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INDICE Introducción ......................................................................................................................1 Marco Teórico...................................................................................................................2 Objetivos:..........................................................................................................................3 6.1 Objetivo General ..................................................................................................3 6.2 Objetivos Específicos ...........................................................................................3 Marco Metodológico.........................................................................................................3 7. 1 Toma de la muestra..............................................................................................3 7.2 Procesamiento de la muestra.................................................................................3 7.2.1 Determinación de pH..................................................................................3 7.2.2 Pre enriquecimiento y Aislamiento............................................................4 7.2.3 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias.............................4 7.3 Mejoramiento y Diseño de Medio ................................................................4 7.5 Determinación de actividad enzimática. Método p-nitrofenil fosfato...................5 Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias........................................5 Bibliografía......................................................................................................................11 11.1 ANEXO I. Método de Determinación de pH ...................................................13 11.2 ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS...................................14 ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática p-nitro fenil fosfato .....................................................................................................................................15 10.3.1 Curva Patrón...................................................................................................15 11.3.2 Preparación Buffer fosfato......................................................................15

Introducción Es frecuente que en los suelos tropicales, los bajos niveles de nutrientes disponibles para las plantas, principalmente aquellos indispensables como el fósforo, condicionen la productividad de los cultivos; especialmente en las regiones sometidas a temperaturas altas. El fósforo es un limitante del crecimiento de las plantas en regiones como El Chaco, por lo que es muy poco soluble. El fenómeno de fijación del fósforo en el suelo, (el que es altamente dependiente del pH), causa una baja eficiencia de los fertilizantes fosforados solubles, el cual tiende a precipitarse en forma de fosfato dicálcico o fosfatos de aluminio y hierro; los microorganismos solubilizadores de fosfatos son un componente del suelo, el cual puede solubilizar fósforo precipitado y otros compuestos fosfatados. El problema radica en los sustratos orgánicos que son fuente importante de fósforo y que deben pasar a hacer fuente disponible, pasando de fósforo orgánico a inorgánico, por que las plantas solo pueden tomarlos como ión ortofosfato, esto se logra mediante hidrólisis por enzimas fosfatasas ácidas, pues el fósforo soluble es un nutriente limitado en un ecosistema natural. Localización de la zona de estudio

1

El muestreo del suelo se realizó en la provincia del Napo en la zona del Chaco, la región tiene una temperatura aproximada de 23°C, el sector de estudio abarca 1 hectárea y va a ser destinada para uso agrícola. En un análisis previo de fósforo en el suelo se obtuvo 159.23 mg/kg de fósforo total; 4.08 mg/kg de fósforo soluble, por lo tanto 155.15 mg/kg corresponde al fósforo insoluble lo que representa a una alta cantidad de fósforo que no puede ser aprovechado por las plantas para crecer y desarrollar su potencial genético. Niveles de P en el suelo son obligatorios para mantener la productividad y promover la eficiente utilización de nitrógeno en los cultivos. Una deficiencia de fósforo en las plantas se manifiesta con signos en las hojas, influye en el crecimiento haciéndolo lento y retrasando la maduración, con la posibilidad de un menor desarrollo radicular y menor floración. Es de gran importancia la presencia de microorganismos que desarrollen mecanismos para incrementar la disponibilidad del fósforo para los cultivos siendo capaces de movilizar el fosfato insoluble a formas solubles disponibles para las plantas. Por esta razón el suelo presenta una gran alternativa de solución a este problema, pues su elevada carga enzimática y bacteriana aumenta la solubilización de los nutrientes haciendo que puedan ser asimilables por las raíces. De esta manera incrementar la viabilidad de fósforo en el suelo ayudando a reducir la aplicación de fósforo en forma de fertilizantes químicos, reduciendo la contaminación química en los suelos y promover una agricultura sostenible.

Marco Teórico IMPORTANCIA DEL FOSFORO Luego del Nitrógeno, el Fósforo es un fertilizante esencial para el desarrollo y el crecimiento de las plantas como para microorganismos. Su principal función fisiológica es intervenir en procesos de acumulación y liberación de energía durante el metabolismo celular; sin embargo, el fósforo soluble es un nutriente limitado para producción de biomasa en un ecosistema natural. Dependiendo del tipo de suelo, se puede decir que entre un 50-60% corresponde a la fracción orgánica, mientras que el resto se encuentra en forma inorgánica. Las plantas absorben el fósforo en forma inorgánica en estado soluble, pero cuando se introduce al suelo, más del 90% de esta pasa rápidamente a formas solubles no disponibles. De esta manera, gran parte de los fertilizantes fosfatados que se aplican no son utilizados por las plantas, sino que se almacenan en el suelo. Las plantas deben absorber el elemento del suelo, donde se encuentra en muy baja concentración. Estos índices bajos del nutriente se deben a que el fosforo soluble reacciona con iones como el calcio, el hierro o aluminio que provocan su precipitación o fijación, disminuyendo su disponibilidad para los vegetales.

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pH La disponibilidad del Fósforo depende del pH del suelo, porque solo puede ser tomado como ion ortofosfato, el pH óptimo para que el ortofosfato sea viable en el suelo es alrededor de 6.5 ya que la precipitación de los fosfatos de aluminio y calcio disminuye. Un pH alto o bajo puede desnaturalizar la enzima y por consiguiente inactivarse. El pH del medio es importante para el crecimiento de los microorganismos, la mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, un inadecuado pH puede inhibir en crecimiento o alterar los procesos metabólicos normales.

Objetivos: 6.1

Objetivo General

 Aislar

y seleccionar microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de un suelo para uso agrícola de la provincia del Napo.

6.2

Objetivos Específicos

 Aislar en medios de cultivo: SMRS y un medio diseñado, microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de suelo para uso agrícola de la provincia del Napo.  Diseñar un medio de cultivo con una solución de fosfato.  Evaluar la actividad fosfatasa mediante la técnica pnitrofenilfosfato

Marco Metodológico 7. 1

Toma de la muestra

Se toma 500 g de muestra por 5 muestras puntuales obtenidas en muestreo aleatorio simple, se depositan en bolsas plásticas selladas. Se almacenan a temperatura ambiente para su transporte y luego se conservan bajo condiciones de refrigeración a 4˚C hasta su procesamiento en el laboratorio. 7.2 Procesamiento de la muestra El procesamiento previo de la muestra de suelo se compone de los pasos que se describen a continuación: 7.2.1

Determinación de pH

El pH influye en el proceso del suelo debido a la acción que ejerce sobre los microorganismos presentes; en los procesos el pH varía de acuerdo al tiempo, en respuesta a los materiales que son utilizados, a los productos y compuestos intermedios de la degradación de estos.

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Se realiza la medición de pH de las muestras de suelo por el método de pasta de saturación según el ICONTEC. (ANEXO I) 7.2.2

Pre enriquecimiento y Aislamiento

Se pesan 10g de muestra de suelo las cuales se homogenizan en erlenmeyers con 90 ml de agua de peptona 0.1% (p/v) y se adiciona 0.5g de fosfato ácido de calcio y 0.5g de goma arábiga. Los recipientes de las muestras se mantienen a 30˚C en agitación a 150 rpm por 72 horas. A partir de los erlenmeyers en los que se hizo el pre enriquecimiento, se realizan diluciones seriadas desde 10-1 a 10-8 en tubos de ensayo con 4.5 ml de agua peptonada al 0.1% (p/v) con el fin de aislar microorganismos de interés. Para determinar la población microbiana se siembra en medio diseñado con adición de Cloranfenicol, cuando el medio esté estéril (ver a ANEXO II), y se aplica el método de recuento por extensión. Se realizan las diluciones mencionadas anteriormente, se inoculan 0.1 ml de muestra en la superficie del medio. Las placas de agar se dejan secar por 15 minutos sin invertir a temperatura ambiente; posteriormente se llevan a incubar a 30˚C por hasta 48 horas hasta que se observen halos de solubilización alrededor de las colonias, este halo se mide en cada colonia con un criterio de selección según el índice de solubilización. IS = A/B Donde: A = Diámetro total (diámetro de la colonia + diámetro del halo) B = Diámetro de la colonia Se escogen las placas que tienen colonias aisladas y además son menos de 40 colonias (entre 10 y 20) para realizar el recuento. 7.2.3

Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias

La identificación macroscópica de las colonias se realiza teniendo en cuenta características de su aspecto como tamaño, color y textura, se identifica la morfología microscópica realizando tinción Gram y tinción azul algodón de lactofenol. 7.3

Mejoramiento y Diseño de Medio

El requerimiento nutricional se basa en la composición química de la célula, se forma primordialmente de C, H, O, N y otros en menor cantidad pero también importantes como el P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe entre otros, incluye vitaminas, aminoácidos purinas y pirimidinas. El pH del medio es importante para el crecimiento de los microorganismos la mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro. Se modificará la formulación del medio SMRS reemplazando el fosfato tricálcico por una solución de fosfato, utilizando goma arábiga y CaHPO4.2H2O

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TABLA I. Medio De SMRS REACTIVO

TABLA II. Medio Diseñado REACTIVO

CANTIDAD (g/l) 10 5 0.2 0.5

Glucosa Solución de fosfato Cloruro de sodio Sulfato de amonio Sulfato de 0.3 magnesio Extracto de 0.5 levadura Cloruro de potasio 0.2 Sulfato de Hierro Sulfato de 0.004 manganeso Cloranfenicol Condiciones ambientales: temperatura 30°C.

Glucosa Fosfato tricálcico Cloruro de sodio Sulfato de amonio Sulfato de magnesio Extracto de levadura Cloruro de potasio Sulfato de Hierro

CANTIDAD (g/l) 10 (ver Anexo II) 0.2 0.5 0.3 0.5 0.2 0.002 0.004 0.1

7.5 Determinación de actividad enzimática. Método pnitrofenil fosfato El principio de la técnica se basa en el uso de una fracción artificial de un sustrato orgánico (p-nitro fenil fosfato) el cual es hidrolizado por fosfatasas del tipo fotomonoestereasas para obtener HPO4. Para probar la actividad de la fosfatasa basta con ajustar el pH del medio de incubación, estableciendo condiciones ácidas o alcalinas, y en casi todos los ensayos para fosfatasa se emplea p-nitrofenilfosfato como sustrato, ya que es incoloro y por acción de la fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a partir del cual se genera p-nitrofenolato que produce color amarillo en condiciones alcalinas. El aumento de coloración con el tiempo de incubación, medido a 450 nm con un espectrofotómetro, es un indicador del nivel en el que el sustrato es hidrolizado por la fosfatasa una vez que la reacción se detiene y la solución se alcaliniza. (Técnica ver anexo III)

RESULTADOS Una vez aisladas las cepas se prosigue a: Caracterización Macro y Microscópica de las Colonias

BACTERIAS Características macro y microscópica de las cepas aisladas. CEPA Cepa 1 (BSP1)

CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS Cocos Gram positivos

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS Colonias lisas, bordes irregulares, blancas 5

Cepa 2 (BSP2 Cepa 3

Cocos Gram positivos

Colonias lisas, estrellada, blancas

Cocos Gram negativos

Colonias lisas, redondas, amarillas

De las cuales únicamente se conservaron 2 cepas pues mostraron mayor actividad enzimática. HONGOS Características macro y microscópica de las cepas aisladas. CEPA Cepa 1

Cepa 2

Cepa 3

Cepa 4

Cepa 5

CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS Mucor Tienen hifas tabiculares y conidioforas cuya cabeza está localizada en el extremo de un hifa, compuesta por una vesícula rodeada por una corona de fiálides en forma de botella directamente insertadas sobre la vesícula.8 De las fiálides se desprenden las esporas Chysosporium: conidiosporas muchas con hifas hialinas vegetativas y ramificadas irregularmente Acremonium: conidias elipsoidales que se acumulan en los extremos de fiálides largas y finas; clamidosporas ovales. Surgen como ramas laterales de la hifa. Aspergillus conidias oscuras formando un racimo de esporas; los conidióforos aparecen de color pardo amarillento claro y septos tabiques gruesos.

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS Blancos, bordes definidos,

Lilas,

Blancos,

Verdes,

Cladosporium: hongo Café verdosa filamentoso con conidióforos con cadenas ramificadas de conidios elipsoides de extremos redondeados.

De las cuales únicamente se conservaron 3 cepas pues mostraron mayor actividad enzimática. HONGOS 

Chysosporium



Cladosporium

6



Acremonium



Aspergillus



Mucor 1. Comportamiento de la Actividad enzimática en función del tiempo

Datos de la Curva de Calibración Concentración umol/ml 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

A 450nm

A 450nm

A promedio

0.046 0.062 0.205 0.298 0.346 0.398 0.469 0.612 0.709 0.823 0.905

0.051 0.065 0.209 0.289 0.356 0.402 0.478 0.62 0.715 0.815 0.916

0.049 0.064 0.207 0.294 0.351 0.400 0.474 0.616 0.712 0.819 0.911

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Datos de la experimentación: PARA HONGOS: HOR A

ABS

Concent ración

UP (µmol/min L)

aspergillus

umol/ml

aspergillus

0

0.041

0.053

0.879

0.5

0.077

0.093

1.550

1

0.098

0.116

1.941

1.5

0.111

0.131

2.183

2

0.120

0.141

2.351

4

0.147

0.171

2.854

6

0.160

0.186

3.096

8

0.245

0.281

4.680

10

0.357

0.406

6.766

ABS muc or 0.03 0 0.05 0 0.08 7 0.09 9 0.10 0 0.10 3 0.14 0 0.22 5 0.10 0

8

Concentra ción umol/ml

UP (µmol/min L) mucor

0.040

0.674

0.063

1.047

0.104

1.736

0.118

1.960

0.119

1.978

0.122

2.034

0.163

2.724

0.258

4.307

0.119

1.978

ABS muc or 0.01 0 0.05 0 0.06 8 0.09 8 0.11 3 0.12 8 0.15 0 0.24 0 0.29 0

Concentra ción umol/ml

UP (µmol/min L) Mucor

0.018

0.302

0.063

1.047

0.083

1.379

0.116

1.932

0.133

2.221

0.150

2.500

0.175

2.910

0.275

4.587

0.331

5.518

PARA BACTERIAS:

HORA 0 0.5 1 1.5 2 4 6 8 10

ABS Concentración BSP1 umol/ml 0.020 0.029 0.036 0.047 0.057 0.071 0.079 0.095 0.100 0.119 0.134 0.157 0.159 0.185 0.200 0.230 0.234 0.268

UP UP (µmol/min (µmol/min L) ABS Concentración L) BSP1 BSP2 umol/ml BSP2 0.488 0.015 0.024 0.395 0.786 0.030 0.040 0.674 1.177 0.067 0.082 1.364 1.587 0.089 0.106 1.774 1.978 0.099 0.118 1.960 2.612 0.103 0.122 2.034 3.078 0.140 0.163 2.724 3.841 0.183 0.211 3.525 4.475 0.100 0.119 1.978

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2. Preservación

HONGOS Se conservaron aquellas cepas que presentaron mayor actividad enzimática   

Aspergillus Mucor Cladosporium

En crioviales en agua esteril a temperatura de refrigeración BACTERIAS Se conservaron: 

En crioviales en BHI con el 20% de glicerol CONSLUSIONES 1. A partir del suelo de la región del Chaco provincia del Napo fue posible aislar 3 cepas de hongos y 2 cepas bacterianas. 2. El medio diseñado puede ser alternativa para el aislamiento y desarrollo de bacterias fosfato solubilizadoras. 3. Se determino la actividad de los Hongos, el Aspergillus tiene 6.766 UP (µmol/min L), en tanto los otros dos géneros Mucor y Cladosporium presentaron una actividad menor. 1.978 UP (µmol/min L) y 5.518 UP (µmol/min L). 4. En tanto en las bacterias la mayor actividad enzimática se consiguió con la bacteria SP1 con un valor de 4.475 UP (µmol/min L), en tanto la bacteria SP2 tiene un valor de 1.978 UP (µmol/min L); siendo la más eficiente la bacteria SP1

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5. Al comparar los resultados de actividad enzimática se determino que los hongos aislados tienen mejor actividad frente a las bacterias, pues los valores obtenidos son más altos.

RECOMENDACIONES 1. Realizar identificación bioquímica de hongos y bacterias aislada

FIGURA I. Cepas Aisladas de Hongos Solubilizadores de Fosfato.

Bibliografía 1.

BROCK,

T.

D.

y

M-

T.

MADIGAN,

“Ecología

Microbiana”, Prentice Hall Hispanoamericana, México, Págs. 655 – 685.

2.

PLASTER, EDWARD J., “La ciencia del suelo y su

manejo”. Primera Edición, Madrid, Editorial Thomson, 2005.

3.

National

Plant

Food

Institute,

“Manual

Fertilizantes”, Segunda Edición, México, Editorial Limusa, 1992 Direcciones Electrónicas

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de

1. http://www.slideshare.net/desarrollo_sostenible/como-hacer-yusar-el-compost-1444481?src=related_normal&rel=1444478 2. http://www.uteq.edu.ec/u_investigacion/uict/guias/Triptico_Estudio %20de%20Mercado_Poster.pdf 3. http://www.quito.cipotato.org/PRESENTACIONES/Resumenes/Articu lo%20cientifico%20de%20Wilian%20Viera%20y%20Gustavo %20Bernal.doc 4. http://ciatlibrary.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/Compostaje_Pescador.pdf

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1. ANEXOS 11.1

ANEXO I. Método de Determinación de pH

Norma Técnica Colombiana 5167. ICONTEC. Determinación del pH del Suelo: La determinación del pH se puede realizar en pasta de suelo saturada en agua. Para ello se añade a la muestra, sin pesar, cantidades de agua hasta obtener una pasta espesa. Se deja macerar durante media hora y se procede a la medida potenciométrica del pH. pH (pasta saturado) •

Valor normal entre 6.5 - 7.5

Preparación de la Pasta Saturada Colocar de 500 g de suelo en un recipiente de saturación se le agrega agua destilada lentamente y se va amasando hasta obtener una pasta lo más homogénea posible. Se agrega tanta agua como sea necesaria para obtener una pasta Saturada. Se debe eliminar el aire lo más completamente posible. Esto permitirá obtener una alícuota volumétrica de suelo lo suficientemente representativa. A partir de esta pasta es posible obtener tantas alícuotas como sea necesario. Para determinar el pH de la Pasta Saturada preparada tal como se describió anteriormente, se introduce el electrodo del potenciómetro directamente en la pasta saturada y se toma la lectura. En la pasta del suelo Saturado

1. Pese aproximadamente 500 g de suelo. 2. Colóquelos en un recipiente apropiado y añada agua destilada en pequeñas cantidades, mezclando bien después de cada adición hasta lograr su saturación, la cual se alcanza cuando, sin quedar agua libre en la superficie del suelo, ésta adquiere una apariencia brillante, fluye ligeramente al inclinar el recipiente donde se encuentra y no se adhiere a la espátula al introducirla en la pasta de suelo. 3. Si observa agua en la superficie de la pasta, debe añadir un poco más de suelo hasta lograr la saturación de la misma. 4. Proceda a tomar la lectura del pH en el potenciómetro, introduciendo con cuidado el electrodo.

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11.2

ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo SMRS

Fuente de carbono: Glucosa Fuente de fósforo: Fosfato Tricálcico COMPONENTE Glucosa Extracto de Levadura Púrpura de Bromocresol Ca3(PO4)2 Agar

g/L 10 0.5 0.1 5 15

Medio base: (NH4)2SO4 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSO4.H2O 0,3 g; FeSO4.7H2O 0,004 g; NaCl 0,2 g;

ANEXO II. Composición del Medio de Cultivo Diseñado Fuente de carbono: Glucosa Fuente de fósforo: Solución de fosfato (goma arábiga 0.5 g, CaHPO4. 2H2O 0.5 g) en 100 ml de agua destilada. COMPONENTE Glucosa Extracto de Levadura Cloranfenicol Agar

g/L 10 0.5 0.1 18

Medio base: (NH4)2SO4, 0,5 g; KCl, 0,2 g; MgSO4.H2O, 0,3 g; MnSO4.H2O, 0.004 g; FeSO4.7H2O, 0,002 g; NaCl, 0,2 g. en 900 ml de agua destilada

NOTA: Ajustar el pH del medio a 7.2 con una solución de NaOH 0.1 N

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ANEXO III. Método de determinación de actividad Enzimática p-nitro fenil fosfato 10.3.1

Curva Patrón

Preparar una solución de p – nitrofenil a una concentración de 1umol/ml, simultáneamente preparar 100 ml de una solución buffer de fosfato (Na2HPO4 1M) a pH 7.0. Preparar concentraciones conocidas de p – nitro fenol empleando buffer fosfato (ANEXO 10.3.2). Los cálculos se realizarán mediante una ecuación: C1V1 = C2V2 Donde: C1 = p – nitro fenil 1umol/ml V1 = volumen de nitro fenil requerido C2 = concentración en umol/ml a la que se quiere llegar V2 = volumen de muestra en cada tubo Medir los valores de absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. Tomar 0.7ml de cada una de las muestras, las cuales fueron adicionadas a tubos con 0.9 ml de p – nitrofenil fosfato al 0.08%, 1% y 1.5% (v/v) dejando actuar durante 1 hora a 35ºC, adicionar 1.6 ml de NaOH 0.02N para frenar la reacción. Las muestras someter a centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos, luego leer las absorbancias a 450 nm en espectrofotómetro. 11.3.2

Preparación Buffer fosfato

Para un volumen de 100 ml se adiciona 57.7ml de Na2HPO4 1M para obtener un pH de 7.0. Curva patrón de p – nitro fenol Preparar una solución de p – nitro fenol de 1 umol/ml en buffer fosfato pH 7.0 a partir de esta y utilizando la ecuación C1V1 = C2V2 Se utilizará espectrofotómetro, la lectura se realizara a 450 nm, colocando 3 ml del blanco (buffer fosfato solo) y los demás de cada concentración, realizando la lectura por triplicado. Realizar regresión lineal determinado de la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal debe ser mayor de 0.9. Concentraciones para la curva de calibración 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 µmol/ml

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