• Author / Uploaded
• SAMIR MARTINEZ SAGBINI

Citation preview

INFORME DE LABORATORIO BIOQUIMICA

PARTICIPANTE SAMIR EDUARDO

TUTORA. GLORIA GUTIERREZ DE PIÑERES.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA. UNAD-CEAD VALLEDUPAR. 2019

INTRODUCCION

Este informe de laboratorio esta plasmada la experiencia de la actividad experimental propuesta para el curso de bioquímica donde los estudiantes demuestras que se realizaron varios experimentos, se analizaron y se comprendieron. desarrollo al componente practico con la guía de la tutora y la ayuda de unos presaberes que permitieron que la actividad fuese fluida. cuando terminamos de ordenar nuestros datos, gráficos, anotaciones y, sobre todo, nuestras ideas. El informe ofrece a los lectores un recuento claro y completo de las actividades experimentales realizadas, de nuestras conclusiones y reflexiones

OBJETIVOS

Al finalizar el curso, el estudiante estará en la capacidad de:  Identificar las propiedades estructurales y funcionales de las biomoléculas a través de la apropiación de los conceptos bioquímicos base, para la comprensión de las moléculas fundamentales de los seres vivos.  Explicar las principales características de las enzimas y factores que influyen en la actividad enzimática, y las reacciones bioenergéticas de óxidoreducción; mediante la asociación de información para su aplicación en procesos biotecnológicos.  Comprender las principales rutas metabólicas de los carbohidratos y lípidos, y su participación en la producción de energía, a partir del análisis comparativo de los procesos, que permitan el estudio de otros sistemas biológicos más complejos.

PRÁCTICA 1: RECONOCIMIENTO DE BIOMOLÉCULAS.

Generalidades de las biomoléculas Las biomoléculas son estructuras orgánicas que hacen parte de los seres vivos. Las biomoléculas realizan las distintas funciones en los sistemas biológicos y las de mayor importancia en bioquímica son: las proteínas, los lípidos carbohidratos y ácidos nucleicos. Las proteínas están formadas por aminoácidos, las cuales forman cadenas que puede plegarse, dando origen a estructuras tridimensional más complejas que cumplen distintas funciones biológicas y bioquímicas. Los carbohidratos son la principal fuente de energía de los seres vivos, pero también cumplen un papel estructural, como por ejemplo la celulosa, quitina entre otros. Los lípidos son biomoléculas muy heterogéneas, tienen una característica común y es que son moléculas hidrofóbicas, es decir, son insolubles en agua, pero pueden ser solubles en solventes orgánicos como la acetona. Su función principal es de reserva, pero también pueden hacer parte de estructuras como la mielina o servir de base molecular a las hormonas. Los ácidos nucleicos, son moléculas encargados de llevar la información genética y se clasifican en el ácido desoxirribonucleico o ADN y el ácido ribonucleico a ARN. El ADN, se caracteriza por presentar una doble cadena conformada por una desoxirribosa y bases nitrogenadas como: adenina, timina, guanina y citosina. El ARN está conformado por una sola cadena que se denomina mona catenaria y su azúcar es una ribosa, cuyas bases nitrogenadas, cambia la timina por el uracilo.

Reacciones de identificación de las biomoléculas.

Las reacciones en biomoléculas están fundamentadas en la identificación de una molécula en particular, gracias a un tratamiento físico y químico, que permite que grupo funcional o cualquier otra parte estructural de la molécula presente un cambio. ENSAYO DE MOLISCH Carbohidratos sugeridos para el ensayo experimental: soluciones al 15 de arabinosa, glucosa, fructosa, sacarosa y almidón. Marco Teórico La prueba de Molisch (llamada así por el botánico austriaco Hans Molisch) es una prueba bioquímica sensible para detectar la presencia de carbohidratos, tiene como principio la deshidratación de los carbohidratos por el ácido sulfúrico o ácido clorhídrico para producir un aldehído, que se condensa con dos moléculas de fenol (generalmente el alfa (α) naftol, aunque otros fenoles (p. ej.,

resorcinol, timol) también dan productos coloreados), dando como resultado un compuesto de color rojo o púrpura. Materiales, Equipos e Insumos        

5 tubos de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 ml Un vaso de precipitados de 500 ml Una varilla de vidrio Una placa de calentamiento Una gradilla para tubos de ensayo Una pinza metálica para tubo de ensayo

Reactivos Molisch: 5 g de alfa-naftol en 100 ml de metanol Ácido sulfúrico (H2SO4) Concentrado. Procedimiento a. Marcar 5 los tubos de ensayo con el respectivo nombre del carbohidrato a ensayar. Luego adicione 3 mL de los carbohidratos preparados en una concentración al 1%.

b. Agregue dos gotas del reactivo de Molisch a cada tubo.

c. Incline el tubo y deposite 1 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo.

d. Posiciones lentamente el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta que aparece en la zona de contacto de los dos líquidos. Esto es indicativo de la presencia de un carbohidrato, Se sugiere consultar la reacción que permite dar explicación al fenómeno observado.

Analisis de resultado: La sacarosa, arabinosa, fructosa y glucosa que fueron los azúcares usados dieron un resultado positivo con el reactivo de Molish, a pesar de que la glucosa, arabinosa y la fructosa son monosacáridos y de que la sacarosa es disacárido, esto hace que dicha clasificación se deba al tiempo que tarda en formarse el anillo color rojo violeta ya que el el ácido sulfúrico concentrado [H2SO4] permite

que los glúcidos se deshidraten formando compuestos furfúricos por tanto diremos que como en nuestro caso las hexosas dan HMF (hidroximetilfurfural). 

La glucosa, arabinosa y la fructosa presentaron la formación de un anillo de color rojo violeta en interfase inmediatamente. Lo que nos indica que corresponde a un carbohidrato (monosacárido).



La sacarosa presentó en interfase la formación de un anillo de color rojo violeta después de un tiempo. Lo que nos indica que corresponde a un carbohidrato (disacárido).

ENSAYO DE TOLLENS Soluciones patrón de carbohidratos al 1%: arabinosa, glucosa, fructosa, y sacarosa Marco Teórico El reactivo de Tollens es una solución alcalina que contiene un complejo de plataamoníaco, que se utiliza en bioquímica para identificar la presencia de aldehídos. Este ensayo utiliza ácido sulfúrico concentrado y deshidrata los carbohidratos que están presentes en la muestra, actúa sobre cualquier enlace glucosídico y lleva a forma de furfural a las pentosas y de hidroximetilfurfural a las hexosas. Estos se condesan con alfa-naftol y producen sustancias coloreadas. El reactivo de Tollens (Ag (NH3)2+), es un agente oxidante suave, la solución de nitrato de planta es transparente y este permite distinguir un aldehído de una cetona. En esta reacción, el aldehído se oxida al ácido carboxílico correspondiente y el ion de plata se reduce a plata metálica, que se deposita como una película delgada en la superficie interna del tubo de vidrio y se conoce comúnmente como un espejo de plata. Materiales, Equipos e Insumos            

5 tubos de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 m Un vaso de precipitados de 500 ml Una varilla de vidrio Una placa de calentamiento Una gradilla para tubos de ensayo Una pinza metálica para tubo de ensayo Un matraz de Erlenmeyer 250 ml Pipetas Pasteur Probeta de 200 ml Vaso de precipitados de 250 ml,



Espátula

Reactivos  Hidróxido de sodio (NaOH)  El nitrato de plata (AgNO3) sal inorgánica mixta  Amoniaco (NH3)  Hidróxido de amonio (NH4OH) Procedimiento a. Marcar 4 tubos de ensayo con el respectivo carbohidrato que se va analizar. Adicionar a cada tubo de ensayo 3 mL de la solución del carbohidrato al 1%.

b. Añadir 2 gotas de hidróxido de sodio (NaOH) al 5% a cada tubo. Agitar con cuidado el tubo.

c. Adicionar 1 mL de disolución acuosa de AgNO3 al 5%

d. Agitar el tubo y añadir gota a gota y con agitación hidróxido de amonio NH4OH 2N, hasta que se consiga disolver el precipitado de AgOH. La formación de un espejo de plata es indicativa de la presencia del grupo funcional aldehído.

Analisis de resultado: se presenta la formación de anillo de plata en la fructosa y glucosa. La experiencia comienza con la preparación del complejo diaminado de plata [Ag(NH3)2]+, conocido como reactivo de Tollens, a partir de nitrato de plata y amoniaco. Posteriormente, se añade glucosa que actúa como reductor, lo que permite la formación de una capa delgada de plata metálica sobre la superficie

del tubo de ensayo, que se agita para que la disolución esté en contacto con toda la superficie del tubo del ensayo que queremos metalizar Esta es la reacción que tiene lugar: CH2OH(CHOH)4COH + 2[Ag (NH3)2]+ + 3OH--->2Ag(s) + CH2OH(CHOH)4 COO¯ + 4NH3 + 2H2O

ENSAYO DE LUGOL Soluciones patrón de carbohidratos: almidón y ribosa Marco Teórico El uso del reactivo de yodo de Lugol (I2/KI) es útil para distinguir el almidón y el glucógeno de otros polisacáridos. La solución de Lugol no detectará azúcares simples como la glucosa o la fructosa. El almidón y el glucógeno forman espacios helicoidales, los átomos de yodo pueden acoplarse en estos espacios y formar un complejo de almidón-yodo o glucógeno-yodo de color azul oscuro. Materiales, Equipos e Insumos   

2 tubos de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 m

Reactivos 

Lugol

Procedimiento a. Seleccionar dos tubos de ensayo limpios y secos. b. Al tubo 1 adicionar 3 mL de solución de almidón de papa al 1%. c. Al tubo 2 adicionar 3 mL de solución sacarosa al 1% d. Agregar a cada tubo de ensayo 5 gotas del reactivo de lugol.

e. Observar y tomar apuntes de los cambios de coloración.

Analisis de resultado: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul-violeta intensa y ribosa y las dextrinas por formación de coloración roja. RECONOCIMIENTO DE LOS LÍPIDOS. Generalidades Los lípidos son un grupo de biomoléculas grande y diverso de compuestos orgánicos naturales que están relacionados por su solubilidad en solventes orgánicos no polares (por ejemplo, éter, cloroformo, acetona y benceno) y la insolubilidad general en agua. Para estudiar las características de los lípidos se plantean algunos ensayos como el proceso de saponificación, solubilidad y reacciones coloreadas; las cuales se presentan a continuación: ENSAYO DE SAPONIFICACIÓN. Marco Teórico La saponificación es la hidrólisis de grasas o aceites bajo condiciones básicas para producir glicerol y la sal del ácido graso correspondiente. La saponificación significa literalmente "hacer jabón". Los lípidos derivados de los ácidos grasos al tratarse con una base fuerte como hidróxido de potasio (KOH) o hidróxido de sodio (NaOH), los derivados de los ácidos grasos forman sales alcalinas (jabones) y alcohol.

Materiales, Equipos e Insumos     

1 tubo de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 m Un vaso de precipitados de 500 ml Una varilla de vidrio

Reactivos   

Grasa de fuente animal o vegetal Hidróxido de sodio (NaOH) Hidróxido de potasio (KOH)

Procedimiento En un tubo de ensayo agregue 2ml de la grasa y 2ml de hidróxido de sodio (NaOH) al 20%. Agitar y llevar el tubo al baño María durante 20 minutos. En el tubo puede observar 3 fases: la solución de hidróxido de sodio (NaOH) en el fondo del tubo, el sobrenadante es la glicerina y la fase intermedia es jabón.

ENSAYO SOLUBILIDAD Generalidades de la solubilidad Las grasas y los aceites son insolubles en agua y son altamente solubles en solventes orgánicos tales como éter, hidrocarburos aromáticos e hidrocarburos halogenados. La solubilidad de las grasas está asociada a su estructura química, la cual está dada por largas cadenas de hidrocarburos no polares. Marco Teórico Los lípidos son un grupo de sustancias insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos, como el hexano. Materiales, Equipos e Insumos  

tubo de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml

Reactivos

 

Hexano (C6H14) Aceite de cocina

Procedimiento a. Llene con un cuarto de aceite de cocina un tubo de ensayo, agregue 2ml de hexano y agite.

b. Para comparar tome un segundo tubo de ensayo con la misma cantidad aceite de cocina y agregue 2 ml de agua. Observe las diferencias.

Analisis de resultado: En el agua no por mas que se agite no se alcanzan a mezclar los compuestos, debido a su solubilidad, por otro lado, los otros dos compuestos si se alcanzan a mezclar por completo. ENSAYO REACCIONES COLOREADAS DEL COLESTEROL En el ensayo colorimétrico de Liebermann-Burchard (LB), el tratamiento del colesterol con ácido sulfúrico, anhídrido acético y ácido acético produce un color azul. Marco Teórico El colesterol es una sustancia no coloreada; al tratarse con ácido sulfúrico y anhídrido forma colesterileno, un compuesto que forma color; de esta manera se puede identificar el colesterol. Materiales, Equipos e Insumos         

2 tubos de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 m Un vaso de precipitados de 500 ml Una varilla de vidrio Una placa de calentamiento Una gradilla para tubos de ensayo Una pinza metálica para tubo de ensayo. Un matraz de Erlenmeyer 250 ml

   

Un mortero 1 Probeta de 200 ml Vaso de precipitados de 250 ml, Espátula

Reactivos  Ácido sulfúrico (H2SO4)  Cloroformo (CHCl₃)  Reactivo de Sudán III  Tinta roja  Yeso (CaSO4·2H2O)

Técnica: Se puede preparar la muestra a partir de tejido de cerebro. Pesar 6 gramos de cerebro y triturar en un mortero o licuadora. Agregar 6 g de yeso (CaSO4·2H2O), luego llevar a 40ºC en una mufla durante 30 minutos. Sacar la muestra y triturarla hasta obtener un polvo. Este residuo se trata en un tubo de ensayo con 10 mL de cloroformo, se agita por 3 minutos y se filtra. La solución obtenida es la base para las siguientes reacciones coloreadas del colesterol. Nota: El proceso se realiza con yema huevo en vez de tejido de cerebro.

REACCIÓN CON EL ACIDO SULFÚRICO.  Reacción de Schiff Adiciona un 1 ml del extracto de colesterol en cloroformo en un tubo de ensayo. Agregar lentamente por la pared, un 1mL de ácido sulfúrico concentrado. Observar la aparición de un anillo de color rojo.

Analisis de resultado: La reacción de Schiff tuvo un resultado positivo para la presencia de colesterol, en la yema de un huevo. En la parte superior, se observa el color característico (rojo-vinotinto) que se forma en la capa clorofórmica; en la parte inferior, se observa un rojo amarillento con fluorescencia verde.  Reacción de Salkovsky Adicionar un 1 mL del extracto de colesterol en cloroformo en un tubo de ensayo. Agregar lentamente por la pared, un 1mL de ácido sulfúrico concentrado. Observar la aparición de un anillo de color rojo. Luego se adiciona 1ml de ácido acético. Observe los cambios y regístrelos.

Analisis de resultado: La reacción de colesterol con este reactivo produce una condensación de biesteroides. La formación de un anillo de color indica la presencia de colesterol. Su fundamento es la formación de derivados de los esteroides, cuando se tratan con ácidos. La coloración roja o Vinotinto característica, se forma en la capa del disolvente graso no polar, es decir, en el cloroformo  Reacción de Liebermann-Burkhardt De la solución del colesterol en cloroformo, tomar 2 ml y añadir gota a gota 10 ml de anhídrido acético, luego 2 gotas de ácido sulfúrico, y agitar cuidadosamente. Observe: primero una coloración roja, luego una violeta y último verde. ENSAYO EL SUDÁN III Marco Teórico El Sudán III es un test específico para las grasas, es insoluble en agua y soluble en las grasas; permitiendo teñir las grasas de color rojo. Materiales, Equipos e Insumos    

Tubos de ensayo Una pipeta graduada de 1 ml Una pipeta graduada de 5 m Un vaso de precipitados de 500 ml

Reactivos  Sudan III (1-((4-(fenildiazenil)fenil)diazenil) naftaleno-2-ol) Tinta roja Procedimiento a. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2 mL de aceite. b. Al primero tubo añadir de 4-5 gotas de Sudán III. c. Al segundo tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja d. Agitar ambos tubos y dejar reposar e. Observar los cambios y explicar.

ENSAYO DE RECONOCIMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Marco Teórico El ácido desoxirribonucleico (ADN) está conformado por un azúcar, llamado desoxirribosa, bases nitrogenadas adenina A, timina T, citosina C o guanina G y un grupo fosfato. En el ADN se presenta una doble cadena, una hebra de ADN está formada por unidades alternas de grupos fosfato y azúcar. Los bases nitrogenados, se unen a la desoxirribosa y se forman dos hebras, unidas entre sí por puentes de hidrógeno. El ácido ribonucleico (ARN) es una molécula similar al ADN. El ARN difiere en que es monocatenario, es decir, presenta una hebra de ARN; tiene un esqueleto formado por grupos alternantes de azúcar ribosa y fosfato. Se adjunta a cada azúcar una de las cuatro bases: adenina A, uracilo U, citosina C o guanina G. Ensayo de difenilamina. Es una técnica colorimétrica, para determinar el ADN. El reactivo usado es la difenilamina. Cuando estos se calientan con el ADN se rompen los enlaces fosfodiéster e hidrolizan los enlaces glucosídicos entre el azúcar y los purines.

Materiales, equipos e insumos     

Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1%. Ácido etilendiaminotetraacético EDTA pH 8 Difenilamina Ácido sulfúrico concentrado 𝐻2 𝑆𝑂4 Etanol al 95%

Procedimiento a. Pelar y rallar una cebolla mediana. b. Pesar 10 g de cebolla rallada y adicionarle 25 ml de solución de lisis (0.1% de Dodecil Sulfato de sodio (SDS) en 25 Mm EDTA pH 8.0) y dejar 20 minutos a temperatura ambiente c. Centrifugar a 1500 revoluciones por 5 minutos. d. Filtrar y recoger en probeta.

e. Adicionar 8 ml de etanol etanol 95% frío a un tubo de ensayo y agregar 4 ml de filtrado a un tubo de ensayo.

f. Observe la formación una fina hebra.

g. Con ayuda de una pipeta Pasteur separar la fina hebra en un tubo la fina hebra. A continuación, realizaremos la caracterización del ADN. h. En un tubo de ensayo agregar 1 mL de disolución de ADN; luego se añade 2 mL del reactivo de difenilamina recién preparado, y se observa la coloración. i. Leer la absorbancia a 595 nm. Analisis de resultado: Se logro extraer el ADN de la cebolla dejandolo visible ya que el ADN se precipita en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser visto. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa. Práctica 2: REACCIONES ENZIMÁTICAS DE LA POLIFENOL OXIDASA DE MANZANA Y CATALASA DE PAPA. POLIFENOL OXIDASA DE MANZANA Marco Teórico La polifenol oxidasa (PFO) es responsable del pardeamiento enzimático de las manzanas. El pardeamiento enzimático es una de las reacciones más importantes que ocurren en las frutas y verduras, produce efectos negativos en el color, el sabor y el valor nutricional. Es causada por la oxidación de los compuestos fenólicos por la poli fenol oxidasa (PFO). Materiales, equipos e insumos        

Papa. Cuchillo. Manzana. Mortero. Cuchara o espátula. Portaobjetos. Pipeta Pasteur. Vaso de precipitados 50 ml.

Reactivos  100 ml de peróxido de hidrógeno o “agua oxigenada” comercial.  1 Pastilla de vitamina C. Procedimiento a. b. c. d.

Presencia de polifenol oxidasa de manzana Moler una pastilla de vitamina C hasta obtener un polvo. Tomar el polvo y diluir en 10 ml de agua destilada. Luego cortar una manzana por la mitad y a una mitad de la manzana agregar el polvo de la vitamina C.

e. Tomar una rodaja de manzana e impregnar en la solución de vitamina C, luego dejar secar y observar los cambios. f. Dejar ambas mitades de manzana a temperatura ambiente durante 60 minutos y observar los cambios.

La manzana está compuesta, entre otras cosas, por fenoles. Son moléculas que se oxidan con facilidad al estar en contacto con oxígeno del aire. Y por oxidasas, que son unas proteínas que se encargan de acelerar las reacciones de oxidación. Los compuestos resultantes de esta reacción química son marrones. Por eso, si dejamos la manzana expuesta al aire sin ninguna protección, como el trozo 1, se oxida rápidamente y su color cambia a pardo. Si protegemos la manzana con plástico, el aire no está en contacto con la superficie de la manzana y, por lo tanto, se retrasa el deterioro de la fruta. La vitamina C (ácido ascórbico) que actúa como antioxidante. CATALASA DE PAPA Marco teórico Las catalasas son proteínas que contienen un grupo hemo que catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno molecular, protegiendo así las células de los efectos tóxicos del peróxido de hidrógeno.

Procedimiento a. Cortar una rebanada de papa y colocarla sobre un portaobjetos. b. Agregar 3 gotas de agua oxigenada sobre la rebanada de papa. c. Ver la actividad de la catalasa por el burbujeo de oxígeno que se desprende. d. Observar el tiempo en el cual se lleva a cabo la reacción.

Interpretación de resultados Después de efectuar todos los experimentos en cada caso: 1. ¿Cómo evidencia que se produjo una reacción enzimática? En la manzana se evidenci en la oxidación ya que comienza a oxidarse gracias a la presencia de aire. En la papa en la descomposición del peróxido de hidrogeno debido a la intervención de la catalasa 2. ¿A qué se debe la presencia del color marrón en la manzana que no tiene vitamina C? La manzana está compuesta, entre otras cosas, por fenoles. Son moléculas que se oxidan con facilidad al estar en contacto con oxígeno del aire. Y por oxidasas, que son unas proteínas que se encargan de acelerar las reacciones de oxidación. Los compuestos resultantes de esta reacción química son marrones.

3. ¿Qué papel desempeña la vitamina C sobre la manzana expuesta al oxígeno? La vitamina c es ácido ascórbico que actúa como antioxidante en este proceso 4. ¿A qué se debe la producción de burbujas en el experimento de la catalasa? El agua oxigenada se descompone gracias a la catalasa, una enzima presente en la patata.

Práctica 3: EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO Marco teórico Kappa caseína de la leche, es una proteína, la cual está asociada al calcio en forma de fosfato de calcio. Esta proteína es globular y tiene gran influencia en la composición de la leche, se encuentra en la fase acuosa y presenta un predominio en la composición de la leche relacionada con la coagulación, el tiempo de formación del cuajo y en general en la formación de quesos. La Kappa caseína se considera una fosfoproteína; bioquímicamente, esta sustancia contiene ácido fosfórico que son la mayoría del grupo fosfatos que están unidos por grupos hidroxilo a los aminoácidos de serina y treonina principalmente.

Gráfico 3. Grupos fosfatos de la proteína. Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México Durante la adición de ácido a la leche, las cargas negativas en la superficie exterior de la micela se neutralizan (los grupos fosfato están protonados) y la proteína neutra precipita como se muestra en el gráfico 3. La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos

en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela. La caseína está presente en la leche como sal de calcio y caseinato de calcio. Es una mezcla de caseínas alfa, beta y kappa para formar un grupo llamado micela. Estas micelas son responsables de la apariencia opaca blanca de la leche. Como se muestra en el gráfico 5.

Gráfico 5. Micela de caseína. Tomado de Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México El gráfico 5 muestra la kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. La caseína presenta baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína se encuentra cargada negativamente y se solubiliza como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita 𝐶𝑎2 + 𝐶𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎𝑡𝑜 + 2𝐻𝐶𝑙

𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 + 𝐶𝑎𝐶𝑙2

La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de calcio y fósforo altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. El punto isoeléctrico Las moléculas grandes adquieren una carga eléctrica y se puede definir como el pH en el cual una proteína tiene cargas netas cero. Puede presentar grupos con cargas positivas y negativas y la suma de las mismas debe ser cero. La caseína, como las proteínas, está formada por muchos cientos de aminoácidos individuales. Cada uno puede tener una carga positiva o negativa, dependiendo del pH del sistema, en este caso la leche. A algún valor de pH, todas las cargas positivas y todas las cargas negativas en la proteína (caseína) estarán en

equilibrio, por lo que la carga neta en la proteína será cero. Ese valor de pH se conoce como el punto isoeléctrico (IEP) de la proteína y generalmente es el pH en el que la proteína es menos soluble. De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). Estas moléculas constituidas por múltiples aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, cuyos grupos R, determinan las cargas positivas y negativas al igual que el grupo amino y el grupo carboxilo libres, como se muestra en el gráfico 6.

Gráfico 6. En lace polipéptido. Tomado de Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México Materiales, equipos e insumos  

Diez vasos precipitados de 25 ml Dos vasos de precipitados de 50ml



Un vaso de precipitado de 250ml



Probeta de 50ml



Matraz aforado de 50 ml



pipeta graduada de 5,0 ml

 

pipeta graduada de 1,0 ml pipeta graduada de 10,0 ml



Embudo de vidrio mediano

 

Papel de filtro Termómetro Reactivos



Agua destilada



Acetato sódico 0,1 N



Ácido acético 0,01 N



Ácido acético 0,1 N





Ácido acético 1,0 N



NaOH 1N



Éter etílico



Etanol al 70%

Materiales y reactivos de uso general:  Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro  Potenciómetro (pH-metro)  Leche entera corriente (1 litro)  Ácido acético 1N  Hidróxido de sodio (NaOH) 1N Procedimientos Aistamiento de la caseína A. Caliente en un vaso de precipitado 150 ml de agua destilada a 38ºC, Añada 50ml de leche y luego gota a gota, con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). B. Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo. C. Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro. D. Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro. E. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico. F. Filtre nuevamente. G. Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la caseína.

Preparación de la solución de caseína a. Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml.

b. Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución total de la caseína. c. Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien. d. La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

Determinación del punto isoeléctrico de la caseína En diez vasos de 25 ml, limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos según la siguiente tabla: TABLA 1. De Disoluciones añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo. TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Acetato 0.1N 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8

Acético 0.1N 9.5 9 8.5 8 7 6 4 2 -

Acético 0.1N 4 2

Ph resultante 3.2 3.6 3.8 4.0 4.2 4.5 4.7 5.1 5.5 6.1

Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, que debe cubrir un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso crecientes. - Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo. - Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. - Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm. - Anotar los resultados, y graficar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI

Interpretación de resultados 3. 1) Representar A640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia? 4. 2) ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?

promedio es de 4,6. A este pH

5. 3) Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en la pI?

La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados. 6. Preparación de soluciones Preparar: 

litros leche entera



litros acetato sódico 0,1 N (16 g acetato en 2 L agua destilada)



litros ácido acético 0,1 N (12 g acético glacial en 2 L agua destilada)



400 mL ácido acético 0,01 N (0,24 g acético glacial en 400 mL agua destilada)



500 mL ácido acético 1 N (30 g acético glacial en 500 mL agua destilada)



300 mL NaOH 1 N (12 g NaOH en 300 mL agua destilada)

Práctica 4: ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA PAPAINA Y EL EFECTO DE ALGUNOS INHIBIDORES Marco teórico Las proteasas son enzimas que catalizan la degradación de péptidos y proteínas, estas enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, y ocupan un papel importante en numerosos procesos fisiológicos en los seres vivos, así como por su uso en diferentes procesos industriales. Del látex producido por la papaya, higuera, piña y en menor medida de otras especies vegetales se extraen este grupo de enzimas. La papaína es un componente proteolíticamente activo en el látex de la fruta de papaya (Carica papaya). La papaína es probablemente el miembro más ampliamente estudiado de la clase de enzimas cisteína proteinasa. Materiales, equipos e instrumentos     

Trípode Licuadora Pipetas Cajas de Petri Tamiz

   

Vasos de precipitados de 400ml Vasos de precipitados de 100ml Plancha calentadora Balanzas

Reactivos     

Carne de res o gelatina Enzimas bromelina papaína y Ficina. (Proteasas), Piña Ananas comosus Papaya Carica papaya Ficus carica L (breva e higo)

Procedimientos 1. Preparar la gelatina sin sabor; para ello, pesar 12g y disolver en 60 mL de agua caliente.

2. Repetir en seis vasos de precipitados de 50 mL y llevarlo a la nevera para que solidifique. 3. Licuar 100g de la papaya y piña con 150 ml agua destilada. 4. Filtrar el licuado y recoger en vaso de precipitado limpio.

5. Marcar cada uno de las muestras del licuado. 6. Tomar la mitad del contenido de los filtrados de piña y papaya, y calentar a 100 ⁰C por cinco minutos.

7. A partir de los filtrados anteriores agregar el contenido de acuerdo como se indica en la tabla.1, en un vaso de precipitados de 50 mL. 8. Para la gelatina realizar observaciones a los 40 minutos y anotar los cambios

9. Para la carne determinar los cambios en la consistencia a través del tacto, después de una hora.

A. Procedimiento para la gelatina. Agregar 4ml de los filtrados de piña y papaya según se indica en la tabla 1.

Tabla.1 Ordenamiento de las muestras de gelatina Muestra

Vaso uno

Vaso dos

Vaso tres

Gelatina

Gelatina

Gelatina

Jugo de piña fresca

-

4 ml

-

Jugo de piña hervido

-

-

4 ml

B. Procedimiento para la carne. Agregar 4ml de los filtrados de piña y papaya según se indica en la tabla 2. Tabla.2 Ordenamiento de las muestras de carne Carne cruda Carne cruda Jugo de 4 ml papaya fresca Jugo de papaya hervido

Carne cruda -

4 ml

Dejar en reposo por una hora y anotar los resultados En la muestra cárnica determinar a través del tacto la consistencia una hora después. La bromelina y la papaína son enzimas endopeptidasas e hidrolizan los enlaces peptídicos de las proteínas, evidenciándose en el vaso dos de la tabla1 Cuestionario Interpretación de resultados

¿Cuál es la acción bioquímica de la bromelina y la paina en la industria cárnica? En la industria cárnica las enzimas más utilizadas son la bromelina y la papaína. La primera, entendida como aquella enzima que degrada proteínas y que se extrae de la piña; tanto en la medicina como la industria moderna y en la gastronomía, se utilizan este tipo de enzimas vegetales tales como lo hacían nuestros ancestros. La enzima se encuentra distribuida tanto en el fruto, como en el tallo y las hojas de este mismo (Javier Carnero, 2008). El uso principal de la papaína es como un suavizador de carne. También es usada como una ayuda digestiva para personas que tienen problemas para digerir las proteínas (University of Florida Extensión, Steven Bratman, MD, 2008). Esta investigación

nos permite resaltar y decir que los trabajos realizados hasta el momento sobre las enzimas Bromelina y Papaína que se utilizan en la industria cárnica son de excelente beneficio para la calidad, conservación y manejo de éstos productos (Autor). También se pude decir que esta información recolectada nos permite poner a prueba la tecnología propuesta por la facultad de ingeniería de alimentos donde se aplican rigurosos conocimientos en cuanto al manejo adecuado de alimentos como son las carnes, apuntando al incremento en un futuro del manejo de otros productos derivados para mejorar calidad y nutrición, ya que las enzimas son benéficas para la salud y el bienestar de la alimentación y nutrición del organismo, creando productos innovadores (Autor).

Producción e importancia de Bromelina y Pipaina para la industria cárnica Tipo de Recurso Digital info:eu-repo/semantics/bachelorThesis Proyecto_Aplicado_o_Tesis URI https://repository.unad.edu.co/handle/10596/1517

¿Qué otras enzimas de origen Enzimas proteolíticas de origen vegetal? Ficina OBTENCIÓN: látex de los tallos de la higuera ACTIVIDAD: tiene actividad proteolítica. Rompe los enlaces disulfuro generados por AA con azufre (cisteína). USO: insuficiencia digestiva ACTINIDINA OBTENCION: Fruto del kiwi (zumo) ACTIVIDAD: tiene actividad proteolítica. USO: insuficiencia digestiva, mejora el tránsito intestinal

CONCLUCIONES

Se logro identificar las propiedades estructurales y funcionales de las biomoléculas a través del concepto planteado y la guía de la tutora. Durante el trabajo se explicaron las principales características y factores que intervienen en la actividad enzimática.

BIBLIOGRAFIA

El

espejo

de

plata;

Departamento

de

Química

Inorgánica

https://dqino.ua.es/es/laboratorio-virtual/el-espejo-de-plata.html

Desnaturalización (bioquímica) - Wikipedia, la enciclopedia libre https://es.wikipedia.org › wiki › Desnaturalización_(bioquímica)

Producción e importancia de Bromelina y Pipaina para la industria cárnica Tipo de Recurso Digital info:eu-repo/semantics/bachelorThesis Proyecto_Aplicado_o_Tesis URI https://repository.unad.edu.co/handle/10596/1517