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• Lina Rodriguez

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FACULTAD DE INGENIERÍA Y GESTIÓN AMBIENTAL

TEMA “Microbiología Ambiental en el estudio de microorganismos dentro de la Columna de Winogradsky”

INTEGRANTES Caja Molina, Valeska; Elera Palma, Williams; Quesquén Bello, Tiffani; Ramos Coronado, Milagros; Rivas Galindez, Ilich; Sotomayor Chávez, Astrid CURSO Microbiología Ambiental DOCENTE Alexandra Muñoz Blandon JULIO DEL 2014 “Microbiología Ambiental en el Estudio de Microorganismos dentro de la Columna de Winogradsky”

I.

II.

OBJETIVOS: -

Establecer el ecosistema microbiano de sedimentos de ambientes naturales (Lagunas de Villa I de la UCSUR) a partir de la construcción de una columna de Winogradsky.

-

Reconocer e interpretar los diferentes estratos de la Columna de Winogradsky, en base a su microbiota colonizadora y sus interrelaciones. INTRODUCCIÓN: La COLUMNA DE WINOGRADSKY es un instrumento útil para estudiar y demostrar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en comunidades mixtas, y constituye una forma de observar cómo los microorganismos ocupan “microespacios” altamente específicos, de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales, como los requerimientos de carbono y energía (altamente específico). Además, constituye una estupenda práctica para comprobar cómo se establece un ecosistema microbiano, ya que se puede reproducir un ecosistema natural en el laboratorio, correspondiente a un sedimento con contenido orgánico de diferente origen (restos de raíces de plantas, hojarasca etc.). Es, en síntesis, un sistema completo y autónomo de reciclaje, mantenido sólo por la energía lumínica.

Objetivo de la Columna de Winogradsky Evidenciar los diferentes metabolismos bacterianos, los cuales generan ecosistemas complejos y son los protagonistas fundamentales de los ciclos biogeoquímicos. III.

PARTE EXPERIMENTAL: (valeska) III.I. Construcción de la Columna de Winogradsky a. Materiales -

2 cilindros de vidrio o plástico transparente. 2 hojas de papel filtro (fuente de carbono y energía para la cadena trófica microbiana) Sulfato de calcio Carbonato de calcio (agente tamponador del pH) Muestra de sedimento Arena (color claro) Agua destilada Agua de charco 2 platos desechables Restos de hojas, plantas, ramas, etc. Papel parafilm Papel aluminio

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b. Procedimiento: 1. Tomar una muestra de sedimento o suelo (60% del volumen). 2. Cortar trozos pequeños de papel filtro. 3. Mezclar la muestra con 1 g de sulfato de calcio, y 1 g de carbonato de calcio, restos de hojas, plantas, ramas, etc. Y con las trozos de papel filtro. 4. Agregar la mezcla al fondo de la columna. 5. Agregar arena. 6. Adicionar agua del lugar de donde proviene la muestra (de preferencia) hasta casi al borde. 7. Cubrir con papel parafilm la parte superior de la columna e incubar en presencia de la luz. 8. Realizar el mismo procedimiento desde el punto 1 a 7 con una segunda columna que se envolverá en papel aluminio para incubarla bajo condiciones de oscuridad. 9. Haga observaciones de su columna diariamente durante una semana y cada tercer día durante las siguientes tres semanas. Registre los cambios macroscópicos que se presenten. 10. Mantenga el volumen de agua adicionando agua destilada en caso de observar evaporación. 11. Al final del experimento, observar al microscopio muestras de la columna de agua como del sedimento. c. Experimentación: (Realizado el 12 de Mayo del 2014) La muestra de sedimento fue obtenida de la laguna ubicada en Villa I de la UCSUR (Fig.1), para lo que se utilizó baldes de 1 litro y guantes quirúrgicos al momento de retirar la muestra. Esta laguna presenta una coloración predominantemente verde, lo que podría indicarnos la presencia de microalgas. El sedimento de la laguna presentó una coloración gris con puntos negros, acompañado de gravas (Fig. 2). La muestra emitía un fuerte y desagradable olor, además de presentar una textura entre líquida y gelatinosa. Se trató de obtener la muestra de la mayor profundidad posible de la laguna, para así obtener gran cantidad y variedad de nutrientes y microorganismos de la laguna. Paralelamente se extrajo una muestra del agua de la laguna, la cual presentó una coloración amarilla con pequeños puntos marrones. (Fig.3) Por otro lado, los restos de hojas, plantas y ramas fueron retiradas de las áreas verdes de villa I (Fig. 4), y la arena fue obtenida de la playa ubicada en Villa 6 de la misma universidad.

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Fig. 1. Obtención de la muestra de sedimento de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 2. Muestra retirada de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 4 de agua laguna de la

Muestra de la Villa I de UCSUR

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Fig. 4. Restos de plantas, hojas y ramas

La muestra se vertió en una probeta transparente de 1000 ml, hasta ocupar un poco más de la mitad del volumen (600 ml aproxidamente), ayudándonos con un cucharón de plástico. A esto se le añadió la arena, los restos de plantas, hojas y ramas, el gramo de sulfato de calcio y carbonato de calcio (previamente pesados en la balanza eléctrica), y los trozos de papel filtro.

PorParte último,líquida: se le añadió el agua procedente de la laguna hasta completar los 1000 1000 ml la probeta, y se tapó la probeta con parafilm. Esta columna ml de aproximadamente fueVolumen: rotulada como EXPUESTA. (Fig. 5) 200COLUMNA ml aproximadamente. Coloración: Amarillo claro. Se procedió a realizar los mismos pasos para nuestra segunda columna, En la parte más alta de la columna se puede observar pequeños restos de hojas con la diferencia que ésta fue tapada con papel aluminio, para evitar que tenga contacto con la luz. Esta probeta fue rotulada como COLUMNA TESTIGO. (Fig. 5) Ambas columnas fueron incubadas en el invernadero de Villa 3 ubicadas en la UCSUR.

Materia orgánica: Volumen: 800 ml aproximadamente: Coloración: Marrón oscuro en los primeros centímetros y pasa a negro en la parte más La Materia orgánica o sedimento comienza a descender.

Fig. 5 Testigo

Columna (izquierda) y Columna Expuesta (derecha) dejadas a incubación

IV.

SEGUIMIENTO DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY: (Astrid) Las columnas fueron dejadas en incubación por 7 semanas y 3 días. IV.I. COLUMNA EXPUESTA A LA LUZ SOLAR -

13 de Mayo del 2014

5

3

2

-

27 de Junio del 2014 1

6

Según lo observado el 27-06-14, la columna presentó 3 zonas diferenciadas: 1. Zona baja: (Materia orgánica) -

Volumen: 650 ml aproximadamente (descendió desde el primer análisis) Coloración: Entre marrón oscuro y negro.

2. Zona Intermedia: -

Volumen: 100 ml aproximadamente (entre 650 ml y 750 ml de la probeta) Coloración: Presentó colores en No se observaba esta fase en los primeros análisis.

7

3. Zona alta: (Líquido) -

-

Volumen: 300 ml aproximadamente (aumentó desde el primer análisis). Entre 750 ml y 1050 ml de la probeta (se fue aumentando agua a la columna para mantener el volumen aproximadamente. Coloración: Marrón claro (cambio su coloración desde el primer análisis).

IV.II. COLUMNA TESTIGO

La Columna Testigo no fue sometida a ningún cambio. El aluminio no fue retirado hasta el día del análisis de las columnas en el laboratorio.

V.

ANÁLISIS DE RESULTADOS (MILAGROS) V.I. ANÁLISIS DE LAS COLUMNAS El análisis de resultados se realizó el 03 de julio del 2014 en el laboratorio de microbiología. Este procedimiento consistió, en primera instancia, de remover el agua de la superficie de la columna, se vertió el agua excedente en un recipiente aparte, para luego utilizar una pipeta de 10mL para extraer el líquido restante. Luego se utilizó un asa de siembra de ojo para sacar una muestra y ponerla sobre una placa y observarla bajo el microscopio. Para cada zona de color encontrada a lo largo de las columnas trabajadas, testigo y la que fue expuesta a la luz, se realizó tinción Gram para su observación en el microscopio.

8

A. Columna expuesta Esta columna presentó un total de siete fases de las que se extrajo una muestra por fase. La primera de éstas es, la fase líquida, de agua superficial. Las siguientes fases diversas de coloración morada, amarilla, verde, y las dos últimas presentaron una coloración marrón. Además, también se realizó la medición de pH de la columna, donde se obtuvo un pH 8. OBSERVACION AL MICROSCOPIO Se describe a continuación lo observado en el microscopio por cada una de las 7 fases encontradas a los largo de la columna expuesta. 1. Primera fase: Fase líquida de coloración marrón oscura.

Se realizó un fresco de la muestra, encontrando probablemente una diatomea, la cual fue alcanzada a observar a 10X en el microscopio. (Fig. 6)

10 X

9

Fig. 6. Observación de una diatomea de la fase líquida a 10X 2. Segunda fase:

Fase marrón

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y por la forma observada, estas son bacterias Beggiatoas. (Fig. 7) Además, se observaron formas alargadas, que podrían indicar la presencia de estreptobacilos. (Fig. 7)

100 X

Estreptobacilos Beggiatoa

Fig. 7. Observación de Beggiatoas y estreptobacilos a 100X 3. Tercera fase:

10

Fase morada

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y por la forma observada, se determinó la presencia de esporas. (Fig. 8)

40X

Esporas

Fig. 8.

Observación de Esporas a 40X

4. Cuarta fase: Fase amarilla

11

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración rosada lo que indica la presencia de una bacteria Gram negativa. También se observó la posible presencia de micelios, constituyentes del cuerpo vegetativo de un hongo. (Fig. 9)

100X

Fig. 9. Observación de bacterias Gram – y posible presencia de hongo vegetativo 5. Quinta fase:

Fase verde

12

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo. Además, se observó presencia de bacilos. (Fig. 10)

10X

Bacilo s

Fig. 10. Observación de bacterias Gram + y bacilos

6. Sexta y Séptima fase:

Fase marrón oscura y negra

13

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y probablemente la presencia de Clostridium, bacterias anaerobias (Fig. 11)

10X

Fig. 11. Observación de bacterias Gram + y Clostridium 1

B. Columna testigo Esta columna presentó un total de cinco fases. Sólo 3 de ellas fueron evidentemente diferenciadas.

2y3

La primera de éstas, es la fase líquida o fase superficial. La fase 2 y 3 presentaron una coloración marrón y las restantes, y poco distinguidas, presentaron una coloración más oscura que las anteriores. Se realizó medición del pH de la columna testigo, para lo que se obtuvo un pH igual a 8.

4y5

14

FASE 1: Fase líquida de coloración amarrilla. (Ocupa 200 ml aproximadamente) FASE 2 Y 3: Materia orgánica de coloración marrón. (Ocupa 300 ml aproximadamente) FASE 4 Y 5: Materia orgánica de coloración marrón oscuro. (Ocupa 500 ml aproximadamente)

OBSERVACION AL MICROSCOPIO 1. Primera fase: Fase liquida

Se realizó un fresco de la muestra y pudimos observar filamentos 40X cilíndricos que hacían evidenciar la presencia de hifas dentro de la muestra. (Fig. 12)

Filamentos cilíndricos

15

Fig. 12. Observación de filamentos cilíndricos a 40X

2. Segunda fase: Marrón

Entre 760 ml y 650 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas (Fig. 13)

40X

16

Fig. 13. Observación de bacterias Gram + de la segunda fase de la columna testigo

3. Tercera fase: Marrón

Entre 650 ml y 500 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas observadas, la posible presencia de esporas. (Fig. 14) 40X

17

Fig. 14. Observación de bacterias Gram + y esporas

4. Cuarta fase: Marrón oscuro.

Entre 500 ml y 300 ml

Se realizó un fresco de esta fase. Se encontró filamentos pequeños, pertenecientes probablemente a la estructura vegetativa de algún hongo. (Fig. 15)

10X

18

Fig. 15. Observación de filamentos

5. Quinta fase: Marrón oscuro.

Últimos 300 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada, lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas observadas, se detectó la presencia de esporas. (Fig. 16)

19

40X

Fig. 16. Observación de filamentos

En ambas columnas se observaron presencia de macroporos, lo que indica desprendimiento de gases por las bacterias debido a su metabolismo. Estos macroporos se observaron en mayor cantidad en la columna expuesta a los rayos solares.  Cada zona de las columnas analizadas fueron estriadas en 4 placas de petri y analizadas al siguiente día mediante tinción de Gram y tinción de Esporas. 1. Zona de la superficie aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y Testigo (T) 2. Zona media o mitad aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y Testigo (T). 3. Zona media o mitad anaerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y Testigo (T). 4. Última zona anaerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y Testigo (T).

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T

N

SUPERFICIE AEROBIA

T

N

MITAD AEROBIA

21

N

T

MITAD ANAEROBIA

T

N

FONDO ANAEROBIA

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V.II. ANÁLISIS DE LAS PLACAS PETRI (04/07/14) a. Superficie Aerobia -

Columna Normal o Expuesta (N)

Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de esporas con coloración azul. -

Columna Testigo (T)

Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de esporas con coloración azul.

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b. Mitad Aerobio -

Columna Normal o Expuesta (N)

Espor as

Bacil os

Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de esporas con coloración azul y bacilos, en forma de palos alargados verdes. -

Columna Testigo (T) Cuando se le sometió a Tinción de espora, se observó presencia de esporas, como pequeños puntos verdes.

Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia de bacilos y esporas.

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c. Mitad Anaerobio -

Columna Normal o Expuesta (N) Cuando se le sometió a Tinción de espora, se observó presencia de esporas, como pequeños puntos verdes y bacilos, como palos alargados rojos.

Espor as

Bacil os

Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia de bacilos, esporas y cocos.

25

-

Columna Testigo (T) Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia de bacilos y cilios.

VI.

CONCLUSIONES:  Han proliferado organismos anaerobios, debido a que la columna fue sellada y nunca fue removida, por lo que no hay forma que su contenido haya sido oxigenado.  En cada paso del ciclo de los elementos que se observan dentro de la columna siempre está implicado algún grupo de organismos.

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 Un microorganismo particular y sus productos metabólicos suele servir como fuente de nutrientes esenciales para otros organismos, generándose una red trófica dentro de la columna.  Los procesos bioquímicos utilizados por estos microorganismos para obtener energía (ATP y poder reductor) y fuente de carbono son los mecanismos más eficientes para sortear las condiciones fisicoquímicas adversas imperantes en estos hábitats.  El único requerimiento es la fuente de carbono orgánico para generar los productos de la fermentación necesarios para las sulfo-reductoras.  Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclamiento, mantenido sólo por la energía de la luz.  Hemos diferenciado los grupos microbianos presentes en un microambiente también pudimos comparar los microorganismos que crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos, relacionando la diversidad microbiana presente en un microambiente con algunas de sus características fisiológicas.  Esto es una clásica demostración de cómo los microorganismos ocupan micro-sitio muy específico de acuerdo a su medio ambiente y sus tolerancias de carbono y las necesidades de energía.  El oxígeno difunde desde la superficie, creando condiciones similares a las que existe en un largo sedimento ricos en nutrientes.  Con la luz se reproduce la penetración de la luz solar en la región inferior anaeróbica, para facilitar el desarrollo, de los microorganismos fotosintéticos anoxigénicos y en la parte más alta se pueden ver cianobacterias.

VII.

DISCUSIONES: Al comparar las columnas con las de los demás grupos de estudio, obtuvimos coloraciones distintas en la estructura de la columna. Much de esta diferenciación se debe al tipo de suelo utilizado para la muestra de nuestra columna. La coloración morada es debido a la acción de la Cromatium y a sus cúmulos, debido a sus compuestos carotenoidicos como la “okenona” (caso especial es la especie Cromatium okenii.), la cual se puede observar en el trabajo de José L. Perez (2008). Los ciclos biogeoquímicos, como el del azufre, se observaron de la misma forma más de no de la misma particularidad con las demás columnas José L. Perez (2008).

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VIII.

CUESTIONARIO: a. ¿Por qué se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento?  Funciona como base de sulfato. Se liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias purpuras que no utilizan azufre. Cianobacterias crecen en la parte superior y liberan oxigeno que mantiene aerobia esta zona. b. ¿Cuál es la función de los restos de hojas, plantas, ramas, etc, en la columna?  La función de los restos de hojas, plantas, ramas y demás en la columna, es simular la materia orgánica que se encuentra de forma natural en el ambiente. Así logrando una simulación más real que se puede dar de forma natural en el medio. Además la materia orgánica promueve el crecimiento de microorganismos y para algunos de estos sirve como nutriente. c. ¿Por qué razón la columna testigo se mantiene en la oscuridad durante el transcurso del experimento?  Esta columna se mantiene en la oscuridad con el fin de poder determinar si en ésta podrán proliferar microorganismos en la misma cantidad o menor cantidad que en la columna expuesta a la luz solas. Por otro lado, la columna en mención se mantiene tapada para evitar la evaporación. Además, esta columna simula un micro-ecosistema o microambiente que ilustra cómo los microorganismos ocupan micro-espacios altamente específicos de acuerdo con sus necesidades vitales, tales como: requerimientos de carbono, energía y oxígeno, así como la interdependencia, prescindiendo de la energía solar.

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IX.

ANEXOS Organismos encontrados en cada fase de la Columna expuesta a la luz solar

29

X.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 

Obtenido de: http://www.redalyc.org/pdf/920/92050311.pdf, José Pedro López Pérez, Murcia.

2008,



Atlas,

R.M.y R. Bartha. 2001. Ecología microbiana y microbiología ambiental. Ed. Addison Wesley.

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