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INFORME DEL PROYECTO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Cultivo in vitro de lenteja Lens culinaris m.

Realizado por: Karina Quishpe y Magaly Zumba Julio del 2014

TABLA DE CONTENIDO

1.

OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 4 1.1

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 4

2.

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 4

3.

JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 4

4.

MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 5

5.

6.

4.1

Descripción botánica de Lens culinaris m. ................................................. 5

4.2

Requerimientos del cultivo en campo ........................................................ 5

4.3

Variedad...................................................................................................... 5

4.4

Generalidades del cultivo in vitro............................................................... 5

MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 6 5.1

Limpieza de lugar de trabajo y esterilización de insumos .......................... 6

5.2

Formulación del medio de cultivo .............................................................. 6

5.2.1

Medio de cultivo 1 (M1): Medio de coco ................................................. 7

5.2.2

Medio de cultivo 2 (M2): Medio de plátano y tomate .............................. 7

5.2.3

Medio de cultivo 3 (M3): Medio de papa ................................................. 8

5.3

Protocolo de Esterilización ......................................................................... 8

5.4

Siembra del material vegetal ...................................................................... 9

DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................ 9 6.1

Variables ..................................................................................................... 9

6.2

Factores de Evaluación ............................................................................... 9

6.3 7.

Población y muestra ................................................................................... 9

RESULTADOS .............................................................................................................. 10 7.1

Contaminación de medios de cultivo........................................................ 10

7.2

Contaminación de medios de cultivo en Repetición 6 ............................. 10

7.3

Resultados por variables de estudio.......................................................... 11

8.

DISCUSIÓN ................................................................................................................... 11

9.

CONCLUSIONES .......................................................................................................... 13

10. ANEXOS ........................................................................................................................ 14 10.1 Cronograma de actividades ...................................................................... 14 10.2 Resultados de la primera revisión ............................................................. 14 10.3 Recopilación de fotos ............................................................................... 15 10.4 ESCALADO ............................................................................................. 16 10.4.1

Información del cultivo para escaldo ...................................................... 16

10.4.2

Esquema del cultivo in vitro propuesto para la especie .......................... 16

10.4.3

Cálculo de escalado para la producción anual requerida ........................ 18

10.4.4

Cronograma propuesto ............................................................................ 20

11. Referencias ...................................................................................................................... 21

TABLA DE ILUSTRACIONES Figura 1. Esquema del cultivo in vitro ..................................................................... 6 Figura 2. Contaminación de medios de cultivo en porcentaje ............................... 10 Figura 3. Gráfico de contaminación de medios de cultivo .................................... 10 Figura 4. Contaminación en medios de cultivo ..................................................... 10 Figura 5. Resultados por variable de estudio ......................................................... 11 Figura 6. Tamaño en cm de plántulas en medios de cultivo 1 y 3 ......................... 11 Figura 7. Cronograma del proyecto ....................................................................... 14 Figura 8. Tabla de resultados de la primera revisión ............................................. 15 Figura 9. Información de la planta ......................................................................... 16 Figura 10. Esquema propuesto para el cultivo ....................................................... 16 Figura 11. Datos de escalado ................................................................................. 18

1.

OBJETIVO GENERAL

 Conocer y aplicar los diferentes procedimientos para el cultivo in vitro de la lenteja (Lens culinaris) 1.1

OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Desarrollar dos formulaciones para los medios de cultivo  Determinar un protocolo de desinfección efectivo para el tipo explante  Aplicar las técnicas aprendidas para la siembra in vitro de semillas.  Determinar mediante este ensayo la viabilidad del cultivo in vitro de la especie escogida.

2.

INTRODUCCIÓN

La lenteja es una leguminosa muy cultivada alrededor del mundo y Latinoamérica, que constituye una fuente de proteína de bajo coste y de fácil disponibilidad en la dieta diaria de gran parte de la población descrita. Su cultivo aporta positivamente a la fijación de nitrógeno atmosférico en los suelos, gracias a su simbiosis con Rhizobium durante su desarrollo en el campo, creando un micro hábitat en los lugares donde se cultiva (Alonso, 1980). Con respecto a estudios de su micropropagación, son relativamente pocos. El primer estudio fue desarrollado y publicado en 1979 por Bajaj y Dhanju, haciendo pocos aportes a su desarrollo. En 1989 se realizaron los primeros ensayos para regeneración de brotes con kinetina, aunque los resultados fueron bastante pobres debido a la fragilidad de las plantas obtenidas. Los últimos estudios realizados fueron publicados por (Fratini Richard, 2002) donde se cultiva in vitro lenteja, y además se estudiaron las influencias de las citoquininas en el enraizamiento.

3.

JUSTIFICACIÓN

La importancia del cultivo in vitro de la especie radica en su rizosimbiosis (Fratini Richard, 2002), que puede utilizarse de forma benéfica en otros cultivos con altos requerimientos de nitrógeno. Para lo cual es necesaria la producción de plantas libres de patógenos que no representen riesgos para la asociación directa (Peñaloza, 2014).

4. 4.1

MARCO TEÓRICO

Descripción botánica de Lens culinaris m. Es una planta de cultivo anual y de porte erecto, su tallo es delgado y llega a alcanzar una

altura aproximada de 20 a 50 cm. Las hojas están formadas por un raquis en donde se insertan más de 15 foliolos, las flores son de pequeño tamaño con dos tipos de coloraciones; blanca o azul y sus frutos de forma romboidea, con un tamaño de 7 a 20 mm donde se encuentra en el interior la semilla o semillas (como máximo dos). Tiene gran importancia alimenticia por su aporte proteínico y en los agroecosistemas; atraves de la fijación de nitrógeno atmosférico en simbiosis con la bacteria Rhizobium; durante su crecimiento en campo. 4.2

Requerimientos del cultivo en campo Este cultivo necesita un periodo libre de heladas de al menos 110 días para su periodo de

madurez. Se adapta a una amplia gama de suelos, desde los más ligeros a los más pesados, con pH comprendidos entre 5,5 a 9,0 (Moreno, 2004). Requiere temperaturas medias entre los 5 y 28 °C durante su desarrollo y crecimiento vegetativo, (Ramos, 1996) y se puede cultivar en rangos de 100 a 3.200 msnm (Herrera, 2014). 4.3

Variedad Existen tres variedades de lenteja y la utilizada en este ensayo es el lentejón o “lenteja

reina”; Lens culinaris Medicus, var. vulgaris, son semillas de 6 a 7 mm de diámetro y color verde amarillento (Herrera, 2014).

4.4

Generalidades del cultivo in vitro El cultivo de tejidos puede definirse como un conjunto muy heterogéneo de técnicas, en el

que un explante o semilla, se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida, y se incuba en condiciones ambientales controladas. Es común dividir las técnicas del cultivo en dos grandes grupos: cultivos en medios semisólidos y cultivos en medios líquidos, que pueden ser agitados o estacionarios. También se pueden dividir atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento del cultivo es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el material vegetal, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación. La aclimatación de las plantas regeneradas in vitro, también es de gran importancia en la mayoría de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura (Levitus, 2013).

5.

MATERIALES Y MÉTODOS

El siguiente esquema ejemplifica el proceso de introducción al medio de cultivo de la

Elección de material vegetal: semillas

determinación de fórmulas de medios de cultivo M1, M2 y M3 determinación de protocolo de desinfección

protocolo de desinfección para semillas

esterilización de insumos y área de trabajo

preparación, dispensa en frascos y esterilización de medios de cultivo

introducción al medio de cultivo

especie seleccionada Figura 1. Esquema del cultivo in vitro

5.1

Limpieza de lugar de trabajo y esterilización de insumos  las superficies se lavarán con agua y jabón previamente  se desinfectarán con una solución de alcohol al 80%  los insumos como: material de vidrio, recipientes, pinzas, agujas y demás serán esterilizados por calor húmedo en olla de presión por 15 minutos

5.2

Formulación del medio de cultivo Para el establecimiento del cultivo in vitro se desarrollaron 3 formulaciones de medio de

cultivo que se describen a continuación.

5.2.1 Medio de cultivo 1 (M1): Medio de coco  100g de pulpa de coco  10 g de agar-agar  15 g de azúcar.  900 ml de agua destilada.  1,2 g Tiamina Preparación y esterilización del medio de cultivo. 1. Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de pulpa, 1 g de azúcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se añaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plástico hasta disolver todos los componentes. 2. Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos 3. Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de más o menos 1 centímetro (45 a 50 ml).

5.2.2 Medio de cultivo 2 (M2): Medio de plátano y tomate  80 g maicena  100 g por litro de guineo maduro  50 cc de agua de coco  100 g por litro de tomate riñón  1 cc de abono foliar  20 g por litro de azúcar Preparación y esterilización del medio de cultivo 1. Cocinar por 15 minutos en 400 cc de agua el tomate riñón y el guineo maduro, licuar y tamizar 2. Cocinar en 5 minutos la maicena en 500 cc 3. Poner el resto de ingredientes en un recipiente con capacidad de un litro y aforar con lo preparado anteriormente 4. Homogeneizar y licuar 5. Esterilizar en olla de presión

5.2.3 Medio de cultivo 3 (M3): Medio de papa  200 g de papa  10 g de gelatina  1000 cc de agua Preparación y esterilización del medio de cultivo 1. Cocinar la papa previamente pelada hasta que esté ligeramente suave 2. Guardar el agua de cocción y sobre esta colocar el agente gelificante 3. Dispensar en cada frasco 4. Esterilizar en olla de presión

5.3

Protocolo de Esterilización

El protocolo de esterilización definido es el siguiente.  50 ml solución de jabón líquido al 5%  50 ml de solución de hipoclorito de sodio al 3%  50 ml Solución de alcohol al 10%  50 ml de agua oxigenada 1. Elaborar una bolsa que porte las semillas a esterilizar con papel filtro 2. Sumergir el material por 5 minutos en la solución de jabón y enjuagar 3. Sumergir el material por 3 minutos en agua oxigenada y enjuagar 4. Sumergir el material por 10 minutos en la solución de cloro y enjuagar 5. Sumergir el material por 2 minutos en la solución y enjuagar 6. Mantener en un recipiente esterilizado previamente y con agua destilada, hasta su uso que debe ser inmediato

5.4

Siembra del material vegetal

El procedimiento para la siembra de las semillas fue el siguiente. 1. Una vez las superficies estén limpias se encenderá una vela o mechero al lado del lugar de trabajo 2. Con una pinza previamente esterilizada se tomará cada semilla y se introducirá en el recipiente que contiene el medio 3. Se repite el procedimiento hasta sembrar todo el material 4. Colocar en un lugar fresco y seco, alejado de la iluminación directa del sol

6. 6.1

DISEÑO EXPERIMENTAL

Variables  Respuesta del cultivo a la introducción in vitro  Crecimiento de semillas en medio de cultivo  Contaminación de unidades experimentales  Desarrollo comparativo del material vegetal en los medios de cultivo propuestos

6.2

Factores de Evaluación  Contaminación de medio de cultivo (No. y %)  Contaminación de unidades experimentales (No. y %)  Unidades experimentales que presenten respuesta de crecimiento (No. y %)  Tamaño en centímetros de la planta (cm)

6.3

Población y muestra  Población: 12 unidades experimentales con medio de cultivo y 1 semilla sembrada  Muestra: cada unidad experimental, frasco de vidrio

7.

7.1

RESULTADOS

Contaminación de medios de cultivo INTRODUCCIONES CONTAMINACIÓN M1 CONTAMINACIÓN M2 CONTAMINACIÓN M3

1 100% 100%

2 100% 100%

3 70% 85%

4 55,30% 70% 60%

5 20,44%

6 16,67%

35,30%

33,33%

Figura 2. Contaminación de medios de cultivo en porcentaje

Contaminación de medios de cultivo Porcentaje de contaminación

120% 100% 80% CONTAMINACIÓN M1

60%

CONTAMINACIÓN M2

40%

CONTAMINACIÓN M3 20% 0% 0

1

2

3

4

5

6

Número de introducciones Figura 3. Gráfico de contaminación de medios de cultivo

7.2

Contaminación de medios de cultivo en Repetición 6 FASE

Formulación de Medios de cultivo

Medio de cultivo

Contaminación

Número de medios contaminados

Porcentaje

M1 M2 M3

X X X

1 6 2

16,67 100 33,33

Figura 4. Contaminación en medios de cultivo

Resultados por variables de estudio FASE

Introducción al cultivo in vitro

Medio de cultivo

No. de UE contaminadas

Porcentaje de UE contaminadas

No. de UE con respuesta de crecimiento

Porcentaje de UE con respuesta de crecimiento

Tamaño en cm

M1 M3

1 2

16,67 33,33

5 4

100 100

3,8 3,5

Figura 5. Resultados por variable de estudio

Crecimiento en los medios de cultivo 3.9 3.8

Tamaño en cm

7.3

3.7 3.6 Tamaño en cm

3.5 3.4 3.3 1

2

Medios de cultivo Figura 6. Tamaño en cm de plántulas en medios de cultivo 1 y 3

8.

DISCUSIÓN

 Se realizaron 6 introducciones con 12 unidades experimentales. Cada unidad experimental consta de un frasco de vidrio con tapa y una semilla sembrada en condiciones de asepsia. Por la cantidad de pérdidas, se evaluó la contaminación de los medios de cultivo dispensados en primera instancia, y la contaminación de las unidades experimentales. Hasta la cuarta introducción la contaminación de los medios fue mayor al 50% del total, por tanto se reformularon y se cambiaron los frascos de plástico por frascos de vidrio esterilizados. En el caso del medio número 2 se prescindió de su uso debido a la alta contaminación en todas las repeticiones, reemplazándolo con un medio constituido por papa principalmente, como consta en la fórmula descrita con anterioridad. Con estas

medidas se logró reducir la contaminación al 16,7% en el medio 1 y 33,33% en el medio 3.  Como no se podía atribuir a la contaminación únicamente a la formulación y procesamiento de los medios de cultivo, se modificó el protocolo de desinfección aumentando un componente, el agua oxigenada y aumentando los tiempos de inmersión de las semillas.  En la repetición número 6 se redujo considerablemente las pérdidas, siendo solamente 3 contaminadas de las 12 unidades experimentales. La respuesta de crecimiento fue positiva en todas y crecieron un promedio de 3,6 cm hasta su última medición. Por el tamaño muestral no puede demostrarse que exista una diferencia significativa en el crecimiento de las plantas, con respecto a los medios de cultivo utilizados.

9.

CONCLUSIONES

 El cultivo in vitro de lenteja es relativamente sencillo, ya que el material vegetal escogido, es decir las semillas, tuvieron respuesta positiva a las condiciones planteadas para este estudio  El protocolo de desinfección y la formulación del medio de cultivo son determinantes para obtener una respuesta positiva de crecimiento  Los factores que conducen a la pérdida parcial y total de las unidades experimentales están directamente relacionados con el procesamiento del material vegetal y de los demás insumos para establecer el cultivo, por tanto es necesario estandarizar los procesos con el fin de reducir los errores humanos  El tamaño muestral debe ser más significativo para poder establecer una diferencia concreta en la eficiencia de los medios propuestos con respecto al crecimiento.

10. ANEXOS

MES: Abril ACTIVIDADES

MES: Mayo

MES: Junio

MES: Julio

Semana 1

Semana 2

semana 3

semana 4

Semana 1

Semana 2

semana 3

semana 4

Semana 1

Semana 2

semana 3

semana 4

Semana 1

Semana 2

semana 3

semana 4

07 al 13

14 al 20

21 al 27

28 al 04

05 al 11

12 al 18

19 al 25

26 al 31

02 al 08

09 al 15

16 al 22

23 al 29

30 al 06

07 al 13

14 al 20

21 al 27

X X

X X X X X X

X

X

X X X X

X X X X

X X X X X X X X X

X

elección de especie búsqueda de información sobre especie y micropropagación esquematización de proyecto de cultivo in vitro elección del material vegetal determinación de fórmulas de medio de cultivo determinación de protocolo de desinfección PRÁCTICA esterilización de materiales preparación de medios de cultivo dispensación y esterilización PRÁCTICA esterilización de materiales esterilización de semillas y escarificación siembra en medios de cultivo observación presentación de primer avances/resultados

X X X X

X X X X X X X X X

X

X X X X

X X

X

10.1 Cronograma de actividades Figura 7. Cronograma del proyecto

10.2 Resultados de la primera revisión

Estadios del cultivo

Resultados Contaminación

Evento

Porcentaje

Unidades experimentales

Elección de material de propagación

N/A

se eligieron semillas (embriones sexuales)

Determinación de protocolo de desinfección

N/A

se determinó un protocolo de desinfección

Determinación de fórmulas para medios de cultivo

N/A

se determinaron dos fórmulas (M1 y M2) para el cultivo

introducción al cultivo in vitro

0%

se obtuvo respuesta de crecimiento a los 5 días

100%

crecimiento

0%

aparecimiento de tallo y hojas primarias a los 15 días

100%

100%

pérdida de unidades experimentales

0%

6 UE 6 UE 6 UE

desarrollo y elongación

Figura 8. Tabla de resultados de la primera revisión

10.3 Recopilación de fotos

10.4 ESCALADO 10.4.1 Información del cultivo para escaldo

Descripción

Unidad

Material vegetal Semillas por planta Plantas por metro cuadrado

Semilla 30

Ciclo de la planta

120 a 150

Porcentaje de germinación

U m

244

2 d ías

91,00%

%

Figura 9. Información de la planta

10.4.2 Esquema del cultivo in vitro propuesto para la especie

Selección de la planta madre en campo Introducción al medio de cultivo Pérdidas aceptables: