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EXTRACCIÓN, EVALUACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y AMPLIFICACIÓN DEL ADN DE “SACCHAROMYCES CEREVISIAE”

1Agredo

Steven, 2Olarte María Alejandra

[email protected] 2marí[email protected]

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Programa de Microbiología

Profesor Mauricio Ramírez Santiago de Cali, Colombia Mayo 29 de 2019A

RESUMEN: Es esencial dentro de la biología celular y molecular efectuar la extracción del ADN y observarlo de manera macroscópica con fin de resolver problemas genéticos de humanos y animales, mejoramiento de razas (animales) y variedades, pero esta práctica no tiene ese final, esta práctica fue realizada con fines educativos para adquirir habilidades y destreza a fin de realizar correctamente las técnicas para la extracción de ADN y poder ser cuantificado; Esta práctica fue elaborada de manera conjunta en tres diferentes sesiones que en general involucran la extracción, evaluación de cantidad-calidad y cuantificación del ADN de “Saccharomyces cerevisiae”, utilizando las técnicas de amplificación (región ITS1-ITS2), PCR, electroforesis y espectrofotometría. En la primer sesión se extrajo el ADN de levadura seca activa y pigmentada, la cual fue preparada anteriormente con SDS (dodecilsulfato sódico) el cual nos ayudó a desnaturalizar el ADN, Isopropanol, etanol, acetato de potasio, buffer T.E que nos ayudaron a solubilizar el ADN, posteriormente se almacenaron en tubos eppendorf a 20°C temperatura; En la segunda sesión se evaluó la calidad y cantidad del ADN por medio de espectrofotometría UV, para el desarrollo posterior de PCR. Se obtuvo como resultado

PALABRAS CLAVES: ADN, Levadura, cuantificación, amplificación, PCR.

INTRODUCCION

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: En la tabla 1. La cual nos da la cuantificación del ADN de “saccharomyces cerevisiae” para nuestra primera muestra (M1) se obtuvo la absorbancia a 260= 0,332 ng / µl, la absorbancia a 280=0,159 ng / µl y la proporción A260/A280= 2,09 ng / µl nos muestra evidentemente una contaminación, al igual que nuestra muestra 2 (M2), ya que nuestras muestras tienen una proporción A260/A280 mayor a 1.8 ng / µl.

MUESTRA

Control (+) M1 M2

CONCENTRACION DE ACID. NUC.

UNIDADES

0,1 16,6 22,8

A260

A280

A260 / A280

ng / µl

0,002

-0,008

-0,28

ng / µl ng / µl

0,332 0,456

NANOGRAMOS/MICRO LITROS

0,159 2,09 0,200 2,28 Tabla 1. Cuantificación ADN

M2 muestra mayor concentración en la tabla 1, pero en la figura 1 se contrarresta esta información tabulada, debido a que evidentemente la barra no se ve bien marcada. En la figura 1 podemos observar que M1 muestra una barra de color verde fluorescente poco iluminada, comparada con nuestro control positivo, mostrada por Sybr Green.

Figura 1. Resultado de PCR. El ADN puro tiene una relación A260 / A280 de 2.0, por lo tanto, si una muestra de ADN tiene una proporción A260 / A280 mayor que 1.8, esto podría sugerir una contaminación por ARN. Sin embargo, debido a la similitud en los perfiles de absorción

de ARN y ADN, probablemente la forma más precisa de determinar la contaminación por ADN es hacer funcionar la muestra en un gel de agarosa donde se verá claramente que el ARN migra delante del ADN. [1]

En la técnica de electroforesis, el SYBR Green representa una alternativa como tinte al bromuro de etidio, ya que es hasta 100 veces más sensible que éste y mucho menos perjudicial para la salud.[6]

El SDS (Dodecilsulfato sódico) actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido.[2]

La espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS (Polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación automática demuestras de DNA de plásmidos, cósmidos, productos de PCR.[7]

El tampón TE es una solución tampón de uso común en biología molecular, especialmente en procedimientos que involucran ADN, ADNc o ARN. "TE" se deriva de sus componentes: Tris, un tampón de pH común, y EDTA, una molécula que quela cationes como Mg 2+. El propósito del tampón TE es solubilizar ADN o ARN, mientras se protege de la degradación.[3] Las principales técnicas de identificación de levaduras están basadas en la aplicación de métodos de biología molecular como la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa), permitiendo resultados más específicos, extremadamente sensibles y en corto tiempo.[4] El factor de dilución del ADN dependerá de la intensidad de la banda observada en el gel de agarosa; Un valor obtenido de aproximadamente 1.8 es considerado puro para ADN Si es menor hay contaminación con proteínas, fenoles u otras sustancias que absorben en una longitud de onda cercana a 280.[5]

El NanoDrop es un espectrofotómetro de espectro total (220-750nm) que mide concentraciones con 1 µl de muestra, con gran exactitud y reproductibilidad. Utiliza una nueva tecnología que usa la tensión superficial para mantener la muestra en su sitio y se eliminan las cubetas de mesura. Además, el ND-1000 tiene la capacidad de medir muestras muy concentradas, sin necesidad de diluirlas (acepta 50X más de concentración que las medidas estándares con cubetas). Esta característica lo hace idóneo para medir la concentración de ácidos nucleicos y para determinar su cualidad. El software calcula automáticamente la concentración de los ácidos nucleicos siguiendo la relación: 1 A260nm = 1 OD DNA = 50 µg/ml. 1 A260nm = 1 OD RNA = 40 µg/ml. [8]

CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA [1] El factor de dilución del ADN dependerá de la intensidad de la banda observada en el gel de agarosa. [2] A. Nassif, S. C. Chan, F. J. Storrs and J. M. Hanifin. Abstract: Abnormal skin irritancy in atopic dermatitis and in atopy without dermatitis. Arch Dermatol. November 1994;130(11):1402. .[3] Krebs, JE Goldstein, ES y Kilpatrick, ST, 2009. Genes X de Lewin, 10ª ed. Jones y Bartlett.

[4] Berg, JM, Tymoczko, JL & Stryer, L., 2006. Stryer Biochemistry, 4ª ed. WHFreeman & Co Ltd.

[5] Dawson, RMC Elliot, DC, Elliot, WH y Jones, KM, 1989. Data for Biochemical Research , 3ª ed. Prensa de la Universidad de Oxford. [6] Ross; Haites, Kelly (1990). "Repetición de congelación y descongelación de ADN en suspensión: efectos sobre el rendimiento y la integridad del ADN”. Revista de Genética Médica. 27 (9): 569

[7] Molinari HB, Crochemore ML. Extração de DNA genômico de Passiflora spp para análisis PCRRAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal - SP 2001; 23 (2): 447- 450. [8] Nanodrop Genòmica Sct.uab.cat.

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