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• Vito Renal

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INFORME N° 07 DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO “KJELDAHL” i.

INTRODUCCION: El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no

proteicos.

El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utili| zando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción. En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2O como catalizador. VITO RENAL ALVARADO VARGAS 1

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ii.

OBJETIVOS:

 Conocer la cantidad de nitrógeno total y proteína total de una muestra alimenticia  Conocer la practica por el método kjeldahl  Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del contenido en proteína de un alimento.  Conocer el procedimiento experimental del análisis de proteínas por el método de Kjeldahl, recogiendo el nitrógeno sobre ácido bórico y valorándolo con una disolución de ácido clorhídrico o sulfúrico.  Calcular el porcentaje de proteína de un alimento a partir del contenido de nitrógeno obtenido por el método Kjeldahl.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA 3.1.-PROTEINAS: Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo y esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc. La proteína más abundante en plasma es la albúmina. Una de sus funciones más importantes es la de permitir el transporte de ácidos grasos, hormonas esteroides, bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso. La concentración de albúmina en plasma influye notablemente en el mantenimiento de la presión coloidosmótica, lo que estaría relacionado con su relativamente bajo peso molecular y su gran carga neta. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diversos orígenes, se observan hiperproteinemias. En general, ambas situaciones se ven acompañadas también por hipoalbuminemias. Los aumentos anormales de albúmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con deshidratación que produce el consecuente aumento en el contenido proteico del plasma Wilforth (1885 ). 3.1.1.-FUNCIONES: Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos VITO RENAL ALVARADO VARGAS 2

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ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas: Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes; Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares; La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre; Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o agentes patógenos; Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada; La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo durante la contracción; El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén.

3.1.2.- CLASIFICACION:  - Catálisis: Está formado por enzimas proteicas que se encargan de realizar reacciones químicas de una manera más rápida y eficiente. Procesos que resultan de suma importancia para el organismo. Por ejemplo la pepsina, esta enzima se encuentra en el sistema digestivo y se encargan de degradar los alimentos.  - Reguladoras: Las hormonas son un tipo de proteínas las cuales ayudan a que exista un equilibrio entre las funciones que realiza el cuerpo. Tal es el caso de la insulina que se encarga de regular la glucosa que se encuentra en la sangre.  - Estructural: Este tipo de proteínas tienen la función de dar resistencia y elasticidad que permite formar tejidos así como la de dar soporte a otras estructuras. Este es el caso de la tubulina que se encuentra en el citoesqueleto.  - Defensiva: Son las encargadas de defender al organismo. Glicoproteínas que se encargan de producir inmunoglobulinas que defienden al organismo contra cuerpos extraños, o la queratina que protege la piel, así como el fibrinógeno y protrombina que forman coágulos.  - Transporte: La función de estas proteínas es llevar sustancias a través de todo el organismo donde son requeridas. Proteínas como la hemoglobina que lleva el oxígeno por medio de la sangre.  - Receptoras: Este tipo de proteínas se encuentran en la membrana celular y llevan a cabo la función de recibir señales y para que la célula así pueda realizar su función. El acetilcolina que recibe señales para producir la contracción muscular. 3.2.-METODO KJELDAHL VITO RENAL ALVARADO VARGAS 3

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO – PERU LABORATORIO DE MET. ANALISIS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------El método Kjeldahl mide el contenido en nitrógeno de una muestra. El contenido en proteína se puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporción entre la proteína y el nitrógeno para el alimento específico que está siendo analizando, tal y como explicaremos más adelante. Este método puede ser dividido, básicamente en 3 etapas: digestión o mineralización, destilación y valoración. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón. Ello condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así como los reactivos empleados. En este artículo docente se explica el primer procedimiento, cuando el nitrógeno se atrapa sobre ácido bórico 3.2.1.- ETAPAS: (a) ETAPA DE DIGESTIÓN: Un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ión amonio, según la ecuación 1. catalizadores/ calor n - C -NH2 + H2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 (ec. 1) (b) ETAPA DE DESTILACION: se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se desprende en forma de amoniaco (ecuación 2). El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de ácido bórico (ecuación 3). (NH2)SO4 + 2 NaOH ----------------→ 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (ec. 2) NH3 + H3BO3 --------------------------→ NH4 + H2BO3 - (ec. 3) 2.3.- FACTOR Este factor de conversión está tabulado para cada grupo de alimentos. En la tabla 1 se recogen los factores para algunos alimentos.

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medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Un medio de cultivo es cualquier sustancia cuyo interior o sobre la cual pueden desarrollarse los microorganismos en el laboratorio. El desarrollo o cosecha de microorganismos obtenidos en el medio se denomina cultivo, cuando los microorganismos de un cultivo son de la misma especie, se dice que es un cultivo puro; cuando dos o más especies de microorganismos se desarrollan en un medio, se le conoce con un cultivo mixto; si un cultivo contiene accidentalmente más de una especie de microorganismos, se habla de un cultivo contaminado. (Coloma, 2003) 2.3.- Composición de un Medio de cultivo  Sustancias nutritivas apropiadas (proteínas, carbohidratos, minerales, agua, etc.)  Tener un pH conveniente; generalmente de 6.8 a 7.6  Estar previamente esterilizados.  Estar protegidos de contaminación. (Coloma, 2003)

sales

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2.4.- Finalidad de los medios de cultivo      

Aislamiento de gérmenes Identificación Conservación de bacterias Clasificación Obtención de toxinas Recolección o cosecha para preparación de vacunas. (Coloma, 2003)

2.5.- Arobios mesofilos: Son atodos aquiellas bacterias mesofilas capaces de crecer en agar nutritivo se investigación por el método de recunetro en placa con simbreas en profundidad que se basa en recuento en placas. Los arobios mesofilos se encuentra en alimentos congelados y en los conservadores en refrigeración.  Los resultados de estos alimentos permiten:  Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección  Determina el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos  Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte  Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos 2.6.- Coliformes La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, aún existen muchos coliformes de vida libre. 2.6.1.-Los coliformes como indicadores Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura. Asimismo, su número en el agua es VITO RENAL ALVARADO VARGAS 6

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO – PERU LABORATORIO DE MET. ANALISIS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------directamente proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces. 2.7.- S. aureus conocido como estafilococo áureo, es una bacteria anaerobia facultativa, grampositiva, productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y noesporulada que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella.1 Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía. Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria. En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante de las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente. 2.8.- Escherichia coli Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se le puede encontrar en multitud de ambientes, dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominóBacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor. Esta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, además de producir las vitaminas By K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología molecular. 2.9.- Salmonella es un género de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula (excepto la especie S. typhi[cita requerida]) ni esporas. Son bacterias móviles que producen ácido VITO RENAL ALVARADO VARGAS 7

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO – PERU LABORATORIO DE MET. ANALISIS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------sulfhídrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo fermentativo.Es un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, en el procesado de alimentos o en el hogar; también por vía sexual. Algunas salmonelas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo cual puede ser de cuidado cuando se manipulan este tipo de mascotas a la vez con alimentos.

IV. MATERIALES Y METODOS 3.1 EQUIPOS:  EL AUTOCLAVE  CONTADOR DE COLONIAS  BALANZA  ESTUFA 3.2 MATERIALES: 

CUADERNO DE APUNTES



CAMARA FOTOGRAFICA



PLUMONES / MARCADORES

3.3 INSTRUMENTOS

 PLACAS PETRI 

TUBOS DE ENSAYO

 PROBETAS 

MECHERO



PLASTICO



MUESTRAS (comida solida)

3.4 REACTIVOS: 

AGAR MC CONKEY

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AGAR BAIR PARKER



AGAR SS



AGAR PLATE COUNT.



AGAR NUTRITIVO

3.5 METODOLOGIA: 

Escuchar con atención al docente en sus respectivas explicaciones.



Tomar apuntes relativos.



Tomar imágenes a los respetivos materiales y equipos.

3.6.- PROCEDIMIENTO: El procedimiento se hizo en NUTRITIVO:

CINCO métodos con el caldo

i. AGAR MC CONKEY ii. AGAR BAIR PARKER iii. AGAR SS iv. AGAR PLATE COUNT. v. SOLUCION SALINA PEPTONADA

3.6.1 PASOS: a) Pesar las sustancias b) Disolverlas en la cantidad d agua destilada c) Filtrar si es necesario , enfriar moderadamente d) Esterilizar en autoclave por 15 min a 121° c e) Repartir en tubos de prueba f) Distribuir a cada placa g) Almacenar en la incubadora.

SOLUCION SALINA( agua peptonada) VITO RENAL ALVARADO VARGAS 9

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Para licuar la comida Solida de todas las muestras.

Fig. N° 01, solución salina.

COMPOSICION:  Peptona de caceina.  Cloruro de sodio  Hidrogeno, fosfato y potasio. 

PREPARACION: 25.5g-------------100ml X -------------45 ml X = 1,15 g

Fig. N° 02, caldo nutritivo.

COMPOSICION:       

Peptona de caceina y carne Cloruro de sodio Lactosa Mescla sales biliares Rojo neutro Violeta cristal Agar agr

PREPARACION: 50--------------100 ml X -------------- 75 ml X=3, 75g.

Fig N° 03, agar mc conkey. VITO RENAL ALVARADO VARGAS 10

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      

COMPOSICION: Peptona de caceina Extracto de carne Estracto de levadura Pirubate sódico Glicina Cloruro litio Agar agar

PREPARACION: 58g--------------950 ml X -----------75 ml X = 4,58 g.

Fig. N° 04, Agar bair Parker.

       

COMPOSICION: Peptona Lactosa Bilis bobina secada Citrato sódico Tiosulfato sódico Citato de amonio Verde brillante Rojo neutro

   

COMPOSICION: Peptona de fabrina Estracto de levadura Glucosa Agar agar

PREPARACION: 60 g ----------- 100ml X ------------75 ml X= 4, 5g. Fig. N° 05, Agar ss.

PREPARACION: 22,5g ---------1000ml X ------------75 ml X =1,68g. Fig. N° 06, Agar plate count.

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   

COMPOSICION: Pluripeptona Extracto de carne Cloruro de sodio Agar - agar

PREPARACION: 31,5g ------1000 ml X ------ 75 ml X = 2,325g. Fig N° 07, Agar nutritivo.

IV.- RESULATADOS Y DISCUSION: 4.1 RESULTADOS: En este resultado de determinación de proteínas por el método de kjeldahl se da lo siguiente con el producto harina de cañihua.

DATOS: V=ml Hcl = 6.8 Hcl N Hcl = 0.05479 N Meq N = 0.014 Peso muestra= 0.2 g %NITROGENO = ml. Hcl * N * meq N * gr. De Muestra

100

%NITROGENO = 6.8ml Hcl * 0.05479 N * 0.014 meqN * 100 0.2g

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO – PERU LABORATORIO DE MET. ANALISIS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------% NITROGENO = 2.60 % HALLAMOS EL PORCENTAJE SIGUIENTE MANERA:

DE

PROTEINAS

DE

LA

% PROTEINA = % n * FACTOR % PROTEINAS = 2.60 * 6.25 %PROTEINAS = 16.30 %

4.2.- CONCLUCIONES: o Podemos decir que hay la presencia de Aerobios mesofilos, coliformes y no hay presencia de Salmonella sp, S. aureus y E. coli (en este caso se hizo una resiembra ya que podría estar presente pero los resultados fueron negativos para todos los casos). o En los alimentos que analizamos de los restaurantes es óptimo para consumo humano, porque presenta 17x

ufc/ml, mientras que la norma permite

, en

cuando a coliformes también porque presenta 3 gérmenes por g o ml (según método del NMP) la norma permite 10; en cuanto a S. aureus, E. coli y Salmonella no hay presencia de estos en la muestra; por lo tanto la muestra analizada es aceptable para el consumo humano.

V.- BIBLIOGRAFIA Y BEWGRAFI  COLOMA, A. 2003. Microbiología Agroindustrial. Editorial Universitaria UNA – Puno.  Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biología de los Microorganismos. 10ª edición. Prentice-Hall. Madrid, 2003.  Díaz, R., Gamazo, C, y López-Goñi, I. Manual práctico de Microbiología. 2ª edición. Masson, S.A.. Barcelona, 1999.  MSc. Victor Choquehuanca, Guia de Prácticas de Microbiologia Agroindustrial II (Pag. 47.)

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO – PERU LABORATORIO DE MET. ANALISIS ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- MINSA, Norma Sanitaria de Criterios Microbiologicos.

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