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• Eric Quispe Peña

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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC

¨FACULTAD DE INGENIERÍA Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial

“Año de la consolidación del Mar de Grau”

PREPARACIÓN DE INOCULO

INFORME

: 01

ASIGNATURA

: Laboratorio de Biotecnología

DOCENTE

: Ing. Víctor Hugo Sarmiento Casavilca

ESTUDIANTE

: 

SEMESTRE

CÓDIGO CCENTE ORTIZ Jhasminy Elizabeth

: 2016-I

F. DE EJECUCIÓN PRÁCTICA: 18-12-15 F. DE ENTREGA DE INFORME: 28-12-15

ABANCAY – APURÍMAC 2016

121060

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL AGROINDUSTRIAL PREPARACIÓN DE INOCULO

I. SUMMARY In the present report entitled inoculum preparation, three objectives were studied; The first being to obtain identical phenotypic copies of an Aspergillus niger strain, where it was seeded in the PDA culture medium with an incubation period for 48 hours at 28 ° C; From which a spore count was performed by the Neubauer chamber method where 114.5*104 células/ml, was obtained because the Aspergillus niger spores resulted in a lower concentration of 10 106 esporas/ml, it is not necessary to carry out the dilution according to the established protocol. II. RESUMEN En el presente informe titulado preparación de inoculo, se estudió tres objetivos; siendo la primera obtener copias fenotípicas idénticas de una cepa de Aspergillus niger, donde se sembró en el medio de cultivo PDA con un periodo de incubación durante 48 horas a 28°C.; del cual se realizó un conteo de esporas por el método de la cámara de Neubauer donde se obtuvo 114.5*104 células/ml, debido a que las esporas de Aspergillus niger resultaron a una concentración menor

106 esporas/ml, no es necesario realizar la dilución según el protocolo

establecido. III. INTRODUCCIÓN El Aspergillus niger se encuentra en el grupo

sustrato (suelo, plantas, alimentos) y un

de los aspergillus negros, el cual se clasifica

micelio aéreo donde se forman las

dentro de la familia moniliaceae, orden

(sexuales y asexuales) (Alexopulos,1966)

moniliales,

clase

hyphomicetes,

esporas

filum

deuteromycota. (Kwon-Chung, 1992).

El Aspergillus es filamentoso (compuesto de cadenas de células, llamadas hifas, el tipo de

La mayoría de los hongos, sin embargo, son pluricelulares o filamentosos y se caracterizan por

estar

constituidos

por

filamentosos

ramificados o hifas que se desarrollan y

hongos opuesto a las levaduras, que se componen de una sola célula redonda). (Sáez Vega, Flórez Valdés, & Cadavid Rendón, 2002)

entrelazan formando el micelio. Existe un micelio vegetativo adosado a la superficie del

Para realizar un conteo de esporas, se puede usar la cámara de Neubauer. Para determinar la

Laboratorio de Biotecnología

Preparación de inoculo

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concentración se usa un hemacitómetro, con el

Cuando el cultivo está muy concentrado

cual se hacen conteos de esporas en campos de

(>106 cél/mL) se diluye la muestra con agua de

dimensiones conocidas, que darán el número de

mar

esporas por ml de la suspensión inicial. De esta

Generalmente una dilución 1:10 es suficiente,

forma, por medio de diluciones se obtiene el

pero es necesario verificar que la concentración

inóculo

resultante sea suficiente para obtener una

en

la

concentración

deseada.

(Arredondo Vega & Voltolina, 2007)

o

destilada

(según

sea

el

caso).

precisión adecuada (Lund et al., 1958). OBJETIVOS:

La cámara consta de dos campos de conteo, cada uno con nueve cuadros que, a su vez,

 Obtener copias fenotípicas idénticas de una cepa de Aspergillus niger.

están divididos en cuadros más pequeños.

 Aprender a usar la cámara de Neubauer.

Tanto los cuadros grandes como los pequeños

 Obtener un inoculo de esporas de Aspergillus

tienen dimensiones conocidas, de tal modo que por medio de fórmulas se puede obtener el número de esporas por ml (Gilchrist et al, 2005).

niger a una concentración de IV. MATERIALES Y MÉTODOS

La práctica de preparación de inoculo fue desarrollada

Una de las dificultades para el recuento al microscopio

es

obtener

una

buena

reproducibilidad, por lo cual es importante saber seleccionar el tamaño de la muestra, la dilución, el tipo de cámara de recuento, el objetivo del microscopio y la técnica de llenado de la

106 esporas/ml.

en

el

laboratorio

Biotecnología de la UNAMBA. Materiales Para su realización se usó los siguientes Materiales: Material biológico

cámara. En algunos casos, puede ser necesario

-Cepa de Aspergillus niger. Material vegetal

corroborar el volumen de la cámara que se está

-60 gr de papa blanca pelada.

utilizando. (Arredondo Vega & Voltolina, 2007)

Características

del

hematocitómetro

(Neubauer): Volumen 0.9 μL; profundidad: 0.1mm; Área: 9 𝑚𝑚2 ; tamaño celular: 2-30 μm; cel. /ml: 104 − 107 (Guillard y Sierracki, 2005)

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de

Material químico PDA: -4 gr Agar Agar -4 gr Glucosa Anhidro Material de laboratorio -Probetas -Pipetas -Gradillas -Matraces -Cámara de Neubauer Preparación de inoculo

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL AGROINDUSTRIAL  Una vez disuelta los agares en el medio

-Portaobjeto -Asa de siembra

PDA, este se traspasa a 10 tubitos con

Equipos

tapa rosca, colocamos los tubitos en un

-Autoclave -Vartex -Balanza analítica. -Microscopio Material anexo

vaso precipitado para pasar a ser esterilizado. Siembra de cepas de Aspergillus niger:

-Mandil. -Gorro. -Barbijo.

 Una vez estéril el medio de PDA, debido a que esta esta

Procedimientos:

solidificada,

Preparación de Agar (PDA) papa dextrosa:

medios

 Ya

pelada

la

papa

y

cortada

en

cuadraditos, pesamos 60 gr de ella.

calentamos

con

ayuda

microondas, y

de

los un

Figura 1. Cepa de Aspergillus niger

los tubitos se

 La papa se agregó a un vaso precipitado

solidificaran de nuevo a temperatura

con 100ml de agua destilada y se llevó a

ambiente de forma que esta queda en

ebullición (400°C) durante 15 minutos

forma de pico.

 Se filtró el agua de la papa y se elimina la

 Tomamos la cepa de Aspergillus niger y

papa picada y pelada, quedándonos con el

con la ayuda de una asa de siembra

agua de la papa, traspasamos a un

procedemos a sembrar cepas en los

matraz, a esta seguidamente se le añade

tubitos, todo esto en un ambiente estéril,

el 4gr de agar agar y 4gr de glucosa

tapamos los tubitos semiabiertos y se llevó

anhidro, más 100 ml de agua destilada

a incubación durante 48 horas a 28°C.

disolvemos bien para asegurarnos que no se

produzcan

grumos

formara el medio PDA.

agares,

esto

Selección de cepas:  Seleccionamos un tubito de los 10 tubos con esporas, teniendo en cuenta a la cepa que se desarrolló mejor.  Se le agregó 1ml de agua estéril a este tubito,

y

con

la

ayuda

del

Vartex

homogenizamos el agua y las esporas, con la finalidad de que haya suspensión de esporas. Conteo en cámara de Neubauer Laboratorio de Biotecnología

Preparación de inoculo

UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL AGROINDUSTRIAL  Del tubo de ensayo anterior (esporas + agua estéril) se sacó 0.1 ml con la ayuda de una

V. RESULTADOS

pipeta estéril de 1ml, y se gotea a la cámara

En el conteo de la cámara de Neubauer, se

de Neubauer, asegurándonos de que no se

obtuvo los siguientes resultados:

derrame y se disperse a todas las cámaras de ella.  Colocamos a un portaobjetos y lo llevamos a un microscopio, y con el debido protocolo de

identificación,

situamos muestra

Cuadro N°1: Resultados del conteo de esporas en las celdas del primer espejo. Celda

la

1er

2do

espejo

espejo

dentro,

1C

8

9

donde se centró en

2C

5

7

el primer espejo

3C

14

3

que

4C

11

0

5C

2

3

6C

5

3

7C

2

4

8C

7

5

9C

1

9

10C

1

0

11C

1

8

12C

4

3

13C

2

15

14C

1

11

15C

5

2

16C

4

2

 Promediamos los dos resultados del primer

17C

8

9

y segundo objetivo, debido a que esta es

18C

2

0

114.5 no se realiza la dilución, ya que no

19C

1

6

supera en cantidad para llegar a los 106 de

20C

1

2

posee

25

cuadrados, siendo la

técnica

de

conteo de derecha Figura 2. Técnica de conteo a izquierda en de la siguiente manera:  Evitamos células

contar que

las están

encima de las líneas de delimitación,

no

se

cuentan.

Figura 3. Esporas dentro de un espejo de la cámara de Neubauer

 Una vez realizado el conteo del primer espejo, pasamos al segundo espejo.

colonias. Laboratorio de Biotecnología

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21C

1

24

Según Lund et al., 1958; Cuando el cultivo está

22C

1

1

muy concentrado (>106 cél/mL) se diluye la

23C

6

1

muestra, en este caso se obtuvo 114.5*104

24C

6

2

células/ml;

25C

1

1

concentrada, por lo cual no fue necesario

Total

100

129

Cuadro

N°2:

de

Forma

Redonda

que

no

están

las VII. BIBLIOGRAFÍA

esporas de Aspergillus niger. Negro

solución

realizar una dilución respectiva.

Características

Color

una

Según el Cuadro N°1, podemos observar que el 2do espejo hay mayor cantidad de esporas que en el espejo 1er. Espejo.

Arredondo Vega, B. O., & Voltolina, D. (2007). CONCENTRACIÓN, RECUENTO CELULAR Y TASA DE CRECIMIENTO. ResearchGate. Sáez Vega, A., Flórez Valdés, L., & Cadavid Rendón, A. (2002). Caracterizacion de una cepa nativa de Aspergillus niger y evaluacion de acido citrico. Universidad EAFIT.

Hallamos el promedio de entre los dos espejos: 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 =

100 + 129 = 114.5 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 2

Entonces podemos decir que en los espejos hay 114.5*104 células/ml 104 = Factor de conversión de 0.1 μL a 1 mL No se realizó la dilución respectiva. VI. DISCUSIONES Según

Guillard

y

Sierracki,

2005;

las

Características del hematocitómetro (Cámara de Neubauer), tiene una capacidad de 104 − 107 células /ml, por ello es necesario que la dilución del inoculo de esporas de Aspergillus niger

tenga

una

concentración

de

106

esporas/ml, ya que más una dilución de 1:10 esta capacidad será completa. Laboratorio de Biotecnología

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Preparación de in