacto con antígenos ubicados en los llamados “sitios privilegiados” ha sido bien documentada y ejemplo de ello son la oftalm ía simpática observada después de la injuria tisu­ lar y la orquitis que se induce después de la vasectomía. Recientemente se ha demostrado que los antígenos asociados a tejidos periféricos pueden causar tolerancia cuando se introducen experimentalmente en el timo. Algunos autores pudieron observar que la inyección intratímica de células pancreáticas puede prevenir la diabe­ tes autoinmune en ratas Bio-hreeding (B B ) y en ratones non-obese diabetic (NOD), y que la inyección intratímica o intravenosa de glutamic acid decarboxylase (GAD) que parece se r el principal autoantígeno de la diabetes autoinm u­ ne, puede prevenir la enfermedad en ratones NOD. Resultados similares se pudieron obser­ var en otros modelos experimentales de autoin­ munidad, como encefalitis alérgica experimen­ tal (EAE) y gastritis experimental autoinmune, donde la enfermedad se pudo prevenir p o r la expresión en el timo en animales transgénicos, de antígenos responsables de la autoinmunidad. En varias enfermedades autoinmunes se ob­ servó que la liberación de un antígeno secues­ trado induce enfermedad. En la oftalmía sim pá­ tica, el trauma en un ojo induce la liberación al medio de antígenos que estaban secuestrados, haciendo que dichos antígenos sean accesibles para las células T. Las células efectoras induci­ das atacan al ojo traumatizado y además infil­

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Inmunopatología

A

B

Fig. 2 8 -2 . F i daño a un órgano inm u n ológicam ente p rivilegiado p uede causar una respuesta autoinm une. E n la ofía h n ía s im p á tic a , el Ira u m a e n un o jo , p u e d e lib e ra r a n tíg e n o s s e c u e s tra d o s y lib e ra rlo s al m ed io . L as c é lu la s e le c to ra s a ta ­ c a n ta n to al o jo d a ñ a d o c o m o al s a n o . A : E l tra u m a e n un o jo p u e d e c a u sa r ia lib e ra c ió n d e a n tíg e n o s in tra o c u la re s s e c u e s ­ tra d o s. B: E l a n tíg e n o in tra o c u la r lib e r a d o e s lle v a d o a lo s n ó d u lo s lin fá tic o s y a c tiv a r a lo s L T . C ; L T e fe c to re s v u e lv e n p o r v ía s a n g u ín e a y e n c u e n tra n al a n tíg e n o en a m b o s o jo s.

tran y atacan el ojo sano (fig. 28-2). Por lo tan­ to, aunque los antígenos no indueen una res­ puesta inmune por sí mismos, si una respuesta inmune se inicia en otro sitio, ellos pueden ser­ vir como blanco para el ataque. Las evidencias indiean que la liberación de autoantígenos se­ cuestrados puede ser una causa de autoinmuni­ dad, que posiblem ente se com plem ente con otros factores para mantener la respuesta inmu­ ne, eomo por ejemplo una injuria tisular indu­ cida por un virus puede ser un mecanismo libe­ rador de autoantígenos y además proveería fac­ tores eoestim ulatorios que coadyuven en el proceso de autoinmunidad. 1.3. Epitopes no accesibles o subdominantes Los principios de esta teoría se basan en que cada proteína propia presenta un número p e­ queño de determinantes antigénicos dominan­ tes que están involucrados en la selección ne­ gativa, siendo el organismo tolerante a ellos. Por otra parte hay determinantes que, por no ser dominantes no inducen tolerancia, y son los denominados epitopes crípticos o subdominan­ tes, lo que permite la existencia de un gran nú­ mero de células T potencialmente autorreaetivas. La falta de tolerancia hacia los epitopes crípticos puede deberse a un procesam iento inefectivo del antígeno o porque están cerca de un epitope dominante con el que compiten por la unión a las moléculas del MHC o del recep­ tor de linfocitos T (TCR). El rol de los determi­ nantes crípticos en la patogénesis de la autoin­ m unidad ha sido observ ad o en los ratones NOD, posiblemente porque los virus dan el es­ tímulo inicial a través de una incrementada pre­ sentación del determinante críptico o subdomi­ nante, ya sea por similitud molecular o por la regulación inducida por el interferón y (IFN-y) para la expresión de genes entre los que se in­ cluyen las moléculas del MHC, importantes pa­

ra la presentación de antígenos. Elson y col., han sugerido la existencia de una estrecha aso­ ciación entre los epitopes crípticos y los linfo­ citos T h l. Estos linfocitos liberan citoquinas entre las que se encuentran el IFN-y y otras que producen alteración de las enzimas lisosom a­ les, con los consiguientes cambios en la ruptura de proteínas durante el procesamiento antigénieo. Se ha observado además la homología entre determinantes dominantes en una molécula ex­ traña y determinantes crípticos de las molécu­ las propias, así eomo también la inducción de eélulas T y B autorreactivas después de la in­ munización con una molécula propia y con una molécula extraña que presentan reacción cruza­ da. Recientemente se ha postulado que una vez que se inicia una respuesta contra un determi­ nante críptico se inducirían posteriores respues­ tas contra determinantes adicionales. 1.4. Desconocimiento de lo propio Para que las células T se activen en la perife­ ria se necesitan dos señales: la primera está da­ da por el antígeno asociado a las moléculas del c o m p le jo m ay o r de h is to c o m p a tib ilid a d (MHC) y la segunda por la coestim ulación a través de moléculas accesorias no polimórfieas presentes en las eélulas presentadoras de antí­ geno (APCs). Si se da la primera señal pero es­ tá ausente la segunda habrá falta de respuesta o anergia. Por ejemplo; los linfocitos T que no fueron eliminados intratímieamente y que son específicos para péptidos propios que no están expresados en las APCs se harán tolerantes. Posteriormente, si los linfocitos T potencial­ mente autorreaetivos no se activan no tendrán acceso a tejidos no linfoides. Por lo tanto, la presencia de clones de linfocitos T específicos para antígenos propios que no son expresados sobre la superficie de APCs no representan un daño importante en una situación fisiológica.

Autoinmunidad 1 i

Sóio señal del coestimulador

í ' '' ... ! ' ' -- ' ' '

1 '

565

Sólo señal específica

' ■ ■' '

CPA

RLT

Sin efecto en LT

Inactivación de LT (anergia)

Fig. 28-3. Los LT toleran tes a antígenos expresados sobre células pueden producir reconocim iento en a u se n c ia de co-estim ulación. L a s c é lu la s p re s e n ta d o ra s de a n tíg e n o s (A P C ) n o p u e d e n re c o n o c e r lo s L T a c tiv a d o s o in a c tiv a d o s si no e s tá p r e s e n te so b re la s u p e rfic ie d e la c é lu la el a n tíg e n o e s p e c ífic o , e n c a m b io , si e x p re s a n u n a m o lé c u la c o -e s tim u la d o r a p u e d e n p ro d u c ir la se ñ a l 2. S in e m b a rg o , c u a n d o ias c é lu la s re c o n o c e n a n tíg e n o s en a u s e n c ia d e m o lé c u la s c o -e s tim u la d o ^ ras, e lla s a c e p ta n la se ñ a l 1 y son in a c tiv a d a s.

Se ha postulado que células T maduras espe­ cíficas para antígenos extratímicos sufren aner­ gia cuando estos antígenos son presentados por células presentadoras de antígeno no profesiona­ les (distintas a células dendríticas y m acrófa­ gos). Esto se debería a la ausencia de una segun­ da señal apropiada o de factores coestimulatorios (fig. 28-j). Una posibilidad alternativa es que no haya inducción de anergia, pero que las células T maduras no puedan recibir señales apropiadas y/o ayuda. Esto daría como resultado que las células T simplemente ignoren a estos antígenos. Si posteriormente hay una adecuada presentación a través de células profesionales, las células autorreactivas que están silenciosas pueden ser activadas y causar daño tisular. O sahi y col., realizaron experimentos con animales doblemente transgénicos, para la pro­ teína del virus de la coriomeningitis linfocítica

(LCMV) y para el TCR específico. Los resulta­ dos indican que las células T específicas para el virus no fueron eliminadas ni anergizadas, ya que se demostró que había un número gran­ de de las mismas que eran funcionales in vitro dando respuesta proliferativa y citotoxicidad, aunque no fueran eficientes in vivo para reco­ nocer y atacar al virus presente en las células pancreáticas. Sin embargo, después de la infec­ ción con la cepa viral apropiada se observó in­ filtración celular y daño del páncreas. Estos ha­ llazgos fueron interpretados como una indica­ ción de que las células T autorreactivas del teji­ do están presentes pero no fueron activadas o se volvieron anérgicas porque las células que expresan autoantígeno (por ej. islotes ¡3) pue­ den tener niveles bajos de moléculas del CMH de clase L no expresar moléculas del CM H de clase II y no tener señales coestimulatorias.

566

Inmunopatología

Sin embargo, los resultados obtenidos con animales transgénicos, aunque de gran signifi­ cación, deben ser tomados con gran precaución para formular conceptos generales en autoin­ m unidad ya que, por ejem plo, los anim ales TCR-transgénicos son anim ales inm unocomprometidos y muy susceptibles a las enferme­ dades infecciosas. 1.5. Sim ilitud m olecular La sim ilitud m olecular, tam bién conocida como mimetización molecular, se puede definir como la homología en una secuencia de am i­ noácidos entre moléculas propias y extrañas. Las teorías de epitopes crípticos o de falta de segunda señal son compatibles con las hipóte­ sis de similitud molecular entre antígenos pro­ pios y extraños, particularmente si estos liltimos son agentes infecciosos. Es bastante fre­ cuente encontrar polipéptidos muy similares o idénticos en proteínas no relacionadas, y se ha observado que muchos fragmentos peptídicos de agentes infecciosos son homólogos con pro­ teínas del huésped inclu id as m o léculas del MHC (cuadro 28-3). Entre los antígenos micro­ bianos involucrados en autoinmunidad, los más estudiados son las proteínas del estrés (Hsps), encontradas en prácticamente todas las formas

vivas. Cuando se compararon las secuencias dC' aminoácidos de la HspóO con las bases de da­ tos de secuencias de péptidos humanos conoci­ dos se observó que 8 6 péptidos humanos tienen regiones similares a la HspóO y de éstos, 19 es­ tán asociados a autoantígenos involucrados en enferm edades autoinm unes. Sin em bargo, la importancia de la similitud molecular en la pa­ togénesis de enfermedades autoinmunes espon­ táneas no está muy bien definida, como tam po­ co está definido por qué las respuestas inmunológicas a las Hsps, que son expresadas en todas las células, pueden llevar a una enfermedad au­ toinmune específica de órgano. En un estudio muy interesante, utilizando ra­ tones transgénicos que expresan una proteína del LCM V en células de los islotes del pán­ creas, se pudo observar que no responden a la proteína y que no enferman de IDDM. Sin em­ bargo, si los ratones transgénicos son infecta­ dos con LCMV se induce una potente respuesta de células T citotóxicas anti-virus y esto mata las células llevando a la IDDM (fig. 28-4). Se debe tener en cuenta que, si bien hay varios ejemplos de inducción de autoinmunidad, des­ pués de la infección por algunos microorganis­ mos (miocarditis por streptococos del grupo A, artritis por micobacterias, etc.) para la mayoría de las enfermedades autoinmunes humanas no

C u ad ro 28-3. Sim ilitud molecular entre proteínas de organismos infecciosos y proteínas del huésped humano Proteína*

R esiduo’

Secuencia^

C ito m e g a lo v iru s h u m a n o M o lé c u la H L A -D R

79 60

PD PLG R PD ED VTELG RPD A E

P o lio v iru s V P 2 R e c e p to r d e a c e tilc o lin a

70 176

STTKESRGTT T V IK E S R G T K

Viru.s d e p a p ilo m a E 2 R e c e p to r d e in su lin a

76 66

SLH LESLKDS V Y G LESLK D L

G lu c o p ro te ín a d e l v iru s d e la ra b ia R e c e p to r d e in su lin a

147 764

T K E S L V II S N K E S L V IS E

K lebsiella pneum oiae n itro g e n a s a M o lé c u la H L A -B 2 7

186 70

SR Q TD R ED E KAQTDREDL

A d e n o v iru s 12 E l B a -g lia d in a

384 206

LRRGM QTDREQCN LG QG SQTD REQ QN

P ro te ín a p 2 4 d e l v iru s del S ID A R e g ió n c o n s ta n te d e la IgG

160 466

GV ETTTPS GV ETTTPS

P ro te ín a P 3 del v iru s d e s a ra m p ió n C o rtic o tro p in a

13 18

L E C IR A L K L E C IR A C K

P ro te ín a P 3 del v iru s d e s a ra m p ió n P ro te ín a b á s ic a d e m ie lin a

3] 61

E IS D N L G Q E ELSFKLG QE

* E n cada par, la p ro le/n a h u m a n a es lista d a segunda. S e h a o b serv ad o q u e las p ro leín a s de cada p a r p re sen tan re activ id ad cruzada. ^ C ada n ú m ero indica la p osición a m in o -term in a l del p ép tid o in d icad o , en la p ro teín a nativa. 2 La sec u en cia es re p rese n ta d a con el có d ig o d e una sola letra.

Autoinmunidad se ha determinado un agente patógeno que esté totalmente identificado con un determinado ór­ gano. No se puede descartar que el microorga­ nismo haya estado en contacto con el organis­ mo antes de la manifestación de la enfermedad y que los órganos que tengan el epitope de reacción cruzada puedan estar afectados sin es­ tar presente el microorganismo. Es interesante destacar que los agentes infec­ ciosos pueden participar en la inducción de las enfermedades autoinmunes no sólo por la simi­ litud molecular con un autoantígeno sino que además producen daño tisular y liberación de antígenos secuestrados, disponibilidad de epi­ topes crípticos a través de una increm entada expresión de moléculas MHC, cambios en el espectro de la producción de citoquinas, activa­ ción aberrante de linfocitos T, etc. 1.6. Teoría de lo “propio modificado” Esta teoría postula que la autoinmunidad se puede inducir como consecuencia de una res­ puesta inmune contra determinantes antigéni­ cos propios modificados. Aunque no hay una demostración clara de esta teoría, han sido pu­ blicados varios ejemplos, entre ellos, aquellos que indican que pueden aparecer nuevos deter­ minantes antigénicos en anticuerpos que sufrie­ ron alguna mutación somática durante la m adu­ ración de la respuesta inmune. También se pos­ tula que la modificación de la IgG al form ar complejos inmunes o los defectos en la glucosilación de la IgG podrían inducir la formación de los denominados factores reumatoideos (ver en Artritis reumadoidea), o que el C3 del com­ plemento podría exponer nuevos determinantes durante su activación. Por otra parte, hay una gran lista de drogas a las que se han relaciona­ do con la inducción de LES por la posibilidad de que se unan a epitopes de moléculas pro­ pios, induciendo una modificación molecular. 1.7. Defectos en la tolerancia central o periférica Los defectos en la tolerancia central o periféri­ ca como inductores de autoinmunidad tienden a inducir, fundamentalmente, enfermedades autoin­ munes sistémicas y pueden ser debidos a proble­ mas de los linfocitos T o de los linfocitos B. 1.7.1. Defectos en la tolerancia de linfocitos T Existen varios modelos experim entales de autoinmunidad inducida por falta de tolerancia de linfocitos T. Uno que está bastante desarro­ llado es la inducción de enfermedades autoin­ munes órgano-específicas en ratones irradia­

567

dos, reconstituidos con médula ósea y tratados con ciclosporina; el efecto posiblemente es de­ bido a la interferencia de esta droga en la apoptosis durante la selección negativa de clones autorreactivos. Otro ejemplo bastante estudiado es el desarrollo de manifestaciones autoinmu­ nes en distintos órganos en animales que fue­ ron timectomizados los primeros días de vida. Parecería que hay una correlación entre el esca­ pe a la periferia de clones V de superantígenos (SAg) propios y el daño tisular. Sin embargo, otros hallazgos no apoyan esta hipótesis. Se ha observado que ratones susceptibles al LES, in­ cluidos los ratones Ipr y glcl, que tienen defec­ tos en el Fas (CD95) y en el ligando del mismo (Fas L), tienen las proteínas endógenas del SAg, que serían las mediadoras de la elimina­ ción del clon V. Se observó que este proceso no se altera con la edad ni con el desarrollo de la enfermedad. Sprent sugirió que la autoinmu­ nidad en anim ales neonatos tim ectom izados puede ser causada por deficiencias cuantitati­ vas de linfocitos T, así como también la sus­ ceptibilidad a la infección y la posterior libera­ ción de antígenos propios desde el sitio de la infección. Los hallazgos relacionados a elimi­ naciones intratímicas mediadas por el SAg no excluyen la posibilidad de que haya defectos en la tolerancia central a linfocitos T por antíge­ nos convencionales en la patogénesis de au­ toinmunidad. 1.7.2. Defectos en la tolerancia de linfocitos B No hay evidencias claras que indiquen que un defecto en este proceso pueda contribuir marca­ damente a la inducción de una enfermedad au­ toinmune. Sin embargo, hay varios estudios rea­ lizados con animales transgénicos donde se ob­ serva falta de tolerancia a linfocitos B, lo que se trató de explicar diciendo que habría antes una activación de linfocitos T, los que sacarían de la anergia a los linfocitos B. Otra posibilidad para explicar esta falta de tolerancia sería que haya sido inefectiva la muerte de linfocitos B auto­ rreactivos por tener deficiencias del Fas y no ha­ ber podido ser eliminados por los linfocitos T ci­ totóxicos CD4+ que expresan Fas. 1.8. Activadores polielonales La activación policlonal de linfocitos T y B es considerada un mecanismo importante en la inducción o mantenimiento de las enfermeda­ des autoinmunes, especialmente las enfermeda­ des sistémicas. Se ha demostrado la existencia de linfocitos B autorreactivos y de células aner­ gizadas que se pueden activar después de un estím ulo apropiado. Hay un gran núm ero de

568

Inmunopatología

B Páncreas

Promotor de insulina

Nucleoproteína LCMV (NP)

Fig. 28-4. U na infección viral p uede rom per la toleran cia por una proteína transgénica viral expresada en células pancreáticas p . R a to n e s q u e e x p re s a n u n a p ro te ín a d e l L C M V en las c é lu la s p a n c re á tic a s (3 n o r e s p o n d e n a la p ro te ín a y p o r lo ta n to n o se e n fe rm a n . S in e m b a rg o , si ra to n e s tra n s e g é n ic o s so n in fe c ta d o s c o n el L C M V , se p ro d u c e u n a p o te n te re s p u e s ta a n ti-v ira l c o n p ro d u c c ió n d e L T c ito tó x ic o s q u e d e s tru y e n las c é lu la s p a n c re á tic a s (3, p ro d u c ié n d o s e la e n fe r m e ­ dad. A lg u n o s a g e n te s in fe c c io s o s p u e d e n d e s e n c a d e n a r u n a re s p u e s ta a c é lu la s T , y p ro d u c ir u n a re a c c ió n c r u z a d a co n p é p tid o s p ro p io s, p ro c e s o c o n o c id o c o n el n o m b re d e m im e tiz a c ió n m o le c u la r o s im ilitu d a n tig é n ic a , p u d ie n d o c a u s a r e n ­ fe rm e d a d m e d ia n te u n a v ía sim ila r. A : G e n h íb rid o p ro d u c id o p o r in se rc ió n del g e n d e la n u c le o p ro te ín a (N P ) del L C M V al p r o m o to r d e in su lin a . B : R a tó n tra n s g é n ic o q u e e x p re s a s ó lo la N P s o b re las c é lu la s p d e l p á n c re a s , p o r lo n o se p ro d u c e re s p u e s ta a L T . C: L o s L T C D 8 e s p e c ífic o s p a ra N P so n a c tiv a d o s p o r in fe c c ió n c o n el v iru s L C M V . L o s L T C D 8 in fil­ tra n a los islo te s y d e s tru y e n las c é lu la s p q u e e x p re s a n la N P , p ro d u c ié n d o s e d iab e te s.

moléculas, especialmente de origen microbia­ no, que tienen capacidad para activar polielonalmente linfocitos B e inducir autoanticuerpos. Sin embargo, es discutible la patogenicidad que estos activadores pueden originar en las enfermedades sistémicas ya que, por ejem­ plo, los anticuerpos que inducen son general­ mente de tipo IgM y de baja afinidad, mientras que el daño más importante en el LES está da­ do por los anticuerpos tipo IgG. Por otra parte, en animales de experimentación, aunque se ob­ serven títulos altos de anticuerpos, las manifes­ taciones histológicas se observan sólo en los animales con predisposición genética a adquirir la enfermedad. También es interesante tener en cuenta que la im plantación de enferm edades autoinmunes requiere, en la mayoría de los ca­ sos, la participación de linfocitos T. Estudios llevados a cabo para determinar la activación de linfocitos T por los superantíge­ nos (SAgs), demostraron que SAgs bacterianos o virales unidos a moléculas del MHC sobre los linfocitos B llevan a la producción policlo­ nal de inmunoglobulinas y en algunos casos de autoanticuerpos. Alternativamente, los linfoci­ tos T activados pueden inducir por sí mismos daño tisular a través de reacciones cruzadas con moléculas propias. Se ha inferido que este

mecanism o es el que estaría presente en p a­ cientes afectados de artritis reumatoidea donde se observa un enriquecimiento en la sinovia de linfocitos T que expresan V[3l4, y una dismi­ nución de éstos en linfocitos T de sangre peri­ férica. Se ha postulado además que las eélulas activadas por el SAg (incluyendo las que ex­ presan V pl4 ) son expandidas y luego elimina­ das, pero que algunas son atraídas a la sinovia porque expresan TCRs que dan reacción cruza­ da con una molécula propia presente en este si­ tio. Los ensayos realizados para inducir experi­ mentalm ente enferm edades autoinm unes por activación de linfocitos T con SAg in vitro e in vivo son poco promisorios, aunque se ha podi­ do inducir artritis por un SAg producido por el micoplasma, al igual que algunas manifestacio­ nes autoinmunes se asociaron con infecciones estreptocócicas. Sin embargo, estas manifesta­ ciones generalm ente estuvieron relacionadas con la similitud m olecular entre epitopes del microorganismo y del huésped. 1.9. A lteraciones de los mecanismos de inmunorregulación La ausencia de una inmunorregulación ade­ cuada ha sido considerada una de las principa­

Autoinmunidad les causas de la inducción de autoinmunidad, aunque estos mecanism os no han sido clara­ m ente d efin id o s. Sin em bargo, hay v ario s ejemplos de modelos experimentales de enfer­ medades autoinmunes donde sub-poblaciones de linfocitos T pueden inducir o inhibir el desa­ rrollo de las enfermedades. Por ejemplo, si se eliminan células T RT6.1+ de una sublínea de ratas BB resistentes a la diabetes, se revierte el proceso y las ratas enferman. Por el contrario, la enfermedad se puede inhibir por transferen­ cia de células T CD4+CD45RC (low) en cepas de ratas linfopénicas (timectomizadas e irradia­ das). Se ha postulado que estas células proveen IL4 e ILIO, que disminuyen la producción de IFNy disminuyendo las células citotóxicas inductoras de diabetes. 2. CO N CLU SIO N ES Con respecto a las enfermedades autoinmu­ nes específicas de órgano, se puede concluir que son causadas por respuestas inmunes con­ vencionales contra antígenos propios hacia los que no se indujo tolerancia. La ausencia de to­ lerancia para antígenos específicos de determi­ nados tejidos puede ser atribuida a antígenos que no estaban presentes o disponibles en con­ diciones norm ales como consecuencia de un secuestro anatómico, una presentación inade­ cuada debido a la naturaleza críptica del deter­ m inante, etc. En caso de que hubiera algún trauma tisular o inflamación por un microorga­ nismo o reacción cruzada con algún epitope del elemento patógeno, se podría iniciar una enfer­ medad autoinmune específica de órgano. Con respecto a las enfermedades autoinmu­ nes sistémicas tales como el LES, la situación es menos clara, ya que ni la activación policlo­ nal de linfocitos T o B ni los elementos que al­ teran los mecanismos inmunorregulatorios pa­ recerían ser suficientes para inducir la enferme­ dad. Sin embargo, la inducción de LES en ce­ pas de anim ales susceptibles, independiente­ mente de las condiciones del bioterio, sugiere que un elemento patógeno, exógena o endóge­ no, podría estar involucrado. El hecho de que en el LES haya respuesta autoinmune contra una vasta variedad de autoantígenos estaría en contra de la similitud molecular con un antíge­ no externo. Estos argumentos no excluyen los efectos precipitantes de una variedad de facto­ res físicos, químicos e infecciosos. Esta enfer­ medad heterogénea podría estar causada por el compromiso de un gran numero de linfocitos T no tolerantes que reconocen varios péptidos propios presentados por moléculas del CMH de clase II a distintos niveles. Otra posibilidad, co­ mo está ejemplificada en los modelos murinos

569

Ipr/gld de LES, puede ser que defectos en la apoptosis lleven a una inadecuada tolerancia de linfocitos T y linfocitos B. 3. PA TO G E N IA Cada enfermedad autoinmune tiene una ca­ racterística inm unopatogénica que involucra uno o más mecanismos de daño tisular. L a pa­ tología de la enfermedad está determinada por el antígeno o el grupo de antígenos contra los que está dirigida la respuesta inmune y el m e­ canismo por el cual el tejido que presenta dicho antígeno es dañado. Una clasificación m uy di­ fundida de las enfermedades autoinm unes se basa en el mecanismo inm unopatogénico res­ ponsable de la lesión observada en las mismas (cuadro 28-4). La interacción antígeno-anticuerpo puede producir diferentes tipos de lesión tisular según que los anticuerpos estén dirigidos contra antí­ genos de la célula o estén formando parte de complejos inmunes. El primer caso se observa frecuentemente en anemia hemolítica, neutro­ penias, linfopenias y trombocitopenias asintomáticas debido a la presencia de anticuerpos contra células de la sangre. En el síndrome de Goodpasture, cuya lesión principal es debida al prim er mecanismo descripto, se observa glom erulonefritis debida a la presencia de an ti­ cuerpos contra antígenos de la membrana basal del glomérulo y fijación de complemento. En otras ocasiones el daño tisular es producido por anticuerpos que median la citotoxicidad celular

C u a d ro 28-4. Clasificación de las enfermeda­ des autoinmunes de acuerdo al mecanismo in­ munopatogénico involucrado 1. LESIÓN MEDIADA POR ANTICUERPOS L L A n tic u e rp o s d irig id o s c o n tra a n tíg e n o s d e la m a tr iz o d e la s u p e rfic ie c e lu la r A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e P iírp u ra tro m b o c ito p é n ic a a u to in m u n e S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re P é n fig o v u lg a ris F ie b re r e u m á tic a a g u d a 1.2. L e s ió n p ro d u c id a p o r c o m p le jo s in m u n e s G lo m e ru lo n e fritis p o s e s tr e p to c ó c ic a P o lia r te r itis n o d o sa L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o

2. LESIÓN MEDIADA POR LINFOCITOS T D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te A r tritis re u m a to id e a E n c e fa lo m ie litis

570

Inmunopatología

dependiente de anticuerpos; por ejemplo, la ti­ roiditis autoinmune espontánea de pollos obe­ sos. Sin embargo, existen otras situaciones donde la combinación del antígeno (ligado a la célula) y el anticuerpo no produce daño de la membra­ na celular sino estimulación de la célula. Este es el caso de la detección de anticuerpos que se fijan al receptor de la hormona estimulante de tiroides (TSH) y activan la glándula (enferme­ dad de Graves) estimulando la producción ex­ cesiva de hormona tiroidea (fig. 28-5). La pro­ ducción de horm ona tiroidea en condiciones normales es controlada por un fenómeno de re­ troalimentación, ya que altos niveles de hormo­ na tiroidea inhiben la liberación de TSH por la glándula pituitaria; este mecanismo de retroalimentación no tiene efecto cuando el receptor es estimulado de manera patológica, como es el caso de autoanticuerpos anti-receptor. En la en­ fermedad de Graves, se producen estos autoan­ ticuerpos que estimulan al receptor, por lo tan­ to el fenómeno de retroalimentación no funcio­ na y los pacientes presentan hipertiroidism o (véase más adelante). La presencia de autoanticuerpos contra re­ ceptores celulares se ha detectado en diversas enfermedades o estados autoinmunes así, por ejemplo, se observan anticuerpos antagonistas contra el receptor de insulina induciéndose hiperglucemia y quetoaeidosis con resistencia a la insulina. Si por el contrario el anticuerpo es un agonista del receptor de la insulina, se ob­ serva hipoglucemia. En la miastenia gravis se detectan anticuerpos contra el receptor de la acetilcolina; tam bién se han observado anti­ cuerpos contra receptores de la prolactina, de la hormona de crecimiento y p-adrenérgicos. En la miastenia gravis los anticuerpos contra la ca­ dena a del receptor de la acetilcolina bloquean la transmisión neuromuscular normal (fig. 286 ). Se ha postulado que los anticuerpos colabo­ ran en la internalización y degradación intrace­ lular de los receptores de acetilcolina. Los pa­ cientes con miastenia gravis tienen un debili­ dad progresiva y eventualmente mueren como consecuencia de esta enfermedad autoinmune. Varios autores han estudiado enfermedades au­

toinmunes en las que se detectaron anticuerpos contra receptores de la prolactina y de la hor­ mona de crecimiento, los que bloquean princi­ palmente la unión de la hormona homóloga. En el cuadro 28-5 se detallan algunas de las enfer­ medades en las cuales los autoanticuerpos con­ tra receptores celulares tienen un rol importan­ te pudiendo actuar como agonistas o antagonis­ tas de las hormonas. En el caso de la lesión producida por com­ plejos inmunes, los anticuerpos tipo IgG e IgM se combinan con el antígeno y forman comple­ jos inmunes que fijan complemento. Los com­ plejos inmunes pueden estar formados por antí­ genos solubles o antígenos que forman parte de la estructura de un tejido o una célula. Los complejos inmunes solubles pueden producir vaseulitis y nefritis por su depósito en los endotehos de los vasos o en el glomérulo renal. Los factores del complemento, además de los granulocitos y monocitos, son atraídos a los si­ tios de depósito de los complejos inmunes, pro­ vocando muerte celular. Este mecanismo es el principal responsable de las lesiones observa­ das en el LES, y es muy importante también en la patogenia de los ratones NZB/NZW. Las reacciones inm unitarias m ediadas por células ocurren eomo resultado de las acciones recíprocas de linfocitos T activamente sensibi­ lizados y sus antígenos específicos, y son m e­ diadas por linfoquinas o son debidas a citotoxi­ cidad directa. Es posible clonar líneas celulares T que transfieren la enfermedad a un animal del m ism o haplotipo. Esto ha hecho posible identificar los autoantígenos involucrados en muchas enfermedades autoinmunes experimen­ tales. Los antígenos son péptidos que se unen a moléculas determinadas del MHC. Por ejem ­ plo, líneas T clonadas pueden causar una enfer­ medad desmielinizante del cerebro, la encefalom ielitis alérgica experim ental (EAE), que se asemeja a la esclerosis mtíltiple del ser huma­ no. Estas líneas celulares clonadas son estimu­ ladas por péptidos de la proteína básica de mielina. La identificación de péptidos autoantigénicos es particularmente difícil en el caso de enfermedades autoinmunes mediadas por célu­ las T CD 8 +.

C u ad ro 28-5. Enfermedades mediadas por anticuerpos contra receptores celulares Antígeno

M ecanism o

Sintonías

E n fe rm e d a d d e G ra v e s

Enferm edad

R e c e p to r d e la T S H

E s tim u la n te

H ip e rtiro id is m o

M ia s te n ia g rav is

R e c e p to r d e a c e tilc o lin a

B lo q u e a n te

D e b ilid a d p ro g re s iv a

D ia b e te s m e llitu s

A n ta g o n is ta d e l re c e p to r

B lo q u e a n te

H ip e rg iu c e m ia

571

Autoinmunidad

Cuadro 28-6. Modelos experimentales de autoinmunidad espontánea M odelo anim al

Posible contrapartida de enferm edad en hittrumos

Antígeno inductor

E nferm edad transm itida p o r L T

R a to n e s d ia b é tic o s n o -o b e s o s (N O D )

D ia b e te s m ellitu s in su lin o -d e p e n d ie n te (IDDIVI)

N o c o n o c id o



R a to n e s F l (N Z B X N Z U ')

L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o (L E S )

N o c o n o c id o



C e p a d e p o llo s o b e so s

T iro id itis d e H a s h im o to

T iro g lo b u lin a



A l realizar una prueba de la actividad de cé­ lulas de los nodulos linfáticos sobre monocapas de células de tiroides provenientes de ratones inm unizados con tiroglobulina homóloga, se detectaron células citotóxicas efectoras. La ci­ totoxicidad se produjo después de la estim ula­ ción in vitro con tiroglobulina durante 5 o 6 días. Sin embargo, en esta enfermedad no se excluye el papel de los autoanticuerpos en el agravam iento de la lesión tiroidea, especial­ mente en el ser humano, donde las células B activas se encuentran en número elevado. En algunas enferm edades autoinmunes es­ pontáneas como la IDDM observada en ratones NOD, el 60-80% de las hembras se vuelven hiperglucémicas a las 30 semanas de edad y to­ dos los ratones presentan infiltración linfocita­ ria de los islotes de Langerhans. Estos infiltra­ dos están constituidos principalmente por linfo­ citos T CD4+ y CD 8 +, linfocitos B y m acrófa­ gos pero, por experim entos de transferencia adoptiva, se demostró que los linfocitos T son los principales responsables de la enfermedad. Existen evidencias que demuestran que las cé­ lulas T hl tienen un rol patogénico en la IDDM; por ejemplo, se pudo prevenir el desarrollo de diabetes en ratones NOD por la aplicación de anticuerpos anti-IFN-y. Es posible que este an­ ticuerpo actúe sobre el IFN-'y producido por los linfocitos T h l o el producido por las células NK. En la EAE se pudo demostrar el rol prota-

gónico de las células T hl y no de las Th2, es­ pecíficas para la proteína básica de mielina, ya que la enfermedad pudo ser transferida por cé­ lulas T h ly no por Th2. 4. MODELOS EXPERIMENTALES DE A UTOINM UNIDAD Los modelos animales de autoinmunidad es­ pontánea o experim entalm ente inducida son útiles para tratar de dilucidar la etiopatogenia de estas enfermedades. 4.1. M odelos de autoinmunidad espontánea Diferentes cepas de animales que presentan alteraciones en el sistema inmune han sido m o­ delos útiles para estudiar enfermedades autoin­ munes (cuadros 28-6 y 28-7). Entre los anim a­ les más utilizados para estudiar enfermedades autoinm unes sistém icas podem os citar a un gran número de cepas de ratones, y entre ellas, a la cepa NZB/NZW. En estos animales se ob­ serva nefritis autoinm une con p rese n c ia de complejos inmunes, y son ampliamente utiliza­ dos como modelo experimental para el estudio del lupus eritematoso sistémico (LES) en hu­ manos. El LES murino es una enfermedad que está determinada genéticamente y es muy simi­ lar a la enfermedad humana. Las anormalida-

Cuadro 28-7. Modelos de autoinmunidad experimentalmente inducidos’'^ IVIiastenia g ra v is a u to in m u n e e x p e rim e n ta l (E A M G )

M ia s te n ia g rav is

R e c e p to r d e a c e til-e o lin a

Si

E n c e fa l itis e x p e rim e n ta l a u ­ to in m u n e (E A E )

E s c le ro s is m ú ltip le (M S )

P r o te ín a b á s ic a d e la m ie lin a

Si

A rtritis a u to in m u n e (A A )

A r tritis re u rn a to id e a

M . tuberculosis ( p ro te o g lic a n o s )

Si

T iro id itis e x p e rim e n ta l auto in m u n e (E A T )

T iro id itis de H a s h im o to

T iro g lo b u lin a

Si

E stas e n ferm e d ad es p u e d e n s e r in ducidas en anim ales a p ro p ia d o s, por in y ec ció n del antígeno con a d y u v a n te co m p leto de F reu n d . E x ce p to para la íirtritis a u to in m u n e, el a n tíg en o usad o co rresponde al au to a n tíg e n o a so c ia d o con la en ferm e d ad h u m ana. L a artritis re u rn a to id e a está asociada a re acc io n es co n tra p ro teo g lica n o s, q u e son au to a n tíg e n o s asociados c o n el tejido conectivo.

572

Inmunopatología

Pituitaria

Tiroides

A



F ig. 28-5. E n la enferm edad de G raves, la regulación de la producción de horm ona tiroidea se halla interrum pida. L a e n fe rm e d a d d e G ra v e s es c a u s a d a p o r a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to re s d e la T S H . E n c o n d ic io n e s n o rm a le s , las h o rm o n a s t i ­ ro id e a s se p ro d u c e n c o m o r e s p u e s ta a la T S H la q u e p o r a u to rre g u la c ió n lim ita su p ro d u c c ió n p o r la g lá n d u la p itu ita ria . E n la e n fe rm e d a d d e G ra v e s , los a u to a n tic u e rp o s s o n a g o n is ta s d e la T S H y p o r lo ta n to e s tim u la n d e m a n e ra d e s c o n tro la d a la p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s tiro id e a s , p ro d u c ié n d o s e h ip e rtiro id is m o . A: L a g lá n d u la p itu ita r ia s e c re ta T S H q u e a c tú a so b re la tiro id e s p a ra in d u c ir la lib e ra c ió n d e h o rm o n a s tiro id e a s . B : L a s h o rm o n a s tiro id e a s a c tú a n s o b re la p itu ita ria , p o r d is m i­ n u c ió n d e la p ro d u c c ió n d e T S H , lo q u e p o r fe e d b a c k s u p rim e la sín te s is d e las h o rm o n a s . C : L o s L B a u to in m u n e s p r o d u ­ c e n a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e la T S H , q u e e s tim u la n ta m b ié n la p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s . D: L a p ro d u c c ió n d e h o n n o ñ a s p o r e s tim u la c ió n de l re c e p to r a tra v é s d e la u n ió n d e a u to a n tic u e rp o s n o p u e d e a u to rre g u la rs e , lo q u e c a u s a e x c e s iv a p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s .

des inmunológicas iniciales en cada cepa de ra­ tón pueden variar pero la patogenia es similar en todas las cepas y se caracteriza por hiperfunción de las células B,. producción de autoanti­ cuerpos, formación de \complejos inmunes cir­ culantes, desarrollo de 'glomerulonefritis y en­ ferm edad cardiovascular. Las anorm alidades serológicas primarias comunes incluyen: con­ centraciones elevadas de inmunoglobulinas sé­ ricas, gran cantidad de autoanticuerpos entre los que se Incluyen anticuerpos antinucleares y

anti-ADN de cadena doble y simple. Cada una de las características autoinmunes de los rato­ nes NZB/W se halla bajo un control genético específico y múltiples genes están involucrados en las alteraciones autoinmunes observadas en estos ratones. Se demostró que determinados genes están comprometidos en la aparición de anticuerpos anti-ADN, nativo y desnaturaliza­ do, pero no en la aparición de autoanticuerpos naturales timocitotóxicos, anti-eritrocitarios e IgG m onoclonal. En otro grupo de ratones

Autoinmunidad

Receptores de acetilcolina

M l isc u Io

Los receptores de acetilcolina son endocitados y degradados

573

Flujo de Na+ Contracción muscular

No flujo de Na+ No contracción muscular

Fig. 28-6. A utoan ticuerp os dirigidos contra el recep tor de la acetilcolin a inhiben su función. L a m ia s te n ia g r a v i s es c a u sa d a p o r a n tic u e rp o s d irig id o s c o n tr a la su b u n id a d a d e l r e c e p to r d e a c e tilc o lin a , q u e e s tá r e la c io n a d o co n la t r a s m i ­ s ió n n e u ro m u s c u la r. A: P o r im p u ls o s n e u ro n a le s se lib e r a a c e tilc o lin a q u e se u n e a su s r e c e p to re s , p r o d u c ie n d o c o n tr a c ­ c ió n m u sc u la r. B : E n la m ia s te n ia g ra v is , lo s a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e a c e tilc o lin a se u n e n a lo s r e c e p to re s , p r o d u c i é n ­ d o s e e n d o c ito s is y d e g ra d a c ió n d e lo s re c e p to re s , p o r e n d e la a c e tilc o lin a n o p u e d e ac tu a r.

MRL/lpr el gen Ipr produce linfoproliferación de linfocitos T y es un modelo bastante utiliza­ do para estudiar la artritis reurnatoidea. Los animales más empleados en el estudio de enfermedades autoinm unes específicas de órgano son los ratones diabéticos no obesos (NOD) y ratas bio-breeding (BB), que se utili­ zan en el estudio de la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM ). En ambas cepas de animales se observa reacción autoinmune con­ tra células del páncreas. En estos animales hay aparición espontánea de IDDM con destrucción de células e insulitis. Inicialmente sólo el 10% de las crías de ratas BB eran diabéticas, pero los cruzam ientos selectivos incrementaron la frecuencia de diabetes en forma significativa. La aparición de diabetes en ratas BB es abrupta

y la mayoría de los animales diabéticos mueren de cetoacidosis dentro de la semana de apari­ ción de la enfermedad, a menos que se les ad­ ministre insulina. Un pequeño número de ani­ males manifiesta sólo hiperglucemia y no re­ quiere insulina exógena. En ambos modelos la genética es compleja, pero estudios de entrecruzamiento permitieron demostrar en am bos casos que la susceptibilidad a la diabetes está relacionada con el complejo mayor de h isto ­ compatibilidad. Hay también varios modelos espontáneos de enfermedad tiroidea, en los que se observa de­ sarrollo de tiroiditis autoinmune; esto se puede ver especialm ente en ratas Búfalo, y en los de­ nom inados “pollos obesos” . La tiroiditis au­ toinmune espontánea observada en pollos obe­

574

Inmunopatología

sos es una enfermedad autoinmune espontánea eon earaeterístieas de órgano-específica, que se asemeja a la tiroiditis de Hashimoto del ser hu­ mano. En estos pollos se observan autoanti­ cuerpos contra antígenos de tiroides y la glán­ dula experim enta destrucción progresiva por lesión inflam atoria crónica. Este m odelo es­ pontáneo tiene varias ventajas; por ejem plo, que en las aves, la bursa y el timo están anató­ micamente separados, que el embrión se desa­ rrolla en un huevo accesible y que m uchas crías pueden ser derivadas de un par de padres. 4.2. Modelos de autoinmunidad experimentalmente inducidos Un modelo muy empleado en la inducción de autoinmunidad en determinadas cepas de ra­ tones es realizar timectomía en animales de tres a cinco días de edad. Cuando estos animales son adultos desarrollan enfermedades autoin­ munes caracterizadas por la presencia de au­ toanticuerpos e infiltrados de linfocitos T en los órganos afectados. En ratones BALB/c la principal enfermedad que se induce es la gastri­ tis, aunque también pueden estar presentes la orquitis, ooforitis, pancreatitis, prostatitis y ti­ roiditis. Es poco probable que el m ism o autoantígeno sea el blanco en los diferentes órga­ nos. Se pudo observar que diferentes poblacio­ nes de células efectoras inducen diferentes en­ fermedades, ya que la expresión intratímica de antígenos responsables de la gastritis elimina el desarrollo de gastritis en animales timectomizados pero no el de ooforitis. Se cree que la en­ fermedad está mediada por linfocitos T CD4+ porque pudo ser transferida por este tipo de cé­ lulas obtenidas de animales timectomizados. Sin em bargo, para obtener autoinm unidad experimental es necesario, en la mayoría de los casos, incorporar al material inmunizante sus­ tancias adyuvantes. El uso de adyuvantes tiene importancia no sólo en la inducción sino tam­ bién en la regulación del tipo de respuesta in­ mune; por ejemplo, el tejido cerebral inyectado en animales de experimentación induce encefalomielitis alérgica experimental (EAE) (cuadro 28-7). En esta enfermedad se demostró que el antígeno responsable es la proteína básica de m ielin a, que in c o rp o rad a al ad y u v a n te de Freund completo e inyectada en ratas singenei­ cas induce EAE. Por el contrario, el tratamien­ to de ratas con proteína básica de mielina en adyuvante de Freund incom pleto previene el desarrollo de EAE. Ratas no tratadas y ratas pretratadas con albúmina bovina o proteína bá­ sica de ratón en solución fisiológica no fueron protegidas al ser posteriormente inmunizadas con proteína básica incorporada a adyuvante de Freund completo. Los síntomas que se m ani­

fiestan en ratas enfermas son falta de tonicidad de la cola y debilidad definida de las patas tra­ seras, que ev o lu cio n a a p arálisis com pleta acompañada por incontinencia. Se ha demos­ trado que las células T son responsables de las lesiones observadas en la médula espinal y de la desmielinización producida en estos anima­ les, la mayoría de los cuales se recupera espon­ táneamente y se vuelve resistente a posteriores intentos de inducir la enfermedad. Se ha de­ mostrado que esto es debido a la presencia de células T supresoras. Algunas de las manifesta­ ciones de esta enfermedad experimental se ase­ mejan a una enfermedad desm ielinizante del hombre, la esclerosis múltiple, lo que ha hecho suponer su origen inmunológico. 5. ENFERMEDADES AUTOINM UNES ORGANO-ESPECÍFICAS Y SISTÉMICAS Las enfermedades autoinmunes afectan entre el 5 y 7% de la población mundial, pudiendo causar desde afecciones crónicas leves hasta al­ teraciones muy severas que pueden llevar a la muerte al individuo que la padece. En general, las enfermedades autoinmunes que se observan en humanos pueden ser divididas en dos cate­ gorías: específicas de órgano y sistémicas (cua­ dros 28-8 y 28-9). En las enfermedades órga­ no-específicas, la respuesta autoinmune prima­ ria es dirigida contra un único órgano, glándula o tejido, por tal motivo a esta categoría de en­ fermedades también se la puede dividir tam ­ bién tomando en cuenta el órgano blanco invo­ lucrado (cuadro 28-10). 5.1. Enfermedades autoinmunes órgano-específicas En las enfermedades órgano-específicas, la inmunidad humoral y/o la inmunidad mediada por células inducidas, están dirigidas contra au­ toantígenos localizados en un solo órgano. Es­ tas patologías también pueden ser clasificadas según la enfermedad sea debida principalmente a la inmunidad humoral, celular o a ambas. En algunas ocasiones se presenta más de una en­ fermedad autoinmune en un mismo individuo, especialmente cuando están implicadas glándu­ las de secreción endocrina. En el cuadro 28-8 se detallan las principales enfermedades englo­ badas en este grupo. Enfermedades autoinmunes tiroideas Las hormonas secretadas por la glándula ti­ roides, 3,5,3’,-5’-tetraiodotironina (T^, tiroxina) y 3,5,3’-triiodotironina (Tj), regulan la sín­ tesis de proteínas por acción sobre la transcrip-

Autoinmunidad

575

Cuadro 28-8. Enfermedades autoinmunes órgano-específicas Enferm edad

Respuesta inm une

Autoantígeno involucrado

E n fe rm e d a d d e G ra v e s

R e c e p to r d e la h o r m o n a d e tiro id e s

A u to a n tic u e rp o s (e s tim u la n te s )

T iro id itis d e H a s h im o to

C é lu la s y p ro te ín a s d e tiro id e s

A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i ­ p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a

D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te

C é lu la s p a n c re á tic a s tip o b e ta

A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i ­ p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a

M ia s te n ia g ra v is

R e c e p to re s d e a c e tilc o lin a

A u to a n tic u e rp o s (b lo q u e a n te s )

E s c le ro s is m iíltip le

M a te ria g ris o b la n c a d e c e re b ro

C é lu la s T c ito tó x ic a s y m e d ia d o ra s d e h ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a A u to a n tic u e rp o s

E n fe rm e d a d d e A d d is o n

C é lu la s a d re n a le s

A u to a n tic u e rp o s

A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e

P ro te ín a s d e m e m b r a n a d e g ló b u lo s ro jo s

A u to a n tic u e rp o s

S ín d ro m e d e G o o d s p a s tu re

C é lu la s b a s a le s d e riñ ó n y e s tó m a g o

A u to a n tic u e rp o s

P ú rp u ra tro m b o c ito p é n ic a id io p á tic a

P ro te ín a s d e m e m b r a n a d e p la q u e ta s

A u to a n tic u e rp o s

A n e m ia p e rn ic io s a

C é lu la s g á s tric a s p a rie ta le s ( fa c to r in tr ín ­ se co )

A u to a n tic u e rp o s

ción y estabilización del ARN. El 65% del peso de la es iodo y su forma desiodada (Tj), es la forma activa de la hormona. La acción de la es mediada a través de su receptor, una nucleoproteína que une ADN. La principal proteína intratiroide es la tiroglobulina, glucoproteína de 660 kD, rica en tirosinas, que tiene la capa­ cidad de atrapar iodo ionizado dentro de la glándula. La incorporación de T y su posterior oxidación dentro de la glándula requiere la pre­ sencia de peroxidasa (TPO); esta enzima es una proteína de 107 kD y se halla ubicada en la fracción microsomal del citoplasma de las cé­ lulas tiroideas. La tiroglobulina iodada es alm a­ cenada en los espacios foliculares de la glándu­ la. La secreción de las hormonas tiroideas, y Tj, se produce por acción de enzimas proteolí­ ticas que las liberan de la proteína almacenada y un sistema de feedbaclc regula la función de la glándula. Las células del hipotálamo sinteti­

zan la thyroid releasing hormone (TRH), que estimula a la glándula pituitaria a producir y li­ berar la tyhyroid stimulating hormone (TSH). La TSH estimula al tiroides para que sintetice y libere T 4 y Tj, que finalmente suprimen la ac­ ción de la TSH por competición con la TRH en la pituitaria. De esta manera se cierra el ciclo. Los tests para evaluar la función de la glán ­ dula tiroides miden la concentración sérica de T^, Tj y TSH. El tratamiento de hipotiroidismo se realiza mediante el empleo de tiroxina. E n el caso de hipertiroidismo requiere el uso de dro­ gas que inhiban la síntesis de tiroxina, tra ta ­ miento quirúrgico del total o parte de la glán ­ dula o destrucción de la glándula con iodo ra­ diactivo. Las principales enfermedades autoinm unes tiroideas humanas (tiroiditis de Hashimoto, h i­ potiroidismo autoinmune priinario y enferm e­ dad de Graves) se caracterizan por una reactivi-

C uadro 28-9. Enfermedades autoinmunes sistémicas más comunes Enferm edad

A utoantígeno involucrado

Respuesta inmune

L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o

A D N , p ro te ín a s n u c le a re s ( rib o n u c le o p ro te ín a s ) m e m b r a n a d e p la q u e ta s

A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s

A rtritis re u m a to id e a

T e jid o c o n e c tiv o Ig G

A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s

D e rm a to m io s itis y p o lio m io s itis

I n fla m a c ió n d e m ú s c u lo y p iel

A u to a n tic u e rp o s

E s c le ro d e rm ia

C o ra z ó n , r iñ o n e s , tra c to g a s tro in te s tin a l

A u to a n tic u e rp o s

S ín d ro m e d e S jo g re n

G lá n d u la s s a liv a le s , h íg a d o , r iñ o n e s , t i ­ ro id e s

A u to a n tic u e rp o s

576

Inmunopatología

C uadro 28-10. Clasificación de las principales enfermedades autoinmunes órgano específicas humanas según el órgano o sistema afectado Sistem a endocrino T iro id itis d e H a siiim o to E n fe rm e d a d d e G ra v e s (h ip e rtiro id is m o , tiro to x ic o s is ) D ia b e te s m e llitu s tip o I ( in s u lin o d e p e n d ie n te o d ia b e te s ju v e n il) In su fic ie n c ia a d re n a l (e n fe rm e d a d d e A d d is o n ) O rq u itis a u to in m u n e

Sistem a hem atopoy ético A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e (c o n a u to a n tic u e rp o s ti­ p o “c a lie n te s ”) A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e (co n a u to a n tic u e rp o s “ frío s ” o c río a g lu tin in a s ) T ro m b o c ito p e n ia a u to in m u n e A n e m ia p e rn ic io s a C o a g u lo p a tía s a u to in m u n e s ( a n tic o a g u la n te s c irc u la n te s o s ín d ro m e fo sfo lip íd ic o )

Sistem a neurom uscular M ia s te n ia g rav is P o lin e u ritis a u to in m u n e E s c le ro s is m ú ltip le P o lim io s itis

Piel P é n fig o y o tra s e n fe rm e d a d e s a m p o lla re s

Sistem a cardiopulm onar M io c a rd itis re u m á tic a S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re ( h e m o rra g ia p u lm o n a r y n e fr i­ tis)

dad hacia antígenos tiroideos propios, la que puede estar expresada como una respuesta au­ toinm une de tipo inflam atorio destructivo o una respuesta autoinmune anti-receptor. Tiroiditis de Hashimoto La tiroiditis de Hashimoto es una de las en­ fermedades más comunes que causan hipotiroidismo en adultos. Generalmente afecta a muje­ res de mediana edad y su principal manifesta­ ción es el hipofuncionamiento de la glándula, produciendo severas complicaciones metabólicas, debido a la hipoproducción de la hormona por tumefacción de la glándula tiroides. El hipotiroidism o com ienza con una variedad de signos y síntomas como por ejemplo la apatía por disminución del metabolismo. El mixedema es una manifestación muy comiin del hipotiroidismo y se caracteriza por la tumefacción del tejido subcutáneo, especialmente alrededor de los ojos. En la tiroiditis de Hashimoto, coino en la mayoría de las enfermedades autoinmu­ nes, podría estar involucrado un componente genético, ya que se ha observado, que mieiTibros asintomáticos de una familia tienen mayor incidencia a padecer la enfermedad, si en dicha familia existen antecedentes de la enfermedad.

En la Tiroiditis de Hashimoto el daño princi­ pal está relacionado con la inmunidad mediada por células ya que se encuentran infiltrados de células plasiTiáticas, macrófagos, linfocitos B y linfocitos T, principalmente CD4+. Estas célu­ las pueden, en algunos casos, reemplazar com­ pletamente la arquitectura normal de la glándu­ la tiroides. Las células epiteliales tiroideas pue­ den interaccionar directamente con las células T que expresan tanto antígenos de clase I como antígenos de clase IL La expresión de estos líltimos por parte de las células tiroideas es indu­ cida por el lEN-y liberado por la célula T y di­ cho efecto es incrementado por el factor de ne­ crosis tum oral (TNF). Recíprocamente, estas células tiroideas pueden presentar antígenos a las células T aumentando de esta forma la libe­ ración de citoquinas. El INF-y y T N F a también inducirían la expresión de algunas moléculas de adhesión sobre las células tiroideas como, por ejemplo, la molécula de adhesión intercelu­ lar (ÍCAM -1). Adem ás, IL -ip y T N F -a son sintetizados por las células epiteliales tiroideas, creando la posibilidad de un control autocrino por estas citoquinas. Otras moléculas de adhe­ sión expresadas sobre la célula tiroidea inclu­ yen al CD56 y CD58. El 95% de los sueros de los pacientes con ti­ roiditis de Hashimoto contienen anticuerpos di­ rigidos contra la tiroglobulina y la peroxidasa. Estudios realizados con anticuerpos m onoclo­ nales anti-tiroglobulina humana han contribui­ do a dem ostrar que los epitopes reconocidos por los autoanticuerpos presentes en el suero de estos pacientes se encuentran en la región cen­ tral (no hormonogénica) de la molécula de tiroglobulina, es decir que esta zona estaría ex ­ puesta sobre la superficie de la molécula de ti­ roglobulina nativa. El clonado de los genes de los antígenos involucrados en la tiroiditis de Hashimoto permitió conocer la autoantigenicidad de los mismos, definiendo cuáles son los epitopes específicos para las células T y cuáles para las células B. Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina quizás tengan un rol patogénico limitado, pero se obser­ vó que el reconocimiento de esta porción central por autoanticuerpos en pacientes con el SíndroiTie de Sjogren (ver más adelante) se correlacio­ naría con la severidad de la lesión tiroidea. En el modelo animal de tiroiditis autoinmu­ ne experimental inducido por la inmunización de ratones con tiroglobulina, se demostró que los determinantes iodados son los responsables de la patogenicidad de la enfermedad, ya que son reconocidos por las células T autorreacti­ vas y forman parte de los dominios hormonogénicos de la tiroglobulina. Tanto la tiroglobulina como la peroxidasa ti­ roidea pueden ser expresadas sobre las células

Autoinmunidad foliculares de la tiroides, por lo tanto pueden ser reconocidas por células inmunes y anticuer­ pos. Por otra parte, los LB aislados de sangre de pacientes con tiroiditis de Hashimoto son capaces de producir in vitro anticuerpos anti-tiroglobulina, cuando son co-cultivados con cé­ lulas T antologas y tiroglobulina. Los anticuerpos anti-TPO aparentemente tie­ nen mayor importancia patogénica que los antitiroglobulina. Esto se basa en las siguientes ob­ servaciones: 1) la mayoría de los pacientes con tiroiditis de Hashimoto presentan anticuerpos anti-TPO mientras que los anticuerpos anti-tiroglobulina están a veces ausentes o presentes en pequeña cantidad; 2) los niveles séricos se correlacionan con los estadios activos de la en­ fermedad; 3) a diferencia de los anticuerpos anti-tiroglobulina, los anti-TPO producirían daño directo a las células tiroideas por fijación de complemento; in vitro se observó que dañan las células tiroideas por ADCC con células natural killer. La tiroiditis experimental autoinmune (EAT) puede ser inducida en ratones H-2b por inm u­ nización con TPO porcina purificada o por transferencia adoptiva de células T sensibiliza­ das. En general, los epitopes reconocidos por el receptor de las células T involucrados en la pa­ togénesis de la enfermedad son poco conoci­ dos. Enfermedad de Graves La manifestación clínica más importante es la hiperactividad de la glándula tiroides, con excesiva liberación de hormonas tiroideas (tirotoxicosis). Esta anorm alidad funcional causa hiperactividad con temblores, insomnio y alte­ raciones en el ritm o cardíaco. Un im portante aspecto del hipertiroidismo es la exoftalmia, un peculiar agrandamiento de los globos oculares, que, si es severo, puede causar su daño. Los pacientes con hipertiroidismo tienen anticuer­ pos de tipo IgG contra el receptor de la TSH. Estos anticuerpos m im ifican la acción de la TSH, estimulando inapropiadamente a las célu­ las tiroides a producir excesivas cantidades de tiroxina; las anticuerpos anti-TSH también pue­ den estimular in vitro el crecimiento de las cé­ lulas tiroideas, efecto que podría correlacionar­ se con el agrandamiento de la glándula tiroidea que se observa en la enfermedad de Graves. Existen evidencias de una respuesta inmune dentro de la glándula, ya que se han encontrado LT CD4+ y en menor grado, LT CD8+. Por otro lado, se ha observado in vitro que, LB prove­ nientes de glándulas de pacientes con la enfer­ medad, producen anticuerpos anti-TSH. Tam ­ bién se ha visto que estos anticuerpos están res­ tringidos a una única cadena liviana ( k o X), su­

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giriendo que provienen de una restringida po­ blación de clones B, a pesar de que no ha sido posible detectar LB específicos. Que en el de­ sencadenamiento del hipertiroidismo sean res­ ponsables los anticuerpos anti-TSH ha sido do­ cumentado por el éxito del tratamiento, en al­ gunos pacientes, con methamazole, compuesto con actividad antitiroidea, que reduce la pro­ ducción de anticuerpos. Pero más convincente aun es la inducción de hipertiroidismo en niños recién nacidos, debido al pasaje placentario de dichos anticuerpos. El receptor de la TSH ha sido objeto de estu­ dios debido a su importancia fisiológica e im­ plican cia en la enferm edad de G raves. E stá compuesto por una subunidad extracelular de unión a la hormona y una subunidad de m em ­ brana, unidas por puentes disulfuro. L os pa­ cientes con enfermedad de Graves presentan autoanticuerpos estim ulantes dirigidos contra el receptor de la TSH mientras que pacientes con hipotiroidismo autoinmune primario pre­ sentan anticuerpos que bloquean la unión de la TSH y que no son estimulantes. Ambos tipos de anticuerpos se unirían a distintos sitios del receptor. Los anticuerpos estimulantes activan la adenilciclasa elevando los niveles intracelu­ lares de AMPc y los niveles de ARNm para la tiroglobulina y TPO. La oftalmopatía en la enfermedad de Graves está asociada con anticuerpos dirigidos contra una proteína de 64 kD, específica de la m em ­ brana del músculo del ojo. No se sabe cuál es el origen de estos anticuerpos y por qué no to­ dos los pacientes con enferm edad de G aves presentan daño ocular. Diabetes mellitus La diabetes m ellitus es un desorden en el metabohsmo de la glucosa, debido a una dism i­ nución o falta total de insulina. La deficiencia de insulina produce hipergiucemia, causando aumento de la osmolaridad plasmática, lo que increm enta la producción de orina, que es el primer síntoma de diabetes. Existen dos formas principales de la enfer­ medad: diabetes tipo I, en la que los pacientes dependen de insulina exógena para el m anteni­ miento del metabolismo normal de la glucosa, y diabetes tipo II, donde el tratamiento es fre­ cuentemente innecesario, ya que es suficiente una dieta sin carbohidratos. La diabetes tipo II es debida a disturbios bioquímicos del receptor de la insulina, mientras que la diabetes de tipo 1 es una enfermedad autoinmune que destruye las células p de los islotes de Langerhans del páncreas, células productoras de insulina. Las lesiones específicas de la enfermedad se cono­ cen como insulitis, infiltrado de los islotes de

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Inmunopatología

Langerhans con células mononucleares, espe­ cialmente LT CD8+ y en menor cantidad LT CD4+. La diabetes tipo I, tam bién conocida como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) afecta aproximadamente al 0,2-0,5% de la po­ blación y el pico de aparición de la enfermedad es a los 11-12 años de edad, por lo que a la dia­ betes tipo I también se la conoce con el nombre de diabetes juvenil insulinodependiente. Se ha observado una mayor incidencia de la enferme­ dad según el grupo étnico o raza, lo que indica su estrecha relación con los antígenos del com ­ plejo mayor de histocompatibihdad. La IDDM, si no se trata tempranamente, puede llevar al paciente a un desenlace fatal, debido a la total destrucción de las células de los islotes de Lan­ gerhans del páncreas. La retinopatía diabética, daños renales, y un tipo acelerado de arteriees­ clerosis, que puede llevar a la amputación de las piernas o pies, son las complicaciones más severas de esta enfermedad. La IDDM es considerada una enferm edad autoinmune específica de órgano debido a la presencia de anticuerpos contra distintos com ­ ponentes de las células de los islotes y a la morfología que presenta el páncreas. Además, se ha visto que está frecuentem ente asociada con otras enfermedades autoinmunes específi­ cas de órgano, como enfermedades autoinmu­ nes tiroideas, anemia perniciosa y la enferme­ dad idiopática de A ddison. Los anticuerpos contra las células de los islotes son una caracte­ rística de esta enfermedad; algunos se unen a componentes del citoplasma; otros, a proteínas de la membrana de las células [3. Un hecho im­ portante de estos anticuerpos es que pueden ser un m arcador im portante de la enferm edad, y predecir si un individuo es susceptible o no. Se ha observado que el 80% de los pacientes pre­ sentan anticuerpos contra una proteína de 64 kD localizada en el citoplasma de las células [3. Estos anticuerpos se han detectado antes de la aparición de la enfermedad, por lo tanto, pue­ den servir como marcadores predictivos. Esta proteína de 64 kD ha sido identificada como la ácido glutámico decarboxilasa (GAD), enzima presente en una gran variedad de tejidos que cataliza la síntesis del ácido y-aminobutírico. Se han encontrado dos isoterm as, de 65 y 67 kD respectivamente, pero ambas contienen una secuencia peptídica homóloga a un péptido de la proteína P2-C del virus Coxsackie B4, lo que hace suponer que la IDDM se gatillaría por es­ ta infección viral, aunque todavía no ha sido demostrada reacción cruzada entre el G AD y la molécula P2-C. Los anticuerpos anti-GAD en la IDDM son un enigma, debido a la distribu­ ción de esta enzima en los diversos tejidos del organismo.

En el suero de pacientes, tanto diabéticos co­ mo prediabéticos, se ha detectado la presencia de anticuerpos anti-GAD. Los autoanticuerpos detectados en sujetos en un estadio pre-clínico y en pacientes en quienes la enfermedad es de reciente aparición, están dirigidos contra célu­ las de los islotes (ICA) y autoanticuerpos anti­ insulina (lAA). Durante años se ha tratado de encontrar un marcador sérico en personas sus­ ceptibles a la diabetes antes de la aparición clí­ nica de la misma. Sin embargo, no se han en­ contrado diferencias significativas en el riesgo a desencadenar diabetes entre personas con al­ tos y medianos títulos de anti-GAD. La respuesta autoinmune que se genera tiene bases genéticas, es decir que está relacionada con la presencia de determinados haplotipos de los antígenos del complejo mayor de histocom­ patibilidad de ciase II (especialm ente DR3DR4). El riesgo de un individuo, cuando uno de los progenitores presenta la enfermedad es del 8-10%, y aumenta al 25 % si ambos la pa­ decen. También los factores ambientales pue­ den ejercer efectos moduladores profundos so­ bre dicha predisposición genética; si estos fac­ tores gatillan o protegen de la enfermedad aún no se sabe. Ciertos virus han sido implicados en la inducción de IDDM en humanos, como virus de rubéola, Coxsackie y citomegalovirus. Sin embargo, las evidencias que la IDDM en hum anos resulte de una infección viral que afecte directa o indirectamente a través del sis­ tema inmune a las células, son poco claras. Aún no existen evidencias claras respecto al gatillado de la destrucción celular por algún ti­ po especial de anticuerpo o por algún particular autoantígeno. El argumento en contra de la hi­ pótesis que sugiere que los autoanticuerpos son la causa primaria de la enfermedad es que los LT son las células mayoritarias que se obser­ van en el infiltrado de los islotes. La cepa de ratón NOD es un modelo animal de IDDM ampliamente estudiado. Muchas lí­ neas de trabajo apuntan hacia la importancia de los hnfocitos T en el proceso de destrucción de las células de los islotes dando como resultan­ do el desarrollo de diabetes. Sin embargo, no ha sido fácil la purificación de las células auto­ rreactivas. También se ha comprobado que di­ ferentes citoquinas, liberadas por las células del sistema inmune, juegan un rol muy importante en la patogénesis de IDDM y en el daño celu­ lar. Estudios in vitro han demostrado que cier­ tas citoquinas (IL-1, TN F-a, lEN-y) pueden ser citotóxicas para las células, inhibir la secreción de insulina y, generalmente en combinación, dañar y destruir a las células. La expresión de las mismas se encontró en las lesiones de insulitis en ratones NOD y en ratas BB. El IFN -yha sido detectado en infiltrados de islotes hum a­

Autoinmunidad nos diabéticos con la presencia de linfocitos. También se observó que la administración de IL-2, IL-4, e IL-10 a ratones NOD y ratas BB in vivo pueden prevenir el desarrollo de diabe­ tes. Englobando los resultados mencionados se sugiere que, dada la importancia del IFN-y co­ mo mediador en la destrucción de las células de los islotes in vitro y de la insulitis y diabetes in vivo, las células T hl productoras de IFN-y participarían en el proceso de destrucción de las células de los islotes. Por otro lado, los efectos protectores contra insulitis y diabetes producidos por la ÍL-4 e IL-10, sugieren que las células Th2 productoras de estas citoquinas serían las responsables de prevenir la respuesta autoinmune. Por lo tanto, la respuesta autoin­ mune en IDDM involucraría algún tipo de des­ balance en los circuitos inm unorregulatorios que llevarían a un dominio en la función y pro­ ducción de citoquinas de la población T h l so­ bre la Th2. Miastenia gravis La miastenia gravis (MG) es una enferm e­ dad autoinmune en la que se observa bloqueo de la trasmisión neuromuscular, por la produc­ ción de autoanticuerpos contra el receptor de la acetil colina (AChR). La enfermedad es más frecuente en m ujeres que en hombres; en las mujeres la enfermedad aparece generalmente durante la tercera década de vida y en los hom­ bres, a partir de los 60 años. El sistema m uscu­ lar más afectado es el ocular, laríngeo y respi­ ratorio. Es muy común la asociación entre MG y otras enferm edades autoinmunes, especial­ mente hipertiroidismo. El timo juega un papel muy importante, ya que se ha visto que la timectomía puede curar a pacientes jovenes. El 90% de los enfermos presentan anticuerpos anti-AChR y las madres pueden trasmitir la enfer­ medad a sus hijos, muy probablemente por pa­ saje por placenta de dichos autoanticuerpos. La MG es una enfermedad poco común, pe­ ro es muy estudiada debido a que el autoantíge­ no involucrado en la enfermedad está muy bien caracterizado, lo que permite un excelente sis­ tema para investigar las interacciones molecu­ lares que ocurren en la respuesta autoinmune en humanos. Los anticuerpos contra el AChR son la principal causa de los síntomas que se observan en la enfermedad, la que puede ser in­ ducida en animales sanos por tratamiento con suero o IgG de pacientes con MG o con anti­ cuerpos anti-ACliR. En la MG también hay an­ ticuerpos contra otros epitopes presentes en músculo, contra proteínas sinápticas y contra una proteína de membrana del sarcoplasma in­ volucrada en la liberación del Ca^^. Estos anti­ cuerpos pueden tener un rol en Ja patogénesis

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de la enfermedad, especialmente en casos don­ de los anticuerpos contra la AChR no son detectables. El AChR es una proteína compleja formada por cuatro subunidades homólogas a , (3, y y (e) 6. En el músculo em brionario el A C hR está compuesto de subunidades a , [3, y y 5; después de la inervación, la subunidad y es reemplazada por la subunidad homóloga. No se conoce si la respuesta contra el AChR es iniciada por el mismo receptor o por una pro­ teína de reacción cruzada. Se ha postulado que en pacientes con miastenia gravis, el tim o sería el órgano donde se inicia la inducción contra el AChR. En estos pacientes es común la hiperpla­ sia del timo y en algunos casos se observa la presencia de un timoma y hay presencia de lin­ focitos T y B con receptores anti-AChR. Por lo tanto la timectomía, en estos pacientes es consi­ derada en algunos casos un tratamiento benefi­ cioso. Diferentes proteínas similares al AChR han sido descritas en el timo. Una de estas pro­ teínas es expresada en timomas pero no es un verdadero AChR porque, aunque si bien algu­ nos anticuerpos contra el receptor se unen a ella no se unen a Ja a-bungaroto.xina (péptido de ví­ bora, antagonista colinérgico que reconoce es­ pecíficamente el AChR muscular). El AChR em brionario parece ten er un rol importante en la patogénesis de la MG, lo que explicaría en parte el hecho de que algunos pa­ cientes reconocen solamente AChR embriona­ rio. Se ha propuesto que los anticuerpos contra el AChR en MG reconocen epitopes únicos del AChR embrionario o comunes a ambas formas, em brionaria y adulta, pero nunca reconocen epitopes pertenecientes solamente a la forma adulta del AChR. Los anticuerpos anti-AChR de pacientes con M G causan degradación acelerada del AChR por entrecruzamiento o por lisis m ediada por complemento de la membrana post-sináptica y raramente bloquean el sitio de unión colinérgica. Estos anticuerpos son polielonales y hay poca correlación entre el título de anticuerpos y la severidad de los síntomas, sugiriendo que sólo ciertas subpoblaciones de anticuerpos con­ tra AChR son patogénicas, quizás debido a su capacidad de degradar el AChR y/o de activar el complemento. Algunos pacientes con MG no tienen anticuerpos detectables contra el AChR, y otros pueden producir anticuerpos contra epi­ topes del AchR que no están relacionados con de la unión neuromuscular. L a mayoría de los anticuerpos anti-AChR están dirigidos contra una porción extracelular de la subunidad denominada MIR (principal re­ gión inmunogénica) y que está conservada en diferentes especies animales. Los anticuerpos anti-MIR jugarían un rol muy im portante en la

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patogenicidad de la enferm edad, ya que su transferencia pasiva en ratas Lewis puede des­ encadenar MG; en cambio la enfermedad no se desencadena si se inoculan anticuerpos dirigi­ dos contra otras porciones de la misma subuni­ dad y contra otras subunidades del receptor. Por otro lado, los anticuerpos anti-MIR, cuan­ do se añaden a cultivos de células musculares son capaces de inhibir la expresión del AChR, causando el mismo efecto los sueros de pacien­ tes con MG. Se puede concluir que los anticuerpos son los principales responsables de los síntom as observados en MG y que los anticuerpos antiMIR pueden tener un rol predom inante en la enfermedad. Los anticuerpos anti-MIR tienen diferentes idiotipos y parecería que la activa­ ción de los anticuerpos anti-idiotipos del cir­ cuito inm unorregulatorio podrían ser de uso práctico en el tratam iento de la enferm edad. Los síntomas de la MG pueden ser disminuidos por el uso de toxinas unidas a AGhR ya que pueden llevar la toxina a los linfocitos B antiAGhR. Esclerosis múltiple La esclerosis m iiltiple es una enferm edad desm ielinizante del sistem a nervioso central, siendo los linfocitos T importantes mediadores de la misma. En la actualidad se están realizan­ do numerosos estudios sobre esta enfermedad y las investigaciones se basan fundamentalmente en un modelo experimental de encefalitis au­ toinmune (EAE) inducido en ratas Lewis. Estos animales, cuando son inyectados con mielina o proteína básica de mielina (MBP), al cabo de 14 días desarrollan una parálisis ascendente de la cola seguida por debilidad de las patas trase­ ras o parálisis de las mismas. En los estudios histológicos se observa inflamación de las m e­ ninges asociada a desmielinización primaria de la médula espinal. Por microscopía electrónica se observan células apoptóticas presentes en el sistema nervioso central desde el día de la apa­ rición de la enfermedad hasta el momento en que comenzó la recuperación del animal. Los linfocitos CD4+ que reaccionan contra la pro­ teína básica de mielina son los factores patogé­ nicos en la EAE. Si se inyectan linfocitos T que reaccionan con MBP, en animales norma­ les en form a endovenosa, estos linfocitos se acumulan en el sistema nervioso central y cau­ san EAE. Su patogenicidad involucra procesos complejos tales como localización, extravasa­ ción de células que inducen EAE e inducción de daño en el sistema nervioso central. La hi­ persensibilidad de tipo retardada es uno de los procesos patogénicos de los linfocitos T encefalogénicos. Los linfocitos T-MBP pueden in­

terferir en la conductividad o ser citolíticos. Se ha observado que los astrocitos que presentan . MBP pueden ser Usados por células específicas para MBP. La actividad lítica está restringida a las m oléculas del CM H -II, es específica de MBP y está asociada con la encefalogenicidad de las células T. 5.1.1. Clasificación de las enfermedades autoinm unes según el sistema involucrado Como se puede ver en el Cuadro 28-10, las enfermedades autoinmunes específicas de ór­ gano se pueden clasificar también según el sis­ tema involucrado. Aquí mencionaremos algu­ nas de ellas. E nferm edades autoinm unes del sistema hematopoyétieo Síndrome antifosfoUpídico En 1963 Bowie y col. describieron que un grupo de pacientes con LES presentaban una extraña sintomatología clínica: trombosis recu­ rrente, y el plasma contenía un factor que era capaz de inhibir la coagulación in vitro, por lo que años más tarde se lo llamó anti-coagulante lúpico. En el año 1987, se agrupó a estos pa­ cientes bajo el término de síndrome antifosfolipídico (APS), ya que sus sueros presentaban anticuerpos anticardiolipina y anti-fosfolípidos. Por otro lado, este síndrome ocurría gene­ ralm ente en ausencia de m anifestaciones de LES. El APS puede presentarse con diferentes ma­ nifestaciones, pero siem pre depende de una trombosis primaria. La trombosis comienza en las venas de las piernas, continúa con embolis­ mo pulmonar e infarto placentario con abortos espontáneos recurrentes. Los anticuerpos anti-fosfolípidos tienen pre­ ferencia por los lípidos cargados, clasificados como cardiolipinas, uniéndose al grupo polar del fosfato. Se pueden encontrar dos formas de fosfolípidos: la forma laminar, que es el mayor componente fosfolipídico de la bicapa de las m em branas celulares, m ientras que la form a hexagonal es componente menor. Los anticuer­ pos anti-fosfolípidos preferentemente se unen a la forma hexagonal. Por otro lado, éste es el fosfolípido inmunogénico para ratones, sin ne­ cesidad de adyuvantes, mientras que la forma laminar no es inmunogénica, aunque se inyecte con adyuvante. Por lo tanto, los anticuerpos anti-fosfolípidos pueden ser el resultado de una respuesta inmune contra la forma hexagonal, que por alguna causa se exprese de m anera anormal sobre la membrana celular. Algunos investigadores creen que el cofactor P^-gluco-

Autoinmunidad proteína, componente normal del plasma, pue­ da ser fundamental para la unión de los anti­ cuerpos a la cardiolipina. Algunos anticuerpos anti-fosfolípidos pue­ den reaccionar con ADN, vía el fosfato del áci­ do nucleico. Más aun, ratones normales inmu­ nizados con cardiolipina conjugada a una pro­ teína, producen anticuerpos que reaccionan con cardiolipina y ADN. Estos resultados estarían explicando la reactividad cruzada de los anti­ cuerpos anti-fosfolípidos en el LES. Aún se desconocen los mecanismos median­ te los cuales los anticuerpos anti-fosfolípidos producen trombosis. Dos grupos de investiga­ dores han dem ostrado que la adm inistración endovenosa de anticuerpos anti-fosfolípidos en ratones preñados causa la muerte fetal. A pesar de ello, la patogenicidad de estos anticuerpos no está universalmente aceptada. Vasculitis Los síndromes vasculíticos son un grupo de desórdenes heterogéneos, en los cuales la ma­ nifestación principal es la inflamación de las paredes de los vasos sanguíneos. Pueden afec­ tar los vasos grandes, medios y pequeños de to­ do el organismo, pero con mayor frecuencia, los vasos de la piel, riñones, pulmones y cere­ bro. El hallazgo de anticuerpos contra componen­ tes del citoplasm a de neutrófilos (ANCA) ha sido una importante contribución para dilucidar los mecanismos de estos síndromes. Uno de los ANCA se une específicamente a una serin-proteasa (m ieloblastina) que se encuentra dentro de los gránulos azurófilos de los neutrófilos. Estos anticuerpos son característicos de la granulom atosis de W egener y su concentración tiende a correlacionarse con el período activo de la enfermedad. Un segundo tipo de ANCA se une a mieloperoxidasa, otra enzima neutrófila. Los anticuerpos anti-mieloperoxidasa apare­ cen en diferentes tipos de vasculitis, principal­ mente poliartritis nodosa y glom erulonefritis necrotizante. Se vio que los dos tipos de ANCAs eran capaces de activar a los neutrófilos in vitro, causando la degranulación y producción de radicales libres, y estos efectos eran incre­ mentados por efecto del TNF. Estos hallazgos estarían indicando que los ANCA tienen un rol patogénico en los diferentes tipos de vasculitis. No se conoce aún si estos anticuerpos son el re­ sultado de una primera injuria que causa libera­ ción de antígenos potencialmente inmunogéni­ cos a partir de neutrófilos, o a través de algún otro mecanismo. Muchas agentes infecciosos tienen la capaci­ dad de activar neutrófilos, pero no inducen vas­ culitis o la producción de ANCAs, por lo tanto

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la v asculitis m ediada por ANCA es aún un enigma, como la mayoría de las enfermedades autoinmunes. Anemia hemolítica autoinmune (AHAI) La AHAI comprende un grupo de enferme­ dades que se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos contra glóbulos rojos, causan­ do una severa disminución de la vida m edia de dichas células. Se conocen dos tipos de autoanticuerpos anti-glóbulos rojos, IgG e IgM, ambos con dife­ rente especificidad y asociados a diferentes AHAI. Los autoanticuerpos de tipo IgG , aun­ que se unen a eritrocitos, no son capaces de aglutinarlos y sólo pueden ser evidenciados m ediante el uso del suero anti-Y-globulinas (test de Coombs). Los antígenos a los cuales se unen estos autoanticuerpos han sido difíciles de caracterizar. Hoy se sabe que se hallan dentro del altamente polirtiórfico sistema Rh. L a ca­ racterística de esta enfermedad es la anem ia he­ molítica por la depuración de eritrocitos unidos a los anticuerpos, vía receptor Fe de m acrófa­ gos. Estos autoanticuerpos no son fijadores de complemento, por lo tanto, la hsis intravascular es poco común. La AHAI asociada con anti­ cuerpos de tipo IgG puede ser idiopática o estar asociada a LES u otras enfermedades autoininunes. Los anticuerpos de tipo IgM asociados a ia AHAI a son capaces de aglutinar a los glóbulos rojos, por lo se los conoce con el nom bre de crioaglutininas (CA), ya que lo hacen a bajas temperaturas (4-22°C). Las CA reconocen un sistema de antígenos llamado I/i, cuyo epitope está formado por unidades repetidas de N-acetil-lactosam ina de manera lineal o ram ificada respectivamente. El antígeno i se h alla sobre los glóbulos rojos fetales y de recién nacidos; el antígeno I aparece luego de los tres m eses de vida. E stos anticuerpos norm alm ente se hallan presentes en el sitero de individuos normales, en títulos muy bajos, pero en la enfermedad se incrementan enormemente, pudiéndose obser­ var aglutinación con sueros diluidos hasta 1: 10''. La enfermedad crónica por CA es debida generalmente a anticuerpos monoclonales de ti­ po IgM producidos por células B neoplásicas. Un hecho llamativo de estos autoanticuerpos es que, hasta el presente, son el único modelo de autoanticuerpos con restricción en el uso de un determinado gen Vj^. La asociación es con el Vj^4-21, gen da la familia V h4. Este gen es altamente representado en el repertorio de LB normales. Si un antígeno extraño o propio se­ lecciona una célula B V h4-21+ y, si esta célula sufre una transformación maligna, el resultado

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puede ser la producción de un alto nivel de an­ ticuerpos monoclonales patogénicos y con es­ pecificidad de CA. Enferm edades autoinm unes de la piel Antes de hablar de las enfermedades autoin­ munes de la piel es importante hacer una intro­ ducción, aunque breve, de cómo está constitui­ do este órgano. La piel es el órgano más extendido del cuer­ po. Está formado por un epitelio (epidermis), una matriz de tejido conectivo (dermis) y tejido adiposo (hipodermis) y muchas de las estructu­ ras de la piel han sido clasificadas en función de su composición bioquímica. La epidermis está constituida por un epitelio estratificado, células pigm entarias (melanocitos), células dendríticas (células de L an g er­ hans), y linfocitos residentes. Los queratinocitos, componente mayoritario de la epidermis, contienen un citoesqueleto form ado por fila­ mentos de queratina. Dichos filamentos se in­ sertan en la placa de desmosomas y hemidesmosoraas estableciendo uniones con las células adyacentes. Los queratinocitos se distribuyen formando diferentes capas con distinto grado de diferenciación. La dermis está formada por tejido conectivo, sistema de fibras, filamentos y un sistema co­ nectivo amorfo, que acomoda la red de nervios y vasos. Las células más características son los fibroblastos y macrófagos. En la dermis, en res­ puesta a diferentes estímulos, pueden aparecer células derivadas de la sangre como linfocitos, células plasmáticas y leucocitos. La dermis pro­ tege al cuerpo de injurias mecánicas externas. La adhesión célula-célula de la epidermis es mantenida por la unión de las proteínas de la membranas celulares y reforzada por diferentes tipos de adhesiones intercelulares. En estos di­ versos tipos de adhesiones participan diferentes proteínas especializadas como microfilamentos de actina, filamentos intermedios (tonofi lamen­ tos de queratinas), vinculinas, placoglobina, a actinina, etc. Los desmosomas son placas epiteliales que unen los tonofilamentos y son los que mantie­ nen la resistencia mecánica de la piel y las m u­ cosas. Por otro lado, las proteínas desmosomales son las reconocidas por los autoanticuerpos presentes en la m ayoría de las enfermedades ampollares. Las principales proteínas que com ­ ponen las placas desmosomales son: desmoplaquina, desmogleína, placoglobina y desmoglobina. Las diversas enfermedades autoinmnes que atacan a la piel se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra diferentes componentes proteicos de las diversas capas de

la piel. La mayoría de estas enfermedades sé conocen también con el nombre de enfermeda­ des am pollares, siendo las más com unes las que se hallan bajo la denominación de Pénfigo. Los autoanticuerpos que se encuentran en el suero de pacientes con enfermedades ampolla­ res han sido de gran importancia para identifi­ car las diferentes moléculas de la piel responsa­ bles de las adhesiones epiteliales célula-célula y de las adhesiones dérmicas/epidérmicas. Enferm edades ampollares (Pénfigo) El pénfigo (del griego pemphix, ampolla) es una enfermedad autoinmune de la piel y mem­ branas de mucosas. Se conocen diferentes tipos de pénfigos, en­ tre los cuales podemos nombrar: el P. vulgaris (con ampollas orales y cutáneas, por la presen­ cia de IgG intracelular), el P. vegetans (con le­ siones orales y verrugas que simulan erupción, por la presencia de IgG intracelular), P. foliaceus (con ampollas superficiales en piel, por la presencia de IgG en la epidermis), el P. brasi­ leño (con ampollas superficiales en piel, por anticuerpos en la epidermis). El más comiín es el P. vulgaris. Posteriormente a la formación de las ampo­ llas aparece la acantolisis debida a la pérdida de la conexión entre las células epidérmicas de la piel por desaparición de puentes intracelula­ res. La lesión acantolítica puede contener un exudado inflamatorio, pero un hecho más ca­ racterístico de estas patologías es la presencia de autoanticuerpos contra importantes sustan­ cias que mantienen la estructura rígida de las células de la piel. El suero de los pacientes también contiene estos autoanticuerpos, cuyo título tiende a fluctuar, según la actividad de la enfermedad. Los anticuerpos que aparecen en todos los ti­ pos de pénfigo están dirigidos contra antígenos conservados del epitelio estratificado. La carac­ terización de estos autoantígenos es muy com­ pleja. Los autoanticuerpos presentes en el P. foliaceus inmunoprecipitan un complejo polipeptídico de epidermis de 269 kD, 160 kD y 85 kD. El polipéptido de 85 kD es la placoglobina, un componente del desmosoma, que media la adhesión celular de la epidermis. La proteína de 160 kD es la desmogleína, una glucoproteí­ na de transmembrana que se extiende en el in­ terior del desmosoma. En el P. vulgaris, el autoanticuerpo une un autoantígeno epidérmico de 210 kD, conformado por dos cadenas poli­ peptídicas de 130 kD y 85 kD (placoglobina), unidas por puentes disulfuros. El componente de 130 kD es un miembro de la familia de la caderinas, que median la adhesión célula-célula y son Ca^+ dependiente.

Autoinmunidad La desmogleína es el autoantígeno reconoci­ do por los anticuerpos presentes en el P. foliaceus. La glucoproteína de 210 kD se halla en la región baja de la epidermis, sitio relacionado con el P. vulgaris, mientras que la proteína de 160 kD identificada por los anticuerpos presen­ tes en el P .foliaceus se localiza en la región al­ ta de la epidermis, zona afectada en este tipo de pénfigo. Los anticuerpos involucrados en estas pato­ logías también producen liberación del activa­ dor de plasminógeno a partir de las células epi­ dérmicas. Esta enzima proteolítíca es capaz de participar en los mecanismos que causan pérdi­ da de adhesión entre las células epidérmicas, quizás por degradación de la sustancia intrace­ lular. Una dramática demostración que la actividad patogénica de los autoanticuerpos es el desa­ rrollo de lesiones ampollares en un niño recién nacido, cuya madre padece de pénfigo vulgaris activo. La susceptibilidad de contraer algunos de los tipos de pénfigo se halla ligada al HLA-DR4 y al HLA-DRw6 y específicamente al HLA-DR4 variante cadena-¡3 (DwlO DR(3I). 5.2. Enferm edades autoinmunes no órgano-específicas (sistémicas)

La enfermedades autoinmunes no órgano-específicas, también llamadas sistémicas, se ca­ racterizan por la presencia de autoanticuerpos circulantes que pueden ser patogénicos o no y están dirigidos contra autoantígenos presentes en todo el cuerpo, no siendo específicos de un órgano en particular (cuadro 28-9). La presencia de uno o más autoanticuerpos circu lan tes co n tra autoan tíg en o s n u cleares (ANAs) es la característica de las enferm eda­ des reumáticas sistémicas. Este grupo de enfer­ medades no presenta manifestaciones clínicas homogéneas, sino graduaciones en la variedad y severidad de los multisistemas involucrados. El lupus eritematoso sistémico (LES) es el pro­ totipo de enfermedad autoinmune que involu­ cra una variedad de órganos y tejidos, como ser, articulaciones, piel, riñones, sistem a ner­ vioso central, pulmones, corazón y músculo es­ quelético. Otras enfermedades de este grupo, como la enfermedad mixta del tejido conectivo (M CTD), síndrom e de Sjógren (SS), artritis reum atoidea (AR) y esclerodermia (Sel), son de un orden intermedio en el rango y variedad de órganos involucrados. Finalmente se halla la dermato/polimiositis, donde los órganos blanco son piel y músculo. Las enfermedades autoinmunes como LES, SS, escleroderm ia y polimiositis se caracteri­ zan por la presencia de anticuerpos antinuclea­

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res (ANAs). Estudios realizados m ediante la técnica de inm unotransferencia y clonado de ADN han revelado que los autoantígenos rela­ cionados con este multisistema de enfermeda­ des autoinmunes son importantes proteínas re­ lacionadas con el metabolismo de ácidos ribo­ nucleicos, que incluyen ARNt, ADN y cofactores de la RNA polimerasa. Entre esta gran variedad de autoantígenos in­ volucrados en el reconocimiento de los autoan­ ticuerpos relacionados con las enferm edades autoinmunes sistémicas se hallan las partículas ribonucleoproteicas (RNP) altamente conserva­ das, como las SSA/Ro, SSB/La y uRNP. Su es­ trecha vinculación con enferm edades autoin­ munes ha permitido un estudio profundo sobre su naturaleza molecular y la caracterización de su secuencia; esto ha permitido la identifica­ ción de homologías estructurales y de secuen­ cia con proteínas no relacionadas, así como la localización de secuencias RNP consenso, que se han relacionado con la propiedad de estos autoantígenos de unir ARN. Debido a que estos motivos (estructuras repetidas) se hallan alta­ mente difundidos, se ha postulado que el siste­ ma inmune puede reconocer antígenos simila­ res presentes en un amplio número de organis­ mos, y mediante reactividades cruzadas ser res­ ponsables del desencadenamiento autoinmune. Como se ha podido hallar una eficiente reacti­ vidad por parte de los autoanticuerpos contra estos motivos, se ha sugerido que pueden fun­ cionar como epitopes para los LT. Clark y col. en el año 1969 describieron por primera vez el antígeno SSA/Ro en un paciente con LES. Estudios posteriores, utilizando sue­ ros pacientes con SS, revelaron que los mismos eran capaces de precipitar tres antígenos dife­ rentes provenientes de un extracto de linfocitos humanos. Estos anticuerpos fueron designados como A, B y C y con el prefijo SS, indicando que estaban involucrados en el SS. A ños más tarde Alspaugh y Maddison demostraron que el Ro y SS-A eran el mismo antígeno y que no eran específicos del SS, ya que los sueros de pacientes con LES también contenían estos au­ toanticuerpos, aunque con menor frecuencia. Estos autoanticuerpos reconocen partículas ri­ bonucleoproteicas pequeñas, cuyo componente proteico varía entre 50 y 150 kD. Estudios rea­ lizados por diversos autores han llegado a la conclusión de que el principal componente del sistema Ro es un polipéptido de 60 kD que se asocia a pequeños ARN de 83-112 nucleótidos. Esta proteína es común a muchos tipos celula­ res, y el análisis de extractos de linfocitos y eri­ trocitos ha perm itido identificar otra proteína de 52 kD en linfocitos y de 54 kD en eritroci­ tos, ambas antigénicamente diferentes, ya que se han encontrado sueros que son capaces de

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reconocer una y no la otra. La disociación de la respuesta inmune hacia distintas proteína de Ro sugiere la posibilidad de diferentes procesos autoinmunes en las patologías en las que se ha­ llan involucrados estos autoanticuerpos. A comienzos de la década del ’70 Mattioli y Reichlin observaron que el extracto citoplasmático de timo de ternera presentaba un antíge­ no precipitable por el suero de un paciente con LES, al que denom inaron La, in iciales del nombre del paciente. Estudios posteriores de­ mostraron identidad entre los antígenos SS-B y La. Este autoantígeno es una fosfoproteína alta­ mente conservada y se han descrito por lo m e­ nos seis isoformas, siendo el polipéptido mayoritario de 46-48 kD. Los autoanticuerpos antiLa se detectan casi exclusivamente en pacien­ tes con SS y LES, aunque con mayor frecuen­ cia en el SS. En el año 1959, Holman y col. describieron en el suero de pacientes con LES, la presencia de anticuerpos que reaccionaban con un antíge­ no nuclear diferente al ADN y ribonucleoproteínas que, años más tarde. Tan y Kunkel deno­ m inaron Sm (iniciales del nom bre de un p a­ ciente). Mattioli y Reichlin observaron que este antígeno era lábil al tratamiento con ARNasa, por lo tanto lo definieron como una ribonucleoproteína, que denominaron U1 RNP. Los anti­ cuerpos anti-Sm reconocen pequeñas partículas ribonucleicas presentes en todas las células eucariotes. Una importante caracterización de es­ te autoantígeno o sistema de autoantígenos es el hecho de que los anticuerpos anti-Sm son ca­ paces de precipitar pequeñas partículas de ribonucleoproteínas diferentes (U l, U4, U5 y U6), en cambio los anticuerpos anti-U l sólo reac­ cionan con la partícula nRNP U l . A su vez, ca­ da una de las nRNP U está asociada a diferen­ tes polipéptidos, por lo que este complejo siste­ ma de autoantígenos se conoce de acuerdo al peso molecular del péptido al cual los nRNP U están asociados; Sm B ’ (27 kD), SmD (13 kD), SmE/F (un duplete de 11 kD) y SmG (menor a

10 kD). Los autoantígenos nRNP Sm fu n cio -' nalmente están relacionados con el splicíng del pre-ARNm. Cada síndrome está asociado con una restric­ ta variedad de ANAs, coino ser: anti-La con SS, anti-Sm con LES, enzimas anti-sintetasas con miositis, anti-topoisomerasa I (Sel 70) con esclerodermia y anti-centrómero con CREST. Debido a ello, la precisa caracterización de un determinado ANA es de gran valor de diagnós­ tico y pronóstico (cuadro 28-11 y fig. 28-7). La inm unotransferencia (immunoblotting o W estern-blot) es la técnica más utihzada en la actualidad para determinar la especificidad de un particular autoanticuerpo. Esta técnica se basa en la separación, por eleetroforesis en gel de acrilamida, de las diferentes proteínas con distinto peso molecular, presentes en un extrac­ to celular soluble, y después transferidas a una m em brana de nitrocelulosa. La mem brana es luego incubada con sueros de pacientes; de es­ tar presente algún autoanticuerpo específico, se unirá a su autoantígeno. Esta unión podrá vi­ sualizarse con un anticuerpo anti-y-globulina humana marcado con una enzima. La visualiza­ ción de una banda de 47 kD sugiere la presen­ cia de autoanticuerpos SS-B, mientras que la unión con una pro teína de 60 kD indica la pre­ sencia de autoanticuerpos SS-A. Por medio de las técnicas de biología molecular se han podi­ do clo n ar algunos au to an tíg en o s com o ser RNP, Sm, SS-A, y SS-B, lo que ha permitido el desarrollo de técnicas mucho más sensibles co­ mo el enzimoinmunoanálisis (ELISA). Lupus eritematoso sistémico (LES) El LES es una enfermedad que afecta princi­ palm ente a m ujeres jóvenes adultas aunque también se presenta en niños y ancianos de am­ bos sexos. Clínicamente, el LES se presenta con fiebre alta, artralgia, erupciones de piel, problemas cardíacos, pulmonares y renales. Se observan

C u ad ro 28-11. Anticuerpos antinucleares y patologías autoinmunes sistémicas asociadas A utoantígeno

E nferm edad asociada

d s -A D N

L E S (7 0 -9 0 % )

S m (S m ith ), R N P H is to n a S S -A (R o) S S -B (L a) S c i-70 C e n tró m e ro Jo-1

L E S (3 0 % ) L E S , L E S in d u c id o p o r d ro g as L E S , SS L E S , SS E s c le ro d e rm ia E s c le r o d e rm ia P o lio m io s itis

IFI; inm u n o flu o resc en cia ; E L IS A : e n z im o in m u n o an á lisis; W B : in m u n o tran sfe ren c ia ; ID : in m u nodifusión. ds-A D N : A D N de do b le ca dena.

Técnica usada C rith id ia L u c ilia e (lE t) E L IS A ID -W B E L IS A -W B ID -W B ID , W B ID , W B IFI ID

Autoinmunidad

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Fig. 28-7. Perfiles de inm unofluorescencia ob ten id os en fren tan d o células H ep-2 con diferentes a u toanticu erp os. A: p e rfil h o m o g é n e o o b te n id o con un s u e ro d e L E S q u e contiene p r in c ip a lm e n te anticuerpos a n ti-A D N d e d o b le c a d e n a . B: p e rfil d e p u n te a d o f in o /n u c le o la r, d a d o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S c l-7 0 . C : p e rfil d e p u n te a d o g ru e s o , o b te n id o c o n a n tic u e rp o s an ti-S m , a n ti-R N P , S S -B u o tro s. D: p e rfil p e rifé ric o p ro d u c id o p o r a n tic u e rp o s p o r a n tic u e rp o s a n ti-A D N d e d o b le c a d en a o a n tic u e rp o s a n ti-m e m b ra n a n u c le a r. E : p erfil d e p u n te a d o fin o p r o d u c id o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S S -A , e ste p e rf il p u ed e d a rse ta m b ié n c o n o tro s a u to a n tic u e rp o s. F: p e rfil n u e le o la r, q u e c o n fre c u e n c ia se o b s e rv a c o n s u e ro d e p a c ie n te s c o n esc le ro d e rm a . T a m b ié n se o b s e rv a la r e g ió n n u e le o la r d e s o rg a n iz a d a d e u n a c é lu la en d iv is ió n .

autoanticuerpos contra distintos antígenos del organisiTio, variaciones en el nivel de comple­ mento sérico, presencia de complejos inmunes, ininunidad mediada por células ligeramente al­ terada e importantes lesiones en distintos órga­ nos. En el cuadro 28-12 se detallan los autoanti­ cuerpos más característicos presentes en LES. A nticuerpos antinucleares. Aunque no to­ dos estos anticuerpos son específicos del LES, su presencia es un factor importante en el diag­ nóstico diferencial de las enfermedades del te­ jido conectivo. Una técnica muy eiTipleada en la detección de los ANAs es la inmunofluorescencia indi­ recta utilizando como material nuclear hepatocitos de ratón obtenidos m ediante cortes al crióstato u homogeneizado del órgano. Se ob­ servó que los resultados obtenidos con el uso de este material eran de baja especificidad y sensibilidad, por tal motivo fue reem plazado por células H ep-2 en m etafase, línea celular proveniente de un epitelioma humano. Existe una clara correlación entre la presen­ cia de anticuerpos circulantes contra ADN nati­ vo y glom erulonefritis de tipo lúpico, ya que cuando la afección renal entra en remisión, el nivel de anticuerpos anti-ADN desciende nota­ blem ente. En pacientes que padecen LES y presentan anticuerpos anti-ADN desnaturaliza­

do, sólo se demostró compromiso de piel, arti­ culaciones y células sanguíneas. Por otra parte, los pacientes con LES severo presentan gene­ ralmente lesiones renales, pleuritis, pericarditis y compromiso del sistema nervioso central; en estos casos es poco comtin la presencia sola­ mente de anticuerpos anti-ADN desnaturaliza­ do. Por lo tanto, la detección de anticuerpos anti-ADN nativo es de gran importancia para el pronóstico de esta enfermedad. Existe una gran variedad de técnicas que utilizan ADN nativo, de distinto origen, como material antigénico.

C u a d ro 28-12. P rincipales autoanticuerpos presentes en LES 1) A n tic u e r p o s a n tin u c le a re s (A A N ) a) c o n tra n u c le o p ro te ín a s b ) c o n tra á c id o d e s o x irrib o n u c le ic o (A D N ) c ) c o n tra á c id o r ib o n u c le ic o (A R N ) d ) c o n tr a h isto n a e ) c o n tra a n tíg e n o s n u c le a re s e x tra c ta b le s ( E N A ) 2) A n tic u e rp o s c o n tra a n tíg e n o s R o y La. 3) A n tic u e r p o s a n ti-Ig G y a n ti-lg A (fa c to r r e u m a to id e o ). 4) A n tic u e r p o s a n ti-c ito p la s m á tie o s 5) A n tic u e rp o s a n ti-e ritro c ito s 6) A n tic u e r p o s a n ti-fa c to re s d e la c o a g u la c ió n 7) A n tic u e rp o s c o n tra a n tíg e n o s ó r g a n o -e s p e c ífic o s 8) A n tic u e rp o s a n ti-c o lá g e n o ’ 9 ) A n tic u e rp o s c o n tra m e m b ra n a b a sal g lo m e ru la r (M B G )

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Inmunopatología

La técnica de inm unofluorescencia indirecta, utilizando como sustrato Crithidia lucilliae fue introducida por Aarden y col. en 1975. El uso de este microorganismo se fundamenta en que posee un cinetoplasto de gran tamaño, rico en ADN nativo. Es una técnica simple y se pensó que era específica para anticuerpos anti-ADN nativo. Sin embargo, Deng y col. demostraron que ocasionalm ente anticuerpos anti-histona pueden unirse al cinetoplasma. Estudios adicio­ nales indicaron que la expresión de histona era función del ciclo de vida del microorganismo y es detectada con más facilidad dos días después de la iniciación del cultivo. Este detalle debe tenerse presente al utilizar esta metodología p a­ ra investigar anticuerpos anti-ADN nativo. Sin embargo hay una buena correlación entre esta metodología y la técnica de Farr cuando ios tí­ tulos de anticuerpo están relativamente eleva­ dos. Otras técnicas utilizadas para la detección de anticuerpos anti-ADN nativo son la hemaglutinación de células tañadas, fijación de comple­ mento, contrainmunoelectroforesis, unión espe­ cífica del antígeno marcado (método de Farr), etcétera. A lgunos autores observaron poca correla­ ción entre ensayos utilizando técnicas diferen­ tes, en la determinación de anticuerpos antiADN; esto se debería a que, en cada ensayo se miden anticuerpos de distintas afinidades y a la posibilidad de reacciones cruzadas. La princi­ pal diferencia se encuentra entre ensayos de fa­ se sólida, como el ELISA, que detecta una am­ plia gama de anticuerpos de reacción cruzada, y ensayos de fase líquida, como la técnica de Farr, que detecta principalmente anticuerpos de alta especificidad y afinidad. A lgunas de las reacciones cruzadas son probablem ente debi­ das a la estructura polianiónica del ADN que reaccionaría con proteínas cargadas positiva­ mente como inmunoglobulinas. Por otra parte, es interesante observar que anticuerpos antiADN reaccionan con moléculas que presentan grupos aniónicos repetidos como heparán sul­ fato y dextrán sulfato. La unión con el primero sería de interés ya que es el principal protéoglicano constituyente de la membrana basal glomerular. La detección de anticuerpos anti-Sm tiene gran importancia en el diagnóstico de LES ya que este anticuerpo es considerado un m arca­ dor de dicha enfermedad. Los antígenos Sm y RNP forman parte del antígeno nuclear extractable (ENA). La detección de estos antígenos se realiza mediante técnicas de inm unoprecipi­ tación. La técnica de inm unotransferencia ha mejorado la identificación y caracterización de los antígenos nucleares y perm ite una defini­ ción más precisa de la especificidad de anti­

cuerpos para epitopes de los antígenos RNP y Sm. O tros anticuerpos detectados en LES. La presencia de anticuerpos contra antígenos Ro y La fue demostrada en pacientes con LES y Sín­ drome de Sjógren. Ambos antígenos se encuen­ tran en el citoplasma y el ntícleo celular. Los anticuerpos contra estos antígenos parecen par­ ticipar en la lesión renal de algunos pacientes con LES. Es frecuente encontrar anticuerpos anti-lgG, y con menor frecuencia anticuerpos que reac­ cionan con otros IgS. En la actualidad se ha comenzado el estudio de los anticuerpos contra antígenos de la mem­ brana basal glomerular (MBG). Estos anticuer­ pos serían inducidos como consecuencia de la liberación de antígenos del glomérulo, debido a la lesión renal producida por el depósito de complejos inmunes. Bemstein y colaboradores realizaron estudios en pacientes con LES, de­ mostrando la relación directa entre la presencia de anticuerpos contra MBG y nefritis. Niveles de complemento sérico y alteracio­ nes inmunológicas. En los casos más severos de esta enfermedad es frecuente la aparición de glom erulonefritis, la que suele estar asociada con títulos elevados de anticuerpos anti-ADN nativo y niveles muy disminuidos de com ple­ mento sérico, pudiendo estar comprometidos C l, C4, C2 y C3. Se observó que cuando los ni­ veles de complemento total se normalizan, el C4 perm anece ligeram ente dism inuido. M e ­ diante antisueros marcados se detectó la presen­ cia de complemento en los inm unocomplejos depositados en el glomérulo. En esta enferme­ dad, el complemento se puede activar también por vía alterna. Por otra parte, los niveles de complemento sérico son útiles para determinar una presunta lesión renal en ausencia de mani­ festaciones de glomerulonefritis, y son de ayuda en el control del tratamiento ya que sus niveles tienden a normalizarse al entrar en remisión la enfermedad. Los glomérulos afectados reaccio­ nan con diversas formas de compromiso histo­ lógico, que pueden abarcar fenómenos proliferativos ya sea de tipo focal o difuso. Las lesiones producidas se extienden a las arteriolas renales y pueden comprometer los túbulos. Ocasionalmente se observan cuerpos de hematoxilina en las zonas de lesión. Mediante elución de los anticuerpos comprometidos se determinó que son específicos para ADN nati­ vo y modificado y ARN. En pacientes con alte­ raciones neurológicas y altos títulos de anti­ cuerpos anti-ADN se suele encontrar disminui­ do el complemento sérico con degeneración del colágeno y proliferación de tejido elástico en la dermis. En las lesiones de piel se detectaron depósitos de inmunoglobulinas.

Autoinmunidad En un 30% de los casos se presentan ade­ más, alteraciones a nivel de articulaciones, con artritis deformante en las manos. Inm unidad m ediada po r células. Al estudiar los receptores linfocitarios se detectó disminu­ ción en número y proporción de linfocitos T en LES activo, y en algunos casos fue notable también una disminución de linfocitos B. Amasaki y col sugirieron que la expresión aumenta­ da del antígeno Fas (CD95) en linfocitos T na­ tivos y de memoria en sangre periférica, sería un posible mecanismo para explicar la linfopenia observada en pacientes afectados de LES. Artritis reumatoidea La artritis reumatoidea (AR) es la enferme­ dad autoinmune más común; se halla am plia­ mente distribuida tanto en adultos como en ni­ ños. En adultos el pico de incidencia se m ani­ fiesta entre los 30 y 50 años de edad y es entre 2 a 3 veces más com ún en m ujeres que en hombres. Es una enfermedad crónica que afec­ ta principalmente las articulaciones, con infla­ mación, dolor, calor y tumefacción de las m is­ mas; los casos agudos están acompañados de aumento de la temperatura corporal. La AR es un claro ejem plo de enfermedad autoinmune sistémica, y es fácilmente reconocida como tal. En contraste a las artralgias que aparecen en el LES, puede culminar con deformación y des­ trucción de las articulaciones. La AR no está confinada sólo a las articulaciones, ya que nor­ malmente está acompañada de una variedad de alteraciones sistémicas como, por ejemplo, la vasculitis. La vasculitis es causada por comple­ jos inmunes formados por factor reumatoideo e IgG y puede causar daños en piel, ojos y pul­ món. El curso de la enferm edad es variable, pudiéndose dar casos de rem isiones espontá­ neas que persisten por varios tmos. Como en la mayoría de las enfermedades autoinmunes no existe cura para la AR. El único rol de los m e­ dicamentos es reducir la inflamación y, por en­ de, el dolor y preservar la función de las articu­ laciones para prevenir la invalidez. Los antiin­ flamatorios no-esteroides como la aspirina son las drogas más comunes, aunque se han utiliza­ do y se continúan usando tratamientos con corticoides, sales de oro, penicilamina, metotrexate, etc. con diferentes resultados. Debido a la toxicidad de estas drogas, sólo se recu rre a ellas en casos extremos. La artritis es el resultado de una compleja in­ teracción entre las células sinoviales y leucoci­ tos que infiltran desde la circulación. La causa principal de la lesiones en las articulaciones no es conocida, ya que no son claros los m ecanis­ mos que inician la inflamación aguda de la si­ novia. Se han identificado péptidos y m olécu­

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las de adhesión en las células sinoviales que producen quimiotaxis de linfocitos y monocitos a los espacios sinoviales. Las células sinoviales en proliferación expresan moléculas de clase II del M CH y co-estim ulan m oléculas que au­ mentan la activación e infiltración de LTh, con la consiguiente estimulación de LB del líquido sinovial que finalmente sintetizan y liberan in­ munoglobulinas. Algunos de estos anticuerpos producidos localmente son de tipo IgG y tienen actividad de factor reum atoideo y unen otras moléculas de IgG y forman complejos inmunes que se depositan en las articulaciones. Estos in­ munocomplejos activan la cascada del com ple­ mento, iniciando de este modo el proceso infla­ matorio. Las células responsables de la in fla­ mación liberan proteasas lisosomales, radicales de oxígeno y prostaglandinas que producen in­ juria del colágeno y la matriz del cartílago de las articulaciones. No todos los pasos de esta secuencia han sido rigurosamente demostrados. Si el factor reumatoideo contribuye a la lesión y si la sinovitis depende de la activación de LT, son puntos que aún deben ser aclarados. El autoanticuerpo característico de esta enfer­ medad es el llamado factor reumatoideo (FR). Generalmente es de tipo IgM y reacciona con el Fe de la IgG. Por tal motivo este autoanticuerpo puede unirse a la IgG normal circulante y for­ mar complejos IgM-IgG, depositándose en las articulaciones. Estos inmunocomplejos pueden activar la cascada del complemento, producien­ do una inflamación crónica de las articulacio­ nes. Debido a que el factor reumatoideo se halla presente en el suero del 80 % de los pacientes, su detección es muy útil para el diagnóstico de la enfermedad y se lo considera un marcador de la enfermedad, aunque se lo ha encontrado sólo en un 5-10% en pacientes jóvenes y por otro la­ do también se lo ha encontrado en pacientes con infecciones bacterianas o parasitarias crónicas. Investigaciones recientes han permitido hallar, en pacientes con artritis reumatoidea, anticuer­ pos típicos del lupus eritematoso sistémico, in­ clusive anti-ADN y anticuerpos anti-histona, sin que presenten signos de esta enfermedad. Tam ­ bién se han encontrado anticuerpos anti-queratina y anti-perinuclerares. Los inmunocomplejos que producen el FR, por la unión con la IgG causan serios proble­ mas de vasculitis sistémica, que ha sido asocia­ da con la expresión homocigota del antígeno del com plejo m ayor de h istocom patibilidad H LA -D R pl. Se ha postulado que una deficien­ cia en la actividad de la galactosil transferasa de los linfocitos puede reducir la glucosilación de la región C \ de la IgG. Esta glucosilación deficiente podría rendir a la molécula de IgG inmunogénica y estimular la producción de an­ ticuerpos anti-Cy (es decir producción del FR).

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Inmunopatología

La asociación de la artritis reurnatoidea con el MHC está dada con las m oléculas HLADR 1, HLA-DRw6 y HLA-DR4, y con algunos subtipos particulares en determinados grupos étnicos. Estudios moleculares han demostrado una fuerte relación entre la susceptibilidad por esta enfermedad y la molécula D R pl. Los tres alelos conocidos de esta m olécula, que están asociados a la susceptibilidad, presentan una se­ cuencia común de Gln-Lys-Arg-Ala-Ala o GlnArg-Arg-Ala-Ala en la tercera región de variabihdad de la cadena (3 (residuos 67-71). Esta re­ gión puede constituir la región de la molécula del MHC que interactúe con el TCR y por lo tanto influenciar al LT a una particular selec­ ción o reconocimiento. La tercera zona variable de la cadena (3 de las moléculas de clase II de las ratas BB endocriadas también presentan una secuencia característica (motif); la inm uniza­ ción de estos animales con colágeno humano provoca una intensa respuesta inmune y artritis severa, lo que estaría demostrando la importan­ cia de esta secuencia en esta región para el de­ sencadenamiento de la patología en cuestión. Dermatomiositis y polimiositis Es una enferm edad que afecta a niños y adultos; clínicamente se presenta con debilidad muscular a veces precedida de fiebre y puede estar afectado cualquier músculo esquelético, aunque los involucrados más comúnmente sue­ len ser los músculos proxim ales de brazos y piernas. Los dolores musculares, las manifesta­ ciones cutáneas con eritema y descamación so­ bre los nudillos de manos y pies y erupciones papilares en la cara y párpados son característi­ cas comunes de esta enfermedad. Se desconoce la relación, pero hay evidencias de carcinoma, en aproximadamente el 20% de los adultos, an­ tes o después de la aparición de la dermatomio­ sitis. Los autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con m iositis reaccionan p rin cip al­ mente con antígenos citoplasmáticos, razón por la que la tradicional determinación de ANA en estos pacientes es generalm ente negativa. Si hay sospecha de miositis se deben realizar am­ bos tests; ANA y ENA. Más del 90% de pa­ cientes con miositis presentan algún autoanticuerpo detectable. El autoanticuerpo más cono­ cido asociado con miositis, es el anti-Jol, que reacciona con la enzima citoplasmática histidil ARNt sintetasa (HRS), enzima que cataliza la unión de histidina a su ARNt específico. El au­ toanticuerpo anti-Jol pertenece a una fam ilia característica de autoanticuerpos, presentes en el suero de pacientes con miositis, que reaccio­ nan con diferentes ARNt sintetasas; por ejem­ plo han sido detectados autoanticuerpos que

reaccionan con 5-am inoacil A RN t sintetasas, para histdina, treonina, glicina, isoleucina y alanina. Todos ellos sólo han sido detectados en pacientes con miositis y todos asociados con una alta incidencia de alteraciones en pulmón. En el suero de pacientes con miositis tam ­ bién pueden encontrarse autoanticuerpos contra proteínas relacionadas con factores de transla­ ción, como ser anticuerpos anti-KJ, mientras que otros autoanticuerpos parecen estar dirigi­ dos contra la partícula de reconocim iento de señales, un complejo macromolecular que diri­ ge la secreción de proteínas del retículo endeplasmático. Autoanticuerpos específicamente asociados con miositis son: Anti-histidil ARNt sintetasa (Jo- 1), anti-treonil ARNt sintetasa (Pl 7), antialanil ARNt sintetasa (Pl 12), anti-glicil ARNt sintetasa (EJ), anti-isoleucina ARNt sintetasa (OJ), anti-Partícula de señal de reconocimiento (SRP) y anti-Eactor de traslación de elongación (KJ). Ciertos síndromes que se superponen poseen m arcadores específicos, por ej. los autoanti­ cuerpos PM/Scl y Ku, están asociados con la superposición de los síndromes miositis y escleroderm ia. La m io sitis puede acom pañar otras alteraciones del tejido conectivo, como ser escleroderma, artritis reumatoidea, LES, SS y síndrome mixto del tejido conectivo, pero en estos casos la miositis es generalmente suave y los autoanticuerpos presentes son los marcado­ res del síndrome primario. Los autoanticuerpos asociados a la miositis, particularmente los anti-sintetasas parecen de­ finir subgrupos de miositis. El 66% de pacien­ tes que presentan en su suero anticuerpos antiJol son HLA-DR3+, comparados con el 22% de los pacientes que no presentan a n ti-Jo l. Aquellos pacientes también presentan altera­ ciones respiratorias típicas, artritis y fenómeno de Raynaud (desorden circulatorio secundario asociado a un desorden vascular primario). Hasta tanto no haya datos acerca de los m e­ canismos por los que, algunos autoanticuerpos específicos de la miositis son patogénicos para las fibras musculares, la detección de estos an­ ticuerpos provee información valiosa para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. El anti-Jol en particular es importante ya que pue­ de predecir el desarrollo de la enfermedad. Los niveles de anti-Jol son independientes de los n iv eles de IgG total y pueden d e sap arecer cuando la enfermedad entra en remisión. Los tradicionales ensayos de inmunodifusión sólo detectan el 25% de anti-Jol en suero de pacien­ tes con m iositis, m ientras que el ensayo de ELISA detecta el 44%. La asociación específica entre miositis y au­ toanticuerpos contra proteínas relacionadas con

Autoinmunidad factores de elongación y traslación ha generado una serie de hipótesis relacionadas con algunos virus y las enzim as antes m encionadas. Hay evidencias de la estrecha relación entre la mio­ sitis y algunos enterovirus en especial infec­ ción por Coxsackie B. Estos virus pueden tener estructuras ARNt similares en su genoma. Una hipótesis para la inducción de anticuerpos antisintetasas sugiere que puede formarse un com­ plejo macromolecular de sintetasa-aminoácidovirus y actuar como neoantígeno y rom per la tolerancia a lo propio con la siguiente produc­ ción de autoanticuerpos anti-sintetasa. Una se­ gunda hipótesis sugiere que los anticuerpos anti-Jo 1 actúan como anticuerpos antiidiotipo para los anticuerpos anti-virus, los que podrían unirse a la enzima. Una tercera hipótesis sugie­ re que las proteínas virales podrían mimetizar a la enzima y los anti-Jo 1 unirse a ésta. Esclerodermia La esclerodermia es una enfermedad que se manifiesta por el depósito excesivamente anor­ mal de colágeno en la piel. Afecta a personas de edad media, en especial mujeres, y se pre­ senta inicialmente con problemas vasculares en la punta de los dedos de manos y pies, luego continúan en la cara, cuello, la parte superior del tórax, difundiéndose hacia las extrem ida­ des. Se produce engrosamiento de la dermis y el tegumento resulta invadido; también son fre­ cuentes los cambios degenerativos con fibrosis e inflamación de piel, sinovia y algunos órga­ nos. En más del 50% de los pacientes el fenó­ meno de Raynaud precede el comienzo de la enfermedad; cuando va asociado a calcinosis, dismotilidad esofágica, esclerodactiha y telan­ giectasia, suelen detectarse anticuerpos anticentrómero. Los tres autoanticuerpos más caracterizados asociados a esclerodermia son Scl-70, anticuer­

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pos anti-centrómero y anticuerpos anti-nucleolares (cuadro 28-13). Más del 90% de los pa­ cientes con ecleroderma, presentan en el suero anticuerpos anti nucleares. A nticuerpos anti-Scl-70. Estos anticuerpos son llamados así porqué reconocen una proteí­ na nuclear de 70 kD; actualmente se sabe que es la enzima nuclear topoisomerasa L Aproxi­ madamente el 20-50% de los pacientes con es­ clerodermia presentan en el suero anticuerpos Scl-70, cuando son detectados por el ensayo tradicional de inm unoprecipitación. C uando fue utilizado el ensayo de ELISA con la topoi­ somerasa purificada, la detección de autoanti­ cuerpos se incrementó al 70%. Los pacientes con escleroderm ia que presentan anticuerpos Scl-70, tienden a tener un curso más severo de la enfermedad. Estos anticuerpos son raram en­ te hallados en otras enfermedades, por lo tanto su detección es altamente significativa. La importancia de la identificación de la to­ poisomerasa I como autoantígeno en la esclero­ dermia difusa promueve a interesantes hipóte­ sis. El anormal funcionamiento de esta enzima podría incrementar la expresión de genes del colágeno de piel, ya que aparentemente la to­ poisomerasa I se une frecuentemente a cuatro genes de colágeno fibrilar y tres de ellos están relacionados con la expresión del colágeno de piel. Por lo tanto este podría ser un mecanismo de patogénesis de la enfermedad. Por otro lado, dentro de la secuencia de la topoisom erasa I existe un epitope de seis aminoácidos sim ilar a varias proteína retrovirales, sugiriendo una mimetización molecular. A nticuerpos anticentróm ero (ACA). Estos autoanticuerpos producen un perfil característi­ co en inm unofluorescencia indirecta p o r su unión con la región centromérica del crom oso­ ma. L a más fuerte asociación de los A CA y con títulos más elevados es con el fenómeno de Raynaud. La inm unotransferencia rev ela que

C uadro 28-13. Anticuerpos antinucleares y antinucleolares en esclerodermia y métodos ele de­ tección Inm unofluorescencia

Inm unodifusión

N aturaleza del cmtígeno

N ucleares G ra n u la d o d ifu s o C e iilró m e ro /k in e to c o re P u n te a d o fin o P u n te a d o g ru e s o H om ogéneo M a n ch a s

S c l-7 0

-

-

A s o c ia d o a c ro m o s o m a ( p ro te ín a d e 7 0 kD ) d e n tro o f u e r a d e k in e to c o re -

-

P ro b a b le m e n te c e n trío lo

N ucleolares H om ogéneo G ru m o s P u n te ad o

4 S -6 S A R N

P ro b a b le m e n te U3 A R N

-

....

-

-

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Inmunopatología

los sueros con ACA reconocen tres polipéptidos cromosomales de 17 kD, 80 kD y 140 kD. Los anticuerpos contra la proteína de 80 kD, llamada CENP-B están presentes en todos los sueros ACA positivos, mientras que aparecen con título y frecuencia baja los anticuerpos di­ rigidos contra las moléculas de 17 kD (CENPA )y 140kD (CENP-C). Anticuerpos anti-nucleolares. La designa­ ción de anticuerpos anti-nucleolares puede es­ tar referida a diferentes antígenos nucleolares (ADN, histonas, Sm, Scl-70 etc.); el término de anticuerpos anti-nucleolares describe un grupo heterogéneo de autoanticuerpos característicos de la escleroderm ia. Los más caracterizados son los anti-fibrilarina, anti-P M /S cl y antiARN polimerasa 1. Cada uno de ellos tiene una asociación clínica con diferentes subgrupos de pacientes con esclerodermia. Anticuerpos antifibrilarina unen una proteína de 34 kD rica en dimetilarginina (fibrilarina), parte del complejo nucleolar U3 RNP. Estos anticuerpos parecen estar asociados con pacientes del sexo masculi­ no que p resentan esclero d erm ia con lig ero compromiso articular. Los anticuerpos contra el complejo PM/Scl aparecen en pacientes con esclerodermia asociada a miositis, con un com ­ promiso renal incrementado. Los anticuerpos anti-ARN polímera 1 están asociados a un pe­ queño subgrupo de pacientes con escleroder­ mia que envuelve órganos internos, incluyendo desórdenes renales. La detección y caracteriza­ ción de autoanticuerpos asociados con esclero­ dermia es de importante diagnóstico y pronós­ tico y deben ser determinados en forma tem ­ prana cuando los pacientes presentan una su­ gestiva sintomatología, en particular el fenó­ meno de Raynaud. Síndrome Primario de Sjógren (SS) El concepto clínico de Síndrome primario de Sjógren es confuso, por lo tanto necesita ser clarificado antes de hablar de los autoanticuer­ pos relacionados. Se debe diagnosticar el SS cuando no hay un claro compromiso del tejido conectivo como ser AR, LES o esclerodermia. El SS puede aparecer como una simple seque­ dad ocular o bucal hasta un severo desorden con infiltrado linfocítico de piel, intestino y músculo, con incremento de incidencia de lin­ fom a y vaseulitis sistém ica. Los anticuerpos antinucleares SS-A/Ro y SS-B/La son m arca­ dores característicos del SS primario. Anticuerpos SS-B. Los autoanticuerpos SSB reconocen a una proteína nuclear de 48 kD (SS-B) que actúa como cofactor para la ARN polimerasa III. El antígeno está asociado tam­ bién con todas los ARN transcriptos por ARN polim erasa III, incluyendo tARNs, ARNs 5S

ribosomal y ARNs viral codificado por la ARN polimerasa III del huésped, incluyendo el virus de Epstein-Barr 1 y 2. La detección de la presencia de los anticuer­ pos SS-B en los sueros de pacientes con SS pri­ mario es muy variado y oscila entre el 40 y 96%. Estos autoanticuerpos tam bién fueron descritos en una población de pacientes con SLE. Como otros autoanticuerpos, los anti-SS-B constituyen una variedad de anticuerpos que re­ conocen diferentes moléculas SS-B, algunas de las cuales han sido mapeadas y se conocen los sitios de unión para el anticuerpo. Recientemen­ te se ha demostrado que la formación de anti­ cuerpos anti-SS-B parece estar dirigida, en un comienzo hacia la porción amino-terminal de la molécula SS-B, desarrollándose finalmente una respuesta autoinmune contra la molécula entera. Se ha postulado que una infección viral podría originar una reacción cruzada dirigida inicial­ mente hacia un simple epitope, con la posterior diversificación de la respuesta autoinmune. A n ticu erpos SS-A. E xisten por lo m enos cuatro anticuerpos que constituyen una com ­ pleja serie de autoanticuerpos que reaccionan con cuatro proteínas d iferentes. La técn ica usualmente utilizada en laboratorio para la de­ tección de estos anticuerpos, como es la doble difusión en agar (Outcherlony) no puede distin­ guir este conjunto de anticuerpos SS-A. La in­ m unotransferencia con extractos solubles de células nucleadas puede poner en evidencia dos proteínas SS-A de peso m olecular diferente, una de 60 kD y otra de 53 kD. Cuando se utili­ zan eritrocitos como fuente antigénica los sue­ ro de pacientes que presentan anticuerpos antiSS-A reconocen dos proteínas de peso molecu­ lar de 54 kD o 60 kD, y son antigénicamente diferentes de los antígenos SS-A provenientes de las células nucleadas. En el cuadro 28-14 se enumeran las diferentes patologías asociadas a los antígenos SS-A y SS-B. Bonfa y col. han mostrado que pacientes con psicosis secundaria a LES tenían anticuerpos anti-ribosomales, pero la mitad de los pacientes con LES, y que formaban anticuerpos anti-ribosomales no tenían psicosis; esto claramente demuestra que dichos anticuerpos no son sufi­ cientes para producir la enfermedad. Sin em ­ bargo la precisa medición de los anticuerpos anti-ribosomales es clínicamente necesaria para poder distinguir entre eventos psicóticos no re­ lacionados, psicosis inducida por drogas y lu­ pus-psicosis. Estudios longitudinales de anti­ cuerpos anti-ribosomales han revelado que es­ tos anticuerpos aparecen antes y durante la fase activa de la psicosis. Anticuerpos anti-ribosomales han sido detectados en el líquido espinal de pacientes con lupus-psicosis. Otros investí-

Autoinmunidad

591

Cuadro 28-14. Asociación de los autoanticuerpos Ro/SS-A y LaJSS-B con enfermedades autoin­ munes sistémicas Anti-Ro/SS-A

Anti-La/SS-B %

% D esórdenes clínicos S ín d ro m e d e S jo g re n P rim a rio S e c u n d a rio LES L E S c o n A N A n e g a tiv o L E c u tá n e o s u b a g u d o (S C L E ) su p e rp o s ic ió n d e SS y S C L E L E d isc o id e (D L E ) L E n e o n a ta l (N L E ) B lo q u e c a rd ía c o n e o n a ta l D e fic ie n c ia d e C 2 y C 4 C irro sis b ilia r p rim a ria H e p a titis c ró n ic a a c tiv a C o n tro le s n o rm a le s

ID

ELISA

ID

E L IS A

60

95

20

90 5

20 25 62 62 100 3 90 80 80 raro raro

0,1

10 90

32 25

100

10

50

50

10 10

0,1

ID : in m u n o d ifu sió n , E L IS A : en z im o in m u n o an á lisis

gadores no han hallado una relación entre estos anticuerpos y psicosis, pero recientes hallazgos soportan fuertemente esta asociación. El lupus cerebral, es un desorden heterogéneo con m ani­ festaciones locales y difusas, con la probable presencia de autoanticueipos no solo ribosomales sino de otros tipos como por ejemplo anticardiolipina. Concluyendo, los anticuerpos anti-ribosomales pueden ser de importancia para el seguimiento de un grupo específico de lupus cerebral. 6. CLONADO MOLECULAR DE A UTO A N TÍG EN O S Para los ensayos de inmunodifusión se utili­ zan mezclas crudas de antígenos provenientes de tejidos (timo de conejo o bazo humano) o lí­ neas celulares. Estos ensayos generalmente son de poca sensibilidad y no detectan todos los au­ toanticuerpos. Autoantígenos bioquímicamente purificados pueden estar contaminados con tra­ zas de otros autoantígenos, particularm ente cuando los mismos existen naturalmente como complejos macromoleculares como ser RNP y Sm o SS-A y SS-B. En la actualidad existe ADN clonado de al­ gunos de los autoantígenos más importantes re­ lacionados con escleroderm ia, miositis y SS. Estos incluyen (U l) RNP proteínas 70kD; las proteínas Sm B /B ’, D, E y N; el autoantígeno de la esclerodermia. Sel 70 y centrómero B; el autoantígeno de la miositis Jo-1 y los autoantí­ genos de la SS, SS-B y tres de SS-A. Estos an­ tígenos clonados están siendo utilizados en en­ sayos de ELISA para detección de ANAs espe­ cíficos.

Teóricamente una preparación de un autoan­ tígeno obtenido por clonación puede garantizar la pureza del mismo y por lo tanto eliminar fal­ sos positivos. Sin embargo experiencias in d i­ can que aíin existen problemas no resueltos en el uso de autoantígenos recombinantes utiliza­ dos en técnicas de ELISA. Es muy frecuente el reconocimiento de epitopes conformacionales, especialm ente en el caso de anticuerpos antiRNP y SS-A que reaccionan sólo con antígenos que presentan la estructura tridimensional nati­ va, por lo tanto no reconocerán antígenos recom binantes. En ensayos de inm unodifusión que usan extractos crudos, están presentes los autoantígenos en su estado nativo, por tal m oti­ vo, a pesar de ser una técnica poco sensible, se sigue utihzando como control de los otros m é­ todos. 7. T R A T A M IE N T O DE LAS ENFERMEDADES AUTOINM UNES La mayor parte de la investigación básica y aplicada que se realiza en las enfermedades au­ toinmunes está orientada a la inmunoterapia de las mismas. La tolerancia inducida por aplica­ ción del antígeno específico puede ser utilizada para prevenir la inducción de una enfermedad autoinmune y para tratar un estado autoinmune previamente establecido. Esto ha sido am plia­ mente utilizado en modelos experimentales. En ratones SJL/ y en ratas Lewis la EAE, experi­ mentalmente inducida y donde se habían pro­ ducido fenómenos de parálisis, pudo ser total­ mente inhibida por aplicación de esplenocitos u n id o s a h o m o g e n a to de c o rd ó n e s p in a l (MSCH) y parcialmente inhibida si los espíe-

592

Inmunopatología

nocitos se unían a la proteína básica de mielina (MBP), ya que la remisión observada en este último caso fue temporal. Esto se podría expli­ car pensando que la inhibición se debería a la aplicación de MBP y que las posteriores mani­ festaciones se podrían deber a otros neuroantígenos tales como el PLP (poli-lipoproteína), MAG y MOG (glucoproteínas asociadas a la mielina). Estos serían expuestos al sistema in­ mune periférico como consecuencia del daño de la mielina y de la apertura de la barrera hematoencefálica por las linfocitos T CD4-t-, du­ rante el período agudo de la enfermedad. Se puede pensar que estos son determinantes críp­ ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que tiene MBP y los otros neuropéptidos. Un tratamiento que se está estudiando mu­ cho es la inducción de resistencia a la enferme­ dad por administración de dosis subpatogénicas de células T autoinmunes (vacunación con lin­ focitos T). En estudios tem pranos la vacuna­ ción con linfocitos T fue obtenida utilizando linfocitos T activados que se atenuaban por irradiación, por presión hidrostática o por com­ puestos químicos. Estos métodos de atenuación causan cambios cuahtativos en las células T y aunque se administre un gran número de linfo­ citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob­ servar que la vacunación con dosis bajas de lin­ focitos T anti-MBP activa las células T antiidiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s­ to también fue demostrado en pacientes con es­ clerosis múltiple. Una estrategia muy utilizada en el tratamien­ to de enfermedades autoinmunes es la aplica­ ción de anticuerpos contra determinadas citoquinas. En algunas enfermedades como la artri­ tis reum atoidea hay citoquinas consideradas pro-inflamatorias en la articulación reum atoi­ dea, entre las que se incluyen del TNE-a, IL-1, IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac­ tuarían en cascada y la estrategia inmunoterapéutica es tratar de bloquear alguna de las citoquinas para evitar el efecto de todas ellas. Un tratamiento muy utilizado es la aplicación de anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4 para lograr una acción sinérgica.

B IB L IO G R A F ÍA 1. A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T a k e d a T ., O g u ra N ., Jo d o S., N a k a b a y a s h i T ., T s u tsu m i A ., F u jis a k u A , a n d K o ire T. U p -re g u ia te d e x p re s ió n o f F a s a n tig e n (C D 9 5 ) by pe rip h e ra l n a ív e an d in e m o ry T ceí) .subsets in p a tie n ts w itii s y s te m ic lu p u s e ry th e m a to s iis (S L E ), a p o s s ib le m e e h a n ism fo r ly m p h o p e n ia . C lin . E x p . Im m u n o l. 99: 2 4 5 -2 5 0 , 1995.

2, B e r n s te in K .A ., B o ls h o u n D . a n d L e fk o w ith . S e ru m g lo m e ru la r b in d in g a c tiv ity is h ig ly c o rre la te d w ith r e ­ n a l disea.se in M R L /lp r m ic e . C lin .E x p . T tninunol. 9 3 : 4 1 8 -4 2 3 , 1993. 3, D ia m o n d B . a n d S o lo m o n . A m o n o c lo n a l a m ib o d y rec o g n iz e s a n ti- D N A a n ti b o d i e s w ith s y s te m ic lu p u s e r y t h e m a t o s u s . A n n . N Y . A c á . S c i. 4 1 8 : 3 7 9 - 3 8 5 , 1983. 4, G a r c ía L e rn a J .G .; S e q u í N a v a rro J. y V e la O lm o C . C a ra c te rís tic a s m o le c u la re s d e los a u to a n tíg e n o s S S A / R o , S S B /L a y n R N P (S m y U 1 R N P ). I m u n o lo g ía . 1 3 :8 5 -1 0 1 , 1994, 5, tta r r is E, N . a n d P ie ra n g e li S. A n tip h o sfo lip id a n tib o ­ d ie s a n d th e a n tip h o s p h o lip id s y n d ro tn e , S p in , S e m , Im m u n o p th , 1 6 :2 2 3 -2 4 5 , 1994, 6, J e n e w a y , C h a rle s A , Jr. a n d T ra v e rs Paul, Im m u n o b io lo g y , T h e im m u n e s y s te m in h e a lth a n d d ise a s e , C u ­ rre n t B io io g y G a rla n d , 1994. 7, K u b y J a n is , I m m u n o lo g y , W , H, F re e m a n an d C o ra p a n y , N e w Y o rk , 1992, 8, IVIargni R ic a rd o A , Im n u n o lo g ía e In m u n o tiu ím ic a , 4 a, E d , P a n a tn e ric a n a , 1989. 9, M c N e il H ,P ,, C h e s te rm a n C . N , a n d K rilis S ,A , Im m u n o lo g y an d c lin ica l itn p o rta n c e o f a n tip h o s p h o lip id a n ­ tib o d ie s. A d v Im m n u n o l, 4 9 : 19 3 -2 8 0 , 1991, 10, M e ilo f J E, A u to a n tib o d ie s a g a in s t s m a ll c y to p la s m ic rib o n u c le o p ro te in s : th e a n ti-R o /S S -A a n ti-L a /S S -B au to im m u n e re s p o n s e , R h e u to m a to l, In t. 12: 1 2 9 -1 4 0 , 1992. 1 1, N a p a rs te k Y , a n d P ltz P, T h e ro le o f a u to a n tib o d ie s in a u to im m u n e d ise a s e , A n n , R e v , Im m u n o l. 1 1 :7 9 -1 0 4 , 1993, 12, P a u l W illia m , F u n d a m e n ta l Im m u n o lo g y , T h ird E d itio n , R a v e n P re ss. 1993, 13, P ro v o s t T. a n d W e sto n W . B u llo u s d ise a se s. F irs t E d itio n . M o s b y Y e a r B o o k , 1993. 14, R o k e a c h L an d H o c h S, B -c e ll e p ito p e s o f S m a u to a n tig e n s. M o l, B io l, R ep , 1 6 :1 6 5 -1 7 4 , 1992, 15, S ilb e rste in L. E ., J e ffrie s L, C ,, G o ld m a n J,, F rie d m a n D ,, M o o re J.S ,, a n d N o w e ll P ,C . V a ria b le r e g ió n g e n e a n a ly s is o f p a th o lo g ic h u m an a u to a n tib o d ie s to th e r e la ­ te d i a n d I red b lo o d c e ll a n tig e n s , B lo o d , 7 8 :2 3 7 2 2 3 8 6 , 1991. 16, S in g e r K, H ., H a s h im o to K „ J e n se n P ,J,, a n d M o rio k a S, P a th o g e n e s is o f a u to im m u n ity in p e m p h ig u s , A n n , R e v , Im m u n o l. 3 :8 7 - 1 0 3 , 1985. 17, S o n th e iin e r R .D ,, M c C a u liffe D ,P , Z a p p i E, a n d T a r g o ff I. A n tin u c le a r a n tib o d ies: C lin ic a l c o rre la tio n s an d b io lo g ic s ig n ific a n c e , A d v , D e rm a to l, 7: 3 -5 3 , 1 9 9 L 18, S tu rg e s s A . R e c e n tly c h a ra c te riz e d a u to a n tib o d ie s an d th e ir c lin ica l s ig n ific a n c e , A u st, N ,Z , J M e d , 22: 2 7 9 2 8 9 , 1992, 19, T a la l N o r m a n , M o le c u la r A u to im m u n ity , A c a d e m ic P re ss, 1991, 2 0, T h e o filo p o u lo s A ,N , T h e b a sis o f a u to im m u n ity , P a rt I, Im m u n o l, T o d a y 16: 9 0 -9 8 , 1995, 2 1, T h e o filo p o u lo s A ,N . T h e b a s is o f a u to im m u n ity . P a rt II, Im m u n o l, T o d a y 16: 15 0 -1 5 8 , 1995, 2 2, V e r h e ije n R , B - c e ll e p ito p e s o f s c le r o d e r m a - s p e c if ic a u to a n tig e n s. M o l. B io l, R e p , 16: 1 8 3 -1 8 9 , 1992, 2 3, U y td e h a a g F ,, V a n d e r H e y d e n R, a n d O s te rh a u s A , M a in te n a n c e o f im m u n o lo g ic a l m em o ry : rol fo r C D 5* c e lls? im m u n o l. T o d a y . 12: 4 3 9 -4 4 1 , 1991, 2 4, Y a n n i G ., W h e la n A ,, F e ig h re y C ,, Q u in la n W ,, S y mon.s J,, D u f f G , a n d B re s n ih a m B, Contrasúng le v e ls o f in v itro c y to k in e p ro d u c tio n b y r h e u m a to id s y n o v ia l tis s u e s d e m o s tra tin g d iffe re n t p a tte rn s o f m o n o n u c le a r ce ll in filtratio n . C lin , E x p , Im m u n o l, 9 3 :3 8 7 -3 9 5 , 1993, 2 5, Z a p p i E . a n d S o n th e im e r R ,D . C lin ic a l re le v a n c e o f a n ­ tib o d ie s to R o /S S - A a n d L a /S S - B in s u b a c u te c u ta n e o u s lu p u s e ry th e m a to s u s a n d re la te d c o n d itio n s. C lin , D e rm a to l. 1 0 :4 3 1 -4 4 1 , 1993,

Estructura y función del complejo

mayor de histocompatibilidad

29

M. LEONARDO SATZ LEONARDO FAINBOIM

Antecedentes históricos Como hemos visto en el capítulo 10, las mo. léculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen un papel crucial en la presentación de antíge­ nos para la activación de las células T. Sin em ­ bargo, la secuencia de sucesos que condujeron a este descubrimiento estuvieron enmascarados por su “seudo función”, que es la de servir co­ mo barrera principal al trasplante de órganos y tejidos. La disponibilidad de cepas endocriadas faci­ litó el rápido conocimiento del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2. En el caso del CMH humano, denominado sis­ tema HLA, la situación fue diferente. A partir del descubrimiento de las moléculas HLA, los estudios de genética de población fueron los que permitieron definir el polimorfismo del sis­ tema. El primer antígeno HLA fue descubierto en 1958. Dausset identificó en el suero de un pa­ ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglutinantes, cuyo patrón de reactividad perm itió identificar el antígeno denominado Mac. Este antígeno corresponde al hoy conocido com o HLA-2. En el mismo año 1958, los laboratorios de Payne y van Rood, comprobaron que m uje­ res con em barazos miiltiples producían an ti­ cuerpos contra aloantígenos del padre expresa­ dos codom inantem ente por el feto. En 1963, van Rood y van Leeuwen describen el “sistema 4 ” , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En 1964, Payne y col. describen una serie de antí­ genos denominados LA. Esta serie LA y el sis­ tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos como HLA-A y HLA-B, respectivamente. El paso sig u ien te que p rovocó el ráp id o avance en el conocim iento del HLA fue la

creación de los Talleres Internacionales de H is­ tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato­ rios intercambian reactivos (células, anticuer­ pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con protocolos estandarizados, que permiten identi­ ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se realizó en Durham en 1964, el XI en Y okcha­ ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el XII Taller, que finalizará en 1996. Estructura y distribución de las moléculas de histocompatibilidad M oléculas de clase I Estructura: Tal como se escribió en el capí­ tulo 10, las MHC de clase I están constituidas por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova­ lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglobulina. Sólo la cadena a está codificada dentro del sistema HLA. Productos de clase 1. En el hombre existen tres M HC de clase I distintas, denom inadas HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun­ ción de presentación de péptidos a los linfoci­ tos T CD8. Las tres se expresan sim ultánea­ mente en la superficie de casi todas las células, con excepción de los glóbulos rojos y el sinci­ tio trofoblasto. Estas moléculas poseen diferen­ tes cadenas pesadas pero comparten la mism a cadena-p2 microglobulina. Las cadenas están codificadas por sendos loci A, B y C localiza­ dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1). Una de las características más salientes de estas moléculas es su enorme polimorfismo pohlacional. Se estima que existen más de 40 ale­ los distintos para la molécula HLA-A, m ás de 80 alelos diferentes para HLA -B y más de 30 para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-

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Inmunopatología

nocitos se unían a la proteína básica de mielina (MBP), ya que la remisión observada en este último caso fue temporal. Esto se podría expli­ car pensando que la inhibición se debería a la aplicación de MBP y que las posteriores mani­ festaciones se podrían deber a otros neuroantígenos tales como el PLP (poli-lipoproteína), MAG y MOG (glucoproteínás asociadas a la mielina). Estos serían expuestos al sistema in­ mune periférico como consecuencia del daño de la mielina y de la apertura de la barrera hematoencefálica por las linfocitos T CD4-t-, du­ rante el período agudo de la enfermedad. Se puede pensar que estos son determinantes críp­ ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que tiene MBP y los otros neuropéptidos. Un tratamiento que se está estudiando mu­ cho es la inducción de resistencia a la enferme­ dad por administración de dosis subpatogénicas de células T autoinmunes (vacunación con lin­ focitos T). En estudios tem pranos la vacuna­ ción con linfocitos T fue obtenida utilizando linfocitos T activados que se atenuaban por irradiación, por presión hidrostática o por com­ puestos químicos. Estos métodos de atenuación causan cambios cuahtativos en las células T y aunque se administre un gran número de linfo­ citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob­ servar que la vacunación con dosis bajas de lin­ focitos T anti-MBP activa las células T antiidiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s­ to también fue demostrado en pacientes con es­ clerosis múltiple. Una estrategia muy utilizada en el tratamien­ to de enfermedades autoinmunes es la aplica­ ción de anticuerpos contra determinadas citoquinas. En algunas enfermedades como la artri­ tis reum atoidea hay citoquinas consideradas pro-inflamatorias en la articulación reum atoi­ dea, entre las que se incluyen del TN F-a, IL-1, IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac­ tuarían en cascada y la estrategia inmunoterapéutica es tratar de bloquear alguna de las citoquinas para evitar el efecto de todas ellas. Un tratamiento muy utilizado es la aplicación de anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4 para lograr una acción sinérgica.

B IB L IO G R A F ÍA L A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T alceda T ., O g u ra N ., Jo d o S., N a lía b a y a s h i T ., T s u tsu m i A ., F u jis a k u A , a n d K o ire T. U p -re g u ia te d e x p re s ió n o f F a s a n tig e n (C D 9 5 ) by pe rip h e ra l n a ív e an d in e m o ry T caí) .subsets in p a tie n ts w itii s y s te m ic lu p u s e ry th e m a fo s u s (S L E ), a p o s s ib le m e c h a n ism fo r ly m p h o p e n ia . C lin . E x p . Im m u n o l. 99: 2 4 5 -2 5 0 , 1995.

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Estructura y función del complejo

mayor de histocompatibilidad

29

M. LEONARDO SATZ LEONARDO FAINBOIM

Antecedentes históricos Como hemos visto en el capítulo 10, las mo. léculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen un papel crucial en la presentación de antíge­ nos para la activación de las células T. Sin em ­ bargo, la secuencia de sucesos que condujeron a este descubrimiento estuvieron enmascarados por su “seudo función”, que es la de servir co­ mo barrera principal al trasplante de órganos y tejidos. La disponibilidad de cepas endocriadas faci­ litó el rápido conocimiento del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2. En el caso del CMH humano, denominado sis­ tema HLA, la situación fue diferente. A partir del descubrimiento de las moléculas HLA, los estudios de genética de población fueron los que permitieron definir el polimorfismo del sis­ tema. El primer antígeno HLA fue descubierto en 1958. Dausset identificó en el suero de un pa­ ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglutinantes, cuyo patrón de reactividad perm itió identificar el antígeno denominado Mac. Este antígeno corresponde al hoy conocido com o HLA-2. En el mismo año 1958, los laboratorios de Payne y van Rood, comprobaron que m uje­ res con em barazos m últiples producían an ti­ cuerpos contra aloantígenos del padre expresa­ dos codom inantem ente por el feto. En 1963, van Rood y van Leeuwen describen el “sistema 4 ” , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En 1964, Payne y col. describen una serie de antí­ genos denominados LA. Esta serie LA y el sis­ tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos como HLA-A y HLA-B, respectivamente. El paso sig u ien te que p rovocó el ráp id o avance en el conocim iento del HLA fue la

creación de los Talleres Internacionales de H is­ tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato­ rios intercambian reactivos (células, anticuer­ pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con protocolos estandarizados, que permiten identi­ ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se realizó en Durham en 1964, el XI en Yok cha­ ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el XII Taller, que finalizará en 1996. Estructura y distribución de las moléculas de histocompatibilidad M oléculas de clase I Estructura: Tal como se escribió en el capí­ tulo 10, las MHC de clase I están constituidas por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova­ lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglobulina. Sólo la cadena a está codificada dentro del sistema HLA. Productos de clase 1. En el hombre existen tres M HC de clase I distintas, denom inadas HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun­ ción de presentación de péptidos a los linfoci­ tos T CD8. Las tres se expresan sim ultánea­ mente en la superficie de casi todas las células, con excepción de los glóbulos rojos y el sinci­ tio trofoblasto. Estas moléculas poseen diferen­ tes cadenas pesadas pero comparten la mism a cadena-p2 microglobulina. Las cadenas están codificadas por sendos loci A, B y C localiza­ dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1). Una de las características más salientes de estas moléculas es su enorme polimorfismo pohlacional. Se estima que existen más de 40 ale­ los distintos para la molécula HLA-A, m ás de 80 alelos diferentes para HLA-B y más de 30 para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-

594

Inmunopatología

Clase I

Clase I DQ

DP

I

DR

I

—> OJ < CVJ

Centrómero

_J

-«S-----------

ü

o

CQ < cc cr o Q

11 í u u i u i I para p a l a \-/ivii i" i (vía endocítica) M a c ró fa g o .

v ^ ^^ A n tig e n o /

A ntíg e n o/ CiVIH-clase

jfe"*'— CM FI-clase i

.RCT

Linfoquinas Linfocito T C itotóxico (Te) CD8+

Linfocito T C olaborador (Th) CD4+

Fig. 33-2. P ara que los LT citotóxicos específicos de tum or restrictos por antígenos del C M H de clase I se activen deben recibir por lo m enos dos señales, la prim era está dada por el reconocim iento antigénico m ediado por el receptor T (R CT) y la segunda por la liberación de linfoquinas p or los L T colaboradores, los que deben ser previam ente activados vía p resen ­ tación del péptido tum oral por una célula presentadora de antígeno profesional, dentro del contexto de antígenos del C M H de clase II. Estas C PA profesionales expresan en su m em brana m oléculas com o B7, capaces de enviar señales coestim ulatorias uniéndose a receptores (CD 28) expresados sobre los L T colaboradores.

o para sustancias coestimuladoras dentro de las células tumorales, y estas células son reinyectadas en el huésped de donde se extrajeron, se induce una buena respuesta inmune. Por ejem ­ plo, cuando se transfectan los genes para IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, F N T a, INFy o GM -CSF en tumores de ratón, éstos regresan. En algunos casos se acumulan infiltrados inflamatorios al­ rededor de los tumores que secretan las citoquinas, y el tipo celular del infiltrado varía con la citoquina. Esto es importante ya que en fun­ ción del infiltrado celular y las citoquinas libe­ radas se pueden cumplir diferentes funciones efectoras y accesorias necesarias para una bue­ na activación de los LT aum entando las res­ puestas específicas de los LT contra los antíge­ nos tumorales. Se han llevado a cabo investigaciones utili­ zando linfocitos infiltrantes de tum or (TILs) provenientes de pacientes con melanoma, los que han sido transfectados con el gen para el F N T a y también para IL-2, con el objeto de aumentar la inmunorreactividad hacia las célu­ las tumorales, evitando la toxicidad que produ­ ce la administración sistémica de estas drogas. Por transfección de células tumorales con el gen para la IL-7 se facilita el rechazo tumoral por un mecanismo que involucra la expansión de LT CD8+, generación de LT citotóxicos y

generación de células LAK por parte de las cé­ lulas CD8+ y NK. En algunos tumores los LT CD4+ y los macrófagos podrían ser importan­ tes inhibiendo el crecimiento vía reacción de hipersensibilidad retardada. Por transfección del gen que codifica para la molécula coestimulatoria B7 se puede obtener una respuesta anti-tumoral mucho más efecti­ va. Las células tumorales que expresan B7 son rechazadas en el huésped singeneico mientras que las células tumorales originales no lo son. Además, la expresión de B7 en las células tu­ morales induce inmunidad hacia las células tu­ morales originales inoculadas en otro sitio dis­ tante del inicial. La identificación de genes que codifican p a­ ra antígenos específicos de tumor reconocidos por LT citotóxicos proporcionó las bases para la introducción de grandes cantidades de antí­ geno en las células tumorales, uniendo los ge­ nes que codifican para los antígenos con pro­ motores activos, transfectando estas construc­ ciones (constructs) en las células tum orales del huésped u otros tipos celulares in vivo y reintroduciendo las células transfectadas en el paciente. Alternativamente, las vacunas de v i­ rus vaccinia recombinantes con insertos de ge­ nes de antígenos tumorales pueden ser utiliza­ das para aum entar la expresión de antígenos

Inmunología tumoral tum orales en el paciente. P or otra parte, los antígenos tum orales com partidos por varios tumores, como el MAGE-1 en los melanomas o la proteína ras m utada en la posición 12, pueden ser potencialm ente buenos inm unóge­ nos. Utilizando la reacción en cadena de la po­ limerasa (PCR) es posible determinar si un p a­ ciente expresa un antígeno tumoral por detec­ ción del gen mutado, y se podría emplear la ti­ pificación de antígenos del CMH para eviden­ ciar si un paciente puede expresar moléculas que se unen al péptido inm unodominante de ese antígeno. In m u n o terap ia pasiva Se están utilizando variados y diferentes m é­ todos en la terapia con anticuerpos con el fin de inducir una regresión tumoral o prevenir su re­ currencia. Los más utilizados son: 1) Anticuerpos anti-idiotipo. Han sido utili­ zados en el tratamiento de linfomas B que ex­ presan inmunoglobulinas de superficie con es­ pecificidad frente a idiotipos particulares. El idiotipo sería un antígeno tum oral altam ente específico, ya que se expresa sólo en el clon de células B neoplásicas y no en otras células. La unión del anticuerpo anti-idiotipo, capaz de ac­ tivar el com plemento o la citotoxicidad anticuerpo-dependiente (ADCC) produciría la des­ trucción de las células tumorales. Sin embargo, este tratamiento no siempre actúa en forma sa­ tisfactoria. 2) A nticuerpos dirigidos contra receptores de factores de crecimiento (receptor de lL-2). Han sido utilizados en terapia experimental en linfomas T humanos incluidos las leucemias y linfomas asociados al virus HIV. Esta terapia se basa en el hecho de que la IL-2 estimularía el crecimiento de las células tumorales que ex­ presan el receptor de IL-2. Los anticuerpos anti-receptor podrían modular o bloquear dichos receptores, de esta manera se impediría la acti­ vación celular. A lternativam ente, estos an ti­ cuerpos m onoclonales podrían producir lisis mediada por complemento de las células tumorales que expresan el receptor de lL-2. La tera­ pia con anticuerpos anti receptor de IL-2 no es específica y podría llegar a producir inmunosupresión ya que también actuaría sobre los LT norm ales activados transform ándolos en nofuncionales. 3) Anticuerpos específicos para un producto inducido por un oncogén. Estos serían poten­ cialmente capaces de inhibir el crecimiento tu­ moral si el producto del oncogen fuera esencial para el fenotipo transform ado. A nticuerpos monoclonales contra la proteína de superficie inducida por el oncogén nen inducen la rever­

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sión del fenotipo nen-transformado a no-trans­ formado in vitro y los mismos anticuerpos son capaces de inhibir el crecimiento del tum or en ratones. 4) Anticuerpos anti-tumor copulados a toxi­ nas o drogas. Ciertas toxinas, por ejemplo rici­ no o la toxina diftérica, son potentes inhibido­ res de la síntesis proteica. Unidos covalente­ mente a anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados en ínfimas dosis y pueden ser dirigi­ dos hacia el blanco deseado (la célula tumoral), actuando como inm unotoxinas: Este m ism o principio puede ser utilizado con ciertas drogas antineoplásicas o con radioisótopos con acción citocida que podrían actuar unidos covalente­ mente a anticuerpos específicos. Estas m etodo­ logías requieren de dos requisitos para que la terapia resulte exitosa: a) la especificidad del anticuerpo debe ser tal que sea capaz de unirse sólo a células tumorales pero no normales. Co­ mo ya ha sido descrito previam ente, esto es muy difícil de lograr; b) es difícil de prever y asegurar que el anticuerpo llegará realmente en una concentración suficiente a la célula blanco antes de ser eliminado por las células fagocíticas a través de sus receptores Fe. Si esto suce­ de se reduce la efectividad de la terapia aunque la utilización de (F ab ’)^ conjugado a toxinas puede minimizar este problema. 5) Anticuerpos heteroconjugados. En este ca­ so, un anticuerpo específico hacia un antígeno tumoral se une covalentemente a otro anticuerpo con especificidad contra una proteína de superfi­ cie presente en una célula efectora citotóxica, por ejemplo NK o linfocitos T citolíticos ( LTc). Estos heteroconjugados favorecen la unión de dichas células hacia las células tumorales blanco apropiadas, por ejemplo un anticuerpo anti-CD3 unido a un anticuerpo contra una proteína de su­ perficie del tumor favorecerá la lisis de las célu­ las tumorales mediadas por LTc. 6) Conjugados de anticuerpos y hormonas. Pueden ser utilizados para dirigir LTc hacia las células tumorales que expresan receptores para dicha hormona. Por ejemplo anticuerpos antiCD3 unidos a la hormona estimulante de melanocitos aumentan la destrucción in vivo , m e­ diada por LTc, de células de melanoma hum a­ no con receptores para la hormona. 7) Depleción in vitro de células tum orales de médula ósea por lisis mediada por anticuer­ pos y complemento. Este tratamiento se utiliza en pacientes con linfoma B que reciben un tras­ plante antologo de médula ósea. En estos casos se toman células de médula ósea del paciente y se somete a éste a una dosis de radiación y qui­ mioterapia para destruir sus células tumorales. Por supuesto, también son destruidas las célu­ las norm ales del individuo. La m édula ósea previamente removida es tratada con anticuer­

678

Inmunopatología

pos monoclonaJes contra los antígenos norma­ zar para para dirigir una célula o un ligando ha- ■ les de LB que también se expresan en las célu­ cia la célula tumoral, o para incrementar la es­ las del linfoma. Posteriormente se añade com ­ pecificidad y afinidad de interacción de una cé­ plem ento para producir la lisis de todas esas lula con su molécula blanco. células. La médula ósea, que de esta manera fue purgada de las células tumorales, se rein- Inmunoterapia celular adoptiva yecta en el paciente para reconstituir su sistema hematopoyético destruido por la radiación y la Implica la transferencia de células en cultivo quimioterapia. que pueden reaccionar contra el tumor cuando 8) Actualmente se están comenzando a utili­ son inoculadas en el huésped. Esto puede lle­ zar nuevas moléculas obtenidas por tecnología varse a cabo de dos formas: del ADN recombinante. Los anticuerpos huma­ nizados y quiméricos se utilizan en pruebas clí­ a) Utilizando la terapia con células killer ac­ nicas y las cadenas Fv de ciertos anticuerpos se tivadas por citoquinas. Este método tiene por están evaluando en modelos anim ales. F rag­ objeto la generación in vitro de células LAK, lo mentos de cadenas de IgG se pueden fusionar o que se logra por cultivo de leucocitos periféri­ conjugar a diferentes moléculas de manera tal cos tomados del paciente con tumor en presen­ de obtener nuevas funciones efectoras, tal co­ cia de altas dosis de IL-2. Las células LAK ge­ mo se esquematiza en la figura 33-3. Es posible neradas (originadas principalmente a partir de crear m oléculas con doble especificidad por las células NK) se reinyectan en el paciente. unión de dos sitios Fv, las que se pueden utili­ Este tratamiento administrado junto con IL-2

F(ab’)2

F ig . 33-3. E sq u em atizació n de la e stru ctu ra co m p leta de una m o lé ­ c u la d e Ig G y s u s f r a g m e n to s F (ab ’)2, Fab y Fv, lo que es p o si­ b le obtener por m étodos quím icos o por recom binación. Por estos m é­ todos pueden obtenerse m oléculas b iv a le n t e s b ie s p e c íf ic a s |l g G , F (ab ’)2], capaces de unirse al antí­ geno tum oral por uno de los sitios d e c o m b in a c ió n y p o r el o tro a reactivo,s adecuados com o drogas, to x in as, en zim as, rad io n u cleid o s, c ito q u in a s , p a r a q u e e je r z a n su efecto directo sobre la célula tum oral. Estos reactiv o s pueden u nirse tam bién a fragm entos F ab y Fv por m éto d o s q u ím ico s, co n stitu y en d o reactivos biesp ecífico s en los que los fragm entos derivados de la m o ­ lé c u la a n tic u e rp o son b iv a le n te s pero sólo tienen un sitio de co m b i­ nación para cada ligando

Inmunología tumoral

679

tuvo mucho éxito en la regresión de tumores los factores estimulantes de colonias granulosólidos en ratones. En seres humanos se está cíticos (G-CSF). Se utihzan en inmunoterapia utilizando actualmente en los casos de tumores contra el cáncer si bien no actúan aumentando la respuesta inm une contra los tum ores. Ac­ metastáticos avanzados. b) Mediante terapia con linfocitos infiltra­ tualm ente, y en form a experim ental, se está dos en el tumor. La finalidad es la generación tratando de transfectar las células tum orales in de células LAK a partir de células mononuclea­ vitro con los genes de diferentes citoquinas pa­ res tomadas del infiltrado inflamatorio que está ra luego trasplantar estas células en anim ales próximo a los tumores sólidos. De esta manera portadores del tumor. De esta manera se logra se enriquece la población de linfocitos TILs la producción de las citoquinas específicamen­ que incluyen a las células NK y a los LTc que te en el sitio donde está creciendo el tumor. son células asesinas inespecíficas. Este trata­ Esto se llevó a cabo con genes de IL-2, IL-4 e miento se realiza administrado junto con altas INFy. En todos los casos se logró la inhibición dosis de IL-2 y está siendo utilizado actual­ del crecimiento tumoral. Todavía no puede ser utilizado en humanos porque los resultados ob­ mente en seres humanos. tenidos, si bien alentadores, son muy prelim i­ nares. Terapia con citoquinas En resumen, los agentes m odificadores de Esta terapia se fundam enta en el hecho de las respuestas biológicas pueden ser utilizados que las citoquinas poseen la capacidad de acti­ para activar macrófagos y células NK. Los an­ var las células que participan de la respuesta ticuerpos monoclonales dirigidos contra antí­ genos tumorales bivalentes o biespecíficos y inmune. Las más utilizadas son las siguientes; IL-2. Administrada en altas dosis se utiliza unidos a drogas citotóxicas o toxinas también sola o junto con inm unoterapia celular adopti­ pueden ser buenas armas contra el tum or. Al­ va. Este tratamiento es efectivo en inducir re­ tern ativ am en te, con ju g ad o s de an ticu erp o s gresión tum oral en 20-40% de pacientes con asociados a enzimas inoculadas en el sitio de melanoma y carcinoma renal. Presumiblemen­ crecimiento tumoral podrían actuar sobre pre­ te la IL-2 actúa activando células NK y/o LTc cursores de ciertas drogas las que, adm inistra­ induciendo la aparición de células LAK in vi­ das en forma sistémica, producen la liberación vo. E ste tr a ta m ie n to p u e d e tra e r e fe c to s del compuesto activo en el sitio correcto y ne­ secundarios, fiebre, edema pulmonar, etc. y es­ cesario. Es aún muy difícil conocer cuál o cuáles de to es producto de la activación de otros linfoci­ tos los que, a su vez, liberan TNE, INFy y lin- los m étodos em pleados tendrá más éxito. El hecho real es que se dispone de una am plia se­ fotoxina. TNF. Se utilizó en pacientes con carcinomas rie de estrategias para contrarrestar el creci­ avanzados. Si bien posee un gran efecto anti- miento tumoral. El futuro aclarará cuál será el turnoral in vitro, produce un efecto tóxico en mejor tratamiento, según el tipo de patología, a utilizar en la inmunoterapia del cáncer. las dosis necesarias requeridas in vivo. IN F a. Es producido por leucocitos. Posee efectos anti-proliferativos in vitro, incrementa el potencial lítico de las células NK y aumenta B IB L IO G R A F ÍA la expresión de antígenos del CMH de clase I A bbas A .K .. Lichtm an A .H . and P ober LS. (1993). Cellu^ en diferentes tipos celulares. Se lo utilizó y se lar an d M o lecu lar Im m u n o lo g y . W .B . S au n d ers Comobtuvieron 10-15% de regresiones en carcino­ pany. 3rd. Edition. mas renales, melanomas y sarcoma de Kaposi, B o o n , T ., C ero ttin i, J.C ., V an d en E y n d e, B ., V a n der B ruggen, P. and V an Peí, A. (1994) Tum or an tig en s re40-50% en linfomas y 80-90% en la leucemia c o g n ized by T lym pbocytes. A nnu. Rev. Im m u n o l. 12, vellosa (tumor de tipo B), en la que se lo utiliza 337-365. actualm ente como citoquina que produce un B urnet, F.M . (1970). T h e concept o f im m u n o lo g ical surveillance. Progress in Exp. T um or Res. 13, 1-27. efecto confiable. INFy. Se lo utilizó para el tratamiento de tu­ Franks, L.M , and Teich, N.M. (1991). Introduction to the. C ellu lar and M olecular mores sólidos y hem atopoyéticos sin m ucho B io lo g y o f C án c er, 2 n d . E d itio n , O x fo rd U niv er.sity éxito. Se pensó que su efecto activante sobre Press. los macrófagos y las células NK, así como su G eorge, A .J.T., Spooner, R.A. and Epenetos, A .A . (1994). A pplications of capacidad para aumentar la expresión de antí­ m o n o c lo n al an tib o d ies in clin ic al oncology. Im m u n o l. genos del CMH favorecería su capacidad para T oday, 15,559-561. hacer más efectiva la inmunidad anti-tumoral H erlyn,M . and K oprow ski, H. (1988). M elanom a antigens: im m unological and biological characterization an d clini­ pero esto no fue así. cal significance. A nnual Rev. of Im m unol. 6, 283 -3 0 8 . Factores de crecim iento hem atopoyéticos. Jack so n , A .M . and .lam es, K. (1994). U n d erstan d in g the Estos incluyen los factores estimulantes de co­ m o st successful im m unotherapy fo r cáncer. T h e Immulonias granulocito-macrofágicos (GM-CSF) y nologi.st, 2/6, 208-214.

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K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E. (1960). D emon,stration o f resistance against m ethylcholanthrene-induced .sarcomas in the prim ary autochtonoiis host. C áncer Res. 20, 1561-1572. K nudson, A .G . (1986). G enetics o f H um an C ancers: review. A nnual Re. o f G enetics 20, 231 -51. L añe, D.P. (1994). T he regulation o f p53 function: Steiner A w ard Lecture. Int. J. C áncer 57, 623-627. L anzavecchia, A. (1993). Identifying strategies for im m une intervention. Science 260, 937-944. P ardoll, D .M . (1993). C áncer vaccines. Im m unol. Today, 14, 310-316. Paul, W . (1993). Fundam ental Im m unology. R aven press. 3rd. Edition. R o sen b erg , S.A . and Lotze, M .T. (1986). C áncer im m unotherapy using interleukin -2 and in terle u k in -2 activa-

te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 710. S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s H .J.(I988). U nique tum or-specific antigens. A nnual Rev. o f Im m unol. 6 ,3 5 9 -3 8 0 . Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988). The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I antigens in tum or grow th and m etastases. A nnual Rev. o f Im m unol. 6 , 359-380. U rban, J.L. and Schreiber, Fl. (1992). T um or A ntigens. A n ­ nual Rev, o f Im m unol. 10, 617-644. V itetta, E.S., Thorpe, P.E. and U hr, J. (1993). Im m unotoxins: m agic bullets or m isguided m issiles. Im m unology T oday 14, 253-259. W aterfield, M .D . (1989). G row th factors. B ritish M edical Bulletin 45, 541-553.

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RICARDO MARGNI ILEANA MALAN BOREL

INTRODUCCION Los mecanismos que conducen a que el feto, considerado como un injerto alogeneico, no sea rechazado por su madre, no están totalm ente esclarecidos. Se han propuesto varias hipótesis, apoyadas en investigaciones científicas. Los avances en los últimos años de las técnicas de biología molecular y de anticuerpos monoclo­ nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca­ nismos inm unológicos involucrados en la re­ producción. M edewar, en un principio, propuso que el éxito de la preñez se debía a que el útero era un sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el tejido implantado no se produce rechazo. Más adelante, y conociendo la importancia que los antígenos del CMH tienen sobre el rechazo de injertos, se atribuyó a que la placenta, al estar desprovista de estos antígenos, actuaría como una barrera antigénicamente neutra entre el feto y la madre. Con el avance de las investigacio­ nes se postuló que durante la preñez se produce una inm unosupresión no específica local, es decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u­ nosupresión no específica sistémica. En los rechazos de injertos alogeneicos hu­ manos, los linfocitos T desempeñan una fun­ ción importante tanto en el reconocimiento de los antígenos no propios, como en la citolisis y destrucción de las células que exponen a estos antígenos. El feto está protegido contra el efec­ to de estas células citotóxicas; los mecanismos involucrados en este fenómeno serán analiza­ dos más adelante. El sistema inmune de la madre desempeña un rol fundamental en el mantenimiento de la ges­ tación, existiendo además una estrecha relación entre este sistema y el endocrino. Una buena re­

lación entre ambos, junto con factores placentarios y factores séricos producidos durante la preñez habrán de llevar al éxito de la misma. En el presente capítulo, todo cuanto se espe­ cule sobre sistema inmune, órganos co m p ro ­ m etidos y productos sintetizados durante la preñez, está referido a humanos. Cuando se tra­ te de otros vertebrados se los identificará espe­ cíficamente. PLACENTA Durante el primer período de su desarrollo, el embrión extrae directamente del endometrio las sustancias nutritivas y el oxígeno que nece­ sita. A medida que se desarrolla, este tipo de intercambio con el organismo materno se hace insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias y respiratorias del embrión, responde la form a­ ción de un nuevo órgano: la placenta. En la mujer, ésta se desarrolla gradualmente durante los tres primeros meses de gestación y al final del tercer mes está completamente formada. F orm ación de la placenta La formación de la placenta se puede dividir en dos períodos: a) prevelloso y b) velloso. a) En el período prevelloso el huevo fecunda­ do llega al útero donde se implanta en el estadio de blastocito. El disco embrionario se orienta hacia la parte profunda del endometrio; una es­ pesa capa de trofoblastos lo separa de las célu­ las deciduales. Una vez producida la im planta­ ción el trofoblasto se diferencia en sincitiotrofo­ blasto primitivo, formado por una espesa masa citoplasm ática sin límites intercelulares. Este sincitio emite brotes que, por acción de enzimas

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K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E. (1960). D em onstration o f resistance against m ethylcholanthrene-induced sarcom as in the prim ary autochtonoiis host. C áncer Res. 20, 1561-1572. K nudson, A .G . (1986). G enetics o f H um an C ancers: review. A nnual Re. o f G enetics 20, 231 -51. L añe, D.P. (1994). T he regulation o f p53 function: Steiner A w ard Lecture. Int. J. C áncer 57, 623-627. L anzavecchia, A. (1993). Identifying strategies for im m une intervention. Science 260, 937-944. P ardoll, D .M . (1993). C áncer vaccines. Im m unol. Today, 14, 310-316. Paul, W . (1993). Fundam ental Im m unology. R aven press. 3rd. Edition. R o sen b erg , S.A . and Lotze, M .T. (1986). C áncer im m unotherapy using interleukin-2 and interleukin-2 activa-

te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 710. S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s H .J.(I988). U nique tum or-specific antigens. A nnual Rev. o f Im m unol. 6 ,3 5 9 -3 8 0 . Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988). The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I antigens in tum or grow th and m etastases. A nnual Rev. o f Im m unol. 6, 359-380. U rban, J.L. and Schreiber, H. (1992). T um or A ntigens. A n ­ nual Rev, o f Im m unol. 10, 617-644. V itetta, E ,S „ Thorpe, P,E, and U hr, J, (1993), Im m unotoxins: m agic bullets or m isguided m issiles, Im m unology T oday 14, 253-259, W aterfield, M ,D , (1989), G row th factors, B ritish M edical Bulletin 45, 541-553,

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INTRODUCCION Los mecanismos que conducen a que el feto, considerado como un injerto alogeneico, no sea rechazado por su madre, no están totalm ente esclarecidos. Se han propuesto varias hipótesis, apoyadas en investigaciones científicas. Los avances en los últimos años de las técnicas de biología molecular y de anticuerpos monoclo­ nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca­ nismos inm unológicos involucrados en la re­ producción. M edewar, en un principio, propuso que el éxito de la preñez se debía a que el útero era un sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el tejido implantado no se produce rechazo. Más adelante, y conociendo la importancia que los antígenos del CMH tienen sobre el rechazo de injertos, se atribuyó a que la placenta, al estar desprovista de estos antígenos, actuaría como una barrera antigénicamente neutra entre el feto y la madre. Con el avance de las investigacio­ nes se postuló que durante la preñez se produce una inm unosupresión no específica local, es decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u­ nosupresión no específica sistémica. En los rechazos de injertos alogeneicos hu­ manos, los linfocitos T desempeñan una fun­ ción importante tanto en el reconocimiento de los antígenos no propios, como en la citolisis y destrucción de las células que exponen a estos antígenos. El feto está protegido contra el efec­ to de estas células citotóxicas; los mecanismos involucrados en este fenómeno serán analiza­ dos más adelante. El sistema inmune de la madre desempeña un rol fundamental en el mantenimiento de la ges­ tación, existiendo además una estrecha relación entre este sistema y el endocrino. Una buena re­

lación entre ambos, junto con factores placentaríos y factores séricos producidos durante la preñez habrán de llevar al éxito de la misma. En el presente capítulo, todo cuanto se espe­ cule sobre sistema inmune, órganos co m p ro ­ m etidos y productos sintetizados durante la preñez, está referido a humanos. Cuando se tra­ te de otros vertebrados se los identificará espe­ cíficamente. PLACENTA Durante el primer período de su desarrollo, el embrión extrae directamente del endometrio las sustancias nutritivas y el oxígeno que nece­ sita. A medida que se desarrolla, este tipo de intercambio con el organismo materno se hace insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias y respiratorias del embrión, responde la form a­ ción de un nuevo órgano: la placenta. En la mujer, ésta se desarrolla gradualmente durante los tres primeros meses de gestación y al final del tercer mes está completamente formada. F orm ación de la placenta La formación de la placenta se puede dividir en dos períodos: a) prevelloso y b) velloso. a) En el período prevelloso el huevo fecunda­ do llega al útero donde se implanta en el estadio de blastocito. El disco embrionario se orienta hacia la parte profunda del endometrio; una es­ pesa capa de trofoblastos lo separa de las célu­ las deciduales. Una vez producida la im planta­ ción el trofoblasto se diferencia en síncítiotrofoblasto primitivo, formado por una espesa masa citoplasm ática sin límites intercelulares. Este sincitio emite brotes que, por acción de enzimas

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Inmunopatología

citolíticas, destruyen a las células deciduales que Los troncos principales (vellosidades de 1er los rodean liberando sustancias nutricias para el orden) se subdividen en vellosidades de 2- y de embrión (glucógeno, lípidos, prótidos, etc). El 3“' orden. El conjunto de las ramificaciones de­ otro producto de diferenciación es el citotrofo- rivadas de cada vellosidad de 1er orden consti­ hlasto primitivo, situado en la vecindad de la tuyen un cotiledón placentario, separados entre cavidad coriónica y constituido por una capa de sí por tabiques que se originan en la decidua. células poliédricas. El origen del sincitio y del Cada una de las vellosidades está formada por citotrofoblasto no se conocen. un estroma de tejido conectivo, por el que cir­ Más adelante aparecen, en el sincitiotrofo- cula una arteriola y una vénula procedentes de blasto, numerosas vacuolas o lagunas separa­ la arteria y de la vena umbilical del feto, y por das por trabéculas formando las cavidades la­ un revestimiento de sincitiotrofoblastos. berínticas. Esta capa va perforando los capila­ La parte materna de la placenta es la decidua res del endometrio hasta alcanzar las arteriolas basal, la que en su parte superficial es compac­ y las vénulas que lo recorren, penetrando así la ta y en su parte profunda esponjosa debido a la sangre materna en los espacios [acunares. La presencia de glándulas y vasos venosos. Duran­ verdadera circulación de la sangre por las lagu­ te el parto la decidua se desprende de la pared nas trofoblásticas se inicia en la tercera sema­ uterina (fig. 34-2). na, cuando las arterias espiraladas del endome­ Si se secciona la placenta se puede observar trio son perforadas. En esta etapa el huevo ha hacia la superficie fetal la placa corial cubierta penetrado en el endometrio más profundamente por el líquido amniótico y hacia la superficie y se completa la anidación. materna la placa basal formada por la decidua b) El período velloso se inicia a partir del día y por el epitelio de sincitiotrofoblastos. Entre 13 con una intensa actividad proliferativa del ambas placas se encuentra el espacio interve­ trofoblasto. Las trabéculas del sincitio toman lloso (fig. 34-2 y 34-3). un aspecto velloso y hay penetración de células La placenta ejerce innumerables funciones, citotrofoblásticas, formándose las vellosidades las que se adaptan a la tarea que aquella debe primarias. Éstas, al evolucionar se transforman desarrollar para lograr el mantenimiento del fe­ en troncos vellosos que darán origen a los coti­ to en el útero materno. A través de la placenta ledones fetales. Los cotiledones están formados la sangre venosa del feto cede el COj a la san­ por un centro conjuntivo vascular rodeado por gre m aterna y se provee nuevam ente de O^. un epitelio de citotrofoblastos o capa profunda También hay pasaje de ciertas sustancias nutri­ y por un epitelio de sincitiotrofoblastos o capa cias tales como agua, azúcares, grasas, aminoá­ superficial. cidos, sales, vitaminas, etc, fundamentales para El lugar de implantación ocupa sólo una par­ la nutrición fetal. La placenta constituye, ade­ te del endometrio; a esta zona durante la preñez más, una barrera de protección para determina­ se la denomina decidua. dos microrganismos patógenos que pueden en­ contrarse en la sangre materna. Por el contra­ rio, ciertos virus como los del sarampión, vari­ Estructura y función cela y viruela atraviesan la placenta, quedando La .placenta humana es de tipo hemocorial, el feto expuesto a los mismos. esto significa que las células trofoblásticas es­ La placenta humana y de algunos vertebrados tán en contacto directo con la sangre materna. permite el pasaje de anticuerpos producidos por En un embarazo de término, la placenta hu­ el sistema inmune de la madre. En el hombre mana, cuando está completamente desarrollada los anticuerpos de tipo IgG son los que atravie­ es de tipo circular, esponjosa, con un diámetro san la placenta otorgando protección fetal, ya de alrededor de 20 cm, un espesor de 2 cm y su que el feto todavía no es capaz de producirlos. peso oscila entre 500 y 600 g. El cordón umbi­ La placenta secreta varias hormonas como lical se inserta en la cara que enfrenta al feto y son la gonadotrofina coriónica, estrógenos, por transparencia se pueden ver los vasos san­ progesterona, las que son volcadas al torrente guíneos distribuidos en forma de estrella a par­ circulatorio materno. La placenta secreta tam­ tir de su punto de inserción (fig. 34-1). bién factores moduladores de la respuesta in­ E stá constituida por una parte fetal y una mune a los que se les atribuye una función pri­ parte materna. La parte feta! está formada por mordial en el mantenimiento del feto en el úte­ las vellosidades córlales que se han desarrolla­ ro materno. do y ramificado. Hay dos tipos de vellosidades, A partir del 7“ mes de gestación la actividad las fija s que profundizan en la decidua y cuya de la placenta va disminuyendo, la altura de las función sería la de “anclar” la placenta a la pa­ vellosidades es menor, el corion degenera en red uterina, y las libres, más numerosas, están algunos puntos y entre el corion y la decidua se en contacto directo con la sangre materna en van formando depósitos fibrosos. A este proce­ las lagunas sanguíneas. so se lo denomina senescencia de la placenta,

Inmunología de la reproducción que anuncia el cese de las funciones placentaria que terminarán con el parto. Células trofoblásticas: expresión antigénica El feto no se encuentra en contacto directo con la madre, son las células trofoblásticas las que lo hacen, formando lo que se denomina in­ terfase materno-fetal. En ella existen dos áreas de contacto: el sincitiotrofoblasto y el citotro­ foblasto. Los sincitiotrofoblastos son las célu­ las que recubren las vellosidades coriónicas y por tal razón constituyen la mayor interfase en­ tre la madre y el feto, ya que las vellosidades están bañadas por la sangre materna. Estas cé­ lulas en los roedores se denominan trofoblastos laberínticos. Los citotrofoblastos invaden a la decidua endometrial y es aquí donde se ponen en contacto con las células maternas. En los roedores a estas células se las denomina espongiotrofoblastos. La expresión de los diferentes antígenos en la placenta ha sido ampliamente estudiada. Dado que la preñez se asemeja a un trasplante aloge­ neico, e! mayor énfasis ha sido puesto en una serie de antígenos codificados por el CMH, res­ ponsables de los rechazos de injertos. Con el ob­ jeto de ayudar a comprender cómo pueden coe­ xistir madre y feto, siendo ambos genéticamente diferentes, es que se han realizado estudios in­ munológicos y moleculares para analizar la ex­ presión de los genes que codifican para los antí­ genos del HLA de clase I y de clase II en las di­ ferentes poblaciones de células trofoblásticas. La regulación en la expresión de los antígenos HLA a nivel placentario sería uno de los hechos más importantes para el éxito de la preñez. Los antígenos HLA clase 1 y clase II clásicos, indispensables para el desarrollo de la respuesta inmune humoral y celular, están ausentes en los sincitios y en los citotrofoblastos. En el ratón, las células laberínticas no expresan moléculas de clase I, mientras que los espongiotrofoblastos pueden expresar antígenos de clase I (H-2K, H2D) y en algunas cepas se ha encontrado la ex­ presión de los antígenos H-2L. Se supone que estos antígenos, al estar presentes en las células trofoblásticas, actuarían como un inmunoadsor­ bente uniendo las moléculas de anticuerpos anti­ paternos formados en la madre los que se degra­ darían más rápidamente. En la rata la situación es semejante a la del ratón, salvo que en los es­ pongiotrofoblastos se ha demostrado la expre­ sión de un sistema antigénico denominado Pal y Pa2 (“pregnancy associated”). En el hombre, los citotrofoblastos expresan un antígeno denominado HLA-G. Este fue pri­ m eram ente identificado como una m olécula HLA de clase I clásica (A,B,C) ya que reaccio­ naba con el anticuerpo monoclonal W6/32. E s­

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te anticuerpo reacciona con una porción co n ­ servada de las moléculas de clase I clásicas. A pesar de esta expresión aloantigénica los trofo­ blastos, in vitro, y por razones no establecidas, no son destruidos por células citotóxicas ni por lisis mediada por complemento. A causa de e s­ tos hechos se considera que cum plirían u n a función importante en la protección del feto en el útero materno. Existen diversas sustancias, tales como INE-y, IL-4, 5-azycytidina (5 Azac) que tienen la capacidad de inducir la expresión de los antígenos HLA-II clásicos sobre las c é ­ lulas trofoblásticas. El lEN-y lo hace, por ejem ­ plo, sobre los espongiotrofoblastos del ratón y la 5-Azac sobre las células laberínticas. Otras sustancias como la a-fetoproteína, son capaces de inhibir la inducción ejercida por el INE-y so ­ bre la expresión de esos antígenos. En 1978 Eaulk y col. observaron la expre­ sión en células trofoblásticas de un antígeno, posteriormente descrito en linfocitos por otros investigadores. A este antígeno se lo denominó TLX (Trophoblast lymphocytes cross-reactive antigens). Es un antígeno heterogéneo en su peso molecular (55-65 kD) según provenga de diferentes líneas celulares y de distintas prepa­ raciones de trofoblastos. Los trofoblastos y lin ­ focitos de un mismo individuo expresan el m is­ mo epitope antigénico. Trabajos recientes han demostracTo que este antígeno es sinónimo de CD46. Esta proteína es un cofactor de mem bra­ na capaz de unirse a C3b y C4b y facilitar la inactivación de éstos por la proteína I del siste­ ma complemento. De esta manera CD46 ejer­ cería un efecto protector del trofoblasto evitan­ do un ataque inmunológico. Al antígeno TLX se le asigna además u n efecto protector de las células trofoblásticas. Estos antígenos estimularían a la madre a una respuesta inmune beneficiosa para el desarrollo de la placenta. Se postula además la formación de un anticuerpo anti-idiotipo; un equilibrio e n ­ tre la relación anti-TLX y su anti-idiotipo sería beneficioso para el éxito de la preñez. Su a u ­ sencia llevaría al aborto. En esta hipótesis se basa el tratamiento que a ciertas pacientes que presentan abortos recurrentes de etiología d es­ conocida se les hace inyectándoles una suspen­ sión de linfocitos provenientes de su pareja, con el fin de lograr embarazos que lleguen a fe ­ liz término. Expresión de proteínas relacionadas con la regulación del sistema complemento Las células trofoblásticas expresan ciertas sustancias que modulan la activación del co m ­ plemento: “la proteína cofactor de membrana” (MCP, identificada actualmente como sinóni­ mo de CD46, TLX, arriba descrita) y el “factor

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Inmunopatología

_ Vasos sanguíneos

F ig . 34-1. L a placenta vi.sta desde la cara fetal (Tom ada de E n ciclopedia “C onsulta” Edit. C odex, 1965.)

acelerador del decaimiento” (DAF) modulan la activación de C3 de la cascada del complemen­ to, acelerando la inactivación de la actividad funcional de C3-convertasa de la vía clásica y de C3bBb de la vía alterna. Estas proteínas han sido bien identificadas. Las características del MCP (CD46) ya han sido indicadas. El DAF es una glucoproteína sim ple de PM 74 kD. La función de estas proteínas sería la de proteger a la placenta de un ataque inmunológico media­ do por complemento. Antígenos relacionados con los grupos sanguíneos Los antígenos relacionados con el sistema ABO no estarían expresados sobre las células

trofoblásticas humanas. Se ha localizado un an­ tígeno sialyl-Le* en los citotrofoblastos. Fue detectado con dos anticuerpos monoclonales, uno dirigido contra los hidratos de carbono fucosilados y el otro contra los hidratos de carbo­ no sialilados de la cadena precursora de los grupos sanguíneos tipo 1 y tipo 2. Los sincitiotrofoblastos, células que recubren las vellosida­ des coriónicas, no reaccionan con ninguno de estos dos anticuerpos. Durante el desarrollo embrionario hay expre­ sión de algunos antígenos carbohidratados. Es­ tos podrían estar involucrados en el reconoci­ miento célula-célula e incrementar la sialidación de glucoconjugados de superficie, mecanismo que en las células tumorales le confiere resisten­ cia a su lisis por las células NK. Sería muy inte­ resante determinar si estos antígenos tienen al­ guna función semejante en la interacción que se produce entre células trofoblásticas y células de la decidua. De ser así, su presencia en las célu­ las trofoblásticas sería importante para el mante­ nimiento de la integridad placentaria. DECIDUA La decidua es un tejido membranoso consti­ tuido por la mucosa uterina que se forma du­ rante la gestación y que es expulsada luego del parto. En la decidua humana y de ratón se ha evidenciado una gran variedad de células. En­ tre ellas los macrófagos CD14+, los que expre­ san antígenos CMFÍ clase II que les confiere una función inmunológica importante, actuan-

nI

Espacio E ¡: intervelloso inte

J lasal

F ig. 34-2. Estructura y circulación placentaria (T om ada de E nciclopedia “C onsulta” Edit. C odex, 1965.)

Inmunología de la reproducción

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F ig . 34-3. C o rte transversal de placenta: ubicación de ias células trofoblásticas.

do como células presentadoras de antígenos a ción de la lL-2, interfiriendo con los receptores los linfocitos T. En el tejido decidual están en para dicha interleuquina. El desarrollo de esta contacto con los citotrofoblastos placentarios. población de pequeños linfocitos requiere de Los macrófagos normalmente están presentes ciertas señales hormonales, así como también en el estrom a endom etrial duran te el ciclo de factores solubles secretados por los trofomenstrual, aumentando su número al comenzar blastos. Al factor soluble secretado por los p e ­ queños linfocitos presentes en la decidua m uri­ la preñez. Los linfocitos T forman parte también de las na se lo ha relacionado con TGE-P^ (“Transforcélulas del estroma uterino, presentando la m a­ ming growth factor (32” ). Su presencia está re ­ yoría receptores T C R (a/p); una baja propor­ lacionada con una preñez normal, ya que, si su ción presenta receptores TCR( y/5). Los linfoci­ actividad es débil se producen abortos. jEste tos T CD3+, CD8* podrían participar en meca­ efecto ha sido corroborado con experiencias realizadas in vivo inyectando a la madre un an­ nismos de supresión. En el estroma decidua! humano existe una ticuerpo monoclonal anti-TGF-p^. Hasta el m o ­ población de leucocitos con características de mento no se conoce cual es el linaje de estos gran linfocito (LGL). En el primer trimestre de pequeños linfocitos. la gestación éstos forman la mayor parte de las células deciduales (75%), no presentan caracte­ rísticas de linfocitos T ni de hnfocitos B, pero IM PLA N T A C IÓ N sí presentan actividad NK. Expresan el marca­ dor de superficie CD 56 y son CD2+, C D 3% La im plantación de los blastos en el útero C D l6", no presentando receptores para Fe. Es­ materno es regulada por una serie de mecanis­ tas células serían las responsables de la produc­ mos endocrinos e inmunológicos estrechamen­ ción de factores de crecimiento. La actividad te relacionados, que llevarían al éxito de la im ­ NK que presentan les otorgaría un rol im por­ plantación del huevo fecundado. tante en la gestación controlando la invasión En el momento de la implantación las célu­ las endometriales sufren diferenciación y proli­ del trofoblasto en el tejido uterino. Se ha demostrado que la decidua, tanto hu­ feración. Todo esto es controlado por una serie mana como de ratón, expresa capacidad inmu- de sustancias tales como hormonas esteroideas nosupresora. En el humano no se han identifi­ ováricas, histamina, prostaglandinas, leucotrie­ cado aún las células responsables de este efec­ nos y factor activador de plaquetas (PAF), las to. En el ratón esto se atribuye a una población que contribuyen a la transformación celular, es de pequeños linfocitos que presentan gránulos decir, a la formación de la decidua endom e­ citoplasmáticos. Clark y col. han demostrado trial. Estas sustancias son secretadas por los te ­ que estas células o no estaban presentes o, si lo jidos endometriales del útero. En el endometrio estaban, lo hacían en muy baja proporción en humano se secretan factores supresores depen­ dos m odelos m urinos que presentan un alto dientes de la progesterona, que atenúan la lingrado de resorción fetal. Estos investigadores foproliferación producida por los mitógenos o han identificado además un factor soluble, se­ los aloantígenos. En los program as de fertilización in vitro cretado por dichas células, que actuaría b lo ­ queando la respuesta de los linfocitos T a la ac­ que se realizan en humanos, sobrenadantes de

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cultivos tie embriones presentan, como en el caso anterior, la misma actividad inmunosupresora, existiendo una estrecha correlación entre la presencia de este efecto y el éxito de la im­ plantación. Imakawa y col. han encontrado una sustan­ cia bioquímicamente activa denominada proteí­ na de trofoblasto (TP-1) en ovinos y en bovi­ nos, que guarda una estrecha relación con el IFN -a. Dicha proteína presenta efecto anti viral y tiene la propiedad de inhibir la respuesta de linfocitos a mitógenos y a IL-2, por lo que se le atribuye una activa participación en el control de la respuesta inmune materna a los aloantígenos embrionarios. Otra de las proteínas encontradas es la |3-lactoglobuhna (PLG/PP14), secretada por las cé­ lulas del epitelio glandular del endometrio, con efecto inmunosupresor sobre la actividad de las células NK. Por este mecanismo el embrión es­ taría protegido del ataque por las células NK maternas durante el período de pre-implantación. Las células del estroma endometrial produ­ cen INF-P 2, IL-6 en respuesta a IL-1, TNF e IFN-y, efecto que es suprimido por la acción de los estrógenos. La IL-1 estimula la produc­ ción de prostaglandina E-2 (PG-E2) en el teji­ do endometrial, y como ésta tiene un potente efecto inm unosupresor, el hecho de haberse encontrado niveles elevados de IL-1 en el en­ dometrio luego de la implantación, hace que se le atribuya una función regulatoria. La IL-1 tendría otro efecto, como es el de inhibir la decidualización de las células del estroma endo­ metrial humano inducida por la progesterona. Si células endometriales son cultivadas, duran­ te dos semanas, con 10 * M de progesterona, se transforman en células deciduales productoras de prostaglandina, fenóm eno que es inhibido por el añadido de IL-1. No se comprende exac­ tamente cuál es el rol de la IL-1 en el endome­ trio, pero podría pensarse que la infertilidad causada por una inflamación endometrial, po­ dría deberse a un incremento de la secreción de, esta molécula por parte de los macrófagos uterinos activados. En el período de implantación, se le ha asig­ nado un posible rol en el desarrollo de la pla­ centa, al factor estimulador de colonias de ma­ crófagos (M-CSF). Si bien este factor se en­ cuentra presente en cultivos de células epitelia­ les y de células del estroma, la adición de pro­ gesterona sólo estimula la producción del mis­ mo por las células del estroma. En el endome­ trio, M-CSF podría actuar en la diferenciación y maduración de los macrófagos tisulares y de las células endometriales, como así también en el d e sarro llo p la c e n ta rio en el p e río d o de preimplante.

RESPU ESTA INMUNE ESPECÍFICA Y NO ESPECÍFICA Las investigaciones realizadas hasta el pre­ sente confirman que el sistema inmunológico de la madre desempeña un rol fundamental en el mantenimiento fetal. La regulación de la res­ puesta inmune materna se llevaría a cabo me­ diante dos mecanismos: uno específico y otro inespecífico. Los mecanismos específicos esta­ rían m ediados por anticuerpos y por células sensibilizadas, en tanto que mecanismos supresores locales y sistémicos lo harían en forma inespecífica. Mecanismos inespecíficos Los mecanism os supresores locales serían debidos a factores locales no específicos inhibi­ dores de la respuesta celular. Esta actividad po­ dría estar mediada, entre otros, por TGF-p se­ cretado por células presentes en la decidua. Los sobrenadantes de cultivos de células placentarias suprimen la respuesta mitogénica y alogénica de linfocitos estimulados en cultivo mixto, inhibiendo además la actividad de las células NK. No se conoce exactamente la naturaleza de estos factores, pero se sabe que rompen los me­ canismos de adhesión célula-célula esenciales para el desarrollo de una respuesta inmune. Los mecanismos supresores sistémicos esta­ rían mediados por factores derivados de la pla­ centa y de la decidua que alcanzan la circula­ ción materna, entre los que se encuentran hor­ monas y glucoproteínás asociadas a la preñez (a^-PAG y P,-PSE), las que inhiben la funcio­ nalidad del Unfocito T y de las células NK. Su origen es atribuido a la placenta por habérselas encontrado en varios sueros retroplacentales al comienzo de la preñez, para ir desapareciendo a lo largo de la misma. Es probable que éstas sean eliminadas antes de entrar a la circulación, lo que hace que con frecuencia no se las detec­ te en el suero materno o sólo lo sean en bajas concentraciones. Mecanismos específicos Los sincitiotrofoblastos vellosos están en contacto directo con la sangre materna y los ci­ totrofoblastos presentes en la decidua lo hacen con las células maternas. Estas serían las áreas más importantes en donde los linfocitos mater­ nos pueden ser sensibilizados por las células trofoblásticas. En la interfase entre la madre y el feto se realiza el pasaje de células a la circu­ lación materna llevando, de esta manera, antí­ genos hacia otros lugares del sistema inmunológico de la madre donde podría ocurrir una respuesta inmune.

Inmunología de la reproducción En la vena uterina de algunas mujeres emba­ razadas se han encontrado sincitiotrofoblastos y citotrofoblastos. No se conoce el motivo del desprendimiento de estas células de la placenta y su posterior pasaje a la circulación materna. En ésta se han detectado durante el parto y en algunos casos durante el embarazo, células ro­ jas fetales. El tipo de respuesta inmune que la madre de­ sarrolla durante la preñez dependería de la na­ turaleza de los antígenos expresados por las cé­ lulas placentarias y por los tejidos fetales que están en contacto con las células inmunocom­ petentes maternas. Respuesta a antígenos HLA paternos No obstante que los antígenos HLA clásicos no están presentes sobre las células trofoblásti­ cas, la madre puede estar expuesta a antígenos paternos expresados en células fetales, desarro­ llándose de esta manera anticuerpos dirigidos hacia dichos antígenos. Esta sensibilización po­ dría deberse al pasaje de leucocitos fetales, HLA+, a la circulación materna, debido a una ruptura accidental de la continuidad de las ve­ llosidades coriónicas. Se han detectado an ti­ cuerpos citotóxicos anti-HLA paternos en un 15% de mujeres que transcurren con un primer embarazo normal, elevándose este porcentaje al 60% en el caso de mujeres multíparas. Estos anticuerpos no son capaces de fijar com ple­ mento; su presencia no pondría en peligro la integridad del feto. Respuesta a antígenos no pertenecientes al sistema HLA clásicos Durante el embarazo hay una respuesta in­ mune hacia diferentes antígenos, los que pue­ den ser moléculas específicas de la placenta o del feto, aloantígenos presentes en tejidos placentales y tejidos fetales, los que pueden ser expresados, o no, por los tejidos somáticos del adulto. Existe, además, una serie de antígenos expresados por las células trofoblásticas y por los linfocitos, tales como TLX y HLA-G. En estos casos los anticuerpos producidos pueden ser detectados cuando se usa como antígenos (célula “blanco”) los linfocitos paternos. Existen otros antígenos denominados antíge­ nos de histocompatibilidad menores definidos por técnicas celulares y por injertos, pero no por serología. Durante el embarazo no se han detectado anticuerpos con esa especificidad. Producción de anticuerpos “facilitantes” Trabajos sobre tumores realizados en la dé­ cada del ’60, demostraron la presencia de anti­

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cuerpos que se unen específicamente a los antí­ genos presentes en células tumorales, ocultán­ dolos del sistema inmune del huésped y evitan­ do, de esta manera, su eventual rechazo. A e s­ tos anticuerpos se los denominó/ac77íía«íe.s d e­ bido a que, al impedir la destrucción del tum or por un mecanismo inmune de tipo celular, faci­ litan su crecimiento. Se presume que un m eca­ nismo de tipo similar podría tener lugar durante la gestación. En efecto, en el suero de mujeres embarazadas se encontró una IgG que bloquea específicamente la respuesta inmune celular de la madre hacia los antígenos paternos y hacia los antígenos presentes en la placenta. Este tipo de anticuerpo no fue detectado en mujeres que presentan abortos recurrentes. Anticuerpos IgG asimétricos A com ienzos de 1970 pudim os dem ostrar que toda respuesta inmune que cursa con p ro ­ ducción de anticuerpos de la clase IgG, precipi­ tantes, fijadores del complemento, depuradores de antígenos, está acompañada por otra pobla­ ción de anticuerpos, de la clase IgG, de lo s mismos isotipos que los precipitantes y que tie ­ nen un comportamiento inmunoquímieo y b io ­ lógico totalm ente diferente. P ara estos a n ti­ cuerpos, descritos en detalle en el capítulo 19, hemos propuesto el nombre de anticuerpos IgG asimétricos y es como se los conoce en la lite­ ratura. La designación proviene del hecho de que estas moléculas de IgG tienen insertado un oligosacárido en sólo uno de sus Fab, originan­ do este hecho una asimetría molecular. El o li­ gosacárido más representativo es de alto conte­ nido en mañosa (“high mamiose type”), con c a ­ pacidad de unirse a la lectina concanavalina A, a diferencia de lo que ocurre con los oligosacá ridos que se encuentran en el Fe, donde predo­ minan los que tienen restos de galactosa y ác i­ do siálico. Esto hace que de la población total de moléculas de anticuerpos IgG, sólo los a si­ métricos se fijan a Con A. Este hecho ha p e r­ mitido, además, poder demostrar que en to d a población de IgG "no específica” aislada de un suero normal, el 10-15% de las moléculas son de tipo asimétrico. Este es un hecho extensivo a todos los vertebrados y que afecta a las dife­ rentes subclases de IgG que se elaboran. Estas moléculas son consecuencia de un fe ­ nómeno de origen postraduccional, no son e la ­ boradas por células distintas, ya que, como lo hemos demostrado empleando cultivos de h i­ bridomas, son sintetizados por el mismo clon celular. Los mecanismos que pueden ser re s ­ ponsables de este hecho han sido discutidos en el capítulo 19. El resto oligosacarídico, responsable de la asim etría, interfiere en la funcionalidad d el

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fragmento Fab al que afecta. A consecuencia de ello este Fab no puede unirse a grandes ligandos y la molécula de IgG funciona como anticuerpo bloqueante, univalente, protector del agente agresor y no deJ huésped. Al no for­ mar agregados, debido a su univalencia funcio­ nal, no pueden poner en marcha mecanismos efectores de la respuesta inmune como precipi­ tación por formación de complejos adecuados, fijación del complemento y depuración antigé­ nica, entre otros. En condiciones normales la inoculación de antígenos solubles en pocas dosis o en dosis re­ petidas por períodos prolongados, inducen en todos los casos respuestas en las que los anti­ cuerpos IgG asimétricos sólo llegan al 10-15% de la población total de anticuerpos produci­ dos. Los antígenos particulados, inoculados en forma repetida, inducen respuestas en las que los anticuerpos asim étricos pueden llegar a constituir hasta el 70% del total. Dado que la afinidad por el ligando de los anticuerpos IgG normales y la de los asimétricos es la misma (son sintetizados por el mismo clon celular), un suero que los contenga se comportará de mane­ ra diferente segíin sus proporciones, ya que en este caso la competición será por masa de anti­ cuerpo. E stud ios efectuad o s m u estran que cuando en una m ezcla de anticuerpos de la misma especificidad, la proporción de anticuer­ po asimétrico es del 20%, o menor, esa concen­ tración no modifica el comportamiento del an­ ticuerpo precipitante normal pero, si esa pro­ porción aumenta, dicha actividad disminuye y para mezclas en las que la proporción de anti­ cuerpo asimétrico es del 70-80%, la actividad del anticuerpo normal no se expresa. Esto hace que los sueros inmunes, que contienen alta pro­ porción de anticuerpo IgG asimétrico, se com­ porten como univalentes, bloqueantes, protec­ tores del agente agresor y no del huésped. Esta situación es la que hemos podido observar en infecciones crónicas, que son fenómenos de la naturaleza que cursan con estimulaciones a re­ petición por antígenos particulados. En estos casos los anticuerpos asimétricos, al proteger al microrganismo o parásito, contribuyen a poten­ ciar la cronicidad (véase cap. 19). Dado el particular comportamiento de estos anticuerpos, hemos investigado si podrían tener alguna participación en la protección del feto en el útero materno. Hemos podido demostrar que la proporción de moléculas IgG asimétri­ cas, que en el suero de mujeres no gestantes es del 10-15%, se duplica en las em barazadas. Cuando analizamos las moléculas de IgG eluidas de placentas previamente lavadas con solu­ ción salina y tratadas luego con buffer diso­ ciante (Glicina-HCI 0,1 M, pH 3 o KCl 4 M), entre el 40-60% de esas moléculas eran asimé­

tricas. Cuando se investigó la actividad anti-antígenos paternos, usando linfocitos como célu­ las “blanco” , pudim os dem ostrar que el 7080% tenían actividad, en tanto que de las IgG normales o simétricas sólo el 7% reaccionaban con los linfocitos paternos. Teniendo en cuenta la competición que existe entre moléculas nor­ males y asimétricas, y la proporción con activi­ dad anti-antígenos paternos en ambas poblacio­ nes de IgG, es lógico presum ir que los anti­ cuerpos IgG asimétricos deben jugar un papel importante en la protección del feto en el útero de la madre. Cuando se analizaron los sueros de mujeres embarazadas, que contenían 30% de moléculas asimétricas, sólo el 2% de éstas tenían activi­ dad anti-paterno, lo que está indicando que la inducción de asimetría molecular es un fenó­ meno general, que debe afectar a la mayoría de las células sintetizadoras de inmunoglobulina, y no solamente a aquellas comprometidas con la síntesis de anticuerpos antipaternos. Todos los fenómenos descritos son bien evidentes en las multíparas, siendo por el contrario muy di­ fíciles de evidenciar en prim íparas. Es muy probable que ello esté relacionado con las reestimulaciones en las multíparas y con la sensibi­ lidad de los métodos de detección usados. En efecto, teniendo en cuenta el volum en de la placenta hum ana (20x10x2 cm) y el tam año promedio de las células (10 |J- de diámetro) que la constituyen, la misma estaría compuesta por aproximadamente 2 x 10^ células. Si se admite como valor promedio que el número de epito­ pes por célula es lO”*, su número total sería 2 x 10‘“. Si la concentración de anticuerpo fuera aproximadamente 1,5 ng/ml (10“"M ) sería muy difícil de detectarlos por los métodos serológicos de diagnóstico. No obstante, si a esa con­ centración molar se la multiplica por el número de Avogadro (6,2 x 10^^) se obtiene el número de moléculas por litro de sangre, en este caso 6 X 10'^, número muy superior al total de epito­ pes que sería necesario bloquear para lograr un efecto beneficioso. Por otra parte, no debe olvidarse que de los métodos serológicos usados con fines de diag­ nóstico, algunos son de interacción prim aria (ELISA, radioinmunoanálisis, inm unofluores­ cencia) en tanto que otros, como la inmunoprecipitación, hemaglutinación, fijación del com­ plemento, son de interacción secundaria (véan­ se caps. 8 y 9). En una mezcla de anticuerpos IgG precipitantes normales y asimétricos, todos ellos serán puestos en evidencia si se usa una reacción de interacción primaria pues sólo uno de los sitios de combinación del anticuerpo o Fab interacciona con el ligando. En cambio, si se usan reacciones de interacción secundaria, en las que la agregación es fundamental y para que

Inmunología de la reproducción ella ocurra deben participar los dos Fab de la molécula, sólo serán puestos en evidencia los anticuerpos normales, no así los asimétricos. És muy importante el conocimiento de este hecho. Se considera como una muy probable causa del aborto recurrente la aparición de anti­ cuerpos normales capaces de interaccionar con los antígenos paternos y poner en marcha reac­ ciones de agresión, a diferencia de lo que ocu­ rre con los anticuerpos asim étricos que blo ­ quean al antígeno y lo protegen de los mecanis­ mos agresores de la inmunidad humoral y celu­ lar. El hacer una buena evaluación diferencial de la respuesta inmune que se ha originado po­ dría ser de mucha utilidad para una mejor eva­ luación diagnóstica y pronóstica. Flay quienes utilizan, en el tratamiento pre­ ventivo del aborto recurrente, inoculaciones re­ petidas de suspensiones de leucocitos de origen paterno. M uy probablemente este tratamiento lleve, por ser una inoculación repetida de antí­ genos particulados, a la inducción de la síntesis de anticuerpos IgG asimétricos, supliendo de esta m anera alguna falla del mecanismo res­ ponsable de la regulación de este fenómeno. Si bien no caben dudas de la importancia de los anticuerpos asimétricos, el interrogante sur­ ge sobre cuáles son los mecanismos que llevan a su síntesis preferencial durante la preñez. So­ bre este particular, investigaciones desarrolla­ das por nosotros han permitido demostrar que la placenta, mediante factores que sintetiza, es la responsable de la regulación de la calidad de los anticuerpos que se elaboran. Utilizando co­ mo reactivo diferentes hibridomas con distintas especificidades, que sintetizan bajas proporcio­ nes de anticuerpos asim étricos de las clases IgG l e IgG2b, hemos comprobado que el aña­ dido a los cultivos de hibridomas del sobrena­ dante de cultivos placentarios varía la calidad del anticuerpo sintetizado, haciendo que se in­ cremente la proporción de anticuerpos asimé­ tricos. Ello ocurre cuando el sobrenadante es añadido al hibridom a en la proporción 5-8%, produciéndose un efecto inhibitorio de la sínte­ sis de anticuerpos totales cuando esas propor­ ciones superan al 20%. Estas experiencias ponen en evidencia que la placenta secreta factores capaces de modular la calidad del anticuerpo que se elabora. Constitui­ ría un mecanismo fisiológico normal de la pre­ ñez, el que haría que la respuesta inmune de la madre contra los antígenos paternos se desviara hacia la producción de anticuerpos protectores de esos antígenos, protegiéndolos del efecto agresor que pudieran inducir los anticuerpos precipitantes normales, a la vez que bloquearían los mecanismos de la inmunidad celular. Se ha podido determinar que la acción regu­ ladora de los factores placentarios es un fenó­

meno general, que afecta a todo el sistema in ­ mune. Hemos demostrado que cuando se in o ­ culan ratas vírgenes y ratas preñadas con an tí­ genos convencionales (ovoalbúmina), la p ro ­ porción de anticuerpos asimétricos sintetizados por ambos grupos es diferente. En las ratas v ír­ genes la relación anticuerpo asim étrico/anti­ cuerpo norm al es 15/85, en tanto que en las preñadas esa relación en los anticuerpos an ti­ ovoalbúmina sintetizados es 30-35/70-65. V a ­ lores sim ilares a estos ú ltim os se o b tien en cu an d o ra tas v írg en e s son in o cu lad a s c o n ovoalbúm ina e inyectadas sim ultáneam ente, por v ía intraperitoneal, con sobrenadante de cultivos de placenta. Estos resultados indican que factores secre­ tados por la placenta, cuyo aislamiento, purifi­ cación e identificación estamos intentando en estos momentos en nuestros laboratorios, p u e ­ den m odular la calidad de respuesta inm une. Los anticuerpos inducidos ejercen un p o d e r protector de los antígenos hacia los que están dirigidos. Se han iniciado estudios en los que se procurará determinar si, como consecuencia de este efecto, su uso podría ser beneficioso en el tratamiento de algunas enfermedades autoin­ munes y en la facilitación del implante de órga­ nos y tejidos alogeneicos. Un efecto similar al de los sobrenadantes de cultivos de placenta lo hemos encontrado en los provenientes de cultivos de linfocitos de embarazadas, que expresan receptores citosólicos para progesterona, cuando son pulsados con la hormona. Estos sobrenadantes constitu­ yen el material del que Szekeres-Bartho aisló el factor que ha demostrado efecto supresor sobre linfocitos T citotóxicos y células NK. Una reflexión final cabe sobre la síntesis de anticuerpos asimétricos por las mujeres gestan­ tes. Siendo estos anticuerpos protectores d el antígeno, incapaces de mediar reacciones b io ­ lógicas que lleven a la destrucción del agente agresor, ¿habrá de resultar beneficioso, en to ­ dos los casos, vacunar a la madre con la finali­ dad de transferirle al feto una inmunidad h u ­ moral pasiva congénita, que no habrá de ser precisamente de la calidad deseada? Respuesta inmune hacia el trofoblasto, mediada p or células La inmunidad celular requiere de la interac­ ción de linfocitos T y de macrófagos, ambos presentes en la decidua en el prim er trimestre de gestación. A pesar de que el trofoblasto no expresa antígenos HLA clase II, es posible que antígenos del trofoblasto sean presentados al linfocito T por macrófagos deciduales y de esta manera estimular la formación de linfocitos T c ito tó x ico s esp ecífico s para el tro fo b lasto .

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Membranas de sincitiotrofoblasto provenientes de placentas autólogas no estimulan la respues­ ta proliferativa en linfocitos maternos. Los ci­ totrofoblastos tampoco estim ulan a linfocitos en cultivo mixto de linfocitos, lo que sugiere que a diferencia de los antígenos HLA-clase 1, los antígenos HLA-G (presentes en los citotro­ foblastos) serían incapaces de generar células T citotóxicas. Importancia de la respuesta inmune materna para el éxito de la preñez Normalmente se presentan un niimero bajo de abortos espontáneos que pueden ser detecta­ dos clínicamente (10-15%). Existen los llama­ dos abortos recurrentes, así denom inados a aquellos producidos más de tres veces en una paciente y que transcurren antes de la semana 20 de gestación. La frecuencia con que apare­ cen es de 1 en 300 mujeres gestantes, su etiolo­ gía es desconocida pero se lo asocia a proble­ mas endocrinos y a anormalidades anatómicas. Los inmunólogos han propuesto varios meca­ nismos para encontrar una explicación al éxito de la preñez. En todos ellos se involucra la for­ mación de anticuerpos, por el sistema inmune de la madre, dirigidos contra antígenos paternos a efectos de protegerlos y asegurar el manteni­ miento fetal. En estos mecanismos participa­ rían: a) la formación en la madre de anticuerpos citotóxicos con actividad anti-iinfocitos pater­ nos, b) la síntesis de anticuerpos “facilitantes” o bloqueantes y de moléculas IgG asimétricas con actividad específica, capaces de bloquear antí­ genos paternos e inhibir el cultivo mixto de lin­ focitos, c) la producción de anticuerpos antiTLX. En las parejas que no comparten este an­ tígeno y que presentan embarazos de término, se ha demostrado la presencia de anticuerpos anti-TLX, los que tendrían por función blo ­ quear a dichos antígenos e impedir que sean el “blanco”de agresión por los componentes nor­ males de una respuesta materna. Se ha observa­ do que las abortadoras comparten con su pareja los antígenos TLX y no presentan anticuerpos contra éste. Es por ello que hay autores que su­ ponen que los antígenos TLX podrían tener al­ guna participación en los mecanismos que regu­ lan la protección del feto en el iítero materno. Corno ya se indicara, se ha ensayado con algtin éxito, en los casos de abortos a repetición, la inoculación de suspensiones de linfocitos provenientes del padre, la que puede revertir la situación, haciendo que el embarazo llegue a término. La mayoría de los autores consideran que ello sería debido a la inducción previa en la madre de una respuesta inmune con formación de anticuerpos protectores contra los antígenos paternos; los anticuerpos IgG asimétricos po­

drían tener participación en este hecho. Otros autores, en cambio, estiman que ello sería con­ secuencia de un fenómeno inespecífico media­ do por citoquinas que aparecen por cualquier estímulo antigénico, y no necesariamente por antígenos de origen paterno. Muy interesantes son los resultados experi­ mentales de Clark y Chaouat, quienes han estu­ diado en profundidad un modelo murino que p re s e n ta un alto g rad o de re s o rc ió n fe ta l (CBA/j X DBA/2). Si hembras CBA/j (H2-k) son apareadas con machos de la cepa DBA/2 (H2d), se produce la preñez pero con un alto grado de resorción fetal (30%). Este porcentaje disminuye considerablemente si a las hembras C B A /j, antes de ser apareadas con m achos DBA/2 se las inoculas con: a) células esplénicas provenientes de ratones BALB/c (H-2d), b) suero de ratones CBA/j previamente inmuniza­ dos con células de BALB/c, c) si se las aparea con ratones BALB/c. Se podría pensar que el efecto que tienen las inoculaciones linfocitarias sobre la resorción pudiera ser debido a la producción de anticuer­ pos anti-H-2d, así como también a un efecto in­ flamatorio. Este efecto estimularía la produc­ ción de citoquinas y de factores de crecimiento que estimularían el desarrollo placentario, evi­ tando así los abortos. Esto último estaría avala­ do por el hecho de que, si a las hembras sólo se les inyecta adyuvante de Freund completo an­ tes de aparearlas con los machos, el porcentaje de resorción también se ve reducido. FACTORES INMUNOMODULADORES SECRETADOS POR EL TROFOBLASTO Tanto el feto como la placenta expresan una variedad de antígenos, entre los que se encuen­ tran los antígenos del complejo mayor de histo­ compatibilidad no clásicos (HLA-G), antígeno TLX, antígenos oncofetales, antígenos especí­ ficos de tejidos, contra los cuales la madre po­ dría reaccionar generando una respuesta inm u­ ne y producir por lo tanto el rechazo del feto. Esto afortunadam ente no sucede. A pesar de que en el suero de la madre se pueden encon­ trar anticuerpos específicos y linfocitos sensibi­ lizados para alguno de ellos, la sobrevida de la unidad feto-placentaria no se ve comprometida. Los diferentes mecanismos propuestos para encontrar una respuesta a esta incógnita son los siguientes: 1. La placenta formaría una barrera fisiológica evitando el pasaje de células maternas y de células fetales. 2. A dsorción de anticuerpos citotóxicos por células expresadas en la placenta.

Inmunología de la reproducción 3. Falta de expresión de antígenos del C M tF clase I y clase II clásicos, por las células tro­ foblásticas. 4. La expresión de los antígenos HLA-G. 5. La producción de anticuerpos “facilitantes”. 6. La producción de anticuerpos asimétricos de la clase IgG. 7. La inducción de una supresión local y sistémica de la respuesta inmune materna. 8. La suceptibilidad dañada de los trofoblastos a las células NK y a las CTL (células “ki­ ller” activadas por linfoquinas). 9. Una inmunorregulación local debida a los productos celulares secretados por la ínterfase materno-fetal, que incluyen trofoblas­ tos, células deciduales y linfocitos presentes en el endometrio. Un número elevado de factores asociados al trofoblasto han sido propuestos como agentes inmunomoduladores involucrados en la sobre­ vida de la unidad feto-materna, posiblemente inhibiendo el efecto de eitotoxicidad T aiogeneica hacia los aloantígenos expresados en el trofoblasto. Estos factores pueden ser clasifica­ dos en dos categorías; I) factores inmunosupresores, II) factores inmunoestimuladores. I. Factores inmunosupresores: Extractos obtenidos de sincitiotrofoblastos tienen un efecto inmunosupresor sobre la res­ puesta proliferativa que ejercen distintos mitó­ genos, como la concanavalina A (Con A) y fitohemaglutinina (PHA), sobre linfocitos y células alogeneicas en los cultivos mixtos de linfocitos. Sobrenadantes de cultivos de trofoblastos pro­ venientes de placentas normales generaron in vitro una población de linfocitos supresores, a los que generalmente se considera responsables de la tolerancia inmunológica. Estos sobrena­ dantes reducen también la actividad de las célu­ las NK contra células “blanco” K562. Efectos similares fueron encontrados en roedores. Extractos placentarios retardaron, en ratón, el rechazo de un injerto tumoral alogeneico. Aná­ lisis serológicos mostraron que estos extractos causaban una disminución en la producción de anticuerpos fijadores de complemento como lo es la IgG2 y un incremento en los anticuerpos anafilácticos (IgGl). Estos extractos indujeron una desviación en la respuesta contra aloantíge­ nos, así como también un aumento en la pro­ ducción de anticuerpos y células supresoras, fa­ voreciendo de este modo la sobrevida del feto. A partir de cultivos de células de coriocarcinoma humano se identificó un complejo protei­ co de PM 150-200 kD que inhibe la transfor­ mación linfocitaria producida por la PHA y por el toxoide tetánico. Parecería que estos factores

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sólo suprimen la función proliferativa de célu­ las inm unocompetentes sin afectar su activ a­ ción ni su diferenciación. Estos factores serían semejantes a los derivados de los trofoblastos humanos. Factores inmunosupresores no específicos a) Hormonas. Las hormonas esteroideas se incrementan durante la gestación e influyen en la reactividad inmunológica. Estas hormonas, producidas inicialmente por el cuerpo lúteo ba­ jo el estímulo de la gonadotrofina coriónica y a partir del 7® mes por la placenta, desempeñan una importante función en el mantenimiento de la gestación. La progesterona actúa inhibiendo las contracciones del miometrio, bloquea la ac­ tividad de la colagenasa uterina, m odifica la actividad de las enzimas proteolíticas y afecta además a la respuesta inmune. Hay evidencias de que altas concentraciones de progesterona son capaces de prolongar la sobrevida de un in­ jerto de piel xenogeneico y alogeneico, habién­ dose logrado además prolongar la sobrevida de células tumorales xenogeneicas en el útero de un hámster aplicando un tratamiento con pro­ gesterona. Si éste es suspendido aparece inm e­ diatamente el rechazo. Tanto los estrógenos como la progesterona suprimen in vivo e in vitro, las reacciones in­ munes. La progesterona inhibe la incorpora­ ción de 3H-timidina por los linfocitos estim ula­ dos con PHA; este efecto se produce al iniciar­ se el cultivo, lo que indicaría que esta horm ona inhibe el proceso de activación inicial de la mitogénesis de las células T. La progesterona en combinación con la prostaglandina E (PGE) (la que aumenta en el endometrio y en la decidua) tiene un efecto sinergístico sobre la respuesta mitogénica de linfocitos periféricos humanos. Los niveles de las hormonas esteroideas en suero y en placenta no son suficientes com o para ejercer un efecto directo sobre los' linfoci­ tos. El nivel de estas hormonas en el útero y en la interfase materno-fetal es mayor que en san­ gre periférica, por lo que cada una de ellas po­ dría regular desde allí la respuesta inmune. N i­ veles elevados de estas hormonas en la vecin­ dad de la placenta participarían en la sobrevida fetal, actuando como un factor inmunosupresor local no específico. Se podría pensar tam bién que estas hormonas puedan afectar indirecta­ mente a la respuesta inmune, induciendo la sín­ tesis de proteínas o glucoproteínas con propie­ dades inmunosupresoras, como así tam bién la producción tímica de células o factores inm unorreguladores. La gonadotrofina coriónica humana (hCG ) es una glucoproteína de PM 46 kD producida

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Inmunopatología

durante la gestación por los sincitiotrofoblas­ timocitos murinos dependiente de IL-1. Estos tos. Esta horm ona es capaz de inhibir la res­ factores bloquean la capacidad de la IL-I de es­ puesta linfocitaria a la PHA, como también la timular la proliferación linfocitaria, inhibiendo respuesta de células alogeneicas. No presenta además, en humanos, la mitogénesis de los lin­ efectos citotóxicos sobre los linfocitos. En un focitos T de sangre periférica sin afectar la sín­ comienzo se pensó que la inoculación de esta tesis de IL-2. hormona prolongaba la sobrevida de un injerto de piel y disminuía la incidencia de enferme­ II- Factores inmunoestimuladores dad injerto-huésped. Experiencias posteriores dem ostraron que ese efecto era debido a un Las células placentarias tienen la capacidad contaminante presente en las muestras ensaya­ de secretar diferentes factores solubles con ac­ das, proveniente de la orina, a partir de la cual tividad inmunestimuladora, favoreciendo el de­ se hacían las purificaciones. Esta sustancia fue sarrollo de tejido placentario. Entre ellos pode­ identificada y se la denominó “Urom odulin”, mos citar a algunas citoquinas que actúan sobre con capacidad para bloquear eventos tem pra­ la diferenciación celular, como son la IL-1 y la nos en la proliferación de células T y de regular IL-6, a los factores estimuladores de colonias la actividad de la IL-1. GM-CSF y M-CSF, al TNF (factor de necrosis b) Proteínas y glucoproteínás. Existe una tumoral), interferón (INF). La IL-1 y la IL-6 son glucoproteínás de PM serie de proteínas y glucoproteínás de origen placentario, cuyas propiedades biológicas toda­ 17 kD y 26 kD, respectivamente, que presentan vía se encuentran en estudio, a las que se les múltiples actividades biológicas. La IL-1 actúa induciendo la secreción de IL-6 en diferentes atribuye actividad inmunosupresora. - a^-glucoproteína asociada a la preñez (a^- sistema celulares, entre ellos fibroblastos, célu­ PAG). Su PM es 360 a 380 kD. Su efecto in­ las endoteliales y células endometriales. Estas munosupresor es preferentemente sobre la res­ interleuquinas son producidas por los trofoblas­ tos y regulan la secreción de hCG por dichas puesta mediada por linfocitos T. - Pj-glucoproteína específica de la preñez células. (Pi-PSG). Es sintetizada también por el sinciEl T N F -a ha sido detectado en sobrenadan­ tiotrofoblasto y alcanza su máxima concentra­ tes de tejidos placentarios y deciduales, así co­ ción al final de la preñez. Su PM es 90 kD. Se mo también en líquido amniótico. Si a las célu­ encuentra en muy baja concentración en el sue­ las trofoblásticas se las estimula con T N F -a e ro materno, por lo que se sugiere que su efecto IL-1, hay aumento de IL-6 y por ende un au­ supresor sea efectuado localmente, en la inter­ mento en la secreción de hCG, lo que indica fase materno-fetal. que dichos factores regularían los niveles de - Proteína A plasmática asociada a la preñez secreción de IL-6 por esas células. (PAPP-A). Es una macroglobulina de PM 750 Se ha determinado la presencia de IN F -a “likD, sintetizada por el trofoblasto. k e” sobre las células trofoblásticas. Teniendo - Proteína placental 14 (PP14). Fue aislada en cuenta que las células placentarias presentan de placenta y tiene una estructura similar a las receptores específicos para IN F-a, se considera otras proteínas asociadas a la preñez. que el IN F -a “like” funcionaría como regula­ Estas sustancias presentan un potente efecto dor fisiológico de los procesos celulares de la inm unosupresor sobre la proliferación celular placenta, participando de esta manera en la re­ inducida por aloantígenos o por mitógenos y gulación de la proliferación de tejidos previa­ m ente estim ulados por los factores de creci­ sobre el cultivo mixto de linfocitos. La PPM presenta además un efecto inhibitorio sobre la miento. El factor M-CSF, originalmente identificado secreción de IL-1 y sobre la producción de IL2 por linfocitos estimulados con PHA. como factor de crecim iento hem atopoyétieo, - F actor transform ante del crecim ien to -p indispensable para la proliferación, diferencia­ (TGF-p, “transforming growth factor”). Es un ción y sobrevida de las células mononucleares, polipéptido multifuncional de PM 25 kD, com­ fue identificado en el útero y su nivel aumenta l.OOO veces durante la gestación. Fue detectado puesto de 2 subunidades de 12,5 kD cada una. Es producido por células neoplásicas, por célu­ en placenta de rata y en el tracto reproductivo las hematopoyéticas y por células asociadas a de ratones preñados. Recientemente se demos­ los órganos de la reproducción. En efecto, las tró la expresión de un gen para el factor Mcélulas placentarias, las células deciduales y las CSF en placenta y decidua, lo que indicaría la células granulosas del ovario producen este posible regulación, por parte de este factor, del factor. Su acción es muy similar a los factores crecimiento y diferenciación de las células en inmunosupresores derivados de los cultivos de la interfase materno-fetal. trofoblastos. Tanto el TGF-P, como su homólo­ Como dijéramos anteriormente, la placenta go el TGF-p 2 suprimen la proliferación de los secreta factores que modulan in vivo e in vitro

Inmunología de la reproducción la calidad y cantidad de la síntesis de anticuer­ pos. Estos factores, inducen una síntesis preferencial de anticuerpos IgG asimétricos los que, dado su particular comportamiento biológico, contribuirían al mantenimiento de la unidad fe­ to-placentaria. FACTORES LINFOCITARIOS M O D U LA D O R ES DE LA RESPUESTA INM UNE Además de los factores placentarios citados anteriorm ente existen factores linfocitarios moduladores de la respuesta inmune. Szekeres-Bartho y col. demostraron que lin­ focitos CD8+ provenientes de mujeres embara­ zadas presentan receptores para progesterona (PRs). El porcentaje de linfocitos PRs positi­ vos aumenta a lo largo de las gestas que trans­ curren normalmente mientras que abortos es­ pontáneos o abortos recurrentes van asociados a una alteración en el número de dichos linfo­ citos. El estudio y caracterización de estos recep­ tores demostraron que es una proteína de PM 80-100 kD formada por 3 dominios: la región N-terminal, la región central rica en cisteína y la región C-terminal. El dominio central es el responsable de la unión del receptor al ADN, el dominio C-terminal es la estructura de unión de la horm ona con funciones de traslocación nuclear y el N-terminal contiene los determi­ nantes antigénieos. La mayoría de los anticuer­ pos están dirigidos contra esta región proteica. Los linfocitos CD8+ de mujeres em baraza­ das que presentan PRs, en presencia de la hor­ mona secretan un factor con propiedades moduladoras de la respuesta inmune. Este factor es una proteína de 34 kD con capacidad para inhibir la lisis mediada por células NK, de in­ hibir la proliferación de cultivo mixto de linfo­ citos y de generar células con fenotipo y fun­ ciones supresoras. Esta proteína aparece en el suero de mujeres que transcurren con embara­ zos normales; su nivel dism inuye considera­ blemente si hay abortos o amenazas de abor­ tos. Esto indicaría una estrecha relación entre esta proteína y el éxito de la gestación. Es posible inducir la expresión de PRs+ en poblaciones linfoideas por estim ulación con m itógenos o por acción de aloantígenos. Se han detectado células PRs+ en pacientes politransfundidos y en aquellos que fueron someti­ dos a trasplantes hepáticos. Este factor no solo tiene efecto modulador in vitro de la respuesta inmune, sino que pre­ senta in vivo efecto antiabortivo. Si sobrena­ dante de linfocitos de ratones preñados estim u­ lados con progesterona se inyecta en ratones

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que presentan un alto grado de resorción fetal, como es la cruza CBA/2 x DBA/j, se observa una disminución en el grado de resorción. Este efecto no se logra si los linfocitos provienen de ratones vírgenes. Un efecto contrario puede observarse si a ratones preñados norm ales se les administra bloqueantes de los PRs com o es el RU486, de manera que la hormona no pueda actuar y por ende no se pueda secretar el factor modulador. Trabajos realizados en nuestros laboratorios han demostrado que el sobrenadante de cultivo de células linfoides provenientes de bazo de ratas, obtenidos al día 10 de preñez alogeneica (W istar X Fischer) modulan in vitro la produc­ ción de anticuerpos IgG l anti-DNP simétrico y asim étrico por células de hibridom a. E ste efecto no se m anifiesta si los leucocitos son previam ente incubados con progesterona. El añadido de 5% de sobrenadante leucocitario a las células del hibridoma produjeron un in cre­ mento del 70%, respecto del control, en la se­ creción de moléculas Ig G l asimétricas, y un aum ento del 10% en la producción to tal de Ig G l. Si el sobrenadante provenía de leucoci­ tos previamente incubados eon la hormona, las células de hibridom a redujeron la síntesis de IgG l anti-DNP asimétricas en un 9% y en un 18% la producción total de moléculas de an ti­ cuerpo. Los resultados expuestos, provenientes de experiencias in vivo e in vitro, indican que la placenta y los linfocitos de hembras preñadas secretan factores que increm entan la p ro p o r­ ción de moléculas IgG asimétricas, las que, d a­ do su co m portam iento b io ló g ico p a rtic u la r (bloqueante), si expresan actividad anti-antígenos paternos participarían activamente en los mecanismos de protección del feto durante la preñez. Por otra parte, se podría presum ir que la progesterona, al actuar sobre los PRs citosólicos presentes en las células linfoideas, pondría en marcha un mecanismo modulador de la sín ­ tesis de moléculas simétricas y asimétricas in ­ ducida por los linfocitos de las hembras p reñ a­ das. BIBLIOGRAFÍA A n d e rs o n D .J., Jo h o n so n P .M ., A le x a n d e r N .J., J o n e s W .R ., G riffin P.D . “ M o n o clo n a l an tib o d ie s to h u m a n tro p h o b last and sperm a antigens: re p o rt o f tw o W^HOsponsored w orkshop” . J. R eprod. Im m unol., 10:231-257, 1986 Billington W .D . “Species D iversity in the Iram unogenetic R elationship betw een M o th er and F etus: Is T ro p h o b last Insusceptibility to Im m unological D estruction tlie O n iy E ssential C oom on F eature for the M aintenance o f A llo geneic P reg n an cy ? Exp. C lin. Im m unogenet. 10 :7 3 -8 4 , 1993

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Inmunopatología

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METODOLOGÍAS

IV

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos y anticuerpos

RICARDO MARGNI

PRECIPITACIÓN CUALITATIVA Precipitación en medios líquidos Puede hacerse mezclando volúmenes igua­ les de las soluciones de antígeno y anticuerpo. La aparición de turbidez indica reacción posi­ tiva. No obstante, el método más utilizado es el del anillo, basado en la reacción interfásica que se produce cuando en un pequeño tubo se colo­ can sucesivamente, y evitando que se mezclen, las soluciones de antígenos y anticuerpos que se corresponden. Es conveniente, para evitar redisoluciones, que los reactivos se encuentren en concentraciones equivalentes.

de tubos 0,2 mi del suero precipitante, añadien­ do luego por las paredes 0,2 mi del material a investigar en diluciones 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10. Dejar en baño de agua a 37“C durante una hora y observar si en alguno de ellos aparece un p re ­ cipitado anular blanco. 2. Cuando se desea identificar un antígeno: colocar en una serie de tubos 0,2 mi de los d is­ tintos sueros precipitantes, añadiendo luego por las paredes 0,2 mi del material sospechoso. In ­ cubar a 37°C durante una hora e investigar la aparición de anillo blanco en alguno de ellos. El tubo que dé reacción positiva indicará co ­ rrespondencia entre el antígeno y el respectivo anticuerpo. En todos los casos es indispensable colocar tubos testigos con solución salina y cada uno de los reactivos (fig. 9-1).

M aterial necesario a) Sueros precipitantes, clarificados por cen­ trifugación. b) Antígenos: si están en solución, se em ­ plean como tales. Si fueran productos insolu­ bles sospechosos de contener antígenos solu­ bles, se los trata con solución salina fosfatada para solubilizar. Centrifugar para clarificar. c) Solución salina fosfatada: solución de clo­ ruro de sodio 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2. d) Tubos de 5 X 0,3 cm. e) Pipetas Pasteur. f) Gradillas; baño termostatizado; centrífuga.

Precipitación en medios gelosados IN M U N O D IF U S IÓ N

1. din)'

Precipitación en tubos (método de Ou-

Material necesario

a) Agar purificado para uso inmunológico al 1% en solución de cloruro de sodio 0,15 M y 0,01% de Merthiolate. b) Agar al 0,5% en el mismo 'diluyente. c) Antígenos a estudiar. d) Sueros precipitantes o anticuerpos p u rifi­ Método cados correspondientes. 1. Cuando se desea saber si un antígeno d e­ e) Pipetas de 1 mi. terminado está presente: colocar en una serie f) Tubos de 5 X 0,5 cm.

698

Metodologías

Método En pequeños tubos de hem ólisis m ezclar partes iguales de agar al 1% fundido y enfriado a 50°C y suero precipitante. Transferir 1 mi de la mezcla al tubo de reacción, enfriando rápida­ m ente para que solidifique. Inm ediatam ente después añadir 0,5 mi de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50"C, y luego de la solidificación agregarle 1 mi de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno. Después de la solidificación, los tubos, con­ venientemente tapados para evitar evaporacio­ nes, son dejados a temperatura ambiente 24-48 horas para la lectura de los resultados (figs. 9-8 y 9-9). 2. Precipitación en placas (Método de Ouehterlony)^ Material necesario a) Agar purificado al 1,5%, en solución de cloruro de sodio 0,15 M y 0,01% de M erthiola­ te o agarosa al 0,8%. b) Sueros precipitantes. c) Soluciones de antígenos a estudiar. d) Placas de Petri o portaobjetos. e) Pipetas de 1 mi y 10 mi. f) Pipetas Pasteur. g) Sacabocados o matrices especiales para la confección de los orificios sobre el gel de agar. Método En caja de Petri estéril se vierten 15 mi de agar fundido y enfriado a 50°C. Se deja solidi­ ficar y se confeccionan los orificios de 5 mm de diámetro, que deben distar 1 cm entre sí. Si se usaran portaobjetos, se añade a cada uno 2,5 mi de agar, y la distancia entre los orificios, de 2,5 mm de diámetro, debe ser de 5 mm. Según los sistemas que se desee anahzar así será la distribución de los antígenos y antisue­ ros en los orificios de las placas de agar con­ feccionadas (figs. 9-10, 9-11 y 9-12). Las lecturas de los resultados se efectúan a las 24-72 horas; las placas o portaobjetos se mantienen en cámaras húmedas. Si interesa conservar los resultados, puede colo reárselo s previa d esecació n , según las instrucciones indicadas en inmunoelectrofore­ sis. Para obtener buenas reacciones de precipita­ ción eo geles, tanto en tubos como en placas, los reactivos deben ser utilizados en diluciones óptimas para evitar la solubilización de los pre­ cipitados por exceso de reactivos, en especial de antígeno.

In

m u n o e l e c t r o f o r e s is

^''*

M aterial necesario a) Agar purificado para inmunoelectrofore­ sis. Existen en el comercio agares elaborados que reúnen las condiciones de pureza necesa­ rias para su uso (Agar Difeo, Ion Agar, Agar Noble, etc.). En caso contrario, el agar debe ser sometido a lavado y precipitaciones alcohólicas para eliminarle todas aquellas sustancias que pudieran interferir en la reacción. Con el agar se prepara una solución acuosa al 2,5%, que en el momento del uso, previa fu­ sión, se mezcla con partes iguales del buffer usado para la eleetroforesis. Puede usarse agarosa a la concentración fi­ nal del 0,8%. En este gel los fenómenos electroendosmóticos están minimizados, hecho que debe tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. b) Buffer para eleetroforesis: se prepara disol­ viendo 11 g de Veronal sódico en 900 mi de agua destilada. Se añade luego HClN hasta pH 8,4 (aproximadamente 16 mi), y se completa con agua hasta un litro. Su fuerza iónica es 0,05. c) Portaobjetos desengrasados. Para evitar cjue el agar o la agarosa se desprenda de los portaobjetos, conviene pretratarlos cubriéndo­ los con una pequeña película de agar al I % en NaCl 0,15 M o agarosa al 0,5% en el mismo diluyente. Los portaobjetos desengrasados cu­ biertos con una delgada capa de gel, bien ex­ tendida sobre la superficie con un hisopo, son secados en estufa a 50°C. Una vez secos se los envuelve en papel de aluminio y se los conser­ va en heladera hasta el momento de ser usados. Los geles preparados sobre estos portaobjetos quedan adheridos y no se desprenden. d) Matrices para confeccionar los orificios de siembra y las canaletas de precipitación. e) Pipetas Pasteur. f) Pipetas graduadas en lam bdas para las siembras de las muestras. g) Cubas para las corridas electroforéticas. h) Fuente de poder estabilizada capaz de su­ ministrar una tensión de 0-400 voltios y 0-50 miliamperios. i) Solución salina para lavado: cloruro de so­ dio 0,15 M. j) Soluciones colorantes: existen varias, sien­ do recomendables las siguientes proteínas: I) Fucsina á c id a .............................. Alcohol 96°.................................. Agua destilada............................ Ácido acético............................... II) Negro am ido................................ Acido acético................................ Agua destilada..............................

0,5 g 250 200 50 100 20 980

mi mi mi mg mi mi

Métodos utilizados para ia identificación y cuantificación de antígenos Para coloraciones de glucoproteínás, Upoproteínas o sustancias con actividad específica, pueden emplearse otros métodos de tinción. k) Decolorantes: se utiliza ácido acético al 25% en metano) al 50%. Método Se preparan las placas y se añaden 2,5 mi de la m ezcla agar-buffer por cada portaobjeto. Mediante la aplicación de las matrices corres­ pondientes se confeccionan los esquemas ade­ cuados. Se colocan las placas en los soportes y con pequeños trozos de papel de filtro embebi­ dos en buffer se efectúan los puentes que unen las placas con las cubas. Se colocan las m ues­ tras a analizar en los orificios de siembra y, he­ chas las conexiones, se pone en funcionamien­ to la fuente de poder, aplicando una corriente de aproximadamente 6 v/cm. Con 75 minutos de corrida se consigue una buena separación electroforética. Luego de esto, se separan las placas, se eli­ mina el agar de las canaletas en las que se colo­ ca el inmunosuero y se las deja en cámara hú­ meda por 24-48 horas para que la precipitación entre los antígenos y anticuerpos se produzca. Para conservar los resultados las placas pue­ den ser directamente fotografiadas o secadas y coloreadas para su conservación. En este caso, estas placas deben ser previamente lavadas por inmersión en solución salina, donde se las deja 24-48 horas, con recambios cada 12 horas. El lavado es necesario para eliminar la proteína no precipitada. Luego de lavadas, se cubren las placas con un trozo de papel de filtro húmedo y se dejan a tem peratura ambiente hasta seque­ dad. Se retira el papel y se las sumerge en la solución colorante (15 minutos para la I y una hora para la II). El exceso de colorante se eli­ mina por inmersión en la solución decolorante y se procede luego al secado, que puede acele­ rarse colocándolas en una estufa a 50“C (figs. 9-15, 9-16 y $-17). CUANTITATIVA Valoración de anticuerjpospor curva de precipitación

Cua n d o

e l a n tíg e n o n o c o n tie n e n itró g e n o

(P O L I Ó S I D O S M I C R O B IA N O S )^

d) Suero a valorar clarificado por centrifuga­ ción, adicionado a EDTA 7 mg • m i '. e) Solución del poüósido específico (500 |j,g • m i '), clarificada por centrifugación. f) Solución de hidróxido de sodio 0,1 N. g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga, refrigeradora. h) Espectrofotómetro, M étodo La valoración se efectúa en tubos de hem óli­ sis de acuerdo con el siguiente esquema:

T ubo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Suero Antígeno añadido precipi- ~ tante (mi) (mi) (Mg)

0,5 0,5 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50

S o lu ció n sa lina (m i)

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05

-

In c u b a r ' e n b a ñ o d e a g u a a 37“C d u r a n te 1 hora, y 24 horas a 4 “C en refrigeradora. Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar los precipitados tres veces con solución salina tamponada. Finalmente, escurrir los tubos por inversión sobre papel de filtro, disolviendo los precipitados en 2 mi de NaOH 0,1 N. Leer al espectrofotóm etro a 280 nm. Las DO leídas, multiplicadas por 2 (dilución) y por el factor correspondiente a la inmunoglobulina de la es­ pecie animal que se analiza (10/E '*,^,^), dan los valores del contenido proteico (anticuerpo) de cada tubo. Con ellos se confecciona la curva de precipitación y se grafican mg de anticuerpo en el precipitado (0,5 mi de suero) versus |J,g de antígeno añadido, lo que permite determinar el título de los anticuerpos. La figura 9-3 y el cua­ dro 9-1 corresponden a una valoración de anti­ cuerpos antipoliósido neumocócico tipo III. Los factores de conversión de inmunoglobu­ linas de diferentes especies anim ales se en­ cuentran en el Apéndice III. C

u a n d o e l a n t íg e n o e s u n a e r o t e ín a

C O M P L E J A (O V O A L B Ú M IN A , S E R O A L B Ú M IN A B O V IN A , E T C ./ ’

M aterial necesario a) Tubos de hemólisis. b) Pipetas de I mi, 2 mi y 5 mi. c) Solución salina tamponada (cloruro de so­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).

699

M aterial necesario a) Tubos de hemólisis. b) Tubos de 5 X 0,3 cm c) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi.

700

' Metodologías

d) Pipetas Pasteur. e) Solución salina tamponada (cloruro de so­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2). f) Suero a valorar clarificado por centrifuga­ ción, adicionado a EDTA 7 mg • m h ’. g) Solución del antígeno específico (500 |j,g-ml-l) clarificado por centrifugación. h) Solución de hidróxido de sodio 0 ,1 N. i) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga, refrigeradora. j) Espectrofotómetro. Método Se efectúa en tubos de hemólisis utilizando el esquem a indicado en el m étodo anterior. Terminada la incubación de 24 horas a 4°C, los tubos se centrifugan y se separan los sobrena­ dantes de los precipitados. Con los precipitados se procede del mismo modo indicado anterior­ mente, y se determina el contenido proteico de cada tubo (anticuerpo y antígeno). Con cada sobrenadante se efectúan precipitaciones zona­ les por el método del anillo descrito, frente a antígeno y anticuerpo, a efectos de establecer la zona de equivalencia (tubo en el que la pre­ cipitación sea negativa para ambos). Estableci­ do ello, al contenido proteico total del tubo, de­ terminado por espectrofotometría, se le resta la proteína antigénica añadida ya conocida, y di­ cha diferencia corresponderá a la proteína anti­ cuerpo contenida en 0,5 ml de suero. Para la conversión de la DO en mg de proteí­ na se utilizan los factores correspondientes a las respectivas inm unoglobulinas, dado que siendo las relaciones Ac/Ag aproximadamente 10 a 1, la proteína antigénica influye muy poco en los resultados (cuadro 9-3). C u a n d o e l a n t íg e n o e s u n a p r o t e ín a M ARCADA CON UN HAPTENO CUYA MÁXIMA ABSORCIÓN BSPBCTROFOTOMÉTRICA SE PRODUCE A UNA LONGITUD DE ONDA DISTINTA DE 280 NM (PROTEÍNAS MARCADAS CON DINITROFENOL, ÁCIDO SULFANÍLICO, ETC.)’

Para la descrición del método se tomará co­ mo ejemplo un suero de conejo obtenido por inmunización con gammaglobulina humana dinitrofenolada (HGG-DNP) y como antígeno, albúm ina bo v in a m arcada con d in itro fen o l (BSA-DNP), ya que interesa valorar anticuer­ pos antidinitrofenol (a-DNP). Material necesario a) Tubos de hemólisis. b) Pipetas de 1 ml, 2 m l y 5 ml. c) Solución salina tamponada (cloruro de so­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).

d) Suero a valorar clarificado por centrifuga­ ción, al que se le añaden 7 mg • m h ‘ de EDTA para evitar la coprecipitación del complemento. e) Solución de BSA-DNP (500 |ig • m h ‘)D ebe contener no menos de 30 grupos DNP por mol de BSA. Para su preparación, véase el capítulo 44. Considerando que el antígeno incorpora pro­ teína al precipitado, para calcular la proteína anticuerpo es necesario determinar el factor de corrección del antígeno a usar. Para ello se pre­ paran cuatro diluciones del mismo en solución salina tamponada, que contengan 100, 200, 300 y 400 |Tg • m l l a s que se mezclan con un vo­ lumen igual de NaOH 0,1 N. Se deja 15 minu­ tos en reposo para estabilizar y se lee al espec­ trofotómetro a 280 nm y 360 nm. Los resulta­ dos obtenidos se grafican y con ellos se deter­ mina el factor de corrección. La figura 35-1 co­ rresponde a una determinación experimental. f) Solución de hidróxido de sodio 0,1 N. g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga, refrigeradora. h) Espectrofotómetro. Método La valoración se efectúa en tubos de hemóli­ sis siguiendo el mismo esquema indicado para antígenos proteicos complejos (ovoalbúmina, seroalbúmina bovina, etc.). Los precipitados, una vez disueltos en 2 ml de NaOH 0,1 N, son leídos en el espectrofotóm etro determ inando las DO a 280 nm y 360 nm. A las DO medidas a 280 nm se les sustrae el valor que resulta de multiplicar la DO a 360 nm por el factor de coiTección (proteína del antígeno). La DO a 280 nm resultante, m ultiplicada por el factor de conversión correspondiente (A péndice III), perm itirá conocer los miligramos de proteína anticuerpo en el precipitado de cada tubo. Con ellos se confecciona la curva de precipitación y se determina la concentración de anticuerpo sé­ rico (fig. 9-4 y cuadro 9-2). Con las lecturas de DO a 360 nm se calcula el antígeno presente en cada tubo, lo que a su vez permite establecer las relaciones Ac/Ag. Éstas sirven de control ya que en la zona de equivalencia (m áxim a, precipitación del anticuerpo) dicha relación es aproximadamente 10. Valoración de anticuerpos por floculación® Este método se utiliza cuando el antisuero a valorar es de origen equino (suero antidiftérico, suero antitetánico, etc.). Como ya se ha indica­ do, en estos casos el precipitado que se deposi­ ta en forma de flóculos es soluble en exceso de anticuerpo y de antígeno, y la zona de precipi­ tación es más estrecha (fig. 9-7).

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

701

Se tomará como ejemplo la valoración de un suero antidiftérico (método de Ramón). M aterial necesario a) Tubos de hemólisis. b) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi. c) T oxoide diftérico. Se utiliza un toxoide estabilizad o valorado en L f (véase cap. 4). Conviene diluirlo a 100 L f • mL'. d) Suero antidiftérico a valorar clarificado por centrifugación. Si no se tiene idea aproxi­ mada del título, conviene hacer la valoración por duplicado, usando en una serie suero sin di­ luir y en la otra suero 1:5. e) Solución salina tamponada (cloruro de so­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2). f) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga. Método En una serie de tubos colocar cantidades fi­ jas de toxoide y cantidades crecientes de anti­ suero. Completar al mismo volumen con solu­ ción salina tamponada, mezclar para homoge­ neizar e incubar en baño de agua a 45“C hasta floculación del primer tubo. Calcular el título de suero analizado (cuadro 35-1). Éste contendrá 100 L f de antitoxina, ya que la floculación ocurre en aquel tubo en que antí­ geno y anticuerpo se encuentran en la zona de equivalencia. Si el tubo en que aparece la flo­ culación inicial hubiese sido el N° 4, el título del suero sería 100/0,4 = 250 L f • mL’. Valoración de antígenos por inmunodifusión radial® M aterial necesario a) Agar purificado para uso en inmunodifu­ sión. Con él se prepara una solución al 2% en buffer de Veronal sódico pH 8,4 (el indicado en inmunoelectroforesis, adicionado con 0,01% de Merthiolate). b) Antisueros específicos. c) Antígenos patrones. d) Placas de vidrio de 3 x 10 cm o similares. En casos especiales pueden usarse portaobjetos. e) Pipetas de 2 ¡il, 1 mi y 5 mi. f) Sacabocados de 2 mm de diámetro o ma-

|ig DNP - BSA/ml Fig. 35-1.

G ráfica que perm ite d eterm inar con cu án ta p ro ­ teína contribuye el antígeno en los precipitados A g-A c. C o ­ rresponde a albúm ina bovina dinitrofenolada (D N P-B SA ).

trices especiales para la confección de los o rifi­ cios sobre las placas de agar. Método A ñadir 5-10% del antisuero específico al agar fundido y enfriado a 50°C, procurando que la m ezcla sea lo más hom ogénea posible (la cantidad de antisuero a usar depende del conte­ nido en anticuerpos del que conste). Inm ediata­ mente cubrir la placa con una cantidad d e la m ezcla capaz de producir una capa de gel de 1 mm de espesor y dejar en reposo hasta solidi­ ficación. Mediante el empleo del sacabocados efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que deben estar situados a distancias co n v e ­ nientes para evitar interferencias. Se necesita un orificio para la muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para las distintas concentracio­ nes del antígeno patrón, las que habrán de u tili­ zarse para la elaboración de la curva. En un orificio de la placa se colocan 2 ^ I de la solución antigénica a valorar, o dilución co n ­ veniente. En los orificios restantes son coloca­ dos 2 |i! de las diluciones del antígeno patrón (idéntico al que se valora). Las placas se m an ­ tienen a temperatura ambiente, en cámaras h ú ­ medas, hasta que el halo de precipitación no aumente. La evaluación de los resultados se hace m e­ diante la determinación del diámetro de los h a ­

Cuadro 35-1 Tubos

1

2

3

4

5

6

7

S

9

Suero antidiftérico Toxoide diftérico (100 L f • m i-') Solución salina

0,1 1

0,2 1 0,8

0,3

0,5

0,5

0,8 1 0,2

0,9

0,9

1

1

0,6 1

0,7

1 0,7

0,5

0,5

0,4

0,3

1

Incubar a 45° h asta floculación de! p rim er tubo ' Los v o lú m en es in d icad o s c o rresp o n d e n a m i.

1 0,1

JO

1 1 _

702

Metodologías

los de precipitación. Puede efectuarse sobre el material fresco o previa desecación y lavado de manera similar a la indicada para inmunoelec­ troforesis. L a m edida directa de los diám etros de los halos de precipitación es un método poco sen­ sible. Resulta más conveniente utilizar una am­ pliadora fotográfica. Colocando las placas en la ranura donde se ubican los negativos, es posi­ ble ampliar los halos convenientemente y me­ dirlos sobre papel milimetrado. Con los valores obtenidos se calculan los r^. Graficando los valores de r^ versus las res­ pectivas concentraciones del antígeno patrón, se obtiene la curva que permitirá calcular la con­ centración antigénica de la muestra analizada. Si se hubiese valorado una solución de albú­ mina bovina, y con un dilución de la solución de 1:100 se hubiese obtenido un r^ de 10 mm^, tomando como valores los de la curva patrón de la figura 9-13 la concentración de albúmina bovina sería 0,6 x 100 = 60 mg • m L‘.

g) Baño termostatizado, gradillas, centrífu­ ga, refrigeradora. h) Espectrofotómetro. Método

Utilizando el método indicado en Valoración de anticuerpos por curva de precipitación, de­ terminar cuál es la dosis de antígeno que pro­ duce la máxima precipitación (zona de equiva­ lencia), usando para ello volúmenes fijos de 0,5 mi de suero de conejo antidinitrofenol y canti­ dades crecientes de seroalbúmina bovina dini­ trofenoiada. Conocido ello, en una serie de tubos colocar; 0,5 mi de suero antidinitrofenol y cantidades crecientes de hapteno (0,05 a 0,35 mi), comple­ tando todos los tubos a 0,85 mi con solución salina tamponada. Incubar 1 hora a 37“C en ba­ ño de agua. Añadir luego a cada tubo la canti­ dad de antígeno correspondiente a la zona de equivalencia e incubar 1 hora a 37"C y 24 horas a 4°C (cuadro 35-2). Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar Inhibición de precipitación por haptenos " los precipitados tres veces con solución salina Teniendo en cuenta que la reversibilidad de tamponada. Añadir a cada tubo 2 mi de NaOH la reacción entre el hapteno y el anticuerpo es 0,1 N y después de 15 minutos leer las DO a más manifiesta, aproximadamente cinco veces 280 nm. Considerando como 100% de precipi­ superior, que la correspondiente entre anticuer­ tación (0% de inhibición la lectura del tubo po y antígeno, constituye éste un dato importan­ N°8), calcular sobre la base de las lecturas ob­ te que no debe olvidarse cuando se hacen cálcu­ tenidas en los otros tubos los correspondientes porcentajes de inhibición. los teóricos previos para estos tipos de ensayos. Se tomará como ejemplo suero de conejo anAl realizar el gráfico del “porcentaje de inhi­ tidinitrofenol, obtenido por inm unización con bición” versus “|i,g de hapteno añadido”, puede gammaglobulina humana dinitrofenoiada. elaborarse la correspondiente curva (fig. 9-6), Conviene incluir como testigos un tubo con un sistema Ag-Ac distinto del reactivo (en este M aterial necesario caso ovoalbúmina-antiovoalbúmina) y otro con a) Anticuerpo: suero de conejo antidinitro- el mismo sistema y el hapteno en estudio para fenol conteniendo aproximadamente 3 a 4 mg ■ descartar el poder inhibitorio inespecífico que m i ' de anticuerpo. éste pudiera tener. b) Antígeno: seroalbúmina bovina dinitrofe­ E lectroforesis, inmunoelectroforesi noiada al 0 ,1% en solución salina tamponada. c) Hapteno específico: solución de dinitro­ se inm unodifusión rad ial cuan titativ a en acetato de celulosa** fenol 0,001 M en solución salina tamponada. d) Solución salina tam ponada; cloruro de E l e c t r o f o t r e s is sodio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2. e) Tubos de hemólisis. El acetato de celulosa como soporte de corri­ f) Pipetas de 1 mi y 10 mi. da tiene mayor poder resolutivo que el papel. Cuadro 35-2 Tubos A ntisuero H apteno (0,001 M) S olución salina A ntígeno (dosis óptim a)

I

2

0,5 0,05 0,30 0,5

5

4

0,10

0,5 0,15

0,20

0,25

0,20

0,5

'

0,5

5

6

0,5 0,5 0,5 0,25 0,30 0,15 0,10 0,05 Incubar a 37“C durante una hor a 0,5 0,5 0,5 0,5 Incubar 1 hora a 37'C y 18 horas a 4"C

" L o s v o lú m en es in dicados co rresp o n d e n a m i.

7 0,5 0,35 .

8 0,5 -

_

0,35

0,5

0,5

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

703

g) Líquido de elución: ácido acético al 80% en agua destilada (v/v). h) Cubeta para eleetroforesis: con puente so­ porte de 11 cm y 8,5 cm. Resulta muy iitil el modelo 2 PAC/5 (Chemetron). i) Fuente de poder estabilizada capaz de su­ ministrar 0-400 voltios y 0-50 mA. j) Dispositivo para las siembras.

locada en la cuba. En estas condiciones el tiem ­ po de corrida óptimo es de 55 minutos. e) Después del fraccionamiento proteico, su­ mergir las tiras en la solución colorante durante 5 m inutos, y decolorar luego con la solución decolorante. Normalmente, con tres recambios se consigue una buena decoloración de las p ar­ tes libres de proteínas. f) Si se desea hacer cuantificación, puede lo­ grarse por densitometría o elución. En este íiltimo caso cortar las fracciones proteicas, co lo ­ carlas en tubos de ensayo y disolverlas en un volumen fijo de ácido acético a f 80%. Leer en el esp ectro fo tó m etro a 620 nm . Usar co m o blanco un trozo de la tira de acetato de celulosa procesada, que no contenga proteínas, disuelta en ácido acético al 80%. Los cálculos de los porcentajes de las distin­ tas fracciones proteicas de la muestra se hacen relacionando directamente las DO (620 nm). Si se conoce la concentración proteica de la m ues­ tra analizada, los porcentajes hallados pueden transformarse en valores absolutos. La cuantificación de las fracciones puede ha­ cerse también mediante el empleo de un densitómetro adecuado. g) Si las corridas electroforéticas efectuadas son para estudios cualitativos, conviene transparentizar el material. Para ello, las tiras decolora­ das segiín se indicó en e) son deshidratadas por inmersión en metanol durante 30 segundos, de inmediato se las coloca en la solución de trans­ parencia durante 60 segundos, agitando m anual­ mente. Retirarlas y colocarlas sobre una placa de vidrio limpia; eliminar el exceso de líquido de transparencia. Llevar a estufa a 60“C o poner la placa de vidrio bajo una lámpara de rayos in­ frarrojos hasta completar la transparentización. Dejar a temperatura ambiente hasta la pérdida completa de la humedad (figs. 9-17 y 35-2).

Método

1 N M U N O E I.E C T R O F O R E S L S

Puede usárselo también con muy buenos resul­ tados para inmunoelectroforesis. El acetato de celulosa gelatinizado (“C ellogel” de Chemetron, Milán) es recomendable. M aterial necesario a) Tiras de acetato de celulosa (Cellogel 2,5 X 17 cm). b) Buffer Veronal-Veronal sódico: Veronal sódico Veronal Agua destilada hasta Ajustar a pH 8,6

10,30 g 1,34 g 1.000 mi

c) Solución colorante: Amidoschwartz 10 B Metanol Agua destilada Acido acético glacial

0,5 35 45 10

mg mi mi mi

d) Solución decolorante: ácido acético al 5% en agua. e) Baño deshidratante: metanol puro. f) Baño de transparencia: Metanol Acido acético Glicerina

87 mi 12 mi I mi

a) Las tiras de acetato de celulosa, que se conservan sumergidas en metanol al 40%, de­ ben ser lavadas previamente con solución buf­ fer para eliminar todo vestigio de alcohol que pudiera desnaturalizar las proteínas. b) Sacar las tiras del buffer y secarlas entre dos hojas de papel de filtro. Extenderlas sobre el soporte (puente de 11 cm), con la superficie absorbente hacia arriba. c) Utilizando un sembrador adecuado, depo­ sitar a 2,5 cm del extremo catódico 3,5 |ll de la muestra a analizar. La concentración proteica debe ser ajustada a 50-70 mg • mL‘ si se trata de una mezcla de sustancias. Para productos puros, 10-30 mg ■mL*. d) Fíacer pasar una corriente de 200 V fijos y 2,5 mA por cada tira de acetato de celulosa co-

M aterial necesario a) Micropipetas de 2,5 y 25 [J,!. b) Solución salina: cloruro de sodio 0,15 M. c) Plantilla guía para depósito de las m u es­ tras a analizar y los antisueros. d) Antisueros específicos. e) El resto de material necesario es el indica­ do en eleetroforesis en acetato de celulosa. Método C olocar las tiras lavadas con buffer en el puente soporte de 8,5 cm. De acuerdo con los esquemas indicados en la figura 35-3, sem brar 2,5 |ll de muestra a analizar. Efectuar el íxaccionamiento proteico en las condiciones indica-

704

Metodologías que la línea de depósito sea lo más fina posible y guarde las relaciones de distancia indicadas. Colocado el antisuero se cortan los extremos de las tiras de acetato de celulosa (para evitar que contacten con el líquido de la cámara de difusión) y se las deja en su interior para que actiíe como cámara hiimeda. El tiempo de difu­ sión no debe ser superior a 18-24 horas. Finahzado éste, retirar las tiras de la cámara htimeda y lavarlas con solución salina durante dos ho­ ras, agitando, con el objeto de eliminar el exce­ so de antisuero y proteínas que no han precipi­ tado. Durante esta operación conviene recam­ biar 3-4 veces la solución de lavado. Colorear y transparentizar como se indicó en electroforesis (fig. 9-17). C u a n t if ic a c ió n d e p r o t e ín a s POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL EN ACETATO DE CELULOSA

El principio del método es el descrito para inmunodifusión radial en agar. F ig . 3S-2. Electroforesis en acetato de celulosa de tres sue­ ro s de pacientes con m ielom a. Las inm unoglobulinas son IgG m onoclonales con diferente carga neta, de ahí su dis­ tinta m ovilidad electroforética.

das anteriormente (200 V, 2,5 mA por tira, 55 minutos de corrida). Finalizado ei fraccionamiento, dejar las tiras sobre el puente soporte y, empleando la planti­ lla guía o una reglilla, depositar con una pipeta de 25 |0,1 el antisuero específico. La cantidad depende del título de anticuerpos del antisuero. Generalmente son necesarios 50 ¡jl (2 pipetas); para ello colocar 25 |xl y, cuando se hayan ab­ sorbido, colocar los otros 25 jal. Es importante

M aterial y método a) Tiras de acetato de celulosa; resultan muy titiles para estas determinaciones las de Cellogel, 5,7 X 14 cm. Previo a su uso deben ser la­ vadas con buffer de veronal sódico (veronal só­ dico 8,24 g, agua destilada hasta 1.000 ml; pH 9,2). Se las seca entre dos hojas de papel de filtro y se las coloca en un bastidor con la superficie absorbente hacia arriba. Existen en el comercio cámaras de inm unodifusión con tensores que permiten fijar los extremos de las tiras. b) Plantilla de siembra, con perforaciones de igual diámetro, para el depósito de las muestras a valorar.

2 mm

\ (-)

50 ni antisuero

c O 2.5 ni Ag -f 2mm 3 mm C

50 |xl antisuero

5mm ] ^ 2 ,5 hI Ag 25 M -l antisuero

(+)

........................ 1

F ig . 35-3. El esquem a A se utiliza cuando se desea com parar dos antígenos. El esquem a B, para com parar antisueros.

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos c) El inmunosuero precipitante debe ser uti­ lizado a dilución conveniente para conseguir la máxima precipitación. Con 200 |il se cubre la superficie de la tira, distribuyéndolos unifor­ memente. Los esparcidores volumétricos DC/6 (Chemetron) facilitan esta tarea. Tapar la cámara de difusión y dejar 24 horas para conseguir una buena estabilización de la tira. Para evitar que se seque conviene sellar la cámara con cinta Durex. d) Transcurrido el tiempo indicado, sacar la tapa de la cámara de inmunodifusión y dejarla descubierta durante 2-3 minutos para que la tira pierda una parte del líquido de saturación y se absorban con facilidad las muestras a valorar, que se depositarán sobre su superficie. Para ello sacar la cubierta, y a través de los agujeros de la plantilla de siem bra depositar, con una micropipeta o microjeringa, 1 )il de cada una de las diluciones de la proteína patrón y de las muestras a valorar. e) Retirar las tiras de la cámara de inmunodi­ fusión y colocarlas individualmente entre dos vidrios de 10 x 20 cm; cerrar los bordes con cinta Durex. Colocar en cámara húmeda bien nivelada y dejar 48 horas. f) Retirar las tiras, lavarlas con solución sali­ na durante una hora, agitando constantemente. Recambiar el líquido de lavado cuatro a cinco veces durante ese período. Colorear durante 3 minutos con solución de Amidoschwartz al 0,5% en metanol-agua-ácido acético y decolorar como se indicó en electro­ foresis. g) La lectura de los resultados, la prepara­ ción de la curva de calibración y los cálculos se efectúan de igual manera que la indicada en in­ munodifusión radial en agar. E l e c t r o in m u n o d jf u s ió n (“R O C K E T ” E L E C T R O F O R E S IS )‘^



Es un método muy usado para el dosaje de algunas proteínas séricas; sus fundamentos han sido ya descritos en el capítulo 9. Puede ser desarrollada sobre placas de gel de agarosa conteniendo el correspondiente an ti­ suero o en tiras de acetato de celulosa, prefe­ rentemente Cellogel, impregnadas con el inm u­ nosuero. Se describirá la metodología que utili­ za este último soporte. M ateriales necesarios a) Tiras de Cellogel de 5,7 x 14 cm. b) Equipo com pleto para electroforesis en acetato de celulosa. c) Micropipetas de 1 |il. d) Distribuidor volumétrico DC/6. e) Antisueros monoespecíficos.

705

f) Soluciones patrones de antígenos. g) Solución buffer de veronal sódico 0,04 M, pH 9,2 (8,24 g • htro->). h) Solución de lavado: NaCl 0,15 M. i) Solución colorante: azul brillante de Coomasie al 2,5% en metanol-ácido acético-agua (5:1:5). j) Solución decolorante; metanol-ácido acético-agua (5:1:5). Método Sumergir las tiras de acetato de celulosa en la solución buffer por 10 minutos, retirarlas, es­ currirlas sobre dos hojas de papel de filtro y ex ­ tenderlas sobre el puente de 8,5 cm de la cám a­ ra electroforética. Dejar 2-3 minutos para que las tiras se vuelvan más absorbentes. A continuación, empleando micropipetas de 1 ¡il, se siembran las diferentes concentraciones de antígeno patrón y las muestras de suero d es­ conocidas en las que ese antígeno se quiere v a ­ lorar. Las muestras se siembran a 1 cm de d is­ tancia del cátodo y separadas entre sí por 0,8 cm. Para visualizar mejor la zona de la siembra es recomendable colorear las muestras con azul de bromofenol. Inm ediatam ente después, esparcir, con el distribuidor volum étrico, el antisuero co n v e­ nientemente diluido en buffer (3 |il/cm^ de su­ perficie), hasta conseguir una buena d istribu­ ción y absorción del antísuero. La cantidad total de antisuero a usar, así c o ­ mo su dilución, dependen del título de a n ti­ cuerpos. Generalmente se usan 150 |il de d ilu ­ ción 1:2. A continuación se hace pasar la corriente eléctrica, que será de 120 volts durante 75-90 minutos cuando se valora albúmina, y durante tiempos mayores (120-180 minutos) para las fracciones con movilidad beta. Finalizada la corrida, las tiras se lavan con solución de NaCl 0,15 M durante 30 minutos, agitando perm anentem ente, con el objeto de eliminar las proteínas no precipitadas. Se introducen las tiras en solución colorante por 5-10 minutos y luego se decoloran hasta la perfecta visualización de los picos de precipita­ ción (fig. 9-19). La medida de la altura de los picos se e fe c ­ túa con un vernier o una regla de buena c a li­ dad, considerando como punto base el centro de la siembra. Con los valores obtenidos con las diferentes concentraciones del antígeno p a ­ trón (los picos máximos no deben ser inferio­ res a 4 cm de alto) se construye una gráfica, la cual perm ite calcular por interpolación, tal c o ­ mo se describiera en inmunodifusión radial, la concentración antigénica de la muestra an ali­ zada.

706

Metodologías

INMUNOFUACIÓN'*

I"

Los fundam entos del m étodo ya han sido descritos en el capítulo 9. M aterial necesario a) Tiras de acetato de celulosa, preferente­ mente desecado no gelatinizado, de 150 X 78 mm, porque requiere menor cantidad de inmu­ nosuero para el revelado y menos muestra para el análisis. b) Antisueros monoespecíficos (para el estu­ dio de inmunoglobulinas: anti-y, anti-ji, anti-a, anti-5, anti-e, anti-K y anti-?^). c) Cuba electroforética y fuente de poder. d) Nigrosina, Ponceau S, azul brillante de Coomassie R-250. Método a) La proteína a inmunofijar debe ser previa­ mente diluida en el buffer de corrida de modo que su concentración final oscile entre 5 y 20 mg%. En casos particulares en que interese ob­ tener una banda de precipitación más intensa, sobre todo cuando se analizan sueros patológi­ cos, éstos deben ser diluidos de modo que la concentración proteica del producto a investi­ gar oscile entre 50 y 100 mg%. b) E fectuar la eleetroforesis convencional sobre acetato de celulosa, haciendo siembras con un m ultiaplicador de m anera de obtener varias corridas de la misma muestra. El buffer a usar es el de Veronal 0,06 M, pH 8,6 y la corrida debe hacerse con una corriente constante de 0,4 mA/cm de ancho de la tira. c) El inm unosuero a usar debe ser diluido convenientemente en el buffer de Veronal de corrida adicionado con polietilenglicol 6.000 al 4%. La dilución debe ser tal que permita una buena precipitación del antígeno, lo que se consigue cuando Ag y Ac están en zona de equivalencia. No debe olvidarse que el exceso de Ag da lugar a la formación de complejos so­ lubles, hecho que es más manifiesto cuando los inmunosueros fueron obtenidos por inmuniza­ ción de caballos y ovejas. Estos inconvenientes están minimizados si los antisueros provienen de conejos o cabras. Los antisueros diluidos 1:10 a 1:2 de su con­ centración origina] deben ser previamente fil­ trados por m em branas porosas para retener cualquier proteína agregada que pudieran con­ tener, ya que su presencia daría lugar a un “fondo” en los preparados teñidos. d) Inmediatamente después de la electroforesis, la tira de acetato de celulosa se corta en fragmentos, de modo que cada uno de ellos co­ rresponda a una corrida. Uno de los fragmentos

es procesado para su teñido en la forma habi­ tual indicada para eleetroforesis en acetato de celulosa, con Ponceau S al 0,2% en ácido trieloroacético al 3% o con Nigrosina al 0,1%, se­ gún el caso. El resto de los fragmentos es introducido en recipientes planos especiales que contienen los diferentes inm unosueros m onoespecíficos, o apoyados sobre soportes son recubiertos con aquéllos. Después de 5 minutos, las tiras de acetato de celulosa son lavadas con el buffer de corrida, adicionado con 0,1% de Tritón X-100, y con solución salina. Inmediatamente después son coloreadas como en el caso anterior, usan­ do Ponceau S si el inmunosuero empleado fue previamente diluido 1:2, o Nigrosina si la dilu­ ción fue 1:10. Muy buenos resultados se obtie­ nen también tiñiendo eon azul brillante de Coo­ massie R-250 al 0,25% en metanol-agua-ácido acético (5:5:1 en volúmenes). Por comparación de los fragmentos de aceta­ to de celulosa correspondientes a la corrida no inm unoprecipitada y a las que reaccionaron con los inm unosueros, puede establecerse la identidad del componente sospechoso. V a l o r a c ió n s im u l t á n e a e n s u e r o d e o v e ja D E a n t i c u e r p o s U B IC A D O S EN LA S ER A C C IO N E S in m u n o g l o b u l ín ic a s I g

GI

(yl)

e

IgG2 (y2)‘°

Puede lograrse por com binación de adsor­ ción en zona de equivalencia y eleetroforesis en acetato de celulosa. M aterial necesario a) El descrito para valoración de anticuerpos totales por precipitación cuantitativa. b) El indicado en eleetroforesis en acetato de celulosa. Método 1. Valoración de proteínas totales. Se hace p o r c u a lq u ie ra de los m éto d o s c o n o c id o s (Biuret, Lowry, etc.). Puede efectuarse tam ­ bién por lec tu ra e sp ectro fo to m étrica. P ara ello, diluir el suero convenientemente (1/75 a 1/100) y leer absorción a 280 nm. M ultipli­ cando el valor de la DO leída por 0,83 se ob­ tiene la concentración proteica del suero en mg • m \-'. El valor 0,83 resulta de lO/E co ­ rrespondiente a un suero normal de oveja cu ­ yo contenido proteico fue determinado previa­ mente por Kjeldahl. 2. Valoración de anticuerpos totales. Se ob­ tiene por curva de precipitación de acuerdo con el método ya descrito. Es necesario determinar el título de anticuerpos y en especial la zona de equivalencia (concentración de antígeno que

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

707

produce la máxima precipitación). Si se trata antígeno añadido. Ello se consigue aplicando la de anticuerpos contra determinantes antigéni­ siguiente ecuación: cos definidos (DNP), se hace por lectura espec­ IgG% X proteínas totales del suero (mg ■m k ') x F trofotométrica a la longitud de onda correspon­ = mg ■m l'‘ Too d ie n te . C u an d o so n a n tíg e n o s c o m p le jo s (ovoalbúmina), se efectúa reacción zonal con en la cjue IgG = IgG l o IgG2, y E = 1 + v o lu ­ los sobrenadantes de los tubos de precipitación, men de antígeno añadido por mi de suero. frente a anticuerpo y antígeno, estableciendo en La proteína del antígeno añadido no interfie­ cuál de ellos no existe exceso de ninguno de re porque es incorporada a la concentración co ­ rrespondiente a la zona de equivalencia y en los reactivos. 3. Valoración de anticuerpos ubicados en esas condiciones es prácticamente eliminada en las fracciones globulínicas y\ y yZ. Se hace el precipitado. por electroforesis en acetato de celulosa. Es La concentración de los anticuerpos u b ica­ necesario efectuar dos determinaciones: la pri­ dos en las fracciones inmunoglobulinas Ig G l e mera correspondiente al suero inmune total, y IgG2 se calculan sustrayendo a las valoracio­ la segunda, al mismo suero previamente adsor­ nes de IgG l e lgG2 en mg • ml'^' del suero no bido con el antígeno específico en la zona de adsorbido, las obtenidas respectivamente en la equivalencia. Para ello, a 1 mi de suero añadir­ valoración del suero después de la adsorción le la cantidad de antígeno determinada en b. con el antígeno específico. Dejar en contacto durante una hora a 37“C y 24 horas a 4°C. Puede hacerse también por inAGLUTINACIÓN m unoadsorción, usando el inm unoadsorbente específico (antígeno polim erizado o unido a CUALITATIVA saphorosa). En el sobrenadante de centrifugación, ai Ensayos de identificación igual que en el suero inmune sin adsorber, va­ de microorganismos lorar proteínas totales en la forma indicada e inmunoglobulinas IgG l e lgC2 por electrofore­ M aterial necesario sis en acetato de celulosa. Para ello, una vez efectuada la corrida y antes de la coloración, a) Un cultivo en medio sólido de la bacteria cortar las tiras en los valles correspondientes a a tipificar. las fracciones IgG l e IgG2 (fig. 35-4). Cada b) Antisueros anti bacterianos de distinta es­ fracción inmunoglobulínica se disuelve en 3 mi pecificidad. de ácido acético al 80% (v/v) y el resto de la ti­ c) Placas de Petri. ra en 9 mi. Leer las DO a 620 nm. Con estos d) Mango de Kole con hilo de platino o niresultados, y después de haber hecho las co­ crón. e) Solución salina tamponada: cloruro de so­ rrecciones teniendo en cuenta los volúmenes de disolución de los fragmentos de la tira de ace­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2. tato de celulosa, pueden calcularse las concen­ f) Tubos de hemólisis. traciones por ciento de IgG l e IgG2. g) Pipetas de 0,1 mi. En el caso del suero sin adsorción, esos valo­ h) Pipetas Pasteur. res pueden transform arse en mg ■ mi ' c o ­ i) Varillas de vidrio para agitar. nociendo la concentración proteica total del suero. Método Para calcular IgG l e IgG2 en el suero adsor­ bido, es necesario hacer las correcciones por Suspender el cultivo microbiano en solución variación de volumen como consecuencia del salina tamponada, procurando que sea lo más

Fig. 35-4. E lectro fo re sis en acetato de celulosa de suero de oveja. Las lí­ neas de puntos m arcan las zonas don­ de deben efectuarse los cortes para la separación de IgG l e Ig 0 2 a efectos de su cuantificación.

igG2

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Metodologías

densa posible (no menos de 20.000 millones de bacterias por ml). En placa de Petri colocar 0,03 ml de cada uno de los antisueros y 0,03 de solución salina tamponada (testigo), de modo que estén a distancias prudenciales para evitar mezclas. Añadirles una gota (± 0,03 ml) de la suspensión bacteriana y mezclar para homogeneizar. Agitar la placa por rotación manual du­ rante 3 minutos y observar. La aparición de aglutinación indicará corres­ pondencia entre antígeno y antisuero (fig. 9-23). Ensayos de tipificación de antígenos hemáticos S is t e m a

AB/0

Método Colocar sobre la placa de reacción una gota de suero anti-D y añadirle igual volum en de sangre. Mezclar y observar si aparece aglutina­ ción. No conviene prolongar los tiem pos de lectura (máximo 3-5 minutos). 2. Prueba en tubos con sueros anti-C, anti-D, anti-E, anti-c y anti-e (para determinar el fe­ notipo y el probable genotipo)

M aterial necesario a) Placa de reacción. b) Palillos de madera para mezclar. c) Sangre total obtenida directam ente del pulpejo del dedo, sangre oxalatada, citratada o heparinizada. d) Sueros hemoclasificadores antí-A y antiB. Método Colocar en la placa de reacción una gota de suero anti-A y otra de anti-B. A ñadir a cada una de ellas un volumen de sangre total aproxi­ madam ente igual a 1/3 del correspondiente a antisueros. Mezclar y, manteniendo la placa a tem p eratu ra am biente, o b serv ar si aparece aglutinación. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: Aglutinación con G rupo sanguíneo

b) Palillos de madera para mezclar. c) Sangre total obtenida directam ente del pulpejo del dedo; sangre oxalatada, citratada o heparinizada. d) Suero anti-D para pruebas en placa.

Suero anti-A

Suero anti-B

AB

M aterial necesario a) Suspensión de hematíes al 2%; se prepa­ ran a esa concentración en su propio suero o plasma. b) Sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e para pruebas en tubo. c) Tubos de hemóhsis pequeños. d) Pipetas de 1 ml y 5 ml. e) Pipetas Pasteur. f) Baño termostatizado regulado a 37“C. g) Centrífuga. Método En una serie de cinco tubos colocar, respec­ tivamente, una gota de cada antisuero. Añadir a todos ellos una gota de la suspensión de hema­ tíes, mezclar por agitación e incubar a 37“C du­ rante 15 minutos. Centrifugar a 1.000 rpm du­ rante un minuto. Por agitación muy suave de los tubos, determinar en cuáles se ha producido aglutinación. CUANTITATIVA

S is t e m a R h

1. Prueba en placas con suero anti-D (para determinar si el individuo es Rh positivo).*'

Valoración por el método rápido de aglutinación en placas*^ M aterial necesario

M aterial necesario

a) Antígeno: suspensión microbiana de apro­ a) Placa de reacción: teniendo en cuenta que ximadamente 10" (100.000 millones) de bacte­ los anticuerpos anti-Rh interaccionan mejor en rias por mililitro, en solución de cloruro de so­ caliente, es muy útil em plear como placa de dio al 12%. reacción una botella de cara plana llena de agua Generalmente se adicionan colorantes, como calentada a 45-50‘’C. el cristal violeta que, además de actuar como

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos bacteriostáticos, facilitan la lectura de los resul­ tados. b) Suero a valorar. c) Pipetas de 0,2 mi y 1 mi. d) Aglutinoscopio. Método

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AGLUTINACIÓN CON ANTÍGENOS SOLUBLES UNIDOS A SOPORTES INERTES Cuando se emplean hematíes como soporte P o r f i j a c i ó n d i r e c t a (s i e l a n t í g e n o ES U N h i d r a t o d e C A R B O N O )'^

Sobre la placa de vidrio del aglutinoscopio, colocar 0,08 mi, 0,04 mi, 0,02 mi, 0,01 mi y 0,005 mi del suero a valorar. Añadir, 0,03 mi del an tíg en o a to d o s ello s, m ezclar y le e r los resultados entre los 3 y 5 minutos. El títu­ lo estará dado por la máxima dilución agluti­ nante. P ara las cantidades indicadas los títu lo s aglutinantes son, respectivamente, 1:25, 1:50, 1:100 y 1:400. Cuando el título de los anticuer­ pos es muy elevado (aglutinación de todas las diluciones), debe usarse suero 1:2 o 1:4, multi­ plicando el título obtenido por la dilución para expresar el valor final.

Valoración por aglutinación lenta en tubos M aterial necesario a) Antígeno: suspensión bacteriana en solu­ ción salina tamponada a la concentración de 5 X lO® (5.000 millones) por mililitro. b) Solución salina tamponada: cloruro de so­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2. c) Pipetas de 1 y 5 mi. d) Tubos de hemólisis. e) Baño termostatizado regulado a 37°C, gra­ dillas. Método En una serie de tubos, colocar 0,5 mi de so­ lución salina tamponada. Al primero de la se­ rie, añadirle 0,5 mi del suero a valorar, m ez­ clar, extraer 0,5 mi de la mezcla y transferirla al segundo; 0,5 mi de ésta transferirla al terce­ ro, y así sucesivamente. El último tubo lleva sólo solución salina como control. A ñadir a todos los tubos 0,5 mi de suspensión antigéni­ ca e incubar a 37°C durante 2 horas. Leer los resultados. El título estará dado por la máxima dilución capaz de dar aglutinación visible. En los casos de urgencia pueden acelerarse los resultados incubando durante 15 minutos a 37°C y centrifugando luego a 3.000 rpm du­ rante 5 m inutos. Previa agitación suave, d e ­ term inar cuál es la m áxim a dilución ag lu ti­ nante.

El método es muy utilizado en la investiga­ ción de anticuerpos contra lipopolisacáridos bacterianos y antígenos poliosídicos diversos. M aterial necesario a) Antígenos: se emplean productos purifica­ dos. En el caso de los lipopolisacáridos b acte­ rianos se los obtiene a partir de bacterias trata­ das con fenol-agua a 65-68“C y precipitación posterior con alcohol, según las especificacio­ nes dadas en el capítulo 43. La concentración antigénica óptim a debe determ inarse ex p e ri­ mentalmente en cada caso. b) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca­ lienta a 56“C durante 30 minutos y se lo adsor­ be durante una hora a tem peratura am biente con un 10% de hematíes lavados para elim inar anticuerpos heterófilos. c) Glóbulos rojos de carnero: se utiliza una suspensión al 2% en cloruro de sodio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2. Para su preparación y v alo ració n se sigue el m étodo indicado en Complemento (cap. 22). d) Sensibilización de los hematíes: se m ez­ clan volúmenes iguales de la solución antigéni­ ca y glóbulos rojos al 2%. Después de 30 m i­ nutos de contacto a 37°C se centrifuga, se lavan los hematíes dos veces con solución salina tam ­ ponada y se suspenden al 1% en el mismo d ilu ­ yente. e) Tubos de hemólisis. f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 5 mi. g) Baño termostatizado, gradillas, centrífu­ ga. Método En una serie de tubos pequeños, colocar 0,5 mi de diluciones crecientes del suero a valorar y añadir a cada uno de ellos 0,5 mi de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno poliosídico. Incubar a 37°C durante una hora y dejar a temperatura ambiente hasta el día siguiente. Se examinan los tubos y se determina cuál es la m áxim a dilución con capacidad aglutinante. Para ello se sigue el criterio indicado en h emoaglutinación pasiva de Boyden. Es necesario incluir siempre testigos consti­ tuidos por glóbulos rojos no sensibilizados y

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Metodologías

suero a analizar, y glóbulos rojos sensibilizados frente a sueros negativos y de positividad cono­ cida. P o r s e n s ib il iz a c ió n p r e v ia (A N T ÍG E N O S PR O T E IC O S)

1. Hemoaglutinación pasiva de Boyden'’^-''' M aterial necesario a) Antígeno: debe emplearse la concentra­ ción óptima en cada caso, que varía entre 1 y 5 mg de proteína por mi. b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser calentado a 56°C durante 30 minutos y adsorbi­ do con hematíes lavados no sensibilizados para eliminar anticuerpos heterófilos. Para ello, aña­ dirle un 10% del paquete globular e incubar a temperatura ambiente durante una hora, clarifi­ cando por centrifugación. c) Solución buffer de pH 7,2: Cloruro de sodio 0,15 M ..................... 500 mi Fosfato monopotásico 0,15 M ........... 120 mi Fosfato disódico 0 ,15 M ..................... 380 mi d) Solución buffer de pH 6,4: Cloruro de sodio 0 ,15 M ..................... 500 mi Fosfato monopotásico 0,15 M ........... 339 mi Fosfato disódico 0,15 M ..................... 161 mi e) Solución salina: cloruro de sodio 0,15 M. f) Glóbulos rojos lavados al 2,5%: normal­ mente se emplean los de carnero. La sangre obtenida por punción venosa se m ezcla con solución de A lsever y en el m o­ mento del uso se lava tres veces con 10 volú­ menes de solución salina y se diluye al 2,5% en buffer de pH 7,2. Para su valoración se emplea el método indicado en Complemento (cap. 22). g) Solución de tanino: se prepara al 1% en agua destilada. Se conserva bien en heladera, debiendo desechársela si contiene precipitados. El tanino a usar debe ser de muy buena calidad. Para la reacción se usa una dilución 1:20.000 en solución salina, la que se prepara a partir de la solución madre. h) Tañado de los hematíes: mezclar volúme­ nes iguales de glóbulos rojos al 2,5% y tanino 1:20.000. Incubar a 37°C durante 10 minutos y centrifugar a 2.000 rpm durante 5 m inutos. Volcar el sobrenadante y lavar con un volumen igual de solución buffer de pH 7,2, efectuando luego un lavado con solución salina. Resuspen­ der en ella hasta volumen original. i) Sensibilización de los hematíes: a 2 mi de glóbulos rojos tañados agregar 8 mi de solu­

ción buffer de pFI 6,4 y 2 mi de antígeno. Mez­ clar y dejar a temperatura ambiente 10 minu­ tos. Centrifugar y lavar dos veces con 4 mi de suero normal de conejo al 1% en solución sali­ na, llevando finalm ente el sedimento a 2 mi con el mismo diluyente. Sim ultáneam ente se prepara la suspensión testigo de glóbulos rojos tañados siguiendo el procedimiento anterior, pero reemplazando el antígeno por solución salina. Nota: para algunos antígenos, como el toxoide tetánico, por ejemplo, se consiguen mejores suspensiones aglutinantes si para el tañado de los eritrocitos se usa una dilución 1:40.000. Método Siendo la reacción altam ente sensible, el suero a valorar debe ser diluido en forma con­ veniente. En una serie de tubos colocar 0,5 mi del sue­ ro a valorar diluido en razón 2, utilizando suero normal de conejo al 1% en solución salina co­ mo diluyente. Añadir a todos los tubos 0,05 mi de glóbulos rojos tañados y sensibilizados al 2,5%. Incluir dos tubos testigos que contengan 0,5 mi de la primera y las últimas diluciones del suero a valorar, respectivamente, a los que se les añade 0,05 mi de glóbulos rojos tañados no sensibilizados al 2,5%. Agitar y dejar a temperatura ambiente efec­ tuando la lectura entre las 3 y 24 horas. Puede facilitarse la lectura con la ayuda de un espejo cóncavo. Conviene incluir tubos con­ trol con sueros positivos y negativos. La figura 9-26 muestra los fondos de los tu­ bos de reacción, en los que pueden verse distin­ tos grados de hemoaglutinación. 2. Hemoaglutinación pasiva previa sensibiliza­ ción con tricloruro de cromo (CrCl¡)‘''^ El material y el instrumental necesarios son los indicados en los otros métodos de hemoa­ glutinación. a) Sensibilización de glóbulos rojos: se em ­ plean glóbulos rojos humanos del grupo O, Rh negativo, o hematíes de pollo, los que, previo lavado por tres veces, son suspendidos en solu­ ción de NaCl 0,15 M. Antes de su uso se sepa­ ran los glóbulos rojos por centrifugación. A un volumen de NaCl 0,15 M añadirle y mezclar un volumen de la solución del antíge­ no proteico (0,5-3 mg.ml *) y un volumen del paquete de los glóbulos rojos lavados. Añadir luego 2 volúm enes de una dilución 1/50 en NaCl 0,15 M de una solución madre de CrClj (CrClj 6H,0 al 1% en agua destilada). Agitar

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

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intensamente 5-15 minutos. Añadir 20-40 vo­ lución salina fosfatada añadirles 0,1 mi de una lúmenes de NaCl 0,15 M, centrifugar, lavar 3 suspensión de glóbulos rojos de carnero al 50% , veces con la m ism a solución y suspender al previamente lavados y suspendidos en el mismo 2%. diluyente. Agregar 1 ml de bencidina bis-diazoSi los iiematíes así sensibilizados dieran au- tizada diluida 1:30 en solución salina fosfatada toaglutinación en solución salina, significa que y m antener la mezcla a temperatura ambiente el tratamiento con CrClj ha sido excesivo. Para durante 15 minutos. Centrifugar 5 m inutos a 1.500 rpm, volcar el sobrenadante y lavar los una buena sensibilización se necesita exceso de antígeno; de ahí que dicha concentración y el glóbulos rojos dos veces con solución salina tiempo de tratamiento con CrClj deben ser re­ tamponada. Suspender en 2,5 ml de la m ism a gulados en cada caso, dentro de los rangos se­ solución adicionada de 1% de suero normal de conejo. Se obtiene de este modo una suspensión ñalados. b) Suero a analizar (calentado 30 minutos a de glóbulos rojos sensibilizados al 2%. 56°C): previa dilución 1:10, se lo mezcla con c) Suero a valorar: luego de un calentamien­ igual volumen de glóbulos rojos lavados e in­ to a 56°C durante 30 minutos se lo adsorbe con cuba una hora a 37°C. Se separan los glóbulos glóbulos rojos para eUminar anticuerpos hetepor centrifugación y el sobrenadante, libre de rófilos. cualquier heteroaglutinina natural antihematíe, d) Solución salina tamponada: cloruro de so ­ es el que se utiliza en los ensayos. dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2. e) Tubos de hemólisis. f) Pipetas de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml. Método g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga. En una serie de tubos de hemólisis colocar 0.5 ml de diluciones seriadas en razón 2, del Método suero a valorar. Añadirles 0,05 ml de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno específico La reacción se hace mezclando 0,5 ml de d i­ y dejar a tem peratura am biente 10 m inutos. luciones seriadas del suero a valorar y 0,05 mi Centrifugar un minuto a 1.000 rpm y leer los de la suspensión de glóbulos rojos sensibiliza­ resultados como en los métodos ya descritos. dos. Los resultados se leen a las 18 horas de p e r­ manecer los tubos a temperatura ambiente. P o r f ija c ió n d ir e c t a o in d ir e c t a D E A N T ÍG E N O A G L Ó B U L O S R O JO S M ED IA N T E u n io n e s

CO VA LEN TES

1. Método de la hencidina his-diazotizada^'’ La hencidina tratada con ácido nitroso da un bis-diazo capaz de copularse simultáneamente con un antígeno y restos reactivos de la mem ­ brana de los eritrocitos. M aterial necesario a) Bencidina bis-diazotizada: disolver 0,23 g de bencidina en 45 ml de HCl 0,2 N y enfriar en baño de hielo. Separadamente, disolver 0,175 g de NaNOj en 5 ml de agua destilada y enfriar del mismo modo. En un período de aproxima­ damente un minuto, añadir, con agitación cons­ tante, la solución de nitrito de sodio sobre la bencidina. M antener la mezcla en el baño de hielo durante 30 minutos, agitando cada 5 m i­ nutos. Para dar por terminada la reacción con­ viene investigar la ausencia de nitrito libre con reactivo de ioduro de potasio-almidón. La bencidina bis-diazotizada se conserva a - 2 0 ”C; es conveniente repartir el material en ampollas y almacenarlo hasta su uso. b) Sensibilización de los glóbulos rojos: a 3 ml de solución antigénica (1 a 3 m g-m l‘) en so­

2. Método del difluordinitrobencem/'-’ Se utiliza para la investigación de anticuer­ pos antidinitrofenol. La marcación de los h e ­ matíes con difluordinitrobenceno se hace sobre los residuos lisina de la membrana celular. M aterial necesario a) Solución buffer-EDTA pH 7,5: se deben disolver 17 g de EDTA disódico en 300 ml de agua destilada, ajustar a pH 7,5 con NaOH N (± 45 ml) y añadir luego NaCl 0,15 M h asta completar un litro. b) Solución buffer-EDTA pH 8,4: disolver 1,7 g de EDTA disódico y 5 g de glucosa en 80 ml de agua destilada. A justar a pH 8,4 con NaOH N y completar a 100 ml con agua d esti­ lada. c) Glóbulos rojos de carnero, conejo o h u ­ manos marcados con DNP: lavar los hematíes 3-5 veces con buffer-EDTA pH 7,5 y suspen­ derlos al 10% en el mismo buffer. D isolver 1-3 di flúor 4-6 dinitrobenceno al 2% en acetona y por cada 0,15 ml añadirle 1 ml de buffer-EDTA pH 8,4. Inmediatamente, a un volumen de éste añadirle, gota a gota y agitan­ do, la mitad del volumen de glóbulos rojos al

712

Metodologías

10%. Dejar a 37°C durante 15 minutos e inte­ rrumpir la reacción por añadido de 6 volúme­ nes de buffer-EDTA pH 7,5. Centrifugar, lavar tres veces con el mismo buffer y completar a un volumen cinco veces superior al de glóbulos rojos inicialmente usado. De este modo se tiene una suspensión final de glóbulos rojos dinitrofenolados al 2%. Si no se dispone de difluordinitrobenceno para la marcación, puede usarse fluordinitrobenceno. Como aquí la reacción es más lenta, para conseguir buenos resultados el buffer ED­ TA pH 7,5 a utilizar durante la marcación debe prepararse con NaCl 0,3 M. Para la interrup­ ción de la reacción y los lavados debe usarse buffer-EDTA pH 7,5 preparado con NaCl 0,15 M. Pueden usarse también glóbulos rojos trinitrofenolados, los que se preparan de la siguien­ te manera; con el paquete de glóbulos rojos previamente lavado con buffer de fosfatos 0,1 M.pH 7,8, preparar una suspensión el 5% (v/v) en el mismo buffer. Preparar una solución de trinitrofenil sulfo­ nato de sodio (TNB) de 3 mg ■mi ' en buffer de fosfatos 0,1 M. pH 7,8. A un volumen de la suspensión de glóbulos rojos añadir, gota a gota y agitando m anual­ m ente, un volum en igual de TNB. D ejar en agitación rotatoria por 1 hora a tem peratura ambiente. Lavar los glóbulos rojos trinitrofenolados con NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2 y suspender en el mismo buffer. d) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca­ lienta a 56"C durante 30 minutos y se adsorbe con glóbulos rojos no marcados para eliminar anticuerpos antihematíes naturales que pudie­ ran existir. e) Tubos de hemóhsis. f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi. g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga. Método A 0,5 mi de diluciones seriadas del suero a valorar, añadir 0,05 mi de glóbulos rojos dinitrofenolados, incubar 15 minutos a 37°C y de­ jar a temperatura ambiente hasta el día siguien­ te. La lectura de los resultados se efectúa en la forma ya indicada. 3. Método del glutaraldehído'^‘^'^'^^ M aterial necesario a) Glóbulos rojos de carnero lavados no m e­ nos de tres veces con buffer de fosfatos 0,15 M , pH 7,2. Separar el paquete globular por centrifugación. b) Dializar la proteína antigénica a fijar a los eritrocitos contra buffer de fosfatos 0,15 M, pH

7,2 y ajustar a la concentración adecuada (1-2 mg • mL')c) A 10 mi de esta solución, añadir 0,4 mi del paquete de glóbulos rojos de carnero, mez­ clar para homogeneizar y adicionar la cantidad óptima de glutaraldehído al 2,5% en agua (0,52 mi). Continuar agitando durante 1 hora, lavar las células tres veces con el buffer de fosfatos indicado (10 mi cada vez) y suspender final­ mente en 5 mi del mismo buffer que contiene 1% de suero normal de conejo o seroalbúmina bovina. Reacción. Con el suero a analizar, efectuar d iluciones seriadas usando com o diluyente NaCl 0,15 M fosfatos 0,01 M, pH 7,2, añadido de 1% de suero normal de conejo o seroalbú­ mina bovina. A 0,5 mi de cada dilución añadir 0,05 mi de glóbulos rojos sensibilizados, mez­ clar por agitación y dejar a 4°C por toda una noche. Leer los resultados. H e M O A G L U T IN A C IÓ N p a s i v a PA R A A N T ÍG E N O S PR O T E IC O S Y PO L IO SÍD IC O S U S A N D O G L Ó B U L O S R O JO S E S T A B IL IZ A D O S C O N A L D E H ID O S^'

Glóbulos rojos de carnero, pollo o conejo, estabilizados con aldehido fórmico o pirúvico, pueden fijar directamente antígenos proteicos o hidrocarbonados y ser utilizados para reaccio­ nes de hem oaglutinación. Para los antígenos proteicos los mejores son los glóbulos rojos de carnero estabilizados con aldehido fórmico y, para los hidrocarbonados, los de conejo estabi­ lizados sucesivamente con aldehido pirúvico y fórmico. Estos glóbulos rojos así sensibilizados, con­ servados en heladera, se mantienen útiles por cinco semanas. Estabilización de glóbulos rojos de carnero con aldehido fórm ico Se emplean glóbulos lavados, suspendidos al 8% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. A un volumen de formol (aldehido fórmico al 40%) al 7,5% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2, se le añade con agitación continua un volumen de glóbulos rojos al 8%. Se mantiene la agita­ ción (agitador magnético) durante 17 horas a temperatura ambiente (20“C) y luego se centri­ fuga y lava cinco veces con buffer de fosfatos. Se filtra por gasa y se lo suspende al 10% en buffer de fosfatos 0,11 M. Se conserva a 4“C. Sensibilización, con antígenos proteicos, de glóbulos rojos estabilizados con aldehido fórm ico Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9 mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 5 y se le

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos añade 1 mi de solución de antígeno (0,5-3 mgmi). El buffer a utilizar debe ser de un pH pró­ ximo al punto isoeléctrico de la proteína. El in­ dicado es el recomendado para ovoalbtimina o albúminas séricas. Se los mantiene en agitación durante 2 horas, se los lava cinco veces y sus­ pende al 1% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. Estabilización de glóbulos rojos de conejo con aldehido pirúvico y fórm ico Glóbulos rojos de conejo son estabilizados con aldehido pirúvico al 3% (ajustado a pH 7,2 con NaOH) de manera similar a la indica­ da para aldehido fórm ico. Finalmente se los suspende al 8% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. A un volum en de los mism os se le añade un volumen de aldehido fórmico al 3% (formol al 7,5% ) en buffer de fosfatos y se agita 17 horas a 20-24°C. Se filtra por gasa y se los suspende al 10% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. Sensibilización, con antígenos hidrocarbonados, de glóbulos rojos de conejo estabilizados con aldehido pirúvico y fórm ico Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9 mi de buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2 y se añade 1 mi de la solución de antígeno (10-300 )ig • mf*)- Se agita durante una hora, se lava cinco veces y se suspende al 1% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. Reacción: Puede hacerse en placas con con­ cavidades o en tubos. Para la reacción se efec­ túan diluciones seriadas del suero en fosfato 0,11 M, pH 7,2, adicionado con 0,1% de gelati­ na y 0,5% de albúm ina (conejo o humana) o 1% de suero normal. Si se efectuara en placas, en cada concavidad se colocan 25 |U,1 de las di­ luciones séricas e igual volum en de glóbulos rojos sensibilizados. Si se hace en tubos, los volúmenes son 0,5 mi. Se agita tres veces con intervalos de 10 minutos y se deja a temperatu­ ra ambiente durante 16-20 horas. Las lecturas se hacen de manera similar a las ya indicadas. Nota: Los glóbulos rojos formolizados, obte­ nidos de acuerdo con las indicaciones dadas en el método precedente, pueden ser utilizados pa­ ra la preparación de glóbulos rojos sensibiliza­ dos por la bencidina bisdiazotizada o el difluordinitrobenceno, tal como si fueran glóbulos ro­ jos frescos. En, el caso de sensibilización por tanino, éste debe usarse en una dilución de 1:2.000 en lugar de 1:20.000. Tienen la ventaja de conservarse estables va­ rias semanas y no Usarse en soluciones hipotónicas.

713

Cuando se emplean bacterias como soporte^^ En algunas oportunidades pueden emplearse bacterias como soportes, en sustitución de h e ­ matíes, para reacciones de aglutinación pasiva. Una de las más utilizadas es el Micrococcus lysodeikticus, y el método de fijación de los antí­ genos, es el de la carbodiim ida hidrosoluble. Este método da buenos resultados para diferen­ tes tipos de antígenos como los toxoides, albú­ minas, gammaglobulina, etc. M aterial necesario a) M icrococcus lysodeikticus: la masa m i­ crobiana necesaria se obtiene por cultivo de una cepa controlada, en agar peptonado e n ri­ quecido con 5% de extracto de levadura. D es­ pués de 48 horas de incubación a 37“C las bac­ terias se suspenden en solución salina fosfatada y se las calienta a 60°C durante 1 hora; repítase el calentam iento al día siguiente. Hechos los controles de esterilidad, se procede a centrifu­ gar y lavar por tres veces el sedimento m icro­ biano, usando para ello solución salina fosfata­ da, suspendiendo finalmente al 80% en el m is­ mo diluyente. b) Sensibilización de las bacterias; a 1 mi de la suspensión bacteriana al 80% se añaden 6,6 m i de la so lu c ió n p ro te ic a an tig é n ic a (1 5 mg-mf^ en solución salina fosfatada) y 5 mi de clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiim ida al 10%; se m antiene la m ezcla con agitación constante 14 a 16 horas, a 4°C. Se lavan las bacterias dos veces con Na^EDTA al 2% en solución salina fosfatada y se las su s­ pende al 5% en solución salina. c) Suspensión microbiana control; se prepara en las m ism as c o n d ic io n e s e sp e c ific a d a s en b), pero sustituyendo los 6,6 mi de solución proteica antigénica por solución salina fo sfa­ tada. d) Coloración de las bacterias; para facilitar la visualización, las bacterias sensibilizadas pueden teñirse por el añadido de azul de metileno al 4% en solución salina fosfatada (0,05 mi por cada mi de suspensión bacteriana). C o­ mo conservador puede añadirse azida sódica al 0,1%. Debe conservársela a 4°C. e) Suero por valorar; previo calentamiento a 56°C durante 30 m inutos, adsorberlo con la suspensión m icrobiana no sensibilizada p a ra elim inarle cualquier anticuerpo inespecífico que pudiera contener. f) Solución salina fosfatada; NaCl 0,15 M , fosfatos 0,01 M, pH 7,2. g) A glutinoscopio o placas p ara aglutina-

714

Metodologías

Método

M ateriales necesarios

E n la p la c a d el a g iu tin o s c o p io c o lo c a r 0,03 ml de las diluciones seriadas del suero por valorar que contiene los anticuerpos específi­ cos para el antígeno fijado a las bacterias y 0,03 ml de la suspensión de bacterias sensibili­ zadas. Colocar como control, 0,03 ml de la primera dilución de suero y 0,03 ml de la suspensión microbiana no sensibilizada. Mezclar con una varilla de vidrio o monda­ dientes y determinar directamente, entre los 2 y 4 minutos, si hay aglutinación.

a) E ritrocitos de carnero: se preparan de acuerdo a las indicaciones dadas en el capítulo 22. Su concentración final depende del sistema hemolítico a preparar. b) H emolisina anticarnero: los métodos de preparación y titulación ya han sido indicados en el capítulo 22. c) Complemento: se utiliza una mezcla de sueros frescos de cobayo. Los métodos de va­ loración en unidades 50 y 100% hemolíticas y las recomendaciones para su conservación fue­ ron especificadas en el capítulo 22. d) Buffer Veronal-salino: se emplea el reco­ mendado por Mayer (capítulo 22). e) Solución frenadora de la hemólisis: citrato de sodio al 4% en solución de cloruro de sodio 0.15 M, mantenida en baño de hielo para ser agregada helada. f) Antígenos; deben ser titulados previamen­ te a su uso. Para ello se efectúan reacciones con diferentes diluciones de él, respetando las dosis de antígeno indicadas para el sistema. Se considera como óptima para la reacción aquella que dé el máximo de sensibilidad y especifici­ dad cuando se la ensaya frente al anticuerpo es­ pecífico y a otros no relacionados. g) Sueros a examinar: deben ser frescos y mantenidos en heladera no más de 48 horas. En caso de que deban conservarse más tiempo, pa­ ra evitar que se vuelvan anticomplementarios por agregación de gammaglobulina o contami­ naciones, se les añade 0,1% de cisteína o glici­ na y 0,01% de Merthiolate, que no interfieren en la prueba. Antes de su uso deben ser calen­ tados a 56°C durante 30 minutos. h) Tubos de hemólisis. i) Pipetas de 1 ml y 5 ml. j) Gradillas, baños termostatizados, centrífu­ ga, refrigeradora. k) Espectrofotómetro.

Cuando se emplean sustancias inertes como soportes O tras sustancias distintas de los hem atíes han sido utilizadas para la fijación de antíge­ nos. Eiguran entre ellas las partículas de bentonita de diámetro conveniente seleccionadas por centrifugación diferencial, las partículas de co­ lodión y las de látex (poiiestireno) de 0,21 a 0,81 jl de diámetro. De todas ellas, la más usada es el látex de poiiestireno, el que suspendido al 1% en solu­ ción sahna boratada de pH 8,2 (partes iguales de NaCl 0,3 M y ácido bórico 0,1 M ajustado a pH 8,2 con NaOH), glicina 0,1 M ajustada a pH 8,2 con NaOH 0,1 N u otras soluciones estabilizadoras, puede fijar antígenos en su super­ ficie por sim ple contacto, a tem peraturas y tiempos variables. Las concentraciones antigé­ nicas y las condiciones de fijación deben esta­ blecerse experimentalm ente en cada caso. Se consiguen buenas fijaciones entre los 35“C y los 50°C; los tiempos varían con la temperatura empleada. Con las partículas sensibilizadas se hacen reacciones en placas, m ezclando volúm enes iguales (aproximadamente 0,05 ml) de ellas y del suero a analizar. Las lecturas se efectúan a los 3-5 minutos y la positividad se establece por la aparición de grumos. El método puede hacerse cuantitativo si se utilizan distintas dilu­ ciones del suero. F IJA C IÓ N DEL COMPLEMENTO» Pueden emplearse sistemas con lecturas fina­ les del 50 a 100% de hemólisis, los que a su vez pueden ser cualitativos o cuantitativos. Como varios de los reactivos a utilizar son comunes a los diferentes sistemas, se describi­ rán en conjunto los materiales necesarios y lue­ go los métodos para cada reacción.

1. Reacción cualitativa con lectura del 100% de hemólisis Tubos

5

6

0,1

0,1

2

3

-

0,1

_ -

0,1

0,1

Id r

Id r

0,5

0,5 0,5 0,5 0,5 Incubar 1 hora a 37»C 0,5 0,5 0,5 0,5

1

S uero a analizar Suero a analizar diluido 1:5 A ntígeno Com plem ento diluido 1:30* B uffer c.s.p.

0,1

S istem a hem olílico **

0,5

4

_

-

0,1

_

0,1

-

Idr

Idr

-

Idr 0,5 0,5

Incubar 30 m inutos a 37°C L ectura de los resultados

dr= dosis de reacción obtenida en la titulación (100% hem ojítica) E l siste m a a em p le a r está co n stitu id o p o r g ló b u lo s ro jo s al 2% y 2DHioo/mÍ de h em o lisin a , m ez clad o s en p arte s iguales. El v o lu m en d e ios re activ o s está ex p resad a en m l.

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

715

Interpretación Tubo I

O O

O 50 75

25 50 75

% de lisis

R esultado

Tubo 2

++ +

100

100 100

100

Los tubos 1 y 2 son de reacción. Los tubos 3, 4 y 6 (100% de hemólisis) y el tubo 5 (0% de h e ­ móhsis) son testigos. 2. Reacción cuantitativa con lectura del 100% de hemólisis Tubos Suero a analizar 1:1 Suero a analizar 1:5 Suero a analizar 1:10 Suero a analizar 1:20 Suero a analizar 1:40 Suero a analizar 1:80 Suero a analizar 1:160 A ntígeno C om plem ento diluido 1:30 B uffer c.s.p.

0,1

Id r 0,5

0,1 Id r 0,5

0,1 Idr 0,5

0,1 Idr 0,5

Sistem a hem olítico

0,5

0,5

0,5

0,5

0,1

0,1

10

II

0,1

0,1

0,1 0,1

0,1

0,1 0,1

0,1

0,1

0,1

Id r Idr Id r 0,5 0,5 0,5 Incubar 1 hora a 37°C 0,5 0,5 0,5 L ectura de los resultados

0,1

0,1 Idr 0,5

Id r 0,5

0,5

Id r 0 ,5

0,5

0,5

0,5

0,5

El v o lu m en d e los re acü v o s e s tá e x p resad o en m i.

Los tubos 1 a 7 son de reacción, y los tubos 8 a 11, controles. Las dosis reactiva (dr) de complemento y el sistema hemolítíeo a emplear son los ya indica­ dos en la reacción cualitativa. El título estará dado por la máxima dilución capaz de inhibir la hemólisis en forma parcial o total. Si se expresa el resultado en unidades, és­ tas corresponderán a la inversa de la dilución que produce el efecto deseado (unidades/0,1 mi). Leer las DO en el espeetofotóm etro a 565

nm, calculando los porcentajes de hemólisis en cada tubo y usando como testigos tubos que corresponden al O y 100% de hemólisis, prepa­ rados por el agregado de 1 mi de buffer y 1 mi de agua destilada, respectivamente, a 1 mi de sistem a hem olítico. Producido el lacado, se añade a ambos tubos 2 mi de citrato de sodio helado. El sistema hemolítico a emplear en la reac­ ción se prepara mezclando partes iguales de glóbulos rojos de carnero al 5% y 5 DHj,/ml de hemolisina.

3. Reacción cualitativa con lectura del 50% de hemólisis Tubos

/

2

3

4

5

6

7

A ntígeno diluido según titulo Suero a analizar 1:1 Suero a analizar 1:5 C om plem ento 3CH,(, en 0,2 m i Com plem ento 2 C H 5,, en 0,2 mi Com plem ento 4CH,,| en 0,2 mi B uffer V eronaLsalina

0,1 0,1

0,1

0,1

-

...

-

...

0,1

0,1

0,1

0,1 0,1

-

-

-

-

0,2

0,1 0,2

0,2

0,2

-

-

-

-

-

-

-

0,2

-

-

-

--

-

-

-

0,2 0,6

0,8

1

1

2

2

Sistem a hem olítico Citrato de sodio al 4% helado

0,6

0,6

1

1

2

2

0,7 0,7 0,6 Incubar 18 horas a 4 “C y 15 m inutos a 37“C

1

1

1

Incubar 30 m inutos a 37°C

2

2

2

-

Centrifugar a 3.500 rpm durante 5 m inutos y esperar el sobrenadante El volum en de los re activ o s es tá ex p resad o en m i.

-

716

Metodologías

Interpretación Tubos

2

1 í

% de hem ólisis

3

0 12

0 0 0-12 12-25 25-50 50 a > 50

50 50 50 50 50 50

12-25 25-50 50 a > 50 50 a > 50

a a a a a a

4

> 50 > 50 > 50 >50 > 50 > 50

50 50 50 50 50 50

4. Reacción cuantitativa con lectura del 50% de hemólisis (cuadro A) Separar los sobrenadantes y leer en el espec­ trofotómetro las DO a 565 nm; calcular el por­ centaje de hem ólisis en cada tubo y emplear para ello los tubos 13 (0% de lisis) y 14 (100% de lisis). Los tubos 9, 10,11 y 12 son testigos. U tilizando cualquiera de los métodos des­ critos al ocuparnos de la valoración de com ­ plem entos en unidades 50% hemolíticas, cal­ cular cuál es la dilución del suero que da 50% de hem ólisis. Su inversa corresponde a las unidades de anticuerpo por mililitro. Aplicando la ecuación de von Krough a este sistema reactivo, el valor de 1/n = 0,2. Con él se ha calculado el cuadro 35-3, que correspon­ de a los valores de 1 (1-x) para los diferentes porcentajes de hemóhsis, ya que lo que se mide es consumo de complemento. Siempre que las condiciones de la reacción no se modifiquen ni varíen, se la puede usar para calcular las dosis

a a a a a a

5

> 50 > 50 > 50 > 50 > 50 >50

50 50 50 50 50 50

a a a a a a

> 50 > 50 > 50 >50 > 50 > 50

6

7

Positividad

>50 >50 >50 >50 >50 >50

0 0 0 0 0 0

++++ +++ -H+ ± -

reactivas 50% hemolíticas. Para ello multipli­ car la dilución del suero que más se aproxima a 50% de lisis por el factor correspondiente. Su inversa constituye el número de unidades reac­ tivas de anticuerpo por 0,1 mi. Para las condiciones indicadas en la reac­ ción, 3CH,g de complemento constituye la do­ sis óptima. 5. R e a c c ió n de fija c ió n d e c o m p le m e n to en placas Materiales necesarios a) Sueros a examinar inactivados por calen­ tamiento a 56“C por 30 minutos. b) Sueros controles positivos y negativos, inactivados. c) Glóbulos rojos de carnero al 2,8%, según se indicó en el capítulo 22. d) H em olisina valorada en placas frente a glóbulos rojos al 2,8%.

C u ad ro A. Reacción cuantitativa con lectura del 50% de hemólisis T uhos A ntígeno diluido según título Suero 1:1 Suero 1:2 Suero 1:4 Suero 1:8 Suero 1:16 Suero 1:32 Suero i :64 Suero 1:128 Com plem ento 3 C H 5„ en 0,2 mi C om plem ento 2CH,,, en 0,2 mi C om plem ento 4CHj(, en 0,2 mi BuíTer V eronal-salina A gua destilada Sistem a hem olítico C itrato de sodio al 4% helado

3 0,1

0,1

0

0,1



5 0,1

0,1

7

8

0,1

0,1

0,1

10

II

0,1

0,1

12

13

14

0,1

0,1

0,1

0,1 0,1 0,1

0,1 0,1 0,1

0,1

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2 0,2 0,2

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,7

0,7

0,7

0,7

0,9 0,9

1

2

1

1

2

7

2

2

Incubar 18 horas a 4°C y 1.5 m inutos a 37°C 1 1 1 1 1 1 Incubar a 37“C durante 30 m inutos

2

2

2

2

2

2

C entrifugar a 3500 rpm durante 5 m inutos

1

2

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

Cuadro 35-4. Estándares de porcentaje de lisis

Cuadro 35-3 —— —- —---------------------—% de lisis

Factor

% de lisis

F actor

10

1,36 1,33 1,30 1,28 1,26 1,24 1,20 1,16 1,12 1,08 1,04

55 60 65 70 75 80 82 84

0,96 0,92 0,87 0,82 0,75

12 14 16 18

20 25 30 35 40 45 50

0,68

90

Solución de hem oglobina (ml)

H em ólisis

0,65 0,61 0,57 0,51 0,45

86 88

717

1

Eritrocitos a l 0,28% (m l)

0 10 20

0,0 0,1 0,2

LO 0.9

30 40 50 60 70 80 90

0,3 0,4 0,5

0.7

100

1,0

0.8 0.6 0,5 0,4 0.3

0,6 0,7

0,8

0,2 0,1 0,0

0,9

L os eritro cito s al 0,28% se p re p ara n m ez clan d o 1 volum en de g l ó ­ bulos ro jo s al 2 ,8 % (su sp e n sió n estándar) y 9 v o lú m en es de b u ff e r d iluyente. L a so lu ció n d e h e m o g lo b in a se p re p ara m ez clan d o 1 m l d e g l ó b u ­ los rojos d e ca rn ero al 2 ,8 % , b ien h o m o g en e iz ad o s con 7 v o lú m e ­ nes d e a g u a d estilada, A g itar h asta que los eritro cito s estén lisa d o s . A ñ a d ir lu eg o 2 m l d e b u ffer d e d ilu ció n y m ezclar.

e) Sistema hemolítico. Mezclar partes igua­ les de glóbulos rojos al 2,8% y hemoUsina (2 dmh • por ml '). f) Diluyente. Es el mismo que se utiliza para el macrométodo. g) Antígeno, usado a la dilución óptima, pre­ via valoración en placas. h) C om plem ento. Suero fresco de cobayo valorado en placas frente al sistema hemolítico indicado. Las dosis 5 CH^g deben estar conteni­ das en 50 |0,1. Las dosis de complemento 2,5 CHjg y 1,25 CH jq se preparan diluyendo la do­ sis 5 CHjg a 1:2 y 1:4 en buffer diluyente, res­ pectivamente.

llar la reacción de fijación de complemento en placas, se indican en la figura 35-5. M edición de la capacidad fijadora de complemento, usando glóbulos rojos marcados con ®^Cr M ateriales necesarios

Método

a) Glóbulos rojos de carnero marcados con “•■Cr. Para ello los eritrocitos son lavados con buffer de Mayer (véase cap. 22) y resuspendidos

Las cantidades y la distribución de los reacti­ vos, así como los pasos a seguir para desarroDilución de suero ~

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

5 C H ,,

2,5 . U25 CH,,, GH,,

Reacción

Suero descon. Antígeno 5C H j,

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 . 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 5()

25 25 50

A ntígeno Diluyente Com plem ento

Control

Suero descon. Diluyente 5CH„,

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

Suero desc. 1:8 Control Diluyente suero d esc. Com plem ento

Reacción

Suero posil. Antígeno 5CH3„

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

Suero posit. 1;8 Controi suero p osit. Diluyente Com plem ento

Control

Suero positiv. Diluyente 5CH,„

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

50 50

50 50

50 50

Diluyente Com plem ento

Control diluyente

Reacción

Suero negal. Antígeno 5 C H ,,

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

100

Diluyente

Control Sistem a hemol.

Conlrol

Suero negativo D iluyente 5 C H ,,

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

25 25 50

_

Testigo positivo

— Testigo negativo L

1:8

Control antígeno

F ig. 35-5. Los volúm enes de los reactivos están expresados en |i.l. A gitar e incubar a 4“C por 15-18 horas. Añadir a to d o s los pocilios 25 |0.1 del sistem a hem olítico (volúm enes iguales de eritrocitos de carnero al 2,8% y dosis óptim a de h e m o lisi­ na). C ubrir la placa con tira plástica transparente e incubar a 37°C durante 30 m inutos. R etirar. C olocar en cada uno de c in ­ co pocilios, 25 |il de los controles de O, 30, 50, 80 y 100% de lisis, preparados según el cuadro 35-4. C entrifugar si se di.spone de centrífuga apropiada o dejar en heladera 2-3 horas hasta que las células sedim enten. Leer los resultados por c o m ­ paración con los testigos de porcentaje de lisis. Para que los resultados de la reacción sean válleos, los controles de 5 CLIj,, y 2,5 CH 51, y 1,25 CHj,j deben dar los correspondientes grados de lisis.

718

Metodologías

al 50% en el mismo buffer. A 0,2 mi de la sus­ pensión de hematíes se le añaden 50-100 |0,Ci de ^'Cr (Na/'CrO^) en solución salina. La suspen­ sión se incuba 1 hora a 37“C con agitación fre­ cuente. Las células se lavan 4-5 veces con 20-30 volúmenes de buffer de Mayer. El sobrenadante del último lavado no debe tener radiactividad medible. Ajustar la suspensión celular a 2 X 10* eritrocitos por mi. La marca incorporada no de­ be ser inferior a 2.000 c.p.m. para la cantidad de eritrocitos a usar por tubo de reacción. b) Hemolisina. Se la emplea a la dilución 2 ACH|,,„.ml"', determinada según se indicó en el capítulo 22. Método I

Tubox A ntígeno A ntisuero 1:50 A ntisuero 1:100 A ntisuero 1:200 C om plem ento D iluyente

3

5

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,50 0,50 0,75

1,0

hicubar a 37“C por I hora

S istem a hem olítico*

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Incubar a 37“C por 30 m inutos * El s iste m a h e m o lític o usad o estíl co n stitu id o p o r u n a m ez cla de p a rte s iguales d e eritro cito s d e ca rn ero y h em o lisin a en las c o n c e n ­ tra c io n e s in d ic a d o s . E l v o lu m en d e lo s re a c tiv o s e s tá e x p re s a d o en m i.

c) Complemento. Se utiliza suero fresco de cobayo diluido convenientemente de modo que 1 CH|pg esté contenida en 0,25 m. La determi­ nación de las unidades CH,pg se efectúa como se indicó en el capítulo 22. d) Antígeno. Se lo diluye de manera tal que contenga 10-15 ¡ag.ml'. e) El suero a valorar, previamente inactivado a 56°C por 30 mirmtos, se lo diluye 1:50, 1:100 y 1:200. f) Diluyente. Buffer de M ayer (véase cap. 22 ).

Finalizada la incubación, los tubos son cen­ trifugados y se procede a medir la radiactividad en 0,75 mi de cada uno de los tubos y en los se­ dimentos de todos ellos, previa eliminación del resto de sobrenadante. Para la lectura de los re­ sultados se utiUza un contador de radiaciones gamma. Los tubos 1, 2 y 3 son de reacción, y los restantes son controles. El porcentaje de ^'Cr liberado en los tubos de reacción, representante de la capacidad fijadora de complemento, se calcula como sigue: %

AX 2 5 iC r= -----------A +B

X

100

Siendo A, radiactividad del sobrenadante, y B, radioactividad del sedimento. Un 100% de lisis en los tres tubos significa reacción negati­ va. IN V ESTIG A C IÓ N D E A N TIC U ER PO S ANTI RH INCOMPLETOS Por dilución en medio albuminoideo^"’ M aterial necesario a) Glóbulos rojos del grupo 0-Rh positivos (D o de la especificidad deseada) al 4% en NaCl 0,15 M adicionado con 15% de albúmina bovina. Lavar los glóbulos tres veces eon 10 volúmenes de NaCl 0,15 M. Decantar el sobre­ nadante, medir 0,05 mi del paquete globular y añadir 1,2 mi de NaCl 0,15 M con 15% de al­ búmina bovina. b) Diluyente: albúm ina bovina al 20% en NaCl 0,15 M. c) Suero a valorar. d) Tubos de hemólisis pequeños. e) Pipetas de 0,01,1 mi y 5 mi. f) Gradillas, baño termostatizado, centrífuga. Método En una serie de tubos, colocar 0,1 mf de di­ luciones crecientes en razón 2, del suero a va­ lorar en albúmina bovina al 20%. Añadir a to­ dos los tubos 0,1 mi de la suspensión de glóbu­ los rojos al 4% e incubar una hora a 37°C. Cen­ trifugar un minuto a 1.000 rpm. Determinar el título estableciendo cuál es la máxima dilución aglutinante, previa agitación suave del sedi­ mento globular. Deben incluirse en la reacción tubos testigos con sueros positivos y negativos. Por modificación previa de la superficie de los hematíes por acción enzimática^f’ M aterial necesario a) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la especificidad deseada) tripsinados: se emplea una suspensión al 4% en NaCl 0,15 M. Para la tripsinización, a un volumen de glóbulos rojos lavados tres veces con solución salina se le añade un volum en y m edio de solución de tripsina (solución salina 10 mi, tripsina cristatizada 10 mg, fosfato disódico 1/15 M 2 mi, fosfato monopotásico 1/15 M 0,05 mi). Se in­ cuba en baño de agua a 37“C, con agitación periódica, durante 10-15 m inutos. Luego se lavan con solución salina y se los suspende en ella al 4%.

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos b) Solución salina: NaCl 0,15 M. c) Tubos de hemólisis. d) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi. e) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.

719

El título estará dado por la m áxim a dilución aglutinante.

Por bloqueo^* Método Cualitativo. En un tubo de hemólisis colocar 0,2 mi del suero a analizar y 0,1 mi de la sus­ pensión de glóbulos rojos tripsinados. Dejar en reposo 5-10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 1.000 rpm durante 1 minuto. D es­ prender suavemente el botón celular y determi­ nar la presencia de aglutinación. C uantitativo. R epetir el m étodo anterior, usando diluciones seriadas del suero a analizar. El título estará dado por la máxima dilución aglutinante. Por la prueba de Coombs indirecta” M aterial necesario

M aterial necesario a) Suero a analizar. b) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la especificidad deseada). Se utiliza una suspen­ sión al 2% en solución sahna. c) Solución salina: NaCl 0,15 M. d) Suero aglutinante anti-Rh: usar un suero de buen poder aglutinante, de tipo salino, espe­ cífico para los glóbulos rojos empleados en la prueba. e) Tubos de hemólisis. f) Pipetas de 0,2 mi, 1 mi y 10 mi. g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.

Método

a) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la especificidad deseada). Con los mismos, previo lavado, se orepara una suspensión al 1% en NaCl 0,15 M. b) Diluyente: Na C1 0,15 M. c) Suero de Coombs (suero de conejo anti­ globulina humana). d) Tubos de hemólisis. e) Pipetas de ] mi y 5 mi. f) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.

1. Cualitativo: a dos tubos de hemólisis (n- 1 y n- 2) añadir 0 ,1 mi de la suspensión globular. Al tubo n® 1 agregarle 0 ,1 mi del suero a inves­ tigar y al tubo n° 2, 0,1 mi de solución salina. Mezclar e incubar en baño de agua a 37“C d u ­ rante una hora. Centrifugar a 1.000 rpm duran­ te 1 minuto. Volcar el sobrenadante y agitar el sedimento. Si no hay aglutinación, añadir a c a ­ da tubo 0,1 mi del suej-o aglutinante, mezclar e incubar a 37“C durante una hora. La lectura de los resultados se efectúa de Método manera similar a la indicada en ¡os otros m éto­ 1. Cualitativo: el esquema de la reacción es dos descriptos. Ausencia de aglutinación en el tubo n® 1 y aglutinación en el tubo n° 2 (testi­ el siguiente: go) indica presencia de anticuerpos bloquean­ tes. Aglutinación en ambos tubos expresa re ­ 2 sultado negativo. / T uhos 2. Cuantitativo: se repite el ensayo anterior, G lóbulos rojos al 1% (mi) 0,1 0,1 usando diluciones seriadas del suero a valorar. Suero a valorar (mi) 0,2 El título estará dado por la máxima dilución ca ­ N aC I 0,15 M (mi) 0,2 paz de inhibir aglutinación. Incubar una hora a 37°C, centrifugar y lavar DETECCIÓN DE ANTICUERPOS no menos de tres veces con 20 volúmenes de CONTRA ANTÍGENO NUCLEAR NaCl 0,15 M para eliminar las proteínas no an­ EXTRACTARLE (ENA) ticuerpos inespecíficamente adheridas. Volcar Se sigue esencialmente la técnica de hem oa­ los sobrenadantes y añadir a cada tubo 0,1 mi de suero de Coombs. Incubar a 31°C durante 15 glutinación pasiva de Boyden con la siguientes minutos, centrifugar y determinar si hay agluti­ variantes. nación. El tubo 1 es el de reacción, y el 2, el de con­ M aterial necesario trol. Aglutinación en el tubo 1 indica presencia a) Antígeno: extracto salino de timo de co n e­ de anticuerpos incompletos. 2. Cuantitativo: repetir el ensayo anterior, jo. La concentración óptima es 1 mg de proteí­ usando diluciones seriadas del suero a valorar. na por mi.

720

Metodologías

b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser calentado a 56“C durante 30 minutos. c), d) y e) Igual a la técnica original. f) Glóbulos rojos lavados al 4%. Se emplean glóbulos rojos humanos, grupo O, Rh negativo. g) Igual a la técnica original. h) Tañado de los hematíes: mezclar voMmenes iguales de glóbulos rojos lavados al 4% y ácido tánico al 1:20.000. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y 30 minutos a 4°C. La­ var 3 veces con solución de buffer pH 7,2. Resuspender luego hasta volumen original. i) Sensibilización de los hematíes: mezclar volúmenes iguales de glóbulos rojos tañados y solución antigénica. Mezclar y dejar a tem pe­ ratura ambiente durante una hora. Centrifugar y lavar una vez con solución buffer de pH 7,2 y dos veces con suero normal de conejo al 2% en solución salina, llevando parcialm ente el sedim ento a volum en original con el mismo diluyente. Dividir el volumen total de la sus­ pensión de glóbulos rojos en partes iguales. A una de ellas se le agrega una solución de RNasa a razón de 1 mg por cada mi de suspensión de glóbulos rojos y se coloca 30 m inutos a 37“C. M étodo Se realizan dos series de diluciones por cada suero en estudio. En cada orificio de la microplaca se colocan 50 )ll del suero a valorar dilui­ do en razón 2, utilizando suero normal de cone­ jo al 2% en solución salina como diluyente. Se añaden a todos los orificios de una serie 25 |J,1 de glóbulos rojos tañados y sensibilizados y a los de la otra serie los glóbulos rojos tañados, sensibilizados y tratados con RNasa. Se inclu­ yen orificios testigo que contienen la primera y la última dilución de cada suero en estudio a los que se les añaden 25 ¡il de glóbulos rojos tañados, no sensibilizados; además, orificios donde se colocan 50 |ll de diluyente y glóbulos

Toxina tetánica al 1 p o r m il (mi)

0,21 0,22 0,23 0,24 0,2-5 0,26 0,27



Antitoxina tetánica patrón 0,1 U Alm l (mi)

1 1 1 1 1 ] I

rojos tañados y sensibilizados tratados o no con RNasa. Se continúa igual que en la técnica original. Interpretación Si las dos series de sueros a los que se les agregaron glóbulos rojos tañados y sensibiliza­ dos con RNasa y sin ella tienen igual título, la positividad es debida solamente a anticuerpos contra antígeno Sm. Si la positividad se en ­ cuentra únicamente en la serie donde se coloca­ ron las células sin tratar, los anticuerpos están dirigidos contra antígeno RNP solamente. Si por el contrario, la reducción del título en la se­ gunda serie no es total, habrá presencia de anti­ cuerpos contra ambos antígenos. VALORACIÓN DE ANTITOXINAS POR NEUTRALIZACIÓN Se describirá como modelo la valoración de antitoxina tetánica. M aterial necesario a) Toxina valorada: las instituciones oficia­ les proveen antitoxinas patrones para la valora­ ción de toxinas, dada la poca estabilidad de és­ tas. Para ello se hace una dilución conveniente de la toxina en solución salina, la que es mez­ clada en diferentes dosis con una cantidad co­ nocida de antitoxina (en este caso 0,1 UA), com pletando a un volum en final de 2,5 mi. Después de 45 minutos de reposo a temperatu­ ra ambiente se inoculan cobayos de 300 ± 20 g de peso. La dosis de toxina tetánica a utilizar en futu­ ras valoraciones de antitoxina es la que mezcla­ da con 0,1 UA m ata al cobayo en 96 horas (véase cap. 3). A continuación se transcribe como ejemplo un protocolo de valoración de toxina tetánica:

O bservaciones ¡Solución salina (mi)

Cobayos (peso en g)

1,28 1,28 1,27 1,26 1,25 1,24 1,23

285 300 310 295 290 305 295

H oras 24

48

72

0 0 0

0 0

0

It It t t

0: au se n cia de tétanos; It; ligero tétanos; t: tétan o s; m t: m u ch o tétan o s; +; m u erte d el anim al.

It t t t mt

It t t mt ■ + +

96

Título de la toxina (mg)

0 It t mt +

0,25

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos

721

. O bservaciones Antitoxina tetánica a valorar ( l m l dilución)

1:6.000 1:7.000 1 :8.000 1:9.000 1 :10.000 1: 11.000 1 : 12.000

T oxina patrón (1:1.000) (d. test 0,2.5 ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 ■ 0,25 0,25

Solución salina (ml)'

Cobayos (pe.m en g)

1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25

305 310 295 280 295 300 285

T ítu lo U A /m l

H oras 48

72

0 0 0

0 0

0 0

0 0

It It t t mt

It t t mt +

t t mt +

It It t t



96

24

1.100

b) Cobayos de 300 ± 20 g de peso, sanos y suspende al 0,5% en la misma solución. E sta concentración puede variar según las técnicas y bien alimentados.. los virus a identificar. e) Solución salina: NaCl 0,15 M. b) L íquido hem oaglutinante: proviene de d) Tubos cónicos anchos y cortos (20 x 40 medios de cultivo, líquido amniótico, líquido mm) para la mezcla de la toxina y antitoxina. alantoideo de embriones de pollo infectados, e) Pipetas de 1 ml, 2 ml y 5 ml. etcétera. f) Jeringas hipodérmicas 5 ml, agujas 25/6. c) Tubos de hemólisis. d) Pipetas de 1 ml. Método de valoración e) Solución salina fosfatada: NaCl 0,15 M, Es similar al indicado para la valoración de fosfatos 0,01 M, pH 7,2. toxina, con la diferencia que lo desconocido, en este caso, es la antitoxina (véase cuadro, arri­ Método ba). Preparar con el líquido hemoaglutinante d i­ luciones que van de 1:20 a 1:5.120, usando so­ lución salina fosfatada como diluyente. R epar­ HEMOAGLUTINACIÓN POR VIRUS tir las diluciones en una serie de tubos de h e ­ Y NEUTRALIZACIÓN mólisis a razón de 0,5 ml por tubo. Añadir a to­ DE HEM OAGLUTINACIÓN» dos los tubos 0,5 ml de la suspensión de hem a­ N um erosos virus tienen la propiedad de tíes, agitar y dejar a temperatura ambiente por aglutinar hematíes sobre los que se han fijado. 90 minutos. El título hemoaglutinante estará dado po r la Asimismo, los sueros que contienen anticuer­ pos antivirales inhiben específicamente la he- máxima dilución aglutinante. moaglutinación. Los dos fenómenos, son de uso corriente en Inhibición de hemoaglutinación virología. El primero, para detectar la presencia de un virus en un medio de cultivo, y el segun­ M aterial necesario do, para establecer un diagnóstico serológico a) Suero a analizar. Para eliminar inhibidores en el caso de una infección viral generadora de inespecíficos conviene calentar a 58°C durante anticuerpos específicos. 20-30 minutos. b) Líquido hemoaglutinante. Hemoaglutinación c) Suspensión de hematíes al 0,5% d) Tubos de hemólisis. M aterial necesario e) Pipetas de 1 ml. a) Glóbulos rojos: el poder aglutinante de un f) Solución salina tamponada. virus no se manifiesta sobre todos los glóbulos rojos, sino sobre los de determinadas especies. Método El virus de la influenza aglutina los glóbulos Efectuar diluciones seriadas del suero a an a­ rojos de pollo y humanos grupo 0; el de las pa­ peras, los de pollo, cobayo, camero y humanos; lizar en volúmenes de 0,25 ml, usando como di­ el de la poliom ielitis, los hum anos, etc. Su luyente solución salina fosfatada. Añadir a cada uno de los tubos 0,25 ml de líquido hemoaglutíelección dependerá del virus a investigar. Se los obtiene por punción venosa o cardía­ nante (4 unidades/0,25 ml). Mezclar, dejar en contacto 15 minutos y añadirles 0,5 ml de sus­ ca, y se los recoge en solución de Alsever. Para su uso se los lava v arias veces con pensión de hematíes al 0,5%. Dejar a tem pera­ NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2 y se los tura ambiente 1 hora y leer los resultados. ■

722

Metodologías

El título estará dado por la más alta dilución del suero capaz de inhibir la hemoaglutinación.

tos aparecerán los síntomas del “shock” anafiláctico. A nafilaxia local

ANAFILAXIA (ANTICUERPOS CITOTRÓPICOS)

A

A nafilaxia generalizada

l . Anafilaxia cutánea

A

M aterial necesario

c t iv a

M aterial necesario a) A ntígeno sensibilizante: se u tilizará el más apropiado. Es muy recomendable para fi­ nes demostrativos la ovoalbúmina purificada. b) Solución salina: NaCl 0,15 M. c) Jeringas hipodérm icas de 1 mi y agujas 25/ 6 para inoculaciones subcutáneas e intraperitoneales y 15/3 para inoculaciones intraveno­ sas. d) Tubos de ensayo, pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi. e) Cobayos. Son recomendables los albinos de la raza Hatíey, de 300 g de peso, por su ma­ yor sensibilidad para este tipo de ensayos. Método Preparar una solución de antígeno en solu­ ción salina (50 mg.ml) e inocular a cada coba­ yo 0,5 mi por vía subcutánea y 0,5 mi por vía intraperitoneal. Tres semanas después, desen­ cadenar, inoculando por vía intravenosa, 1 mi de solución antigénica al 5%. Si el animal esta­ ba suficientemente sensibilizado, presentará a los pocos m inutos los síntom as del “ shock” anafiláetico (véase cap. 32). Las venas más fácilmente abordables son las de las patas delanteras y traseras y la del pene. Con los debidos cuidados, la inoculación puede hacerse también por vía intracardíaca. P

a s iv a

M aterial necesario a) Suero sanguíneo proveniente de un animal activamente inmunizado. b) Cobayos no inmunizados. c) Los restantes materiales indicados en ana­ filaxia activa generalizada. Método Inocular los cobayos, por vía intravenosa, con 1-2 mi del suero inmune. Por la misma vía inocular 12-18 horas después, 1 mi (10 mg.ml) de la m ism a solución antigénica usada para sensibilizar al animal dador. A los pocos minu­

c t iv a

a) Animal activamente inmunizado (cobayo, ratón). b) Antígeno: solución al 0,01-0,02% en solu­ ción salina. c) Solución salina; NaCl 0,15 M. d) Solución colorante; azul de Evans al 0,51% en solución salina. e) Jeringas tipo tuberculina y agujas 15/5 pa­ ra las inoculaciones intradérmicas y 15/3 para las endovenosas. Método Rasurar los animales en la parte dorsal, pro­ curando no producir lesiones, las que inciden desfavorablemente en los resultados al producir extravasaciones no específicas del colorante. Inocular por vía intradérmica, en la zona ra­ surada, 0,1 mi de la solución antigénica. A una distancia no inferior a los 2 cm, inocular 0,1 mi de solución salina como control. Inm ediata­ mente después, inocular por vía intravenosa 0,5 mi de la solución colorante. Si la reacción es positiva, entre los 15-30 m i­ nutos, en el punto de inoculación del antígeno aparecerá una mancha azul cuya intensidad y tamaño dependerán del grado de sensibiliza­ ción del animal. La mejor manera de leer la reacción es sacri­ ficar al animal, quitarle la piel rasurada y ob­ servarla por transiluminación. En estos casos se pueden m edir muy bien los diámetros de las manchas del colorante, lo que permitirá expre­ sar los resultados en cruces según dicho diáme­ tro, a saber; Diámetro del. halo (cm)

Grado de positividad

0,5 1 1,5 2 m ás de 2

+ ++ + ++ ++++

-f

2. Des granulación de los mastocitos^^ M aterial necesario a) Animal activamente inmunizado (cobayo, ratón).

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos b) Antígeno: solución al 0,01-0,02% en solueión salina. c) Solueión salina: N aCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2. d) Solución fijadora: alcohol metílico 50 mi, agua 50 mi, ácido acético 3 mi. e) Solución colorante: tionina acuosa al 1%. f) Portaobjetos: placas de Petri. g) Pipetas de 1 mi y 5 mi. h) Pipetas Pasteur. i) Microscopio. Método Sacrificar los animales; con la mayor pulcri­ tud separar la serosa peritoneal y adosarla a los portaobjetos, los que son colocados en una pla­ ca de Petri. Cubrirlos con la solución antigéni­ ca y mantenerlos de preferencia a 4°C durante 20-30 minutos. V olcar el antígeno, lavar con solución salina tamponada y cubrir con el fija­ dor, previamente enfriado a 4“C. Se lo deja ac­ tuar durante 30 minutos, se lava con solución salina tamponada y finalmente se cubre eon el colorante durante 3 minutos. Se lava, se seca y se observa al microscopio. Deben incluirse siempre testigos sin antíge­ no. El resultado se expresa en p o rcentaje de mastocitos desgranulados, el que debe estable­ cerse co m o p ro m e d io de no m en o s de 2.0003.000 células contadas (fig. 32-10 cap. 32). P a s iv a

1. Anafilaxia cutánea^^ M aterial necesario a) Suero sanguíneo proveniente de un animal activamente inmunizado. b) Cobayos no inmunizados. c) Solución de antígeno al 0,2% en solución salina. d) El mismo material indicado en anafilaxia cutánea activa. Método Rasurar los cobayos en la parte dorsal e ino­ cularles 0,1 mi de diluciones del suero en ensa­ yo. Tres horas después, inocular por vía intra­ venosa 1 mi de una mezcla en partes iguales de solución antigénica y colorante. A los 15-30 m inutos leer los resultados, procediendo de igual modo al indicado en anafilaxia cutánea activa (fig. 32-11, cap.32).

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2. Desgranulación de los mastocitos M aterial necesario a) Suero sanguíneo proveniente de un anim al activamente inmunizado. b) Cobayos no inmunizados. c) El mismo material indicado en desgranu­ lación activa de mastocitos. M étodo Los portaobjetos conteniendo la serosa p eri­ toneal, preparados según las indicaciones espe­ cíficas en el método activo, se cubren con dilu­ ciones del suero a ensayar. Se los deja en con­ tacto 30 minutos, se lava con solución salina tamponada y se los cubre con el antígeno, con­ tinuando luego con la metodología indicada al hablar de desgranulaeión activa. Es necesario incluir testigos de suero, antíge­ no y solución salina. IN M U N O FLU O RESC EN C IA ^’M aterial necesario a) Antisueros marcados con el fluorocromo (isotioeianato de fuoresceína). Separar la frac­ ción globulínica del suero inmune por precipi­ tación con un volumen igual de solución satu­ rada de sulfato de amonio. Conviene añadir la solución salina sobre el suero, en un tiempo de 2 a 3 minutos, con mantenimiento constante de la agitación durante una hora, mediante el em ­ pleo de un agitador magnético. Centrifugar a 5.000 rpm durante 30 minutos, desechar el so­ brenadante y redisolver el precipitado en agua destilada, en un volumen igual a la mitad ini­ cial. Reprecipitar con sulfato de amonio y d i­ solver el precipitado en iguales condiciones a las indicadas en la primera precipitación. C olo­ car el precipitado en un tubo de celofán y d iali­ zar frente a solución salina tam ponada h asta reacción negativa de sulfatos en el líquido de diálisis, usando solución de cloruro de bario al 5% como reactivo indicador. La diáhsis debe hacerse a 4“C, con agitación constante (agita­ dor magnético), recambiando la solución salina cada 4 horas. Finalizada la diálisis, se valoran las proteínas totales por cualquiera de los métodos con o ci­ dos. Flallado este valor, se determina la canti­ dad de isotioeianato de fluoresceína a utilizar, la que debe estar en relación de 0,02 mg a 0,03 mg por ing de proteína. Para la marcación se diluye la solución p ro ­ teica en solución salina tam ponada hasta una concentración de 20 a 30 m g.m f' y se lleva a

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Metodologías

pH 9-9,5 con buffer de carbonato de sodio 0,5 fría. Agregar a la suspensión de tejido filtrado M (partes iguales de carbonato de sodio 0,5 M 4 voMmenes de acetona fría, agitar en agitador y bicarbonato de sodio 0,5 M). Las globulinas m agnético y centrifugar luego 10 m inutos a colocadas en un vaso de precipitación son lle­ 2.000 rpm. Filtrar por Buchner cubierto con pa­ vadas a heladera (4°C) y se las agita con agita­ pel de filtro embebido en acetona y lavar el te­ dor magnético. Se añade la fluoresceína en pe­ jido retenido con varios volúmenes de acetona queñas cantidades, no efectuando nuevos agre­ fría. Decantar el sobrenadante y repetir el lava­ gados hasta disolución del anterior, operación do con acetona otras cuatro veces. El material, que lleva de 3 a 4 horas. La agitación debe con­ al que se le ha eliminado el máximo de acetona por aspiración, es colocado en cajas de Petri o tinuar toda la noche. Otra manera de efectuar el marcado es colo­ recipientes similares y secado en estufa a 37°C. car la solución de IgG en una bolsita de celofán Si fuera necesario se lo puede triturar en morte­ para diálisis e introducirla en un recipiente con ro hasta transformarlo en polvo fino. Se lo con­ la cantidad adecuada de isotiocianato de fluo­ serva en heladera en frascos oscuros. resceína disuelta en el buffer de marcación. Se O tra m anera de resolver el problem a, que agita con agitador magnético a 4“C durante 18 perm ite obtener IgG conjugada con diferente horas. El produv-co de marcación, contenido en número de moléculas de isotiocianato de fluo­ la bolsa de diálisis, resulta más hom ogénea­ resceína, libres a su vez de IgG no conjugada, mente marcado que en el caso anterior. es el siguiente. Dializar el producto de conjuga­ La eliminación de la fluoresceína no conju­ ción frente a buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6. gada puede hacerse dializando la solución de El producto así obtenido se pasa por columna globulinas frente a solución salina tamponada o de D EA E-celulosa equilibrada con el mismo filtrando por Sephadex G-25, En este caso una buffer. A esa molaridad eluye la IgG no conju­ colum na de 1 X 30 cm que contenga 5 g de gada, la que de estar presente podría competir Sephadex resulta útil para la purificación de por masa y actuar como bloqueante. Por elucio­ 5-8 mi de solución conjugada. Como eluyente nes escalonadas con buffer de fosfatos 0,05 M, se usa solución salina tamponada. 0,1 M y 0,2 M se obtienen poblaciones de IgG Todo conjugado debe ser evaluado antes de que han fijado diferentes números de moléculas su uso para determinar la intensidad de la tin­ de isotiocianato de fluoresceína, ya que esta ción específica y la presencia y la cantidad de molécula aumenta la carga positiva del produc­ fondo o tinción inespecífica. Ello se determina to de conjugación. Cada pico eluido es concenm ediante reacciones de inm unofluorescencia , trado y analizado en cuanto a su capacidad de frente a patrones conocidos. unión al antígeno y a su tinción inespecífica. Un exceso de tinción inespecífica puede re­ Los eluidos con buffer de la más alta molari­ solverse a veces por simple dilución de conju­ dad corresponden a m oléculas de IgG m uy gado. En otras, es necesario adsorber con polvo marcadas con la sustancia fluorescente y pre­ de tejidos, generalmente de hígado. La canti­ sentan una tinción basal más elevada. Los reac­ dad a utilizar es aproximadamente 100 mg por tivos más eficientes generalmente son los que mi de conjugado a adsorber. La adsorción se eluyen con fosfatos 0,05 M, pH 7,6. hace a 4-5“C durante una hora, y después se se­ c) Solución tamponada: NaCl 0,15 M, fosfa­ para el sobrenadante por centrifugación. Gene­ tos 0,01 M ,p H 7 ,2 . ralm ente con dos adsorciones se consigue el d) Glicerina tamponada; a 9 partes de glice­ efecto deseado. rina neutra añadirle 1 parte de solución salina b) Polvo de tejido para adsorciones. Colocar tamponada llevada a pH 9 con carbonato de so­ una determinada cantidad de órgano (hígado de dio 0,5 M. ratones) en una licuadora y añadirle un volu­ e) M icroscopio para las lecturas: existen men igual de agua destilada enfriada a 4“C. Tri­ equipos especiales. No obstante, puede ser usa­ turar durante 5 minutos, centrifugar y volcar el do un microscopio común que posea condensa­ sobrenadante. Repetir la operación dos o tres dor de fondo oscuro y lárnpara de luz ultravio­ veces para eliminar hemoglobina. Trasvasar a leta para la iluminación. Esta debe contar con un vaso de precipitación, colocarlo sobre un filtros excitadores que dejen pasar solamente la agitador magnético previa introducción de la luz ultravioleta deseada, y el microscopio debe barra de agitación y añadirle cuatro volúmenes tener un filtro de bloqueo que impida la llegada de acetona fría. Agitar 5 minutos. Trasvasar a del exceso de luz al ojo del observador. tubos de centrífuga y centrifugar 10 minutos a 2.000 rpm. D ecantar el sobrenadante, añadir Método solución salina tamponada, mezclar y centrifu­ gar. Repetir la operación 3-4 veces hasta que el 1. Directo. líquido sobrenadante sea claro. Filtrar por do­ En este caso se emplea el anticuerpo especí­ ble gasa y lavar el residuo con solución salina fico marcado con el fluorocromo.

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos Sobre portaobjetos limpios y desengrasados liacer las im presiones del material a analizar, dejando secar a temperatura ambiente (aproxi­ m adam ente 30 m inutos). Introducirlos en un vaso de Coplin con acetona fría y dejarlos en heladera por un tiempo que puede variar entre 1 y 4 horas según el material a fijar. Para la tinción, escurrir los portaobjetos y dejar que tomen la temperatura ambiente. Cu­ brirlos con el anticuerpo marcado con el fluo­ rocromo, previamente diluido según su título y dejarlos en cámara húmeda 30-60 min a 37°C. Lavar con abundante solución salina tampona­ da para eliminar el ñuorocromo no fijado, en­ juagar rápidam ente con agua destilada, dejar escurrir y secar. Para la observación m icroscópica, m ontar previamente con glicerina tamponada. 2. Indirecto Para el método directo es necesario marcar cada anticuerpo específico. En el indirecto se hace actuar anticuerpo sin marca sobre el antí­ geno y sobre el complejo formado antigammaglobulina (contra la gammaglobulina de la es­ pecie animal de la que proviene el anticuerpo sin marca) conjugada con isotiocianato de fluo­ resceína. Tiene la ventaja de no necesitar un anticuerpo marcado para cada antígeno. Las impresiones del material antigénico so­ bre los portaobjetos se preparan de manera si­ milar al método directo. Se cubren con el anti­ cuerpo no marcado y se dejan en cámara húm e­ da a 37”C durante 30-60 minutos. Se lavan con solución salina tam ponada; se cubren con la antigammaglobulina marcada con isotiocianato y se dejan en cámara húmeda 30-60 minutos a 37"C. Se lavan con abudante solución salina tamponada y se enjuagan con agua destilada. Se dejan escurrir y secar y, previamente a la observación microscópica, se los monta en gli­ cerina tamponada (fig. 8-8, cap. 8). INMUNOENZIMOLOGÍA»»..^) Esta metodología puede usarse para analizar cortes de tejidos o improntas celulares, de un modo similar al que se hace por inmunofluo­ rescencia. Tiene la ventaja de que utiliza m i­ croscopía óptica común. Puede usarse también para investigar y dosar antígenos y anticuerpos previamente fijados a placas de poiiestireno. En este apartado sólo se describirá el método usado para estudios de cortes histológicos, ya que las otras aplicaciones del enzim oinm unoensayo, o ELISA, se describen en detalle en el capítulo 38.

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M aterial necesario a) Inm unosuero m arcado con peroxidasa. Los del comercio resultan útiles. b) Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6. c) 0.1'^0 en el buffer indicado en b). d) Irñprontas con el antígeno (cortes de teji­ dos, células, etc.) específico para los anticuer­ pos a investigar. e) Suero a analizar. f) Microscopio óptico común. Método a) Cubrir las improntas con el suero a anaUzar e incubar a 37°C por 15 minutos, en cám ara húmeda. b) Lavar y cubrir con antiinm unoglobulina m arcada con peroxidasa, convenientemente di­ luida (1:10 a 1:50), e incubar a 37“C durante 15 minutos. c) Lavar y cubrir con 1 ml del siguiente reac­ tivo: 3,3’ diaminobencidina. HCl 5 mg Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6 9 ml im l (preparar la mezcla en el momento de usar) Mantener a temperatura ambiente durante 20 minutos, lavar, secar y observar al microscopio. Los antígenos que han reaccionado con el correspondiente anticuerpo y la antiinmunoglo­ bulina marcada con peroxidasa toman colora­ ción pardusca. Los sueros marcados con peroxidasa pueden ser antiinmunoglobulinas totales o m onoespe­ cíficos. DETECCIÓN DE COMPLEJOS INMUNES 1. Dosaje de complejos inmunes usando fa cto r reumatoideo 19S monoclonal El método se funda en la interacción que tie­ ne lugar entre el factor reumatoideo IgM 19 S monoclonal y la IgG agregada. Si se utiliza fac­ tor reumatoideo marcado con se lo puede hacer com petir con factor 19 S frío y de esa manera llegar a determinar la IgG agregada (inmunocomplejo). M aterial necesario a) Buffer de unión: Tris HCl 0,075 M, E D ­ TA.N a, 0,01 M, seroalbúm ina bovina al 1%, pH 7,4." b) IgG agregada: disolver 600 mg de IgG comercial en 30 ml de solución salina tam po-

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Metodologías

nada (SST), pH 7,4. Calentar a 63°C por 20 m i­ bos y determinar las cpm en contador de radia­ nutos y centrifugar a 145.000 x g a 4“C durante ciones gamma. 1 hora. Suspender los sedimentos en 10 mi de Las muestras se analizan por duplicado. SST y homogeneizar con un homogeneizador Deben incluirse los siguientes controles: 1) de tejidos. Centrifugar a 600 x g durante 15 mi­ buffer de unión solo, sin muestra ni IgG agre­ nutos a 4“C, separar el sobrenadante y guardar­ gada y ‘^‘’I.FRm. Mide la unión no específica, lo en alícuotas a -70°C. Cuando se lo va a usar, que debe ser descontada de todos los tubos de descongelar y centrifugar a 600 x g por 15 mi­ reacción; 2) IgG-Sepharosa y '^T.FRm. Deter­ nutos. Cuantificar los agregados del sobrena­ mina 100% de unión. dante midiendo la concentración proteica por el El porcentaje de inhibición se calcula como método de Lowry. sigue c) IgG-Sepharosa: véase Fijación de proteí­ Cpm 100% de unión - cpm de la m uestra nas a Sepharosa activada con CNBr (cap. 41). % inhibición --------------------------------------------------------- x 100 d) Factor reumatoideo purificado (FRm): se cpm 100% de unión lo aísla de pacientes con enfermedades linfoproliferativas (artritis reumatoidea) o criogloLos resultados, comparados con la curva de bulinemias. calibración obtenida con diferentes concentra­ Si el factor reumatoideo es una crioglobuli- ciones de IgG agregada, perm ite expresar la na, se separa ésta del suero por enfriamiento a concentración de los com plejos inm unes en 4°C durante 24 horas. Se centrifuga, se lava concentraciones equivalentes de IgG agregada. eon SST y se la disocia con buffer de acetato 0,1 M, pH 4. Si la unión fuera muy fuerte usar 2. Determinación de complejos inmunes fija ­ glicina-FlCl 0,1 M, pFl3. Filtrar por columna dores de complemento p o r su interacción de Sephadex G-200 estabilizado con el mismo con células Raji buffer. E lu ir con el b u ffer de diso ciació n . El factor reum atoideo eluye con el volum en Las células Raji son una línea celular linfode exclusión (véase cap. 41). Los tubos que blastoide hum ana cultivada, derivadas de un contienen el FRm se juntan y dializan contra linfoma de Burkitt. Los complejos inmunes que SST, fijan el complemento se unen a los receptores Si el factor reumatoideo no es una crioglobu- de C lq , C3b y C3d que tienen esas células. Co­ lina, se lo aísla por cromatografía de afinidad mo carecen de receptores Fe, los complejos fi­ usando una columna de IgG-Sepharosa. Previo jados pueden detectarse eon un suero antigamlavado de la colum na con SST, se disocia el maglobulina. FRm por tratamiento con glicina-HCl 0,1 M, pH3, procediendo de inmediato a su neutraliza­ Material necesario ción con Tris y diálisis posterior frente a SST. Se lo conserva a -70°C. a) Medio esencial de Eagle: los cultivos de e) IgG radiomarcada con véase el capí­ células R aji se m antienen en el laboratorio tulo 41. por pasaje en medio esencial de Eagle suplementado. La composición de este medio es la siguien­ Método te: L-arginina 17,4 mg; L-cistina 6,0 mg; L-hisEn dos tubos de plástico de 10 x 75 mm co­ tidina 3,2 mg; L-isoleucina 26,2 mg; Lleucina locar, respectivam ente, 0,1 mi de buffer de 13,1 mg; L -lisina 18,2 mg; L -m etionina 7,5 unión y 0,1 mi de m uestra a ensayar diluida mg; L-fenilalanina 8,3 mg; L-treonina 11,9 mg; 1:10. En otra serie de tubos, colocar 0,1 de IgG L-triptófano 2 mg; L-tirosina 18 mg; L-valina agregada a la concentración de 200, 100, 50, 11,7 mg; L-glutam ina 146 mg; colina 1 mg; 25, 12 y 6 )i,g.mf' para confeccionar la curva ácido nicotínico 1 mg; ácido pantoténico 1 mg; de calibración. piridoxal 1 mg; riboflavina 0,1 mg; tiamina 1 Añadir 0,1 mi de ’^q.pRm (2 ¡ag.mf’; activi­ mg; inositol 1 mg; biotina 1 mg; ácido fóhco l dad específica 0 ,1 jiCi.mg^*)mg; glucosa 2.000 mg; NaCl 8.000 mg; KCl Mezclar en mezclador Vortex y añadir 0,25 400 mg; CaCl^ 140 mg; M g S o ,.7 H p 100 mg; mi de una suspensión de Ig G -S ep h aro sa al M g C L .ó H p 100 mg; N a,H P 0 ,.2 H 2 0 60 mg; 1,25%. Añadir 0,55 mi de buffer de unión, ta­ KHjPO^ 60 mg; NaHCOj 350 mg; rojo fenol par los tubos e incubar a temperatura ambiente, 20 mg; penicilina 0,5 mg; agua destilada hasta por 18 horas, con rotación. 1 litro. Centrifugar los tubos tapados a 200 x g du­ b) Suero de conejo anti-IgG humana: se ob­ rante 2 minutos, quitar los tapones y aspirar los tiene como se indica en el capítulo 37. La frac­ sobrenadantes. Lavar tres veces con NaCl 0,4 ción IgG del suero se marea en por el m é­ M, EDTA 0,1 M, pH 7,4. Volver a tapar los tu­ todo de la cloramina T (cap. 33). Se la diluye a

Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 1 mg.mf*; actividad específica alrededor de 3 x 10^ cpm.|i,g^'. Método Células Raji de 72 horas de cultivo (2x10'’ células en 200 |J,1 de medio) se transfieren a tu­ bos plásticos cónicos de 1,5 ml (Eppendorf). Añadir 1 ml de m edio mínim o de Eagle sin Ca^t ni Mg^+ y centrifugar a 800 x g durante 8 miriutos. Aspirar los sobrenadantes y resuspen­ der las células en 50 |0,1 del mismo medio. Aña­ dirles 25 |al del suero a ensayar diluido 1:4 en NaCl 0,15 M e incubar a 37"C por 45 minutos, agitando manualmente cada 5-10. Lavar las cé­ lulas tres veces con el medio de Eagle. Después del último lavado añadir la anti-IgG hum ana marcada con y dejar reaccionar a 4°C por 30 minutos, agitando cada 5 minutos. La antiIgG debe usarse a la dilución óptima, previa­ m ente determ inada, usando como diluyente medio mínimo de Eagle adicionado de albúmi­ na humana al 1%. Después de la incubación se lavan las células tres veces, se elimina el sobrenadante y se de­ termina la radioactividad del sedimento en un contador de radiaciones gamma. Deben incluirse testigos de medio de cultivo y células Raji, sin la muestra a anahzar, para determ inar la captación inesp ecífica de ra ­ dioactividad por las células Raji. Se calcula el porcentaje de radioactividad re­ tenida siguiendo el procedimiento indicado en valoración de inmunocomplejos con ‘^“’I.FRm. Con el dato obtenido, utilizando una curva de calibración preparada de igual manera que la indicada para la muestra en análisis, pero utili­ zando en este caso cantidades variables de IgG agregada mezcladas con suero humano normal diluido 1:2 (fuente de complemento), se deter­ mina la concentración de inmunocomplejos ex­ presados como IgG agregada. 3. D eterm inación de com plejos inmunes p o r precipitación con polietilenglicol (PEG) El PEG es un polímero no cargado, soluble en agua que añadido a un suero produce la precipitación de proteínas sin que éstas expe­ rimenten desnaturalización. Esta precipitación es en cierto modo dependiente de la concen­ tración y el peso m olecular de las proteínas presentes, las cuales en condiciones normales no p recipitan con concen tracio n es de PEG 6.000 inferiores al 4%. Los complejos inm u­ nes, dado el mayor peso molecular, son precipitables con PEG al 3% concentración final. El método, si bien práctico, presenta errores ya que todo agregado existente en el suero por valorar en el que no participan las inm unoglo­

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bulinas - o componentes proteicos de muy alto peso m olecular com o las m acro g lo b u lin as-, algunos componentes del sistema com plem en­ to o productos que participan en los fenóm e­ nos de la inflamación, pueden ser precipitados por PEG al 3%. No obstante ello, es un m éto ­ do que aún se sigue utilizando en los exám e­ nes rutinarios. M aterial necesario a) Polietilenglicol (PEG) 6.000 (Mr 6.000) al 6% en SST. Antes de usar filtrar por papel de filtro W hatman N° 1. b) NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M . pH 7,4. M étodo Mezclar volúmenes iguales de suero a anali­ zar y PEG 6.000 al 6%. Incubar 1 hora a A°C. Centrifugar a 1.000 x g a 4“C en centrífuga refrigerada, por 20 minutos. Rem over el sobrenadante y lavar el precipi­ tado con PEG 6.000 al 3% en SST. La valoración del precipitado obtenido p u e­ de hacerse por métodos nefelométricos o redisolviéndolo en NaOH 0,1 N y midiendo la ab­ sorbancia a 280 nm. Si se multiplica la D 0 2 8 0 x E l'tm de la IgG humana (12,3) x factor de dilución se obtiene el valor que permite ex p re­ sar la concentración de inm unocomplejos co­ mo IgG. 4. Valoración de complejos inmunes p or f i ja ­ ción a eritrocitos de pollo El método se basa en la capacidad que tienen los eritrocitos de los diferentes vertebrados de fijar, por intermedio de un receptor específico, el fragmento Fe de IgG agregado bajo la form a de complejo Ag-Ac. Los glóbulos rojos hum a­ nos no tienen receptores para Fe en su superfi­ cie y sólo los exponen después de tripsinización. Para el desarrollo del método los eritrocitos a usar serán los de pollo. M aterial necesario a) G lóbulos rojos de p o llo obtenidos de sangre heparinizada. Antes de su uso se los la­ va 5 veces con NaCl 0,15 M. b) Suero a analizar. Debe ser previam ente calentado a 56°C durante 30 minutos y cen tri­ fugado a 10.000 rpm durante 15 minutos. c) Suero anti-IgG hum ana. Se lo ob tien e por inoculación de IgG en conejos, de acuerdo con los planes de inmunización indicados en el capítulo 45. Antes de su uso se lo adsorbe con glóbulos de pollo.

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Metodologías

M étodo En una serie de tubos de hemólisis, se colo­ can 0,2 mi de diluciones crecientes, en razón 2, del suero a analizar y 0,05 mi de glóbulos rojos de pollo al 1%. Después de incubar a 4°C du­ rante 18 horas, observar los tubos para estable­ cer si hubo aglutinación directa. Los tubos no algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves­ tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e­ diante reacción de Coombs con suero anti-lgG. El título, en valores relativos, se expresa por la inversa de la máxima dilución del suero ca­ paz de dar una reacción de Coombs positiva cuando previamente ha sido incubado a 4“C du­ rante 18 horas. Por este método se puede detectar hasta 1 (ig de complejo inmune (expresado como Ac en el complejo), cuando los complejos existentes en el suero están en la relación M/M Ac/Ag = 3,8 o ligeramente superior. Los complejos forma­ dos en marcado exceso de Ag (relación M/M Ac/Ag = L8 o menor) no se fijan en los eritro­ citos. Cuando hay alta concentración de com ple­ jos, especialmente los formados por anticuer­ pos precipitantes, suele observarse aglutinación directa de los eritrocitos. BIBLIOGRAFIA 1. Oüá'm, y. CR A ca d Sci, 222 : \ \ 5 , 1946. 2. O u ch leú o n y,O -.P ro g ress in A lle r g y ,5 : \, 1958. 3. G ra b a r, P: W illia m s , C A : B io c h im B io p h y s A c ia , l():m, 1953. 4. Scheidegger, J J:/n í/S rc /i A//erg>>, 7.T03, 1055. 5. H eidelberger, M; K endall, FE: ./ E xper M ed, 65.■647, 1937. 6 . H eidelberger, M ; K endal, FE: J E xper M ed, 62:b91, 1935. 7. F a r a h , F S ; K e rn , M ; E is e n , N H . ./ E x p e r M e d , 7 /2 .T 1 95, 1960. 8. P au lin g , L; P ressm an , D; C am p b ell, D H ; Ik ed a, C: fkawa, M: J A m er Chem Soc 64:1994, 1942. 9. H eer, EE; M argni, RA: E lectro e inm unoelectrofore­ sis. G. Fernández, Ed. B uenos A ires, 1971.

9bisa. K ohn, J, R iches, PG: J Im m unol M ethods, 20: 365, 1978. 9bisb. P izzolato , M y col. J Im m u n o l M eth o d s, 2 6 :3 6 5 , 1979. 10. M argni, R A ; C ástrelo s, O D ; Paz, CB: Im m u n o lo g y, 24:1%\, 1973. 11. D iam ond, LK; A belson, N M :,/ L ab Clin M ed, 30:204, 1945. 12. L a n d ste in e r, K; W ie n e r A S: J E x p er M e d 7 4 :3 0 9 , 1941. 13. H uddieson, IF; A bell E:,/ Infecí D is, 42:242, 1928. 14. W right, AA; Sm ith, F: Lancet, 1:656, 1897. 15. N eter, E; C ohén, E; W estphal, O; L uderitz, O: .í Im m uno l,8 2 :» 5 , 1959. 16. Boyden, SV: , / & / ; e r M ed, 9J.T07, 1951. 17. S tavitsky, A B : I Im m unol, 72.-360, 1954. 18. J a n d l,JH ;S ira m o n s, R L :B r ííJ /to e m a í,5 .'1 9 , 19.57. 19. P ressm an, D; C am pbell, DH; Pauling, L: J Im m u n o l 4 4 : \0 \ , 1942. 20. Bulock, W E; K antor, FS: I Im m unol, 94:3X1, 1965. 20bis. A vram eos, S; Taudou, B; Chouillon, S: Im m unochem istry, 6:61, 1969. 21. H ira ta , A A ; B ra n d riss , M W : .1 Im m u n o l, 1 0 0 :6 4 1 , 1968. 22. O k o a ,L M : R ev Latinoam M icrobiol, 1 3 : 1 8 1 ,\9 1 \. 23. Lelchuk, R; Vacs, E; M argni, RA: Revista A so c A rg en t M icroh, 1:3, 1969. 2 3bis. R iches, D W H ; S tan w o rth , D R: Im m tm o l L etters, 1:363, 1980. 24. M arg n i, R A : L a b o ra to rio (G ran ad a, E sp añ a ), p ág . 501, 1967. 25. D iam ond, LK; D entón, RL: ,/ L ab Clin M ed, 3 0 :S 2 l, 1945. 26. M orton, JA; Pickies, M M : N ature, 159:119, 1947, 27. Coom bs, RR; M ourant, A E; Race, RR: Lancet, II; 15, 1945. 28. W iener, A S: P ro c S oc E x p er B iol, 5 6 : \1 3 , N Y ork; 1944. 29. Lepine, P; Sohier, R: Techniques de laboratories appliquées au diagnostic des m aladies á virus. M asson Ed. París, 1954. 30. M athov, E; G rinstein, M: Alergia, 26.-179, 1969. 31. O v a ry , Z: I n t A rc h A lle r g y A p p l Im m u n o l, .?.-293, 1952. 32. Coons, AH; K aplan, M H: .f Exper M ed, 91:1, 1950. 32bis. Prim us, J; W ang, RH: ./ Im m unol M ethods, 8:261, 1975. 33. N ota. NR; D iacopoulos-B riot, M; Stifel. C; B iozzi. G: C o m p tR e n d 259:1211, 1964. 33bis. M argni, RA ; P erdigón. G; M anghi, M; H ajos. SE: M edicina, 3 9 :]&3, 1979. 34. J e m e . N K ; N o r d in , A A : H e n r y . C : C e ll b o u n d a n tib o d y. W ista r In stitu te P ress. F ila d e lfia . p. 109. 1963. 35. D resser, DW ; W ortis. HH: N attire, 208:859, 1965.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

CLAUDIA MONGINl CLAUDIA WALDNER

IN T R O D U C C IÓ N El estudio del sistema inmune es de funda­ mental importancia ya que posibilita el enten­ dimiento y el control de varias enfermedades autoinmunes y de aquellas que directa o indi­ rectam ente afectan la respuesta inmune. Las metodologías descritas en este capítulo están dirigidas, a investigar las funciones inmunes en individuos normales y en pacientes con enfer­ medades congénitas o adquiridas. Además, los protocolos pueden ser aplicados al estudio de procesos infecciosos o de envejecimiento del sistema inmune, no sólo en seres humanos, si­ no también en modelos experimentales. La importancia de la evaluación funcional se fundamenta en el uso creciente de estas técni­ cas en el diagnóstico y en el monitoreo de pa­ cientes eon cáncer, SIDA, enfermedades au ­ toinmunes y de aquellos que recibirán un tras­ plante de órganos. Además, la utilización de agentes inmunomoduladores en la práctica clí­ nica y de modificadores de la respuesta bioló­ gica en experimentos clínicos, hacen necesario el empleo de técnicas confiables para el segui­ miento de las funciones del sistema inmune. En la actualidad, es posible medir un amplio es­ pectro de parámetros funcionales que van des­ de la activación, la proliferación, la síntesis de sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio­ nalidad de las células efectoras. La mayoría de las disfunciones del sistema inmune se tradu­ cen en la falta o depresión en uno o más de ps. tos parámetros. En la rama humoral de la respuesta inmune, mediada por linfocitos B, la producción de anti­ cuerpos inducida por inmunización o sensibili­

36 zación con un determinado antígeno, y la poste­ rior medición de los anticuerpos por ensayos cualitativos y cuantitativos, proveen inform a­ ción acerca de la respuesta de los linfocitos B como el resultado final de un ntiniero de eventos celulares independientes pero inteiTelacionados. En la ram a celular de la respuesta inm une m ediada por linfocitos T se realizan, com o pruebas funcionales, ensayos in vitro que son relativamente simples y de fácil reproducibili­ dad. Sin embargo, éstos no son indicativos de la suma de los fenómenos complejos observa­ dos en un individuo ya que utilizan poblaciones aisladas de linfocitos o subpoblaciones de célu­ las purificadas. Por el contrario, la prueba cutá­ nea de hipersensibilidad retardada es el único ensayo in vivo de la función de las células in­ m unocom petentes y puede proveer in fo rm a­ ción valorable acerca del estado inmune en su totalidad. La caracterización fenotípica de las células inmunes, así como la determinación del núm e­ ro de éstas, a menudo no ofrece información acerca de su actividad, porque el fenotipo celu­ lar frecuentem ente no se correlaciona con la funcionalidad de las células. El personal involucrado en la ejecución de las técnicas aplicadas en la evaluación de la in­ munidad celular, no sólo deberá estar capacita­ do para trabajar en las condiciones de esterili­ dad requeridas e indispensables para el cultivo de células, sino también estar familiarizado con las normas de bioseguridad. Es por ello que en primer lugar se detallan una serie de conceptos básicos que deberá conocer todo operador an­ tes de realizar las técnicas que se describen a continuación.

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Metodologías

M étodo En una serie de tubos de iiemólisis, se colo­ can 0,2 ml de diluciones crecientes, en razón 2, del suero a analizar y 0,05 ml de glóbulos rojos de pollo al 1%. Después de incubar a 4°C du­ rante 18 horas, observar los tubos para estable­ cer si hubo aglutinación directa. Los tubos no algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves­ tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e­ diante reacción de Coombs con suero anti-IgG. El título, en valores relativos, se expresa por la inversa de la máxima dilución del suero ca­ paz de dar una reacción de Coombs positiva cuando previamente ha sido incubado a 4“C du­ rante 18 horas. Por este método se puede detectar hasta 1 (ig de complejo inmune (expresado como Ac en el complejo), cuando los complejos existentes en el suero están en la relación M/M Ac/Ag = 3,8 o ligeramente superior. Los complejos forma­ dos en marcado exceso de Ag (relación M/M Ac/Ag = 1,8 o menor) no se fijan en los eritro­ citos. Cuando hay alta concentración de com ple­ jos, especialmente los formados por anticuer­ pos precipitantes, suele observarse aglutinación directa de los eritrocitos. BIBLIOGRAFIA L Oüá'm, y. CR A ca d Sci, 222:115, 1946. 2. O u ch leú o n y,O -.P ro g ress in A lle r g y ,5 : \, 1958. 3. G ra b a r, P: W illia m s , C A : B io c h im B io p h y s A c ta , l():m, 19.‘i3. 4. Scheidegger, J J:/n í/S rc /i A//erg>>, 7.-103, 1055. 5. H eidelberger, M; K endall, FE: ./ E xper M ed, 65.■647, 1937. 6 . H eidelberger, M ; K endal, FE: J E xper M ed, 62:b91, 1935. 7. F a r a h , F S ; K e rn , M ; E is e n , N H . ./ E x p e r M e d , //2 .T 1 9 5 , 1960. 8. P au lin g , L; P ressm an , D; C am p b ell, D H ; Ik ed a, C: fkawa, M: J A m er Chem Soc 64:1994, 1942. 9. H eer, EE; M argni, RA: E lectro e inm unoelectroforesis. G. Fernández, Ed. B uenos A ires, 1971.

9bisa. K ohn, J, R iches, PG: J Im m m o l M ethods, 20: 365, 1978. 9bisb. P izzolato , M y col. J Im m u n o l M eth o d s, 2 6 :3 6 5 , 1979. 10. M argni, R A ; C ástrelo s, O D ; Paz, CB: Im m u n o lo g y, 24:1%\, 1973. 11. D iam ond, LK; A belson, N M :,/ L ab Clin M ed, 30:20A, 1945. 12. L a n d ste in e r, K; W ie n e r A S: J E x p er M e d 7 4 :3 0 9 , 1941. 13. H uddleson, IF; A bell E:,/ Infect D is, 42:242, 1928. 14. W right, AA; Sm ith, F: Lancet, 1:656, 1897. 15. N eter, E; C ohén, E; W estphal, O; L uderitz, O: J Im m uno l,8 2 :» 5 , 1959. 16. Boyden, SV: ,/& /) e r M e d , 9J.-107, 1951. 17. S tavitsky, A B : J Im m unol, 72.-360, 1954. 18. J a n d l,JH ;S ira m o n s, R L :B r ííJ /7 a e m a í,5 .'1 9 , 19.57. 19. P ressm an, D; C am pbell, DH; Pauling, L: J Im m u n o l 4 4 : \0 \ , 1942. 20. Bulock, W E; K antor, FS: J Im m unol, 94:311, 1965. 20bis. A vram eos, S; Taudou, B; Chouillon, S: Im m unochem istry, 6:61, 1969. 21. H ira ta , A A ; B ra n d riss , M W : J Im m u n o l, 1 0 0 :6 4 1 , 1968. 22. O kon, L M: Rev Laíínoam M ícroft/o/, 75.-181, 1971. 23. Lelchuk, R; Vacs, B; M argni, RA: Revista A so c A rgeitt M icroh, 1:3, 1969. 2 3bis. R iches, D W H ; S tan w o rth , D R: Im m u n o l L etters, 1:363, ¡980. 24. M arg n i, R A : L a b o ra to rio (G ran ad a, E sp añ a ), p ág . 501, 1967. 25. D iam ond, LK; D entón, RL: ,/ L ab Clin M ed, 3 0 :S 2 l, 1945. 26. M orton, JA; Pickles, M M : N ature, 159:119, 1947, 27. Coom bs, RR; M ourant, A E; Race, RR: Lancet, II; 15, 1945. 28. W iener, A S: P ro c S oc E x p er B iol, 56:1 1 3 , N Y ork; 1944. 29. Lepine, P; Sohier, R: Techniques de laboratories appliquées au diagnostic des m aladies á virus. M asson Ed. París, 1954. 30. M athov, E; G rinstein, M: Alergia, 26:119, 1969. 31. O v a ry , Z: I n t A rc h A lle r g y A p p l Im m u n o l, .?.-293, 1952. 32. Coons, AH; K aplan, M H: .1 Exper M ed, 91:1, 1950. 32bis. Prim us, J; W ang, RH: ./ Im m unol M ethods, 8:261, 1975. 33. N ota, NR; D iacopoulos-B riot, M; Stifel, C; B iozzi, G: C o m p tR e n d 259:1211, 1964. 33bis. M argni, RA ; P erdigón, G; M anghi, M; H ajos, SE: M edicina, 3 9 : U 3 , 1979. 34. J e m e , N K ; N o r d in , A A : H e n r y , C : C e ll b o u n d a n tib o d y. W ista r In stitu te P ress. F ila d e lfia , p. 109, 1963. 35. D resser, DW ; W ortis, HH: N attire, 2 0 8 :S59, 1965.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

CLAUDIA MONGINl CLAUDIA WALDNER

IN T R O D U C C IÓ N El estudio del sistema inmune es de funda­ mental importancia ya que posibilita el enten­ dimiento y el control de varias enfermedades autoinmunes y de aquellas que directa o indi­ rectam ente afectan la respuesta inmune. Las metodologías descritas en este capítulo están dirigidas, a investigar las funciones inmunes en individuos normales y en pacientes con enfer­ medades congénitas o adquiridas. Además, los protocolos pueden ser aplicados al estudio de procesos infecciosos o de envejecimiento del sistema inmune, no sólo en seres humanos, si­ no también en modelos experimentales. La importancia de la evaluación funcional se fundamenta en el uso creciente de estas técni­ cas en el diagnóstico y en el monitoreo de pa­ cientes con cáncer, SIDA, enfermedades au ­ toinmunes y de aquellos que recibirán un tras­ plante de órganos. Además, la utilización de agentes inmunomoduladores en la práctica clí­ nica y de modificadores de la respuesta bioló­ gica en experimentos clínicos, hacen necesario el empleo de técnicas confiables para el segui­ miento de las funciones del sistema inmune. En la actualidad, es posible medir un amplio es­ pectro de parámetros funcionales que van des­ de la activación, la proliferación, la síntesis de sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio­ nalidad de las células efectoras. La mayoría de las disfunciones del sistema inmune se tradu­ cen en la falta o depresión en uno o más de ps. tos parámetros. En la rama humoral de la respuesta inmune, mediada por linfocitos B, la producción de anti­ cuerpos inducida por inmunización o sensibili­

36 zación con un determinado antígeno, y la poste­ rior medición de los anticuerpos por ensayos cualitativos y cuantitativos, proveen inform a­ ción acerca de la respuesta de los linfocitos B como el resultado final de un ntímero de eventos celulares independientes pero inteiTelacionados. En la ram a celular de la respuesta inm une m ediada por linfocitos T se realizan, com o pruebas funcionales, ensayos in vitro que son relativamente simples y de fácil reproducibili­ dad. Sin embargo, éstos no son indicativos de la suma de los fenómenos complejos observa­ dos en un individuo ya que utilizan poblaciones aisladas de linfocitos o subpoblaciones de célu­ las purificadas. Por el contrario, la prueba cutá­ nea de hipersensibilidad retardada es el único ensayo in vivo de la función de las células in­ m unocom petentes y puede proveer in fo rm a­ ción valorable acerca del estado inmune en su totalidad. La caracterización fenotípica de las células inmunes, así como la determinación del núm e­ ro de éstas, a menudo no ofrece información acerca de su actividad, porque el fenotipo celu­ lar frecuentem ente no se correlaciona con la funcionalidad de las células. El personal involucrado en la ejecución de las técnicas aplicadas en la evaluación de la in­ munidad celular, no sólo deberá estar capacita­ do para trabajar en las condiciones de esterili­ dad requeridas e indispensables para el cultivo de células, sino también estar familiarizado con las normas de bioseguridad. Es por ello que en primer lugar se detallan una serie de conceptos básicos que deberá conocer todo operador an­ tes de realizar las técnicas que se describen a continuación.

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Metodologías

1. C O N SID ER A CIO N ES DE B IO SEG U R ID A D PARA TRABAJAR CON MATERIAL DE ORIGEN HUMANO SUSCEPTIBLE DE ESTAR INFECTADO El primer paso para trabajar eon material de origen humano es considerar cada muestra eon la que se trabaja como posiblemente infectada y por lo tanto potencialmente peligrosa. Es por ello que el personal que llevará a cabo los ex­ perimentos con muestras humanas debe estar entrenado en el manipuleo de muestras conta­ minadas eon agentes patógenos. En este senti­ do el profesional a cargo deberá instruir al per­ sonal acerca de los procedim ientos y de los m ateriales apropiados para trab ajar con las muestras así como los pasos a seguir para pro­ cesar los desechos provenientes del material posiblemente contaminado. A tal efecto, exis­ ten publicaciones editadas por organismos sa­ nitarios nacionales e internacionales (Biosafety in M icrobiological and Biom edical laboratories. NIH Publication #, 88-8395, U.S.; Normas de bioseguridad. VIH, el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana. Ministerio de Sa­ lud y Acción Social Secretaría de Salud, Bue­ nos Aires) en donde figuran la determinación precisa de áreas de trabajo, normas de trabajo p ara evitar la infección del o p erad o r y los agentes químicos y físicos a emplearse en la decontaminación. A continuación se enum eran una serie de normas básicas a seguir en el laboratorio donde se procesan muestras de origen humano. Estas reglas están destinadas primordialmente a pro­ teger al operador y a todas aquellas personas que, de una u otra forma, estarán en contacto con dichas muestras. Normas de protección del operador y manipulación del material 1. El operador debe utilizar guantes descartables. Si existe riesgo de salpicaduras deberá utilizar anteojos y barbijo. 2. Se debe evitar pipetear cualquier material de riesgo eon la boca, para ello se debe recurrir a los pipeteadores manuales o automáticos. 3. No se debe fumar, comer ni beber en los si­ tios en donde se maneja material de riesgo. Asimismo no se debe apoyar comidas ni be­ bidas sobre las mesadas de trabajo. 4. Se debe evitar el uso de elementos punzan­ tes y cortantes en la manipulación del mate­ rial. 5. Las agujas no deben ser dobladas ni coloca­ das en el capuchón. Estas serán colocadas en recipientes de plástico resistente, sella­ dos.

6. Debe evitarse el material de vidrio para la manipulación de la sangre, por este motivo debe ser transportada y/o centrifugada en tu­ bos de material plástico con tapa a rosca. Decontaminación del material 1. El material de vidrio o plástico deberá ser colocado inm ediatamente después del uso en una solución de lavandina extemporánea al 10% y permanecer en remojo durante 1824 h. 2. El material descartable contaminado, así co­ mo los coágulos, cultivos y otros materiales que puedan ser de riesgo deberán ser incine­ rados. Para ello deberán ser colocados en re­ cipientes de plástico eon tapas y depositarse en contenedores especiales, destinados para tal fin y correctamente rotulados. 3. Las agujas ya utilizadas serán incineradas previo a su descarte. 4. Las mesadas de trabajo deberán ser deconta­ minadas antes y después de realizar el traba­ jo. Con esta finalidad se pueden utilizar al­ cohol al 70®, lavandina al 10% u otro desin­ fectante apropiado. 2. AISLAMIENTO DE POBLACIONES CELULARES IN M U N O C O M PE T EN T ES Antes de realizar una purificación o el enri­ quecimiento de poblaciones celulares inmunocompetentes se deben considerar varios aspec­ tos: el órgano donde existe el mayor porcentaje de las células de interés, la accesibiUdad de di­ cho órgano (en general cuando se trabaja con seres humanos se utiliza sangre periférica), la menor contaminación con otras células, etc. Es por ello que resulta de gran importancia recor­ dar la distribución de las células pertenecientes al sistema inmune en la sangre y en los tejidos linfáticos secundarios (cuadro 36-1). 2.1. AISLAM IENTO DE CÉLULAS M ONONUCLEARES HUMANAS A PARTIR D E SANGRE PERIFÉRICA POR MEDIO D E GRADIENTES En la mayoría de las técnicas empleadas para el estudio de las células inmunocompetentes es ventajoso trabajar con las células mononuclea­ res sin la contam inación que representan los eritrocitos y los granulocitos. A diferencia de lo que ocurre con los eritrocitos, cuya presen­ cia no representa mayor problema, los granulo­ citos liberan sustancias tóxicas y por lo tanto es conveniente proceder a su separación. Si bien los nódulos linfáticos, las amígdalas y el bazo poseen una baja proporción de granulocitos y

M etodologías para la evaluación d e la s célu las in m u n ocom peten tes

731

Cuadro 36-1. Distribución de las poblaciones linfocitarias en los diferentes compartimientos P orcentaje del total de lirifocitos

Tipo celular

B azo

N odulos linfáticos

Sangre periférica

CM H clase 11; Inm unoglobulina

40-45

20-25

10-15

colaboradores

CD 3^ CD4+; C D 8 ^

50-60

50-60

50-60

citotóxicos

CD 3^ CD4 ; C D 8+

10-15

15-20

20-25

Receptor Fcy (CD16)

~ 10

F unciones

Linfocitos B

Linfocitos T

N atural killer

M arcadores fenotípicos

pueden ser utilizados directamente, la muestra de elección para obtener células mononucleares de seres humanos es, sin lugar a dudas, la san­ gre periférica por su accesibilidad.

2.1.1. Separación de células mononucleares mediante gradientes con Ficoll-Hypaque El método de elección para el aislamiento de las células m ononucleares a partir de sangre entera fue descrito originai'i ámente por Boyum (Boyum, 1968) y consiste en la separación de las células a través de un gradiente de FicollHypaque. El Ficoll es un polisacárido que pro­ duce la aglutinación de los eritrocitos logrando que éstos sedimenten más rápidamente y el Hypaque es una sustancia densa que, diluida apro­ piadamente, confiere a la mezcla la densidad requerida para la separación. El aislamiento de las células mononucleares se realiza teniendo en cuenta la diferencia de densidades que existe entre los elementos de la sangre. Los eritrocitos y los granulocitos p o ­ seen una densidad mayor que 1.077 g/ml y por lo tanto se ubicarán por debajo de la capa del gradiente de esa densidad, mientras que los mo­ nocitos, los linfocitos y las plaquetas, al ser m e­ nos densos, flotarán por encima (fig. 36-1). Las plaquetas serán separadas de las células mononucleares por medio de lavados sucesivos o por centrifugación a través de un gradiente de suero fetal bovino, que permite que las células mononucleares lo penetren pero no las plaquetas.

Materiales - Sangre heparinizada (5U de heparina sódica/ml de sangre). - Solución salina tamponada (SST). Ver apén­ dice al final del capítulo. “ Solución de Hanks libre de Ca+* y Mg+“^, a temperatura ambiente. Ver apéndice al final del capítulo.

~ 10

Solución de Ficoll-H ypaque. Preparar una solución de densidad 1,077 g/ml, agregando 64.0 g de Ficoll (PM: 400.000; Sigma cat. n° E4375); 99.0 g de diatrizoato sódico (Sig­ ma cat.n° S4506) y 0.7 g de NaCl para 1 li­ tro de solución. Filtrar a través de una m em ­ brana esterilizante de 0,22 [Xm y conservar a 4°C. Alternativamente se puede adquirir la so lu ció n de F ico ll-H ypa qu e de d en sid ad 1,077 g/1 (Sigma, Histopaque 1077-1 o P har­ macia 17-0840-02). - Suero fetal bovino (SFB), descomplementa­ do a 56°C durante 30 minutos. M edio RPMI completo adicionado con un 10% de SFB. Véase apéndice al final del ca­ pítulo. - Tubos cónicos de plástico para centrífuga de 15 o 50 mi.

Método 1. Diluir la sangre agregando un volum en de SST que deberá estar a temperatura am bien­ te. Alternativamente, en los casos en que in­ terese separar previamente el plasma, centri­ fugar la sangre a 900 x g, a temperatura am ­ biente, durante 10 minutos. Posteriormente recoger las células ubicadas en la interfase entre los eritrocitos y el plasma y resuspenderlas en 2 partes de SST. 2. Agregar cuidadosamente la solución de F i­ coll-Hypaque por debajo de la suspensión celular, o bien a un tubo que contiene la so­ lución de Ficoll-Hypaque agregar la sangre diluida por la parte superior con extrem o cuidado. La proporción de Ficoll-Hypaque usada dependerá de los volúmenes de traba­ jo: para un tubo de 15 mi se dispensarán 3 mi de Ficoll-Hypaque cada 7 mi de sangre diluida. Cuando se trabaja en tubos de 50 mi se agregarán 10 mi de F icoll-H ypaque y 40 mi de sangre diluida.

732

Metodologías

Centrifugación

Plasma diluido

Células mononucleares Ficoll-Hypaque

Células polimorfonucleares Glóbulos rojos

F ig. 36-1. Esquem a de la distribución de los elem entos de la sangre en un gradiente de Ficoll-H ypaque.

3. Centrifugar entre 20 y 30 minutos, a 900 x “g ” y sin usar el freno de la centrífuga. Los gradientes son dependientes de la temperatu­ ra, es por ello que se deberá mantener la mis­ ma entre 18 y 20°C durante la centrifugación. 4. Recoger la capa de células mononucleares que se encuentra en la interfase entre el Fícoll-H ypaque y el plasm a (fig. 36-1) cui­ dando de no arrastrar los eritrocitos que se encuentran en la parte inferior. Transferir las células a un nuevo tubo en el que se han dispensado 2 a 3 voMmenes de solución de Hanks por cada volumen de capa de células. 5. Lavar las células tres veces con exceso de solución de Hanks. ■ 6. Resuspender las células en medio RPMI com­ pleto. Contar y determinar la viabilidad celu­ lar por el método de exclusión del azul tripán. 2.1.2. Separación de granulocitos, células mononucleares y linfoblasíos a partir de sangre periférica o de cultivos celulares. Gradientes de Percoll Para determ inadas experiencias es conve­ niente separar las poblaciones celulares de la sangre o aislar células estimuladas (linfoblastos), de células no estiinuladas provenientes de cultivos celulares. En estos casos, la separación a través de un gradiente discontinuo de polyvinilpirrolidona, conocido com ercialm ente con el nombre de Percoll, ofrece un método senci­ llo y rápido. Usando esta técnica es posible ob­ tener los granulocitos en la interfase de la capa correspondiente a una densidad de 1.083, las células mononucleares en la de 1.077 y los eri­ trocitos, que se ubican en el fondo del tubo. Por otra parte, los linfoblastos se separan de las cé­ lulas sin activar por su diferencia de densidad.

los primeros flotarán por encima de la capa co­ rrespondiente a una densidad 1.065 y las célu­ las sin activar lo harán sobre la capa de 1.077. Materiales - Sangre heparinizada (5U de heparina sódica/m l de sangre) o una suspensión celular con linfocitos estimulados por medio de m i­ tógenos. Véase punto 2.4. - Percoll (Pharmacia, Uppsala, Suecia) - Solución salina tamponada (SST lOx), para ajustar la isotonicidad de la solución de Per­ coll. - M edio RPMI completo. Véase apéndice al final del capítulo. - Solución salina tamponada (SST). Ver apén­ dice al final del capítulo. - Tubos de centrífuga de 15 o 50 ml. - Pipetas Pasteur. Método 1. Preparar una solución isotónica de Percoll a partir de la solución stock de Percoll, agre­ gando 1 volumen de SST lOx por cada 10 volúmenes de solución final (para preparar 100 ml de solución isotónica de P ercoll agregar 10 ml de SST lOX y 90 ml de la so­ lución stock de Percoll). Esta solución de Percoll posee una densidad aproximada de 1,12 g/ml. 2. Mezclar la solución de Percoll con SST de forma tal de obtener la soluciones de dife­ rentes porcentajes. P ara la separación de granulocitos y de células mononucleares se req u ieren so lu cion es de P erco ll al 70% (densidad de 1.083) y al 60% (densidad de 1.077) mientras que para separar linfocitos

Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes

3.

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activados (linfoblastos) de células sin acti­ var se utiliza una solución de Percoll al 50% (1,065) y otra al 60%. Dispensar 3 mi de Percoll al 70% en un tu­ bo de centrífuga de 15 mi y sembrar, por en­ cima, 3 mi de Percoll al 60%, evitando resuspender las capas. Por últim o agregar, cuidadosamente, 8 mi de sangre diluida al medio con SST. En el caso de la separación de los linfo­ blastos se preparará un gradiente discontinuo con una capa inferior de Percoll al 60% y una superior de Percoll al 50%. Por sobre ésta colocar la suspensión celulai- de blastos (las células en el medio de cultivo donde se las estimuló durante 48-72 h con el mitógeno ad e c u a d o . R e fe rirs e al p u n to 2 .4 p a ra la descripción de cómo obtener linfoblastos). Centrifugar el gradiente a temperatura am ­ biente durante 20 minutos, a 900 x g. Sepa­ rar las células m ononucleares que se e n ­ cuentran por encima de la capa de Percoll al 60% y posteriormente los granulocitos de la interfase del Percoll 70%. Los linfoblastos se ubicarán en la interfase superior (sobre la capa de Percoll 50%) y las células sin activar flotarán sobre la capa de P ercoll 60% (fig. 36-2). Para el aisla­ miento de células activadas solamente, se puede preparar un gradiente con P erco ll 60% y recuperar la fracción celular obtenida en la parte superior del mismo. Lavar tres veces las células con exceso de SST. R esuspender las células en medio R PM I completo. Contar y determinar la viabilidad celular por el método de exclusión del azul tripán.

2.2. ENRIQUECIMIENTO EN POBLACIONES LINFOCITARIAS POR PASAJE A TRAVÉS DE COLUMNAS DE LANA DE NYLON El aislam iento de poblaciones linfocitarias es generalmente un requisito previo para su es­ tudio fenotípico o funcional. Los monocitos, junto con los linfocitos B, constituyen un 25% de la población mononuclear. Es por ello que para algunas determinaciones es necesario se­ parar la población Iinfocitaria T de la B, como es el caso en la tipificación de HLA de clase II o al realizar un cross m atch específico para linfocitos T y linfocitos B, previo a un tras­ plante. Uno de los métodos clásicos de enriqueci­ miento de poblaciones linfocitarias utilizando colum nas de nylon, fue descrito o rig in aria­ mente por Julius y colaboradores (Julius y col., 1973). Los linfocitos B y las células accesorias

733

Plasma diluido Blastos, monocitos, NK 1.065 Linfocitos 1.077 Granulocitos 1.090 Eritrocitos F ig. 36-2. E.squema de la di.stribución de los elem en to s de la sangre y de linfoblastos en un g radiente de Percoll.

como los macrófagos se adhieren preferente­ mente a la lana de nylon mientras que los lin­ focitos T no se adhieren o lo hacen pobrem en­ te y se recogen directamente. Los linfocitos B y los macrófagos pueden ser eluidos a co n ti­ nuación por medio de agitación. La técnica de la lana de nylon es la más usada para el enri­ quecimiento en linfocitos T a partir de las cé­ lulas mononucleares obtenidas de un gradiente de Ficoll-H ypaque. La ventaja que p o see es que no requiere de anticuerpos o complemento y es el método de elección en aquellas ocasio­ nes en las que se quiere separar linfocitos B y linfocitos T en gran cantidad a partir de bazo o nódulos linfáticos. Por otra parte, debe co n si­ derarse que las poblaciones celulares aisladas no son tan puras como las que se purifican por procedimientos específicos, como la elim in a­ ción de poblaciones por medio de la citotoxici­ dad mediada por anticuerpos y complemento o m étodos de inmunoplaqueo o panning. M ateriales - Lana de nylon esterilizada (véase apéndice al final del capítulo). - Jeringas de 10 o 20 mi. - M edio RPMI adicionado con 5% de SFB, RPMI-5 (véase apéndice al final del capítulo). - Agujas 19-G. - Tubos cónicos de plástico de 50 mi. - Suspensión de células mononucleares o b te­ nidas de sangre periférica por medio de un gradiente de Ficoll-Hypaque o esplenocitos, M étodo 1. A rm ar una colum na de lan a de nylon de acuerdo a la metodología especificada en el

734

Metodologías

apéndice. (El tamaño de la columna depen­ derá de la cantidad de células a sembrar: p ara sep arar h asta 1,5 x 10* célu las se aconseja usar una columna de 12 mi empa­ cada con 0,8-1,0 g de lana de nylon. Para cantidades entre 1,5 y 3,0 x 10* células se prefiere usar una columna de 20 mi con 1,6 a 2 g de lana de nylon, usando en ambos ca­ sos 15 a 20 mi de medio de cultivo para eluir las células). 2. Calentar el medio de cultivo a 37°C y man­ tenerlo en estas condiciones a lo largo del procedimiento. 3. Impregnar la lana de nylon con medio RPMl-5 tratando de elim inar las burbujas de aire atrapadas y compactar la columna con una pipeta estéril. Cerrar la parte superior de la colum na con parafilm y la inferior con una llave de tres vías y ana aguja de 19-G. Colocar la columna a 37°C durante 30 mi­ nutos, en una estufa gaseada con 5% de CO,. 4. Ajustar la suspensión celular libre de glóbu­ los rojos a una densidad de 7,5 x 10’ cél/ml en RPMI-5. 5. Eluir la columna completamente y sembrar en la parte superior la suspensión celular. Dejar drenar todo el medio y adicionar entre 0,5 y 1 mi de medio a 37°C. Cerrar la llave de tres vías y agregar 2 o 3 mi de medio. Cerrar la parte superior de la columna con parafilm. 6. incubar la colum na durante 45 minutos a 37°C en estufa gaseada con 5% de CO 2. 7. L lenar la colum na con m edio RPM I-5 a 37"C. Abrir la llave de tres vías e inmediata­ mente recuperar las células no adherentes (linfocitos T) eluidas en un tubo cónico de 50 mi. Agregar medio RPMl-5 adicional y recoger las células de los primeros 15 mi de medio eluidos a través de la columna. 8. Para obtener las células adherentes (linfoci­ tos B y macrófagos) agitar enérgicamente la columna con una varilla de vidrio estéril du­ rante 1 minuto y eluirlas rápidam ente con 20 mi de medio, en otro tubo cónico. 9. Centrifugar las células 10 minutos a 200 x g. Resuspender en la concentración adecua­ da y determinar la viabilidad celular por el método de exclusión dei azul tripán. Generalmente se recupera un 80 a un 90% de linfocitos T contaminados con un 10 a 20% de linfocitos B y macrófagos. 2.3. P U R IF IC A C IÓ N D E L IN F O C IT O S B, LIN F O C ITO S T Y SU BP O BLA C IO N E S T El método de inmunoplaqueo o panning, la purificación por selección negativa mediante la citotoxicidad específica dependiente de anti-

Cuadro 36-2. Marcadores de superficie de las células inmunocompetentes y de sus principa­ les contaminantes Tipo celular Linfocitos T colaboradores Linfocitos T citotóxicos Linfocitos B N atural killer M onocitos G lóbulos rojos

M arcador de superficie CD4 CD8 CD20 Inm unoglobulinas CD 16 CD14 C D Il glicoforinas

cuerpo-complemento y la técijica de aislamien­ to con partículas magnéticas, más recientemen­ te desarrollada, se fundamentan en la separa­ ción de las células de interés de aquellas no de­ seadas en base al reconocimiento de antígenos p re se n te s en la m em b ran a c e lu la r (cu ad ro 36-2), por parte de anticuerpos específicos. La separación celular puede ser por selec­ ción negativa cuando la población que se desea purificar carece del antígeno específico en su membrana. Por el contrario, en la selección po­ sitiva se aislará la población que expresa el marcador de interés. A continuación se detallan los marcadores de superficie de las principales clases de célu­ las inmunocompetentes y de las células conta­ minantes. 2.3.1. Aislamiento de linfocitos por medio de lisis específica mediada por anticuerpocomplemento La citotoxicidad dependiente de anticuerpocomplemento es una técnica utilizada, general­ mente, para depletar una población heterogé­ nea de células en donde una subpoblación es reconocida específicamente por un anticuerpo dirigido hacia un antígeno de la superficie celu­ lar. Este complejo antígeno-anticuerpo form a­ do en presencia de complemento lleva a la lisis. Puede ser utilizada como un paso preliminar de selección negativa o para eliminar células con­ taminantes de una población celular enriqueci­ da en una determ inada clase de células. Este protocolo presenta la ventaja de originar una población celular que no ha sido m anipulada por uniones antígeno anticuerpo y sus desven­ tajas son la pérdida de la población celular que se une al anticuerpo y el requerimiento de que el anticuerpo utilizado sea fijador de com ple­ mento. A continuación se detalla la técnica de puri­ ficación de la subpoblación de linfocitos T co­ laboradores (CD4+) por lisis específica de la subpoblación citotóxica (CD8+).

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes Materiales - M edio RPM I com pleto suplem entado con SFB al 1%, RPMI-1 (véase apéndice al final del capítulo). - Complemento de conejo con baja linfotoxicidad. - Suspensión de linfocitos T. - Anticuerpos monoclonales anti-CD8. - Tubos de centrífuga cónicos de plástico de 15 mi. Método 1. Determinar de antemano la dilución del an­ ticuerpo a utilizar por inmunofluorescencia o por citometría de flujo, asimismo, la con­ centración óptima de complemento que pro­ duce la máxima citotoxicidad específica y la mínima citotoxicidad no-específica. 2. En un tubo de centrífuga agregar una sus­ pensión de 1 X 10*’ - 1 X 10’ células y cen­ trifugar 10 minutos a 18-20°C y 400 x g. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en la dilución apropiada de anticuer­ po. 3. Colocar las células en un baño de hielo du­ rante 30 minutos. Centrifugar 10 minutos a 4°C y a 400 x g. Descartar el sobrenadante. 4. Resuspender las células en una concentra­ ción de 1 X 10'' cél/m l de la dilución del com plem ento en R PM I-1. Incubar 1 h a 37°C. Examinar una alícuota de la suspen­ sión celular para determinar la lisis celular. Si el tratamiento no hubiese resultado total­ mente efectivo repetir la incubación con el anticuerpo y el complemento. 5. Frenar la lisis agregando a la suspensión ce­ lular 10 mi de medio RPMI frío. Centrifugar 10 minutos a 4°C y 400 x g. Lavar 2 veces y resuspender las células en medio R PM l-1. 6. Determinar la viabilidad y el porcentaje de citotoxicidad según la siguiente fórmula: (N° cél. no v ia b le s )' % de citotoxicidad (C D 8"^) = -

X 100

(N° cél. viables + N “ cél. no viables)

7. Eliminar la células no viables por medio de un gradiente de Ficoll-Hypaque recuperan­ do las células viables que se encuentran en la interfase superior (las células no viables se ubicarán en el fondo del tubo). 2.3.2. Aislamiento de linfocitos por el método de inmunoplaqueo o panning La técnica de plaqueo en un comienzo fue desarrollada para la separación de los linfocitos

735

B de los linfocitos T (Mage y col., 1977; Wysocki & Sato, 1978; Mage et al. 1981). Puede ser utilizada ya sea como método positivo o ne­ gativo de selección celular. La pureza de las poblaciones celulares obtenidas es comparable con aquellas derivadas del citómetro de flujo. Además, esta metodología es superior a la téc­ nica de lisis por complemento ya que la pobla­ ción no seleccionada puede ser recuperada. En la técnica de plaqueo directa (fig. 36-3a), las células son separadas usando placas de po­ liestireno sensibilizadas con anticucipos espe­ cíficos unidos al plástico por medio de uniones no-covalentes. A continuación, las células que poseen en su superficie el antígeno determina­ do se unen a los anticuerpos específicos, m ien­ tras que las células que no los poseen son recu­ peradas por medio de lavados. Las células uni­ das pueden a su vez ser obtenidas cambiando las condiciones de la reacción: por el agregado de m ed io con a lta c o n c en trac ió n p ro te ic a (SFB) o por tratamientos mecánicos. L a des­ ventaja de necesitar grandes cantidades de .anti­ cuerpo purificado indujo al desarrollo de la téc­ nica de plaqueo indirecta. El método de plaqueo indirecto consiste en el tratam iento de las células con aiticuerpos, generalmente monoclonales, que reconocen es­ pecíficamente a los marcadores de las células. A la suspensión celular así tratada, se la incuba en placas previamente sensibilizadas con una anti-gamma globuhna específica para la espe­ cie utilizada para reconocer a las células. Las células que poseen en su superficie el anticuer­ po monoclonal serán fijadas a la placa quedan­ do libre la subpoblación que no fue reconocida. A continuación se describe, a modo de ejem ­ plo, la purificación de linfocitos T CD4+ y de linfocitos CD8+ por medio de la técnica de pla­ queo indirecta (fig. 36-3b). M ateriales - Anti-gamma globuhna de ratón purificada y adsorbida contra iminunoglobulina hum ana. - Anticuerpos monoclonales murinos específi­ cos para la población celular a purificar (anti CD8). - Solución salina tamponada (SST). Ver apén­ dice al final del capítulo. - Tris-Cl 0.05 M, pH: 9,5. - Suspensión enriquecida en linfocitos T por lana de nylón. - SST adicionada con 5% y 1% de SFB (SST5 o SST -1). - M edio RPMI completo. Ver apéndice al fi­ nal del capítulo. ~ Placas de Petri de plástico estériles de 15 x 100 mm. - Tubos cónicos de 15 mi.

736

Metodologías AgA g-

Placas sensibilizadas con anticuerpo específico para su marcador de superficie diferencial

Y

Selección positiva

Ag+

F ig . 36-3a. E squem a del fu n d am en ­ to de la técnica de inm unoplaqueo d i­ recta (Panning directo).

Selección negativa

Ag+

’fyy'P M étodo 1. A una placa de Petri adicionar 10 ml del antisuero anti-gamma globulina de ratón dilui­ do adecuadam ente (aproxim adam ente 10 |Xg/ml) en Tris-Cl 0,05 M, pH; 9,5. Incubar

durante 40 minutos a temperatura ambiente o 24 h a 4°C. (Las placas así sensibilizadas pueden ser conservadas durante 2 semanas a4°C). 2. En un tubo de centrífuga agregar 2-3 x 10’ células y centrifugar a 400 x g durante 10

Células- anticuerpo monoclonal específico para un m arcador de superficie determinado Placas sensibilizadas con anti-gama globulina

Selección positiva

Selección negativa

F ig . 36 -3 b . E squem a del fundam ento d e la técn ica de inm unoplaqueo in d i­ recta {Panning indirecto).

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

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minutos a 4°C. Descartar el sobrenadante y resuspender las células con la dilución del anticuerpo específico (anti CD8) deter­ minada de antemano por medio de una inmunofluorescencia o por citometría de fl u ­ jo. Colocar las células en hielo por 30 mi­ nutos. Agregar 5 mi de SST-5 y centrifugar 10 mi­ nutos a 400 X g en frío y lavar con SST-5. Resuspender las células en 3 mi de SST-5. Rem over la solución del antisuero de la placa de Petri usando una pipeta estéril y lavar tres veces con 10 mi de SST-5 agi­ tando suavemente cada vez. (El antisuero recuperado puede ser reutilizado.) Retirar completamente el líquido de lavado de la placa de Petri e inmediatamente agre­ gar la suspensión celular. A gitar suave­ mente e incubar durante 1 h a 4°C (a los 30 minutos, agitar suavemente durante 30 se­ gundos). R ecoger por aspiración la suspensión de células que no se han unido. Lavar 2 veces con 7 mi de SST-1, o hasta haber retirado todas las células no adheridas. Todos los pasos detallados en este punto deben ser realizados suavemente, colocan­ do la pipeta sobre un lado de la placa, de m anera tal de no desprender las células unidas específicamente (CDS*^). Despegar las células adheridas con una es­ pátula ad hoc o bien pipeteando enérgica­ mente 15 mi de SST-1. Examinar la placa en un microscopio invertido y colocar las células obtenidas en otro tubo de 15 mi. Centrifugar los tubos con las células adhe­ rentes y el de las células no adherentes a 4°C, durante 10 minutos a 400 x g. Resuspender en medio RPMI y determinar el grado de pureza por medio de inmunofluorescencia o citometría de flujo. Si se requiere un mayor grado de pureza repetir el procedimiento a partir del paso 3.

2.3.3. Purifícación de células por medio de técnicas inmunomagnéticas La purificación de poblaciones y subpobla­ ciones celulares por métodos inmunomagnéticos, a partir de una muestra heterogénea, ha si­ do desarrollada am pliam ente en los últim os años debido al grado de pureza de las muestras obtenidas (comparable al método de citometría de flujo), la reproducibilidad y la facilidad del manejo de muestras pequeñas o grandes. Esta metodología se fundamenta en una se­ paración física en un campo magnético, de las células unidas a un anticuerpo específico que se encuentra adherido a microesferas magnéti­ cas de poliestireno.

737

Al igual que en la técnica de plaqueo, se puede realizar una selección positiva o negati­ va de las células. En el caso de la inmunoseparación positiva, la separación de las partículas m agnéticas de las células es muy trabajosa, m ientras que la selección negativa ofrece un p ro ced im ien to muy sen cillo p ara p u rific a r grandes cantidades de células, por lo que se la prefiere. Además, uno o más anticuerpos nionoclonales pueden ser adheridos a las m icroes­ feras para la separación simultánea de varias poblaciones celulares contaminantes. Aislamiento inmunomagnético de linfocitos T p o r selección negativa M ateriales - Células mononucleares separadas a partir de sangre periférica por medio de un gradiente de Ficoll-Hypaque; o suspensión celular de bazo, de nodulos linfáticos, de tumores o de fluido peritoneal. - Anticuerpos monoclonales específicos para linfocitos B (CD20), monocitos (CD14), cé­ lulas NK (CD16) y glóbulos rojos (anti-glicoforinas). (Véase cuadro 36-2.) - Solución de Hanks libre de Ca++, adi­ cionada con 10% de SFB y buffer H EPES 10 mM (Hanks-10), ~ Microesferas magnéticas recubiertas con anti IgG de ratón obtenido en cabra (aproximada­ mente 7 microesferas por célula blanco; Dynabeds M-450, Dynal 11005 y 1 1006), - Aparato para la separación magnética (Dynal MPCI 12001 o Advanced Magnetic 41025). - Tubos de polipropileno de 15 mi. Método Importante: todos los pasos a seguir debe­ rán ser realizados a 4°C para minimizar fen ó ­ menos de capping y el desprendimiento de los anticuerpos de la membrana celular. 1. D eterm inar la concentración saturante de anticuerpos monoclonales por medio de inm unofluorescencia o citom etría de flu jo . Generalmente se logra con una concentra­ ción de 1 |ig/ml. 2. Resuspender las células en una concentra­ ción de 2 X 10’ cél/ml de H anks-10. 3. Agregar 1 mi de la solución de la mezcla de anticuerpos cada 10 mi de suspensión celu­ lar. Incubar 30 minutos a 4°C con agitación continua (6 a 10 rpm) para evitar que las cé ­ lulas sedimenten. 4. Lavar 2 veces las células con Hanks-10 cen­ trifugando en frío a 150 x g, durante 10 m i­ nutos. Resuspender las células en 10 mi de

738

5.

6. 7.

8.

Metodologías

Hanks- IO frío y transferirlas a un tubo nue­ vo. A gregar 4 x 10® m icroesferas (Im l de la suspensión comercial) para 2 x 10® células mononucleares totales y lavar con Hanks10. Colocar el tubo de forma de orientar las partículas en una cara del tubo y aspirar el medio con una pipeta colocada en el fondo del tubo. Repetir la operación y resuspender las microesferas en 1 ml de H anks-10. Agregar la suspensión de microesferas a la suspensión celular y agitar suavemente (6 a 10 rpm) 1 h a 4°C. Separar las células marcadas con los anti­ cuerpos monoclonales unidos a las microes­ feras m agnéticas colocando el tubo en un campo magnético. Después de 5 minutos, transferir las células no marcadas a un tubo nuevo y repetir el procedimiento. Contai' las células y resuspenderlas en H an k s-10 en una concentración de 2 x 10’ cél/ml. Repetir los pasos 4 a 7 en los casos en que se requiera un mayor grado de pureza.

2.4. O BTE N C IÓ N D E L IN F O B L A ST O S M ateriales - Suspensión de esplenocitos o de células mononucleares. M edio RPM I com pleto suplem entado con SFB al 10% (véase apéndice al final del ca­ pítulo). - Frascos de cultivo de 75 cm^ (T75). - Solución de PHA o Con A para linfocitos T y solución de Staphyíococcus A Cowan 1 pa­ ra linfocitos B (véase cuadro 36-5). NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. M étodo 1. Ajustar la suspensión celular en 5,0 x 10'’ cél/m l en m edio R P M I-10. A d icio n ar la concentración del mitógeno que estimula a la población linfocitaria en form a óptima, previamente determinada por medio de un ensayo linfoproliferativo. 2. Incubar las células a 37°C en estufa gaseada con 5% de CO^, durante 48-72 h. 3. Centrifugar las células a 900 x g durante 5 minutos. 4. R esuspender las células en m edio RPM I completo. Contar y determinar la viabilidad celular por el método de exclusión del azul tripán.

OBTENCIÓN D E ESPLENOCITOS M U R IN O S 2 .5 .

M ateriales - Ratones de una cepa determinada, entre 6 se­ manas y 6 meses de edad. - Alcohol 70°. - Solución de Hanks o medio de cultivo RPMI co m pleto suplem entado con 5% de SFB (véase apéndice al final del capítulo). ~ Malla de acero inoxidable o de nylon de 200 |jm .

- Material de cirugía estéril. M étodo 1. Sacrificar los ratones por dislocación cer­ vical o inhalación de CO^. 2. C olocarlos en posición dorsal sobre una plantilla de disección. 3. Rociarlos con alcohol 70“. 4. Practicar la incisión adecuada para poner en descubierto el bazo, abriendo la cavidad peritoneal desde abajo h acia la cabeza. (Véase fig. 36-4.) 5. Cortar el bazo con pinza y tijera estéril en varios pedazos. Colocarlo en una placa de Petri y lavarlo con medio de cultivo. 6. Colocarlo sobre una malla de acero inoxi­ dable y triturarlo en fragmentos pequeños con una tijera de punta curva. Preparar un homogeneizado celular en medio de culti­ vo, por disgregación sobre la malla. Lavar la malla varias veces con medio de cultivo para desprender las células que hayan que­ dado adheridas. 7. Recoger la suspensión celular filtrada por la malla con una pipeta Pasteur y colocarla en un tubo cónico. 8. Dejar reposar 5-6 minutos para que sedi­ menten los grumos. 9. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g du­ rante 10 minutos. 10. Descartar el sobrenadante y lavar el sedi­ mento celular con medio de cultivo. 11. Resuspender las células en el medio ade­ cuado. Se recuperan aproximadamente 5-15 x 10’ células por bazo. N O TA : En general es aconsejable lisar los glóbulos rojos presentes en una suspensión de esplenocitos por medio de las metodologías de­ talladas en el apéndice antes de ajustar la con­ centración celular. No obstante, existen contro­ versias acerca de la conveniencia de eliminar los glóbulos rojos contaminantes presentes en la suspensión de esplenocitos cuando se reali­ zan pruebas funcionales.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

739

F ig. 36-4. Esquem a de la distribu­ ción de los órganos del ratón.

— Nodulo linfático axilar Nodulo linfático axilar lateral Hígado Bazo - Estómago Riñón _ Nódulo linfático inguinal superficial

Intestino—f

Nodulo linfático mesentérico

Nódulo linfático poplíteo

2.6. OBTENCIÓN D E CÉLULAS GANGLIONARES MURINAS Materiales - Ratones de una cepa determinada, entre 6 se­ manas y 6 meses de edad. - Alcohol 70“. - Solución de Hanks o medio de cultivo RPMI com pleto suplem entad o con 5% de SFB (véase apéndice al final del capítulo). - Malla de acero inoxidable o de nylon de 200 |im. - Material de cirugía estéril. M étodo 1. Sacrificar los ratones por dislocación cervi­ cal o inhalación de CO^. 2. C olocarlos en posición dorsal sobre una plantilla de disección. 3. Rociarlos con alcohol 70°. 4. Poner en descubierto los ganglios de la zona poplítea, inguinal o axilar y seccionarlos con pinza y tijera (fig. 36-4). 5. Transferirlos a una placa de Petri, lavar con medio de cultivo y extirpar cualquier resto de tejido extraño que pudiera estar adosado a los ganglios. 6. Lavar nuevamente con medio de cultivo y proceder a la fragmentación, el homogeneizado y la separación de las células como se indicó para el bazo. Se recuperan aproximadam ente 5-10 x 10^ células por ganglio. 2.7. OBTENCIÓN D E TIMOCITOS MURINOS M ateriales - Ratones de una cepa determinada, entre 3 y 6 semanas de edad.

~ Alcohol 70°. - Solución de Hanks o medio de cultivo RPM I co m p leto suplem entado con 5% de SFB (véase apéndice al final del capítulo). - M alla de acero inoxidable o de nylon de 200 ¡am. - Material de cirugía estéril. M étodo 1. En las preparaciones de timocitos debe ex­ cluirse a las células provenientes de la san­ gre. Para evitar esta contaminación, sangrar los animales a blanco a través def plexo retroorbital. Normalmente el ratón muere co ­ mo consecuencia de esta maniobra. Si así no ocurre, sacrificarlo por inhalación con CO^ y no por dislocación cervical pues ello p ro ­ duce muerte de células en el área tíniica. 2. C olocar al ratón en posición dorsal sobre una plantilla de disección. 3. Realizar una incisión, con ] mza y tijera, en la piel del cuello previamente i ociada con alcohol 70°. 4. Con cuidado poner en descubierto el tim o, extirparlo y colocarlo en una cápsula de P e­ tri . 5. Ehminar nodulos linfáticos y vasos, lavar el timo con medio de cultivo y luego disgre­ garlo en una malla de acero inoxidable. 6. Recoger la suspensión de células con pipeta Pasteur y colocarlas en un tubo cónico. 7. D ejar reposar 5-6 minutos para que se d i­ menten los grumos. 8. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g d u ­ rante 10 minutos. 9. D escartar el sobrenadante y lavar el se d i­ mento celular con medio de cultivo. 10. Resuspender las células en el medio ade­ cuado. Para la obtención de timocitos es convenien­ te usar ratones de 3 a 6 semanas ya que los an i­

740

Metodologías

males de mayor edad dan menores rendimien­ tos. Se obtienen aproximadamente 10-30 x 10’' timocitos por animal.

- Placas de Petri de plástico de 100 mm de diámetro, ~ SST-EDTA 0,02%.

2.8. OBTENCIÓN D E MACRÓFAGOS Y MONOCITOS

Método

1. 2.8.1. Obtención de macrófagos peritonea­ les de rató n : cuando se quieren obtener macró­ fagos peritoneales murinos es conveniente esti­ mular en el animal la producción de los mis- 2. 3. Materiales - Ratones de una cepa determinada. - Medio tioglicolato (Difeo), envejecido en la heladera por 2 a 3 meses. - Solución de Hanks (véase apéndice al final del capítulo). - Alcohol de 70”. - Materia] de cirugía estéril. Método 1. Inocular ratones intraperitonealm ente con medio de tioglicolato envejecido. Por cada ratón inocular 2-3 mi. 2. Recoger las células peritoneales, previa ino­ culación de 5 mi de solución de Hanks, cua­ tro días después de la estimulación con tio­ glicolato. Puede procederse también, sacrificando al animal por dislocación cervical, fijando lue­ go al ratón en una plantilla de disección. Frotar el abdomen con alcohol de 70°, in­ yectar intraperitonealm ente 5 mi de solu­ ción de Hanks y m asajear suavem ente el área abdominal. Efectuar Un corte en la piel correspondiente a la zona peritoneal baja y recoger la suspensión celular con pipeta Pasteur. 3. Centrifugar las células a 200 X g durante 10 minutos y lavarlas una o dos veces con solu­ ción de Hanks. El rendimiento es de 3-4,5 x 10’ células por ratón. 2.8.2, Separación de monocitos-macrófagos por adherencia al plástico Materiales - Células mononucleares aisladas por FicollHypaque o macrófagos murinos obtenidos por estimulación con tioglicolato, - Solución salina tam ponada (SST) (véase apéndice al final del capítulo). “ RPMI completo (véase apéndice al final del capítulo).

4.

5.

6. al

Ajustar las células, aisladas de sangre por el método de Ficoll-HypaCjue o las provenien­ tes del exudado peritoneal, a 2 x 10® cél/ml en RPMI. Añadir 10 mi de la suspensión celular en las placas de Petri. M antener las placas en incubación a 37°C en estufa gaseada con 5% de CO^, durante 60 minutos. Agitar las placas vigorosamente en forma manual, evitando derram ar el fluido, para separar los linfocitos no adherentes. Descar­ tar el medio que contiene las células no ad­ heridas. Lavar 2 veces con medio y agregar 10 mi de RPMI completo. Por este procedimiento, los linfocitos quedan en suspensión mientras que los macrófagos permanecen adheridos al fondo de la placa. Para remover las células adheridas a la pla­ ca, adicionar SST-EDTA 0,02% frío. Dejar 10 minutos y despegar las células golpeando enérgicamente la base de la placa. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mi y cen­ trifugar las células a 300 x g durante 10 mi­ nutos. Resuspender las células obtenidas en RPMI. La pureza conseguida generalmente excede 90%.

3. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS CÉLULAS QUE PARTICIPAN EN LA RESPU ESTA INMUNE. SU UTILIDAD EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES La determinación del número de linfocitos es uno de los métodos utilizados de rutina para el m onitoreo inm unológico de pacientes con deficiencias en su inmunidad celular. Por ejem­ plo: en personas afectadas por el virus de la inm unodeficiencia adquirida (HIV) decrece el porcentaje de linfocitos T CD4+. El análisis fenotípico de las células mononucleares de san­ gre periférica incluye marcadores para monoci­ tos, células NK, linfocitos T, linfocitos B y marcadores de activación T como por ejemplo: CD25 (receptor para IL-2) o HLA-Dr. Hace ya más de IO años, se realizó la primer mesa de trabajo internacional sobre antígenos de diferenciación de leucocitos humanos y sur­ gió una nomenclatura nueva para designar ti­ pos y subtipos de células. Se establecieron una serie de grupos denom inados CD, del inglés

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes clusters de diferenciación para definir antíge­ nos celulares (véase cap. 2). Los antígenos su­ perficiales forman parte del fenotipo de una cé­ lula. Aunque esta nomenclatura se empleó ori­ ginariamente para designcir antígenos de leuco­ citos humanos luego se extendió su uso a otros dpos celulares y especies. En el cuadro 36-3 se enumeran marcadores de los linfocitos T y de los linfocitos B. Actualmente, con el advenimiento de los an­ ticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos y del clasificador electrónico de células activado por fluorescencia (FACS), han ido de­ jándose de lado otras metodologías como las rosetas, para la determinación del número y del fenotipo de los hnfocitos. 3.1. LIN F O C IT O S F O R M A D O R E S D E R O SE T A S E SP O N T Á N E A S CON E R IT R O C IT O S D E C ARN ERO (R O SE TA S E) Los linfocitos T humanos tienen receptores para eritrocitos de cai'nero, denominados CD2. Cuando se m ezclan células mononucleares y glóbulos rojos de camero, éstos se unen a los linfocitos T portadores de los receptores CD2 formando rosetas, llamadas rosetas E. Es por ello que una de las maneras de identificar a los linfocitos T ha sido por su capacidad de unir glóbulos rojos de carnero y formar rosetas.

741

Esta metodología ha sido reemplazada por la detección del receptor CD2 utilizando anticuer­ pos monoclonales. Sin embargo, aún se utiliza para el aislamiento de linfocitos T a partir de células mononucleares. Las rosetas de linfocitos T y glóbulos rojos de carnero se separan de otras células mononucleares por centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque. Luego se aíslan las células T de los glóbulos rojos unidos en las rosetas por lisis hipotónica. A continuación se detallará la técnica de fo r­ mación de rosetas E para la detección de lin fo ­ citos T. M ateriales - Suspensión de mononucleares de sangre p e ­ riférica en RPMI-10 (1 x 10’ cél/ml), - Glóbulos rojos de carnero suspendidos en el medio Alsever. - M edio de cultivo RPMI suplementado con SFB al 10%, RPMLIO. (Véase apéndice al final del capítulo.) ~ Solución de Hanks. (Véase apéndice al final del capítulo.) - SFB inactívado I h a 56“C. M étodo 1. Lavar los glóbulos rojos de carnero con so­ lución de Hanks, mezclando 1 volumen de

C u ad ro 36-3. Principales marcadores de superficie de los linfocitos T y B Linfocitos T M olécula de superficie/m arcador

Linfocitos B

Fim ción

M olécula de superficie/m arcador

Fuñí ion

TC R (ap )* TC R (y8)*

R eceptor antigénico R eceptor antigénico

Inm unoglobulina* M oléculas del CM H clase II

R eceptor antigénico Interacción de LT h y LB

CD2* ( T ll,L F A - 2 ), receptor p ara glóbu­ los rojo,s de carnero [en hum anos]

M olécula de adhesión, activación de células T

C D 10 (C A LLA )

E ndopeptidasas asociada a m em ­ brana (enkefalinasa)

CD 3* (T3, Leu-4)

M olécula que form a parte del com plejo del TCR

C D 1 9 (B 4 )*

A ctivación o regulación de lin fo ­ citos B

CD4* (T4, Leu-3, L 3T4 [en ratónj)

M olécula de adhesión (CMH cla­ se 11) y transducción de señales

C D 2 0 (B 1 )*

A ctivación o regulación de lin fo ­ citos B

C D 8 * (T 8, Leu-2, Lyt-2 [en ratón])

M olécula de adhesión (CM H cla­ se 1) y transducción de señales

CD22*

A dhesión celular y activación de LB

C D 28* (Tp44)

M olécula eoestim ul adora en la ac­ tivación del LT

CD40*

A ctivación de LB inducida por contacto con LT h

CD35

R eceptor de C3b

CD35

R eceptor de C3b

^ M arcad o r e s p e cífico ** C D 2, p re sen te tam b ién en N K ;

C D 4, p re sen te tam bién en m o n o c ito s y m ac ró fa g o s hu m an o s.

742

2.

3. 4. 5.

Metodologías

glóbulos rojos y 9 volúmenes del diluyente. Centrifugar a 1000 x g durante 10 minutos. Repetir el procedimiento cinco veces. Resuspender el sedim ento g lobular en una concentración al 2% v/v en RPM I-10. Mezclar 0,25 mi de la suspensión de eritro­ citos con 0,25 mi de la suspensión de mononucleares e incubar en baño de agua a 37”C por 15 minutos. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos pa­ ra favorecer el contacto entre los glóbulos rojos y los linfocitos. Incubar a 4°C entre 2 a 16 h. R esuspender suavem ente y determ inar el número absoluto de rosetas E colocando go­ tas de la suspensión en una cámara de Neubauer. Observar al microscopio a 400 X.

Se consideran linfocitos T, form adores de rosetas E, a todas aquellas células que tienen adheridas a su superficie 3 o más eritrocitos. Se calcula el porcentaje determinando el número total de células presentes y el de aquellas que formaron rosetas. Una modificación de esta técnica fue utiliza­ da para identificar o separar subpoblaciones de linfocitos. Algunos linfocitos T y linfocitos B tienen receptores para Fe de inmunoglobulinas y/o receptores para C3b del complemento. Es­ tos linfocitos son capaces de unirse, a través de estos receptores, a eritrocitos recubiertos con anticuerpos específicos para un antígeno del glóbulo rojo o a glóbulos rojos sensibilizados con hemolisina en presencia de una fuente de complemento deficiente en C,, formando rose­ tas. El receptor para Fe se expresa en la mem­ brana de muchas células incluyendo, linfocitos B, linfocitos T (pequeña subpoblación), mono­ citos, macrófagos, granulocitos, plaquetas y cé­ lulas NK mientras que el receptor para C3b es­ tá presente en eritrocitos, neutrófilos, macrófa­ gos, eosinófilos, linfocitos T, linfocitos B y cé­ lulas dendríticas foliculares. Si bien la metodo­ logía es similar a la formación de rosetas E, es­ tas técnicas son inespecíficas para identificar linfocitos T o linfocitos B y han sido totalmen­ te dejadas de lado para tal fin. 3.2. IN M U N O F LU O R ESC E N C IA Los anticuerpos específicos para los antíge­ nos presentes en los linfocitos humanos, son reactivos indispensables para la identificación de estas células. En la década del ’60, se desa­ rrollaron metodologías sencillas para la marca­ ción de proteínas con reactivos fluorescentes, uno de los fluorocromos más comúnmente uti­ liz a d o es el is o tio c ia n a to de flu o re sc e ín a (FITC). Mediante las técnicas de inmunofluorescencia, que se detallan en el capítulo 35, se

pueden identificar células en suspensión o en cortes fijos de tejidos, disponiendo de un m i­ croscopio de luz ultravioleta. Los resultados se expresan en forma cualitativa o semicuantitativa como porcentaje de células positivas expre­ sando un determinado antígeno. 3.3. C ITO M E TRÍA D E FLUJO. SU U TILID AD E N LA D ETE C C IÓ N D E L F EN O TIP O C ELU LAR, LA C L A SIF IC A C IÓ N D E C ÉLU LAS Y E L A N Á L IS IS D E L A D N La tecnología de los clasificadores de células activados por fluorescencia se desarrolló en la década del ’70 con el propósito de disponer de métodos cuantitativos y para facilitar los estu­ dios de poblaciones de linfocitos que podrían ser identificados y clasificados sobre la base de la expresión de un antígeno determinado pre­ sente en la membrana de la célula, y luego ca­ racterizados funcionalmente. La determinación del número y la capacidad funcional de los leucocitos de sangre periférica de un individuo reflejan el estado íntegro de la inm unidad. Los linfocitos expresan diversos marcadores de superficie que pueden ser iden­ tificados por anticuerpos monoclonales, anti­ sueros policlonales o monoespecíficos. El uso de anticuerpos monoclonales junto con la cito­ metría de flujo permite definir el fenotipo celu­ lar de linfocitos discrim inando no sólo entre linfocitos T, linfocitos B y células NK sino también entre subgrupos de estas poblaciones. La citometría de flujo para determinar sub­ poblaciones de linfocitos humanos ha comen­ zado a ser muy útil en el diagnóstico y pronós­ tico de diversas situaciones clínicas, como el trasp lan te de órganos y de m édula ósea, el diagnóstico de leucemias y linfomas y la eva­ luación de inmunodeficiencias. Esta metodolo­ gía ha desplazado a las técnicas de inmunojluorescencia en la práctica clínica por ser más confiable, reproducible y sensible que la deter­ minación por microscopía. Los citómetros de flujo son instrumentos que analizan rápidamente células individuales m ar­ cadas con fluorocromos que fluyen a gran velo­ cidad en un medio líquido por delante de una fuente de excitación. Cada célula se evalúa se­ gún diversas características: forma, tam año, composición antigénica y bioquímica. Esta m e­ todología perm ite la identificación de subpo­ blaciones pequeñas en mezclas complejas de células por sus características de alta precisión y sensibilidad. Una propiedad im portante de estos aparatos consiste en poder discriminar la fluorescencia de los fluorocromos que emiten a diversas longitudes de onda. De esta forma, va­ rios marcadores presentes en la membrana de

Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes una célula (por ejemplo en linfocitos T: CD3, CD8) pueden ser detectados simultáneamente mediante el empleo de anticuerpos específicos conjugados a distintos fluorocromos, anti CD3 conjugado a FITC, anti CD8 conjugado a PE (véanse figs. 36-5b y 36-6). La citofluorom etría tam bién puede separar subpoblaciones de células de acuerdo a las ca­ racterísticas medidas. Las células que emiten señales fluorescentes predeterminadas pueden ser desviadas d iferencialm en te por cam pos electromagnéticos cuya intensidad y dirección varía de acuerdo a la intensidad de la señal de la fluorescencia medida. De esta forma, se pue­ den aislar poblaciones celulares en base al anti­ cuerpo, conjugado a un fluorocromo, unido a la superficie celular, obteniéndose las células se­ paradas en tubos colectores. Los instrumentos capaces de ¡•ealizar este tipo de clasificación electrónica de células se denominan clasifica­ dores de células activados por fluorescencia, conocidos por su denominación en inglés fluorescence-activated cell sorter (FACS). Un citóm etro de flujo analiza electrónica­ mente las señales generadas por células u otras partículas simples homogéneamente suspendi­ das cuando fluyen por delante de una fuente de luz. El flujo con la muestra que contiene las cé­ lulas es introducido bajo presión a través de otro flujo de líquido, denominado vaina, que puede ser agua o solución salina isotónica. De esta forma, las partículas se alinean y pasan a través de la fuente de luz en hilera. La fuente de luz, que es generalmente un haz de láser, pro­ vee la longitud de onda específica. La presencia de una célula en el camino del láser dispersa luz en todas las direcciones y excita a los fluorocro­ mos unidos a cada célula. Esta interacción per­ mite diversas mediciones de importancia bioló­ gica en las células. (Véase fig. 36-5.) Cuando una célula interacciona con el rayo láser, la luz dispersada es medida por detecto­ res orientados en forma ortogonal (SS) o frontal (FS) a la luz incidente (fig, 36-5a). Estos detec­ tores no son sensibles a la fluorescencia y se utilizan para discrim inar células (marcadas o no con fluorescencia) del detrito celular. Los parámetros medidos por estos detectores se co­ nocen por su denominación en inglés, forw ard scatter (FS) y side scatter (SS). Cuando se es­ tudian leucocitos, el FS indica el tamaño celu­ lar mientras que el SS se correlaciona con el contenido celular de gránulos. Otros detectores miden emisión de fluores­ cencia de una longitud de onda determ inada por medio de filtros ópticos instalados en el frente de los tubos fotomultiplicadores (véase fig. 36-5a), En un citómetro de flujo, la luz dispersada en un ángulo de 90° y la emitida por los fluoro­

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cromos conjugados a los anticuerpos unidos a las células son detectadas por un sistema amphficador denominado tubos fotomultiplicado­ res. Estos convierten la luz emitida en señales electrónicas que luego son transform adas y analizadas por una computadora que producirá los gráficos característicos. ^ 3.3.1. Detección de antígenos de linfocitos humanos por citometría de flujo Una de las principales aphcaciones de la ci­ tometría de flujo es la determinación del fenoti­ po de leucocitos circulantes y la tipificación de leucemias o linfomas (véase Aplicaciones d e la Inmunogenética al diagnóstico de leucemias y linfomas, desarrollado en el Anexo de este ca­ pítulo). El protocolo que se describirá fue d ise­ ñado para estudiar células humanas de sangre periférica por citometría de flujo. M ateriales - Sangre periférica entera, obtenida con an ti­ coagulante (EDTA o Heparina) y recogida en condiciones de esterilidad. - Anticuerpos monoclonales marcados con un fluorocromo. - Solución para Usar glóbulos rojos de T risCloruro de amonio (véase apéndice al final del capítulo) o H^O destilada estéril. - SST (solución salina tamponada) contenien­ do 0,1 % de azida (véase apéndice al final del capítulo). - Solución fijadora, paraformaldehído 1% en SST. - Tubos de centrífuga con fondo cóncavo, 12 X 75 mm (Falcon # 2052). N O T A : todos los reactivos y las m uestras deberán estar en condición de esterilidad. Método 1. Para cada muestra, mezclar en tubos de cen ­ trífuga de 12 X 75 mm, 100 ¡0,1 de sangre en ­ tera anticoagulada y 5-20 |xl de los anticuer­ pos monoclonales marcados. 2. Homogeneizar e incubar a temperatura am ­ biente 15 a 20 minutos en la oscuridad. 3. Lisar los glóbulos rojos con 2 mi de so lu ­ ción de lisis. Agitar en un vortex e incubar 5 minutos en la oscuridad. 4. Centrifugar a 200 x g, 5 minutos a 4°C y as­ pirar el sobrenadante. 5. Agregar 2 mi de SST conteniendo 0,1% de azida en cada tubo de reacción y agitar con un vortex. Centrifugar a 300 x g, 10 m in u ­ tos a 4°C. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado.

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Metodologías Detector de luz naranja Detector de luz roja

Detector de luz verde>

Detector de luz dispersada ortogonalmente

Fuente de rayo láser

Cubeta de cuarzo Detector de luz incidente frontal (FS) Fig. 36-5a. Esquem a de los com ponentes de un citóm etro de flujo.

6. Para fijar las células, resuspender cada sedi­ mento celular en un volumen final de 0 ,1 ml con paraformaldehído al 1% en SST azida, pH 7,4. Antes del análisis por citometría, agregar SST estéril llevando a un volumen final entre 0,6 y 1,0 ml. 7. Guardar las muestras en la oscuridad a 4°C (hasta 7 días) o analizarlas directamente en el citómetro de flujo. Controles - Células que no fueron marcadas para deter­ minar la autofluorescencia. ~ En el caso de una técnica de marcación di­ recta, se realiza un control con un anticuerpo conjugado irrelevante del mismo isotipo para determinar unión inespecífica, ~ En las técnicas de marcación indirecta, se tratan las células con un anticuerpo irrele­ vante del mismo isotipo y como segundo an­ ticuerpo, el conjugado utilizado en la reac­ ción. Estos controles son indispensables y opcio­

nalmente se puede realizar un control positivo (por ejemplo; células normales, células de lí­ neas caracterizadas). Representación gráfica de los resultados Los datos obtenidos en el análisis de pobla­ ciones celulares a través de un citofluorómetro se pueden representar en diversas formas, grá­ ficos de puntos o de contornos e histogramas, entre otros (fig. 36-6). En las figuras 36-6 a y 36-6b, se representan gráficam en te los parám etros obtenidos por FACS, correspondientes al tamaño y al conte­ nido de gránulos de las distintas poblaciones celulares presentes en una m aestra de sangre p eriférica hum ana norm al. Estos parám etros fueron representados por gráficos de puntos (fig. 36-6a) o de contornos (fig, 36-6b). En las figuras 36-6c-f, se grafican los datos obtenidos al analizar la expresión de uno o más marcadores fenotípicos de superficie en la mis­ ma población celular (figs. 36-6c y 6d y 36-6e y 6f, respectivamente).

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

745

F ig . 3 6 -5 b . D istrib u c ió n de las célu las p ara ser an a liz a ­ das en un citóm etro de flujo.

Rayo láser

C onsideraciones generales - Fluorocromos utilizados: en el cuadro 36-4 se indican la absorción y emisión máxima de los fluorocromos más comúnmente utiliza­ dos. - Autofluorescencia: es el resultado de la luz emitida por materiales intracelulares excita­ dos naturalmente a la longitud de onda utili­ zada para excitar a los fluorocromos unidos a las células. La mayor fuente de aiitofluo-

rescencia son células hematopoyéticas que se excitan a 488 nm y tienen un pico m áx i­ mo de emisión cercano a 560 nm, que in ter­ fiere en las mediciones de FITC y R-PE. Muestra a analizar: la muestra de elección para el estudio de células mononucleares h u ­ manas es sangre entera anticoagulada y p o s­ terior lisis de los eritrocitos, siguiendo la metodología descrita anteriormente. Cuando se trabaja con células de m édula ósea, es aconsejable realizar una separaciÓJi en g ra ­ dientes de Ficoll-Hypaque.

Cuadro 36-4. Emisión y absorción máxima de los principales fluorocromos utilizados en citom e­ tría de flujo Fluorocromo.':

A bsorción m áxim a (nm)

E m isión máxima (nm )

A) Fluorocrom os para conjugar anticuerpos Isotiocianato de fluoresceína (FITC) F icoeritrina B (B-PE) F icoeritrina R (R-PE) R ojo T exas (TXR) A loficocianina (APC) F icocianina C (CPC) Rojo 613 Peridinin C lorophyll (PerCP)

495 545/565 488/545/565 595 650 620 488/565/595 470

525 (verde) 575 (naranja) 578 (naranja) 62 0 (rojo) 660 (rojo) 648 (rojo) 613 (rojo) 680 (rojo)

340/530 345/530 492

620 (rojo) 605 520

B) Fluorocrom os para ácidos nucleicos Y oduro de propidio (Pl) B rom uro de etidio (EB) N aranja de acridina

746

Metodologías

~~ Técnicas de m arcació n : pueden utilizarse metodologías del tipo directa o indirecta, ex­ plicadas en las técnicas de inm unofluores­ cencia (cap. 35). - F ijación: este tratamiento es optativo y se realiza cuando las células no se analizan el mismo día de la marcación. Permite que la muestra se pueda guardar por 5 a 7 días sin una pérdida considerable de la fluorescencia. - V aloración de anticuerpos: la concentra­ ción óptima de anticuerpo se determina rea­ lizando una titulación del mismo frente a cé­ lulas conocidas positivas y se elige la con­ centración que produce la máxima respuesta. La titulación es importante ya que una canti­ dad subsaturante puede disminuir el porcen­ taje de positividad mientras que un exceso de anticuerpos puede resultar en aglutinación de las células y aum entar la fluorescencia in e sp e c ífic a . C o n sid eran d o que en cad a muestra a analizar hay aproximadamente 1 x JO® célu las, se agreg arán en tre 2,5 a 10 )j,g/ml de un anticuerpo monoclonal o 40 a 100 |ig/ml de anticuerpos polielonales para alcanzar la concentración saturante. Como las m oléculas de IgG se pueden unir a los receptores para Fe, expresados en la superficie de diversos tipos celulares, in­ dependientemente de su especificidad anti­ génica, es aconsejable utilizar anticuerpos preparados con fragm entos Fab o F (ab )j’. Otra forma para reducir las uniones inespe­ cíficas a los receptores de Fe, es bloquear los sitios de unión con un exceso de suero. 3.3.2. Clasificación de células La separación de células en citóm etros de flujo involucra el análisis y la clasificación de células individuales. El uso de esta metodología está limitado por el número total de células a separar. Conside­ rando que la velocidad de análisis y de clasifi­ cación de células es de aproximadamente 5.000 cél/segundo, no es conveniente utilizarla para obtener altas concentraciones de subpoblacio­ nes celulares (por ej., 2 x 10’). Los métodos al­ ternativos de separación de células, inmunopla­ queo, inmunomagnéticos y depleción mediada por complemento y anticuerpo, detallados ante­ riormente, tienen las ventajas de ser simples en su procedim iento, producir un m ayor rendi­ miento y lograr una pureza equivalente al clasi­ ficador electrónico de células. 3.3.3. Análisis del ADN y del ciclo celular por citometría de flujo El contenido de ADN de los núcleos celula­ res refleja el com plem ento de crom osom as

(CR) o ploidía y la fase del ciclo celular en la que se encuentran las células en estudio. Las células que proliferan atraviesan distintas fases del ciclo celular, las que fueron designadas G|, S (síntesis), G^ y M (mitosis). En las etapas de G^^ y G |, las células contienen una copia simple del ADN (2 CR). Dentro de una pobla­ ción de células en un determinado tiempo, la mayoría permanece sin dividirse, quiescentes o en Go (véase fig. 36-7) y preparándose para la síntesis del ADN (G,). Cuando las células co­ mienzan a proliferar entran en la fase S, duran­ te la cual se sintetizará un duplicado del ADN. En la etapa G^ las células contienen dos grupos de cromosomas (4 CR). La fase M termina con la división celular y cada célula contiene una cantidad normal de cromosomas (2 CR), deno­ minado euploidía o diploidía. Las células que contienen cantidades anormales de ADN, au­ m entado o dism inuido, se identifican como aneuploides. En general, las poblaciones celu­ lares aneuploides así como también las pobla­ ciones diploides pero con un alto grado proliferativo (SG 2/M) se correlacionan con un pronós­ tico peor en diversas enfermedades malignas. Lfna de las aplicaciones clínicas importantes del análisis por citometría de flujo es la evalua­ ción del contenido celular del ADN para deter­ minar ploidía y frecuencia de células en las dis­ tintas fases del ciclo celular. El contenido del ADN de una célula se estima por la unión estequiom étrica de un fluorocrom o al ADN nu­ clear. De esta manera, las células que estén en G , tendrán una cantidad doble del ADN y fluo­ rocromo que las células en G^. Esta metodolo­ gía se aplica en el diagnóstico de leucemias en seres humanos. Para la determinación del ADN y del ciclo celular por citofluorom etría, en el protocolo que se describirá, las células en suspensión son fijadas con etanol y se marcan con yoduro de propidio. Éste se intercala dentro de la do­ ble cadena de los ácidos nucleicos y puede ser excitado por un rayo láser de 488 nm, utiliza­ do comúnmente en los citómetros de flujo. Se u tiliz a la en zim a A R N asa que d e g rad a al ARN para que el yoduro de propidio sólo pue­ da unirse a la doble cadena del ADN intrace­ lu la r. L a unión del yo d u ro de p ro p id io al ADN incrementa la fluorescencia alrededor de 50 veces. El yoduro de propidio emite a 620 nm y por lo tanto, puede ser discriminada de la emisión de la fluorescencia del FITC (520 nm) en los citómetros de flujo. Esta propiedad permite co­ rrelacionar el contenido de ADN con la expre­ sión de un antígeno celular de superficie utili­ zando yoduro de propidio y un anticuerpo con­ jugado con FITC para marcar las células que serán analizadas.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes M ateriales - Células creciendo en suspensión o monocapa, de sangre periférica o de médula ósea. - Buffer muestra (glucosa al 0.1% en SST, fil­ trar por 0,22 |am y guardar a 4°C). Medio RPMI completo adicionado con SFB al 10%, R PM I-10 (véase apéndice al final del cap.). ^ Etanol al 70° a 0“C. - Solución madre de yoduro de propidio de 1 mg/ml (100 mg de Pl guardado en desecador en 100 mi de H^O, filtrar por 0,22 |am, con­ servar a 4°C protegida de la luz). El yoduro de propidio es un carcinógeno potencial, y se deben tomar precauciones en su manipuleo. - Solución de trabajo de yoduro de propidio: 0.5 mi de la solución madre de yoduro de propidio, 1000 unidades Kunitz de ARNasa (100 U /m l concentración final), 10 mi de buffer muestra. Realizar la mezcla en el mo­ mento de usarla, - Tubos de centrífuga de 15 x 75 mm. M étodo 1. Centrifugar las células en suspensión a 400 X g, a 4°C durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 10 a 12 mi de buffer muestra, lavar dos ve­ ces repitiendo el procedimiento y contar el número de células. A lternativam ente, las células podrían ser tratadas previamente con anticuerpos mono­ clonales para la detección de un antígeno superficial. Se aconseja utilizar como fluorocromo el FITC. 2. Ajustar la concentración a 1-3 x 10*’ cél/ml diluidas en buffer muestra dependiendo del citómetro de flujo. Pipetear 1 mi de la sus­ pensión celular en tubos de centrífuga. 3. Centrifugar las células a 400 x g durante 10 minutos, a 4“C. D escartar el sobrenadante con cuidado sin tocar el sedimento celular. 4. Agitar en vortex vigorosamente durante 10 segundos. Continuar la agitación en vortex y adicionar 1 mi de etanol al 70° frío, gota a gota, sobre el sedimento. Tapar los tubos y dejar las muestras fijándose en etanol, toda la noche a 4°C, para lograr una resolución máxima del ADN celular. Las células que han sido fijadas en etanol son estables por años a 4°C. Las muestras fi­ jadas pueden ser marcadas después de 18 a 24 h. 5. Preparar la solución de trabajo de yoduro de propidio. 6. Agitar la muestra en un vortex. Centrifugar 5 minutos, a alta velocidad (por ej. 2.000 x g).

747

D escartar el etanol sin tocar el sedimento. Verificar que haya un sedimento visible. En el caso contrario, volver a centrifugar a m a­ yor velocidad hasta que sea visible. 7. Agitar en un vortex para resuspender las cé­ lulas en el etanol residual. Adicionar 1 mi de solución de yoduro de propidio en cada tubo y agitar cuidadosamente. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante un tiempo superior a 30 minutos. Una agitación suave puede acelerar el proce­ so de marcación y asegurar la degradación de la doble cadena del ARN. La ARNasa es activa en etanol. 8. A nalizar las muestras en un citóm etro de flujo dentro de las 24 h. En la fig. 36-7, se muestra el histograma co ­ rrespondiente al análisis del ciclo celular de c é ­ lulas mononucleares obtenidas de sangre p e ri­ férica humana. Del gráfico surge que la m ayo­ ría de las células se encuentran en la fase G . 4. ESTU D IO DE LAS C A R A C T E R ÍSTIC A S IN M U N O LÓ G IC A S BÁSICAS DE LAS CÉLULAS QUE PARTICIPAN DE LA RESPUESTA INMUNE. PRUEBAS FUNCIONALES IN VITRO 4.1. E V A L U A C IÓ N D E LA A C T IV A C IÓ N L IN E O C IT A R IA La activación de los linfocitos, mediada p o r un antígeno o un estimulante policlonal, es un proceso caracterizado por una cascada com ple­ ja de eventos bioquímicos y moleculares que com ienza con la generación de los segundos mensajeros y culmina con la proliferación y el desarrollo de funciones efectoras. Los eventos tempranos de esta cascada incluyen la activa­ ción de tirosina quinasas, la hidrólisis de fosfo­ lípidos de membrana, el aumento de la activi­ dad de la Proteína quinasa C (PKC) e in cre­ mento del Ca^+ intracitoplasmático. Fastos s e ­ gundos mensajeros estimulan la transcripción de los genes requeridos para la proliferación y las funciones efectoras de las células. Diversos ensayos permiten la evaluación de eventos tempranos de la activación celular, ta ­ les como, aumento en la concentración de Ca^+ intracelular (Kammer, 1992), activación de la PKC (Kraft y col., 1982; LePeuch y col,; 1983) que ocurren en minutos o la síntesis de IL-2 y la expresión del IL-2R producidas a las 24 h o ­ ras. La detección de lL-2, se describirá en el punto 4.4.2.1 de este capítulo.

748

Metodologías 5 0 % Log

B

T P o lim o rfo n u cle a re s

M o n o cito s

CO

x: c < a)'0 3

d o

0) Tí R Vi 8 o13 ''

-L in focito s

C/3 200 400 600 800 1000 FSC-H/FSC-Height Tamaño Celular

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P o lim o rfo í - /'’ n u cle a re s

M o n o c ito s \ L in fo cito s

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O ^ 0 400 600^’^"«5cr 1000 FSC-H/FSC-Height Tamaño Celular ■

11 :/1/A007/FL1 -H/CD4 FITC

® S>.

FI1-H/CD4 FITC

10=*

lO-*

S

§ LL

FI1-H/CD3 FITC->

FI1-H/CD3 FITC

i F ig . 36-6. Representación gráfica de los parám etros obtenidos al analizar una suspensión celuhu- en un citóm etro de flujo, a y b . G ráficos de puntos y contornos que representan el contenido de gránulos y el tam año celular, SSC y FSC resp ecti­ vam ente, de células provenientes de una m uestra de sangre periférica hum ana, c y d. G ráfico de puntos e histogram a co ­ rrespondientes a la expresión del m arcador CD 4 en las células provenientes de una m uestra d e sangre periférica hum ana, e y f. G ráficos de puntos y de contornos correspondientes a la expresión de los inarcadores CD3 y C D 8 , determ inados si­ m ultáneam ente en las células provenientes de una m uestra de Sctngre periférica hum ana. (Estos gráficos fueron gentilm ente cedidos por la bioquím ica A na E scalada y el doctor A rgim iro R. Suárez.)

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

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Contenido de ADN celular 400

600

F ig. 36-7. H istogram a correspondiente al contenido del A D N de u n a població n de células m ononucleares humanas. (G rá ­ fico gentilm ente cedido p or la bioquím ica A na Escalada y el doctor A rgim iro R. Suárez).

4.2. E V A L U A C IÓ N D E LA P R O L IF E R A C IÓ N LIN F O C IT A R IA I N VITRO La interacción entre el receptor de membra­ na de un linfocito y su ligando específico de­ sencadena señales de activación intracelulares, que en la mayoría de los casos llevan a la divi­ sión celular. La capacidad de los linfocitos para responder in vitro a un estímulo es la respuesta más simple y conveniente de ser evaluada en investigación y en estudios clínicos. La respuesta proliferativa puede incluir a las poblaciones linfocitarias T, B o ambas. Una lis­ ta parcial de los ligandos que pueden iniciar la división celular de los linfocitos incluye a: los mitógenos extraídos de plantas (fitohemaglutinina, PHA; concanavalina A, Con A y el mitógeno de la fitolaca, PWM), productos bacteria­ nos {Staphylococcus aureus Cowan 1), antíge­ nos ubicuos que activan a linfocitos de mem o­ ria {Candida albicans, toxoide tetánico, etc), linfocitos alogeneicos, citoquinas y anticuerpos m onoclonales específicos para receptores de superficie (CD3 o CD2). En el cuadro 36-5 se enumeran los activadores más comunes de los linfocitos humanos y los rangos de dosis en que se utilizan. Los mitógenos PHA y Con A son capaces de estimular a los linfocitos T maduros incluidos los CD4 y CD8 (a/p) y también los CD3+(y/6).

Estas lectinas se unen a la porción de azúcares de las glucoproteínas expresadas en la superfi­ cie de las células T y de las células presentado­ ras de antígeno conduciendo a la activación p o ­ liclonal de los linfocitos. Los linfocitos T aisla­ dos no responden al estímulo antigénico o mitogénico ya que necesitan la presencia de célu ­ las presentadoras de antígeno. La estimulación de las células mononuclea­ res de sangre periférica mediada por el PW M es una m-'dida de la funcionalidad de los lin fo ­ citos T y de la sensibilidad de los linfocitos B. Los linfocitos B puros.no responden al PW M porque necesitan que los linfocitos T activados secreten linfoquinas para poder diferenciarse en células plasmáticas. Las enterotoxinas de los Staphylococcus son mitógenos potentes para los linfocitos T y el Staphylococcus aureus Cowan 1, es un estim u­ lante de los linfocitos B. El lipopolisacárido (LPS) es un mitógeno de linfocitos B pero no posee un efecto mitogénico importante sobre los linfocitos B humanos. En un ensayo de proliferación podría m edir­ se el número de células generadas y sobrevi­ vientes en el cultivo luego de un determinado estímulo, usando un colorante vital y por o b ­ servación posterior de las células en el m icros­ copio óptico. Considerando que esta m etodo­ logía es muy laboriosa, en la práctica se estim a la proliferación por la determinación de la in-

Metodologías

750

Cuadro 36-5. Activadores de linfocitos humanos Activador

Tipo celular

Blanco ele activación

Rango de dosis

A ntígenos T oxoide tetánico PPD

LT LT

TCR TC R

I a 20 |j,g/ml I a 10 |j,g/nil

LT LT LB LT yLB

CD 2. C D 3-TC R C D 2, C D 3-T C R Inm unoglobulina de superficie

1a

LT LT

TCR TCR

1:1 a L IO E /R * 1:1 a 1:10 E/R*

LB y LT

Canales iónicos

0,5 pM

LB yLT

PK C

0,5 a IO ng/m l

LT LB

C D 3-TC R Inm unoglobulina de superficie

D eterm inar la dosis 10 a 50 |j,g/ffll

LT y LB LT yLB LB

Cadenas p /y d e l 1L-2R IL-4R BCG R-R

1 a 100 U/ml 1 a 100 U/ml 10% concentración final

M itógenos PHA C on A Staph A C ow an I PW M

10 |j,g/ml l a iO

l:I 0^al : 105 dilución final 1:100 dilución final

CéJ ulas A logcneicas no LT A ntologas no LT lo n ó foros lonom icina É steres de forbol PM A A nticuerpos A nti-C D 3 A nti-IgM Linfoquinas lL -2 IL-4 B C G F (factor de creci­ m iento de LB)

* N ú m ero de células c s tim u la d o ra s/n ú m erü de cé la la s re sp o n d ed o ra s.

corporación de timidina tritiada al ADN de las células cultivadas, proceso que está general­ mente relacionado con cambios en el número de células. En este capítulo se describirán microensayos para evaluar la respuesta de células m ononu­ cleares, inducida por estimulación con mitóge­ nos de plantas, células alogeneicas o antígenos ubicuos, usando la incorporación de timidina tritiada como una medida de la proliferación celular. Los mitógenos son estimulantes del ti­ po policlonal y transforman a la mayoría de los linfocitos de individuos normales, independien­ tem ente de una inm unización previa. Por el contrario, los antígenos son estimulantes espe­ cíficos de linfocitos provenientes de donantes sensibilizados y, consecuentemente, activan a un menor número de linfocitos. En las meíodologías que se detallarán, se uti­ lizan células mononucleares de sangre periférica humana, como fuente de células efectoras de la inmunidad celular. Cuando se realizan estos en­ sayos con fines experimentales, se utilizan, por

lo general, suspensiones celulares del bazo de un animal, por ejemplo, esplenocitos murinos. 4.2.1. Proliferación in vitro de células mononucleares inducida por un mitógeno Esta metodología permite medir la respuesta de las células mononucleares, aisladas de san­ gre periférica obtenida de diferentes donantes, frente a distintas concentraciones del mitógeno PHA, que estimula principalmente la prolifera­ ción de linfocitos T. El protocolo puede ser modificado para ser usado con una variedad de estimulantes polielonales (cuadro 36-5). M ateriales - Suspensión de células mononucleares aisla^ das de sangre periférica por un gradiente de Ficoll-Hypaque. - Medio de cultivo RPMI completo suplemen­ tado con 5% de SFB, RPMl-5 (véase apéndi­ ce al final del capítulo).

Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes

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- Solución madre de PHA (1 mg/ml) en RPMI5. Se guarda en alícuotas a -20'>C. - Suero fetal bovino (SFB), inactivado a 56°C, 30 minutos, previamente ensayado para des­ cartar la presencia de LPS contaminante que podría inducir una estimulación basal. - M icroplacas de cultivo de 96 orificios con fondo en “U”. - Metil timidina tritiada ([^H] TdR, ImCi/ml, 6,7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027). - Papel de fibra de vidrio. - Cosechador de células. ~ Contador de centelleo líquido del tipo |3.

gre entera se correlaciona con una mejor repre­ sentación de las condiciones in vivo, ya que no se m odifica la distribución de los elem entos humorales y celulares. El procedim iento es igual al descrito an te­ riormente, excepto que la m uestra se prepara diluyendo la sangre heparinizada 1:5 en medio de cultivo (RPMI 1640), sin agregarle suero exógeno. Se siembran 100 ¡xl de dicha suspen­ sión celular en cada pocilio de una placa de 96.

N OTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células.

La reacción de cultivo mixto linfocitario es una medida de la capacidad de los linfocitos T de un individuo de reconocer diferencias en antígenos alogeneicos, principalmente de clase 11, expresados en los linfocitos B y en los m o ­ nocitos de otro individuo. En esta reacción se evalúa la proliferación de los linfocitos en re s­ puesta a la estim ulación de células m ononu­ cleares alogeneicas tratadas con mitomicina C o irradiadas, para evitar la proliferación de e s­ tas últimas. A pesar de que esta reacción ha sido a m e­ nudo utilizada en la evaluación de la inm uni­ dad celular, l;i utilidad más im portante es en los estudios de compatibilidad de donantes p a ­ ra trasplantes, particularmente en los de m édu­ la ósea.

Método 1. Contar las células mononucleares de sangre periférica y ajustar la concentración de la suspensión celular a 1 x 10*’ células/ml en RPML5. 2. Sembrar 1 x 10'’ células (100 }il de la sus­ pensión celular previamente homogeneizada) en cada uno de los pocilios de la placa de 96 orificios. Para cada condición experi­ mental realizar cuadruplicados. 3. Diluir la solución madre de PHA en concen­ traciones de 2, 5, 10 y 20 |ag/ml. Las dilu­ ciones se hacen con RPM L5 y se agregan 100 1J,1 de cada una por pocilio, obteniéndo­ se concentraciones finales de PHA en los cultivos de 1, 2,5, 5 y 10 |ag/ml respectiva­ mente. Realizar controles de proliferación basal, cultivando el mismo niimero de célu­ las respondedoras en presencia de RPMI-5. 4. Incubar a 37"C, en una estufa de cultivo ga­ seada con atmósfera de 5% de CO^, durante 48 o 72 h. 5. En las últim as 4 a 24 h agregar 1 |0,Ci de [3H]-TdR en cada orificio. Luego de ia in­ cubación, cosechar las células y posterior­ mente proceder a la medición de la radiacti­ vidad incorporada, siguiendo las metodolo­ gías detalladas en el apéndice. En una serie de experiencias es importante respetar el tiempo del pulso de [^H]-TdR pa­ ra obtener resultados comparables. Existen diversas ventajas en el uso de sangre entera en ensayos de proliferación respecto del uso de células aisladas. Una de las más impor­ tantes es que se requiere un mínimo volumen de sangre (0,1 mi); esto puede ser crítico en personas muy enfermas, en niños o cuando se realiza un estudio longitudinal. El uso de san­

4.2.2. Reacción de cultivo mixto linfocitario unidireccional

M ateriales - Medio de cultivo RPMI completo suplemen­ tado con SFB al 5%, RPMI-5. Véase apéndi­ ce al final del capítulo. - Suspensión de células respondedoras (célu­ las mononucleares de sangre periférica). - Suspensión de células estimuladoras aloge­ neicas (células mononucleares de sangre p e ­ riférica). - Suspensión de células estimuladoras antolo­ gas (células mononucleares de sangre perifé­ rica). ~ Solución de M itom icina C, 0.5 mg/ml en RPMI-5. Esta solución debe mantenerse p ro ­ tegida de la luz. Alternativamente, las célu ­ las pueden ser irradiadas con una dosis de 2000-3000 rads de radiación y. - M icroplacas de cultivo de 96 orificios con fondo en “U”. - Metil timidina tritiada ([^H] TdR, Im Ci/ml, 6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027). - Papel de fibra de vidrio. - Cosechador de células. - Contador de centelleo líquido del tipo p. N O TA : todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar

752

Metodologías

en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. Método 1. Contar las células mononucleares y ajustar en una concentración de 1 x 10'> células/ml en RPMI-5. 2. Con el propósito de inhibir la proliferación celular, tratar a las células mononucleares e stim u lad o ras, a lo g e n e ic a s y au tó lo g a s (control), con mitoinocina C o con irradia­ ción. Tratamiento con mitomocina C: a la sus­ pensión de células a tratar, se le agrega mitomicina C en una concentración final de 25 |ig/ml y se incuba 30 minutos en estufa de ^ cultivo a 37“C, 5% de CO^ en la oscuridad. Luego, se lavan las células tratadas 3 veces con R PM I-10 para remover los restos de la droga, centrifugando a 400 x g, durante 5-10 minutos, preferentemente en centrífuga refrigerada. Entre cada lavado, las células se incuban 5 minutos a 37“C. Irradiación: 2000-3000 rads (el tiempo de exposición a la radiación dependerá del equipo utilizado como fuente de radiación). Es importante, determinar la viabilidad ce­ lular posteriorm ente a estos tratam ientos, ya que las células deben perm anecer via­ bles. 3. Dispensar 100 |0,1 de células respondedoras por orificio (1 x 10^ células/pocilio). Reali­ zar cuadruplicados para cada condición ex­ perimental. 4. A gregar 100 jal de células estim uladoras alogeneicas o 100 |i.l de células autólogas previamente tratadas (1 x 10'* células/poci­ lio), en los pocilios correspondientes que contienen las células respondedoras. El con­ trol de proliferación basal se realiza agre­ gando 100 ¡il de RPMI-5 a las células res­ pondedoras. Además, se debe controlar que las células hayan recibido una irradiación adecuada y no proliferen. Para ello, sembrar 100 |u,l de estas células en presencia de 100 [il de RPMI-5. 5. Incubar a 37“C, 5 a 7 días en estufa de culti­ vo gaseada con 5% de CO^. 6. En las últimas 4 a 24 h agregar 1 ¡aCi de I^H j-TdR en cada orificio. Luego de la incu­ bación, cosechar las células y posteriormen­ te proceder a !a medición de la radiactividad incorporada, siguiendo las metodologías de­ talladas en el apéndice. En una serie de experiencias es im portante respetar el tiempo del. pulso de pHJ-TdR para obtener resultados comparables.

4.2.3. Proliferación de linfocitos inducida por estimulación antigénica Este protocolo se desarrolló para m edir la proliferación de los linfocitos T en respuesta a un antígeno específico. En este, caso, se utiliza el toxoide tetánico porque es un antígeno para el cual la mayoría de la población está sensibi­ lizada y evalúa la respuesta inmune de memo­ ria. Esta técnica sirve de modelo pudiendo ser modificada para analizar la respuesta prolifera­ tiva de linfocitos T frente a otras proteínas o polisacáridos antigénieos. Materiales - Células m ononucleares aisladas de sangre del paciente. Alternativamente, podría utili­ zarse una suspensión de linfocitos T purifi­ cados adicionados con células autólogas pre­ sentadoras de antígeno (monocitos-macrófa­ gos). “ Solución de toxoide tetánico, 1 mg/ml. Los m ateriales necesarios son los mismos que se mencionaron para la proliferación por mitógenos o en el Cultivo mixto linfocitario. NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. Método 1. Ajustar la concentración de las células res­ pondedoras (células mononucleares o linfo­ citos T purificados) a 1 x 10® células/ml en RPMI-5. En el caso de trabajar con linfoci­ tos T purificados, tratar a las células presen­ tadoras de antígeno con m itom icina C o irradiación y llevar a una concentración a 2 X 105 células/ml. 2. Colocar 150 ¡al de la suspensión de células mononucleares en cada pocilio. Si se utili­ zan linfocitos T puros, sem brar 100 jal de estas células y 50 ¡xl de la suspensión de cé­ lulas presentadoras en cada pocilio. 3. Siguiendo el protocolo de la reacción, colo­ car 50 jo.1 de cada dilución de la solución de toxoide tetánico en cada orificio y por cua­ druplicado. Las concentraciones finales del toxoide tetánico serán de O, 1, 5, 10 y 20 ug/ml, entonces se deberán dispensar 50 jiJ de RPMI-5 y 50 jal de cada una de las con­ centraciones del toxoide tetánico, 4, 20, 40 y 80 jig/ml respectivamente. 4. Incubar entre 5 a 8 días en estufa de cultivo gaseada con 5% de CO, a 37“C, Para cada

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

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C on canavalina A (^g /m l) F ig . 3 6 -8 . R e s p u e s ta lin f o p ro life r a tiv a d e c é lu la s m o n o n u c le a re s h u m a n a s en r e s p u e s ta a d iv e rs a s c o n c e n tr a c io n e s de c o n c a n a v a lin a A.

antígeno se debe establecer el tiempo (días) en donde el pico proliferativo sea mayor. 5. En las últim as 4 a 24 h agregar ] |j,Ci de [^HJ-TdR en cada orificio. Luego de la incu­ bación, cosechar las células y posteriormen­ te proceder a la medición de la radiactividad incorporada, siguiendo las metodologías de­ talladas en el apéndice. En una serie de experiencias es importante respetar el tiempo del pulso de pH]-TdR pa­ ra obtener resultados comparables. 4.2.4. Expresión e interpretación de los resultados Existen diversos criterios sobre la mejor m a­ nera de expresar los datos de un ensayo de pro­ liferación. Cuando se utiliza la incorporación de [^HJ-TdR como medida de la proliferación, la forma más común es calcular el promedio de las cuentas por minuto (cpm) para cada condi­ ción experimental, por ejemplo, cpm promedio de los cultivos estimulados menos cpm prom e­ dio de los cultivos control, sin tratar. Otra m a­ nera frecuentemente utilizada es calcular el ín­ dice de estimulación como el cociente entre las cpm de las células estimuladas y las cpm de las células control, no estim uladas. Este últim o método tiene un ineoveniente, las células no estimuladas pueden variar considerablemente las cpm incorporadas (proliferación basal) y afectar al índice de estimulación. Calcular las cpm promedio y el desvío estándar para cada condición experim ental o para el control. El desvío estándar de las réplicas debe ser menor al 15%.

En este tipo de ensayos es indisp en sab le comparar la respuesta de los linfocitos d e los pacientes con la de donantes normales. £in la figura 36-8 se grafica la respuesta proliferativa de células mononucleares de sangre periférica humana, estimuladas in vitro con dis­ tintas concentraciones de Con A. Esta curva dosis-respuesta es un ejemplo típico de u n a es­ timulación mitogénica. A manera de ejemplo, en el cuadro 36-6 se muestran los resultados correspondientes a un cultivo mixto linfocitario realizado para elegir al donante para un trasplante de médula ósea. 4.3. E V A L U A C IÓ N D E LA FUNCIONALIDAD CELULAR POR MEDIO D E REAC C l O M S D E CITOXICIDAD M l D \D i POR CÉLULAS 4.3.1. Ensayos para evaluar la función citotóxica mediada por linfocitos T La eitotoxicidad o lisis mediada por linfocitos T requiere de la interacción del R eceptor T con péptidos antigénicos unidos a m oléculas del Complejo M ayor de H istocom patibilidad (CMH) presentes en las células blanco. E sta in­ teracción desencadena la lisis celular a través de la liberación de gránulos que contienen en­ zimas proteolíticas. Este mecanismo efector es de fundamental importancia en la respuesta in­ mune dirigida hacia tumores, trasplantes y vi­ rus. La mayoría de las células efectoras citotóxicas son linfocitos T CD8+ específicos que re­ conocen a los antígenos presentados en el con­ texto de las moléculas del CMH de clase L Sin

754

Metodologías

Cuadro 36-6. Cultivo mixto linfocitario Estimuladoras"

Respondedoras

P a c ie n te

P aciente

M adre

Padre

Hei'mano 1

H erm ano 2

D onante no relacicMado

303 + 104

27890 + 3345

35674 ± 3267

2 1 4 5 6 + 2343:

319 ± 1 6 2

37658 ± 2343

40111 ± 3 1 2 0

13375+1999

12567±2015

33432 ± 3789

26574 + 2378

10301 + 6 9 2

41500 ± 3954

M a d re

1 2 3 4 5 ± 1 047

222±85

P a d re

169 8 9 ± 2 0 0 5

2 5 6 7 5 ± 1078

H e rm a n o 1

28887 ± 3 2 7 8

2 0 5 4 6 ± 1879

26998 ± 2367

24908 >1768

39003 ± 4 0 0 9

H e rm a n o 2

423+105

2 0 7 8 6 + 1 457

34789 ± 3699

42549 ± 3987

,2 8 9 ± 7 8

53406 + 5123

27567 ± 3109

37568 ± 3654

52309 ± 4 9 9 7

42346 + 3560

44376 ± 2 6 5 4

302 ± 1 4 4

D o n a n te rio r e la c io n a d o

678 + 309

3 0 3 + 156

Las cé lu la s m ononucleares; estim u la d o ra s sep a rad a s p o r F ico ll-H y p a q u e fu e ro n iirad íad as. E t pac ien te y el h erm a n o 2 son m u tu a m e n te jio re s p o n d e d o re s ,.n o e stim u la d o re s, in d ican d o q u e e x iste c o m p a tib ilid a d a nivel de an tíg en o s del H L A . E stos datos unidos con los dalos d e la tip ific ac ió n sero ló g ic a, in d icarán q u e el herm a n o 2 es un exc elen te d o n an te para el p ac ien te, m ien tras q u e el h erm a n o I no lo es. C ad a uno d e los in d iv id u o s n o re sp o n d ió a las células estim u la d o ra s antologas.

embargo, se demostró que existen, en menor proporción, poblaciones de linfocitos T CD4+ citotóxicos, que efectúan el reconocimiento an­ tigénico a través de las moléculas del CMH de clase II. El primer paso de una determinación de citotoxicidad comprende la generación de los lin­ focitos T citotóxicos específicos. Estos pueden encontrarse pre-estim ulados en el huésped o deberán ser sensibilizados in vivo o in vitro. En sangre periférica los linfocitos T citotóxi­ cos no pueden ser detectados sin una sensibihzación previa, a menos que el individuo se en­ cuentre en el período de actividad de una infec­ ción viral. Cuando se quiere medir la reactivi­ dad de los linfocitos T citotóxicos generalmen­ te es necesario estimular a las células efectoras in vitro pre-incubando células mononucleares en presencia de antígenos específicos. Para ello se co-cultivan las células m ononucleares de sangre periférica, durante 5 a 7 días, con antí­ genos solubles o con células que expresan los antígenos de interés, previam ente irradiadas. Los linfocitos T citotóxicos específicos genera­ dos se cosechan al final de los cultivos. La técnica más frecuentemente empleada pa­ ra determinar citotoxicidad utiliza la liberación de '“''C r por la célula blanco. Las células efectoras son puestas en contacto con las células blanco marcadas radiactivamente con ^‘Cr, du­ rante un período de incubación de 4h. La ra­ diactividad liberada es directamente proporcio­ nal a la lisis celular. Si bien la liberación de ^'Cr es un procedi­ miento ampliamente utilizado para detectar ci­ totoxicidad, en los últimos años se han desarro­ llado métodos colorimétricos (véase apéndice al final del capítulo), fluorimétricos y más re­

cientemente por quimioluminiscencia, tendien­ tes a reem plazar el material radiactivo y au ­ mentar la sensibilidad. M ateriales - Células efectoras: generalmente se utilizan células mononucleares obtenidas por centri­ fugación de sangre periférica a través de un gradiente de Ficoll-Hypaque o células de un homogenato de bazo con fines experimenta­ les. Las células mononucleares pueden estar previamente activadas para ejercer citotoxi­ cidad, es decir linfocitos T citotóxicos pre­ formados con una cierta especificidad (anti­ viral, alogeneica, etc). Alternativamente, las células mononucleares que se utilizarán co­ mo efectoras citotóxicas, pueden ser genera­ das in vitro. Generación de linfocitos T citotóxicos in vitro 1. Mezclar 1 x 10’ células blanco, estimulado­ ras, tratadas con mitomicina C o irradiadas, con 1 X 10’ células respondedoras en un frasco de cultivo T75 con un volumen de 20 mi de RPMLIO. La relación óptima de células respondedo­ ras/células estimuladoras (R/E) utilizada pa­ ra la generación de células efectoras citotó­ xicas puede variar en cada caso. Es aconse­ jable preestablecerla probando con distintas proporciones entre 10:1 hasta 1:1 de R/E. 2. Incubar las células a 37“C durante 6 días, en una estufa gaseada con 5% de CO^ para ge­ nerar los linfocitos T citotóxicos específicos. 3. Lavar las células con RPMl-lO.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

755

4. Determinar la viabilidad celular y resuspen­ derlas en la concentración reciuerida. Esta suspensión se utiliza como fuente de células efectoras citotóxicas. ~ C élulas blanco: la elección de las mismas dependerá de la función efectora a medir y de su disponibilidad. En la elección de una célula blanco, se deben tener en cuenta las siguientes características, la capacidad para ser lisadas por las células efectoras, la capa­ cidad para procesar antígeno in vitro, la m a­ yor facilidad para incorporar y retener la marca y la expresión de antígenos del CMH de clase I y II. a. células blanco para lirifocitos T citotóxicos con reactividad antiviral: podrían utilizarse fibroblastos, la línea celular BLCL, que son linfocitos B humanos in­ m ortalizados por el virus Epstein-B arr (EBV), linfocitos activados por m itóge­ nos o m acrófagos alveolares. En todos los casos las células deberán provenir de donantes autólogos. Las células blanco se pueden infectar con el virus, transfectar con un gen viral específico o sensibi­ lizar con un péptido inm unodom inante viral. b. células blanco alogeneicas: son de utili­ dad para definir la especificidad en antí­ genos de HLA en una respuesta de linfo­ citos T citotóxicos (medición de los nive­ les de aloreactividad después de una sen­ sibilización contra antígenos del CMH en un trasplante de órganos). Como células blanco pueden usarse blastos (células m o­ nonucleares estim uladas por un m itóge­ no, PHA). A lternativam ente, se pueden inmortalizar linfocitos B de un paciente o donante, tratando a las células m ononu­ cleares de sangre periférica con ciclosporina y un cultivo de EBV.

Método

- M icroplacas de cultivo de 96 pocilios con fondo en “U”. ~ M edio RPMI com pleto suplem entádo con 5% y 10% de SFB , R P M l-5 y R PM I-IO (véase apéndice al final del capítulo). - Solución salina tam ponada adicionada con 5% de SFB (SST-5) (véase apéndice al final del capítulo). - ImCi/ml de Na 2'“^'CrO^ (Amersham, NEN). - Cosechador de sobrenadantes semi-automático (optativo). - Contador para radiación p o y.

1. Lavar las células efectoras y ajustar la d en ­ sidad celular según la concentración final que se agregará en las placas. Para una rela­ ción de células efectoras a células blanco de 50:1, se necesitarán 125.000 células efectoras por cada 2.500 células blanco. Conside­ rando un volumen final de reacción de 100 |i.l por pocilio, se preparará una suspensión de células efectoras de 2.5 x lO^ml. G ene­ ralm ente en un ensayo de eitotoxicidad se establecen varias relaciones de células efec­ toras a células blanco, entre 50:1 y 1:1, para determinar cuál es la más conveniente. 2. Sem brar en una placa de 96 pocilios con fondo en “U”, 50 pl de las diferentes co n ­ centraciones de células efectoras y luego 50 pl de la suspensión de células blanco en ca­ da uno de los pocilios. Los controles de li­

NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células.

a. Marcación de las células blanco 1. Las células blanco deberán encontrarse en fase log de crecimiento, debido a que las cé­ lulas en proliferación activa toman m ejor el crom ato y co n sig u ien tem en te se m arcan mejor. 2. Centrifugar la suspensión celular a 400 x g, 10 minutos de forma de obtener 1-2 x 10'’ células blanco en el sedimento. Descartar el sobrenadante y elim inar cualquier exceso del mismo drenando sobre una toallita de papel. 3. Resuspender en 0,25 ml de cromato de so­ dio marcado. Incubar las células durante 45 minutos (no más de 60 minutos, para evitar la liberación espontánea de marca) a 37°C con agitación suave (4-6 rpm) y protegidas con una pantalla de plomo. En el caso de te­ ner fragilidad celular adicionar SFB en una concentración final entre 10-20%. 4. Lavar 3 veces las células con SST-5 calen­ tado a 37°C. 5. Resuspender las células marcadas radioacti­ vamente en medio RPMI-5 en una concentra­ ción adecuada para llevar a cabo el ensayo. Por ejemplo, si se usan 2.500 células blanco en un volumen de 50 |i,l, ajustar las células en 50.000/ml, Mantener la suspensión en la estufa para evitar la lisis espontánea. Si la preparación de la reacción llevara más de 1 h, efectuar un lavado previo de las células marcadas antes de su uso y ajustar la concen­ tración nuevamente. Determinar la incorpo­ ración de 5>Cr, contando una alícuota de la suspensión celular en un contador [3 o y. b. M edición de la actividad citotóxica. Ensayo de liberación de ®'Cr

756

Metodologías

beración espontánea de la marca se efectua­ rán colocando 50 |J,1 de las células blanco y 50 |ji de medio, por pocilio. Efectuar cada determ inación por triplicado. E stab lecer controles de liberación máxima de radioac­ tivo sembrando 50 |il de las células blanco y 50 p,I de HCl IN o de una solución de Tri­ tón X-100 al 5%. 3. Centrifugar las placas a 500 x g por 1 minu­ to e incubarlas a 37“C durante 4 h en estufa gaseada con un 5% de CO^. (En algunas ocasiones el período de incubación puede extenderse hasta 24 h aunque el mecanismo efector es, en la mayoría de los casos, más eficiente durante las primeras 2-4 h.) 4. Agregar 10'' iil de RPMI-5 frío en cada uno de los pocilios. Centrifugar nuevamente las placas a 500 x g durante 5 minutos a 4°C. Recoger 100 ¡0,1 del sobrenadante, con mu­ cho cuidado, de manera de evitar resuspen­ der el sedimento. Colocar los sobrenadantes en viales apropiados para poder ser leídos en un contador y o [3, en este último caso de­ berá agregarse líquido de centelleo (véase apéndice al final del capítulo). 5. Calcular el porcentaje de lisis específica de acuerdo a la siguiente fórmula: lisis es-

e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n tá n e a s)

100 p e c ífic a

(cpm m á x im a s - c p m e s p o n tá n e a s)

Nota: la lisis espontánea no deberá superar. el 20% de la liberación máxima. En algunas ocasiones es conveniente expre­ sar los resultados como unidades líticas (UL), correspondientes a un determinado porcentaje de lisis, frecuentemente se utiliza el 30% o el 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación de células efectoras a células blanco, e interpolando en la curva por el 50% de lisis se lee la relación correspondien­ te de células efectoras a blanco y se establecen las unidades líticas en forma arbitraria, calcu­ lando 100/células efectoras interpoladas. Como se muestra en el gráfico 36-9, para la población B las UL50 son 4 (100/25). 4.3.2 P ru eb as para determinar citotoxicidad de células natural killer (NK) Las células NK forman parte de la inmuni­ dad natural y median reacciones de citotoxici­ dad sin requerir de una .sensibilización previa, ni poseen especificidad antigénica ni restric­ ción por moléculas del CMH, los cuales son prerrequisitos de los linfocitos T citotóxicos. La actividad NK en los seres humanos se mide, generalmente, en ensayos de liberación de -‘’'Cr de 4 h utilizando como células blanco a las cé­ lulas tumorales K562 humanas. Cuando se quiere evaluar la actividad NK en sistemas murinos, generalmente se utiliza una

F ig . 3 6 -9 . G rá fic o c o rre s p o n d ie n te a la c u rv a d e c ito to x ic id a d e s p e c ífic a d e d o s p o b la c io n e s c e lu la re s (A ) y (B ) e n f u n ­ c ió n d e la re la c ió n d e c é lu la s e fe c to ra s a c é lu la s b la n c o . E n el m is m o se m u e s tra la d e te rm in a c ió n d e las U L 5 0 p a ra c ad a u n a d e la s p o b la c io n e s.

Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes suspensión celular de bazo. Como células blan­ co suelen emplearse las células de la línea Yac1, que provienen de un linfoma murino induci­ do por el virus Moloney (ATCC). M ateriales ~ Células efectoras: células mononucleares de sangre periférica humana separadas en gra­ dientes de Ficoll-Hypaque, preferentemente frescas. Para evaluar la actividad de NK, es conveniente usar las células el mismo día de la obtención. Las células mononucleares se pueden guardar en medio completo con SFB (5-10%), por un período de tiempo no mayor de 18 h a 4°C para evitar pérdidas de la acti­ vidad citotóxica de las células NK: - Células blanco: obtenidas de una línea esta­ blecida a partir de células de un paciente con una eritroleucemia crónica en crisis blástica (K562), Esta línea celular es deficiente en la expresión de antígenos del CMH de clase I y clase U. N OTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados pai'a el cultivo de células. Método La marcación de las células blanco con ^'Cr, se realiza como se describe para las células blanco de hnfocitos T citotóxicos (véase ítem 1-5 de marcación de células blanco del punto 4.3.1). El ensayo de liberación de -‘''C r de 4 h, es sim ilar al detallado anteriormente, para la evaluación de linfocitos T citotóxicos.

757

4.3.3. Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) La citotoxicidad celular dependiente de anti­ cuerpo (CCDA) es un mecanismo inmunológi­ co efector citotóxico que es dependiente de la interacción cooperativa de elementos efectores humorales y celulares. Depende de la presencia de células efectoras que tienen receptores, ge­ neralmente para Fcy, y de anticuerpos capaces de unirse específicamente a los epitopes antigé­ nicos expresados en la superficie de una célula blanco. La interacción entre las células efectoras y las células reconocidas por los anticuer­ pos resulta en citolisis (véase fig. 36-10). Este ensayo evalúa la capacidad de las células efec­ toras inmunocompetentes o la actividad de un anticuerpo específico para mediar CCDA. Este tipo de reacción es mediada principal­ m ente por células NK que expresan receptor para Fe. Otras células como los monocitos, gra­ nulocitos y cierta .subpoblación de linfocitos T, son también efectoras en las reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Clínicamente, el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectoras in­ munocom petentes, por ejemplo, en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico. O tra aplicación im portante de la C CD A es en la evaluación de anticuerpos contra aloantígenos, células tumorales o virus. La CCD A se utiliza para estudiar ios sueros de los pacientes que recibirán un trasplante o que cursan un re­ chazo de injerto y en individuos que cursan una infección viral. A continuación se describe un método para m edir actividad efectora de CCDA en células mononucleares de sangre periférica empleando células blanco marcadas con -“''Cr.

R g . 3 6 -1 0 . E s q u e m a del m e c a n ism o d e la r e a c c ió n d e C C D A m e d ia d a p o r c é lu la s e fe c to ra s c ito tó x ic a s N K y a n tic u e r­ p o s e s p e c ífic o s p a ra d e te rm in a n te s a n tig é n ic o s p r e s e n te s s o b re la s c é lu la s b lan c o .

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Metodologías

Si bien la liberación de ‘’'Cr es un procedi­ miento ampliamente utilizado para detectar ci­ totoxicidad, en los últimos años se han desarro­ llado métodos colorimétricos (véase apéndice al final del capítulo), fluorimétricos y más re­ cientemente por quimioluminiscencia, tendien­ tes a reem plazar el m aterial radiactivo y au ­ mentar la sensibilidad.

3. A una de las alícuotas de células blanco agregarle la dilución del antisuero de cone­ jo, calentado a 56°C durante 1 h. Agregar 200 |i.Ci de Na^'^'CrO^ a cada una de las alí­ cuotas. Incubar a 37°C durante 30 minutos. 4, Lavar las células tres veces y resuspender en una concentración de I X 10-“’ cél/ml en medio de cultivo RPMLIO.

Materiales

b. Medición de la actividad de CCDA. Ensayo de liberación de ®‘Cr

- Medio de cultivo RPMI suplementado con SFB al 10%, RPMLIO con HEPES 25mM. - Células efectoras, mononucleares de sangre periférica suspendidas en RPMI-10. Podrían utilizarse también otros tipos de células, sus­ pensión de nódulos linfáticos o de células de bazo. - Células blanco marcadas con ^'Cr, recubier­ tas o no con anticuerpo. Las células blanco utilizadas en este tipo de ensayos de CCD A deberían ten er las s i­ guientes características: facilidad para ser cultivadas, alta actividad específica y bajos niveles de liberación espontánea de la marca incorporada. Entre las células más com ún­ mente usadas en los ensayos de CCDA, se encuentran las células Chang, Rají (células de linfoma de Burkitt) y P815 (células de un mastocitoma murino). - Tritón X-100 al 5% v/v. - Placas de 96 orificios con fondo en “U” . - Tubos de centrífuga de 15 mi. - Antisuero de conejo específico contra las cé­ lulas blanco. La fuente de anticuerpos es un factor para ser considerado, los anticuerpos de conejo tienen buena actividad en los ensa­ yos de CCDA. - Im C i/m l de N a/>CrO , (250-500 m C i/m g, Amersham). ~ Cosechador de sobrenadantes semi-automático (optativo). - Contador para radiación p o y. NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. Método

1. Preparar una suspensión de 1 x 10’ cél/ml efectoras mononucleares. Hacer diluciones seriadas (1:2, 1:4 y 1:8) a partir de la sus­ pensión original. 2. Sembrar por sextuplicado, 100 |il de cada una de las diferentes concentraciones de cé­ lulas efectoras. 3. P ara cada d ilución de células efectoras, agregar 100 |al de células blanco no recu­ biertas con el anticuerpo, en tres de los po­ cilios y colocar 100 |j,l de las células blanco recubiertas con el anticuerpo, en los tres po­ cilios restantes. 4. Realizar controles de máxima liberación de la marca, agregando a 100 )il de las células blanco tratadas con el anticuerpo, 100 jil de Tritón X-100 al 5%. Repetir el mismo pro­ cedimiento con las células blanco no trata­ das con el anticuerpo. 5. Realizar controles de liberación espontánea de la marca, agregando a 100 pl de las célu­ las blanco tratadas con el anticuerpo, 100 pl de R PM LIO . R epetir el m ism o p ro ce d i­ miento con las células blanco no tratadas con el anticuerpo. 6. Cubrir las placas y centrifugar a 55 x g du­ rante 2 minutos a temperatura ainbiente. In­ cubar entre 4 h a 18 h en una estufa de culti­ vo en atmósfera de 5% de COj. 7. Centrifugar las microplacas a 550 x g a tem ­ peratura ambiente durante 5 minutos y cose­ char los sobrenadantes en viales, utíhzando una pipeta multicanal o un cosechador semiautomático. 8. Determinar la radiactividad de los sobrena­ dantes usando un contador de radiación y o p. Calcular el% de lisis según la siguiente fórmula: [cp m e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n tá n e a s]

a. blanco

Sensibilización y marcación de las células % lisis

= ------------------------------------------------------------- ^— X 100 [cp m m á x im a s - c p m e s p o n tá n e a s]

1. Se utilizan entre 1-5 x 10® células por mar­ cpm experimentales: cpm del sobrenadante de cación, las células efectoras y las células blanco, 2. Lavar las células tres veces con RPMLIO. cpm máximas: cpm del sobrenadante de las cé­ Antes del último lavado separar las células lulas blanco m ás Tritón. en dos alícuotas iguales. Centrifugar a 550 x , cpm espontáneas: cpm del sobrenadante de las g, 10 minutos y descartar el sobrenadante. células blanco más medio de cultivo.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes El porcentaje de Jisis específica debe calcu­ larse para las células blanco recubiertas y para­ lelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con anticuerpos, el porcen­ taje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir. 4.4. ESTUDIO D E LA FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS B Y T A TRAVÉS DE LA PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS SECRETADAS POR ELLOS 4.4.1. Funcionalidad de linfocitos B Una de las maneras de determinar la funcio­ nalidad de los linfocitos B es a través de la me­ dición de inmunoglobulinas secretadas en "res­ puesta a un antígeno determinado. Si bien éstas metodologías son muy sencillas el resultado re­ fleja una serie de mecanismos celulares com ­ plejos que involucran no sólo a los linfocitos B sino también su interrelación con varios tipos celulares como las células accesorias y los lin­ focitos T colaboradores. La síntesis de anticuerpos puede ser medida como la sumatoria de las inmunoglobulinas se­ cretadas en respuesta a un antígeno y por lo tanto, en este caso se mide la cantidad de inm u­ noglobulinas que se acumulan en un sobrena­ dante de cultivo de linfocitos o en el suero de un individuo inmunizado. Alternativamente, si se analiza la célula que está secretando el anti­ cuerpo, además de los anticuerpos producidos se determina el número de linfocitos B en una población que secreta la inmunoglobulina con una determinada especir^idad y de un isotipo particular. Para el primer objetivo, las metodo­ logías más empleadas son el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el radioinm unoensayo (RIA) que fueron detallados en los capítulos 38 y 39. Por otra parte, la identificación de los linfocitos B estimulados in vitro específicamente u obte­ nidos a partir de animales inmunizados con un antígeno determinado puede llevarse a cabo a través de la técnica clásica áe form ación de placas de hemólisis o por medio del ELISPOT. Estas técnicas son útiles para determinar la ci­ nética de producción de inm unoglobulinas, particularmente en aquellas situaciones asocia­ das con un cambio rápido del número de célu­ las secretoras de los anticuerpos. 4.4.1.1. Medida de la síntesis de inmunoglobulinas polielonales por medio de la técnica de formación de placas de hemólisis La técnica de formación de placas de hem o­

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lisis se fundamenta en la lisis de los eritrocitos al ser reconocidos por los anticuerpos específi­ cos, secretados por las células presentes en la placa, en presencia de complemento. El antíge­ no puede ser una proteína del eritrocito o una molécula covalentemente unida a la superficie del glóbulo rojo que sirve de indicador de la reacción. Los anticuerpos son sintetizados por las células secretoras de inmunoglobulinas que se están evaluando, las cuales son mezcladas con la suspensión de eritrocitos en un medio semi-sólido que las inmoviliza logrando favo­ recer el contacto entre los anticuerpos y los an­ tíg en o s presentes en los glóbulos ro jo s. El complejo inmune específico al unir el com ple­ mento agregado, inducirá la hsis de los eritro­ citos que se manifestará como placas de hem ó­ lisis (área de lisis que bordea a las células se­ cretoras de anticuerpos). Cada placa de hem óli­ sis formada corresponderá a una célula secreto­ ra de anticuerpos. Esta técnica es sumamente sensible y puede ser realizada en forma directa, indirecta o reversa de acuerdo al objetivo de la medición. Técnica de formación de placas de hemólisis directa (fig. 36-1 la): Esta técnica es útil para detectar IgM específica, las demás inm unoglo­ bulinas fijadoras de complemento no pueden ser determinadas debido a las condiciones en las que se lleva a cabo el ensayo. Las células secretan IgM específica que migra por difusión en el medio semi-sólido y al reconocer al antí­ geno específico en la superficie del eritrocito, se une a él. Este puede ser un antígeno eritrocitario o una proteína covalentemente u n id a al glóbulo rojo, como fue indicado en el capítulo 35 para la hemaglutinación pasiva. Los com ­ plejos inmunes formados en la superficie de los eritrocitos fijan complemento, el cual produce la hsis de aquellos eritrocitos circundantes a los linfocitos B, originando las placas de lisis. Técnica de formación de placas de hemólisis indirecta (fig. 36-1 Ib): Las células secretoras sintetizan inmunoglobulinas específicas que al difundir se unen a su antígeno presente sobre el eritrocito. Como para la fijación de co m p le­ mento se requieren dos moléculas de IgG cer­ canas y en esta situación difícilmente se logra, para poder detectar las IgG se agrega un anti­ cuerpo anti-IgG m onoespecífico y lu e g o el complemento. La hemólisis de los eritrocitos indicará la liberación de IgG y de IgM p o r par­ te de los diferentes linfocitos B. Asimismo esta metodología resulta de utili­ dad para poder detectar linfocitos B secretores de inmunoglobulinas con especificidad para un determinado antígeno, no fijadoras de com ple­ mento. Técnica de formación de placas de hemólisis reversa (fig. 36-1 le): Esta variante metodoló-

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Metodologías

*"%

C om plem ento

. .

\ H E M O LIS IS

IgM específica

F ig . 3 6 - l l a . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la té c n ic a d e fo rm a c ió n d e p la c a s d e h e m o lisis d ire c ta .

gica es utilizada para detectar la producción de inmunoglobulinas totales y no anticuerpos es­ pecíficos, como ocurre en las técnicas explica­ das precedentemente. En este caso los eritroci­ tos pueden ser sensibilizados con Proteína A, que tiene la propiedad de fijar la región Fe de las inmunoglobulinas, o con anticuerpos antiinmunoglobulinas. Aunque la mejor sensibili­ zación de los glóbulos rojos se logra tratando en un primer paso a los eritrocitos con Proteína A y luego con IgG con actividad anti inmunoglobulina de la especie que se quiere determi­ nar. Las anticuerpos liberados por los linfocitos B se unen a los glóbulos rojos sensibilizados y

los complejos así formados unen complemento y ocasionan la lisis de los eritrocitos. A continuación se detalla la técnica de fo r ­ mación de placas de hemólisis directa. Materiales ~ Placas de Petri de 10 cm de diámetro descar­ tables. - Agar purificado (agar noble) o agarosa. “ Solución salina fosfatada de Dulbecco (véa­ se el apéndice al final del capítulo). - Solución de Gey (véase el apéndice al final del capítulo).

anti-lgG

i

H EM O LISIS

IgG específica C om plem ento

F ig . 3 6 - l l b . E squem a del fundam ento de la técnica de form ación de placas de hem ólisis indirecta.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

anti-Ig

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C om plem ento

H E M O LIS IS

Inm unoglobulinas

F ig . 3 6 - l l c . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la té c n ic a d e fo rm a c ió n d e p la c a s d e h e m o lisis rev e rsa .

- Eritrocitos de carnero (sensibilizados con an­ tígenos específicos o sin sensibilizar) al 20% en solución de Gey. - Células mononucleares, esplenocitos o linfo­ citos purificados. Suero de cobayo, fresco o liofilizado. Es conveniente adsorberlo con 1 mi de sed i­ mento de eritrocitos de carnero durante 20 minutos en bario de hielo, para eliminar anti­ cuerpos contaminantes. - Tubos de plástico de 15 y 50 mi. -- Tubos de ensayo. NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. Método 1. Verter sobre la placa de Petri 5 mi de una solución de agar o agarosa estéril, al 1,2% en solución salina fosfatada de D ulbecco, fundida y enfriada a 50°C. A gitar suave­ mente en forma rotativa, sobre una superfi­ cie nivelada y dejar sohdificar. (Estas placas así preparadas pueden guardarse a 4°C, du­ rante varios días). 2. Preparar con anterioridad, agar o agarosa al 0,6% en solución de Gey. Repartir en alí­ cuotas de 2 mi en tubos de ensayo y esterili­ zar en autoclave. Fundir en baño de agua hirviente 1 tubo por cada placa y mantener a 40-42“C (agar) o a 46-48‘>C (agarosa). R eti­ rar y añadir 0,1 mi de la suspensión de eri­ trocitos e inmediatamente 0,1 mi de la dilu­ ción (2 X 10® células/m l) de las células a analizar. Agitar y verter rápidamente en la

placa de Petri que ya tiene la capa inferior. Homogeneizar por rotación y dejar solidifi­ car. 3. Incubar a 37“C durante 90-120 m inutos y agregar, uniformemente sobre toda la super­ ficie, 1 mi de complemento de cobayo dilui­ do 1:10 en solución de Gey. Incubar durante 60 minutos. 4. C ontar las placas de hem olisis form adas, con lupa estereoscópica o microscopio y re­ ferirlas al número de células sembradas. (Si las placas no pueden ser leídas de inmediato fijar los eritrocitos con una solución de glu­ taraldehído al 0,25%.) Las células que sintetizan anticuerpos del isotipo IgG frecuentem ente no dan placas de hemólisis. Ello es debido a que el niímero de moléculas elaboradas no es suficiente para sen­ sibilizar adecuadamente a los eritrocitos, cosa c]ue sí ocurre con la IgM, como consecuencia de su estructura m olecular. Para determ inar otras inmunoglobulinas, excepto la IgM, se de­ sarrolló el método indirecto de formación de placas de hemóhsis. Esta técnica, se realiza de manera similar al ensayo directo, con la varian­ te de que antes de añadir los glóbulos rojos al agar o a la agarosa fundida, se agrega una dilu­ ción del suero anti-gammaglobulina monoespecífico. Este ensayo mide las células formadoras de placa totales (CFPtotales): las células for­ madoras de placas para la inmunoglobulina en estudio (CFPespecíficas) y las directas (Ig M, CFPdirectas). Simultáneamente debe realizarse un ensayo directo para determinar las C FPdi­ rectas. La diferencia entre ambos valores deter­ mina el número de CFPespecíficas del ensayo. CFPespecíficas = CFPtotales - CFPdirectas

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Metodologías

4.4.I.2. Medida de la síntesis de inmunoglobulinas por medio de la técnica de plaqueo inm unoenzim ático o E L IS P O T La técnica del plaqueo inmunoenzimático o ELISPOT, utilizada para la detección de las cé­ lulas productoras de anticuerpos de una deter­ minada especificidad, es un ensayo desarrolla­ do en los años ’80 que ofrece una alternativa más sencilla y versátil a la detección de linfoci­ tos B secretores de anticuerpos, por medio de la formación de placas de hemólisis. A su vez permite el análisis de poblaciones celulares que sintetizan anticuerpos dirigidos hacia dos antí­ genos diferentes. Asim ism o, resulta de gran utilidad para la determinación de células secre­ toras de anticuerpos en tejidos como el intesti­ nal o el pulmonar en donde el aislamiento de linfocitos es de gran dificultad. El ELISPOT se lleva a cabo en tres pasos, la sensibilización de la fase sólida (generalmente nitrocelulosa o placas de poliestireno) con el antígeno, la incubación de las placas con las células secretoras de anticuerpo y la detección del complejo antígeno-anticuerpo formado en la zona de secreción de anticuerpos, por medio de una técnica inmunoenzimática (fig. 36-12). Materiales “ Solución de antígeno en SST. - Células secretoras de anticuerpos presentes en la capa de células mononucleares aisladas de sangre periférica o en esplenocitos. - Anti-gammaglobulina de la especie en estu­ dio conjugada con peroxidasa (0,5 - 5 fig/ml en SST/Tween). - SST adicionada con 5% de SFB (SST-5) o BSA al 1% en SST. - M edio IMDM adicionado con 5% de SFB (IMDM -5) o RPM I-10. (Véase apéndice al final del capítulo.) - SST adicionada con 0,005% de Tween 20 (SST/Tween). ^ Sustrato para la enzima utilizada preparado en una solución de agarosa. Disolver 50 mg de 1,4-p-fenilendiamina (PPD, Sigma) en 2 mi de metanol. Momentos antes de ser utili­ zado agregar 50 ¡il de H,02 al 30% y 100 mi de agarosa al 1% en SST calentada a 46“C. Este sustrato produce manchas de color ma­ rrón. Placas de poliestireno de 96 pocilios (alter­ nativamente se pueden utilizar placas de 6, 24, 48 o 96 pocilios y Placas de Petri). NOTA: todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células.

Método 1. Sensibilizar las placas de poliestireno con una dilución del antígeno en SST. (La dilu­ ción óptima del antígeno deberá ser deter­ m inada de antemano utilizando diferentes concentraciones de antígeno y esplenocitos sensibiUzados. Generalmente se utiliza una concentración antigénica entre 10 y 200 |i,g/ml.) Incubar 18 h a 4°C o 2 h a 37°C. Las placas se pueden guardar a 4°C por varias semanas. 2. Descartar el sobrenadante. Lavar tres veces con SST y drenar el exceso de líquido sobre una toallita de papel. Bloquear la placa con SST-5 incubando 30 minutos a 37°C. 3. Descartar el sobrenadante drenando la placa sobre una toallita de papel y agregar 200 )J,1/ pocilio de las diferentes concentraciones de la suspensión celular en IMDM-5 (entre 10'* y lO'’ células/ml). Incubar durante 3, 4 o 18 h a 37“C en estufa gaseada con 5% de CO^. 4. Recuperar las células para posteriores ensa­ yos o descartarlas y lavar las placas con SST/Tween. 5. Adicionar 100 |il del anticuerpo conjugado. Incubar 2 h a temperatura ambiente o 18 h a 4°C (en cámara húmeda). 6. Lavar las placas tres veces con SST/Tween y el último lavado con SST. 7. Descartar el sobrenadante y drenar cuidado­ samente cualquier exceso de solución de la­ vado. 8. Agregar 50 (xl de la solución de sustrato por pocilio. Mantener las placas en una superfi­ cie horizontal nivelada y controlar el desa­ rrollo de las manchas de color que aparece­ rán dentro de los 5 a 10 minutos, 9. Las células productoras de anticuerpos se identifican por la aparición de m anchas de color marrón. Contar las manchas formadas en un microscopio con un aumento de 10 o 30X. La inm unización parenteral con antígenos proteicos induce por lo general, entre 50 y 500 manchas/ lO*’ células totales después del 6° día de la primera inoculación del antígeno. Cada m ancha representa una única célula secretora de anticuerpo, 4.4.2. Funcionalidad de linfocitos T. Detección de la producción de citoquinas por E L IS A o por ensayos biológicos La identificación de las citoquinas y de los productos solubles de la activación inmune, es una de las maneras de evaluar la frmeipnalidad de las células inmunocompetentes. Estos m ar­ cadores presentes en el suero reflejan la activi­

Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes dad de todas las células inmunes del cuerpo. Es por este motivo que la medición de estas sus­ tancias provee información acerca del estado inmune de un individuo. El factor inhibitorio de la migración de los m onocitos-fagocitos (MIE) es producido por linfocitos T activados y fue una de las primeras citoquinas identificadas in vitro por su capaci­ dad de inhibir la movilidad de los macrófagos. Si bien esta metodología ha sido muy utilizada anteriormente, la identificación bioquímica y el significado biológico del MIE no han sido aún aclarados, y en la actualidad ha sido reem pla­ zada por ensayos para la detección de linfoqui­ nas, tales como IL-2 o interferón y. Entre los productos de activación que actual­ mente se pueden determinar mencionaremos: P 2-microglobulina, receptor soluble de IL-2 (an­ tígeno Tac), moléculas solubles de CD4 y CD8 así como anticuerpos. Estas proteínas son los productos finales de una serie de procesos celu­ lares y, por lo tanto, los niveles incrementados en el suero indican un aumento en su produc­ ción y la activación de estos sistemas celulares. Diversos marcadores están elevados en cier­ tas enfermedades, infecciones por microbios, rechazo de injertos, desórdenes autoinmunes o en enfermedades malignas de células linfoides y su determinación es una medida de la activi­ dad de la enfermedad pero no es un marcador específico de diagnóstico. Las metodologías que pueden ser utilizadas para la medición de las citoquinas, principales mediadores celulares involucrados en la re s­ puesta inmune, incluyen el enzimoinmunoensayo (ELISA), el ELISPOT y bioensayos. El enzimoinmunoensayo tiene miíltiples ventajas, alto grado de especificidad, fácil ejecución y no re­ quiere del cultivo de tejidos o de radiactividad. Dentro de las desventajas del método se desta­ can, la menor sensibilidad en comparación con los ensayos biológicos y el hecho de que se pueden detectar proteínas con reactividad in­ munológica pero que no tengan actividad bio­ lógica. Por el contrario los bioensayos se ca­ racterizan por ser más sensibles que el ELISA y por detectar proteínas biológicamente activas. El principal problema en este tipo de ensayos es que se puede valorar la actividad de más de una citoquina. Cuando dos o más citoquinas es­ tán presentes pueden producir interacciones sinérgicas o antagónicas que llevan a posibles re­ sultados falsos. Este inconveniente puede ser subsanado empleando anticuerpos monoclona­ les específicos para neutralizar la actividad de las citoquinas contam inantes. C onsiderando que los bioensayos detectan las citoquinas fun­ cionalm ente m ientras que los enzim oinm unoensayos en form a estructural, en la actuali­ dad se aconseja el uso de ambos tipos de m eto­

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dologías para la detección de una determinada citoquina. A continuación se describirán metodologías para la determinación de IL-2 e interferón. 4.4.2.I. Medición de IL-2 El método tradicional para la detección de IL-2 en muestras de suero o de sobrenadantes de cultivo de linfocitos humanos, es un bioensayo que utihza las células CTLL-2. Esta línea celular murina derivada de células de bazo esti­ muladas por células alogeneicas se propaga in vitro dependiendo de la IL-2 (Gillis & Smith, 1977). Este ensayo consiste básicamente en de­ terminar la proliferación in vitro de las células CTLL-2 en presencia de las muestras a exam i­ nar o de diferentes concentraciones de IL-2 hu­ m ana usada como estándar. Posteriormente, se calculan las unidades de interleuquina corres­ pondientes a la muestra por comparación con los estándares. Este método es laborioso y está sujeto a los posibles efectos de otros inmunomoduladores presentes en la muestra (por ej., otras citoquinas, prostaglandinas E, etc). Detección de IL-2 usando las células CTLL-2 La metodología utilizada en este caso se ba­ sa en las técnicas de proliferación descritas an­ teriormente. NOTA; todos los reactivos y materiales que estén en contacto con las células deberán estar en condiciones de esterilidad y el operador de­ berá seguir los procedimientos empleados para el cultivo de células. M étodo 1. Colocar 100 |J.I de cada dilución de IL-2 (es­ tándares) o de las muestras, por cuadrupli­ cado, en una placa de cultivo de 96 orificios de fondo en “U”. Incluir un control negativo con RPM I-10. En el caso de las muestras provenientes de los sobrenadantes de cultivo, realizar dilu­ ciones desde 1:1, 1:2 y 1:4 hasta que dism i­ nuya la máxima actividad proliferativa. Si se utilizan sueros humanos, éstos deben ser diluidos ya que los sueros normales contie­ nen inhibidores que pueden afectar a este ti­ po de ensayo. 2. U tilizar las células CTLL-2 después de 2 días del último agregado de medio de culti­ vo. Lavar 3 veces las células con SST. Cen­ trifugarlas 10 minutos a 335 x g a 4°C y resuspender el sedimento en 1 ml de SST lle­ vando luego a 50 ml de SST; repetir este procedimiento 3 veces.

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Metodologías

C élulas secretoras y no secretoras de Ac específico

Placas se nsibilizadas con Ag específico

A Anti-Ig conjugada con peroxidasa

Incubación

Lavado

• Sustrato específico

F ig . 3 6 -1 2 . E s q u e m a d e lo s p a s o s d e la té c n ic a d e ELÍSPO T.

3. Contar las células y ajustar la concentración a 5 X 10“*cél/ml en R PM I-10 completo. 4. Sembrar 100 ¡il de las células en cada poci­ lio de la microplaca. Incubar las placas du­ rante 28 h a 37°C en estufa de cultivo gasea­ da con 5% de CO^. 5. En las últimas 8 h, agregar 1 (iCi de [^H]TdR en cada orificio. Luego de la incuba­ ción, cosechar las células y posteriormente, proceder a la medición de la radiactividad incorporada, siguiendo las metodologías de­ talladas en el apéndice. 6. Para el cálculo de la concentración de la lL-2 presente en las muestras se pueden rea­ lizar diferentes procesamientos de los datos. En los diferentes tipos de gráficos se corre­ laciona la síntesis del ADN con la concen­ tración de los estándares.

Determinación de IL-2 por E L ISA La determ inación específica de citoquinas por ELISA, en este caso de la IL-2, se funda­ menta en un ensayo de doble anticuerpo, tipo sandwich. Es un enzimoinmunoensayo en fase sólida donde se utiliza un anticuerpo monoclo­ nal específico and IL-2 para capturar esta inter­ leuquina presente en la muestra o en el están­ dar. Después de lavar el material no unido, se agrega un anticuerpo policlonal que se une a la IL-2 capturada. Luego de los lavados, se agre­ ga un anticuerpo, conjugado a una enzima, con especificidad para reconocer al segundo anti­ cuerpo. En el caso de la detección de IL-2 en muestras de origen humano, los niveles encon­ trados son muy bajos. Por este motívo, es con­ veniente desarrollar metodologías para aumen­

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes tar considerablemente la sensibilidad de la de­ terminación, por ejemplo, utilizai' el sistema de biotina-estreptoavidina.

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plifica la señal de detección. La cuantificación se realiza por medición espectrofotométrica de la conversión del sustrato en un producto cromogénico.

4A.2.2. M edición de Interferón y La producción in vitro de IFN y por células mononucleares de sangre periférica en respues­ ta a una estimulación por antígenos o mitóge­ nos, es un método muy efectivo para evaluar la funcionalidad de los linfocitos T. Un defecto en la síntesis in vitro del interferón o de otras citoquinas está asociado con diversas enferme­ dades del sistema inmune, autoinmunidad, in­ munodeficiencias, malignidades linfoides e in­ fecciones con ciertos virus. Los linfocitos T son las células responsables de la síntesis del interferón y (IFN y) en res­ puesta a estímulos específicos, como los antí­ genos, o inespecíficos, como los m itógenos, anticuerpos anti-linfocitos o IL-2. A pesar que los interferones a, |3 y y poseen todos la capaci­ dad de inhibir la replicación viral, son antigéni­ camente diferentes. Debido a esta característi­ ca, se pueden utilizar anticuerpos para la iden­ tificación de estas proteínas por inhibición de la actividad antiviral o por ensayos inmunoló­ gicos como el ELISA o el RIA. Los interferones se pueden medir en el suero de pacientes infec­ tados con el virus de la inmunodeficiencia ad­ quirida o con desórdenes autoinmunes. Los ensayos biológicos para evaluar la pro­ ducción de los interferones miden el grado con que éstos inhiben el crecimiento viral: inhibi­ ción de la producción del virus, inhibición del efecto citopático inducido por el virus, inhibi­ ción de la formación de placas virales, inhibi­ ción de la formación de antígenos virales o in­ hibición de la producción de ácidos nucleicos virales. Básicam ente estos ensayos requieren de la incubación de las células con el interfe­ rón, remoción del interferón, infección de las células con el virus y medición de la reducción del crecimiento viral dentro de las células in­ fectadas, m ediada por el IFN (Hooks & Detrick, 1992). Los inmunoensayos tienen la ventaja de ser específicos, realizarse más rápidamente y son de utilidad para el monitoreo simultáneo de nu­ merosas muestras. De todas maneras no pueden reem plazar com pletam ente a los bioensayos que detectan moléculas biológicamente activas. El enzimoinmunoensayo específico, para la cuantificación de IFN y es similar al descrito para la IL-2. El IFN es capturado del fluido biológico por un anticuerpo monoclonal espe­ cífico pegado a una fase sólida y luego es de­ tectado usando un suero policlonal anti-IFN y. El agregado de un anticuerpo policlonal antiinmunoglobulina conjugado a una enzima, am­

5. PRUEBAS FU N C IO N A LES PARA EVALUAR LA INM UNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS IN VIVO La hipersensibilidad retardada (HR) es una respuesta inmune mediada por células, que se manifiesta como una reacción inflamatoria, en la cual el último efector es el macrófago. Este tipo de inmunidad mediada por células, princi­ palmente por linfocitos T y macrófagos, es par­ te de los mecanismos de defensa contra bacte­ rias intracitoplasmáticas que no pueden ser eli­ minadas por los macrófagos no activados. Para poder eliminarlas se necesita aumentar la fun­ ción microbicida de los macrófagos y esto se logra por las citoquinas producidas por los lin­ focitos T activados. Las proteínas antigénicas o haptenos quími­ cam ente reactivos, pueden d esen cad en ar el mismo tipo de reacción de hipersensibilidad re­ tardada que los microbios, pudiendo causar in­ juria tisular. En este caso, cuando el antígeno no es un patógeno, la reacción de hipersensibi­ lidad retardada producirá injuria sin causar una función protectora. S .L P R U E B A S C U TÁ N E A S D E H IP E R SE N SIB IL ID A D R ETA R D A D A A pesar de que se han desarrollado num ero­ sos ensayos in vitro para medir la actividad de los linfocitos T, éstos no evalúan n ecesaria­ mente las mismas células que median hipersen­ sibilidad retardada ni consideran las influencias de los eventos regulatorios ciue influencian la función in vivo de los linfocitos T. Por lo tanto, las respuestas cutáneas de hipersensibilidad re­ tardada representan una importante fuente de información relacionada con la actividad de los linfocitos T in vivo. En la clínica, las pruebas cutáneas son de valor en la evaluación total de la inmunocompetencia. Estas reacciones se dividen en dos fases, la de sensibilización con un antígeno específico y la del desafío de la respuesta de hipersensibili­ dad retardada, que se desarrolla generalmente entre 6 a 14 días después de la sensibilización. Esta prueba se realiza fácilmente en seres hu­ manos y cobayos, mientras que en ratones es más difícil de inducir este tipo de respuesta. La reacción de hipersensibilidad retardada ocurre en el sitio de inoculación del antígeno que ge­ neralmente es la piel, de allí que a este tipo de ensayo se lo conoce como prueba de hipersen-

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Metodologías

sibilidad retardada cutánea (HRC). Histológi­ camente se caracteriza por una induración pro­ ducida por células mononucleares y un número limitado de polimorfonucleares. La inyección intradérm ica de un antígeno puede inducir una o más de los tres tipos de reacciones cutáneas en humanos, que se descri­ ben a continuación. a) una roncha y reacción eruptiva con un pi­ co de aparición entre 15-20 minutos después de la inyección del antígeno, relacionado con la presencia en la piel de IgE específica para ese antígeno. Esta reacción se conoce como alergia. b) una reacción vascular local llam ada de Arthus con un pico entre 12-24 horas y es el re­ sultado de la interacción del antígeno y del an­ ticuerpo fijador de complemento en el sitio de la inyección. c) una reacción de hipersensibihdad retarda­ da, dependiente de hnfocitos T y macrófagos, caracterizada por eritema e induración en el si­ tio de la inyección, con un pico de intensidad entre las 24 y 48 h. Ciertos antígenos son llamados ubicuos ya que la mayoría de los individuos están sensibi­ lizados con ellos. Entre los más comúnmente utilizados en las pruebas cutáneas, mencionare­ mos: Candida albicans, Trichophyton, proteína purificada derivada de tuberculina (PPD), to­ xoide tetánico, Coccidioidin. Cuando se utili­ zan en una prueba cutánea, uno o más de estos antígenos comunes, la reacción de hipersensi­ bilidad se debe a un fenómeno de memoria in­ munológica. Si una persona no responde a nin­ gún antígeno común intradérm ico dando una reacción de hipersensibilidad retardada, mani­ fiesta un estado de anergia. La hipersensibilidad por contacto es otra ma­ nifestación de hipersensibilidad retardada cutá­ nea y se puede evocar por una exposición epi­ dérmica prolongada a un antígeno, que podría ser una macromolécula exógena o un hapteno conjugado a proteínas de la piel (por ejemplo: Dinitro cloro benceno). La sensibilización por co n tacto y p o sterio r d esafío con el m ism o neoantígeno permite evaluar la respuesta inmu­ ne primaria y de memoria. Respuestas dérmicas positivas generalmente se correlacionan con los resultados de pruebas in vitro incluyendo respuestas proliferativas de linfocitos y medición de la producción de citoquinas. Las pruebas de hipersensibilidad retardada cutánea son útiles en la evaluación de pacientes con síndromes de inm unodeficiencias prim a­ rias o adquiridas. Este tipo de pruebas han sido usadas para evaluar los resultados de inmunoterapias en enfermedades malignas, para moni-

torear el curso de ciertas enfermedades o en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Rutinariamente existen dos métodos disponi­ bles como pruebas de hipersensibilidad retarda­ da cutánea. El método clásico se relaciona con la inyección intradérmica de un antígeno (reac­ ción típica de tuberculina) y la sensibilización por contacto, que se diferencian entre sí por la manera en que se origina la respuesta. En la sensibilidad por contacto, las etapas de sensibi­ lización y del desafío involucran aplicaciones de un hapteno químicamente reactivo que m o­ difica moléculas autólogas en la piel resultando en un reclutamiento y activación de los linfoci­ tos T específicos en el sitio involucrado. 5.1.1. Prueba cutánea de hipersensibilidad retardada para un único antígeno (Prueba de tuberculina) Materiales - Aguja de tamaño 27-6 (hipodérmica). - Jeringa de tuberculina. - Proteína purificada derivada de tuberculina (PPD), 0,1 mi (5 U de tuberculina) o de otro antígeno microbiano que se quiera estudiar. Método 1. Inyectar intradérmicamente en el antebrazo una aguja biselada (27-6) unida a una jerin­ ga de tuberculina que contenga 0,1 mi de PPD. Usar la punta de la aguja para elevar la piel y manternerla plana mientras la aguja va entrando. Evitar una inyección subcutá­ nea. 2. Sim ultáneam ente a la aplicación de la in­ yección, se desarrollará una ampolla de 6 a 10 mm. 3. Luego de 24 o 48 h, u opcionalmente 72 h, medir el diámetro mayor de la induración y el eritema. Los grados de la reacción se establecen de la siguiente forma:

O BSER VAC IÓ N

G RAD O D E P O SITIVID AD

E r ite m a > d e 10 m m e in d u ra c ió n d e ] -5 m m In d u ra c ió n > 10 m m In d u ra c ió n 11 -2 0 m m In d u ra c ió n > 2 0 m m

+

++ ++++

L a p re se n c ia d e sólo un erite m a n o indica re acc ió n po.siliva.

El mismo procedim iento se realiza con un mayor número de antígenos (6 por lo menos) para determinar posibles defectos en la inmuni­ dad celular.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 5.1.2. Prueba cutánea múltiple de hipersensibilidad retardada Los ensayos de hipersensibilidad retardada cutánea que utilizan un panel de antígenos co­ munes se realizan cuando se quiere evaluar a pacientes en quienes se sospechan defectos en la inmunidad, por ejemplo: en individuos con infecciones severas y recurrentes o infecciones con microorganismos no comunes y en pacien­ tes que padecen enfermedades malignas como parámetro de valor pronóstico. El test múltiple es una técnica estandarizada en la que se usa un aplicador plástico con pin­ zas que liberan simaltáneamente 7 antígenos y un control, cuando se presiona sobre la piel. Esta prueba denom inada m ultitest evalúa la reactividad frente a los siguientes antígenos: Candida albicans, Trichophyton rnentagrophytes, Proteus mirabilis, Tuberculina Vieja (mez­ cla de proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos, parcial o totalm ente desnaturaliza­ dos provenientes de un cultivo de Mycobacterium tuberculosis envejecido), Estreptococus del grupo C, Toxoide diftérico, Toxoide tetáni­ co y glicerina como control. Este tipo de ensayo fue estandarizado para realizarse en la piel del antebrazo en adultos o en la espalda para niños.

acetona en concentraciones de 2.000 y 50 fXg/0,1 ml para las dosis sensibilizante y con­ trol, respectivam ente. E stas soluciones se guardan en botellas oscuras y se deben usar dentro de las dos primeras semanas. M étodo 1. Luego de limpiar la piel con acetona, aplicar 0,1 ml de cada dosis en sitios separados en la parte superior del brazo, utilizando un anillo de 2 cm de diámetro. Dejar evaporar con ayuda de un secador de cabello. C ubrir los sitios con vendas y dejar por 24 h. 2. Transcurrida una semana, observar la p re­ sencia de un eritema en el sitio de la reac­ ción. Un resultado positivo indica el desa­ rrollo de una reacción de hipersensibilidad retardada. 3. De no observarse un eritema aplicar la dosis de desafío antigénico o desencadenarite. En el día 14 posterior a la aplicación de la dosis inicial aplicar 50 jig/ml de la solución de DNCB y leer la reacción a las 24 y 48 h. Los grados de la reacción se establecen de la siguiente forma: O B SE R V A C IÓ N

5.1.3. Prueba de hipersensibilidad por contacto La hipersensibilidad por contacto es un ensa­ yo in vivo que evalúa la inmunidad m ediada por células. En esta prueba, se exponen las cé­ lulas de la epidermis a un hapteno exógeno y se desencadena una reacción de hipersensibilidad retardada que puede ser medida y cuantificada. Las células de Langerhans que son las células presentadoras del antígeno inician la sensibili­ zación presentándole el hapteno a los linfocitos T CD4, los cuales secretan linfoquinas y reclu­ tan otras células en el sitio de la reacción. 5.I.3.I. Prueba del Dinitro Cloro Benceno (DNCB) El D NC B es uno de Jos agentes quím icos utilizados en las reacciones de hipersensibili­ dad por contacto, es altamente sensibilizante y puede causar reacciones necróticas severas. Es por este motivo que se lo utiliza en pacientes donde se sospecha anergia, y sólo cuando las pruebas cutáneas con los antígenos com unes dieron negativas. Materiales ~ DNCB (agente sensib ilizan te) diluido en

767

E r ite m a y /o in d u ra e ió n e n un á re a m e n o r a la m ita d del sitio d e p ru e b a M a y o r in d u ra c ió n V e s ic u la c ió n U lc e ra c ió n

G RAD O D E P O SIT IV ID A D

+ ++ J-++ ++++

En el caso supuesto de encontrarse en la p ri­ mera etapa de la reacción, sólo un eritema en el sitio sensibilizante, la reacción es de g rado mientras que un eritema en ambos sitios, control y sensibilizante, es grado +-1-+-1-. 5.I.3.2. Reacciones de dermatitis por contacto Los médicos alergistas y dermatólogos em ­ plean comúnmente la Prueba del parche para detectar reacciones de hipersensibilidad retar­ dada causadas por sustancias que se piensa que son las responsables de las reacciones de der­ matitis por contacto. Método 1. Aplicar el alergeno en la piel, en una con­ centración no irritante y cubrir el área con un apósito. 2. Pasadas las 48 h, quitar el apósito y obser­ var .la presencia de reacción inflamatoria en el sitio de aplicación del antígeno.

768

Metodologías

5.1.4. Interpretación de las pruebas de hipersensibilidad retardada cutánea

3. Calcular número de células de la siguiente manera:

La estandarización de los antígenos que se utilizan en los reactivos comerciales disponi­ bles, para pruebas de hipersensibilidad retarda­ da cutánea, es insuficiente o no existe y, entoQces, la comparación entre estudios es difi­ cultosa. Los materiales utilizados se preparan por di­ lución a partir del m aterial stock com ercial. Con el propósito de realizar una buena inter­ pretación de los resultados, las diluciones de cada nuevo lote deberían ser probadas por su reactividad y potencia en voluntarios normales. Es im portante establecer la concentración adecuada de antígeno a ser utilizada en estos ensayos. Cuando se utilizan concentraciones demasiado altas de la sustancia a probar, pue­ den ocurrir reacciones falsas positivas. Las reacciones falsas negativas pueden deberse a concentraciones demasiado bajas. Las diluciones de los antígenos se deben pre­ parar en el momento ya que podrían perder ac­ tividad por adsorción de proteínas a la superfi­ cie del frasco de vidrio o por aceleración de la descomposición de las proteínas en las solucio­ nes diluidas. En los individuos que están muy sensibiliza­ dos pueden ocurrir reacciones locales severas. En ciertas personas las pruebas de hipersensibi­ lidad retardada cutánea pueden causar necrosis dérmica y el tratamiento indicado en estos ca­ sos sería dar corticoides orales o parenterales según la severidad del caso. Los recién nacidos menores de 6 semanas de vida, rara vez dan respuestas de hipersensibili­ dad retardada, y luego la respuesta depende de la exposición antigénica. P or ejem plo, una reacción de hipersensibilidad retardada cutánea positiva para los toxoides diftérico y tetánico, generalmente se desarrolla dentro del primer mes posterior a la prim era inm unización con esos antígenos.

N ú m e ro p ro m e d io

C é lu la s to ta le s

d e c é lu la s

e n los c u a tro c u a d ra n te

APENDICE 1. Determinación del número y de la viabilidad celular 1. Hacer una dilución adecuada de las células en SST (dependerá de la densidad original de cada tipo celular). 2. Colocar una gota de la suspensión celular en una cámara de Neubauer y contar el número de células por observación en un microsco­ pio óptico. Contar cada uno de los cuatro cuadrantes de la cámara, sumarlos y sacar el número promedio de células.

0,1 m ra^ (v o l. d e c a d a c u a d ra n te )

N ú m e ro to ta l d e c é lu la s p o r m i (cél/cm ^)

[N ú m e ro p ro m e d io d e cé lu la s] =

X d ilu c ió n X

10^

0,1 m m '

4. Para ajustar una suspensión celular a una densidad determinada, aplicar la siguiente ecuación; Vi

X

Ci = Vf

X

Cf

Vf Vi = -

X

Cf

Ci 2. Determinación de la viabilidad celular por el método de exclusión del azul tripán Para determinar el número de células viables presentes en una suspensión se utiliza la técni­ ca de exclusión de un colorante. Este método se fundamenta en la capacidad de excluir cier­ tos colorantes como el azul tripán, la eosina o el propidio, por parte de las células vivas que poseen m em branas celulares intactas. Por el contrario, las células muertas son penetradas por el colorante y se tiñen. Para ello, se mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se examina en el microscopio para determinar si las células tomaron o excluyeron al coloran­ te. En el caso de usar azul tripán, una célula viable tendrá el citoplasma refringente mientras que una célula no viable tendrá el citoplasma azul. 1. Resuspender el sedimento celular en SST o medio completo sin SFB. Las proteínas del suero se colorean con azul tripán y pueden causar resultados erróneos 2. Mezclar una parte de la solución de azul tri­ pán al 0,4% con una parte de la suspensión celular. Incubar la m ezcla alrededor de 3 minutos a temperatura ambiente. Las células se deben contar dentro de los 3 a 5 minutos de realizada la mezcla con el azul tripán, ya que períodos más largos de incu­ bación podrían conducir a la muerte celular y reducir el número de células viables, 3. Cargar una gota de la mezcla de las células y del colorante en una cámara de Neubauer y colocarla en un microscopio.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 4. Contar separadamente las células no colo­ readas (viables) y las coloreadas (no via­ bles). Para obtener el número total de células viables por mi, multiplicar por 2 el número total de células viables (factor de dilución por el azul tripán), ver punto 1 del apéndice. 5. Calcular el porcentaje de células viables se­ gún la siguiente fórmula: Número de cél. viables por mi >de células viables =

X

100

Número total de células por mi 3. M étodos para Usar glóbulos rojos 1. Por lisis hipotónica: a un volumen del sedi­ mento celular añadir un volumen de agua destilada, hom ogeneizar con una pipeta. Después de exponer las células al shock hipotónico durante 15 segundos añadir rápida­ mente medio de cultivo o SST 2X. Hom o­ geneizar y centrifugar a 200 X g durante 10 m inutos y lavar las células sedim entadas con medio o SST. 2. Por lisis con solución tam ponada de TrisCloruro de amonio. Para preparar la solu­ ción de trabajo de Tris-Cloruro de amonio ver su preparación al final de capítulo. Para producir la hsis de los glóbulos rojos conta­ minantes, centrifugar las células y agregarle 1 ral de buffer Tris-NH^Cl pH 7.2. Agitar a temperatura ambiente por 2 minutos. Prote­ ger las células agregando SFB y centrifugar a 300 X g durante 10 minutos. Si la lisis de los eritrocitos no fue completa repetir el tra­ tamiento. Lavar las células dos veces con SST antes de usar.

769

2. Retornar la inicroplaca a la estufa de culti­ vo, e incubar por 4 a 24 h adicionales. La duración del período de marcación debe ser determ inada em píricam ente para cada cultivo. Un período de marcación de toda la noche (18 a 24 h) es conveniente y m inim i­ za los efectos de la síntesis asincrónica del ADN por los hnfocitos. 3. Recoger los cultivos sobre papel de fibra de vidrio utilizando un cosechador de células. Aspirar las células y lavar varias veces con agua para lisar las células y tran sferir el ADN al papel permitiendo que se elim ine la [^H]-TdR no incorporada, 4. Secar los papeles en estufa a 37“C o en mi­ croondas, y posteriorm ente, colocar cada uno en un vial de centelleo líquido. 5. Eluir la pHJ-TdR incorporada con el líquido de centelleo (véase al final de este capítulo). Contar la radiactividad incorporada (cpm) en un contador de centelleo líquido del tipo p, 5. Cuantificación de la síntesis de ADN u sando el ensayo colorimétrico de MTT Para la determ inación colorim étrica d e la síntesis del ADN se utiliza la sal de tetrazolio [3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro] (MTT), que al ser clivada por las mitocondrias activas, vira del color amarillo a un producto (formazan) soluble en HCl-isopropanol que es de color azul y puede ser de­ tectado en un lector de policubetas a 570 nm (Mosmann, 1983), Este ensayo provee un m é­ todo simple para detectar células vivas crecien­ do, sin el uso de radiactividad. M ateriales

4. Marcación de células con timidina tritiada para la determinación de la proliferación celular en microplacas

~

Materiales

M étodo

1 |aCi/m] de [^H] metil timidina ([^H] TdR, 6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027). - Medio RPMI completo sin suero. - Papel de fibra de vidrio. - Aparato cosechador de células manual o semiautomático (NUNC, SKATRON).

1. Disolver el MTT en SST (solución stock de 5 mg/ml). Filtrar para esterilizar y elim inar los residuos insolubles. 2. Adicionar 10 )il de la solución de MTT/SST en cada pocilio (conteniendo 100 ¡xl de célu ­ las). Incubar las células a 37°C, en la estufa g asead a con 5% de CO, durante 4 h. El M TT reemplaza a la pH]-TdR, 3. Adicionar 100 \x\ de HCl 0,04 N en isopro­ panol en cada pocilio. Pipetear tres o cuatro veces para disolver los cristales azules oscu­ ros. Dejar las placas unos minutos a tem pe­ ratura ambiente hasta que los cristales se solubilicen.

Método 1. Agregar 1 ¡iCi de [^Hl-TdR por pocilio, di­ luyendo 1:20 la solución de Im C i/m l de [^H] metil timidina con RPMI completo sin SFB. Colocar 20 |J,1 de esta dilución de [’’H]TdR en cada pocilio de la microplaca.

MTT (Sigma#M-2128). HCl 0,04 N en isopropanol. Filtros de 0,22 |U,m. Lector de microplacas con filtro de 570 nm.

770

Metodologías

4. Leer las placas en el lector de microplacas utilizando un filtro de 570 nm. El color es estable unas pocas horas a temperatura am­ biente.

- MgCI^ 0,5 mM - MgSO, 0,6 mM - D-glucosa 5,6 mM Agregar agua destilada hasta completar un litro y ajustar el pH a 7,4.

Soluciones tam ponadas y reactivos quím icos Líquido de centelleo - 5 g de 2,5- difeniloxazol (PPO) - 0,3 g de 1,4-bis [-2-(5-feniloxazolil)]-benceno (POPOP) - 2 ml de ácido acético glacial Llevar a 1 litro con tolueno y agitar durante 1 h. Este reactivo debe ser usado dentro de los 6 meses y guardarse en un frasco oscuro. Medio de cultivo IM D M completo: es el medio de Dulbecco modificado por Lscoves “ L-glutamina 2mM ~ 2-Mercaptoetanol 50 |iM - Estreptomicina 160p,g/ml - Penicilina 100 U/ml Al medio ÍMDM completo suplementado con 5% de suero, descomplementado por calenta­ miento a 56”C durante 30 min, se lo cita como IMDM-5. Medio de cultivo RPM I completo - RPMI 1640 ~ L-glutamina 2 mM - 2-Mercaptoetanol 50 jiM - NaCOjH 2 g/l - Estreptomicina 160 [tg/ml - Penicilina 100 U/ml Al medio así preparado se lo denomina com­ pleto. Cuando al medio RPMI 1640 completo se lo suplementa con 10% de SEB u otro suero, descom plem entado por calentam iento a 56“C durante 30 min, se lo cita como RPMl-lO. Solución salina tamponada (SST) ~ N a C I9 g (1 5 4 m M ) ^ Na^HPO, 1,15 g (anhidro) (8,1 mM) - N a H 2 P 0 ,0,23 g (anhidro) (1,9 mM) Agregar agua destilada hasta 900 ml y ajustar a pH 7.2-7.4 utilizando N aOH IN o HCl IN. Adicionar agua hasta 1 litro. Solución de Hanks -

NaCl 137 mM KCl 5.4 mM Na^HPO^ 0,3 mM KHjPO, 0,4 mM NaHCOj 4,2 mM CaCL 1,3 mM

Solución para lisar glóbulos rojos (Solución tamponada de Tris-Cloruro de amonio) Solución tamponada stock - N H p 0,16 M (8,3 g/l) - Tris 0,17 M, disolver 20,6 g de Tris en 900 ml de agua destilada, ajustar a pH 7,65 con HCl IN. Completar a 1000 ml. Solución tamponada de trabajo 9 0 m ld e N H 4 C I0 ,1 6 M - 10 m id e Tris 0,17 M ,p H 7,65. - Ajustar a pH 7,2 con HCl IN. -

Solución de Gey - S o lu c ió n I. N aC l 35 g; K Cl 1,85 g; N a2H PO ,.l2 H ,0 .5 g; K H ,P 0 , 0,119 g; glucosa 5 g; rojo fenol 0,05 g; agua destilada hasta 1 litro. ^ Solución II. MgCIj. 6 H p 0,42 g; M gSO, 7 H 2O 0,14 g; CaClj 0,34 g; agua destilada hasta 1 0 0 ml. - Solución III. NaHCOj 2,25 g; agua destilada hasta 1 0 0 ml. Esterilizar en autoclave cada una de estas solu­ ciones. En el momento de usar, mezclar 20 ml de la solución I, 5 ml de la solución II, 5 ml de la solución III y 70 ml de agua destilada estéril. Solución salina fosfatada de Dulbecco - S o lu c ió n I. N aC l 4 0 ,4 5 g; K C l 1,45 g; KH^PO, 1,45 g; Na^HPO, 5,49 g; agua desti­ lada hasta 400 ml. - Solución II. CaClj 0,95 g; agua destilada hasta 50 ml. ~ Solución III. M gCl 2 0,95 g; agua destilada hasta 50 ml. Esterilizar en autoclave cada una de estas solu­ ciones. En el momento de usar, mezclar 80 ml de la solución I, 10 ml de la solución II, 10 ml de la solución III y 900 ml de agua destilada estéril. Preparación de la columna de lana de nylon Este protocolo describe la preparación de la la­ na de nylon para el enriquecimiento en linfoci­ tos T.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes Material ~ -

HCl al 1%. Lana de nylon (nueva o reciclada). Guantes de amianto. Jeringa descartable de 12 a 20 ml.

Método 1. Colocar la lana de nylon en un vaso de pre­ cipitado de 4 litros. Saturar con un volumen en exceso de HCl al 1%. 2. Hervir 5 a 10 minutos para remover conta­ minantes. Las burbujas de aire formadas como conse­ cuencia de la ebullición son atrapadas deba­ jo de la lana de nylon lo que resulta en m o­ vimientos violentos del recipiente. Usar los guantes para mantenerlo firme. 3. Dejar enfriar y luego descartar el líquido. Exprimir la lana de nylon para liberar el lí­ quido atrapado y lavar con agua. Repetir al menos 10 veces para extraer todo el HCl (controlar de llegar a pH neutro). 4. Secar la lana de nylon a tem peratura am ­ biente y pesar la cantidad apropiada. 5. Peinar la lana de nylon con un cepillo hasta que no tenga nudos y triplique su volumen. 6. Remover el émbolo de la jeringa y usarlo para colocar la lana de nylon dentro de la jeringa. Insertar el émbolo para para com ­ pactar la lana de nylon. Presionar firm e­ mente. 7. A u to c la v a r las c o lu m n a s 15 m in u to s a 110«C. Las columnas de lana de nylon esterilizadas se pueden guardar durante meses a tempera­ tura ambiente.

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B o y u m , A . Iso la tio n o f m o n o n u c le a r c e lls an d g r a n u lo c y te s fro m h u m a n b lo o d . S c a n d . J. CU n. l^ab. In v e s t S iip p l 2 1 ,7 7 -8 9 ,1 9 6 8 . G illis, S. & S m ith , K . L o n g -te rm c u ltu re o f tu m o r -s p e c if ic c y to to x ic T c ells. N a tu re , 26 8 , 1 5 4 -1 5 6 , 1977. H o o k s , J. & D e tric k , B . E v a lu a tio n o f th e in te rfe ró n sy stem . p 2 4 0 -2 4 3 . In R o se , N, C o n w a y d e M a ca rio , E ., F a je y , .1,, F rie d m a n , H , & P e n n , G ( e d ito rs ), M a n u a l o f cUn ic a l la b o ra to ry im m u n o lo g y , 4 th ed . A m e ric a m S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n , D .C . 1992. J u liu s , M ., S im p s o n , E ., & H e rz e n b e rg , L . A ra p id m e th o d f o r th e is o la tio n o f f u n c tio n a l th y m u s - d e r iv e d m ii r i n e ly m p h o c y te s . E u r. .1. I m m u n o l. 3, 6 4 5 -6 4 9 , 1973. K a m m e r , G . M . T - ly m p h o c y te a c tiv a tio n . p 2 0 7 - 2 1 2 . In R o s e , N , C o n w a y d e M a c a rio , E ., F a je y , J., F rie d m a n , H, & P e n n , G (e d ito rs ). M a n u a l o f c lin ic a l lab o ra to ry i m m u ­ n o l o g y , 4 t h e d . A m e r ic a m S o c ie ty f o r M ic r o b io l o g y , W a s h in g to n , D .C . 1992. K ra ft, A ., A n d e rs o n , W ., C o o p c r, H . & S a n d o , J. D e c r e a s e in c y to s o lic c a lc iu m /p h o s p h o lip id - d e p e n d e n t p r o te in l á ­ ñ a s e a c tiv ity f o llo w in g p h o rb o l e s te r tre a tm e n t o f E I .4 th y m o m a c e lls. J. B io l. C h e m . 251, 1 3 1 9 3 -1 3 1 9 6 , 1 9 8 2 . L e P e u c h , C ., B a lle s te r, R . & R o s e n , O . P u rified ra t b ra in c a l c i u m a n d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o te in k i n a s e p h o s p h o rila te s r ib o s o m a l S6. P ro c. N a ti. A cad . S ci. U S A , 8 0, 6 8 5 8 -6 8 6 2 , 1983. M a g e , M , M c H u g h , L .L ., & R o th s te in , T . L. M o u s e ly m ­ p h o c y te s w ith and w ith o u t su rfa c e im m u n o g lo b u lin : P re p a r a t iv e s c a le s e p a r a tio n in p o ly s ty r e n e tis s u e c u l t u r e p la te s c o a te d w ith s p e c ific a lly p u r ifie d a n ti- im m u n o g lo ­ b u lin . J , I m m u n o l. M e th o d s , 15, 4 7 - 5 6 , 1977. M a g e , M , M a th i e s o n , B ., S h a r r o w , S ., M c H u g h , L . L ., H a m m e r lin g , U ., K a n n e lo p o u lis -L a n g e v in , C ., B r id e a u J r., D ., a n d T h o m a s III, C . P rc p a ra tiv e n o n -ly tic s e p a r a ­ tio n o f Lyt2-i- an d L y t2 - T ly m p h o c y te s , fu n ctio n al a n a ly ­ sis o f th e se p a ra te d c e lls , and d e m o s tra tio n o f s y n e rg y in g ra ft v e rs u s h o s t re a c tio n o f L.yt2+ a n d L y t2 - c e lls , E u r. J, Im m u n o l., 11: 2 2 8 -2 3 5 , 1981. M o s m a n n , T . R a p id c o lo rim e tric a ssa y fo r c e ilu la r g r o w th a n d s u rv iv a l: A p p lic a tio n to p r o lifc r a tio n and c y to t o x i c ity a s sa y s . J, Im m u n o l. M e th o d s , 6 5 , 5 5 -6 3 , 1983. N o rm a s d e b io se g u rid a d . V IH , el v iru s d e la in m u n o d e f ic ie n c ia a d q u irid a h u m a n a . M in is te rio d e Salu d y A c c ió n S o c ia l S e c re ta ría d e S a lu d , B u e n o s A ire s , 1988, W y s o c k i, W , L, an d S a to , V . L, P a n n in g fo r ly m p h o c y te s : A m e th o d f o r c ell se le c tio n , P ro c , N a ti, A cad , Sci, U S A , 7 5 ,2 8 4 4 - 2 8 4 8 , 1978,

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ANEXO Aplicaciones de ia inmunogenética al diagnóstico de leucemias y linfomas

M. LEONARDO SATZ M. ROSA PADRÓS NORA HALPERIN LEONARDO FAINBOIM

IN T R O D U C C IÓ N El desarrollo de la tecnología para la produc­ ción de anticuerpos monoclonales (AcM) (cap. 37) ha permitido en los últimos años una mejor comprensión de los procesos de maduración de los leucocitos. Habíamos visto en los capítulos anteriores (5 y 6) que, durante la diferenciación linfocitaria B en la médula ósea y T en el timo, los distintos estadios de maduración se caracte­ rizan por la expresión diferencial de un conjun­ to de moléculas en la superficie celular y por reordenamientos en los genes de inmunoglobu­ linas y receptor T. Asimismo, existen numero­ sas moléculas de superficie celular (CD), que son específicas de la serie mieloide, eritrocítica y plaquetaria (véanse más detalles en el Anexo listado CD, Apéndice Cap. 2). Las leucemias y los linfomas constituyen un grupo de enfermedades caracterizadas por una proliferación maligna de las células presentes en la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos o bazo. La patología puede afectar cualquiera de los tipos celulares presentes en dichos tejidos: células de la serie eritrocítica, mielomonocítica o linfocitaria B y T. La correcta identificación del tipo celular involucrado resulta crucial tan­ to para el avance en la comprensión de la bio­ logía y la patogénesis de estos tumores como para predecir el pronóstico y decidir el correcto tratamiento de cada uno de ellos. El diagnóstico habitual surge de una serie de pautas entre las cuales la clínica, la morfología de las células al microscopio óptico y la expre­ sión de enzimas específicas de linajes, son las más útiles. Las células malignas constituyen un clon que se ha expandido a partir de una célula que se ha detenido en su maduración normal y

se replica desreguladamente, a partir del proce­ so de “leuceraización”. La disponibilidad de una colección de AcM dirigidos contra los di­ versos CD leucocitarios, perm ite contar con una herramienta complementaria para identifi­ car el linaje celular involucrado en la patología. Básicam ente, m ediante técnicas de inm unomarcación (véase más adelante), se cuantifican los porcentajes de células reactivas contra cada AcM . T eniendo en cuenta el porcen taje de blastos (o células con morfología anómala) en la muestra, el porcentaje de células positivas para un marcador dado y los valores habitual­ mente normales para ese marcador en ese teji­ do, se establece el linaje afectado. En muchos casos, la tipificación de la leucemia se realiza con los elementos diagnósticos mencionados antes; otras veces, la definición del subtipo in­ munológico es decisiva en la distinción de las leucemias mieloides de las hnfoides, para las cuales hay diferencias en el pronóstico y el tra­ tamiento. Tipificación de leucemias y linfomas De acuerdo al grado de maduración de la cé­ lula afectada y a una serie de características clí­ nicas, las patologías se agrupan en agudas y crónicas, y podrán afectar en ambos casos a las series B, T o mielomonocítica. Leucemias agudas En el cuadro 36-7 se muestran los fenotipos que caracterizan a las leucemias agudas, con dos o tres AcM específicos para cada linaje hematopoyético, B, T y mieloide.

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes C u ad ro 36-7. Clasificación inmunológica de las leucemias agudas A ntígenos de diferenciación

LLA-B'^'^

L L A -T

C D IO C D I9 CD 22* CD3 CD5 CD7 C D 13 C D 33 aM PO *

LM A

-/+

773

inmaduras sólo expresan HLA-DR, CD34 y la enzima TdT. Luego adquieren CD19 (LLA-nulas) y luego el CDIO (LLA-comunes). La frecuencia de los distintos subtipos de LLA en la población de la Capital Federal y Gran Buenos Aires en el período 1983-1986 fue la siguiente: LLA común, 73,9%, LLA nu­ la, 11,7%; LLA-T, 13,4%; LLA indiferenciadas, 3%, y LLA-B, 0,84% (experiencia de los autores, sobre la base de más de 250 casos es­ tudiados). Estos resultados son similares a los observados en otros centros europeos con p o ­ blación caueasoide.

Exprejiión citoplásm ica. ** L L A -B te m p ra n a (C D 1 0 -), co m ún (C D IO ) y pre-B (m u-cito)

L EU C EM IA S LIN FO B LÁ STIC A S A G U D A ST LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDAS (LLA) Los primeros marcadores utilizados para di­ ferenciar los subtipos de LLA, fueron el recep­ tor para los GRC (rosetas E), que identificaban a las LLA-T, y las Igs de superficie (slg) que identificaban a las llamadas LLA-B. Posterior­ mente se describieron antisueros contra el Ag de diferenciación CDIO (anti-CALLA), que reaccionan con las células de un 70% de las LLA, con pronóstico más favorable que las an­ teriores. Originalmente, a las de este subgrtipo de LLA se las denominó “comunes” (por su fre­ cuencia) y se les asignó un linaje “no T, no B”. Posteriormente, con la definición de otros mar­ cadores de linaje celular (HLA-DR, p. ej.), la observación de un pequeño porcentaje de célu­ las normales en médula ósea con igual fenotipo, y la detección de reordenamientos en los genes de Igs en estas células, se concluyó que las LLA no T-no B, constituyen células del linaje B, en estadios tempranos de diferenciación. Más recientemente, la identificación de nue­ vos marcadores de diferenciación de la serie B permitió definir nuevos subtipos de LLA: des­ de los estadios más indifereneiados hasta los más maduros (cuadro 36-8). Las células más

Como dijimos antes, las LLA-T representan alrededor de un 15% de las LLA. El m arcador más útil para detectar una LLA-T es el CD7 ya que está presente en la mayoría de los tim oci­ tos y células T y ausente en las LLA de estirpe B. El cuadro 36-9 muestra la clasificación de las LLA-T de acuerdo al nivel de diferencia­ ción tím ica. El grupo I incluye a las células más inmaduras, que expresan CD2 (rosetas E) CD5 y CD7. En este estadio las células ya han reordenado los genes T-beta y pueden tener o no T-alfa reordenado (véase cap. 7 y más ade­ lante en este cap.). El grupo II expresa, además, CDI, C D 4 y CD8 sobre la misma célula y un 25% de los ca­ sos expresa también CD3. Las células han reo r­ denado y expresan T-beta. El grupo III representa los timocitos m adu­ ros y linfocitos T periféricos, los cuales c a re ­ cen de C D l, expresan CD3 junto a CD4 en al­ gunos casos o a CD8 en otros; poseen reordenados y expresan T-alfa. Leucemias mieloides agudas (LMA) Se han descrito AcM que reconocen m arca­ dores presentes en células de estirpe mieloide maduras e inmaduras, pero ninguno de ellos es

C uadro 36-8. Fenotipos principales que caracterizan a los subtipos de LLA de linaje B Antígenos de diferenciación CD 34 H L A -D R CD 19 C D IO CD 20 m u c ito p . s lg TdT

In d if + +

Nula -v

-

+ +

-

-

Com ún - /+ + + +

p re-B

-

-

....

+ r + f -

+

+

- /+

....

-

- /+

' B

_ + -f ...

-r --

774

Metodologías

C uadro 36-9. Clasificación de las LLA-T A ntígenos de diferenciación CD7

CD5

CD2

CD3

CD4

CD8

CDI

G ru p o I

+

+

+ (7 5 )

-

-

-

-

G ru p o 11

+

+

+

+ (2 5 )

+

+

+

G ru p o III

+

+

+

+

+ /-*

+ /-*

-

* N o p re sen ta ex p resió n s im u ltán e a de C D 4 y C D 8 co m o en el g ru p o 11. Se indica en tre p arén tesis el p o rc en taje d e casos positivos.

específico de células leucémicas; sin embargo, la presencia de CD34 junto con los anterior­ mente mencionados indica que estamos en pre­ sencia de un proceso leucém ico. El cuadro 36-10 muestra los fenotipos inmunológicos de las LMA segtin la clasificación de la FAB. Hay gran variación en la expresión de estos marca­ dores en distintas leucemias. Por otra parte, no hay una correlación entre la expresión de deter­ minados marcadores y las patologías clasifica­ das según la FAB. Usualmente se incluye un marcador pan-mieloide que reconoce tanto pre­ cursores de granulocitos como precursores de monocitos, como el CD13 o CD33, para el pri­ mer análisis de una leucemia aguda de estirpe desconocida. La LMA-MO es un ejemplo típico de la ne­ cesidad de evaluar el inmunofenotipo para lle­ gar a un correcto diagnóstico, ya que en ella la m orfología de los blastos se asem eja a una LLA y este estadio es negativo para la citoquímica mieloide. Leucem ias bifenotípicas agudas Se han descrito casos en los que la misma célula blástica coexpresa marcadores indicati­ vos de linajes celulares diferentes. Esto puede deberse a la presencia de una leucemia bifenotípiica aguda (LBA) que afectan a células em­ brionarias multipotentes, con una diferencia­ ción genotípica y fenotípica multilineal; alter­ nativam ente, puede tratarse se una leucem ia aguda mieloide, B o T, en las cuales las células expresan aberrantemente algún marcador adiC u a d ro 36-10. Fenotipos inm unológicos de las LMA Estadio de la EAB M 0 ,M 1 , M 2 M3 M 4, M 5 M6 M7

Fenotipo inm unológico G D I 3, C D 3 3 , C D 3 4 , M P O , H L A -D R C D 1 3 , C D 3 3 ,M P O C D 1 3 , C D 3 3 , G D 1 4 , C D 6 8 , H L A -D R C D 3 3 , a n ti-g lic o fo rin a A C D 3 3 ,C D 4 1 ,C D 4 2 , C D 61

cional. Para distinguir ambas situaciones el Dr. Catovsky propuso un sistema de scores (cuadro 36-11), en cual la presencia de ciertos marca­ dores tiene mayor peso para definir una LBA. Así, por ejemplo, si una LA con marcadores mieloides expresa además CD22 citoplásmico y CDIO o CD19, el score será de 3 y la leuce­ mia se define con bifenotípica; si sólo expresa CDIO o CD I9 como marcador fuera de linaje, el score será de 1 y, por lo tanto, no será bife­ notípica sino simplemente una LMA. Desórdenes linfoproliferativos de la serie B madura Se caracterizan por la proliferación clonal de células con fenotipo maduro y comprenden la leucemia linfática crónica (LLC-B), leucemia prolinfocítica (LPL), leucemia a células vello­ sas o tricoleucemia (LCV), mieloma múltiple (M M ), m acroglobulinem ia de W aldenstróm (MW) y linfomas (LE). El cuadro 36-12 resu­ me los marcadores inmunológicos que caracte­ rizan a estas patologías. Las células de las LLC-B expresan recepto­ res para eritrocitos de ratón e Igs de superficie; la clonalidad se demuestra por la expresión de un solo tipo de cadena liviana, ya sea kappa a lambda, sobre la superficie celular. La densi­ dad de expresión de las Igs de superficie es m e­ nor, sin embargo, que la presente en otras pato­ logías, como los linfomas linfocíticos y leuce­ mias prolinfocíticas. Las LLC-B expresan tam ­ bién el antígeno CD5, típico de la serie T. Se lo encuentra normalmente en una pequeña sub­ población celular en los ganglios linfáticos. E s­ tudios de ontogenia han demostrado que repre­ senta la prim era población que coloniza los ganglios linfáticos y daría origen al resto de la población B en ellos, que luego pierden este marcador. Identificaría entonces a las células en transición entre la médula ósea y el ganglio. Las células de las LLC-B poseen sus genes de cadena pesada y liviana reordenados y un 10% de los casos presentan* también reordena­ mientos de T-beta (véase más adelante).

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

775

Cuadro 36-11. Sistema de scores para distinguir la leucemia bifenotípica aguda Puntos

Linaje

2 1 0,5

B

r

cC d 2 2 C D IO CD 19 TdT

cC D 3 CD2 CD 5 TdT CD7

M M PO* C D 13 C D 33 C D l) b ,c C D l 4 /5

c, C ito p lásm ica . * D e m o stra ció n d e M P O p o r cu a lq u ie r m étodo. El scorc del m a rc a d o r fu e ra d e lin aje ce lu la r deb e ría ser > 2 p ara d ia g n o s tic a r q u e la leu c em ia ag u d a en cuestión es bifenotípica.

C uadro 36-12. Fenotipo inmunológico de las enfermedades linfoproliferativas de la serie B m.adura M arcador R o se ta s M sig C D 19, C D 20 CD5 C D 21 C D IO C D 25 P C A -I PC -1 C D 38

LLC -B

LPL

++ -/+

LF

I.C V

-/+ ++

-/+ ++

M M /M W

-/+ -/+

-/+

-/+

Las células de los desórdenes malignos de la serie B expresan también marcadores típicos de células B: HLA-DR, CD19, CD20, excepto en el miel orna múltiple y en la macroglobulinemia de W aldenstrSm , que afectan a plasm ocitos. Estos últimos expresan, además, CD38, PC A l y PCI. Desórdenes linfoproliferativos crónicos de la serie T El fenotipo de estas patologías corresponde a células postímicas, es decir, siempre son nega­ tivas para TdT y C D l, este último expresado frecuentemente en linfomas linfoblásticos T y en un subtipo de LLA-T. El cuadro 36-13 resu­ me el fenotipo inm unológico de estas patolo­ gías, útil en su clasificación y diagnóstico: leu­

cem ia linfática crónica T (LLA-T), leucem ia prolinfocítica crónica T (LPL-T), leucemia-linfoma T del adulto (LLTA) y linfoma cutáneo de células T (LCCT). La naturaleza elonal de estas patologías se puede evidenciar por reo r­ denam ientos de los genes T -beta y T -g am a (véase más adelante). Con excepción de la LLC-T, todas las pato­ logías se caracterizan por la proliferación de células T CD4+. Existe, sin embargo, una h ete­ rogeneidad funcional: las células de las L CC T y LPL-T se comportan in vitro como coopera­ doras, mientras que las células de las LLTA ac­ túan como potentes supresores de la diferencia­ ción B. No se sabe si esto refleja la afección de ' dos o más subpoblaciones T CD4 diferentes, o alteraciones funcionales como consecuencia de la patología.

C uadro 36-13. Fenotipo inmunológico de las patologías malignas de células T maduras M arcador CD5 CD3 CD4 CD8 CD2 CD7 C D 25

L L C -T

_ + -

+ + -

L P L ^T

LLTA

LC C T

+ + +

+ + +

+ + +

+ +

+

+

-

+

-

_

776

Metodologías

Las células malignas de las LCCT se carac­ terizan por su núcleo cerebriforme. En las mi­ cosis fungoides estas células aparecen en la piel y son CD7+, mientras que en el síndrome de Sézary están en sangre p e riférica y son CDT. La LLTA es una patología asociada frecuen­ tem ente, aunque no siempre, a un retrovirus humano llamado HTLV-L Se presenta en Ja­ pón, Caribe y EE. UU. Las células son de feno­ tipo cooperador y expresan además la cadena beta (p55) del receptor para la lL-2 (CD25). Luego de 24-48 horas en cultivo, estas células expresan en el citoplasma las proteínas virales pl9 y p24. Las células CD8+ de algunas LLC-T exhiben función de ADCC y rara vez actúan como efec­ tores supresores o NK. Algunos casos de LLCT coexpresan CD4 y C D ll o CD8 y C D Il, y son de peor pronóstico que las de fenotipo más común, CD8, CD3.

Procedimiento experimental La detección de los antígenos de membrana se realiza por inmunofluorescencia (lE) directa o indirecta. Generalmente se realiza IF directa para la detección de Igs de superficie, mientras que los marcadores de diferenciación reconoci­ dos por AcM murinos se detectan por IF indi­ recta. La estrategia diagnóstica para una muestra con diagnóstico presuntivo de leucemia aguda, involucra una prim era evaluación de los si­ guientes marcadores; HLA-DR, CD7, Igs de s u p e rfic ie , C D IO , C D 2 0 , C D 1 9 , C D 33 y C D I4. Si el porcentaje de células CD7“^ suma­ do al número de blastos leucémicos es mayor de 100, indicará la presencia de una leucemia aguda T y se evalúan los siguientes marcado­ res: CD2, CD5, CD8, CD4, CD3, CDL Para las leucemias crónicas, una primera in­ vestigación incluye: H LA -D R, CD7, CDIO

F ig . 3 6 -1 3 . G rá fic o s d e d o b le flu o re s c e n c ia o b te n id o s p o r a n á lis is d e c ito m e tría d e flu jo , (a ) G rá fic o d e d o t p lo t, d o n d e la s o rd e n a d a s p o s e e n u n a e s c a la lo g a r ítm ic a d e in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia (F L 2 ) p a ra el m a rc a d o r C D 1 9 y las a b s c is a s u n a e s c a la s im ila r p a ra F L l (C D IO ). El o p e ra d o r d e fin e lo s c u a d ra n te s te n ie n d o e n c u e n ta lo s v a lo re s b a s a le s d e flu o re sc e n c ia , (b ) G rá fic o d e c o n to rn o s d e la s m is m a s c é lu la s, (c) A n á lis is d e l % d e c é lu la s p re s e n te s e n c a d a c u a d ra n te : U L (su p e rio r iz q u ie rd o ), U R ( su p e rio r d e re c h o ), L I. (in f e rio r iz q u ie rd o ) y L R (in fe rio r d e re c h o ). S e in d ic a ta m b ié n el n ú ­ m e ro d e c é lu la s r e g is tra d a s en c a d a c u a d ra n te (ev e n ts ), y el p o r c e n ta je d e las m is m a s s o b re el to ta l d e c é lu la s p a s a d a s p o r e l a p a ra to o s o b re un g ru p o d e célula.s (g a te d ) p r e -s e le c c io n a d a s p o r el o p e ra d o r, en b a s e a u n p a rá m e tro (p .e j. ta m a ñ o : b ia s to s le u c é m ic o s ). T a m b ié n se re g is tra la in te n s id a d m e d ia d e flu o re s c e n c ia p a ra c a d a m a rc a d o r (X m e a n y Y m ea n ).

Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes CD3, CD33, Igs de superficie, CD20, CD5. De ser positivos CD3 o CD7, se identifican las subpoblaciones T CD4, CD8, C D l. Si las Ig de superficie son positivas, se detecta la monoclo­ nalidad kappa/lambda. A SPEC T O S T EC N IC O S Se obtiene la m uestra (sangre periférica o m édula ósea) con heparina. Es conveniente procesarla a la brevedad, aunque puede perm a­ necer hasta 24 horas a tem peratura ambiente con una leve disminución de la viabilidad ce­ lular. Se diluye la muestra a la mitad o a la ter­ cera parte (si el recuento leucocitario superior es 25.000/mm^), con solución salina tampona­ da (PBS). Las células mononucleares se obtie­ nen por centrifugación de 10 ml de la muestra diluida sobre 3 ml de Eicoll-Hypaque, 20-30 min a 400 x g. Se obtienen ]as células mononucleares de la interfase y se lavan tres veces con PBS. Se cuenta el número de células/ml y se ajusta la concentración a lO^/ml. Para IF in­ directa, se centrifugan 10® células a 300 g por 5 min y se descarta el sobrenadante. Se resus­ pende el sedimento celular y se agrega el AcM (volumen y dilución indicadas por el fabrican­ te y previa titulación en el laboratorio). Se in­ cuban las células 30 min a 4"C. Luego se lavan

777

las células dos veces con PBS conteniendo 0 ,1% seroalbúmina bovina y 0,1% azida sódi­ ca. Al sedimento celular resuspendido se agre­ ga el segundo anticuerpo: F (ab)’2 anti-inmunoglobulina de ratón (cabra) conjugado con isotio cian ato de fluoresceína. Se incuba 30 min a 4"C, y se lava 2-3 veces con PBS suplem entado como antes. Si se dispone de A cM conjugados con fluorocromos, se puede re ali­ zar IFD. Análisis: si el resultado será determinado por microscopía de fluorescencia, después del últi­ mo lavado se resuspende el sedimento celular en un mínimo volumen de PBS (0,1 ml) y se observa entre portaobjeto y cubreobjeto con m icroscopio de epifluorescencia. Se cuentan 200 células y se registra el porcentaje de célu­ las fluorescentes. La intensidad de la fluores­ cencia es propiedad del número de moléculas presentes por célula y de la afinidad del Ac por su epitope. Por ello, es variable y se requiere, de gran entrenamiento del operador para las d eter­ minaciones. Por lo general el uso de un segun­ do anticuerpo, como fracción F(ab)’2, evita fal­ sos positivos. Hay numerosas leucemias (sobre todo de estirpe mieloide) que poseen receptores con alta afinidad para el fragmento Fe de las Igs y el uso de un segundo Ac como Ig total origina falsos positivos; para ello es necesario siempre incubar un blanco control de células

V 3 :2 2 8 3 0 0 3 /F L 1 -/F lu o re sc e n c e O ne Height C a d e n a L. Lam bda- % To tal= 13,19 M ean = 108.96

102

1Q3

F ig . 3 6 -1 4 . G rá fic o s d e h is to g ra m a s d e flu o re sc e n c ia o b te n id o s p o r c ito m e tr ía d e flu jo . L a s a b scisa s s e ñ a la n en e s c a la lo gíu'ítm ica ia in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia p a ra la p re s e n c ia d e c a d e n a s liv ia n a s k a p p a (a) y la m b d a (b ). L as o r d e n a ­ das re fle ja n el n ú m e ro re la tiv o d e c é lu la s a n a liz ad a s. E l o p e ra d o r d e fin e , se g ú n la f lu o re sc e n c ia b a s a l, a p a rtir d e q u é in ­ te n s id a d se c o n s id e ra rá p o s itiv a la m u e s tra (in d ic ad o c o n u n a lín e a h o riz o n ta l n e g ra ), (c) a m b o s h isto g ra m a s de ( a ) y ( b ) re s u m id o s e n u n g rá fic o trid im e n s io n a l.

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Metodologías

con el segundo Ac solamente. Estos blancos deben ser inferiores al 5%. Actualmente, muchos centros especiahzados determinan el porcentaje de células positivas por citometría de flujo (CF). Esta técnica per­ mite medir simultáneamente numerosos pará­ metros celulares; (a) tam año celular relativo {forward scatter)\ (b) com plejidad celular y granularidad del citoplasma (side scatter)\ in­ tensidad de fluorescencia relativa (F L l, FL2, pueden representar, por ejemplo, dos fluorocro­ mos diferentes). La CF permite identificar cé­ lulas patológicas aun cuando están presentes en muy pequeño porcentaje. Luego de incubadas con los AcM, las células se resuspenden en 1 mi de PBS para ser anahzadas por CF inmedia­ tam ente. T am bién pueden resuspenderse en PBS conteniendo fijadores, lo que permite con­ servarlas en la oscuridad a 4“C y leerlas días después. Las figuras 36-13 y 36-14 muestran ejemplos de cómo se grafican los resultados obtenidos. La figura 13 a (gráfico de “dot plot”) y 13b (“contour plot”) muestra dos formas de graficar la presencia de células que co-expresan CDIO (en E LI) y CD19 (FL2), que corresponden a una LLA común. La figura 13c registra el por­ centaje de células positivas en cada uno de los cuatro cuadrantes en que se ha dividido la figu­ ra 13a; UL (upper left) cuadrante superior iz­ quierdo, que contiene las células positivas para EL2 (CD19) pero negativas para FL l (CDIO) posee 8,5% de las células analizadas. UR; (up­ per right) cuadrante superior derecho, que po­ see las células positivas para ambos marcadores y registra un 64% de dobles positivas. LL se re­ fie re al cu ad ran te de las d o b les n eg ativ as (25.48%) y LR al que registra las células positi­ vas para FLl y negativas para FL2 (1.92%). La figura 36-14 muestra otra forma de graficar re­ sultados obtenidos por CF. Se trata de histogramas que poseen en el eje de las abscisas la in­ tensidad de fluorescencia y en las ordenadas, el número de células. Son útiles para analizar cé­ lulas teñidas sólo con un fluorocromo. La figura 2 gráfica resultados obtenidos con una LLC-B, donde las células fueron marcadas con un Ac anti-cadenas livianas kappa y anti-cadenas li­ vianas lambda. La figura 14a muestra que más del 86% de las células analizadas son positivas para kappa (con intensidad media relativa de 119) y sólo el 13,19% es positivo para lambda (fig. 14b). Esta distribución indica un exceso clonal de kappa en esta LLC-B. Reordenamientos genéticos como complemento diagnóstico La demostración de la presencia de una po­ blación celular monoclonal resulta crucial para

distinguir una proliferación benigna de una m a­ ligna. En más del 95% de los casos, la conjun­ ción del diagnóstico clínico, hematológico e in­ m unológico perm ite la correcta clasificación del tipo celular comprometido. En el 3-5% res­ tante el análisis no es concluyente. Por un lado es frecuente la existencia de un gran número de células normales junto con las células neoplásicas en el tejido analizado, y en patologías que afectan a células maduras será imposible dis­ tinguir las células afectadas. Lo mismo sucede en una médula ósea: no es posible distinguir células normales y un pequeño porcentaje de células malignas. Por otro lado, algunas neoplasias se caracterizan por células con propie­ dades de membranas alteradas que unen ines­ pecíficamente AcM dirigidos contra marcado­ res específicos de diversos linajes o realmente exhiben marcadores de dos linajes (leucemias bifenotípicas). En la actualidad, la biología m o­ lecular presenta una herramienta de diagnóstico complementaria para la correcta tipificación de estos casos dudosos. En los capítulos 6 y 7 se han descrito los procesos genéticos involucrados para el ensam­ blado de genes activos para la biosíntesis de la inmunoglobulinas (Igs) y del receptor T (recT). Obsérvese en la figura 36-15 que durante los procesos de reordenamiento genético se produ­ cen cambios en los sitios reconocidos por de­ terminadas nucleasas de restricción, alrededor de los genes involucrados. Mediante la utiliza­ ción de genes clonados del recT y de las Igs com o sondas m o lecu lares en la técn ica de Southern, es posible analizar el ADN extraído de las células tumorales y determinar la confi­ guración germinal o reordenada de los mismos (fig. 34-16). Una expansión monoclonal de cé­ lulas B o T constituye la progenie de una sola célula original. Esta población puede ser identi­ ficad a m ediante el an álisis m o lecu lar, aun cuando esté presente en proporciones tan bajas como un 5% en un tejido dado. Los linfocitos presentes en un tejido normal presentarán, cada uno de ellos, un reordenamiento característico propio, pero el pequeño número de células de cada clon que contribuye con su DNA al total no permite detectar la banda específica de cada clon por la sensibilidad de esta técnica. Para estudiar el ADN por estos procedimien­ tos, se requieren un mínimo de 2 x 107 células. El ADN purificado de estas células se digiere con enzimas de restricción, se fracciona en ge­ les horizontales de agarosa y luego de la elec­ troforesis se transfiere a membranas de nitroce­ lulosa o nylon. Dichas membranas se incuban (hibridan) con una sonda de ADN correspon­ diente a estos genes de Igs o rec T, marcada con radioisótopos (^^P) u otros métodos enzi­ máticos. Los fragmentos que posen secuencias

Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes

779

16 kb BamHI

Bam H I* Fam ilia de genes de cadena pesada S ondas 13 kb

(Línea germ inal) B am H I* Fam ilia de genes de ca de n a liviana Kappa

BamHI

i J.

i

Sonda Fig. 36-15. D u ra n te la m a d u ra c ió n Iin fo c ita ria se p ro d u c e n reo rd e n a m ie n to .s g e n é tic o s q u e a p ro x im a n u n gen v a ria b le (V) p ró x im o a u n g e n (en lo s g e n e s d e c a d e n a liv ia n a ) y u n g e n V d e c a d e n a p e s a d a p ró x im a a u n g e n D h y a u n g e n Jj^. E n to d o s e s to s s u c e s o s se p ie r d e n fra g m e n to s d e A D N , y c o n e llo s se p ie rd e n sitio s d e r e c o n o c im ie n to d e c ie rta s n u c le a s a s de re,stricción. E n la fig u ra , lo s sitio s in d ic a d o s con el a s te r is c o (* ), p ró x im o s a lo s g e n e s J, s o n lo s q u e in v a ria b le m e n te d e s a ­ p a re c e n p o r lo s re o rd e n a m ie n to s . E n c o n s e c u e n c ia , lo s fra g m e n to s g e n ó m ic o s d e te c ta d o s p o r las s o n d a s d e g en es c o n s ta n ­ tes, c a m b ia n d e ta m a ñ o re s p e c to d e la lín e a g e rm in al.

homologas a la sorvda utilizada se detectan por au to rrad io g rafía. D esde la obtención de la m uestra hasta la visualización de los resulta­ dos, el procedimiento lleva un mínimo de 3-5 días. Para la estirpe B se utilizan genes clona­ dos correspondientes a C-mu y JH de las cade­ nas pesadas de Igs, y para las cadenas livia­

nas de las Igs. Para la estirpe T se utilizan son­ das correspondientes a los genes T-beta y Tgamma. Por la organización genómica peculiar que poseen los genes T-alfa (una extensa fam i­ lia J-alfa dispuesta a lo largo de más de 60 kb de A D N ), es sum am ente d ifícil d eterm in ar reordenamientos en esta familia usando com o

Fig. 36-16. E je m p lo s re p re s e n ta tiv o s d e re o rd e n a m ie n to s d e lo s g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a s en p a to lo g ía s lin fo p ro ü f e ra tiv a s . S e d ir ig ió a p r o x im a d a m e n te 10 p g d e A D N p u r if ic a d o d e la s c é lu la s le u c é m ic a s , co n la e n z im a d e r e s t r i c c ió n B a m H I, y se la a n a liz ó p o r la té c n ic a d e S o u th e rn . C o m o s o n d a se u tiliz ó un fra g m e n to g e n ó m ic o d e 1,3 kb c o r r e s p o n ­ d ie n te al g e n Cfi. L a f le c h a in d ic a la p o s ic ió n d e u n a b a n d a d e 17 k b , c o rre s p o n d ie n te al fra g m e n to d e lín e a g e rm in a l. L a s mue.stra.s in d ic a d a s ¿i, c y / , s ó lo m u e s tra n ei fra g m e n to g e rm in a !. L a s m u e s tra s d y e m u e s tra n la p r e s e n c ia de u n a le l o en c o n fig u ra c ió n g e rm in a l y u n o re o rd e n a d o . L a m u e s tra b s e ñ a la la p r e s e n c ia d e a m b o s a le lo s re o rd e n a d o s .

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Metodologías

sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no excluye reordenamientos. IN T E PR E T A C IO N D E LOS RESULTADOS En las leucemias agudas de linaje B inmadu­ ro, las LEA nulas (C D l9+ HLA-DR+, TdT+) pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas de Igs en configuración germinal o reordenados. En las LEA comunes (CD10+), todos los casos poseen los genes de cadena pesada reordenados, mientras que alrededor de un 40% ex­ hibe reordenados los genes de cadena liviana. Hasta un 20% de las LEA comunes pueden po­ seer reordenados los genes T,B- Las células B de patologías de estirpes más maduras (LLA-B, linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben siempre reordenados o delecionados los genes de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del 10% de los casos muestran T-beta reordenados. Por otra parte, las ¡eucemias T agudas po­ seen células que han reordenado genes T-beta y T-gama, y sólo las de extirpe más madura reordenan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los casos pueden exhibir, además, reordenados los genes C-mu, aunque en ningún caso se ha ob­ servado reordenamiento de genes de cadena hviana de inmunoglobulinas. En muy raras oca­

siones se han observado reordenam ientos en células de estirpe mieloide. Se desconoce el significado de los reordenamientos genéticos fuera de linaje; si pueden ocurrir en células normales o si constituyen aberraciones caracte­ rísticas de células leucémicas. A pesar de esto, la determinación de reordenamientos genéticos constituye una metodología de estudio comple­ m entaria para el diagnóstico en estas patolo­ gías.

B IB L IO G R A FÍA W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is o f ceJI s u r f a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u k e m ia d ia g n o s is . C y to m e try 18: 1 8 7 -1 9 8 , 1994. R V e n d itti y c o l. M in im a lly d iff e re n tia te d a c u te m y e lo id le u k e m ia (A M L -M O ): c y to c h e m ic a l, im m u n o p h e n o ty p ic a n d c y to g e n e tic a n a ly s is o f 19 c a se s. B ritish J H e m a to lo g y 8 8 : 7 8 4 -7 9 3 , 1994 A M a c e d o y co l. C a ra c te riz a c ió n fe n o típ ic a d e la d ife r e n ­ c ia c ió n m ie lo id e n o rm a l. S a n g re 39: 2 7 7 -2 8 2 , 1994. D C a to v s k y , E M a tu te s . L a c la s ific a c ió n d e la l e u c e m ia a g u d a . R e v is ta L a tín o a in e r ic a n a d e la E u ro p e a n S c h o o l o f O n c o lo g y . S u p p l. 2; 1 6 -2 1 , 1993. G D ig u ie ro , a n d th e F re n c h c o o p e ra tiv e g ro u p o n CLI,.. B cell c h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : p re s e n t s ta tu s a n d fu tu re d ire c tio n s . B lo o d 78: 1 9 0 1 -1 9 1 4 , 1991. G B F o g h e t. C h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : a n u p d a te d rev iew . J. C lin . O n c o l. 12: 1 9 7 4 -1 9 9 0 , 1994. L W D ia m o n d y co l. A k n o w le d g e b a s e d s y ste n i fo r th e in te r p r e t a ti o n o f f lo w c y to m e tr y d a ta in l e u k e m ia s a n d ly m p h o m a s. C y to m e try 17: 2 6 6 -2 7 3 , 1994.

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM CARLOS ALBERTO FOSSATI

HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS M O N O C LO N A LES Consideraciones generales Ante el estímulo con un inmunógeno, un ani­ mal responde produciendo una gran variedad de anticuerpos dirigidos contra diferentes compo­ nentes del antígeno inoculado (polipéptidos, po­ lisacáridos, etc.) y contra los distintos determi­ nantes antigénieos (epitopes) de cada uno de esos componentes. Cada determinante antigéni­ co, a su vez, podrá ser reconocido por más de un anticuerpo, con diferentes afinidades. El conjunto de los anticuerpos producidos, secretados hacia el suero del animal inmuniza­ do, constituye el antisuero. Un antisuero es, pues, una mezcla heterogénea de anticuerpos capaces de reaccionar con el antígeno. Dada la naturaleza dinámica del sistema in­ mune, la composición del antisuero está some­ tida a un cambio continuo en el animal inmuni­ zado, lo cual sumado a las diferencias indivi­ duales entre animales, hace que dicha mezcla sea, además de heterogénea, irreproducible. La tboría de la selección clonal, presentada por Burnet en 1959, propone que cada célula produce sólo un anticuerpo en respuesta a su estimulación, teoría en la que subyace, por lo tanto, la idea de monoelonalidad. Esta idea per­ mitió com prender la naturaleza del m ielom a múltiple, enfermedad debida a la proliferación de un clon celular en el que todas las células producen la misma inmunoglobulina. La paraproteína del suero de pacientes de esta enfer­ medad fue la primera fuente de inmunoglobuli­ nas monoclonales. En 1972, Potter pudo inducir la formación de mielomas en ratones, lo que permitió dispo­

37 ner de líneas celulares productoras de anticuer­ pos químicamente homogéneos, algunos de los cuales reaccionan con antígenos ambientales. Los mielomas inducidos pueden ser transplan­ tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin embargo, y lamentablemente, en general no es posible la inducción de mielomas antígeno-específicos. A lgunos investigadores intentaron obtener anticuerpos homogéneos mediante la transfor­ mación de linfocitos B con virus tales com o Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i­ tió el establecimiento de algunas líneas produc­ toras de anticuerpos específicos que, sin em ­ bargo, secretan muy pequeñas cantidades de anticuerpo. Se intentó también la inmortalización y el clonado de células productoras de anticuerpos mediante la proliferación in vivo. La técnica desarrollada por Askonas y W illiamson co n ­ siste en obtener trozos de bazo de animales in ­ munizados que contengan en promedio una so­ la célula productora de anticuerpos contra el antígeno inmunizante; cada uno de esos trozos es luego transferido a un huésped irradiado conjuntamente eon el antígeno; tras sucesivos pasajes se va enriqueciendo el nuevo huésped con el clon elegido y se logran preparaciones monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si­ ble una verdadera inmortalización con ese m é­ todo. Está claro, entonces, que para disponer de una solución que contenga un solo anticuerpo, y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro ­ liferación de una sola célula productora de a n ti­ cuerpos. La m ejor manera de hacerlo es fusionar la célula productora de anticuerpos específicos para ef antígeno deseado con una célula que

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Metodologías

sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no excluye reordenamientos. IN T E PR E T A C IO N D E LOS RESULTADOS En las leucemias agudas de linaje B inmadu­ ro, las LLA nulas (CD19+ HLA-DR+, TdT+) pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas de Igs en configuración germinal o reordena­ dos. En las LLA comunes (CD10+), todos los casos poseen los genes de cadena pesada reor­ denados, mientras que alrededor de un 40% ex­ hibe reordenados los genes de cadena liviana. Hasta un 20% de las LLA comunes pueden po­ seer reordenados los genes T,B. Las células B de patologías de estirpes más maduras (LLA-B, linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben siempre reordenados o delecionados los genes de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del 10% de los casos muestran T-beta reordenados. Por otra parte, las ¡eucemias T agudas po­ seen células que han reordenado genes T-beta y T-gama, y sólo las de extirpe más madura reordenan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los casos pueden exhibir, además, reordenados los genes C-mu, aunque en ningún caso se ha ob­ servado reordenamiento de genes de cadena hviana de inmunoglobulinas. En muy raras oca­

siones se han observado reordenam ientos en células de estirpe mieloide. Se desconoce el significado de los reordenamientos genéticos fuera de linaje; si pueden ocurrir en células normales o si constituyen aberraciones caracte­ rísticas de células leucémicas. A pesar de esto, la determinación de reordenamientos genéticos constituye una metodología de estudio comple­ m entaria para el diagnóstico en estas patolo­ gías.

B IB L IO G R A FÍA W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is o f ceJI s u rt'a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u líe m ia d ia g n o s is . C y to n ie try 18: 1 8 7 -1 9 8 , 1994. R V e n d itti y c o l. M in im a lly d iff e re n tia te d a c u te m y e lo id le u k e m ia (AM L-M O)-. c y to c h e m ic a l, im m u n o p h e n o ty p ic a n d c y to g e n e tic a n a ly s is o f 19 c a se s. B ritish J H e m a to lo g y 8 8 : 7 8 4 -7 9 3 , 1994 A M a c e d o y co l. C a ra c te riz a c ió n fe n o típ ic a d e la d ife r e n ­ c ia c ió n m ie lo id e n o rm a l. S a n g re 39: 2 7 7 -2 8 2 , 1994. D C a to v s k y , E M a tu te s . L a c la s ific a c ió n d e la l e u c e m ia a g u d a . R e v is ta L a tin o a m e r ic a n a d e la E u ro p e a n S c h o o l o f O n c o lo g y . S u p p l. 2; K > 2 1 , 1993. G D ig u ie ro , a n d th e F re n c h c o o p e ra tiv e g ro u p o n C L L . B cell c h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : p re s e n t s ta tu s a n d fu tu re d ire c tio n s . B lo o d 78: 1 9 0 1 -1 9 1 4 , 1991. G B F o g h e t. C h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : a n u p d a te d rev iew . J. C lin . O n c o l. 12: 1 9 7 4 -1 9 9 0 , 1994. L W D ia m o n d y co l. A k n o w le d g e b a s e d sy ste m fo r th e in te r p r e t a ti o n o f f lo w c y to m e tr y d a ta in l e u k e m ia s a n d ly m p h o m a s. C y to m e try 17: 2 6 6 -2 7 3 , 1994.

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM CARLOS ALBERTO FOSSATI

HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS M O N O C LO N A LES Consideraciones generales Ante el estímulo con un inraunógeno, un ani­ mal responde produciendo una gran variedad de anticuerpos dirigidos contra diferentes compo­ nentes del antígeno inoculado (polipéptidos, po­ lisacáridos, etc.) y contra los distintos determi­ nantes antigénicos (epitopes) de cada uno de esos componentes. Cada determinante antigéni­ co, a su vez, podrá ser reconocido por más de un anticuerpo, con diferentes afinidades. El conjunto de los anticuerpos producidos, secretados hacia el suero del animal inmuniza­ do, constituye el antisuero. Un antisuero es, pues, una mezcla heterogénea de anticuerpos capaces de reaccionar con el antígeno. Dada la naturaleza dinámica del sistema in­ mune, la composición del antisuero está some­ tida a un cambio continuo en el animal inmuni­ zado, lo cual sumado a las diferencias indivi­ duales entre animales, hace que dicha mezcla sea, además de heterogénea, irreproducible. La téoría de la selección elonal, presentada por Burnet en 1959, propone que cada célula produce sólo un anticuerpo en respuesta a su estimulación, teoría en la que subyace, por lo tanto, la idea de monoclonalidad. Esta idea per­ mitió com prender la naturaleza del m ielom a múltiple, enfermedad debida a la proliferación de un clon celular en el que todas las células producen la misma inmunoglobulina. La paraproteína del suero de pacientes de esta enfer­ medad fue la primera fuente de inmunoglobuli­ nas monoclonales. En 1972, Potter pudo inducir la formación de mielomas en ratones, lo que permitió dispo­

37 ner de líneas celulares productoras de anticuer­ pos químicamente homogéneos, algunos de los cuales reaccionan con antígenos ambientales. Los mielomas inducidos pueden ser transplan­ tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin embargo, y lamentablemente, en general no es posible la inducción de mielomas antígeno-específicos. A lgunos investigadores intentaron obtener anticuerpos homogéneos mediante la transfor­ mación de linfocitos B con virus tales com o Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i­ tió el establecimiento de algunas líneas produc­ toras de anticuerpos específicos que, sin em ­ bargo, secretan muy pequeñas cantidades de anticuerpo. Se intentó también la inmortalización y el clonado de células productoras de anticuerpos mediante la proliferación in vivo. La técnica desarrollada por Askonas y W illiamson co n ­ siste en obtener trozos de bazo de animales in ­ munizados que contengan en promedio una so­ la célula productora de anticuerpos contra el antígeno inmunizante; cada uno de esos trozos es luego transferido a un huésped irradiado conjuntamente con el antígeno; tras sucesivos pasajes se va enriqueciendo el nuevo huésped con el clon elegido y se logran preparaciones monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si­ ble una verdadera inmortalización con ese m é­ todo. Está claro, entonces, que para disponer de una solución que contenga un solo anticuerpo, y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro ­ liferación de una sola célula productora de anti­ cuerpos. La m ejor manera de hacerlo es fusionar la célula productora de anticuerpos específicos para e í antígeno deseado con una célula que

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Metodologías

posea ilimitada capacidad de división; de este modo la célula fusionada será capaz de vivir en cultivo, dividirse y producir anticuerpos. El aislamiento y la expansión de uno de tales clo­ nes celulares, en el que todas las células produ­ cen el mismo anticuerpo, constituye una fuente inm ortal de inm unoglobulinas quím icam ente homogéneas denominadas “anticuerpos mono­ clonales” (AcMo) (fig. 37-1). En 1975, Kóhíer y Milstein desarrollaron la técnica de hibridización de células somáticas (hibridomas), que permite el establecimiento y la inm ortalización de células productoras de anticuerpos monoclonales. Por el desarrollo de esta metodología, en 1984 les fue otorgado el premio Nobel de Medicina. Teoría y aspectos generales de la producción de hibridomas La fusión entre células somáticas fue obser­ vada por primera vez hacia fines del siglo pasa­ do, y el primer aislamiento de una célula somá­ tica híbrida se produjo a principios de la déca­ da de 1960. El desarrollo de medios selectivos por Littiefieid y el uso de nuevos agentes de fu­ sión aumentaron la frecuencia de formación de híbrido y facilitaron su producción. El origen de los hibridomas productores de anticuerpos se remonta a los intentos realizados para estudiar la expresión genética y la regula­ ción de la producción de inmunoglobulinas en células de mieloma, lo que permitió la realiza­ ción de im portantes observ acio n es para el afianzamiento de esta metodología, entre ellas: a) el híbrido celular no presenta exclusión alélica, o sea que la fusión de células productoras de anticuerpos lleva a la expresión de ambas inmunoglobuhnas parentales, lo que conduce a la formación de moléculas híbridas por asocia­ ción al azar de las cadenas pesadas entre sí y de éstas con las livianas; b) no se producen nue­ vas cadenas de inmunoglobulinas, lo que sugi­ rió estabilidad en la expresión de inm unoglo­ bulinas y control independiente de la expresión de los genes de ambas células parentales y c) una variante de mieloma que no expresa cade­ nas livianas ni pesadas no suprime en el híbri­ do la producción de la inmunoglobulina codifi­ cada por la otra célula parental. Esta clase de trabajos culminaron con los ex­ perimentos de Kohler y Milstein, quienes fue­ ron capaces de fusionar células normales de ba­ zo de ratones inm unizados con eritrocitos de carnero, con una línea de mieloma y pudieron aislar un híbrido celular secretor de anticuerpos específicos para el antígeno inmunizante. Ese hibridoma crecía continuamente in vitro y se­ cretaba grandes cantidades de anticuerpo quí­ micamente homogéneo al medio de cultivo o al

suero, y/o ascitis cuando crecía in vivo como tumor trasplantado. Célula de mieloma y método de selección La célula parental responsable de la prolife­ ración del hibridoma es de una línea de mielo­ ma. Son células aneuploides, capaces de vivir y chvidirse in vitro y fueron seleccionadas por ser defectivas en la enzima hipoxantil-guanil-fosforribosil-transferasa (HGPRT); defecto enzi­ mático necesario para la selección post-fusional. La HGPRTasa es una enzima que utiliza guanina o hipoxantina para producir purinas, lo que permite la reutilización de las bases cuando la síntesis de novo se ve interrum pida, por ejemplo, por antagonistas del ácido fólico -c o ­ mo la aminopterina-, que bloquean la síntesis de purinas y de timidina. La adición de timidi­ na (T) al medio le permite a la célula sintetizar TMP (timidina monofosfato) vía timidina quinasa (TK), pero al no poder sintetizar bases púricas la célula muere aun en presencia de del precursor hipoxantina (H). (fig. 37-2). El medio selectivo (HAT) consiste en enri­ quecer el medio de cultivo celular con hipoxan­ tina y timidina, con el agregado de aminopterina (A) como inhibidor de la síntesis de novo. En presencia de aminopterina sólo podrán so­ brevivir aquellas células que expresan HGPRT, como los hibridomas. Las de mieloma morirán y las de bazo no desarrollan en cultivo. La selecció n de m u lan tes d e fe ctiv o s en HGPRT involucra mutagénesis de la línea ce­ lular por exposición a un agente tóxico análogo a la base normal (8-azoguanina para HGPRT o bromodeoxiuridina para TK), y posterior clo­ nado de las poblaciones seleccionadas. Células seleccionadas de esta forma podrían eventualmente revertir y reexpresar la enzima, por lo que es aconsejable desarrollar el mielo­ ma en presencia del análogo tóxico o controlar periódicamente que las células mueran en pre­ sencia de HAT. Algunas de las líneas de mieloma habitualmente utilizadas en la producción de hibridomas producen y secretan cadenas de inmunoglobulinas. En la célula híbrida se coexpresan las cade­ nas codificadas por cada célula parental. Dos cadenas pesadas se combinan con dos cadenas livianas para formar las diferentes inmunoglo­ bulinas; esta asociación no es enteramente al azar puesto que la asociación homologa es más frecuente que la heteróloga y no se detectan asociaciones entre cadenas de distinto isotipo (fig. 37-3). La fusión de células somáticas conduce a la formación de un híbrido celular (heterocarion). Inicialmente, el heterocarion es una célula muí-

Hibrídomas y anticuerpos monoclonales tinucleada (2 a 5 núcleos separados). Posterior­ mente, durante la división celular, se desintegra la membrana nuclear y se forma un solo núcleo que contiene los cromosomas de ambas células parentales. En este estadio las células son ines­ tables y a medida que se dividen pierden algu­ nos cromosomas de una o ambas células origi­ nales, hasta que se logra la estabilidad celular. O casionalm ente la p érd id a de crom osom as puede incluir algún cromosoma esencial para la vida de la célula y conducirla a la muerte. Por otro lado, esta pérdida puede conducir a que un h ib rid o m a que o rig in alm e n te expresa, p o r ejemplo, cuatro cadenas diferentes, deje de ex­ presar alguna de ellas y, eventualmente, pierda la expresión de todas las cadenas. La pérdida afecta principalm ente a los cromosomas que codifican para cadenas pesadas (fig. 37-4). En virtud de lo precedentemente detallado, queda claro que lo más conveniente es utilizar para la fusión, células de una línea de mieloma no productor de cadenas de inmunoglobulinas. En estas condiciones, los hibrídomas sólo po­ drán producir la inm unoglobulina codificada por el linfocito B fusionado. Actualmente las líneas no secretoras, por ejemplo la NSO, son las más utilizadas para la producción de hibridomas murinos. Inmunización Se han probado muchos esquemas de inm u­ nización y diferentes protocolos mostraron ser mejores para algunos antígenos que para otros. En general, para los inmunógenos buenos prác­ ticamente cualquier protocolo induce una ade­ cuada generación de anticuerpos y, en definiti­ va, de anticuerpos monoclonales útiles. Dado que la frecuencia de hibrídomas de la especifi­ cidad deseada está aproximadamente relaciona­ da al número de células productoras de anti­ cuerpos en el momento de la fusión, los inm u­ nógenos débiles no serán buenos generadores de anticuerpos monoclonales. Una manera bas­ tante efectiva de aumentar la inmunogenicidad de esos antígenos, es conjugarlos a proteínas portadoras muy inmunogénicas (p.ej., KLH). Un protocolo simple y generalmente efectivo es inocular intraperitonealmente 50-100 (ig de antígeno soluble en adjuvante de Freund com ­ pleto, determinar el título de anticuerpos 4 se­ manas después, dejar bajar el nivel de anticuer­ pos y reestim ular periódicam ente, finalmente inocular unos 50 ^g de antígeno en solución fi­ siológica por vía intravenosa 3 días antes de la fusión. Cuando se dispone de muy bajas canti­ dades de antígenos particulados se puede recu­ rrir a la inoculación intraesplénica, la que tam ­ bién da buenos resultados con antígenos solu­ bles. Existen, además, métodos de inm uniza­

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ción in vitro que han resultado efectivos para la producción de anticuerpos monoclonales. Fusión Se puede aseverar que desde la descripción de K ohler y M ilstein, quienes usaron v iru s Sendai com o fusógeno, no se han producido modificaciones sustanciales al protocolo origi­ nal de fusión. En la actualidad, la mayoría de los laboratorios utilizan polientilenglicol (PEG) como agente fusionante. La fusión es realizada 3 o 4 días después de la última inoculación del antígeno, momento de máxima presencia de blastos en el bazo. El ren ­ dimiento habitual es de 2.000 a 5.000 híbridos por cada 10* células de bazo. Si bien no se conoce con exactitud el m eca­ nismo de acción del PEG, se ha verificado la necesidad del contacto celular directo entre las células a fusionar donde el PEG parece prom o­ ver su unión. Algunos autores sugieren que las impurezas del PEG son los verdaderos estim u­ ladores de la fusión. La máxima frecuencia se logra con PEG al 40-50% (peso/vol); a e sta concentración no se puede detectar agua física­ mente libre en el medio. El agua físicamente li­ bre disminuye a medida que aumenta la c o n ­ centración de PEG, lo que también aumenta la osmolaridad, inconveniente que puede ser re ­ vertido por el agregado de dim etilsulfóxido (DMSO). Sin embargo el DM SO aumenta la frecuencia de fusión de tres células o más, d is­ minuyendo la eficiencia de producción de hibridomas viables. Las células blastoides -e n activa división-, son las que fusionan más eficientemente. L a mayor eficiencia parece ser debida a la expre­ sión de ciertas características p osfusionales más que a una mayor frecuencia de fusión. Si la célula que fusiona no se encuentra en estado blastoide su núcleo no estará en división m itótica al mismo tiempo que el núcleo de la célula mielomatosa, y resultará en una población que contendrá un núcleo extra, silencioso. La fu ­ sión correcta será aquella producida entre una célula linfoide y una de mieloma. Aun así los núcleos podrán dividirse asincrónicam ente y dar lugar a poblaciones celulares abortivas. La fusión del mieloma con otros tipos celu ­ lares no B no dan lugar, en las condiciones h a ­ bituales de producción de AcMo, a la form a­ ción de hibrídomas. Cultivo de hibrídom as En el cultivo de hibrídomas la calidad de los componentes del medio de cultivo debe ser óp­ tima, para favorecer la división celular y la p ro ­ ducción- y secreción de anticuerpos.

784

Metodologías Anti-1 Syero

1

I

2

3

Antígeno

I PEG

é

Células de mieloma (HGPRT)

F ig . 3 7 -1 . A n tic u e rp o s m o n o c lo n a le s y a n tis u e ro s c o n v e n c io n a le s

El crecimiento celular está muy influido por la concentración de células presentes en el cul­ tivo; fuera de ciertos valores el crecim iento puede verse interrumpido. El límite inferior de concentración de células com patible con un

buen crecimiento celular puede establecerse en aproximadamente 10'* cel • m f ’, y el superior en 10®, límites que son aplicables a la mayoría de las líneas celulares. Uno de los elementos involucrados en el establecimiento de un límite

F ig. 37-2. M etabolism o de bases púricas. H G PRT: hipoxantil guanil fosforibosil transferasa.

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

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Fig. 37-3. D ia g ra m a d e s e g re g a c ió n d e c a d e n a s de in m u n o g lo b u lin a s. H y M, ca d e n a s p e s a d a s y K y L, c a d en a s liv ia n a s d e las in m u n o g lo b u lin a s d e l e s p le n o c ito y d e la c é lu la s d e m ie lo m a , re s p e c tiv a m e n te .

• • F ig. 37-4. D ivisiones m itóticas posfusionales. El esquem a incluye sólo algunas de las posibles divisiones incorrectas.

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Metodologías

superior es la competencia por los nutrientes. En el inferior se destaca la necesidad de deter­ m inada cantidad de factores de crecim iento producidos por células en división, tales como monoquinas, linfoquinas, interleuquinas e in ­ termediarios mctabólicos. Algunos autores utilizan células alimentadoras para m ejorar las condiciones de cultivo, esas células, tales como macrófagos, timocitos o célula de bazo irradiadas, son de escaso cre­ cimiento pero proveen nutrientes y factores que enriquecen el medio, permitiendo así el mante­ nimiento y crecimiento de células en baja con­ centración. Otra manera de sostener el crecimiento celu­ lar en esas condiciones es agregar al cultivo un medio “ gastado” proveniente del cultivo en crecimiento exponencial de células no secreto­ ras de anticuerpos. Otro componente fundamental en el cultivo de hibridomas es la calidad del suero bovino fetal utilizado. En la actualidad se dispone de medios que no requieren el agregado de suero, especialmente formulados para facilitar la puri­ ficación de los AcMo. La mayoría de los hibridomas se dividen ca­ da 8-12 horas; de este modo, los lím ites de crecimiento celular antes mencionados adm i­ ten un incremento de 100 veces en la concen­ tración celular, lo que permite el cultivo por 2 a 4 días sin necesidad de efectuar cambios de medio. Monitoreo de la producción de anticuerpos monoclonales La detección de anticuerpos específicos en el medio de cultivo donde crecen los hibridomas es uno de los puntos críticos, si no el más im ­ portante, en la estrategia de producción de anti­ cuerpos monoclonales. Las técnicas a utilizar deben ser de alta sen­ sibilidad como para detectar ¡.tg mi"', ser rápi­ das para evitar la atención de cultivos inútiles y deberían, además, brindar información acerca de la utilidad del anticuerpo con respecto a los fines para los cuales se los produce. En ese sentido los métodos más usuales y útiles son, en términos generales, los radioinmunométricos y enzimoinmunométricos, aglu­ tinación pasiva e inmunofluorescencia, los que son descritos en detalle en otros capítulos de este libro. C lonado En los cultivos en que se detectan anticuer­ pos contra el antígeno de trabajo, pueden coe­ xistir varios hibridomas. Uno o más de ellos se­ rán productores de anticuerpos de interés mien­

tras que otros podrán secretar anticuerpos irre­ levantes para el sistema, o ser no secretores de' anticuerpos. Puede, entonces, tratarse de un cultivo policlonal, por lo que resulta indispen­ sable proceder a su clonado. El clonado debe realizarse tan pronto como sea posible para evitar que los otros hibrido­ mas, o variantes del que se pretende establecer, crezcan más rápido y eliminen a los producto­ res de anticuerpos deseadas. Para ello se puede recurrir básicamente a dos métodos: clonado en agar blando o dilución en medio líquido. El primero consiste en cultivar,sobre agar semisólido células aisladas, las que al crecer da­ rán origen a una colonia donde todas las célu­ las derivan de una misma célula aticestral. Las colonias pueden ser individualmente repicadas a medio líquido y allí expandidas. El segundo se fundamenta en la realización de diluciones de la población original, de ma­ nera de obtener, con una cierta probabilidad es­ tadística, cultivos que contengan una sola célu­ la, que al crecer dará origen al clon correspon­ diente. Algunas células del clon podrían perder un cromosoma o más, pero permanecer viables y continuar dividiéndose, con lo cual el cultivo se transformaría en biclonal o aun multiclonal. La pérdida de producción de anticuerpos de una línea originalmente buena productora sue­ le deberse a biclonalidad con una no produc­ tora. En la figura 37-5 puede observarse un esque­ ma de la metodología para la obtención de hi­ bridomas. Producción de AcMo L a p roducción de grandes can tid ad es de AcMo se puede realizar tanto in vivo como in vitro. tn vivo, como ya se mencionó, se aprovecha la propiedad tumoral del hibiridoma para culti­ varlo en un huésped adecuado (habitualmente isogénico con la línea celular); esto posibilita la obtención de cantidades im portantes de anti­ cuerpo (1-15 mg ml-1), a partir del líquido ascítico o del suero del animal portador del tu­ mor. In vitro, los anticuerpos son obtenidos del sobrenadante de los cultivos, lo que permite la producción del anticuerpo monoclonal relativa­ mente diluido (0,01-0,5 mg m f')- Si bien los métodos de producción escapan a los alcances de este libro, se mencionan a continuación los más comúnm ente usados: en la producción a escala de laboratorio se utilizan sistemas esta­ cionarios o rotativos (roller)-, a escala de labo­ ratorio e industrial existen numerosos métodos

Hibrídomas y anticuerpos monocionaies y sistemas tales como crecimiento de células en suspensión, matrices fluidizadas, reactores de fermentación, cultivo sobre microcarriers; asi­ mismo, pueden cultivarse células m antenidas en sistemas de membranas, holíow fibers, o en matrices cerámicas. Purificación de AcMo Sea cual fuere el sistema de producción utili­ zado, el AcM o se obtiene contam inado con otras proteínas y componentes del m edio de cultivo o de los fluidos biológicos. En algunas aplicaciones, la purificación de los anticuerpos se hace indispensable. Los dos factores fundamentales en la elec­ ción del método de purificación son: el uso al cual el anticuerpo está destinado y la fuente de obtención del mismo. El objetivo del esquema metodológico elegi­ do es purificar o concentrar la especie molecu­ lar en consideración, a un grado tal que se mantengan en la preparación final, las propie­ dades o actividades deseadas mientras se elimi­ nan los contaminantes indeseables. En términos generales, el esquema de purifi­ cación de anticuerpos monoclonales involucra tres pasos: 1. Preparación de la muestra. El método que se aplique en este paso debe ser com patible con los aplicables al paso siguiente. Las téc­ nicas más utilizadas incluyen precipitación salina, clarificación e intercambio de buffer de trabajo (diálisis). 2. P urificación principal. Los m étodos más aplicados son los de cromatografía de afini­ dad y cromatografía de intercambio iónico. 3. Purificación posterior. Suele aplicarse para elim inar im purezas menores y preparar la muestra para su almacenamiento. Las más frecuentemente usadas son filtración en gel, crom atoenfocado y cromatografía de inte­ racción hidrofóbica. Cabe destacarse que, si bien el esquema an­ terior es de aplicación general, se puede lograr la purificación de un anticuerpo m onoclonal en un solo paso. En nuestra experiencia, la precipitación salina con SO^(NH4)2, seguida por cromatografía de intercambio iónico (espe­ cialmente por EPLC), ha resultado de gran uti­ lidad para obtener preparaciones de alta pure­ za. Por otra parte, hem os logrado p u rifica r ÍgG 1 a partir de líquido ascítico en un solo pa­ so de purificación mediante cromatoenfocado y de lgG3 por precipitación en buffer de baja fuerza iónica. La metodología antes mencionada está deta­ llada en otros capítulos de este libro.

787

Diferencias entre anticuerpos m onoclonales y policlonales Las principales diferencias entre los anti­ cuerpos monoclonales y los antisueros (anti­ cuerpos policlonales) derivan, básicamente, de que los primeros, por ser químicamente homo­ géneos, poseen las propiedades individuales de la proteína anticuerpo que lo compone, mien­ tras que el antisuero tiene propiedades que son promedio entre las de sus componentes. La estabilidad podría constituir una desven­ taja para los AcMo, ya que algunos de ellos se inactivan rápidamente a temperatura ambiente o no resisten la descongelación o liofilización. También los hay sensibles a ciertos pH extre­ mos y otros que pueden perder integridad o reactividad al ser marcados enzimática o isotó­ picamente. Sin embargo, estos inconvenientes no son tan frecuentes y pueden, además, ser salvados fácil­ mente mediante un análisis que permita detectar aquellos AcMo que cumplen con las condicio­ nes predeterminadas para su utilización. El anti suero, en cambio, no se ve afectado en el campo de la estabilidad, ya que como conse­ cuencia de su heterogeneidad sólo una pequeña proporción de sus componentes podrá ser sen­ sible a un tratamiento dado, lo que mayormente no incidirá en sus propiedades promedio. La avidez de un antisuero es otra propiedad promedio entre la de todos los anticuerpos que la componen. Es suficiente que un porcentaje muy pequeño de los anticuerpos presentes sea de alta afinidad o avidez para que el conjunto se comporte de esa forma. Los anticuerpos mo­ noclonales, en cambio, responderán a las carac­ terísticas fisicoquím icas de su único com po­ nente, el que poseerá, o no, las propiedades que de él se necesitan. Aquí, nuevamente un buen m étodo de selección perm itirá es aislamiento de los AcMo deseados. Reactividad secundaría. En general, los Ac­ Mo no pueden ser utilizados para técnicas de precipitación puesto que no pueden formarse complejos precipitantes cuando se utilizan anti­ cuerpos homogéneos con antígenos m onova­ lentes o bivalentes. En cambio, los anticuerpos monoclonales sí producen complejos precipitantes cuando reac­ cionan con antígenos con epitopes repetitivos. Los anticuerpos antihapteno dan reacciones de p recip itació n aJ reaccio n ar con conjugados hapteno-proteína debido al carácter multiepitópico de las proteínas conjugadas. Puede tam­ bién lograrse la precipitación mediante mezclas de dos AcMo dirigidos contra determinantes antigénicos ubicados en diferentes cadenas de un a.ntígeno o aun contra epitopes diferentes de una misma cadena.

788

Metodologías

Culi¥0 cátalas fiilei«Ra(HQPRT|-

CéiiilBíi de bazo ratón Ifimunlzado

Fusión

I

Selección en HAT Ensayot de i l anticuerpos

I

Cultivos positivos Clonado Congelación

I

■#♦■ C lo n » positivos Reclonado

I

eterización de clones y selección de variantes

I

Producción Fig. 3 7 -5 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c ió n d e h ib rid o m a s .

Especificidad. Todas las moléculas de una población de anticuerpos monoclonales tienen la misma especificidad debido a que poseen la misma región variable. Esta uniformidad ofre­ ce la ventaja de que no existirán diferencias de especificidad entre las distintas partidas de AcMo, como sucede con los antisueros conven­ cionales. La gran homogeneidad de estos anticuerpos permite análisis que no son posibles con anti­ sueros debido a las reacciones cruzadas que es­ tos presentan. Los AcMo pueden exhibir reactividad cruza­ da, la que en ese caso, es característica de todas las moléculas y por ende no puede ser elimina­ da por adsorción sin eliminar toda la actividad anticuerpo. La reactividad cruzada de los A c­ Mo puede deberse a reacciones con un mismo determinante antigénico sobre diferentes molé­ culas; a reactividad con estructuras quím ica­ mente relacionadas; a reacción con moléculas evolutivamente relacionadas o a estructuras no relacionadas que incidentalm ente posean es­ tructuras parecidas. En el caso de mezclas de AcMo pueden darse efectos sinérgicos que mo­ difiquen su reactividad. A plicaciones La homogeneidad y monoespecificidad de los anticuerpos monoclonales los convierte en reac­ tivos y herramientas de elección para una gran

variedad de propósitos, tanto para su uso in vitro como in vivo, especialmente en el campo de los productos terapéuticos y de diagnóstico. Veamos algunas pocas de las áreas donde la aplicación de anticuerpos monoclonales ha sido y es de fundamental importancia. Purificación de proteínas Se pueden producir anticuerpos monoclona­ les contra componentes minoritarios de m ez­ clas complejas de proteínas con sólo disponer de un método de “screening” que permita de­ tectar anticuerpos contra el antígeno deseado, seleccionarlo y producirlo para su utilización en procedimientos de purificación, por ejem ­ plo, cromatografía de afinidad. De esta forma se puede reducir a un paso la purificación de componentes que, de otra forma, requerían va­ rios pasos de cromatografía, frecuentemente de bajo rendimiento. Ideiitificación y aislamiento de células, subpoblaciones y clones celulares Es posible obtener anticuerpos monoclona­ les contra antígenos de membrana que repre­ senten a determinadas poblaciones o estadios de diferenciación celular que permitan su iden­ tific ac ió n , por ejem p lo , lin fo c ito s CD4+ o CD8+. También es posible detectar proteínas de membrana exclusivas de ciertos clones de

Hibridomas y anticuerpos monoclonales linfocitos. Esos anticuerpos, denominados an­ ticuerpos clonotípicos han resuhado de gran importancia en la identificación y caracteriza­ ción de células T. Detección de tumores La producción de anticuerpos monoclonales contra proteínas presentes en membrana de cé­ lulas tumorales pero ausentes (o expresadas en muy baja densidad) en células normales, p er­ mite su utilización para detectar la presencia de esas células en un tejido u órgano o para elimi­ narlas. El uso de AcMo para la detección de tum o­ res presenta un inmenso potencial. En efecto, la presencia desde ciertos antígenos serviría para el diagnóstico temprano. Por otra parte, anti­ cuerpos marcados con radioligandos han sido empleados para localizar tuinores primarios o focos metastásicos en los pacientes mediante técnica de imágenes (“scanning”) de radioisó­ topos o por resonancia magnética nuclear. Pueden también, provocar específicamente la muerte de células tumorales, de forma direc­ ta por lisis mediada por complemento o hacerlo por medio de conjugación a una toxina letal o un radioisótopo adecuado para transformar el anticuerpo en una Inmunotoxina. Se pueden usar toxinas de diversos orígenes, tales como Shigella, diftérica, colérica, ricina, etc. Estas toxinas están formadas por 2 componentes polipeptídicos, uno portador de la acción tóxica y el otro responsable de unirse a receptores celu­ lares. El segundo resulta inofensivo en ausen­ cia del primero. La inmunotoxina se puede pre­ parar ligando la subunidad tóxica al anticuerpo de manera de dirigir la toxicidad solamente ha­ cia la célula blanco. Aplicaciones básicas Sólo mediante la cristalización de AcMo y de sus complejos inmunes, ha sido posible es­ tablecer con alta resolución la estructura tridi­ mensional del anticuerpo y los complejos y es­ tudiar las modificaciones estructurales causa­ das por mutaciones puntuales. Resultaron fundamentales, también, en el es­ tudio de la diversidad de los anticuerpos. Así, el análisis de la secuencia de las regiones varia­ bles de AcMo, expresadas contra un determina­ do antígeno en respuesta primaria y secundaria, fue fundamental para comprender el fenómeno de mutación somática y la “maduración” de la respuesta inmune. El estudio de anticuerpos monoclonales antiidiotípicos, permitió la “disección” de las re­ giones variables de esos anticuerpos y el estu­ dio de sus propiedades biológicas.

789

Anticuerpos catalíticos La unión de un anticuerpo a su antígeno tie­ ne algunas características similares a la unión de una enzima a su sustrato. Las interacciones son no covalentes, de alta especificidad y fre­ cuentemente de alta afinidad. El anticuerpo no altera al antígeno mientras que la enzim a cataliza una m odificación del sustrato, para ello la enzima utiliza la energía de unión para estabilizar el estado de transición del sustrato, reduciendo así la energía de acti­ vación para la m odificación del sustrato. La unión del anticuerpo puede “congelar” los gra­ dos de libertad rotacional y translacional de un sustrato, favoreciendo energéticamente la reac­ ción. De tal m anera, un anticuerpo dirig id o contra un análogo estable de un componente de transición de una determinada reacción quím i­ ca, podría actuar como enzima, catalizando la reacción. El descubrimiento de tales anticuerpos cata­ líticos abre un inmenso panorama de aplicacio­ nes. Los anticuerpos pueden ser “fabricados” específicamente para determinada aplicación, producidos a bajo costo y purificados fácilm en­ te. Además, se pueden obtener anticuerpos para catalizar reacciones químicas para las cuales no existen enzimas. OTROS HIBRIDOMAS Hibridomas híbridos (iiibridomas biespecíficos) o heteroconjugados Como ya vimos, si la célula de mieloma ex­ presa cadena liviana y pesada, el hibridom a puede expresar esas cadenas junto con las del esplenocito. Si el mieloma fusionante es a su vez un hibridoma productor de un anticuerpo de determinada especificidad, la célula híbrida producida por fusión con un linfocito B podrá fabricar moléculas que expresen en un F ab el sitio de combinación del hibridoma parental y en el otro brazo el sitio de combinación del an­ ticuerpo codificado por el linfocito B. M ediante esta estrategia, Milstein y Cuello fueron capaces de producir anticuerpos m ono­ clonales biespecíficos, dirigidos sim ultánea­ m ente contra peroxidasa y som astotatina, lo que les permitió la realización de estudios inmunohistoquímicos de detección tisular de la hormona en un solo paso. Uno de esos sistemas consiste en fusionar células parentales deficientes en HGPRT, pero que expresan TK, con otras defectivas en TK pero que expresan HGPRT,, o a la fusión de cé­ lulas sensibles a HAT pero resistentes a uabaína, coñ otras resistentes a HAT y sensibles a

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Metodologías

uabaína. En ambos casos las células híbridas serán capaces de crecer en medio HAT mien­ tras que las parentales no podrán hacerlo. Hibridomas “humanos” El uso de los Ac Mo en la terapéutica huma­ na es uno de los campos de aplicación clínica más importantes en medicina. La inyección de anticuerpos monoclonales murinos con fines terapéuticos en hum anos, provoca la formación de anticuerpos humanos anti-anticuerpos de ratón (HAMA). Esta res­ puesta conduce a una disminución de la efecti­ vidad del tratamiento con las sucesivas inocu­ laciones, debido a un aumento en la velocidad de clearence del agente terapéutico y al blo­ queo de la unión del anticuerpo a su antígeno. También puede generar reacciones de hipersensibiUdad. Como consecuencia, la generación de anti­ cuerpos monoclonales humanos constituye un campo'de gran interés. Por ello se han desarro­ llado diversas estrategias para la producción de hibridomas humanos tales como: fusión de cé­ lulas humanas con mielomas de ratón; hibridi­ zación de células linfoides humanas con mielomas humanos; transformación de linfocitos por infección con virus de Epstein-B arr para in­ mortalizar células productoras de anticuerpos y la producción de anticuerpos con característi­ cas humanas generados por manipulación ge­ nética por aplicación de técnicas de ingeniería genética. H eter ohibridomás La primera de esas estrategias, hibridización interespecies (heterohibridomas), resulta ser de escasa utilidad debido a que habitualmente los hibridomas son inestables y se produce una rá­ pida segregación de cromosomas con pérdida preferencia! de cromosomas humanos. No obs­ tante se han descrito heterohibridomas estables. Hibridomas humano-humano La producción de este tipo de hibridom as presenta importantes dificultades entre las que se pueden destacar: a) las células B periféricas humanas (únicas de fácil obtención) no son una buena fuente de células productoras de anti­ cuerpos, por lo que se está trabajando intensa­ mente en el desarrollo de métodos de inmuni­ zación in vitro; b) la producción de células hu­ manas sensibilizadas para la fusión no pueden ser, en muchos casos, obtenidas por inmuniza­ ción; c) las células de mieloma humano, en ge­ neral, no se adaptan fácilmente al cultivo in vi­ tro por largos períodos y continúan secretando

sus propios anticuerpos; d) la inducción de mu­ taciones para permitir la selección por HAT in­ crementa la inestabilidad de estas células y e) los hibridomas suelen producir anticuerpos só­ lo en bajas cantidades. Transformación por virus de Epstein-Barr Los linfocitos B humanos pueden ser trans­ form ados con virus de E pstein-B arr (EVB). Cuando los linfocitos son cultivados con el an­ tígeno en presencia de EVB, algunas de las cé­ lulas B adquieren la capacidad de crecimiento inmortal mientras continúan produciendo el an­ ticuerpo deseado. Por clonado de estas células transformadas es posible obtener anticuerpos monoclonales humanos. Frecuentemente las líneas celulares obteni­ das resultan ser pobres productoras de anticuerpos. Anticuerpos quiméricos y “humanización” de anticuerpos Una estrategia alternativa consiste en elimi­ nar las regiones xenogeneicas del anticuerpo monoclonal murino y reemplazarlas por estruc­ turas humanas. Combinando la tecnología de AcMo con la ingeniería genética se ha logrado introducir en inmunoglobulinas humanas Va re ­ gión variable de anticuerpos monoclonales es­ pecíficos derivados de ratón, para producir de este modo anticuerpos “humanos” contra el an­ tígeno para el cual se inmunizó originalmente el animal. Estos anticuerpos, denominados an­ ticuerpos quiméricos, están formados por los dominios Vj^ y V^^ murinos insertados en genes CH y CL humanos. Son mucho menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos muri­ nos a pesar de mantener su capacidad de gene­ rar respuesta anti idiotípica, respuesta que pue­ de evitarse o disminuirse utilizando, en las su­ cesivas inyecciones, anticuerpos quiméricos de igual especificidad pero conteniendo diferentes isotipos. U na form a de lograr una “hum anización” más completa de los anticuerpos murinos sería in je rta r sólo las reg io n es determ inantes de complementariedad (CDR) en anticuerpos hu­ manos. Por esta vía se ha logrado construir an­ ticuerpos contra una gran variedad de antíge­ nos potencialmente importantes en la salud hu­ mana. Expresión recombinante de fragmentos de inmunoglobulinas La expresión recombinante surgió como una estrategia alternativa para “inmortalizar” clones específicos y producir in vitro grandes cantida­

Hibrídomas y anticuerpos monoclonales des de fragmentos de anticuerpos monoclona­ les. El huésped elegido para los primeros inten­ tos fue Escheríchia coli, dadas sus ventajas ta­ les como su rápido crecimiento y la disponibili­ dad de muchos y diferentes vectores para el clonado y la posterior expresión. El crecimien­ to de E.coli es barato y puede ser realizado en escala industrial con equipamiento mucho más simple que el requerido para la fermentación de células eucariontes. Además presenta la ventaja de proveer una fácil ruta para la modificación de los fragmentos por ingeniería genética. La mayor dificultad encontrada en el desa­ rrollo de esta tecnología fue la utilización de sistemas de secreción adecuados. Los primeros intentos para producir fragmentos de inmunoglobulinas como cuerpos de inclusión intrace­ lulares no fueron fructíferos, dado que los pro­ cedimientos de solubilización de los cuerpos de inclusión, además de tediosos, producen una importante pérdida de la actividad anticuerpo. E sa d ific u lta d fu e so rte a d a a p a rtir del informe, en 1988, del uso de vectores para la secreción de estas proteínas dentro del espacio periplásmico de la bacteria. Dicho ambiente es favorable para el correcto plegamiento de do­ minios de inmunoglobulinas, dado su carácter oxidante, que permite la formación del puente disulfuro interno que es imprescindible para el correcto plegam iento de los dominios v aria­ bles. Ello facilita la secreción del fragmento en forma soluble, ya sea en el espacio periplásmi­ co de la bacteria o en el sobrenadante de culti­ vo. Este fenómeno se produce si las células son inducidas por prolongados períodos, en dicho caso la acumulación de proteína en el espacio periplásmico junto con la lisis bacteriana pro­ ducen la salida parcial del fragmento al sobre­ nadante de cultivo. De esta m anera fue posible expresar frag ­ mentos Fab, lo que se logró coexpresando bajo la regulación del mismo promotor los fragmen­ tos CH,-Vjj de la cadena pesada y la cadena li­ viana en el espacio periplásmico de la bacteria. El rendimiento de estos sistemas de expresión va de 0.5 a 5 mg/litro de cultivo. Paralelamente surgió la necesidad de produ­ cir fragmentos con actividad anticuerpo de m e­ nor tamaño, fundamentalmente, para mejorar la penetrabilidad en los tejidos de fragmentos de inm unoglobulinas potencialm ente utilizables en tratamiento de tumores o en diagnóstico por imágenes en diversas patologías, así como para simplificar los estudios estructurales de la inte­ racción antígeno-anticuerpo. Ello motivó la ex­ presión de fragmentos E^, consistentes en heterodímeros formados por los dominios V„ y V ,. Dicho heterodímero tiene esencialmente igual constante de afinidad por el antígeno corres­ pondiente que el anticuerpo del que proviene;

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su PM es de aproxim adam ente 25 kD, y sus componentes están asociados en forma no co­ valente. La estabilidad del heterodím ero es p arcial­ mente dependiente de la secuencia aminoacídi­ ca de las regiones determ inantes de com plementariedad (CDRs), ya que estos aminoácidos participan en contactos V h“^ l- Esto hace que determinados fragmentos Fy sean muy poco es­ tables como dímeros, lo que se vuelve crítico a bajas concentraciones. P ara solucionar este problema se diseñó, basado en la estructura tri­ dimensional de varios Fabs y E^s, un péptido de 15 aminoácidos de composición (Gly^Serjj que actúa de puente entre el residuo carboxiterminal de VH y el residuo N-terminal de VL. Dicho péptido cumple la función de unir covalentemente los dos dominios sin alterar la es­ tructura del sitio de combinación. La estructura resultante se denomina scF^ (Single chain o Fy unicatenario), tiene alta estabilidad y con­ serva en general la afinidad por el antígeno, aunque la flexibilidad que le confiere el p épti­ do de unión provoca que se produzcan fenóm e­ nos de dimerización o polimerización parcial. Los fragmentos Fy y scFy son expresados de igual manera que los fragmentos recombinantes Fab, alcanzándose rendimientos que van de 0.5 a 10 mg/litro de cultivo, siendo menores en el caso de scFVs. En todos los casos la purifi­ cación es realizada mediante cromatografía de afinidad (fig. 37-6). Amplificación de ADN de dominios variables de inmunoglobulinas L a reacc ió n en cad en a de la p o lim e ra sa (PCR) (véase cap. 40) ha sido ampliamente u ti­ lizada para el clonado de los genes que codifi­ can para los fragmentos variables de inmunoglobulinas. Esta técnica permite rápida y sim ­ plem ente amplificar varios millones de veces esos genes mediante el uso de “primers dege­ nerados”. Un primer (Pr.) degenerado implica que di­ ferentes nucleótidos pueden ser encontrados en una posición particular en la secuencia del Pr., esto significa que el Pr. obtenido del sintetizador de ADN es en realidad una mezcla de va­ rios Prs., con diferencias en la secuencia oligonucleotídica en una o más posiciones. E stos Prs. son diseñados en base a secuencias conser­ vadas de los extremos amino y carboxi-termina! de los fragmentos variables de las cadenas pesada y liviana. En las posiciones donde no se observa am inoácidos conservados estos Prs. contienen secuencias degeneradas, las que son obtenidas agregando en esas posiciones m ez­ clas de,las 4 bases nucleotídicas. Además estos Prs. introducen en los extrem os de los frag-

792

Metodologías H ibridom a o linfocito B

Purificación de AR N m

AAA A A AR N m C adenas Pesada y Liviana

i

T ra nscriptasa reversa

AAAAA TT T T T

ADN catenario

Prim ers de Inm unoglobulinas

V„

.élLm m

CH,

CH,

CH,

V,

.M —

C.

Jj^PCR

Tstf •AWiiTZi^'Ví-'y. •»

Vh

V,

F ig . 3 7 -6 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c ió n d e g e n e s q u e c o d ific a n p a ra lo s fra g m e n to s v a ria b le s d e in m u n o g lo b u ­ lin as.

mentos amplificados sitios de restricción específicos. Esos sitios son utilizados para el posterior clonado de los fragm entos en diferentes vectores mediante el uso de enzimas de restricción (fig. 37-7).

La amplificación puede realizarse a partir de ARN mensajero proveniente de un hibridoma secretor de un anticuerpo monoclonal. En di­ cho caso se conoce de antemano la especificidad del anticuerpo, y se lo clona para obtener

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

PstI

BstEII

PstI

BstEII

793

SacI

SacI

Xhol

i CH,

BstEII

SacI

Xhol I

w Linker

V,

Tag

F ig . 3 7 -7 . D ia g ra m a d e v e c to re s u tiliz a d o s p a ra la e x p re s ió n y s e c r e c ió n d e fra g m e n to s d e in m u n o g lo b u lin a s. a ) F r a g ­ m e n to s F V ; b ) F ra g m e n to s F a b y c ) sc F v . C írcu lo lle n o : p ro m o to r la c z . R e c tá n g u lo lle n o : líd e r P e lB p a ra la s e c r e c ió n perip lá sm ic a ; L in k e r: g e n p a ra el p é p tid o d e u n ió n e n tr e V H y V L . T a g : s e c u e n c ia n u c le o tfd ic a q u e c o d ific a p a ra u n p é p tid o u tiliz a d o p a ra la in m u n o d e te c c ió n d e scF v .

SU secuencia nucleotídica y a través de ella la secuencia aminoacídica. Además dichos clones pueden ser utilizados para la expresión del fragmento Fv del anticuerpo en sistemas procariontes o eucariontes. En este caso se parte de un material enriquecido en copias del ARNm específico (ya que el hibridoma secreta en cul­ tivo grandes cantidades del anticuerpo m ono­ clonal). Los Prs. utilizados deben ser lo sufi­ cientemente diversos como para amplificar los fragmentos Vj, y V, del anticuerpo. Esta metodología ha servido también de base al desarrollo de bibliotecas de expresión de fragmentos variables de anticuerpos. En este caso el grado de degeneración de los Prs. utili­ zados debe ser muy alta, a fin de am plificar idealmente a todos los componentes de una po­ blación policlonal. Fragmentos de anticuerpos y biblioteca genómica combinatoria Otro enfoque para solucionar las dificultades en la producción de anticuerpos monoclonales “hum anos” , hace uso de otras estrategias de manipulación genética, tal como la expresión y selección de moléculas de anticuerpos en bac­ teriófagos. Brevemente, el ARNm de células B hum a­ nas se convierte en ADNc y los genes de anti­ cuerpos (o de sus fragmentos) se expanden por PCR. Luego se fabrican constructos en los que se permite la combinación al azar de los genes para cadenas H y L, en tándem con el gen de un bacteriófago. Esta biblioteca combinatoria contiene una enorm e cantidad de pares H-L

que codifican para un inm enso repertorio de anticuerpos, expresados como proteínas de fu­ sión en la superficie del fago. La gran cantidad de fagos producidos por infección en E .coli, pueden ser seleccionados en base a su afinidad por el antígeno unido a una fase sóUda. L os fa­ gos deseados pueden ser fácilmente clonados y el anticuerpo producido masivamente. También se han establecido bibliotecas com­ binatorias a partir de ARNm, expandiendo ge­ nes V,:,, V k y VX por PCR y posterior recom bi­ nación para formar constructos scF^, fusiona­ dos al fago. Se han obtenido así fragmentos específicos para una variedad de antígenos. Con esta estra­ tegia ha sido posible, también, producir frag­ mentos Fab. E ste tipo de estrategia tiene la ventaja que permite el manejo de un niimero de especifici­ dades muy superior al que se puede manipular por procedimientos de “screening” y produce in vitro, un fenómeno de selección parecido a la maduración de la respuesta in vivo. El uso de fragmentos recombinantes de anti­ cuerpos humanos ofrece varias ventajas sobre los anticuerpos “hum anizados” . Entre otras: son escencialmente humanos por lo que no ge­ nerarán anticuerpos HAMA; el bajo costo de producción permite su utilización fuera de los propósitos académicos; no requiere inm uniza­ ción y reúne mejores condiciones farmacocinéticas para su uso terapéutico. Además, los fragmentos se pueden clonar en vectores de expresión que los fusionen a proteí­ nas, diferentes de las inmunoglobulinas, de im­ portancia funcional, tales como toxinas, enzi­

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Metodologías

mas u hormonas. Esto permitirá su utiüzación para el direccionamiento específico de drogas o toxinas hacia sus blancos. Recientemente se ha logrado la producción de anticuerpos humanos específicos en respues­ ta a la estimulación antigénica de ratones mani­ pulados genéticamente. Esto se logró insertando elementos de los loci de cadenas pesadas y ca­ denas livianas hum anas en ratones (ratones transgénicos) en los que se eliminó la produc­ ción de cadenas H y L endógenas (ratones “knockout”). Los ratones así modificados pue­ den ser utilizados para producir anticuerpos hu­ m anos contra antígenos hum anos y tam bién empleados para la producción de hibridom as secretores de anticuerpos humanos. Estos ani­ males pueden expresar una extensa diversifica­ ción de anticuerpos y permitir la obtención de anticuerpos de buena afinidad. De acuerdo al manipuleo genético al que son sometidos pue­ d en , ta m b ié n p ro d u c ir cam b io de is o tip o (“switch” de clase). Este hecho es importante porque es conocido que anticuerpos de la mis­ ma especificidad pueden tener diferentes efec­ tos (por ejemplo: terapéutico) dependiendo del isotipo al que pertenecen.

bacterium transfiere ADN a la célula de la plan­ ta donde se integra a su genoma. Luego se rege­ neraron plantas que expresaban, individualmen­ te, cadena pesada o cadena liviana. Las plantas fueron luego cruzadas sexualmente para expre­ sar la inmunoglobulina entera. Los anticuerpos, obtenidos por purificación a partir de un homogeneizado de hojas, mantuvie­ ron la reactividad y afinidad por su antígeno es­ pecífico. La producción de anticuerpos en plantas abre nuevas posibilidades tanto para la investigación básica cuanto para la producción en gran escala a bajo costo. No obstante para su aplicación masiva, es necesario realizar una gran cantidad de estudios previos, tales como el de la compo­ sición de carbohidratos, proleólisis, inmunogenicidad, propiedades funcionales, etcétera. PARTE EXPERIMENTAL 1.

Medios de cultivo y soluciones

Hasta aquí hemos presentado hibridotnas, ge­ nerados por fusión de células de mieloma con linfocitos B, capaces de producir anticuerpos. Las células T pueden producir hibridomas por fusión con células T neoplásicas denomina­ das, tímoma, de manera equivalente a la descri­ ta para células B. En lugar de secretar anticuerpos, los hibrido­ mas T poseen otras propiedades tales como se­ creción de linfoquinas o expresión de receptor T específico para un dado complejo Ag-CMH. Se han obtenido también, hibridomas T con caracte­ rísticas de T helper, supresores o citotóxicos. Sin embargo su uso no se ha extendido por diversas razones inherentes al sistema y fundamentalmen­ te porque se han desarrollado métodos prácticos de cultivo y clonado de linfocitos T.

a. Medios básicos: los medios más comúnmen­ te usados, de entre los muchos disponibles, son: RPMI 1640. DMEM (Dulbecco’s modified Egle’s médium) e IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Médium). Estos son me­ dios básicos que requieren ser suplementados para las distintas etapas del cultivo (pue­ den contener o no C 0 jNa 2, 2 g/l). b. Medio libre de suero: medio básico con el agregado de l-glutamina 3,5 x 10"^ M, piruvato sódico 1,75 x lOf M, penicilina 100 UI m f', estreptomicina 100 g mf*. Algunos au­ tores adicionan 2-mercaptoetanol 5 x 10 M, anfotericina B 2,2 mg/1, entre otros. c. Medio 10%: 900 ml de medio libre de suero más 100 ml de suero bovino fetal. d. Medio 20%: 900 ml de medio libre de suero más 200 ml de suero bovino fetal. e. M edio HT: m edio 20% más h ipoxantina 4 X 10“M y timidina 1,6 x 10-“^M. f. M edio HAT: medio HT más aminopterina 4 x lO m

Anticuerpos producidos en plantas

M edio de congelación

En los últimos años, el desarrollo de plantas transgénicas ha alcanzado un grado tal de desa­ rrollo que se puede dirigir la expresión de pro­ teínas extrañas tanto a un órgano de elección com o a un com partim iento subcelular. Entre ellas, se destaca la producción de anticuerpos. Para ello, cADN codificantes para cadenas pesada y liviana, preparado a partir de un hibri­ doma, fueron insertados en Agrobacterium tumefaciens, bacteria de probada utilidad para la transformación de células vegetales. El Agro-

Suero bovino fetal con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).

Hibridomas a células T

Solución de agente fusógeno P o lietilen g lico l (PEG ) 1500 50% peso/vol, 1 vol; GKN 1 vol. GKN puede ser reemplazado por medio básico; algunos autores recom iendan el agregado de DMSO al 5% final. Se puede utilizar PEG de otros pesos moleculares.

Hibrídomas y anticuerpos monoclonales Buffer GKN Cloruro de sodio 8 g; CIK 0,4 g; fosfato disódico 2 H p 1,77 g; PO.H^Na 2 H p 0,69 g; G lu­ cosa 2 g; rojo fenol 0,01 g; agua csp 1 litro. Este buffer es recomendable para el lavado de las células, especialm ente cuando se usa PEG. 2. Células que se deben usar en la fusión Células de bazo Sacrificar el animal y extraer asépticamente el bazo, colocarlo en un recipiente con medio de cultivo solo o con 3% de suero (o en GKN), R esuspender las células linfoides. Para esto existen varios métodos, aunque nosotros opta­ mos por el homogeneizador de Potter pues per­ mite obtener buenas suspensiones en forma rá­ pida y con buen rendimiento. Dejar sedimentar los agregados celulares por 5 minutos o filtrar por tamiz de 60-80 mallas por cm^. Lavar las células 3 veces por centrifugación a 300-400 xg, 5 min a temperatura ambiente y contar las células viables mediante la prueba de exclusión del colorante con Azul tripán. A lgu­ nos autores aconsejan lisar los eritrocitos antes del recuento. Células de mieloma Cosechar células que se encuentren en fase exponencial de crecim iento. Las células de mieloma son fácilmente despegadas de la su­ perficie mediante aspiración-expulsión con pi­ peta Pasteur. Para realizar la fusión, la viabihdad no debe ser menor del 80%.

795

nes adecuadas, las que varían según el mieloma utilizado entre 10:1 y 1:1. Centrifugar a 400 xg 5 min. Eliminar completamente el sobrenadan­ te, succionando con pipeta Pasteur para evitar la dilución del PEG. Colocar el tubo en un baño de agua a 37°C (resulta muy cómodo usar como recipiente para el agua un vaso de precipitados de 250 mi) y agregar 1 mi de PEG precalentado a 37“C, agi­ tando suavemente por rotación del tubo y suave vaivén de la pipeta, durante 1 minuto. En este tiempo puede observarse la aglutinación de cé ­ lulas. C o n tin u ar agitando durante otro m in u to . Agregar 2 mi de medio sin suero (o GKN) du­ rante 2 min, siempre con agitación suave. A gre­ gar otros 10 mi lentamente durante 6 minutos. Centrifugar (5min, 400 xg), eliminar el so­ brenadante, lavar y resuspender las células en 50 mi de medio selectivo (HAT). Distribuir en no menos de 6 placas de 24 fosas y completar a 1 mi por fosa con el mismo medio (se pueden usar placas de 96 fosas a razón de 100 (il/fosa). Incubar en estufa de atm ósfera controlada con 5-10% de CO^ según el medio utilizado y 95% de humedad. A los 5 días aproximadamente puede com en­ zar a observarse el crecimiento de las células híbridas; al día 7 agregar 1 mi más de m edio selectivo. Si se utilizan células ahmentadoras, éstas d e ­ berán ser incorporadas a la placa de cultivo 2448 horas antes de la fusión. Se debe alim entar periódicam ente, d escar­ tando 1 mi de sobrenadante y renovándolo por 1 mi de medio fresco. Después de 2 o 3 sem a­ nas, reemplazar el HAT por HT. Otros métodos de fusión

Células alimentadoras Una de las células alim entadoras más fre­ cuentemente utihzadas son los macrófagos de exudado peritoneal. Para su obtención, inyectar 8-10 mi de buffer GKN intraperitonealmente y retirar el líquido después de 1-2 minutos. Lue­ go lavar las células blancas, de las que aproxi­ madamente el 75% son macrófagos, resuspen­ der en HAT y distribuir en los pocilios de culti­ vo a razón de aproximadamente 10“^ células en cada uno, 24 horas antes de la fusión. Se pue­ den utilizar también timocitos e inclusive es­ plenocitos. Método Fusión de células en suspensión Mezclar en un tubo cónico de 50 mi, las cé­ lulas de bazo con las de mieloma en proporcio­

Existen otros métodos de fusión, com o el que tiene lugar sobre membranas filtrantes, v a­ riantes que incluyen electrofusión y varias m o ­ dificaciones del protocolo descrito, que h an mostrado ser efectivas. 2. Detección de anticuerpos en el sobrenadante de cultivo Los ensayos con sobrenadantes se realizan cuando los cultivos alcanzan aproximadamente 70% de confluencia y después de 2 o 3 días sin recambio de medio. Los m étodos más com únm ente em pleados son: enzimoinmunométodos, radioinm unom étodos, inmunofluorescencia indirecta, aglutina­ ción directa o indirecta, lisis complemento-de­ pendiente, detección de células productoras de anticuerpos (Jeme), métodos descritos en d eta­ lle en otros capítulos de este libro.

796

Metodologías

3. Clonado Por dilución límite Este método está especialmente indicado pa­ ra cuando se obtienen pocos cultivos positivos. Una forma de hacerlo es sembrando, en las tres primeras filas de una placa de 96 pocilios, un promedio de 5 'células por fosa, en las tres filas siguientes 1 célula por fosa y 0,5 células por fosa en las dos filas restantes. Para ello conviene preparar 4,6 ml de una sus­ pensión conteniendo 230 células híbridas viables por ml en medio de cultivó con 20% SBF y dis­ pensar 100 ^tl en cada una de las 36 primeras fo­ sas. Al mililitro restante agregarle 4 ml de medio y sembrar otras 36 fosas. A la suspensión rema­ nente adicionarle 1 ml de medio y sembrar las últimas 24 fosas. También pueden ser utilizadas otras variantes de esta distribución. Incubar, tratando de no moverlas, por lo me­ nos durante 7 días, observar al microscopio in­ vertido y marcar las fosas en las que crezca un solo clon. Los cultivos deben ser realimentados alrededor de los días 7 y 14 con unos 100 |il de medio. Cuando se alcance un crecimiento con­ fluente, se debe tomar sobrenadante para el en­ sayo de anticuerpos. Los cultivos que conteniendo originalmente un solo clon en crecimiento resulten positivos, p u ed en ser e x p a n d id o s, m ie n tra s que los biclonales o pohclonales pueden ser reclonados. Clonado en agar semisólido Preparar una capa de agar base al 0,5% en m edio 20% (un volum en de m edio 2X con 20% de suero fetal más 1 volumen de agar al 1 % en agua), colocando 15 ml por placa de Petri de 10 cm de diámetro (disminuir apropiada­ mente para placas de m enor tam año) y dejar solidificar. Hacer distintas diluciones celulares (de 100 a 50.000 por mililitro) en tubos con medio 20% de suero mantenidos a 40-42“C y agregarles 1 volumen (1 ml) de agar 0,5% preparado en la forma indicada arriba, mezclar y distribuir cui­ dadosamente sobre la capa base. Dejar soUdificar e incubar a 37°C en incuba­ dor de COj. A los 4-5 días pueden observarse colonias microscópicas que pueden ser transfe­ ridas a medio líquido en policubetas. El uso de células alimentadoras es conveniente en este paso. Norm alm ente es suficiente con repicar una veintena de clones de cada híbrido. El repi­ que se realiza con pipeta fina, Pasteur o capilar, observando al m icroscopio invertido con el menor aumento. Tras 13-15 días de cultivo en agar los clones son observables a simple vista.

Las células repicadas se dejan crecer lo sufi­ ciente para el ensayo de los sobrenadantes. El reclonado es aconsejable a fin de asegurar la monoclonalidad, cualquiera que sea el méto­ do utilizado. 4. Expansión de clones positivos Los clones en crecim iento sem iconfluente que dan reacción positiva son expandidos gra­ dualm ente, observando los lím ites de creci­ miento ya mencionados, hasta alcanzar el gra­ do de expansión deseado. 5. Congelación de células Centrifugar 10®-10’ células a 400 xg a 4°C, durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de medio de congelación; transferir a vial de congelación y colocarlos en una caja de telgopor con paredes de por lo m e­ nos 1 cm de espesor. Colocar en congelador de -70°C durante 24-48 horas y luego transferir directamente a tanque de nitrógeno líquido. Es conveniente congelar por lo menos 3 via­ les de cada hibridoma. 6. Descongelación de células Descongelar tan rápidamente como se pueda agitando el vial en baño de agua a 37"C; trans­ ferir las células a un tubo con medio contenien­ do 10% de suero, a 4°C. Centrifugar, resuspen­ der en medio para cultivo (20% es aconsejable en este estadio) y transferir a 6-12 fosas de una placa de 24 pocilios, o a frasco de cultivo de 25 cm^ de superficie. 7. Producción de líquido ascítico Cosechar células de un cultivo con buen cre­ cimiento, lavarlas varias veces y resuspender en GKN e inyectar intraperitonealmente 0,5 ml conteniendo 2 X 10*> células, en ratones isogénicos previamente inoculados (1-9 semanas an­ tes) por esa misma vía con 0,5 ml de pristane (tetrametilpentadecano). El líquido acumulado es drenado por pun­ ción peritoneal (usualm ente alrededor de 10 días luego de la inoculación) y repetir el proce­ dimiento cada 2 o 3 días hasta el sacrificio o muerte del animal. En lugar de ratones isogénicos se pueden uti­ lizar animales alogénicos inmunosuprimidos. BIBLIOGRAFÍA L G a lfre , G . y M ils te in , C .:P re p a r a tio n o f m o n o c lo n a l a n tib o d ie s : stra te g ie s a n d p ro c e d u re s . E n: L a n g e n e , J.J. y V a n V u n a k is . H . M e th o d s in E n z y m o lo g y , v o l 7 3 , p 3. A c a d e m ic P re ss , N u e v a Y o rk , L o n d re s, 1981.

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797

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ELISA

38

NORBERTO W. ZWIRNER

C O N C EPT O S BÁSICOS Los enzim oinm unoanálisis (EIA) o ELISA (“Enzym e-Linked Iram uno Sorbent A ssay”), descritos hace 25 años, se basan en dos fenó­ menos biológicos importantes: 1. la elevada especificidad de los anticuerpos (Ac); 2. la alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo que perm ite la am plificación de la señal generada por la muestra. Independientemente de los esquemas experi­ mentales empleados, los EIA comprenden dos etapas generales; 1 . la reacción de un inmunorreactante con un

antígeno (Ag) o anticuerpo (Ac); 2 . la detección de ese inm unorreactante m e­ diante la utiUzación de un conjugado enzi­ mático. La sencillez de los ELI§A, sumada a la po­ tencialidad de los anticuerpos m onoclonales (AcMo), hace que día a día se vayan imponien­ do sobre métodos tales como aquellos basados en la utilización de un trazador radiactivo (radioinmunoanálisis -RIA-), un trazador emisor de luz (quim iolum iniscencia) o un trazador fluorescente (fluorografía). La gran ventaja del ELISA sobre los-otros métodos reside en que no requiere un equipamiento demasiado sofisti­ cado para su implementación en el laboratorio. Además, los reactivos empleados son de una vida media muy alta (en el caso del RIA, un trazador radiactivo marcado con iodo tiene una vida media de 60 días, mientras que un conju­

gado enzimático usado en ELISA suele conser­ varse en buen estado durante años) y no se co­ rre el riesgo de contaminación producida por el manipuleo de isótopos radiactivos. Antes de comenzar con la descripción de los EIA más comunes es importante definir dos pa­ rámetros ampliamente usados: SENSIBILIDAD es el cambio en la respues­ ta (dR) por cada cambio de la cantidad de reactante (dC). En un gráfico de dosis-respuesta en EIA (fig. 38-1), la sensibilidad es la pendiente de la curva en un punto determinado. Debido a que las curvas dosis-respuesta de los EIA en g e n e ra l son sig m o id e a s, la s e n s ib ilid a d (dl^dC ) no es constante. LIMITE DE DETEC­ CION es la mínima cantidad de inmunorreac­ tante que puede detectar el sistema. De acuerdo a los parámetros definidos en el. párrafo anterior, la curva roja de la figura 38-1 corresponde a un sistema con una sensibilidad mayor que la curva azul. A pesar de ello, ésta tiene un límite de detección menor que la curva roja. C lasificación de los enzim oinm unoanálisis: Los enzim oinm unoanálisis pueden clasifi­ carse en: a. EIA homogéneos; b. EIA heterogéneos. Los primeros se realizan exclusivamente en fase líquida, mientras que en los segundos se em plea un soporte sólido para inm ovilizar a uno de los inmunorreactantes. Por cuestiones de sencillez y aplicabilidad general, sólo nos dedicaremos al estudio de los EIA heterogé-

ELISA Los ElA heterogéneos pueden clasificarse en dos tipos: L enzim oinm unoanálisis de amplificación de actividad; y 2. enzimoinmunoanálisis de modulación de actividad. En los enzim oinmunoanálisis de amplifica­ ción de actividad o no competitivos (fig. 382a), se em plea un gran exceso del inm unorreactante con el objeto de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a ser dosado. De acuerdo a la ley de acción de masas, un exceso de inmunorreactante permite detectar niveles muy bajos del analito que se quiere determinar. Estos ELISA se subdividen de acuerdo a la molécula inmovilizada en la fa­ se sólida. La inmovilización del Ag para detec­ tar Ac es un sistema que tiene una alta detectabilidad debido a que varias moléculas del con­ jugado enzimático, que en este caso son Ac anti-Ig marcados con la enzima, pueden unirse a cada molécula de Ac que reaccionó con el Ag inm ovilizado. Este efecto se traduce en una gran amplificación de la señal. Mediante la uti­ lización de métodos de “puenteo” inmunológico (con Ac anti-Ig) o no inmunológico (con el sistema avidina-biotína o proteína A) es posi­ ble aumentar aún más la detectabilidad. En ge­ neral, estos sistemas se denominan ELISA de amplificación. Otro sistema de amplificación de actividad es el ELISA de captura, en el que se inmovili­ za un Ac (“Ac de captura”), se captura Ag y se revela su presencia con un conjugado enzim á­ tico anti-Ag. Este sistem a se emplea para la cuantificación de Ag o para la detección de Ac contra el Ag capturado. En general, es desea­ ble que el conjugado enzimático y el Ac inm o­ vilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistem a originadas por reacción cruzada del conjugado con el Ac de captura. En enzimoinmunoanálisis de modulación de actividad o competitivos (fig. 38-2b) se modula la actividad del conjugado enzimático por com­ petición con el analito. Menores cantidades del conjugado enzimático permiten obtener una detectabilidad mayor, ya que pequeñas cantidades del competidor tienen un gran impacto sobre la actividad enzimática detectada en la fase sólida. Existen dos diseños generales de ensayos de modulación de actividad: en uno de ellos, el li­ gando m arcado con enzim a y el ligando sin marcar que se quiere dosar se- incuban simultá­ neamente en el sistema; en el otro diseño, el li­ gando no marcado a ser dosado se incuba en una primera etapa y en una segunda etapa se incuba con e! ligando marcado enzimáticamente, el que

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reaccionará con los sitios no ocupados por el li^ gando que reaccionó en la primera etapa. Independientemente de estos dos diseños g e­ nerales, en ELISA de modulación de actividad se puede inmovilizar el Ae en la fase sólida y agregar el Ag marcado con la enzima (fig. 383a). Se observará una disminución de la activi­ dad enzim ática a medida que se compite con cantidades crecientes de Ag libre presente en una solución patrón de Ag o en una m uestra problema, siendo la concentración de producto coloreado formado inversamente proporcional a la concentración de Ag libre. Alternativamente (fig. 38-3b) es posible in ­ m ovilizar el Ag y usar Ac anti-Ag m arcados con enzima. En este caso se realiza una com pe­ tición de la unión de estos Ac al Ag inm ovili­ zado, por medio de Ag libre presente en una solución patrón o en una m uestra problem a. Como consecuencia de esta competición, la ac­ tividad enzimática deteetable disminuye a m e­ dida que se emplean concentraciones crecientes de Ag libre. Una tercera variante (fig. 38-3c) es usar el sistema descrito en el párrafo anterior con la diferencia de que se emplea un Ac anti-Ag sin m arca en zim ática y en una etap a sig u ien te agregar un conjugado anti-Ig marcado con la enzima. Este ensayo es de modulación y am pli­ ficación de actividad y tiene la ventaja de que permite aumentar la detectabilidad del sistema. En todos los ensayos inmunoenzimátieos en fase sólida, independiente de las numerosas es­ trategias existentes, se pueden distinguir 3 eta­ pas: 1. inmovilización del inmunorreactante (A c o Ag) en la fase sólida: 2. incubación con la muestra de modo que ésta reaccione con el inmunorreactante inm ovili­ zado: 3. amplificación o modulación por medio de la utilización de un conjugado enzimático (es­ ta etapa puede en realidad ser de mas de un paso). Sistemas alternativos de reconocimiento: 1. Sistema A vidina-biotina La avidina es una proteína de la clara de huevo y la estreptavidina es una proteína p ro ­ ducida por ciertas levaduras. Ambas se caracte­ riz a n p o r su e le v a d a a fin id a d por b io tin a (K^ = 10*5 ]y¡-i) Debido a que la biotina es fácilinente acoplable a distintas proteínas (entre ellas, Ac y enzimas) por unión covalente sin afectar su actividad biológica, se han desarro­ llado métodos inmunoenzimátieos basados en la interacción avidina-biotína (fig. 38-4).

800

Metodologías

C u ad ro 38-1. Proteína A de Staphilococcus aureus (cepa Cowan I) y reactividad con inmunoglobulinas de distintas especies Especie

¡sotipo

A finidad

++++

H um ano

IgG , IgG a Ig G , IgG ^ IgG ,

+ ++++

R a tó n F ig . 38-1. C urvas dosis (C ) - respuestas (R) típicas obte­ nidas en ensayos inniunoenzim áticos. S e p u e d e observíu-

R a ta

La biotinil ación se produce por reacción del grupo carboxilo de la biotina con grupos -NH^ de residuos de lisina de las proteínas. En gene­ ral se preparan ésteres de líiotina con grupos químicos separadores (“spacers”) que permiten que el residuo de biotina quede en una zona ex­ terna de la molécula, accesible para la reacción posterior con la avidina.

Es una proteína de la pared de Staphüococcus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afini­ dad (K = 10* M ’) por fragmentos Fe de algu-

Ig G , IgG ,., Ig G a Ig G ,,

unido a fase sólida

^

Inm unorreactante 2

+++

+

+++

+ /-

O v e ja C a b ra

-

C a b a llo

++

C e rd o

++-f

C o n e jo

++++

nos isotipos de las inmunoglobulinas, los que se detallan en el cuadro 38-1. Tiene 4 sitios de unión pero usualmente sólo reaccionan dos. Es­ tas propiedades permitieron el desarrollo de di-

ísm m

íi> c "am mm m i )€ m [% * ' Inm unorreactante 1

++++

IgGj

q u e la curvii ro ja tie n e u n a m a y o r sen .sib ilid ad en la z o n a de m a y o r p e n d ie n te (d R /d C ) q u e la c u rv a az u l. P o r su p a rte , é s ta tie n e u n lím ite d e d e te c c ió n m e n o r q u e la c u rv a ro ja.

2. Proteína A

IgG 2. lg G ,„

+-I--I-+

^

Inm unorreactante unido a fase sólida

^

Inm unorreactante com petidor

co n ju g a d o enzim ático

C onjugado enzim ático

b Fig. 38-2. C lasificación general de los ensayos inn iu n oen zim áticos heterogéneos, a) E L ISA de am plificación de a c­ tividad. E n e s te tip o d e e n s a y o s , u n e x c e s o d e l in m u n o r re a c ta n te 2 (az u l) r e a c c io n a c o n el in m u n o rre a c ta n te 1 in m o v iliz a ­ d o en la fa s e s ó lid a (ro jo ). L u e g o d e la e ta p a d e la v a d o , el in m u n o rre a c ta n te 2 q u e re a c c io n ó se p o n e e n e v id e n c ia al e n ­ fre n ta rlo c o n u n e x c e s o del c o n ju g a d o e n z im á tic o (v e rd e y ro sa ), b. E L ISA de m odulación de actividad. E n e s te tip o d e e n s a y o s , el in m u n o rre a c ta n te c o m p e tid o r (a z u l) y el c o n ju g a d o e n z im á tic o (az u l y ro sa ) c o m p ite n p o r la u n ió n al i n m u n o ­ rre a c ta n te in m o v iliz a d o e n la fa s e s ó lid a (ro jo ).

ELISA

801

f

'%f

Anticuerpo de captura



A ntígeno a ser capturado

%

^

A ntígeno unido a fase sólida A ntíg e n o com pe tid o r soluble

% %¡ C onjugado anticuerpo-enzinia

C onjugado antígeno-enzirm a

Fig. 38 -3. V arian tes d el E L IS A d e m od ulación de actividad, a) E L ISA de com petición usando A g m a r­ cado con enzim a. E n e s te e n s a y o se íia c e u n a c o m p e ti­



c ió n e n tre el A g p re s e n te en u n a so lu c ió n p atró n o e n u n a m u e s tra p ro b le m a (ro jo ) y el A g m in e a d o c o n u n a e n z im a (ro jo y v e rd e ) p o r el A c in m o v iliz a d o en la fa s e só lid a (a z u l), b) E LISA de com petición usando A c es­ p ecíficos m arcad os con en zim a. E n e s ta v a ria n te se re a liz a u n a c o m p e tic ió n e n tre el A g in m o v iliz a d o en la fa s e s ó lid a (ro jo ) y A g en fa s e liq u id a (y a se a en u n a s o ­ lu c ió n p a tr ó n o e n u n a m u e s tra p ro b le m a ; ro jo ) c o n A c e s p e c ífic o s d e A g m a rc a d o s c o n e n z im a (azul y ro sa ),

V,

' .i

^

-

■!

-

J


H H — A g-A ci-A c 2-E

donde Ac, es el Ac específico de Ag y Ac^-E es el conjugado anti-inmunoglobulinas de la espe­ cie 1 ínarcado con enzima.

812

Metodologías

Anti-lgM inmobilizado en fase sólida

Fig. 38-7. D etección de IgM esp e­ cífica de A g p or E L ISA de cap tu ­ ra. En este en say o , se c a p tu ra la IgM sérica total (m arrón) m ediante la utilización de Ac anti-IgM inm o­ v iliza d o s en la fase só lid a (azul). P o ste rio rm e n te la Ig M e s p e c ífic a captura el Ag (verde) y finalm ente se revela su presencia por alguno de los m étodos discutidos en páginas anteriores.

IgM sérica IgM sérica

Revelado del sistema con un Ac anti-Ag marcado con enzima

Incubación con Ag

Nuevamente, la existencia de Ag libre se manifestará como una caída en la absorbancia respecto del control incubado sin Ag libre (“dosis cero”). Procesamiento de datos y expresión de resultados en ensayos inmunoenzimátieos 1.

Cálculo del título de un suero

Los resultados de los ELISA pueden expre­ sarse de dos formas. Por un lado es posible in­ formar la concentracicSn (molar, mg • mb’, etc.) de un Ag por comparación e interpolación en la zona de mayor pendiente (sensibilidad) de una curva de calibración hecha con una solución de

concentración conocida de Ag; por otro lado se puede informar la actividad de un suero en uni­ dades arbitrarias. Esto se debe a que no es posi­ ble informar el título de un suero en mg • m i' de Ac específicos debido a la heterogeneidad de clases, subclases y afinidades de los Ac que componen los sueros. Este problema se presen­ ta también si se ciuiere comparar la reactividad del suero con la reactividad de un suero patrón en un determinado ensayo, ya que ambos pre­ sentarán una curva dosis-respuesta propia. El problema del procesamiento de resultados en ELISA se presenta entonces con el cálculo del título de Ac sét;icos específicos. En los pá­ rrafos siguientes se comentan algunos aspectos relacionados a este problema. Existen varios métodos para calcular el título de sueros; cada uno presenta una serie de ven­ tajas y desventajas. Los más ampliamente utili­ zados: a) el método de titulación a punto final; b) la medida de la absorbancia de un suero a dilución sitnple, y c) el cálculo del título de un suero en unida­ des arbitrarias por comparación con un suero patrón. a) Titulación a punto fin a l

Fig. 38-8. C álculo del título de un suero por titulación a p un to final. Se puede observar que el título del suero depende del criterio elegido para calcularlo. Si se elige co­ m o título la dilución del suero que produce una absorban­ cia igual al 50% de la absorbancia rnáxim a del sistem a se ob tien e un valor (título A) que será diferente del obtenido si se elige com o título la dilución del suero que produce una absorbancia de 0,2 (título B).

El método de titulación a punto final consis­ te en analizar el suero problema en diluciones seriadas en razón 2. Si se grafica la absorbancia en función del logaritmo de la inversa de la di­ lución del suero se obtendrá una curva sigmoi­ dea. Si se elige una determinada absorbancia se podrá calcular la dilución de suero que produce

ELISA

DO 1 0,8 +

0,6

-

0 ,4

-

0,2

C

. • • 2* log [titu lo ]

Fig. 38-9. C álculo del títu lo de un suero por m edida de la absorbancia a dilución sim ple. Si se grafica la absor­ bancia de una dilución pre-establecida de sueros negativos y positivos en función del logaritm o del título (por titula­ ción a punto final) de esos sueros (puntos azules) se obten­ drá una curva sigm oidea (rojo) com o la de la figura. A sí se podrá calcular el título de un suero problem a como si se lo hubiese titulado a punto final, por interpolación en la curva de la absorbancia de ese suero ensayado a dilución simple.

dicha absorbancia y este valor podrá ser toma­ do como el título de ese suero (fig. 38-8). El problema está en elegir ese valor de absorban­ cia. Algunos autores eligen como título la dilu­ ción de suero que produce una absorbancia igual al doble de la absorbancia producida por el control incubado sin suero. Otros autores eli­ gen una absorbancia de 0,5 como valor para es­ tablecer el título de un suero, mientras que otros prefieren elegir como título la dilución de suero que produce un 50% de la absorbancia máxima. Como es fácil de imaginar, estos cri­ terios brindarán títulos que no serán compara­ bles entre sí. Lo importante es fijar un criterio de trabajo y respetarlo, de modo de poder com­ parar títulos de sueros a lo largo del tiempo. El método de la titulación a punto final presenta la ventaja de que se analiza la curva de titulación de cada suero. Esto permite obtener el título de sueros ya sean de bajo o de alto título. Sin em­ bargo, es un método laborioso y costoso, por lo que en muchos casos se prefiere el inétodo de la medida de la absorbancia a dilución simple. b) Medida de la absorbancia a dilución simple

El método de la absorbancia a dilución sim­ ple consiste en tomar como título la absorban­ cia del suero a una dilución fija, elegida previa­ mente. Si bien es un método sencillo y más eco­ nómico que el anterior, presenta la desventaja de no ser útil para discriminar entre sueros de bajo título (porque la absorbancia está demasia­ do cercana a la obtenida en ausencia de Ac) ni para discriminar entre sueros de alto título (por­ que la absorbancia está cercana al máximo de saturación del sistema, en muchos casos limita­ dos por la capacidad del lector de policubetas).

813

Existe un método alternativo que permite calcular el título de un suero analizándolo a di­ lución simple. Para ello se construyen curvas dosis-respuesta de un gran número de sueros (desde negativos hasta positivos altos) o de un suero patrón altamente positivo y diluciones del mismo en süero negativo. Se calcula el títu­ lo de cada uno por el método de la titulación a punto final. Luego se determina la absorbancia de cada suero a una dilución simple (por ejem­ plo, 1/1000). Se obtendrá para cada suero, pa­ res de valores (título; absorbancia a dilución simple). Si se grafica esa absorbancia (en las ordenadas) en función del logaritmo del título (en las abscisas) se obtendrá una curva sigmoi­ dea (fig. 38-9). Posteriormente se podrá anali­ zar cualquier nuevo suero a la dilución simple elegida y, por interpolación en esta curva sig­ moidea, calcular su título. Este método presen­ ta la ventaja de que se podrá calcular el título de un suero analizándolo a dilución simple. Sin embargo, presenta la desventaja de que se asu­ me un paralelismo entre las curvas de titulación de los diferentes sueros, lo que en la práctica pocas veees ocurre. Además, el método es útil sólo en las zonas donde la curva sigmoidea tie­ ne mayor pendiente, si bien existen artificios matemáticos para expandir el rango útil de la curva (por ejemplo, aplicando la función logit). c) Título de un suero en unidades arbitrarias p or comparación con un suero patrón

El método de titulación y comparación con un suero patrón consiste en titular el suero pro­ blema y un suero patrón, al que arbitrariamente se le asigna una determinada cantidad de uni­ dades • ml * como actividad de Ac. Partiendo de la base de que una misma absorbancia es producida por cantidades equivalentes de Ac, será posible calcular la cantidad de unidades ■ m l' del suero problema por comparación con el suero standard (fig. 38-10). Ese valor de ab­ sorbancia para realizar la comparación debe caer en la zona de mayor pendiente de las cur­ vas de titulación de los sueros. En caso de no disponerse de un suero patrón será posible to­ mar como estándar una mezcla (“pool”) de sue­ ros positivos, a la que se le asigna una determi­ nada cantidad de unidades ■m l'. Este método presenta la desventaja de que, para que sea po ­ sible comparar el comportamiento de los sue­ ros, éstos deben originar curvas de titulación paralelas. Sin embargo, esta situación se da po­ cas veees en la práctica. 2. Cálculo del valor de corte Un elemento esencial en todo ELISA cuanti­ tativo es establecer el valor de discriminación

814

Metodologías

entre una muestra positiva y una muestra nega­ tiva. Este valor se denomina valor de corte o “cut'Off ’ y es independiente del método usado para el cálculo del título del suero. En todo ELISA, los sueros negativos mues­ tran una comportamiento que se asemeja a una distribución normal, pero presentan un sesgo positivo o tendencia a producir valores de ab­ sorbancia o títulos mas altos que los esperados si siguieran una distribución normal (véase fig. 38-11). Debido a este comportamiento, y desde un punto de vista matemático, el uso de paráme­ tros que surgen de muestras que siguen tal dis­ tribución no es formalmente correcto en este ti­ po de ELISA. Sin embargo, el desvío estándar es un parámetro ampliamente utilizado en di­ versos ELISA para establecer el valor de corte y puede calcularse como: D S= J i : ( x . - m ) ^ n- 1 donde n es el número de sueros negativos ana­ lizados, m es el media aritmética y x¡ es la reactividad de cada suero. El análisis de las muestras por duplicado o triplicado mejora la confiabilidad del DS obte­ nido pero la distribución de la reactividad de los sueros negativos no cambia, al igual que ese sesgo positivo antes mencionado. Para el caso de un número bajo de muestras negativas, la distribución que se aplica habi­ tualmente es la distribución t, la que presenta un área mayor en las colas de la curva de distri­ bución. Otro aspecto a tener en cuenta cuando se rea­ lizan ensayos serológicos en general y ELISA en particular es la confiabilidad de un resulta­ do, ya sea positivo o negativo. Esta confiabili­ dad depende de la prevalencia del Ag o Ac en la población. Para aclarar esto es necesario de­ finir dos parámetros: el índice de detectabilidad para muestras positivas [ID(-i-)] y el índice de detectabilidad para muestras negativas [ID(-)]. El ID(-i-) es la medida de la habilidad del ensa­ yo de mostrar como positiva a una muestra que realmente es positiva (también conocido como “sensibilidad”, término que no debe confundir­ se con la “sensibilidad del ensayo” -definida anteriormente-); por otra parte, el ID(-) es la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como negativa a una muestra que realmente es negativa (también conocido como “especifici­ dad”). En términos matemáticos se pueden es­ cribir como positivos en el ensayo S ensibilidad o ID(-’r ) =

X

positivos en el ensayo + falsos negativos

100

negativos en el ensayo Especificidad o ID (-) = -------------------------------------- x 100 negativos en el ensayo + falsos positivos

donde los positivos en el ensayo son las mues­ tras positivas que el ensayo detecta como posi­ tivas, los falsos negativos son las muestras que en realidad son positivas pero que el ensayo muestra como negativas, los negativos en el ensayo son las muestras negativas que el ensa­ yo detecta como negativas y los falsos positi­ vos son las muestras que en realidad son nega­ tivas pero que el ensayo detecta como positi­ vas. Por supuesto, para poder calcular estos pa­ rámetros es necesario disponer de un lote de muestras positivas y negativas conocidas. La confiabilidad en la positividad [C(-i-)J o valor predictivo es la probabilidad de que una muestra que el ensayo detecta como positiva sea realmente positiva. Del mismo modo, la confiabilidad en la negatividad [C(-)] es la probabiUdad de que una muestra que el ensayo de­ tecta como negativa sea realmente negativa. En términos matemáticos, se pueden escribir como positivos en el ensayo

C(+) =

X

100

X

100

positivos en el ensayo + falsos positivos negativos en el ensayo

C(-) = negativos en el ensayo + falsos negativos

Para ver el impacto de la prevalencia (núme­ ro de individuos positivos por cada 100 indivi­ duos) sobre estos parámetros, veamos dos si­ tuaciones teóricas donde los ID(-t-) e ID(--) son del 90% y la prevalencia es del 2% en un caso y del 30% en el otro. En el primer caso, una prevalencia del 2% significa que de cada 1000 m.uestras, 20 son positivas. Sin embargo, con unos ID del 90%, el ensayo sólo detecta a 18 como positivas (2 son falsos negativos) y a 882 como negativas (98 son falsos positivos). De todos los positivos detectados con el ensayo, sólo 18 son realmente positivos. Esto hace que la C(+) sea del 15,5%. Para las muestras nega­ tivas tenemos que de las 884 (882 + 2) detecta­ das como tales, sólo 882 lo son realmente, lo que hace que la C(-) sea del 99,8%. Para el ca­ so de una prevalencia del 30% la C(-i-) aumenta enormemente a 79,4%, mientras que la C(-) cae levemente a 95,5%. El valor de corte del sistema debe ser tal que minimicé los resultados falsos, ya sean positi­ vos o negativos. En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad de sueros positivos (los de bajo tí­ tulo) y negativos, en donde no puede estable­ cerse con certeza si una muestra que cae en esa zona de la distribución es positiva o negativa (fig. 38-12). En estos casos se elegirá un valor

ELISA

de corte de manera tal de tener más falsos posi­ tivos o falsos negativos, según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves. Si se analiza un gran número de muestras, se puede establecer el valor de corte como la reac­ tividad media de los sueros negativos -i- 2 o 3 DS. Si paralelamente se analiza la reactividad de una muestra positiva standard y/o una mues­ tra negativa standard, será posible expresar el valor de corte como un porcentaje de la reacti­ vidad de estas muestras standard. De este mo­ do, en ensayos subsiguientes se podrá calcular el valor de corte analizando únicamente la reactividad de estas muestras patrones y multi­ plicando por un factor obtenido aplicando la si­ guiente fórmula:

ve = VCn

A,

X■ Ao

donde VC es el valor de corte para el día que se realiza el ensayo, VCq es el valor de corte calculado el día que se analizó un gran número de muestras negativas, A^ es la absorbancia del standard el día que se realiza el ensayo y Ag es la absorbancia del estándar el día que se calcu­ ló el valor de corte por análisis de la reactivi­ dad de un gran número de muestras negativas. La relación VCo/A,, es el factor que habitual­ mente proveen los fabricantes de reactivos co­ merciales de ELISA para el cálculo del valor de corte. Este método de cálculo del valor de corte permitirá ahorrar tiempo y dinero, además de evitar las variaciones interensayo en los ELI­ SA. Distintas modalidades del ELISA Se han desarrollado distintas modalidades del ELISA. Entre ellas, las más importantes son las siguientes: 1. TERELISA. 2. GEDELISA. 3. DIG-ELISA. 1. TERELISA El TERELISA consiste en un ELISA con­ vencional realizado en placas de Terasaki, pla­ cas habitualmente usadas para la tipificación de alelos del complejo mayor de histocompatibili­ dad por microcitotoxicidad en placa y que son más pequeñas que las placas de plástico diseña­ das para ELISA. La ventaja que presenta este sistema por sobre los ELISA descritos en pá­ rrafos anteriores es que requiere volúmenes

815

muy pequeños de los distintos inmunorreactan­ tes. En general, en el TERELISA se emplean volúmenes del orden de los 10 |al por pocilio, a diferencia de los ELISA convencionales, donde se emplea entre 50 y 200 |J,I por pocilio. Sin embargo, este sistema presenta la desventaja de que no se han diseñado espectrofotómetros (lectores de policubetas) aptos para leer la ab­ sorbancia en estas placas, por lo que la lectura debe realizai'se a simple vista. Esto ha dificul­ tado la difusión y empleo masivo de este tipo se sistemas. 2. GEDELISA El GEDELISA es otra modalidad del ELISA donde en una primera etapa se realiza una sepa­ ración de una mezcla antigénica por electrofo­ resis en geles de pohacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). A conti­ nuación se eluye el antígeno o los antígenos de interés, para lo cual el gel se corta en tiras de unos pocos milímetros de espesor, las que se incuban con solución fisiológica durante tmo o dos días a 4°C. Este procedimiento tiene por objeto permitir la solubilización de los antíge­ nos en la solución fisiológica. Seguidamente, estos antígenos se emplean para la sensibiliza­ ción de placas de poliestireno y se prosigue con el ELISA tal cual se describió en páiTafos ante­ riores. Este sistema permite detectar Ac contra determinados componentes de una mezcla anti­ génica compleja separada por SDS-PAGE. Sin embargo, la presencia del SDS provoca la des­ naturalización de los antígenos separados, de modo que no se podrán evidenciar Ac contra algunos epitopes que se vieron afectados por el tratamiento con SDS. Además, el remanente del detergente que queda en la solución del an­ tígeno extraído del gel es capaz de interferir en la etapa de sensibilización de la fase sólida (véase “Inmovilización de inmunorreactantes en fase sólida”). 3. DIG-ELISA En el DIG-ELISA (“diffusion-in-gel enzyme-linked immunosorbent assay”) se realiza una cuantificación de anticuerpos específicos mediante la medición de su habilidad de formar un gradiente de difusión sobre una superficie de poliestireno sensibilizada con el antígeno respectivo. La reacción Ag-Ac se visualiza en una etapa posterior por empleo de un conjuga­ do enzimático anti-inmunoglobulinas especieespecífico. En el DIG-ELISA se sensibiliza una placa de Petri cón el antígeno en estudio. Luego de lavar

816

Metodologías

DO

a n a d « M l^iw níeiito

-

'

4

log dii Fig. 38-10. C álculo del título de un .suero por com p ara­ ción con un suero p atrón . Si se dispone de un suero pa­ trón (curva azul) será posible calcular el título de un suero problem a (curva roja) en unidades arbitran'as/m l por com ­ paración de las curvas de titulación de am bos sueros.

e] exceso de antígeno no unido, se cubre la pla­ ca con una capa de agar, en la que se practican orificios a modo de pocilios. En estos pocilios se siembra la solución con el anticuerpo, se de­ ja difundir, se elimina el agar y se cubre toda la placa con el conjugado enzimático. Luego de esta incubación, se lava el exceso de conjugado y se cubre la placa con agarosa que contiene la solución de sustrato. AI cabo de cierto tiempo se desarrollará el color producido por la activi­ dad enzimática unida a la placa. El diámetro de los halos de color formados será proporcional al logaritmo de la concentración de anticuerpo que había en la muestra. El DIG-ELISA presenta la ventaja de que no se requiere de un lector de policubetas para una cuantificación de la reacción antígeno-anticuerpo, ya que se mide la velocidad de difusión de estos anticuerpos en el agar. Sin embargo, la complejidad operacional de estos sistemas conspira contra su implementación en la deter­ minación de anticuei*pos específicos en el labo­ ratorio de serología diagnóstica. Fwaieiwa

^ ^ o p o s ttv o

A is o fte w a

Fig. 38-11. G ráfico de frecuencia en función del intervalo de absorbancias de sueros negativos. Se m uestra la curva de distribución y el sesgo positivo (rosa) caracterís­ tico de la distribución de absorbancias de sueros negativos y la curva de di.stribución norm al (verde) que se obtendría si los sueros negativos .siguieran dicha distribución.

Fig. 38-12. G ráfico de frecuencia en función d el interva­ lo de ab so rb a n cia s de sueros n eg a tiv o s y positivo.s. Se puede observar que hay un solapam ieiito de las distribucio­ nes de sueros positivos (rojo) y negativos (azul), lo que p ro ­ voca una incertidum bre en la clasificación d e un suero co­ m o positivo o negativo si su absorbancia cae en la zona de solapanriento.

Dot-blot El Dot-blot es un método inmunoenzimático en el que se inmoviliza un inmunorreactante en una fase sólida compuesta por vm papel. Exis­ ten varios tipos de papeles empleados en este tipo de reacciones. Todos ellos presentan la atractividad de que sirven para inmovilizar cantidades muy pequeiias de inmunorreactante. Muchas de las consideraciones que se comen­ taron para ELISA son válidas para el Dot-blot. El Dot-blot es una técnica ampliamente em­ pleada para realizar el análisis de sobrenadantes de cultivo de hibridomas (“screening”) o para analizar la reactividad de un suero o anti­ cuerpo purificado contra un panel de antígenos diferentes. Mediante el empleo de distintos tipos de pa­ peles es posible inmovilizar proteínas, ácidos nucleicos, membranas celulares, fracciones y organoides subcelulares y hasta células enteras. En los próximos párrafos se harán algunos co­ mentarios acerca de la inmovilización de pro­ teínas en papel. El papel de filtro activado con bromuro de cianógeno ha sido ampliamente empleado para la- unión covalente de proteínas a la fase sólida. Este tipo de sistemas es muy usado para la in­ movilización de alérgenos con el objeto de de­ tectar la presencia de anticuerpos específicos en sueros de pacientes alérgicos atópicos. Sin embargo, el papel más ampliamente em­ pleado para la inmovilización de proteínas es la nitrocelulosa. La unión es no covalente y la in­ teracción hidrofóbica parece ser la que gobier­ na el proceso de interacción proteína-nitrocelulosa. Esto hace que la presencia de detergentes en la solución de proteína interfiera el proceso de unión. A pesar de esto, es posible inmovili­

ELISA

zar antígenos proteicos en solución de deter­ gentes, particularmente no-iónicos (tales como Tritón X-100, Tween 80) y a una concentra­ ción inferior al 0,01%. Una ventaja que presenta la inmovilización de proteínas en nitrocelulosa es que la unión es cuantitativa hasta cubrir la capacidad de satura­ ción del papel. Las proteínas inmovilizadas pueden revelarse por tinción directa con colo­ rantes tales como el negro amido, el azul de Coomassie o el Ponceau-S. Sin embargo, en la reacción de Dot-blot se realizan incubaciones con anticuerpos específi­ cos y el sistema se revela mediante el empleo de un conjugado enzimático. Antes de efectuar la incubación con cualquier anticuerpo es nece­ sario bloquear los sitios de unión a la nitrocelu­ losa libres. Para ello se emplean soluciones ta­ les como las empleadas en ensayos de ELISA. El bloqueo puede realizarse con leche descre­ m ada al 0,5% d ilu id a en PBS o en N aCl 0,15M, TrisHCl 0,05M, pH 7,4 (TBS), durante 30 minutos a 37“C. Los anticuerpos (sueros, sobrenadantes de cultivo de hibridomas, líqui­ dos ascíticos de anticuerpos monoclonales o anticuerpos purificados) y el conjugado enzi­ mático se diluyen en soluciones proteicas, sien­ do la más empleada la solución de leche des­ cremada al 0,5% en PBS o TBS. Los lavados se realizan con PBS o TBS y en general se evi­ ta el empleo de detergentes en estas soluciones con el objeto de evitar el despegado del Ag in­ movilizado en la nitrocelulosa. En caso de em­ plearse un conjugado enzimático de peroxidasa es necesario utilizar diluyentes y soluciones de lavado a base de TBS, ya que el fosfato del PBS interfiere en la etapa del revelado. Los sustratos que se emplean en Dot-blot, a diferencia de los empleados en ELISA, generan un producto insoluble que se deposita sobre la nitrocelulosa en los sitios donde se localiza la actividad enzimática. Para el caso de la peroxi­ dasa, los sustratos pueden ser el 4-cloro-l-naftol o la diaminobencidina. El primero genera un producto azul oscuro que tiene un muy buen contraste para casos en los que sea necesario fotografiar el Dot-blot. La diaminobencidina, por su parte, genera un producto marrón que no tiene un contraste tan elevado para fotografía pero que tiene una detectabilidad superior al 4-cloro-l-naftol. Para el caso del empleo de conjugados enzimáticos a base de fosfatasa se emplea como sustrato una mezcla de 4-nitrobluetetrazolium (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3indolilfosfato (BCIP), que generan un producto insoluble azul oscuro. La actividad enzimática se detiene por lava­ do de la nitrocelulosa con agua destilada. Una vez lavada, es posible secar la nitrocelulosa al aire y guardarla entre papeles de filtro durante

817

mucho tiempo sin que se altere la visualización de los resultados. A diferencia del ELISA, la lectura del Dotblot es visual y por lo tanto no sirve para reah­ zar cuantificaciones. Sin embargo, se pueden realizar lecturas densitométricas (se requiere de densitómetros de reflexión) de la membrana de nitrocelulosa revelada y, si cada punto (dot) tie­ ne la misma área, tomar la altura de los puntos como medida de la reactividad del anticuerpo. Parte experimental 1. Cálculo de la capacidad de saturación de placas de ELISA p o r el método de la peroxidasa

Sensibilizar placas de ELISA con 100 )J,1 de di­ luciones seriadas de una solución de OVA u otro antígeno, desde 0,1 )0 .g/ml h asta 10 |ig/ml, diluida en un “buffer” carbonato-bicarbonato lOOmM pH ==9,2-9,4. Incubar durante 18 horas a 4°C. Lavar 3 veces con PBS. Incubar 3 horas a 37“C con 100 p,l/pocillo de una solución de peroxidasa de 100 jig • m l'\ Lavar 3 veces con PBS suplementado con 0,05% de Tween 20 (PBS-T). Incubar con 100 }.il/pocillo de una solución de o-fenilendiamina de 1 mg/ml en un “buffer” de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^O^ al 30% (1 ¡il • m i'), durante 30 minutos en la oscuridad. Detener la reacción por agregado de 25 jj.1 de H,SO^ 4N a cada pocilio. Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector de policubetas. Graficar la densidad óptica en función del loga­ ritmo de la inversa de la concentración de OVA y calcular la concentración necesaria para saturar la placa. 2. Marcación de anticuerpos con peroxidasa

Dialisar una solución del anticuerpo a marcar (aproximadamente 5 mg/ml) contra “buffer” de carbonato-bicarbonato sódico lOOmM pH = 9,2 durante 18 horas a 4“C. Disolver 2,5 mg de peroxidasa (de buena cali­ dad) en 0,25 mi de NaHCOj lOOmM en un tubo de vidrio. Agregar 0,25 mi de NalO^ (p.a.) 12mM. Incubar 2 horas a temperatura ambiente en os­ curidad. Mezclar la solución del anticuerpo dialisado con la peroxidasa y agregar una sexta parte (peso/volymen) de Sephadex G-25 seco con el objeto de reducir el volumen de reacción a la mitad.

818

Metodologías

Incubar 3 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregar 1/20 en volumen de una solución re­ cién preparada de NaBH^ (5 mg • mh' en NaOH 0,lmM). Incubar 30 minutos a 4°C. Agregar 1/10 en volumen de la solución de NaBH,. Incubar 1 hora a 4°C. Separación de la peroxidasa libre y del Ac no conjugado: Precipitar con (NH^) SO^ al 50% de saturación (precipitan la IgG ubre y la IgG conjugada a peroxidasa). Incubar 1 hora y centrifugar durante 15 minu­ tos a ó.OOOxg. Desechar el sobrenadante. Lavar el precipitado con (NH^j^SO^ al 50% de saturación. Desechar el sobrenadante. Equilibrar el sedimento con una solución de fosfatos 0,1M, NaCl 0,1M, pH = 7,2 o con un “buffer” de acetato sódico O,IM, NaCl IM, CaCl^ ImM, MgCl^ ImM, MnCl^ ImM, pH = 6 por diálisis o por pasaje por una columna de Sephadex G-25. Realizar una cromatografía de afinidad con Sepharosa-Concanavalina A, con lo que la IgG libre eluye con el frente y se retiene el conjugado. Monitorear el proceso por lectura de la absorbancia a 280nm. Eluir la columna con una solución de a-metil • manósido 10 a lOOmM en fosfatos 0,1M, NaCl 0,1M, pH = 7,2 o en acetato sódico 0,1M, NaCl IM, CaCL ImM, MgCL ImM, MnCl^ ImM, pH = 6. Agregar un volumen de glicerina neutralizada y guardar en congeladora de -18‘’C. Titular por ELISA frente al antígeno específico para comprobar la actividad del conjugado. 3. ELISA de amplificación (indirecto) para la titulación de sueros

Se describe un ELISA para la titulación de an­ ticuerpos anti-ovoalbúmina (OVA) en sueros de conejos inmunizados con OVA. Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de una solución de OVA de 1 |xg/ml (100 ng de OVA/fosa), diluida en un “buffer” carbonatobicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4. Incubar durante 18 horas a 4°C. Lavar 3 veces con PBS suplem entado con Tween 20 al 0,05% (PBS-T). Bloquear la placa por incubación con 250 ¡al/fosa de una solución de leche descremada al 3% preparada en solución fisiológica tam­ ponada (PBS) durante Ihora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Realizar diluciones seriadas en razón 2 del sue­ ro de conejo anti-OVA a analizar, en un volu­ men de 100 |J,l/fosa. Utihzar como diluyente

una solución de leche descremada al 1% en PBS-T. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |j,l/fosa de la dilución apropia­ da del conjugado anti— globuhnas de conejo marcado con peroxidasa, diluido en una solu­ ción de leche descremada al 1% en PBS-T, durante 1 hora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |il/fosa de una solución de ofenilendiamina de Img/ml en un “buffer” de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^Oj al 30% (l|il/ml), durante 30 minutos en la os­ curidad. Detener la reacción por agregado de 25 )ll de HjSO^ 4N a cada pocilio. Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector de policubetas. Graficar la densidad óptica en función del loga­ ritmo de la inversa de la dilución de suero de conejo analizado y calcular el título. 4. ELISA de captura

Sensibilizar placas de poliestireno de alta capa­ cidad de unión con el anticuerpo de captura purificado, durante 18 horas a 4°C a razón de 2|ag por pocilio (50|i,l/pocillo), diluido en PBS. Lavar 3 veces con PBS-T. Bloquear la placa por incubación con 200|al/fosa de una solución de leche descremada al 3% en PBS durante 1 hora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Capturar el antígeno específico a partir de la fracción antigénica diluida en leche descre­ mada al 1% en PBS, por incubación durante 1 hora a 37°C a razón de 50 |i/fosa. Dejar un grupo de pocilios sin antígeno capturado co­ mo control del ensayo. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar durante 30 minutos a temperatura am­ biente y a razón de 50 ¡il/ fosa con una dilu­ ción apropiada (por ejemplo, 1/500) de los sueros a analizar. Diluir los sueros en leche descremada al 1% en PBS. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar durante 30 minutos a temperatura am­ biente y a razón de 50 \iV fosa con una dilu­ ción apropiada de anticuerpos anti-inmunoglobulinas e.specie-específicos marcados con peroxidasa, diluidos en leche descremada al 1% en PBS. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 50 |il/fosa de una solución de o-fenilendiamina de 1mg/ml en un “buffer” de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^O^ al 30% (1 )il/ml), durante 30 minutos en la oscuridad.

ELISA

Detener la reacción por agregado de 25 |xl de HjSO^ 4N a cada pocilio. Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector de policubetas. Graficar la diferencia entre la absorbancia pro­ ducida por cada suero en la fosa con Ag y la absorbancia producida por el mismo suero en la fosa sin Ag. 5. ELISA de modulación de actividad para la cuantificación de antígeno Se describe un ELISA para la cuantificación de ovoalbúmina (OVA) en diversas muestras. Sensibilizar placas de ELISA con 100 jil de una solución de OVA de 1 |ig • ml ■(100 ng de OVA/fosa), diluida en un “buffer” carbo­ nato-bicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4. Incubar durante 18 horas a 4°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Bloquear la placa por incubación con 250 |il/fosa de una solución de leche descremada al 3% en PBS durante Ihora a 37"C. Lavar 3 veces con PBS-T. En un volumen de 50 |xl/fosa, realizar dilucio­ nes seriadas en razón 2 de una solución pa­ trón de concentración conocida de OVA, par­ tiendo de una concentración de 10 |ig ■m f . Utilizar como diluyente una solución de leche descremada al 1% en PBS-T. Paralelamente, realizar otra serie de diluciones de la/s muestra/s problema. Dejar una fosa sin OVA solu­ ble ni muestra, que corresponderá al 0% de inhibición. Agregar a cada fosa 50 )il del doble de la dilu­ ción del suero de conejo anti-OVA que pro­ dujo una absorbancia igual al 90% de la ab­ sorbancia máxima producida por ese suero, diluido en leche descremada al 1% en PBS. Incubar 1 hora a 37°C, Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |J,l/fosa de la dilución apropia­ da del conjugado anti-y-globulinas de conejo mai'cado con peroxidasa, diluido en una solu­ ción de leche descremada al 1% en PBS-T, durante 1 hora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |J,l/fosa de una solución de ofenilendi amina de Img • ml * en un “buffer” de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^Oj al 30% (1 }il • m l'), durante 30 minutos en la oscuridad. Detener la reacción por agregado de 25|J,1 de HjSO,^ 4N a cada pocilio. Leer la densidad óptica a 490nm en un lector de policubetas. Calcular el porcentaje de inhibición producido por cada dosis de OVA soluble, tomando como 0% de inhibición la absorbancia obtenida en la fosa incubada sin inhibidor (OVA soluble).

819

Graficar dicho porcentaje en función del loga­ ritmo de la concentración de OVA de la solu­ ción patrón. Por interpolación del porcentaje de inhibición producido por una muestra pro­ blema se podrá calcular la concentración de OVA en la misma. 6. Análisis de la distribución de reactividad de sueros normales y cálculo del valor de corte

Se describe un ELISA de amplificación para el análisis de la distribución de reactividades de sueros humanos normales a dilución simple y cálculo del valor de corte del sistema frente a un sobrenadante de 45.000xg de epimastigotes de Trypanosoma cruzi lisados (fracción F45). Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de la fracción F45, a razón de 10 ¡ag • m f, diluida en un “buffer” carbonato-bicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4. Incubar durante 18 horas a 4°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Bloquear la placa por incubación con 250|al/fosa de una solución de leche descremada al 3% preparada en solución fisiológica tamponada (PBS) durante 1 hora a 37C. Lavar 3 veces con PBS suplem entado con Tween 20 al 0,05% (PBS-T). Realizar diluciones (1/500 o 1/1000) de al me­ nos 30 sueros humanos normales y al menos un suero de paciente chagásico (control posi­ tivo). Utilizar como diluyente una solución de leche descremada al 1% en PBS-T. En cada fosa debe quedar un volumen de 100 | i l . Incubar 1 hora a 37°C. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |al/fosa de la dilución apropia­ da del conjugado anti-y-globulinas humanas marcado con peroxidasa, diluido en una solu­ ción de leche descremada al 1% en PBS-T, durante 1 hora a 37“C. Lavar 3 veces con PBS-T. Incubar con 100 |il/fosa de una solución de ofenilendiamina de 1 mg • m f en un “buffer” de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y HjOj al 30% (1 |al • m f ), durante 30 minutos en la oscuridad. Detener la reacción por agregado de 25 |J,1 de HjSO^ 4N a cada pocilio. Leer la densidad óptica a 490nm en un lector de policubetas. Agrupar las absorbancias de los sueros en in­ tervalos de densidad óptica y graficar la fre­ cuencia de cada intervalo en función del in­ tervalo. Paralelamente calcular la absorbancia media (m) de los sueros negativos y el desvío están­ dar (a^ |). Con estos parámetros calcular el va­ lor de corte del sistema como m + 2 o 3 ,.

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Metodologías

BIBLIOGRAFÍA B u tler J.E. 1981. T he am phfied ELISA : principies o f and aplications for the com parative quantitation o f class and subclass antibodies and the distribution o f antíbodies and a n tig e n s in b io c h e m ic a l s e p a ra te s . IMeth. E n z y m o l. 73:482-523. B u tler J.E., Ni L., N essler R., Joshi K .S., Suter M ., Rosenberg B ., C hang J., Brow n W .R. and Cantarero L.A. 1992. T h e physical and functional behaviour o f capture antibo­ d ie s ad so rbed on po ly e sty ren e. J. Im m unol. M ethods, 150:77-90. C an tarero L.A ., B utler J.E. and O sborne J.W . 1980. T he a d so rp tiv e c h a ra cte ristic s o f p ro te in s fo r p o ly e sty ren e an d th e ir s ig n ific a n c e in so lid -p h a se im m u n o a ssa y s. A nalytical C hem istry, 105:375-382. Elw ing H., Lange S. and N ygrcn H. 1980. D iffusion-in-gel enzym e-linked im m unosorbent assay (D IG -E LISA ): optim al conditíons for quantitation o f antibodies. J. Im m uriol. M eth. 39:247-256. K em eny D .M . 1992. T itration o f antibodies. J. Im m unol. M ethods, 150:57-76, K en n y G .E. and D u n sm o o r C .I.. 1983. P rin c ip ie s, problem s, and strategies in the use o f antigenic m ixtures for th e enzym e-linked im m unosorbent assay. J. Clin. M icrobiol., 17:655-665. L u tz H ., B ruggm ann S., C orboz L., M üller R., Lim acher W ., W eber H „ W issler K. and Theilen G.H. 1981. Combination o f polycrylam ide gel electrophoresis w ith enzyine-linked im m unosorbent assay: a sim ple m ethod for determ ination o f antibody specificity and detection o f anti­ gens in com plex m ixtures. Vet. Im m unol. Im m nnopathol. 2:425-440.

Lutz H., H iggins J., P edersen N.C. and Theilen G.H. 1979. The dem onstration o f antibody specificity by a new technique. T h e gel electro p h o re sis-d e riv ed en z y m e-lin k ed im m unosorbent assay (G ED ELISA ) and its application to antibodies specific for Eeiine Leukem ia V irus. J. H istochem. Cytocheni. 27(8): 1216-1218. M alvano R., B oniolo A., D ovis B. and Zannino M. 1982. ELISA for antibody m easurem ent: aspects related to data exprcssion. J. Im m unol. M eth. 48:51-60. N ieto A., G ayá A., Jansa M ., M oreno C. and V ives J. 1984. D irect m easurem ent o f antibody affinity distribution by hapten-inhibition enzym e im m unoassay. M ol. Im m unol. 21(6):537-543. N ieto A ., G ayá A., M oreno C., Jansá M. and Vives J. 1986. A dsorption-desorption o f antigen to polyestyrene plates used in EL ISA . Ann. Inst. P asteu r Inim unol., 137:161172. N ieto A ., G ayá A., M oreno C. y Vives J. 1984. N uevo m é­ todo para determ inar la adsorción de proteínas a las p la­ cas de p o lie s tire n o u s a d a s en E L IS A . I n m u n o lo g ía , 3(l):25-28. P ateraki E., G uesdon J.I.., Serie C. and A vram eas S. 198 L TERELISA : T he ELISA test perform ed in Terasaki p la ­ tes. J. Im m unol. M eth. 46:361-368. Pesce A. and M ichael J.G. 1992. Artifacts and limitations of enzyme im munoassay. J. Immunol. M ethods, 150:111-119. Portsm ann T. and K iessig S.T. 1992. Enzym e-im m unoassay te c h n iq u e s. A n o v erv iew . J. Im m u n o l. M eth o d s, 150:5-21. Tijssen P. 1988. Practice and theory o f enzym e im m unoas­ says. tm : Laboratory techniques in biochem istry and m o­ lecular biology. Vol. 15. Eds. B urdon R.H. and K nippenberg P.H. Elsevier, A m sterdam , T he N etherlands.

Inmunoanálisis radiométrícos

EDGARDO POSKUS

INTRODUCCIÓN Los inmunoanálisis radiométricos compren­ den un conjunto de técnicas en las cuales las moléculas implicadas como reactivos inmunoquímicos se hallan marcadas radiactivamente. Como guía general puede considerarse que la determinación de los antígenos se efectúa con anticuerpos específicos como reactivos y que, inversamente, la detección de anticuerpos espe­ cíficos se realiza con los correspondientes antí­ genos. También como modelo general puede decirse que los reactivos de esos sistemas ana­ líticos son los que están marcados con un radionucleido, aunque como se verá principal­ mente en el radioinmunoanálisis, las técnicas basadas en reacciones de competencia pueden diseñarse de modo que se marca el mismo tipo de molécula (se emplea, por ejemplo, antígeno puro marcado para medir el antígeno frío que se haha en muestras desconocidas y luego ara­ bos interactúan con los anticuerpos específi­ cos). En la inmunología moderna, tras unas cuatro décadas de aplicación de estos recursos analíti­ cos, se ha verificado una fuerte competencia metodológica. Los principios inmunoenzimáticos y los análisis basados en quimioluminiscencia han disputado últimamente el campo de aplicación con el radioinmunoensayo y sus su­ cedáneos. Hoy en día la elección de un método de análisis aplicado a la inmunología, o valién­ dose de recursos que ella brinda, es un tema complejo. Existen muchos factores que deciden esa elección: los económicos, los de seguridad operativa, los de accesibiUdad, etc. Pero, si se sopesan también las cuestiones referidas a re­ producibilidad, exactitud y sensibilidad, debe admitirse que no existen métodos ideales y sus-

39 titutivos de los otros. En ese contexto las radio­ metrías han cedido posiciones, aunque conser­ van un número de especificaciones de uso que, en ciertos casos, las torna como la mejor op­ ción disponible. Dado que el radioinmunoensayo, o radioin­ munoanálisis, es la técnica radiométrica proto­ tipo y la que efectuó el mayor impacto históri­ co relativo, comenzaremos a partir de ella la descripción de los métodos radiométricos de base inmunológica. RADIOINMUNOENSAYO El desarrollo del radioinmunoensayo {radioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de forma un tanto desapercibida, con los trabajos de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la insulina. Esos autores hallaron que la cantidad de insulina marcada con átomos de iodo radiac­ tivo que se unía a una fracción de globulinas de individuos diabéticos (luego reconocida como anticuerpos), se relacionaba con la concentra­ ción de insulina fría existente. Tal observación constituyó la base de la detección de esa hor­ mona plasmática y del posterior desarrollo de todos los métodos radioinmunológicos de satu­ ración y desplazamiento. A partir de las prime­ ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri­ bieron explícitamente la determinación de insu­ lina plasmática sin previa extracción, resultó ampliamente reconocido que el RIA era un m é ­ todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan la alta sensibilidad, su comparativa sencillez respecto de los métodos biológicos usados en endocrinología, y su versatilidad para aplicarlo a muestras de pequeños volúmenes y en gran­ des series. Esas propiedades lo convierten en

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Metodologías

BIBLIOGRAFÍA B u tler J.E. 198 L T he am plified ELISA : principies o f and aplications for the com parative quantitation o f class and subclass antibodies and the distribution o f antibodies and a n tig e n s in b io c h e m ic a i s e p a ra te s . IMeth. E n z y m o l. 73:482-523. B u tler J.E., Ni L., N essler R., Joshi K .S., Suter IVl., Rosenberg B ., C hang J., Brow n W .R. and Cantarero L.A. 1992. T h e physical and functional behaviour o f capture antibo­ d ie s ad so rbed on po ly e sty ren e. J. Im m unol. M ethods, 150:77-90. C an tarero L.A ., B utler J.E. and O sborne J.W . 1980. T he a d so rp tiv e c h a ra cte ristic s o f p ro te in s fo r p o ly e sty ren e an d th e ir s ig n ific a n c e in so lid -p h a se im m u n o a ssa y s. A nalytical C hem istry, 105:375-382. Elw ing H., Lange S. and N ygren H. 1980. D iffusion-in-gel enzym e-linked im m unosorbent assay (D IG -E LISA ): optim al conditions for quantitation o f antibodies. I. Im m utiol. M eth. 39:247-256. K em eny D .M . 1992. T itration o f antibodies. J. Im m unol. M ethods, 150:57-76, K en n y G .E. and D u n sm o o r C .L . 1983, P rin c ip ie s, problem s, and strategies in the use o f antigenic m ixtures for th e enzym e-linked im m unosorbent assay, J, Clin, M icrobiol,, 17:655-665, L u tz H ,, B ruggm ann S,, C orboz L,, M üller R,, Lim acher W „ W eber H „ W issler K, and Theilen G,H, 1981, Combination o f polycrylam ide gel electrophoresis w ith enzyine-linked im m unosorbent assay: a sim ple m ethod for determ ination o f antibody specificity and detection o f anti­ gens in com plex m ixtures, Vet, Im m unol, Im m unopathol, 2:425-440,

Lutz H,, H iggins J,, P edersen N,C, and Theilen G,H, 1979, The dem onstration o f antibody specificity by a new technique, T h e gel electro p h o re sis-d e riv ed en z y m e-lin k ed im m unosorbent assay (G ED ELISA ) and its application to antibodies specific for Eeline Leukem ia V irus, I, H istochem, Cytochera, 27(8): 1216-1218, M alvano R,, B oniolo A,, D ovis B, and Zannino M, 1982, ELISA for antibody m easurem ent: aspects related to data expression. ,1, Im m unol, M eth, 48:51-60, N ieto A,, G ayá A,, la n sa M ,, M oreno C, and V ives J, 1984, D irect m easurem ent o f antibody affinity distribution by hapten-inhibition enzym e im m unoassay. M ol, Im m unol, 21(6):537-543, N ieto A ,, G ayá A,, M oreno C,, la n sá M, and Vives I, 1986, A dsorption-desorption o f antigen to polyestyrene plates used in EL ISA , Ann, Inst, P asteu r Im m unol,, 137:161172, N ieto A ,, G ayá A,, M oreno C, y Vives I, 1984, N uevo m é­ todo para determ inar la adsorción de proteínas a las p la­ cas de p o iie s tire n o u s a d a s en E L IS A , I n m u n o lo g ía , 3(l):25-28, P ateraki E,, G uesdon I,L ,, Serie C, and A vram eas S, 1981, TERELISA : T he ELISA test perform ed in Terasaki p la ­ tes, I, Im m unol, M eth, 46:361-368, Pesce A, and M ichael J,G, 1992, Artifacts and limitations of enzyme im munoassay. I, Immunol, M ethods, 150:111-119, Portsm ann T, and K iessig S,T, 1992, Enzym e-im m unoassay te c h n iq u e s, A n o v erv iew . I, Im m u n o l, M eth o d s, 150:5-21, Tijssen P, 1988, Practica and theory o f enzym e im m unoas­ says, Em: Laboratory techniques in biochem istry and m o­ lecular biology, Vol, 15, Eds, B urdon R,H, and K nippenberg P,H, Elsevier, A m sterdam , T he N etherlands,

Inmunoanálisis radiométrícos

EDGARDO POSKUS

INTRODUCCIÓN Los inmunoanálisis radiométrícos compren­ den un conjunto de técnicas en las cuales las moléculas implicadas como reactivos inmunoquímicos se hallan marcadas radiactivamente. Como guía general puede considerarse que la determinación de los antígenos se efectúa con anticuerpos específicos como reactivos y que, inversamente, la detección de anticuerpos espe­ cíficos se realiza con los correspondientes antí­ genos. También como modelo general puede decirse que los reactivos de esos sistemas ana­ líticos son los que están marcados con un radionucleido, aunque como se verá principal­ mente en el radioinmunoanálisis, las técnicas basadas en reacciones de competencia pueden diseñarse de modo que se marca el mismo tipo de molécula (se emplea, por ejemplo, antígeno puro marcado para medir el antígeno frío que se haUa en muestras desconocidas y luego ara­ bos interactúan con los anticuerpos específi­ cos). En la inmunología moderna, tras unas cuatro décadas de aplicación de estos recursos analíti­ cos, se ha verificado una fuerte competencia metodológica. Los principios inmunoenzimáti­ cos y los análisis basados en quimioluminis­ cencia han disputado últimamente el campo de aplicación con el radioinmunoensayo y sus su­ cedáneos, Hoy en día la elección de un método de análisis aplicado a la inmunología, o valién­ dose de recursos que ella brinda, es un tema complejo. Existen muchos factores que deciden esa elección: los económicos, los de seguridad operativa, los de accesibilidad, etc, Pero, si se sopesan también las cuestiones referidas a reproducibilidad, exactitud y sensibilidad, debe admitirse que no existen métodos ideales y sus-

39 titutivos de los otros. En ese contexto las radio­ metrías han cedido posiciones, aunque conser­ van un número de especificaciones de uso que, en ciertos casos, las torna como la mejor op­ ción disponible. Dado que el radioinmunoensayo, o radioin­ munoanálisis, es la técnica radiométrica proto­ tipo y la que efectuó el mayor impacto históri­ co relativo, comenzaremos a partir de ella la descripción de los métodos radiométrícos de base inmunológica. RADIOINMUNOENSAYO El desarrollo del radioinmunoensayo {radioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de forma un tanto desapercibida, con los trabajos de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la insulina. Esos autores hallaron que la cantidad de insulina marcada con átomos de iodo radiac­ tivo que se unía a una fracción de globulinas de individuos diabéticos (luego reconocida como anticuerpos), se relacionaba con la concentra­ ción de insulina fría existente. Tal observación constituyó la base de la detección de esa hor­ mona plasmática y del posterior desarrollo de todos los métodos radioinmunológicos de satu­ ración y desplazamiento. A partir de las prime­ ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri­ bieron explícitamente la determinación de insu­ lina plasmática sin previa extracción, resultó ampliamente reconocido que el RIA era un m é ­ todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan la alta sensibilidad, su comparativa sencillez respecto de los métodos biológicos usados en endocrinología, y su versatiUdad para aplicarlo a muestras de pequeños volúmenes y en gran­ des series. Esas propiedades lo convierten en

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Metodologías

uno de los métodos analíticos de base inmunológica de mayor importancia, con proyecciones en medicina, veterinaria y en áreas no médicas interesadas en la detección de muy bajas con­ centraciones de compuestos orgánicos. Las va­ riantes metodológicas acumuladas últimamente hacen que no exista un RIA en particular, sino un conjunto de procedimientos basados en un principio general que describiremos a continua­ ción.

SECUENCIA EXPERIMENTAL DEL RIA Una vez cubierta la etapa de los requeri­ mientos (obtención de antisueros, preparación de los trazadores, selección de los métodos se­ parativos, etc.) para la ejecución de un RÍA se efectúan dos ensayos fundamentales: 1) la titu­ lación del antísuero, y 2) el ensayo de despla­ zamiento o RIA propiamente dicho. Ensayo de titulación o curva de calibración

PRINCIPIO GENERAL La base del RIA consiste en la inhibición competitiva de la unión de un antígeno radiac­ tivo (trazador) a su anticuerpo específico por parte del antígeno no marcado. El sistema radioinmunológico descrito puede esquemati­ zarse como una interacción reversible combi­ nada; A g*

Ac-A g*

Ag

A c-A g

Ac

( 1)

donde Ac representa el anticuerpo específico; Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre; Ag es el antígeno libre no marcado de las solu­ ciones patrones o de las muestras desconoci­ das; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado, y Ac-Ag es e! complejo soluble con el antígeno no mar­ cado. El proceso obedece a la ley de acción de ma­ sas y, además la distribución del trazador den­ tro del antígeno total es indiscriminable por medio del anticuerpo de modo que, cuanto ma­ yor sea la cantidad de antígeno no marcado presente, menor será la cantidad de trazador que se une al anticuerpo. Bajo este principio se puede determinar la concentración del antígeno en muestras complejas de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y especificidad si se cumplen los siguientes requisitos: 1) el traza­ dor es altamente radiactivo y por lo tanto puede colocarse en concentraciones infinitesimales, pero cuantificables, y 2) el anticuerpo es alta­ mente específico, posee muy alta afinidad y se halla en muy baja concentración. La justifica­ ción teórica y el ajuste de las condiciones expe­ rimentales en relación a esos postulados se enuncian formalmente más adelante. Para efectuar las determinaciones que si­ guen, además de optimizar la calidad y la con­ centración de los componentes del sistema, es necesario aplicar algún método que permita se­ parar y medir el trazador libre y el trazador uni­ do. Todas esas operaciones se realizan según un diseño general cuya secuencia se da a conti­ nuación.

En esta etapa se efectúa un ajuste empírico de la concentración de los anticuerpos específi­ cos actuantes en el test. En la figura 39-1 se muestra un esquema del ensayo y la selección final de la dilución del antísuero para condicio­ nes especificadas. En este caso se utilizó polietílenglicol (PEG) como agente separativo del antígeno en sus formas libre, f* (del vocablo inglés universalmente adoptado, free) y unida, b* (de bound). El PEG al 12,5% de concentra­ ción final y en frío, precipita casi exclusiva­ mente las inmunoglobulinas, estén libres o uni­ das a antígenos. Otros sistemas y recursos se­ parativos también son aplicables según vere­ mos en la parte final de Requerimientos. Me­ diante la representación gráfica de alguna de las variables con que suele expresarse la res­ puesta (la más sencilla es la actívidad de los precipitados), en función de la dilución del an­ tisuero, puede seleccionarse un valor apropia­ do. Según se verá en la explicación teórica, puede optarse por aquella dilución que cause aproximadamente un 50% de unión del antíge­ no radiactivo (fig. 39-1). Ensayo de desplazamiento Este etapa consiste en la elaboración de una curva patrón, empleando una dilución fija del antisuero según se mencionó en la etapa de titu­ lación, frente a una serie de concentraciones co­ nocidas del antígeno frío. Obviamente el traza­ dor y los otros componentes y condiciones del sistema no se modifican respecto de la etapa de titulación. En la figura 39-2 se muestra el es­ quema general de un ensayo modelo. Luego del procesamiento de la información (cuadro 39-1) es factible calcular la concentración de mues­ tras desconocidas mediante la interpolación de las respuestas dentro de los mismos rangos. Una mejor visualización de lo mencionado antes se obtiene redefiniendo los componentes de los equilibrios presentados en (1) como sigue: A c-Ag*

A g*

(b*)

(f*) Ac (Q)

(2 ) Ag

(i)

^

A c-A g

(b)

Inmunoanálisis radiométricos TuboN®

R EACC IO N

1

2

X

y

823

z

T R A Z A D O R 0,1 ml (10“ cpm) D ILU Y E N TE 0,1 ml A N TIS U E R O 0,1 ml Dilución

IN C U BAC IÓ N

1/103

1/2x10^

-1/1 OV 1/103

CT

SU E R O C O N TR O L NO IN M U NE

4°C, 1-5 días 37“C, 2-18 horas

------T u bos N® 1 - Y -

SEPAR AC IÓ N

P olletilengllcol (PEG 6000) 1 5 % .................... 1,5 ml (4»C) A gitación C entrifugación sepa ra ción y conteo

SN

=Í>P 10

G R A FIC A C IÓ N b* (cpm X 1Cr^)

1/1Q3

1 / 10 “ 1/ 10 = 1/106

Dilución del antisuero ) Fig. 39-1. C urva de titulación del antisuero o de calibración para la selección de la dilución apropiada en los ensayos p o s ­ teriores del R IA (en el m odelo: 1/2,5 x 10^; expresada com o dilución final será tres veces m ayor). CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubación señaladas representan a l­ gunas de las variantes más usadás. El PEG actúa com o agente de separación pues precipita las inm unoglobulinas lib res y las unidas al antígeno. T am bién existen otros métodos separativos. La form a de la curva en el ám bito de las diluciones bajas y la unión incom pleta del trazador se deben a diversos facto res que no se analizarán aquí. L os ensayos esquem atizados suelen realizarse po r duplicado o triplicado.

donde Q representa el anticuerpo libre o, ixtás precisamente, el “sitio” ligante para un anti­ cuerpo considerado como univalente; f* repre­ senta el trazador libre; b* es el trazador unido al anticuerpo; f es el antígeno frío libre, y b es el antígeno frío unido. Luego la curva patrón o estándar que refleja la relación básica dosisrespuesta del RIA puede trazarse, por ejemplo, representando b* u otras formas derivadas, en función de la concentración de antígeno frío adicionado (cuadro 39-1 y fig. 39-3 A-D). En particular la relación b*/f* es muy utilizada y ventajosa. Ese cociente puede obtenerse direc­ tamente de las actividades (cuentas por minuto) determinadas para cada fase luego de separado el antígeno libre del unido. Pero, como además se parte del supuesto de que el anticuerpo no

distingue entre el antígeno genuino y el marca­ do, la distribución de antígeno frío libre y uni­ do también es la misma (b*/f* = b/f). Vemos, entonces, que en general el cociente definido por la concentración del antígeno total unido (B) y la correspondiente al antígeno total libre (FX resulta ponderado idealmente por este m e­ dio. Por ende, se puede prescindir, al confec­ cionar las escalas, de toda referencia a la po­ blación de m oléculas m arcadas. Esto es, b*/f* = B/F. En la práctica se han aplicado numerosas va­ riantes para la representación gráfica de las res­ puestas medidas y de ellas hap surgido diferen­ tes tipos de curvas patrones, incluso otras río presentes en 1a figura 39-3. La representación gráfica de cualquiera de esas variantes suele

824

Metodologías

REACCION

7

T ubo N=

8

9

10

TRAZADOR 0,1 mi (10“ cpm) ANTISUERO 0,1 mi (1/2,5 x lO^^) ANTÍGENO 0,1 mi conc. final (ng/0,3 mi)

INCUBACION

O

0,026

0,052

0,833

MD

CT

4“C, 1-5 días 37“C, 2-18 horas -Tubos Ns 1 - 9-

SEPARACIÓN

Polietilenglicol (PEG 6000) 1 5 % ...................1,5 mi (4“C) Agitación Centrifugación, separación y conteo

PROCESAMIENTO V éase cuadro 39-1

F ig . 39-2. E squem a del desarrollo experim ental de un RIA para insulina. La dilución del antisuero em pleado es la hallada p reviam ente en un ensayo de titulación (fig. 39-1). antígeno en gran exceso para control de la unión inespecífica. A veces suele incluirse en su lugar un control com o el del tubo “y” en la figura 39-1. M D: m uestra desconocida. CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubación son las m ism as escogidas para la titulación. Los ensayos esquem atizados suelen realizarse por duplicado o triplicado.

Cuadro 39-1. Valores correspondientes al RIA ni >delo para insulina desarrollado en la figura 39-2 E xpresiones de los datos

Tubo N"

1 2 3 4 5

6 7

8 9

10

D osis de antígeno (ng/0.3 mi)

0 0,026 0,052 0,104 0,208 0,417 0,833 oo MD CT

Respuesta b* (cpm)

Bo

1,00

1,00

0,15

0,90 0,80 0,60 0,40 0,30

0,82 0,67 0,43 0,25 0,18

0,10

0,20

0,11

0,03 0,35

0,06 0,70

0,03 0,54

5.000 (b *) 4.500 4.000 3.000

0,50 0,45 0,40 0,30

2.000

0,20

1.500

1.000 300 U N E 3.500 10.000 (T)

b^ : cuentas p ro m ed io d e d u p licad o s o trip lic ad o s un id o s a an ticu e rp o s. P o r re s u lta r p ro p o rcio n ales a las co n c en íra cio n es d ei an tíg en o un id o (B ) en las ex p resio n es re la tiv a s a p a rec e d ire c ta m e n te este sím bolo, an tíg en o en g ra n exceso. U N E : unión n o esp e cífica . E se v alo r tam b ién p u e d e su strae rse a todos los dato s d e b* antes d e e fectu a r los cálculos.

Inmunoanálisis radiométricos B T 0,5

B__ B

825

b* (cpm X 103)

0,4

0,3

0,2 0,1

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

F ig. 39-3. Curvas estándar obtenidas del R IA m odelo para insulina (datos en cuadro 39-1). La concentración de an tíg en o en la m uestra desconocida puede estim arse por interpolación según se indica en los gráficos. Las líneas cortadas p aralela s al eje de abscisas indican la unión no específica. A, B, C, D son distintas form as de expresión gráfica. N ótese que en C y D las dosis se representan en escala geom étrica, equivalente a una escala aritm ética de log [Ag]

dar resultados aceptables; sin embargo las cur­ vas hiperbólicas de los datos sin transforma­ ción previa (fig. 39-3 A y B) pueden generar di­ ficultades para interpolar con exactitud valores extremos de concentración del antígeno en muestras desconocidas. Si la variable indepen­ diente se grafica sobre el eje de abscisas como el log de la concentración, y la variable depen­ diente (en forma directa o en alguna de sus transformaciones) se representa linealmente en ordenadas, se obtienen curvas sigmoidales (fig. 39-3 C, D). Otros procedimientos de transformación de ambas variables se emplean para la rectifica­

ción de la curva estándar. Entre los más em ­ pleados se halla la transformación logit-log, donde el logit de la variable y se define según: logit y = In

1- y

para y = B/Bo, logit B /Bo = In

B /B o 1 - B /B o

donde B/Bo se obtiene como se indica en el cuadro 39-1, aunque previamente suele dedu­ cirse la unión inespecífica y se calculan los co­ cientes corregidos (B/Bo)^.

826

Metodologías

D o sis (n g /0 ,3 m l) \

0 ,9 9

0 ,0 2 6 0 ,0 5 2 0 ,1 0 4 0 ,2 0 8 0 ,4 1 7 0 ,8 3 3 MD

b

\ J ,

0 ,8 9 0 ,7 9 0 ,5 7 0 ,3 6 0 ,2 6 0 ,1 5 0 ,6 8

^

F ig. 39-4. Transform ación log it-lo g de la c u rv a está n d ar. La recta ajustada a los puntos experim entales puede ob ten er­ se con ca lcu la d o ras sen cillas program adas p ara efectuar re­ g re s io n e s lin e a le s o c o n un procesador y graficador en lí­ n ea con el c o n ta d o r g am m a. Los valores representados c o ­ rresponden a los datos del cu a­ dro 39-1 luego de co rrecció n por la unión no específica (re­ cu ad ro inserto). La escala de ordenadas de la izquierda y la escala de abscisas son las h a ­ lladas en cartas lo g it-lo g im ­ presas. Los datos en ese caso in g re s a n sin p r o c e s a m ie n to previo.

\B ,

2 ,0 9 1 ,3 2 0 ,2 8 0 ,5 8 1 ,0 5 1 ,7 3 0 ,7 5

0 ,0 5 0 ,0 4 0 ,0 3

0,02 10 ^ D o sis (n g /0 ,3 mi)

En pocos casos se obtiene una rectificación semejante a la ideal. En los contadores y auto­ máticos provistos de un procesador programa­ do para esos cálculos, o mediante ordenadores en línea o independientes, puede obtenerse un gráfico con la recta de ajuste optimizado y sus parámetros estadísticos. En la fig. 39-4 se muestra un ejemplo de rec- • tificación de la curva estándar luego de la transformación logit-log. Las desviaciones de la linealidad observadas se deben a errores ex­ perimentales. Las más notorias suelen darse en los rangos extremos de concentración de antí­ geno. Cálculos de los parámetros de la interacción primaria Los procesamientos hasta aquí indicados conducen ordinariamente al cálculo de la con­ centración del antígeno en muestras desconoci­ das. Este es el objetivo esencial y rutinario de los RIAs como procedimientos de difundida aplicación, por ejemplo en analítica clínica. Sin embargo, con otros propósitos de investigación básica puede requerirse la estimación de las

10-0

afinidades y la capacidad de unión de los anti­ cuerpos involucrados, así como una expresión formal de la reactividad cruzada de antígenos alternativos en el ensayo, etc. Para todo ello se requiere tratar previamente con cierta profundi­ dad la teoría básica del RIA, de la cual es posi­ ble calcular luego con cierta aproximación los valores de esos parámetros. Como se verá, esa información también surge a partir de las cur­ vas de desplazamiento. TEORÍA MATEMÁTICA DEL RIA La teoría básica del RIA ha sido desarrollada fundamentalmente para el diseño racionalizado de los procedimientos, para evaluar la cah dad y la capacidad analítica y para la interpretación de los resultados, todo lo cual implica poder medir la afinidad y la concentración de los an­ ticuerpos en el ensayo. Por ello, para el trata­ miento de este tema necesariamente deben re­ visarse los principios básicos de la interacción primaria antígeno-anticuerpo. Algunas de las ecuaciones fundamentales dadas en el capítulo 8 vuelven a presentarse,

Inmunoanálisis radiométrícos

aunque ahora como variantes especialmente adaptadas a esta metodología. Asimismo, las representaciones gráficas han sido efectuadas en los sistemas de coordenadas más propicios, de modo de destacar ciertos efectos e implica­ ciones de las curvas dosis-respuesta y derivar las predicciones teóricas más relevantes. Inicialmente consideraremos en algún deta­ lle el modelo más sencillo de RIA y analizare­ mos sus propiedades. Luego trataremos en cier­ ta extensión algunos modelos más complejos y cercanos a las situaciones reales.

827

En el equilibrio y de acuerdo a la ley de ac­ ción de masas de primer orden tenemos c¡ue: [b* K* = -

(5)

1^2

[f*:i íQ] ib]

K=

[fj [Q]

^ 2

( 6)

donde K* y K representan las constantes de afinidad. En virtud de la suposición 3 del mo­ delo básico K* = K. La concentración total de antígeno unido ya había sido simbolizada antes como B, la cual está dada entonces por:

A. El modelo básico

B = [b*| + [b]

(7)

El modelo más sencillo posible de RIA con­ tiene un número de restricciones o postulados que se enumeran a continuación:

En forma similar, la concentración total de antígeno libre, F, está dada por:

1, Tanto el antígeno como el anticuerpo son especies químicas homogéneas y univalentes, 2, La interacción antígeno-anticuerpo obe­ dece a la ley de acción de masas de primer or­ den (con una cinética química de segundo or­ den) sin que existan otros fenómenos alostéricos o cooperativos, 3, El antígeno marcado radiactivamente (trazador) es indistinguible del antígeno inmodificado, desde el punto de vista de su inmunorreactividad. 4, La condición final considerada luego de la reacción antígeno-anticuerpo es la del equili­ brio, 5, Las formas libres y unida del trazador son idealmente separables, sin perturbaciones del equilibrio y finalmente son medibles con exac­ titud.

Luego, la relación de antígeno unido a libre ya mencionada, B/F, puede expresarse según:

Aunque muchas de esas imposiciones no se alcanzan en las situaciones experimentales rea­ les, el tratamiento que sigue provee una razo­ nable aproximación a los sistemas de RIA apli­ cados habitualmente. Luego, en forma progre­ siva iremos considerando las situaciones de in­ cumplimiento simple o combinado de esos pos­ tulados. Para cada una de las interacciones represen­ tadas en (2) podemos escribir: f* +

Q íz > k,

f + Q

F = [f-M + [ f l

(8 )

[b*]

[b]

|f*]

[f]

(9) F

De (6) y (9) obtenemos. B K = --------F • [Q]

( 10)

Además, podemos definir la concentración total de antígeno marcado. A*, como: A*

= [f*| +

[b * ]

( ¡ 1)

y la de antígeno frío. A, como: A = m + [bj

( 12 )

Finalmente, la concentración de antígeno to­ tal, A j se define como: A,,, =

A*

+

A

( i3)

Por otro lado, definimos la concentración to­ tal de anticuerpo, q, como: q = [Q]-H [b*] + |b l

(14)

Luego, de acuerdo a (7) tenemos que: q = [Q] + B

(15)

Combinando (10) y (15) y reordenando, ob­ tenemos;

b*

(16)

(4)

donde k, y k, ’ simbolizan las constantes cinéti­ cas de asociación, y k, y k^’, las constantes ci­ néticas de disociación.

El gráfico de Scatchard

La ecuación (16) indica que existe una rela­ ción lineal entre la relación B/F y la concentra­ ción del antígeno unido, B. Esta rectificación de la ley de acción de masas de primer orden

828

Metodologías

En la figura 39-5 se muestra un ensayo de desplazamiento efectuado con un sistema antígeno-anticuerpo para el cual se cumplen con suficiente aproximación los postulados del modelo básico. En particular, el empleo de un anticuerpo monoclonal decide que el gráfico de Scatchard obtenido sea lineal (representa­ ción incluida en la misma fig. 39-5). La recta obtenida tiene una pendiente de -K e intercep­ ta las abscisas en un valor de B igual a la con­ centración de sitios totales de anticuerpo, q. En general, se requiere una medida indepen­ diente de la concentración de anticuerpos, [Ac], para obtener mediante el cociente q/[Ac] la valencia del anticuerpo en cuestión. Recor­ demos al respecto que puede obtenerse otra forma de la ecuación de Scatchard según la relación:

1.5

1,0

■= K ( n - r )

0,5

1

2

-J-

J-

3

4

Dosis (hGH, ng/0,5 ml) F ig . 39 -5 . A n álisis de d esp la zam ien to p ara el antígeno hG H (horm ona de crecim iento hum ana) y un anticuerpo m onoclonal específico (Q A 68). El trazador em pleado fue ' “ I-hG H. (•): m edia de ios puntos experim entales. El grá­ fico m enor insertado corresponde a un análisis de S cat­ ch ard cuya pendiente es igual a 2,5 x 10‘“ M ' y correspon­ de a -K . La proyección que intercepta las abscisas perm ite calcular la concentración de sitios ligantes, totales (q) en el sistem a. D e ese dato y de la dilución del fluido ascítico en q u e se h allaba el anticuerpo Q A 68 se pudo hallar la capa­ cidad de unión. A dem ás, a nartir de K y q y de los otros p arám etros fijados para el ensayo pudieron calcularse los valores de las resp u estis p m c u ü q u ie r valor de la dosis. Esos valores teóricos ti ish d ad o s nuevam ente al gráfico de desplazam iento (o) m uestran la coherencia del tratam iento

fue originalmente desí ida por Scatchard, en 1949, para describir las interacciones entre proteínas y pequeñas moléculas. Posteriormen­ te fue aplicada al RIA por Berson y Yalow. La ecuación (16) constituye la forma más simple y compacta para expresar la evolución de la relación B/F como una respuesta variable en el RIA.

(17)

donde r se define como el número de sitios de anticuerpo ocupados por el antígeno (B/[Ac]), n se define como el número total de sitios li­ gantes por molécula de anticuerpo y c equivale a la concentración del ligando libre que noso­ tros aquí simbolizamos como F. Según la ecuación (17), de la pendiente de un gráfico de r/c = f (r) también se obtiene -K, pero de la intersección con las abscisas se ha­ lla n. O sea que, tanto a partir de la ecuación (16) como de la (17), se requiere conocer la concentración de anticuerpo total por un pro­ cedimiento separado. La diferencia radica en que a partir de la ecuación (16) puede prescindirse de esta determinación si sólo se desea medir K y la concentración de anticuerpos, ya sea en el ensayo (q) o en el fluido original sin diluir (concentración total original o capacidad de unión, en términos del antígeno total que potencialmente se puede ligar). El valor de n en muchos casos no es objeto de cálculo si se trata de una clase de inmunoglobulina “nor­ mal” (n = 2 para IgG e IgA y 5 o 10 para IgM). En estos casos, q y [Ac] total se interconvierten fácilmente. Pero, si en cambio se trata de definir la valencia de anticuerpos asi­ métricos (p. ej., los definidos como coprecipi­ tantes), donde obviamente n no puede presu­ ponerse, entonces, es imposible soslayar la de­ terminación de [Ac] totales para luego calcular n con la ecuación (16) o (17) indistintamente. Esa equivalencia puede formalizarse reempla­ zando F por c en la ecuación (16) y dividién­ dola por [Ac] total. De ese modo, llegamos a la ecuación (17). Una ventaja para normalizar los datos en términos de r/c ha sido sugerida cuando los ensayos de interacción primaria se hacen variando la concentración de anti­ cuerpo.

Inmunoanálisis radiométricos E l cálculo de B

829

(T + D)

A* + A =

( 21 )

PM x V

Las concentraciones suelen estar expresadas en moles por litro, consecuentemente los valo­ res de K quedarán expresados en litros por mol (M"'). Si se emplea otra escala de concentracio­ nes, por ejemplo para q y B en la ecuación (16), se ve que se produce un cambio recíproco en las unidades de K. Para obtener los valores de B en un gráfico como el de la figura 39-5 debemos considerar los datos de las dosis de antígeno adicionado (variable independiente) y además los valores de las respectivas respues­ tas. Se puede hallar una expresión de B en fun­ ción de la concentración del antígeno total, y de B/F a partir de las ecuaciones (7), (8) y (11)-(13), de donde primero se deduce que; B + F = A,,

09)

ExA E

Si se combinan las ecuaciones (21) y (22), se tiene la relación buscada para calcular la con­ centración del antígeno total en moles por litro: A^ = A* + A =

10-6

y finalmente se llega a:

(22)

T = 4,54 X 10^-2

(18)

Luego, despejando F y dividiendo por B se obtiene: A^ - 1

Pero, a su vez, T en la práctica puede expre­ sarse en términos de otras unidades. Estas son la actividad colocada (a) en cpm, la eficiencia del contador (E) expresada en porcentaje (la cual convierte las cpm en desintegraciones por minuto, dpm) y la actividad específica (AE), la cual suele expresarse en |aCi/|J.g. Considerando que un Ci es igual a 2,2 x 10'^ dpm y requiriéndose la conversión de las unidades de trazador en nanogramos finales, se puede deducir otro factor de conversión igual a 4,54 x 1 0 De es­ te modo, la expresión explícita de T en nano­ gramos será:

= ---------------------

PM x V

/ , ( 4 ,5 4 x 1 0 - ^ y

a \ ----------- + D 1 E X AE )

(23)

( 20)

En forma análoga se deduce para F: F =

A„ (20’) + 1 F

La ecuación (20) permite calcular B en con­ centración molar cuando A.j, ingresa en las mis­ mas unidades, ya que F/B es el cociente adimensional que se obtiene de la determinación de actividades según la ecuación (9). Sin em­ bargo, en la práctica resulta más útil obtener una expresión equivalente a la (20), donde las concentraciones se convierten a las unidades moles por litro a partir de otras unidades de uso habitual en el RIA. Por ejemplo, en la curva de desplazamiento de la figura 39-5, la concentra­ ción del antígeno se expresa en ng/volumen de reacción; luego resulta útil ingresar en la ecua­ ción (20) el dato de dosis, D, directamente en nanogramos. El factor que permite esa conver­ sión es lO'VPM X V, donde PM representa el peso molecular del antígeno y V el volumen de reacción expresado en mililitros. Como en vir­ tud de la relación (13) A^ puede desdoblarse en los componentes marcado y frío (A* y A), ese factor permitirá calcular inclusive A* si tam ­ bién la cantidad de trazador, T, se da en nano­ gramos. Entonces, utilizando el factor común de con­ versión, tenemos que:

Obviamente, si V, a, E, AE y D en forma in­ dividual o combinada se dan en otras unidades, deberán ajustarse los factores de conversión respectivos. Al reemplazar el numerador de la ecuación (20) por su equivalente en la (23), puede hallar­ se 13 en moles/litro. Ese fue el procedimiento seguido para calcular los valores de B en el gráfico de Scatchard de la figura 39-5 a partir de los datos de la curva de desplazamiento. Revisión de conceptos para definir el nivel de “antígeno trazador”

Las transformaciones hasta aquí señaladas no significan solamente una ventaja para operar en los cálculos de B en concentraciones molares. Además, para la deducción de la ecuación (23) se ha introducido el concepto de actividad espe­ cífica del trazador, como un relación entre la actividad y la m a p de la molécula marcada. Ese valor constituye una especificación relativa al número y la calidad de átomos del nucleido con que se ha modificado el antígeno. Los conceptos básicos de radioquímica per­ miten deducir una expresión compacta para el cálculo de la actividad específica teórica de un trazador preparado mediante la incorporación de n átomos de nucleidos radiactivos. En parti­ cular, para n = 1 se tiene que: AE =

1,88

X

PM

IQii

(24)

830

Metodologías

donde ss el período de semidesintegración del isótopo radiactivo expresado en minutos. La AE resulta expresada entonces en [iCi/jig. Las unidades de tiempo pueden seleccionarse para los distintos tipos de nucleidos según su estabilidad. Así, por ejemplo, para el cuyo t ¡/2 es de unos 60 días, el factor de la ecuación (24) se convierte en 1,30 x 10*. Por lo tanto, expresando t,^j en días, la AE surge también en |iCi/|Xg. Otros factores pueden convertir esos datos en Ci/|imol, lo que representa otras uni­ dades de AE de uso común. Las técnicas de marcación que permiten ob­ tener distintos valores de AE serán menciona­ das más adelante cuando se trate el tema de los requerimientos del RIA. Pero en este punto es más importante definir cuál es el reflejo de la AE en las propiedades de un trazador. Para ello reconsideraremos un experimento de titulación como el de la figura 39-1, donde sólo se coloca el trazador y el antígeno frío no interviene. En este caso, la ecuación (23) únicamente incluirá el primer sumando. Se ve, entonces, que para una actividad apropiada en el ensayo (p. ej., a ~ 10“*cpm) la concentración del trazador, A*, guarda una relación inversa con la AE. Cuando la AE presenta un nivel relativamente alto (que luego indicaremos en forma más precisa), por virtud del nucleido seleccionado y el grado de incorporación (ecuación 24), A* presentará un valor relativamente bajo. Ello repercutirá en un valor correspondientemente bajo de B según la ecuación (20) y, por último, en la (16), reorde­ nada según la relación: (1 6 ’)

Ahora resulta evidente que cuando B sea su­ ficientemente bajo respecto de q, podrá igno­ rárselo, resultando: -^ ^ K q

(25)

Ese valor inicial de B/F también es designa­ do como (B/F)g. Esa consideración que pudo introducirse in­ mediatamente después de definir la ecuación (16), gana ahora un significado formal más contundente, ya que es la cantidad relativa del trazador empleado la que puede causar que la respuesta (B/F) sea función sólo de la afinidad y de la concentración de los sitios ligantes (K.q). La afinidad viene determinada por facto­ res moleculares del paratope y del epitope, que condicionan el nivel energético de la interac­ ción. Ello a su vez es consecuencia, por parte del anticuerpo, de factores inscriptos en la in­ munogenética del organismo que produjo tal variante de anticuerpo. Con ello se intenta de­ cir que el diseñador de un RIA podrá manio­

brar con ese parámetro sólo en términos de la selección apropiada del anticuerpo dentro de un repertorio disponible. Pero q, sí es un pará­ metro modulable, el cual puede ajustarse tenta­ tivamente en un experimento de titulación co­ mo el de la figura 39-1 o, en casos menos fre­ cuentes, conocida la concentración por méto­ dos independientes, puede colocarse en los en­ sayos directamente en el rango de concentra­ ciones que darán una unión del trazador de un 50%. Obsérvese que según la ecuación (25) cuando B/F=l, q=l/K. Eso implica que, utili­ zando un trazador de AE suficientemente alta, un RIA puede ajustarse a una relación (B/F)^ = 1 (respuesta “inicial” o valor de los “ceros”) cuando la concentración de sitios iguala la in­ versa de la constante de equilibrio de asocia­ ción. Ello no implica que esa situación sea la óptima para todos los fines analíticos; sin em­ bargo, es conceptualmente importante y otorga una adecuada referencia en el momento de ge­ nerar en forma racional un RIA optimizado. También es importante el papel del trazador para decidir el límite de detección del análisis. Esa situación y otras, en las que la concentra­ ción del trazador (o del antígeno en general) no es insignificante respecto de q, se analizan en la parte siguiente. Análisis de curvas dosis-respuesta

Las deducciones efectuadas hasta aquí nos llevaron a la ecuación más simple posible (la de Scatchard) para describir la evolución de la respuesta en el RIA en términos de la variable B/F. Sin embargo, aún no presentamos formal­ mente la evolución de la variable B/F respecto de la dosis de antígeno total. Esto es, no deduji­ mos aún la función que describe la curva de desplazamiento. En este punto también debe­ mos hacer un retorno a temas anteriores de la secuencia para reconsiderarlos más profunda­ mente. Como punto de partida consideremos que la ecuación (16) relaciona B/F con los parámetros K,q y con la variable dependiente B. Pero ya conocemos que B puede expresarse a su vez en términos de A,, (ecuación 20). Sin embargo, es­ ta última ecuación también incluye la variable B/F. Si reemplazamos entonces B en (16) por su equivalente en (20) obtenemos luego de su­ cesivos reordenamientos una ecuación de B/F en términos de todas las variables implicadas: / B \2

j

B

+ [K (A,. - q) + i] — - K q = O

(26)

Esta ecuación cuadrática ha sido deducida por distintos autores siguiendo diversas vías. Constituye la llave de todas las relaciones do­

Inmunoanálisis radiométricos

sis-respuesta en los ensayos de “un anticuerpo y un antígeno”. Como la relación B/F puede expresarse en función de A*, A, q y K, es facti­ ble generar toda la diversidad de curvas dosisrespuesta que se desee cambiando una o más de esas variables a la vez. Para ello basta con asignar los valores de las variables, conservan­ do la coherencia en la unidades. Por ejemplo, A*, A y q en moles/litro y K en litros/mol. Luego, por practicidad pueden tabularse los coeficientes a, b y c de la ecuación (26) para cada condición propuesta. Los coeficientes de la variable en cada su­ mando son: a= 1 b = K (A ,,~q) + l c = -K q La solución de la ecuación puede hallarse se­ gún la expresión típica: JL =

F

-b ±

^ r h T T '^ i c

2a

Ese algoritmo puede aplicarse a todos los da­ tos tabulados (preferentemente con el auxilio de una calculadora manual programable o de un ordenador), y finalmente obtener los gráfi­ cos de desplazamiento simulados. En la figura 39-6 se muestra un modelo numérico para ilus­ trar en qué proporción se hallan todos los com­ ponentes del sistema antígeno-anticuerpo para una condición inicial fija (K y q establecidos) y dosis variables de trazador y de antígeno frío. Observando atentamente la figura 39-6 con­ cluimos que para q = l/K el antígeno marcado cumple aceptablemente su función trazadora hasta valores de concentración vecinos a O, I K (punto 3). Eso demuestra que no existe ventaja en reducir la traza debajo de esa cota por medio de un incremento de la AE o de una disminu­ ción de la actividad aplicada. Fijada esa con­ centración del trazador, una dosis igual del an­ tígeno frío disminuye poco la respuesta (punto 4), y probablemente en los casos reales no sea discriminable de la anterior debido a la disper­ sión de los valores experimentales. Cuando el antígeno total iguala a l/K, y por ende en este caso a q, la respuesta ha sufrido una variación franca (punto 5), cercana al punto medio del rango. Finalmente, cuando la concentración del antígeno supera 10 veces el caso anterior, la respuesta ha sufrido casi su máxima evolución. Aquí se ha cubierto prácticamente todo el ran­ go útil de ese RIA y nos hallamos cerca del ámbito de la unión inespecífica. Si bien esta propuesta es suficientemente ilustrativa a los fines didácticos, en la práctica resulta más útil aplicar una forma explícita de la ecuación (26). Esto es, podemos retomar la

831

ecuación (23) para calcular A,,, en términos de los datos directos de los protocolos analíticos (PM, V, a, E, AE y D), tal como se hizo para B, y luego introducirlos ya normalizados en la (26). En la figura 39-7 se ofrece una serie de gráficos en los que se han alterado los paráme­ tros en forma aislada o combinada. El simple análisis visual permite predecir qué consecuen­ cias tendrían tales cambios en los ensayos res­ pecto de una situación de referencia. De un modo análogo se ha deducido la curva teórica de la figura 39-5. En este caso q se ha calcula­ do previamente de modo de ajustar el valor de (B/F)q al experimental. Eso se logró mediante un reordenamiento de la ecuación (26) que per­ mite despejar esa variable. Luego, proponiendo las dosis, D, se calcularon las respectivas rela­ ciones B/F por el procedimiento habitual.

Criterios de evaluación del RIA En general se considera que un RIA presenta una buena curva cuando el ensayo arroja alta exactitud, precisión y sensibilidad. Según los objetivos que se persigan en cada caso analítico se hará una diferente elección del sistema de coordenadas y también diferirá el criterio de evaluación. Varios son los parámetros que se han usado para tales evaluaciones. Entre ellos se incluyen: 1) la pendiente: en general cuanto más empinada sea la curva, mejor resultará el ensayo, aunque la dispersión de los puntos ex­ perimentales, concordantemente, también será mayor. 2) La intersección en el eje de ordena­ das, (B/F)^: ya se explicó que este punto puede condicionarse sólo por la influencia de K y q cuando el trazador es infinitesimal. También puede manipularse tal condición para otras si­ tuaciones mediante la orientación de una ecua­ ción como la (26). Siempre es deseable que se parta de un valor apropiadamente alto. 3) Dosis media del rango: se refiere a la dosis de antíge­ no que modifica la respuesta a un valor igual a la mitad de su magnitud inicial. Este valor tam­ bién se puede obtener de la intersección en x de la curva construida en un gráfico logit-log. En ese punto el logit B/Bo es cero y corresponde a B/Bo = 0,5. 4) Coeficiente lambda: se lo define en cada punto de la curva dosis-respuesta como la pendiente en ese punto dividida por la des­ viación estándar calculada por la dispersión de la respuesta en tal punto. Fls un parámetro esta­ dístico que pondera la desviación estándar o el coeficiente de variación de la respuesta estima­ da para una muestra desconocida en ese punto. 5) ¡Dosis mínima detectable: este parámetro es de capital importancia ya que muchas veces re­ sulta crítico en biología detectar metabolitos, hormonas o factores presentes en ínfimas canti-

832

Metodologías

1,0

-------- 4

k = IQi» M-'

0,8

0,6 0 ,4

0,2 O

10 -

10 - ' 2

10-1

10-10

dades en los fluidos bajo investigación. La do­ sis mínima deteetable ha sido deñnida como la menor concentración de antígeno frío, la cual, cuando se adiciona a una solución carente de él, produce un cambio significativo en la varia­ ble que expresa la respuesta. Normalmente se realizan réplicas de todos los puntos de la cur­ va patrón, incluidos los controles sin antígeno frío (ceros). Luego se calcula la media (X) y la desviación estándar (DE) de las respuestas ex­ perimentales en cada punto. Para los ceros se sustrae del valor medio el valor equivalente a 3 veces la desviación estándar y se lo proyecta hacia la curva dosis-respuesta, El valor corres­ pondiente a ese punto en las abscisas determina la dosis mínima deteetable. Como se advierte, ese parámetro está muy influenciado por la pre­ cisión, reflejando la variación causada por las micropipetas y dispensadores y los propios operadores. El control de la precisión puede hacerse construyendo una curva o un perfil de precisión a lo largo de la curva estándar. En or­ denadas suele representarse el coeficiente de variación (CV % = DE x 100/X). La curva ob­ tenida habitualmente tiene la forma de U. Según las recomendaciones de R. P. Ekins,

10-9

F ig . 39 -6 . C u rv a de d esp lazam ien to teó rica para un R IA ideal realizado con un anticuerpo hom ogéneo. L a tabla inferior ilustra encolum nadam ente la proporción d e m oléculas totales, com binadas y libres de cada tipo (los valores ta b u la d o s r e p r e s e n t a n c o n c e n tr a c io n e s M X 10’'^ en núm eros integrales por sim plici­ dad) y finalm ente la relación B /F calculada. A ju stad o el v alo r d e q a 1/K las relacio n e s B /F se dedujeron em pleando la ecuación (26) para cada dosis propuesta. P untos 1-3: traza­ dor (A*) igual a 0,002/K , 0,01/K y 0,1/K , res­ pectivam ente. P unto 4: trazador igual a 0,1/K m ás igual dosis d e antígeno frío (A). P untos 5-6: trazador igual a 0,1/K m ás antígeno frl^o hasta antígeno total igual a 1/K y 10/K, re s ­ pectivam ente.

cuando se fija la concentración de anticuerpos al valor 3/K y la concentración del trazador a 4/K, se obtiene la menor dosis deteetable posi­ ble. En ese caso, además se predice que las cur­ vas se iniciarán con un mismo valor de B/F = 1 para cualquier K propuesta. También se deduce que, si sólo existe el error de conteo, esa rela­ ción de K, q y trazador provee el mejor coefi­ ciente lambda para los ceros. El térm ino sensibilidad, frecuentem ente mencionado en el área del RIA, ha generado al­ guna controversia respecto de la definición más apropiada. Nosotros aquí podemos definirla tanto en términos de la dosis mínima deteetable como de la pendiente de la curva estándar do­ sis-respuesta. Esta asimilación es válida si se supone que el error experimental no cambia cuando logra aumentarse la pendiente de un en­ sayo y entonces esto se traduce en una reduc­ ción de la dosis mínima deteetable. El siguiente ejemplo concreto puede servir para clarificar el concepto: supongamos que la pendiente de una curva dosis-respuesta conduce a un cambio del 10% en la respuesta para una dosis de xpg, y que el error estadístico en la determinación es del 10%. Entonces la cantidad mínima detecta-

Inmunoanálisis radiométrícos

833

T A E = 3 0 0 n C i/jig a = 5 .000 cpm E = 70 %

K=10'“M -\ K=109M-' K=10"M-' \q = 10-’“IVI \q = 10-9M \ q = 10 -"M

0,01

\

\

0,1

10

D o sis (insulina, ng/ml)

F ig . 39-7. C urvas de desplazam iento sim uladas em pleando las ecuaciones (23) y (26). E n A , B y C se varió un p arám etro a la vez. E n D se variaron K y q recíprocam ente de m odo que K, = 1/q.. E n las curvas cuyo (B/F)^, es m en o r que 1 el tra z a ­ dor ya ejerce un efecto de “autodesplazam iento”. Para el m odelo seleccionado (insulina) las flecnas indican a m odo d e re ­ ferencia los valores más frecuentem ente em pleados. Las dosis aquí se refieren sólo a insulina fría. El trazador es '“ I-in su lina, por lo cual scgiín la ecuación (24) 1 átom o de '“ I p o r m olécula corresponde a ~ 380 H.Ci/|j.g.

ble estará en el orden de xpg. Si la pendiente puede mejorarse y alcanza un valor 10 veces más alto (100% de cambio en la respuesta para la misma cantidad), entonces, para el mismo error supuesto en las determinaciones anterio­ res, la cantidad mínima detectable será x/10 pg.

nales de referencia y el sometimiento a progra­ mas regionales de control constituyen medidas adicionales para mejorar las prestaciones de los RIAs.

Control de calidad en el RIA

Hasta aquí sólo tratamos los aspectos teóri­ cos del RIA bajo los postulados del modelo bá­ sico, uno de los cuales (número 4) suponía que el estado final alcanzado era el de equilibrio. Ahora bien, si los reactivos de un ensayo no se agregan simultáneamente y las incubaciones se interrumpen antes de alcanzado el equilibrio, entonces las consecuencias serán diferentes se­ gún las especificaciones seguidas. Si bien se ha desarrollado una teoría matemática que predice la cinética del RIA, nos limitaremos en este punto a mencionar que uno de los recursos más empleados dentro de estas variantes es el de la adición demorada del trazador. Consiste en adi­ cionar anticuerpos y antígeno frío en los tubos

Para los laboratorios que ejecutan rutinaria­ mente los RIAs con distintos fines, es necesa­ rio documentar la exactitud y precisión de los análisis, de modo de controlar las propiedades y la estabilidad de los métodos aplicados. En el área de los análisis clínicos, por ejemplo, esto contribuye a la reducción de los ámbitos difu­ sos que separan los valores normales de los pa­ tológicos. La aplicación de métodos estadísti­ cos y la confección de cartas de control permi­ ten reconocer si una determinación se halla o no dentro de los límites de las especificaciones establecidas. El empleo de patrones internacio­

B. Ensayos en preequilibrio

834

Metodologías

de reacción y luego incubar hasta que se alcan­ ce el equilibrio, o un estado cercano a él. Final­ mente, se agrega el trazador y se comienza a tomar el tiempo de esta segunda incubación. Luego de un lapso preestablecido por un test empíricamente controlado, la reacción se detie­ ne con la ejecución de la etapa separativa. Los resultados esperados de un ensayo óptimo arro­ jarán un valor de (B/F)^ o (B/T)„ casi igual al de un test normal, pero a bajas dosis, la curva del ensayo de “preequilibrio” exhibirá una ma­ yor pendiente que la convencional. Además, tanto el rango de trabajo como la dosis media de ese rango mostrarán un desplazamiento ha­ cia la región de dosis bajas. Todo ello significa un aumento en la sensibilidad del ensayo cuan­ do no existen otros factores que aumentan la dispersión de los datos respecto de un RIA nor­ mal.

res, parece no producirse con los anticuerpos. Dicho en otros términos, en la mayoría de los casos no hay evidencias de que la ocupación de un paratope disminuya la afinidad del otro en la misma molécula por un efecto alostérico (postulado número 2 del modelo básico). La base formal para analizar el modelo de dos o más anticuerpos surge de considerar una de las ecuaciones, como la (10), para cada uno de ellos, reexpresándola en términos de q - B en lugar de [QJ, resolviendo para cada B: K iq ¡ F

1 + K ¡F

Entonces para la suma de concentraciones. B Z y en particular para m = 2 : i= l K ,q ,F

K ^ q .F

1 -l-K, F

1 -l-K, F

(29)

B =

C. RIAs con multicomponentes El siguiente nivel de complejidad que trata­ remos es el más habitual, o sea el de los siste­ mas en que intervienen mezclas de anticuerpos de variada afinidad por el antígeno. Tal es el caso de los sueros inmunes y también el de los anticuerpos fraccionados y rotulados como “monoespecíficos” por reaccionar específica­ mente contra un solo epitope del antígeno. Además, la heterogeneidad del antígeno en otros casos también causa problemas de conta­ minación, de reactividad cruzada o de inespecificidad. A los fines didácticos sólo consideraremos en esta parte los modelos referidos a un antíge­ no frente a dos o más anticuerpos en el test y al de dos antígenos frente a un anticuerpo, con re­ ferencias a una generalización para los sistemas polielonales. Todos estos casos se inscriben dentro de los modelos más cercanos a los rea­ les, y representan, por ende, a los RIAs habi­ tuales que no cumplen con el postulado número 1 del modelo básico. Heterogeneidad en la afinidad

En general los anticuerpos séricos causan curvas de Scatchard francamente contrastantes respecto de las mostradas por los anticuerpos homogéneos. Mientras que en estos últimos se obtiene una recta (véase el caso de un anticuer­ po monoclonal en la figura 39-5), los anticuer­ pos heterogéneos causan gráficos curvados (fig. 39-8). Los antisueros, por representar un sistema heterogéneo de anticuerpos, suelen ex­ hibir típicos gráficos de Scatchard con concavi­ dad hacia arriba. Ese fenómeno, también po­ tencialmente adjudicable a una cooperatividad negativa, como la descrita para ciertos recepto­

(28)

Si dividimos por F tenemos otra forma equi­ valente en términos de la relación B/F: (30) F

1 + K |F

l+ K jF

Tanto en la ecuación (29) coino en la (30) F puede ser reemplazado en función de A Para la ecuación (29), utilizando la relación (13), F = A-j, - B, y luego, reordenando la variable B sur­ ge una ecuación cúbica. Para ingresar a la ecua­ ción (30), F se calcula utilizando la relación (20’). Luego tenemos una expresión de B/F también en términos de A^, y de los parámetros de afinidad y concentración, como se había he­ cho para m = 1 (ecuación 26). Sólo que su ex­ presión reordenada para B/F genera una ecua­ ción aun más compleja. Por ende, una solución más conveniente para resolver las ecuaciones (29) o (30) es el empleo de programas de com­ putación, donde K,, qj, y q^ ingresan como aproximaciones obtenidas de las tangentes grá­ ficas (fig. 39-8) y se ajustan luego mediante métodos iterativos. Otros sistemas de procesa­ miento de datos prescinden de tales valores aproximados y calculan directamente los cuatro parámetros con los datos experimentales. Si la mezcla de anticuerpos es más compleja que la seiialada, entonces el tratamiento analíti­ co hasta aquí efectuado no será estrictamente aplicable. Tal es el caso de muchos sistemas constituidos por un antisuero y, como agravan­ te, por un antígeno suficientemente voluminoso como para permitir interacciones independien­ tes y no interactuantes con dos o más epitopes a la vez. Ai respecto es ilustrativo mencionar que macromoléculas globulares a partir de PM 5-6 KDa (p. ej., la de insulina) ya presentan ra­ dios de Stokes suficientemente importantes co-

Inmunoanálisis radiométricos F ig . 39-8. G ráfico de S catchard curvib'neo producido por u na m ezcla de dos anticuerpos con diferentes afinidades. Ei análisis es estrictam ente aplicable a un sistem a de un antígeno y dos anticuerpos raon o c io n a le s e s p e c ífic o s c o n tra el m ism o epitope (com parar con el sistem a análogo más sencillo de la fig. 39-5). L a curva es una hipérbola cuyas tangen­ tes g ráficam ente trazadas con los puntos extremos (líneas continuas) perm iten la estim ación algo ine­ xacta de las afinidades de cada anticuerpo. Por la in tersecció n de las ab scisa s se p uede apreciar la concentración total de sitios de anticuerpos (no se discrim in a la contribución de cada sum ando). Un an á lisis m ás e la b o ra d o , u tiliz a n d o el m étodo de G auss-N ew ton de regresión no lineal pesada para el ajuste de los datos experim entales, perm ite calcular los cuatro parám etros KjQiKjqj. Con ellos es posi­ ble trazar las asíntotas (líneas cortadas). Estas rectas corresponden a los gráficos de Scatchard de los dos com ponentes en que se descom pone la hipérbola.

F K^q^+K^q,

2,0 K iq,

K, = q, = K, = q2 = R =

835

6 , 9 x 1 0 '“M^' 2 , 6 x 10^” IVI 9 , 5 x 10»M-i 3 , 0 x 1 0 ’' “M 6 ,4 x 1 0 ® M

1.0

^ 1+^2

K jq j

mo para admitir la interacción simultánea con dos inmunoglobulinas específicas. La forma­ ción de complejos cíclicos (Ac,, Ac^): 2Ag conduce a un incremento de la afinidad aparen­ te con deformación de los gráficos de Scat­ chard. Ésa es la base de un RIA cooperativo que utiliza dos anticuerpos monoclonales apro­ piados a la vez. A pesar de todo lo comentado, es frecuente hallar en la bibliografía conectada al tema, re­ ferencias a tratamientos “para dos componen­ tes” aplicados a sistemas de anticuerpos poli­ clonales contra antígenos proteicos. Es discuti­ ble si tal aproximación es lícita o no (incumpli­ miento de los postulados números 1 y 2 del modelo básico) en cada caso en particular. Afinidades promedio

Del gráfico de Scatchard curvilíneo pueden obtenerse gráficamente dos tipos de afinidades promedio. La más ampliamente usada es la constante intrínseca promedio, Ko. En realidad, refleja con mayor exactitud el valor de la me­ diana que el valor denominado “promedio pe­ sado de la afinidad”, K. Mientras este último valor se calcula contemplando la concentración m y la afinidad conjuntamente (X K¡q/q^^^j,j), i= 1 el de Ko se obtiene calculando la pendiente de la tangente en el punto de la curva donde B = qi^^i,j/2. De este modo, la Ko resulta más difícil de obtener gráficamente que la constante pro­ medio pesado, ya que ésta surge simplemente del cociente entre los puntos de intersección de la curva en ambos ejes (fig. 39-8). Según se analiza en la teoría general de la in­ teracción primaria antígeno-anticuerpo (cap. 8), para los antisueros heterogéneos puede calcu­ larse un índice de heterogeneidad y un valor de

0,1

0,2

0 ,3

i (h G H , nM )

afinidad promedio mediante el gráfico de Sips. En este caso, la constante apreciada es Ko. Heterogeneidad en el antígeno

El RIA ha sido una herramienta importante para estudiar no sólo los antígenos “genuinos”, relacionables a los inmunógenos, sino otros es­ tructuralmente vinculados y que exhiben una reactividad cruzada frente a los mismos anti­ cuerpos. Este fenómeno, muy tempranamente descrito en inmunología, puede ser explotado con fines analíticos. Con anterioridad deben re­ conocerse sus dos variantes condicionadas por: 1) la estructura naoleculav de ios antígenos, y 2) el grado de heterogeneidad de los anticuerpos. El caso más sencillo es el de un anticuerpo homogéneo reaccionando alternativamente con dos antígenos. Podría incluirse dentro de este modelo hasta el propio sistema común de un solo antígeno y su trazador, donde este último, debido a la modificación química sufrida puede unirse al anticuerpo con menor afinidad que el antígeno inmodificado (incumplimiento del postulado número 3 del modelo básico). Siem­ pre y cuando el grado de deterioro de esa inte­ racción no determine la inutilidad del trazador, no habrá otras consecuencias en cuanto a la exactitud de los análisis, aunque sí en el cálcu­ lo de la afinidad. En efecto, fue tempranamente reconocido en la historia del desarrollo del RIA que su validez para ponderar antígenos depen­ de de la idéntica inmunorreactividad del están­ dar y de los desconocidos (o sea sus propieda­ des para competir con la unión del trazador) y no depende en cambio de la similitud en la in­ munorreactividad del trazador respecto del es­ tándar o de los desconocidos. Pero en esta sec­ ción analizaremos otro tipo de experimento que suele darse en la práctica del RIA: la determi­ nación de un antígeno no homólogo competi­ dor, A2, en un ensayo realizado en principio

836

Metodologías

con un anticuerpo homogéneo anti-A, (induci­ do por un inmunógeno A,) y un trazador A,* presente en concentración infinitesimal. Luego nos referiremos al caso de un antisuero hetero­ géneo frente a los mismos antígenos. Antes de entrar en los aspectos formales que describen estos modelos, debemos justificar en qué situaciones de la práctica radioinmunoanalítica no se cumple el postulado número 1 del modelo básico, ahora por causa del antígeno. El antígeno A^ puede presentar reactividad cruzada frente a ese anticuerpo anti-A, por cau­ sa de dos mecanismos diferentes: a) el epitope de no es idéntico al de A l porque comparte sólo una fracción de los grupos funcionales; b) los grupos funcionales son enteramente idénticos en A, y A^, pero en este último la es­ tructura espacial presenta una conformación un tanto alterada. El caso a se da típicamente en los antígenos proteicos que constituyen las lla­ madas familias de proteínas filogenéticamente relacionadas y que presentan mutaciones a ni­ vel de uno o más residuos aminoacídicos. Tal es el caso de varias hormonas polipeptídicas que, según ias distintas especies animales, re­ sultan altamente homologas. Por ejemplo, la insulina porcina difiere solamente en un resi­ duo respecto de la humana. Si al obtener anti­ cuerpos monoclonales inducidos por la insulina porcina, el epitope involucrado incluye ese re­ siduo, puede ocurrir que la reactividad cruzada con la insulina humana sea algo menor (con otros monoclonales, la reacción puede ser idén­ tica o nula). En ese caso, un RIA aplicando in­ sulina porcina trazadora puede permitir no sólo la determinación de la hormona humana sino que es factible determinar su constante de afi­ nidad. Además, es innecesario efectuar los es­ fuerzos para generar un trazador de insulina humana o incluso para obtener anticuerpos mo^ nocionales vía ese inmunógeno. Otra situación dentro del caso a, donde pue­ den verse involucrados dos antígenos relacio­ nados, es la de su coexistencia natural en un mismo fluido biológico. Tal es el caso de la hormona de crecimiento hipofisaria (hGH) y del lactógeno placentario (hGS) en el suero de embarazadas. Ambas hormonas dan reactividad frente a antisueros específicos o ante algunos anticuerpos monoclonales inducidos por cual­ quiera de ellas. La determinación específica de hGH en presencia de niveles considerables de hCS (hasta 10^ veces mayores) presenta un pro­ blema analítico que se considera a la luz de los modelos teóricos de competición que se verán seguidamente. El caso b se da típicamente en los antígenos macromoleculares desnaturalizados o que per­ dieron su conformación nativa por hallarse es­ cindidos a un nivel que no involucra los epito­

pes, pero que causan su alteración topográfica indirecta. Éso puede ocurrir durante las etapas preparativas, de purificación, o de almacena­ miento de macromoléculas algo inestables y que luego se estudian mediante RIA como con­ trol de calidad. También surgen cambios du­ rante la ruptura o la síntesis de antígenos pro­ teicos sometidos a estudio de restricción de epitopes. Base teórica del modelo anticuerpo homogéneo-tmzador homólogoantígeno competidor

En la figura 39-9A se muestran esquemática­ mente, a los fines comparativos, las curvas de desplazamiento obtenidas en forma separada para el antígeno homólogo A l (ensayo “nor­ mal”) y para el antígeno competidor A^, em­ pleando el mismo trazador ideal, A,*, en am­ bos experimentos. El simbolismo que utilizaremos aquí conser­ va en lo posible las formas ya utilizadas e in­ corpora las del competidor, según el siguiente listado: q : concentración total de sitios de anticuer­ pos [Q] : concentración de sitios de anticuerpos libres A l : concentración de antígeno frío A l* : concentración del trazador [fl*] y [bi*] : concentración del trazador libre y unido, respectivam ente A 2 : concentración del antígeno com petidor [fa] y [b2] : concentración del antígeno com petidor libre y unido, respectivam ente B [bi*] : relación de las concentraciones de radiac= tividad unida/libre m edidas F [fl*] : : constante de asociación para A] K ^2 • constante de asociación para A 2

En este modelo se cumplen dos reacciones de equilibrio simultáneamente:

(31)

Q + f,*

b *

Puesto que [Q] = q - [b,*] - [b^], según la ley de acción de masas puede expresarse una relación para cada equilibrio: [ b i* ] K a, =

(3 2 ) [ f i* ] ( q - ~ [ b ,* ] - [ b j)

K .,=

[bzl (3 3 ) [ f J (q - [b ,* l - [bj])

Inmunoanálisis radiométricos

837

En el punto medio del rango de ordenadas (fig. 39-9) se cumple a partir de (34) y (25’) que:

K ., ( q ^ [ b , * ] ^ [ b j ) =

t X -

X

1

+

q

+

K A iq (3 6 )

Resolviendo la ecuación (36) para [bj*], y sustituyendo en la ecuación (34), tenemos que:

T ■'

V

( 7).

4

Dosis (log) de A ,O A ,

B

( 1 - K a i [f,* ]) = [ b j

(3 7 )

Luego, resolviendo la ecuación (36) para q, y sustituyendo en la ecuación (33), tenemos que: [b,]

Trazador = A *

K a2 [ b J =

(3 8 )

q/2

Combinando las ecuaciones (37) y (38) obte­ nemos: Ka2 = ^ [Í2]

( 1 - K a , [fj* ])

(3 9 )

Por líltimo, de las ecuaciones (38) y (39) lle­ gamos a que: de A, o F ig . 39-9. A, R IA esquem ático para el inraunógeno, A l, y para un antígeno con reactividad cruzada, Aj, en un sis­ tem a de anticuerpos hom ogéneos. D e los valores de absci­ sas en los puntos m edios de) rango de respuestas se p u e ­ den obtener relaciones en térm inos de y B, R IA esquem ático para los m ism os antígenos ixente a dos h ipo­ téticos sueros heterogéneos. En un caso los anticuerpos d i­ fieren en sus afinidades determ inando una curva no p ara­ lela (reactividad cruzada de tipo 1), E n el otro caso, la h e ­ terogeneidad se refiere a la especificidad por ios epitopes. En la curva de A^ para el suero con reactividad cruzada de tipo 2 sólo intervienen ios anticuerpos dirigidos hacia ep i­ topes com partidos por A, y A ,. El resto sólo reacciona es­ pecíficam ente con A, y su trazador.

La ecuación (32) puede reordenarse de modo que resulte una expresión de B/F = [b,*J/[fj*] en función de [b,*] o de [f *]:

An

( l- K .,

-

[b,*]

Ka , ( q ^ f b j )

[fi

1 + K a , [f,*]

(3 4 )

(3 5 )

Luego se cumple que, para la condición en que tanto A, como A^ tienden a cero, B/F al­ canza un valor límite igual que el definido para la ecuación (25) del modelo básico:

=

(25’)

(4 0 )

Esta ecuación nos demuestra que para B/F = (B/F)(/2, la concentración del antígeno compe­ tidor puede ser función sólo de q y con la condición de que [f,*] sea insignificante res­ pecto de l/K .,, luego K^ [f,*] es « 1 y puede ignorarse el ultimo factor de la ecuación (40), con lo que se obtiene: Al -- -

(4 1 )

Además, por una vía mucho más sencilla, para el modelo simple donde Aj = O y sustitu­ yendo en la ecuación (26) B/F por el valor del punto medio, (B/F)p/2 =

[b,*:i = K a , ( q - [ b ,* : | - [ b J )

[f,*])

Al —•

tenemos que:

q

+ —

(4 2 )

Como se advierte, las ecuaciones (41) y (42) son muy semejantes y permiten relacionar, en los puntos de (B/F)y2 de cada curva de despla­ zamiento, los valores de dosis con las respecti­ vas constantes de afinidad para un mismo y de­ finido valor de q. En la figura 39-9A se destacan las proyeccio­ nes de esos valores en el eje de las abscisas (x e y para A¡ y A^, respectivamente). Como esta­ mos comparando dos experimentos paralelos

838

Metodologías

con un mismo valor de q, despejando q/2 en las ecuaciones (41) y (42) e igualándolas, tenemos que:

sarios (pero no suficiente) para demostrar iden­ tidad radioinmunoanalítica entre un estándar de referencia y la muestra problema: el paralelis­ mo de sus curvas de desplazamiento frente a un I I Ao - A , = ------------ --------(4 3 ) suero policlonal específico. La reactividad cruzada de tipo 2 puede ocu­ O sea que, determinando el valor de por rrir solamente si se da la llamada heterogenei­ los procedimientos ya descritos, el valor de dad de especificidad para diferentes determi­ puede obtenerse de la ecuación (43), donde - nantes. En este caso hay sólo una fracción de A, representa la diferencia entre las dosis y y x . anticuerpos dentro del antisuero heterogéneo Si bien la pendiente de la curva para A2 en que puede reaccionar con el competidor A^. ese punto es menor que la de Al (analíticamen­ Luego el antígeno A^ no podrá causar un des­ te puede demostrarse que la diferencia se debe plazamiento completo como el A,, a ningún va­ a las distintas afinidades), en una escala loga­ lor de dosis (fig. 39-9/?). Nuevamente aquí po­ rítmica de abscisas resultan paralelas. Además, demos aplicar el concepto de especificidad co­ el competidor A^ puede lograr el total desplaza­ mo lo hicimos antes, sólo que para este caso miento del trazador a concentraciones propor­ definiremos un suero como específico para el cionalmente mayores que las de A,. Esas carac­ antígeno A, cuando sólo una mínima fracción terísticas son propias de los llamados antígenos de sus anticuerpos pueda reaccionar contra A^. con reactividad cruzada verdadera o de tipo 1. Por ejemplo, si sólo el 1% de los anticuerpos En los sistemas con anticuerpos monoclonales anti-A| (sin mencionarse las afinidades) reac­ es la única clase de inmunorreactividad cruza­ ciona con un epitope compartido por A^, puede da factible, a diferencia de lo que puede ocurrir decirse entonces que el antisuero es 100 veces con los sueros heterogéneos, según veremos. más específico para A, que para A,^. Un RIA Además, si definimos la especificidad como elaborado en estas condiciones arrojaría una una propiedad en cierto sentido inversa a la de recta paralela al eje de las abscisas, sin indicar reactividad cruzada, podemos considerar que desplazamiento perceptible para el antígeno A un anticuerpo homogéneo será específico hacia su antígeno homólogo A,, en presencia de un contaminante A^, cuando la relación RIA HETERÓLOGO sea suficientemente elevada. Se ha considerado que un valor > 10^ es aceptable en los casos co­ En los casos anteriores los anticuerpos y el munes para discriminar A, de A^. Para otras si­ trazador pertenecían a un sistema homólogo, tuaciones extremas (como la ya señalada para esto es, el anticuerpo monoclonal o el antisuero las hormonas séricas hGH y hCS que coexisten se habían inducido en una especie animal me­ en el embarazo en relación ~ 1:10^), ese índice diante un inmunógeno A, y el trazador también debe ser aun mayor si se desea determinar con se preparaba con el mismo antígeno (A,*). En un anticuerpo monoclonal “específico” el pri­ cambio, ahora definiremos como RIA “heterómer antígeno sin la interferencia del segundo. logo” aquel en el cual el trazador se sustituye por el del antígeno no idéntico, A^*, y el des­ plazamiento se efectúa con A^. Este modelo ha Reactividad cruzada con anticuerpos sido propuesto en ciertos casos en que tal com­ heterogéneos binación permite obviar dificultades de especi­ Hay dos tipos de heterogeneidad en pobla­ ficidad mostradas por el RIA normal u “homó­ ciones de anticuerpos heterogéneos: 1) respecto logo”. El caso más típico es el del sistema FSH de afinidades, y 2) respecto de la especificidad (hormona foliculoestimulante): anti-ESH, don­ por los determinantes. Si los anticuerpos son de estos últimos sueros suelen exhibir reactivi­ específicos por un único determinante pero he­ dad cruzada con otras glicoproteínas presentes terogéneos en afinidad, estamos en presencia en la misma especie, tal como la hCG (gonado­ de un caso de reactividad cruzada de tipo 1. Sin trofina coriónica). Los procedimientos de ab­ embargo, las curvas de desplazamiento no re­ sorción de los sueros con hCG para lograr una sultarán paralelas (fig. 39-9B). En ese modelo adecuada especificidad no suelen dejar sufi­ el tratamiento formal es bastante complejo y cientes anticuerpos de alta afinidad y realmente puede concluirse que no será válido comparar específicos para FSH. Eso probablemente se afinidades relativas en los puntos de (B/E)(/2. debe a que las regiones moleculares críticas pa­ De un RIA en estas condiciones a lo sumo pue­ ra la función hormonal de FSH son relativa­ de obtenerse una idea cualitativa con respecto a mente menos inmunogénicas que las regiones que la constante de afinidad promedio del com­ homólogas con otras hormonas glicoproteicas petidor A, es menor que la del antígeno A l. En de la familia. Cuando se aplica un RIA heteróeste principio se basa uno de los criterios nece­ logo con un trazador de igual hormona pero de

Inmunoanálisis radiométrícos

otra especie, se está seleccionando la población de anticuerpos de especificidad requerida. Se espera en ese caso que los anticuerpos exhiban también una afinidad suficientemente alta por el trazador, aunque por otro lado deba emplear­ se una concentración de suero mayor que para el RIA homólogo. Por ejemplo, un RIA para FSH humana empleando suero anti-FSH ovina y FSH humana marcada puede resultar tan es­ pecífico y sensible como un RIA homólogo ideal. La unión de la FSH humana a los anti­ cuerpos involucrados puede ser tan buena o mejor que la del trazador y por ende la curva de desplazamiento no sufrirá disminución en la pendiente asociada a cambios a la sensibilidad. D E T E R M IN A C IÓ N D E A N TIC U ER PO S

839

ra la masa de insulina en unidades de actividad biológica (lU = 41,67 |j.g). Luego es factible determinar la magnitud de la respuesta inmune humoral específica hacia la insulina de la tera­ pia sustitutiva en los diabéticos, en términos de BC y expresada en U de insulina fijables por li­ tro de plasma. Esta magnitud es más fácilmente interpretable por los médicos diabetólogos para estimar la relación entre la dosis de insuhna ad­ ministrada y la cantidad de anticuerpos poten­ cialmente secuestrantes de la hormona que el valor de q total, ya que éste representa un dato empírico de concentración molar de sitios en el tubo del RIA. Utilización del ensayo de unión de radioligando (RBA)

Los métodos radiométrícos para la determi­ nación de anticuerpos son varios. En esta sec­ ción nos ocuparemos del RIA en fase fluida clásico y de otras variantes relacionadas.

Cuando los sueros poseen muy bajas con­ centraciones de anticuerpos específicos hacia un antígeno macromolecular soluble y bien ca­ racterizado, puede utilizarse para la determina­ ción rápida de esos anticuerpos el llamado test de unión de radioligando o RBA (del inglés,

Utilización del RIA

Radiobinding Assay).

En los RIAs el componente que se determina habitualmente es el antígeno. No obstante, en ciertas ocasiones el objetivo analítico principal es la determinación de los anticuerpos específi­ cos para un antígeno en especial. Determinar los anticuerpos estrictamente significa ponde­ rar tanto los valores de concentración como los de afinidad. Pero en situaciones prácticas de la­ boratorio de inmunología muchas veces basta con tener una idea globalizada de “la potencia” de un suero, lo cual significa sencillamente te­ ner un título que incluye el producto de ambos tipos de parámetros. Ese dato emerge directa­ mente de la primera etapa del desarrollo de un RIA, como es la curva de calibración, según vi­ mos al comienzo. En cambio a veces puede re­ querirse la determinación de la concentración total de anticuerpos específicos en un volumen determinado de suero, lo cual debe derivarse del valor de q o Xqi molares calculados de un ensayo de desplazamiento y del análisis de Scatchard o sus equivalentes. Esta vía conduce en realidad a la concentración de los sitios de unión, según vimos, y de acuerdo al valor de la valencia (conocida o supuesta) se llega a la concentración de los anticuerpos. En ciertas circunstancias las convenciones utilizadas exi­ gen la transformación de los datos de q o q to­ tal en términos del antígeno unido. Tal es el ca­ so de la determinación de los anticuerpos antiinsulina por radiometría, utilizando como uni­ dad de expresión la capacidad de unión, o BC (de Binding Capacity). En estos casos además se requiere conocer el factor de conversión pa­

El RBA consiste en un ensayo de fase fluida en el cual se enfrentan los sueros, en una dilu­ ción convencional orientada por las necesida­ des, con una dosis fija de antígeno marcado ra­ diactivamente. Luego de la incubación, hasta alcanzar un estado cercano al de equilibrio, se procede a la separación de la marca unida y la marca libre por los medios habituales. El méto­ do más empleado es la precipitación de los an­ ticuerpos y de los complejos inmunes con PEG al 12,5%. Este tipo de ensayo radiométrico así conce­ bido posee un diseño idéntico al de la primera etapa del RIA (curva de calibración), aunque se ejecuta con una única dilución fija del suero. Es por ello que ocasionalmente se lo ha deno­ minado como “RIA”, en lugar de RBA. Es conveniente, no obstante, mantener la distin­ ción de nomenclatura entre ambos métodos, ya que el primero sirve en general para la determi­ nación de antígenos y en cambio el segundo se aplica para medir anticuerpos. En el RBA la expresión final de los resulta­ dos se efectúa en términos de porcentaje de marca unida, lo cual representa una unidad re­ lativa, dependiente de las condiciones experi­ mentales. En cambio, cuando se recurre al RIA para la determinación de anticuerpos específi­ cos, por tratarse de un ensayo e saturación con antígeno, las unidades de expresión son absolu­ tas e independientes de las condiciones experi­ mentales. FJ análisis teórico del RBA y su verificación experimental permiten conocer la relación exis­ tente entre la unión porcentual específica del

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Metodologías

trazador (B%) y la concentración de este últi­ mo. Ese análisis teórico puede simplificarse si lo asimilamos al del RIA, en particular comen­ zando de las curvas dosis-respuesta en térmi­ nos de B/F en función de concentración de an­ tígeno. Recordemos que la ecuación que des­ cribe esa relación para anticuerpos homogé­ neos es la (26). L,uego resta hallar una forma de conversión entre B/F y el B%, la cual se obtie­ ne de las siguientes relaciones: B% -f- F% = 100 y B%/F% = B/F. Combinándolas y despejando B% se obtiene la siguiente expresión:



(44)

la cual es semejante a la (20), donde el antíge­ no se expresa en %. A partir de la ecuación (44) podemos obte­ ner curvas de desplazamiento donde B/F es reemplazado por el B% y su expresión gráfica es como de la figura 39-3 C. Otra forma de ob­ tener estas curvas, más directa y aplicable aun a sistemas heterogéneos de anticuerpos, parte de la ecuación (29) resuelta para B como se ex­ plicó en ese punto y luego convirtiendo su va­ lor en B%. Si volvemos a la búsqueda de la relación en­ tre el B% y la concentración del trazador, vemos que ésta se halla comprendida en la relación ge­ neral entre el B% y la concentración de antígeno (esté o no marcado). Por lo tanto podemos reemplazar antígeno frío de las abscisas por an­ tígeno marcado e incluso invertir el sentido de la escala para expresar con mayor conveniencia la evolución de la AE para una actividad cons­ tante del trazador cargado en los tests. En la figura 39-10 se muestran las curvas del B% en función de la AE del trazador para dos sueros con diferente nivel de anticuerpos espe­ cíficos. Se observa que, cuando la AE aumenta (y por lo tanto desciende la concentración de antígeno marcado para una carga de actividad

AE (iiCi/,ug)

100 B% máx

100 B% = - ¡ -----+ 1

constante), el B% evoluciona sigmoidalmente. Por lo dicho anteriormente, se espera que este tipo de representación sea la imagen invertida de la curva de desplazamiento y que se alcance un valor plateau cuando el antígeno marcado tienda a concentración cero (o su equivalente: cuando la AE alcance cierto valor óptimo). El valor límite de la unión porcentual del tra­ zador (B%máx.) puede obtenerse de la ecuación (44) donde B/F se sustituye por su equivalente para antígeno infinitesimal, Kq (ecuación 25): i

(45)

-L + 1 B

Se observa que, en efecto, para una AE sufi­ cientemente alta (en general la que resulta de la incorporación de un átomo de por molécula de antígeno), el B%máx. no resulta función de la concentración del antígeno y sólo depende de la concentración y afinidad del anticuerpo. Para sistemas polielonales Kq se reemplaza en la misma ecuación (45) por 2 Kiqi. A diferencia de otras situaciones, donde el analito se detecta con máxima eficiencia utili­ zando un exceso del reactivo (como en el RIA, donde se satura a los anticuerpos con antígeno para determinar su concentración absoluta), en el RBA se requiere un infinitésimo del reactivo (el trazador) para lograr la máxima señal por­ centual relativa. Este concepto tiene otra deri­ vación: los cálculos de capacidad de unión (BC) no son factibles a partir del RBA (todo intento de cálculo de unión a partir del B% arrojará datos seudoabsolutos y de magnitud muy inferior a la real). Otra aplicación de la ecuación (45) es que a parür de ella se puede deducir cuál es el efecto de cambiar la concentración del suero en el test (o sea la concentración de anticuerpos específi­ cos). Para el sistema más sencillo de un anti­ cuerpo monoclonal, se deduce que la relación no es hneal. Esto es, si por ejemplo duphcamos la concentración de anticuerpo en el RBA

F ig . 39-10. Efecto en el R B A de la A E d el tra z a d o r (a d ic io n a d o c o n u n a a c tiv id a d c o n s ta n te de 10.000 cpm ) sobre la señal B % , re p re s e n ta d a p a ra dos su ero s de alto nivel (suero I) y de bajo nivel (suero 2) de anticuerpos antiinsulina.

Inmunoanálisis radiométricos

(q pasaría a ser 2q), la unión porcentual del tra­ zador puede no resultar duplicada (B% resulta­ ría distinto de 2B%). En realidad se puede veri­ ficar que si el B% inicial es cercano a cero, el incremento de q, n veces, repercute en la unión de tal modo que se alcanza el valor nB%. En cambio, si el B% inicial es cercano a 100% el incremento de q es nulo, lo cual resulta lógico por la saturación alcanzada por la señal del B% desde el inicio. Entre esos dos extremos se dan todas las situaciones intermedias. Una consecuencia práctica de este estudio teórico es qüe en el monitoreo de anticuerpos en muy bajo nivel, como en ciertos períodos de las enfermedades autoinmunes en que se ras­ trean autoanticuerpos hacia antígenos bien ca­ racterizados, deben utilizarse protocolos de RBA con la mínima dilución posible del suero. Además, deben efectuarse incubaciones a baja temperatura, para favorecer la mejor expresión de la afinidad (el mayor valor posible de K) y durante el tiempo necesario para permitir que se alcance un estado cercano al equilibrio (va­ rios días, según los casos, para que el B% sea el máximo posible). Sin embargo, el incremen­ to, de la concentración relativa del suero en el ensayo debe balancearse en la práctica con el aumento progresivo de la unión inespecífica. Este inconveniente puede sortearse de todos modos con la inclusión de ensayos de control, confeccionados con sueros normales. A pesar de tratarse de un ensayo de equili­ brio en fase líquida, donde por ende no inter­ vienen efectos de amplificación de la avidez como veremos más adelante, el RBA ha sido indicado como el método de elección para mo­ nitorear ciertos autoanticuerpos. El enzimoinmunoanálisis, que exhibe ventajas en otros sis­ temas de detección, ha demostrado menor pre­ cisión y sensibilidad en estos casos. Al menos cuando los anticuerpos son de afinidad mode­ radamente alta (en respuestas maduras contra antígenos macromoleculares), el RBA resulta más apropiado que los métodos enzimáticos al­ ternativos. Utilización del ensayo de titulación Otra forma de medir por radiometría los anti­ cuerpos específicos es la denominada “titula­ ción”. En realidad, no la consideraremos como una verdadera variante metodológica puesto que su principio es idéntico al de la etapa de calibra­ ción del RIA (una serie de diluciones del suero incubadas con la traza constante) o al del “RBA con varias diluciones”. El título se define luego como aquella dilución del suero que alcanza una unión convencional (generalmente B% = 50; véase la fig. 39-1) o, menos frecuentemente, una unión específica mínima arbitraria.

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A partir de todo lo discutido precedentemen­ te debemos enfatizar que el título de un suero es una función combinada de las concentracio­ nes y afinidades de todos sus anticuerpos espe­ cíficos. Si no se dispone de esos parámetros, determinables independientemente, no se pue­ de inferir solamente a partir del título si un sue­ ro dado es apropiado o no para determinados usos (por ej., para aplicarlo en un RIA de alta sensibilidad). Tampoco es un parámetro total­ mente válido para la comparación de dos sue­ ros con una misma especificidad. RIAs en sistemas bifásicos (RIAs en fase sólida) Una de las razones por las que han sido con­ cebidos los “RIAs en fase sólida” (RIA-ES) fue la de facilitar la separación de las fracciones li­ bre y unida. El modelo más sencillo consta de una matriz sólida (dextranos, celulosa, vidrio, papel, plásticos) a la cual se han adsorbido o unido químicamente los anticuerpos específi­ cos. Esta superficie activada se dispone en ge­ neral en forma de pequeñas esferas, discos o simplemente es la cara interna del propio tubo de reacción. En la figura 39-1 lA se muestra un esquema de la disposición de los componentes del sistema y de las operaciones sucesivas en un RIA-ES realizado en tubos plásticos. La separa­ ción de la marca unida a los anticuerpos de aquella que se halla libre en la solución se reali­ za, sin adiciones ni centrifugaciones, por medio de simple decantación o aspiración de la mezcla de reacción. Luego se cuenta la actividad unida a los tubos secos. Las ventajas de esta metodo­ logía son: la simplicidad, la rapidez, la omisión de etapas separativas sometidas al riesgo de error, el ahorro de reactivos y la susceptibilidad de automatización. Las desventajas de estos métodos son el comparativamente alto consumo de antisuero y la variación en las propiedades adsortivas de una misma sustancia entre las dis­ tintas partidas (aunque provengan de un mismo proveedor). Muchas veces, este último inconve­ niente se ha sorteado modificando la etapa de unión del anticuerpo al soporte mediante la aplicación de films de otros polímeros o a tra­ vés de la unión covalente de las inmunoglobuli­ nas a los plásticos con reactivos como el gluta­ raldehído o las carbodiimidas hidrosolubles. Los RIAs-ES se han optimizado ajustando empíricamente no sólo las condiciones de fija­ ción de los anticuerpos sino las de aquellas otras etapas críticas que constituyen el diseño básico: los lavados de exceso de antisuero, la cobertura de las superficies activadas con otras proteínas inertes, la reacción inmunoquímica propiamente dicha y los lavados finales antes de contar.

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Metodologías

Los aspectos teóricos relacionados con estos sistemas bifásicos de interacción han contem­ plado ciertos efectos de incremento en la afini­ dad aparente. Sobre todo en aquellos modelos donde se ha fijado el antígeno a la matriz sóli­ da, aparecen fenómenos de unión por puntos múltiples con anticuerpos que normalmente también son,bivalentes o multivalentes. Esas interacciones definidas como “monogámicas” conducen a uniones de carácter casi irreversi­ ble. Otro fenómeno que se suma al anterior está relacionado con la alta concentración efectiva local de sitios dispuestos en la superficie, com­ parado con el mismo número de sitios dispues­ tos en solución. Esta situación es observable aun con antígenos monovalentes frente a frag­ mentos Fab, también univalentes. Las conse­ cuencias de no respetar el principio básico por el que los reactivos del sistema deberían estar libremente distribuidos en solución, son las previsibles según otros modelos teóricos que no analizaremos aquí. Sólo debemos considerar que en estos casos los fenómenos de retención ejercidos por la alta concentración local de si­ tios de unión pueden conducir a erróneas inter­ pretaciones sobre los parámetros de interacción que intentan medirse. Variante del RIA-FS Una serie de variantes radioinmunoanalíticas en fase sólida han sido desarrolladas con dife­ rentes propósitos en el curso de las últimas dos décadas. Ello ha causado cierta confusión en la nomenclatura e incluso ha complicado el pano­ rama, pues esas variantes siguen pautas teóri­ cas, prácticas y de optimización que difieren respecto de las correspondientes al RIA clási­ co. Dentro de esas variantes hay un grupo de métodos que han sido designados genéricamen­ te como “inmunorradiométricos” y cuyo proto­ tipo es el “ensayo inmunorradiométrico de dos sitios,” o simplemente IRMA (de Immunoradiometric assay). El objetivo de este procedi­ miento es el uso de anticuerpos específicos so­ bre una fase sólida para extraer el antígeno de fluidos de donde se los purifica y concentra. Mientras el antígeno permanece unido, un se­ gundo anticuerpo marcado se une a otro sitio sobre el antígeno. Así pueden efectuarse deter­ minaciones del antígeno en función de la canti­ dad de anticuerpo marcado que se ha unido. Si los dos anticuerpos son diferentes, se aumenta considerablemente la especificidad del sistema. Otros procedimientos se basan en acoples suce­ sivos de este tipo y han sido designados con­ juntamente “técnicas en sandwich”. Según la variante empleada, si se fija primero el antíge­ no o el anticuerpo, o si se intenta detectar uno u

otro, cambian los nombres. Por ejemplo, si tan­ to los antígenos como los anticuerpos se detec­ tan a través de un anticuerpo antiinmunoglobulina marcado, se los denomina “métodos indi­ rectos”. Estos son los principios que se usan para la detección de inmunoglobulina E y de alérgenos en el diagnóstico de alergias atópicas. Los tests denominados “PRIST” y “RAST”, respectiva­ mente, se esquematizan en la figura 39-115 y 39-1IC. En estos casos los ensayos se optimi­ zan empíricamente y las dosis se expresan co­ mo unidades relativas de IgE respecto de están­ dares internacionales de referencia. Además de los RIAs-FS basados en el prin­ cipio de los “dos sitios” del antígeno, existen otros modelos de concepción semejante (anti­ cuerpo adsorbido a una matriz: antígeno: anti­ cuerpo) pero que funcionan de manera distinta. Eso ocurre cuando se dan las siguientes restric­ ciones: 1) con antígenos macromoleculares y antisueros heterogéneos, cuando tanto los anti­ cuerpos en la fase sólida como los de la fase lí­ quida reaccionan contra una misma área anti­ génica, o sea contra un mismo epitope o contra dos epitopes muy vecinos y excluyentes para interaccionar simultáneamente con dos anti­ cuerpos. Esta situación no es frecuente. 2) Cuando el antígeno es de pequeñas dimensio­ nes respecto de las áreas paratopes, de modo que la situación anterior es la única opción. 3) Cuando en forma independiente del antígeno, intervienen dos anticuerpos homogéneos selec­ cionados (un mismo anticuerpo monoclonal o dos de tipo excluyen te). En todos esos casos, si la molécula marcada es el antígeno, la unión de aquélla a la fase só­ lida por medio del anticuerpo adsorbido puede disminuirse competitivamente por la presencia del anticuerpo en la fase líquida. Este recurso puede explotarse para la determinación de los anticuerpos en la solución, ya que su potencia inhibitoria (determinada conjuntamente por concentraciones y afinidades) puede estimarse en relación inversa a la marca que subsiste en los tubos luego de la aspiración de sus conteni­ dos. REQUERIMIENTOS Los requerimientos básicos del RIA en su versión clásica son el anticuerpo específico, el antígeno marcado, el antígeno frío patrón y los componentes de la etapa separativa. Muchas de las especificaciones que deben cumplir estos elementos para lograr un RIA optimizado sur­ gieron durante la discusión teórica precedente. Nos limitaremos entonces a describir somera­ mente las fuentes, las formas alternativas de los

Inmunoanálisis radiométrícos F ig . 39-1 1. A , esq u em a del procedim iento RIA -FS en tu ­ bos plásticos desechables. B, p rin cip io del m étodo P R IS T (d el in g lé s : p a p e r d is k rad lo Iw m u ñ o so rh e n t test) p ara la determ inación de IgE total. C , p r in c ip io d e l m é to d o PR A S T o R A ST {paper disk radioallergosorhent test) para la determ inación de IgE espe­ cíficas.

Calibración de la adsorción

trazador (®) Antígeno (o) (Patrón desconoc.)

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Aspiración, lavado

IgE O

Disco de papeleen Anti-lgE unida

Suero 1 /2 -1 /1 0

Incubación lavado

Adición de '^'^l-Anti-lgE

Incubación lavado, conteo

IgE E s p e ^ ^ a j-^

O E I3

Disco Inespecífica de papel con alergeno Suero unido

componentes y a recapitular sus propiedades descollantes. Los anticuerpos específicos En el sentido más amplio, la sustancia ligan­ te específica puede pertenecer a un sistema no inmune. Por ejemplo, puede tratarse de un re­ ceptor celular, de un transportador plasmático de hormonas, de una enzima, etc. En ese caso, en lugar de antígeno el ligando puede cambiar de nombre (p, ej,, sustrato) y el ensayo también (radioensayo competitivo). Limitándonos al ejemplo típico del RIA, las macromoléculas li­ gantes son las inmunoglobulinas específicas in­ ducidas por uno o más antígenos en animales de experimentación. Los programas de inmuni­ zación se aplican a diferentes especies anima­ les, a veces seleccionadas por las diferencias estructurales conocidas del antígeno respecto de los componentes propios, si ése es el caso. El inmunógeno puede administrarse emulsio­ nado con adyuvante de Freund directamente, o previa conjugación a un soporte que incremen­ ta sus propiedades estimulantes.

Adición de '25|-Anti-lgE

Los regímenes de inmunización varían bas­ tante según las distintas recomendaciones, pe­ ro en general emplean la inyección subcutánea de las emulsiones en multisitios de patas y lo­ mo de los animales. En lo posible se usan lotes con un buen número de animales. Los interva­ los de inyección suelen ser de 2 a 3 semanas. El adyuvante de Freund completo suele em ­ plearse sólo en la primera inyección, luego se usa el incompleto. Las dosis de inmunógenos suelen ser sufi­ cientemente bajas. Por ejemplo, para hormo­ nas proteicas alrededor de 10-100 |.ig por vez y por animal. Eso está motivado por la necesi­ dad de inducir selectivamente los clones de linfocitos productores de anticuerpos específi­ cos de alta afinidad. Cantidades superiores a 1 mg pueden inducir, además de posibles fenó­ menos de tolerancia o parálisis inmune según los casos, una inducción de anticuerpos de ba­ ja afinidad. Luego de períodos de no inoculación (3-6 meses) suelen hacerse reinmunizaciones con efectos notables en los títulos de anticuerpos. Mediante sangrías exploratorias y ensayos con

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Metodologías

trazadores radiactivos pueden controlarse los títulos periódicamente. El criterio final de se­ lección de los sueros será, según se discutió ampliamente, el de un ensayo para la afinidad. Éste puede ser poco elaborado, observándose empíricamente la dosis mínima detectada, rela­ cionada con la pendiente inicial de la curva de desplazamiento. Con estos ensayos puede indi­ carse el descarte de los animales (sueros con baja afinidad) o la prosecución de las inmuni­ zaciones (sueros con apropiada afinidad pero bajos títulos). Muchos sueros suelen usarse en diluciones finales de 10'^-10'’, por lo cual pue­ den conservarse sin diluir congelados, o en di­ luciones de reserva (-1/1.000) efectuadas con sueros no reactivos al 1-2% y con conservado­ res (timerosal 1/5.000). De este modo se pre­ servan los anticuerpos diluidos de la adsorción a los tubos de plástico o vidrio. También pueden usarse anticuerpos purifi­ cados parcialmente por precipitación de las in­ munoglobulinas o específicamente por croma­ tografía de afinidad. Sin embargo, algunas ventajas respecto de la homogeneidad de los anticuerpos, contabilizando sólo la especifici­ dad, se dan en los anticuerpos monoclonales surgidos de la tecnología de los hibrídomas. Por otro lado, si se considera la afinidad apa­ rente, relacionada a la sensibilidad de los RÍAs, los sistemas que combinan dos anticuer­ pos monoclonales apropiados o sueros policlo­ nales, pueden presentar sensibles ventajas, se­ gún se mencionó. Los antígenos marcados Como se ha analizado exhaustivamente, el trazador como componente crítico del RIA consiste en una cantidad minúscula del antíge­ no radiactivamente marcado. Se recomienda la adición de aproximadamente 10.000 cuentas por minuto (error estadístico de conteo del 1%). El porcentaje de error de conteo se obtie­ ne de la relación: error% = 100/Vcuentas. Así, para los puntos de la curva donde las cuentas han descendido a 1.000 cpm, el error es del 3,2%. Si se comparan esas magnitudes con los errores de pipeteo, separación, etc., se observa que los errores estadísticos debidos al conteo son de mínima influencia. De este modo se per­ mite la detección del antígeno marcado en el nivel de los picogramos en la etapa final del ensayo. En los trazadores marcados para los fi­ nes del RIA se ha incorporado un nucleido que espontáneamente emite partículas o radiación electromagnética, cambiando la composición de su núcleo (radionucleido). Son muy pocos los elementos radiactivos naturales (’^'C, ‘‘“K, ^^'’Ra), de modo que los radionucleidos de inte­ rés son preparados artificialmente por irradia­

ción. De todos ellos, los más útiles para el RIA son los isótopos del iodo, *^^I y ‘^*1, aunque en particular el primero presenta especiales venta­ jas, según comentaremos. Otros isótopos ocasionalmente usados son los siguientes: ^'“’Se, “’^Co (vitamina B^^) y '^‘T e. Para RIAs de algunos esteroides se ha emplea­ do Tritio (^H), el cual no provoca los cambios estructurales que ocasiona la marcación con '251. El Tritio (t|/2 , 12,25 años) y el '^C (1,^^ 5.736 años) son emisores ¡3 (electrones); con ellos se alcanzan menores actividades específi­ cas y deben ser contados en un contador de centelleo líquido, lo cual representa alguna des­ ventaja respecto de los isótopos que se cuentan en contadores gamma. Precisamente, el es el isótopo de elección en muchos casos por presentar alta actividad específica en conjun­ ción con su carácter de emisor de rayos gamma de baja energía. Además, otra ventaja radica en la relativa simplicidad con la que se incorpora a residuos de tirosina e histidina en péptidos y proteínas. El '^'I que goza de las mismas pro­ piedades químicas fue el isótopo de elección en los primeros años del RIA. Teóricamente, el ‘^'I otorgaría una mayor actividad específica a las moléculas a las que se incorpora respecto del según se deduce de los valores de t,^ (8,07 días y 60,14 días, respectivamente) apli­ cados en la ecuación (24). Pero ocurre que el '^’I suele proveerse con una pureza del 15-30% (el resto es '^’I) en comparación con la del que es cercana al 100%. Además, en los conta­ dores gamma comunes la eficiencia para el '^*1 es menos de la mitad respecto de la del (7075%). Todo ello hace que para la misma con­ centración molar de ambos isótopos las cuentas leídas sean aproximadamente del mismo orden. Además, el '^'I junto a la emisión gamma pro­ duce una fuerte emisión beta que causa más rá­ pidamente un daño por radiación a los materia­ les biológicos. Por todas esas razones, el resulta el isóto­ po más conveniente. A pesar de ello, deben considerarse ciertos fenómenos inherentes a la marcación con ese isótopo y, en cierta medida, los vinculados al grado de incorporación a las moléculas de antígeno. Éstos son: 1) la dismi­ nución de la inmunorreactividad debida a la “catástrofe por decaimiento”. La energía libera­ da es suficiente como para efectuar escisiones moleculares; 2) el daño ocasionado al antígeno durante la marcación y purificación (daño de preparación) y 3) el daño producido durante la reacción inmunoquímica en medios con proteí­ nas plasmáticas (daño de incubación). Este últi­ mo es causado por enzimas proteolíticas sobre los trazadores susceptibles. El principio de marcación con (“iodación”) se basa en la oxidación de por me­

Inmunoanálisis radiométricos

dio de oxidantes apropiados.* Probablemente se genera iodo atómico con la siguiente trans­ formación a iones iodonio ('^^1''). El agente oxi­ dante más conocido es la Cloramina-T, intro­ ducida por Hunter y Greenwood en 1962, la cual genera ácido hipocloroso. Por su inestabi­ lidad sus soluciones deben prepararse a último momento. Junto con la sustitución electrofílica del iodo en los anillos de tirosina, o a veces de histidina, se puede producir la oxidación de re­ siduos de cisteína y de metionina por parte de ese enérgico oxidante. El empleo de protocolos de “Cloramina-T limitante” permite disminuir las oxidaciones indeseadas. Los cambios conformacionales que pueden generarse en el antí­ geno son entonces debidos al iodo y a las posi­ bles reacciones paralelas, si éstas no son mini­ mizadas. Suele emplearse un agente reductor para detener la reacción. El más comúnmente usado es el metabisulfito de sodio. El iodo se incorpora a pH óptimo (7-7,8) en las tirosinas (posición 2 o 2 y 6) y a pH 8,4-9 en las histidinas. Cuando el residuo modificado es en particular el de un hapteno, el incremento del tamaño molecular puede ser considerable, ya que el iodo posee un volumen semejante al del anillo bencénico. Un diiododerivado triphcará entonces el volumen del grupo original. Además, el oxhidrilo fenólico es más disociable por el efecto de disminución de su pKa. Es­ tos efectos pueden resultar críticos para las mo­ léculas pequeñas como la de los esteroides. El resultado final observable podría ser un cambio apreciable en la afinidad de los anticuerpos ha­ cia el trazador respecto del antígeno inmodificado. A pesar de los inconvenientes mencionados, la cloramina-T es el oxidante más usado por su simplicidad. Otros métodos oxidativos emplean lactoperoxidasa con adición directa de HjOj o con producción enzimática (glucosa oxidada/ P-D glucosa), u oxidantes como el iodogen, etc. Para péptidos o antígenos no peptídicos que no poseen residuos tirosilo o histidilo se ha empleado el reactivo de Bolton y Hunter. Este

* H ay que tener en cuenta que para la utilización de isó to ­ pos radiactivos deben seguirse las norm as oficiales que re­ gulan su em pleo. En especial para la preparación de com ­ puestos radioiodados se requieren adecuadas instalaciones, equipam iento y la participación de personal habilitado. Ei principal problem a del constituye la volatilidad de su form a elem ental, sobre todo en las soluciones ácidas. La glándula tiroides resulta la principal captadora luego de su inspiración accidental. Se deben tom ar especiales precau­ ciones en la etapa de extracción del Na'^^l (en m edio alca­ lino) y d urante la oxidación. Luego no existen m ayores riesgos en la m anipulación de las cantidades habituales en el RIA . El em pleo de los “kits” com erciales im plica el uso de actividades bajas en todo m om ento, las cuales pueden m aniobrarse con razonable seguridad.

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reactivo se marca previamente con ‘“ I y luego luego se conjuga a los antígenos a través de grupos amino de este último. Luego de la marcación es casi siempre nece­ sario purificar los antígenos marcados de los productos de reacción y de las moléculas daña­ das, Los métodos más empleados son los de fil­ tración en Sephadex, los basados en adsorción (columnas de celulosa) y los electroforéticos. Ultimamente se han desarrollado métodos muy refinados basados en electroforesis en geles discontinuos o multifásicos de poliacrilamida, en intercambio iónico y en cromatografía líqui­ da de alta resolución (HPLC de fase reversa). Con ellos se logra para ciertos antígenos protei­ cos la preparación de monoiododerivados ho­ mogéneos (un solo residuo tirosilo modificado e identificable). Los ejemplos más sobresalien­ tes son los de trazadores homogéneos de la in­ sulina: mono ’^^l-insulina modificada en su re­ siduo tirosilo número 14 o número 19 de la ca­ dena polipeptídica A (designados “A14” y “A19”, respectivamente) o número 26 de la ca­ dena B (“B26”). Estos trazadores poseen varias ventajas, entre las cuales se destacan: 1) propiedades inmunoquímicas inalteradas o al menos uniformes; 2) gran estabilidad (más de 6 meses de vida útil); y 3) declinación conocida de la actividad espe­ cífica a través del tiempo. Este tipo de trazador se prepara incorporando iiiicialmente relaciones bajas de por molécula de antígeno (-0,1 átomo/molécula), que se logra mediante el ex­ ceso relativo del antígeno respecto del Luego, la etapa de purificación elimina no sólo los componentes inútiles de la reacción, sino que separa las moléculas no marcadas y las for­ mas iodadas entre sí. Entre estas últimas están las monoiodadas en distintas posiciones (que presentan diferencias sutiles en su conducta ió­ nica) y cantidades bajas de diiodo y poliiodo derivados. Los monoiodo derivados poseen teó­ ricamente la alta actividad específica inicial que prevé la ecuación (24). Obsérvese que la activi­ dad específica inicial de la mezcla de reacción era 10 veces menor (método subestequiométrico). Si esos productos se purifican sólo por fil­ tración en geles, resultan heterogéneos y su ac­ tividad específica calculada es la del promedio (además representa un valor relativo bajo). Co­ mo ya se analizó, eso puede tener consecuen­ cias negativas en la sensibilidad de los ensayos. En cambio, serán trazadores estables, pues la baja incidencia de diiodo derivados generará pocas moléculas dañadas y radiactivas. Éstas son causadas por la desintegración de uno de los átomos y la persistencia muy probable de la marca debida al otro átomo. Si se intenta elevar desde el inicio la activi­ dad específica por la incorporación de un áto­

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Metodologías

mo de '“ I por molécula (método estequio métri­ co) se obtendrá ese valor en promedio con una distribución estadísdca de moléculas hiperiodadas y otras menos iodadas y frías. Estos traza­ dores son útiles desde el punto de vista de la sensibilidad en los RIAs, pero resultan inesta­ bles y muestran elevado daño a los pocos días de guardados, aun a ~~20'’C y diluidos. Los monoiodo derivados exhiben ambas propiedades a la vez: alta .actividad específica y alta estabihdad, dos características que se contraponen en los trazadores convencionales o clásicos. De todo lo mencionado surge que es necesa­ rio efectuar controles de cahdad sobre los tra­ zadores. Los más comunes son: 1) el test de unión a anticuerpos en diluciones conocidas de estos últimos (establecidas mediante calibra­ ciones con trazadores anteriores); 2) el test de daño por radiólisis por métodos electroforéticos o cromatográficos, y 3) la determinación de la actividad específica por técnicas de autodesplazamiento. Estas a veces incluyen el control de corrección por la máxima inrnunorreactividad real, puesto que parte de la marca puede estar incorporada a moléculas no antigénicas. Puede obtenerse una medida de la eficiencia de la marcación y una estimación aproximada de la actividad específica por métodos directos y sencillos cuando se purifica la mezcla de marcación mediante columnas de Sephadex. En esos casos se integran los valores de activi­ dad en el pico correspondiente a la proteína (x) y se hace lo propio con el pico correspondiente a la fracción de ioduro no incorporada (y). El cálculo de eficiencia se hace a partir de la rela­ ción x/(x + y) y el de la actividad específica promedio se obtiene de la relación x/masa de proteína marcada. En ese caso, x se expresa usualmente en jO,Ci y ia masa en |ag. Los patrones de antígeno frío Se recuerda que para validar los procedi­ mientos radioinmunoanalíticos los antígenos de los estándares deben ser inmunoquímicamente idénticos a los de las muestras desconocidas. En cambio, no se requiere su identidad química o en términos de potencia biológica. Para los fines comparativos es necesario que los distin­ tos laboratorios posean preparaciones de refe­ rencia comunes y accesibles al uso general. Cuando esos casos no se dan, debe contarse al menos con muestras de concentración conocida para evaluar las soluciones desconocidas. La estabilidad y las especificaciones para la conservación de cada tipo de sustancia patrón deben seguirse según las recomendaciones que se difunden. En cambio, es un requisito genera­ lizado el empleo de proteínas inertes o deter­ gentes no iónicos para prevenir la adsorción de

los antígenos patrones. En efecto, debido a las altas diluciones de las soluciones patrones en stock (20 ng/ml-1 |J,g/ml), y diluidas aun más durante los ensayos, se produciría su firme ad­ sorción a los recipientes y tubos de vidrio o plástico. Técnicas separativas En muy raras ocasiones la separación de los antígenos libre y unido se logra directamente por precipitación espontánea de los inmunocomplejos durante una simple centrifugación. Esto ha sido mencionado por ejemplo para el antígeno australiano debido a sus dimensiones y concentración en los ensayos. En el caso de antígenos más pequeños o diluidos, como acontece para las hormonas plasmáticas, los complejos inmunes permanecen en solución. Por ende, se han desarrollado una serie de téc­ nicas separativas basadas en distintos princi­ pios y ejecutados según diferentes variantes. En el cuadro 39-2 se compendian las técnicas aplicadas comúnmente. Las más frecuentes son las técnicas de carbón (Norit A), las de polieti­ lenglicol, las de fijación de anticuerpos a fase sólida y las de doííle anticuerpo (precipitación de los complejos inmunes por un antianticuer­ po). Las ventajas y hmitaciones de cada una de ellas no son tan definidas como para favorecer a una en particular. Respecto de esta etapa final de los RIAs puede comentarse que es factible contar una o ambas fases. En general, se recomienda contar sólo una de ellas por razones de practicidad y sin hacer concesiones apreciables a la precisión de las medidas. Puede aconsejarse contar, por ejemplo, la fracción unida cuando ésta repre­ senta menos del 50% de la actividad total. Para los trazadores con emisión beta se prefiere con­ tar los sobrenadantes (marca unida o libre, in­ distintamente), pues los precipitados son difir cultosos de suspender o disolver en los fluidos de centelleo. OTRAS TECNICAS RADIOMETRICAS Marcación nietabólica de proteínas e inmunoprecipitación La marcación metabólica de proteínas segui­ da de la inmunoprecipitación específica es un método de considerable utilidad en varios cam­ pos de la biología experimental, por lo cual ha­ remos una somera descripción de esa estrategia. La marcación metabólica comprende la sus­ titución de átomos naturales, frecuentemente de las proteínas, por isótopos radiactivos que se incorporan durante la biosíntesis natural. El

Inmunoanálisis radiométricos

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Cuadro 39-2. Técnicas empleadas en radioinmunoensayo para la separación del antígeno en sus formas líbre y unida a anticuerpos A ntígeno Variante

P rincipio P recipitación de com ­ plejos antígeno-anti­ cuerpo

Libre

Unido

D oble anticuerpo Polietilenglicol S olventes orogénicos

-alco h o l -d io x a n o

|

Sobrenadantes

Precipitados

Precipitados

S obrenadantes

Fase líquida

Fase sólida

Precipitación salina A dsorción de antígeno libre a m ateriales só­ lidos

Carbón

- S in tratam iento -R ec u b ierto con dextrano, albú­ m in a ficoll, etc.

C elulosa

-P o lv o