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Importancia de las plantas C4 La enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) está ampliamente distribuida en células vegetales, bacterias fotosintéticas y no fotosintéticas cianobacterias y en algas verdes. Participa en procesos de la ruta fotosintética en la fijación del CO2 atmosférico en plantas C4 y en las plantas con metabolismo ácido crasuláceo (CAM). La enzima PEPC cataliza la b-carboxilación del fosfoenolpiruvato (PEP), reacción altamente exergónica con un cambio de energía muy negativo (DGº = -6 a -8 Kcal/mol) que es prácticamente irreversible bajo condiciones celulares, utiliza bicarbonato como sustrato y Mg2+, produce oxaloacetato (OAA) y fosfato inorgánico (Pi) (O’leary 1982), de acuerdo a la siguiente reacción: PEP + HCO3 - OAA+ Pi Se han descrito tres isoenzimas de PEPC en plantas superiores asociadas a diferentes funciones fisiológicas: 1) La isoenzima fotosintética de la hoja de plantas C4, que cataliza la fijación de CO2 en la primera reacción de la ruta C4. 2) La isoenzima de las plantas CAM, con función fotosintética presente en plantas de clima desértico, en donde la fijación de CO2 ocurre durante la noche. 3) La isoenzima anaplerótica, que desempeña un papel importante en el abastecimiento de compuestos de cuatro carbonos al Ciclo de Krebs, cuando los intermediarios de este ciclo están siendo usados para biosíntesis. Estas isoformas están codificadas por genes diferentes y pueden distinguirse por sus propiedades cinéticas y por su comportamiento cromatográfico. Las plantas C4 tienen la isoforma de PEPC con función fotosintética. Estas plantas se caracterizan por presentar dos tipos de células diferenciadas que participan en el metabolismo fotosintético de la hoja. En la Figura 1 se muestra un esquema simplificado de metabolismo C4, donde las células del mesófilo se encuentran cerca de la superficie externa de la hoja y toman CO2 directamente de la atmósfera, se hidrata a bicarbonato en el citosol por la enzima anhídrasa carbónica (CA) y, subsecuentemente lo asimila en forma de OAA, un ácido de cuatro carbonos, mediante PEPC. Este metabolito se transporta al interior del cloroplasto en donde se convierte en malato mediante la enzima málico deshidrogenasa (MDH) dependiente de NADP+ (NADPMDH). El malato, en intercambio con el OAA que se está produciendo, es transportado al citoplasma, para posteriormente, ser llevado a las células de la vaina vascular, las cuales se localizan en la periferia de las haces vasculares en donde están aisladas del intercambio directo de CO2 con la atmósfera. En las células de la vaina vascular, el malato es descarboxilado mediante la enzima málico deshidrogenasa descarboxilante dependiente de

NADP+ (enzima málica-NADP) y el CO2 producido se utiliza para la síntesis de carbohidratos mediante el Ciclo de Calvin que tiene lugar en estas células. El piruvato, producto de la descarboxilación regresa a las células del mesófilo y es transportado al interior del cloroplasto en donde produce PEP en una reacción catalizada por la enzima piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK).

La función principal de la ruta C4 es concentrar CO2 en las células internas de la vaina vascular por medio de la PEPC que funciona como una bomba, enviándolo a donde se encuentra la enzima Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa, para así suprimir su actividad de oxigenasa y la foto respiración asociada. El sistema fotosintético C4 opera con pérdidas de agua menores que la fotosíntesis C3, por que la afinidad por CO2 es superior en las C4 y pueden mantener alta velocidad de fijación con apertura estomatal limitada, que permite fotosíntesis activa en condiciones de relativa aridez y con baja concentración de CO2; intercambian CO2 por agua más eficientemente que las plantas C3, porque la concentración interna de CO2 es mucho más baja que en estas últimas. Por otra parte, la asimilación de CO2 es más eficiente en las plantas C4, porque poseen la capacidad de aprovechar mayor cantidad de energía luminosa y crecen mejor en condiciones de alta intensidad lumínica, por esa razón las plantas C4 dominan la flora de los pastizales y la producción de biomasa en regiones de clima tropical y subtropical. Las enzimas involucradas en la fotosíntesis se encuentran en una misma célula y su actividad se expresa de forma diferente a lo largo del día. En estas plantas durante la noche cuando la enzima PEPC está activa, los estomas se encuentran abiertos, el CO2 es fijado produciendo OAA a partir de PEP. El OAA se transforma en malato que se almacena en vacuolas hasta el día siguiente (Ting 1985). En las primeras horas de la mañana, la fijación del

CO2 la llevan a cabo conjuntamente la PEPC y Rubisco, pero al aumentar la temperatura e intensidad de luz, los estomas se cierran para evitar la pérdida excesiva de agua, es entonces cuando el malato es movilizado desde las vacuolas y la actividad de PEPC disminuye y está en presencia de su inhibidor. La descarboxilación del malato crea una concentración elevada de CO2, el cual es utilizado por la Rubisco en la misma forma que lo hacen los cloroplastos de las hojas de plantas C3. Las isoformas de PEPC con funciones no fotosintéticas, se encuentran en células de los tejidos no fotosintéticos de las plantas C4, en los tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos de plantas C3, en semillas y en frutos, donde funciona como enzima anaplerótica, que reabastece al ciclo de los ácidos tricarboxílicos de OAA, cuando sus intermediarios son empleados para síntesis de aminoácidos o porfirinas. Estas isoformas tienen mayor afinidad para el sustrato PEP, la Km es hasta 10 veces menor que la isoforma fotosintética, mientras que para bicarbonato, el segundo sustrato de la enzima tiene menor afinidad en plantas C3 que en plantas C4. Algunas de las funciones de PEPC como enzima anaplerótica son las siguientes: la asimilación de nitrógeno en nódulos aumenta por actividad de PEPC, cuando se requiere de esqueletos carbonados para la asimilación inicial de N, estos esqueletos se derivan del ciclo de los ácidos tricarboxílicos como acetoglutarato y oxaloacetato. En los nódulos de raíz de las leguminosas, la PEPC proporciona una cantidad sustancial de carbono para rellenar la poza de ácidos orgánicos para la síntesis de malato. Se ha determinado que hasta el 25% del carbono requerido para la actividad de nitrogenasa y la asimilación de nitrógeno podría ser aportado por PEPC. La PEPC puede comprender hasta el 2% del total de la proteína soluble del nódulo en especies que transportan amidas. La PEPC participa en tejidos con alta actividad metabólica como el tejido vascular de las semillas en formación, en la maduración y su germinación, se ha observado gran cantidad de PEPC durante la diferenciación, también se ha observado alto contenido de PEPC en la aleurona cuando la actividad mitótica en esas células es alta y puede estar relacionada con la acumulación de malato en el endospermo almidonoso, en los últimos estados de desarrollo del grano. Durante la maduración de las semillas de ricino también se ha observado que hay gran incremento de la actividad de PEPC y probablemente está involucrado en la generación de malato para la síntesis de lípidos de reserva.

Regulación de la PPCK en condiciones de estrés. Las plantas C4 y CAM son conocidas por tener una eficiencia hídrica superior a la de las plantas C3. Además, son plantas muy competitivas en ambientes salinos. La contribución de la PEPC a esta respuesta al estrés salino se

demostró en algunas especies C4 como el sorgo, y también en especies C3, con un aumento de la actividad PEPC. También se ha mostrado un aumento de la actividad PEPC en nódulos tratados con diferentes concentraciones de sal. En la planta halófita Mesembryanthemum crystallinum la salinidad induce la transcripción y la actividad de la PEPC y del metabolismo CAM. Sin embargo, curiosamente, el promotor de la PEPC de Mesembryanthemum crystallinum expresado en plantas transgénicas de tabaco no es inducible por sal. En la actualidad se sabe que el estrés salino conlleva un incremento de PEPC y paralelamente un aumento de actividad nocturna de la PPCK Ca2+independiente, en plantas CAM. Estudios realizados en la planta Clusia, con patrones fotosintéticos entre C3 y CAM constitutivo, han podido demostrar que la expresión de la PEPC es el factor primario determinado por la capacidad genotípica del CAM y que la abundancia de transcritos de PPCK regulados durante el día y la noche es más bien la consecuencia del funcionamiento del CAM y de la fluctuación diurna de metabolitos. Si bien se sabe que la expresión de la PEPC en la inducción del CAM por salinidad u otros factores de estrés es también producida por ABA, no existen datos sobre la participación de esta hormona en la expresión de la PPCK. La inducción de la PEPC y de la PPCK en el metabolismo CAM está bien documentada; sin embargo, existen pocos trabajos sobre la contribución del mecanismo de fosforilación de la PEPC a la adaptación o tolerancia a la salinidad, y en general a otros estreses, en plantas C4. Este concepto es tanto más importante cuanto que es 93 LA FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTÉTICOS C4 Y CAM conocido que en la planta C4 la fosforilación de la PEPC responde del 85% de la eficacia fotosintética. Los primeros resultados publicados sobre el efecto de la salinidad en la PPCK y en la fosforilación de la PEPC en una planta C4 fueron obtenidos por nuestro grupo y derivan del hallazgo de un espectacular aumento de la actividad de la PPCK en extractos crudos de plantas de sorgo aclimatadas a concentraciones crecientes de NaCl (172 y 258 mM NaCl). Este aumento de PPCK repercute en un incremento de la fosforilación in vivo de la PEPC, sin embargo los niveles de PEPC no se ven alterados (Echevarría et al., 2001). El efecto sobre la PPCK es independiente del estrés osmótico; se debe a la toxicidad iónica siendo también promovido por Li+, y no es promovido por la aplicación de ABA exógeno bien a cultivos hidropónicos o por pulverización foliar. Por último, el tratamiento con NaCl aumenta la actividad PPCK de hojas de sorgo en oscuridad en un proceso que depende de síntesis proteica. Este es el primer contexto metabólico en el que se induce la síntesis de la PPCK en oscuridad, en una hoja de planta C4.

La consecuencia de este hecho es un considerable aumento de la concentración de malato en oscuridad además de un incremento de malato en luz respecto de las plantas controles. La ausencia de fijación nocturna de CO2 parece indicar que la planta C4 en condiciones de estrés severo, al igual que algunas C3, podría manifestar un CAM-latente con un aumento de los niveles de malato tanto nocturnos como diurnos. Además del estrés salino se han descrito resultados sobre un aumento de la PPCK en aire libre de CO2, en plantas CAM y en estrés oxidativo. En conjunto estos resultados indican que la participación de la PEPC en situaciones de desecación, salinidad, o CO2 limitante, se puede establecer por una regulación del nivel de fosforilación de la enzima destacando el papel de la PPCK como enzima implicada en mecanismos de tolerancia al estrés.

Regulación de la degradación de la PEPC-quinasa. El protagonismo en los estudios de la PPCK ha estado centrado en la regulación de la síntesis de la enzima y de la cadena de transducción de señales que conduce a la síntesis/activación tanto en plantas C4 como CAM. Este hecho está justificado porque la síntesis de la PPCK es el elemento principal de la regulación circadiana de la actividad PPCK en estas plantas. En este sentido se le ha prestado muy poca atención a la regulación de la degradación y a los mecanismos implicados. Los resultados obtenidos por el grupo de Izui, utilizando una PEPC-quinasa recombinante de F. trinervia

expresada transitoriamente en protoplastos de células de mesófilo de maíz, sugieren que la PEPC-quinasa puede ser degradada vía ubiquitinaproteasoma. Sin embargo, los experimentos realizados con anticuerpos anti ubiquitina en los que utiliza extractos crudos o PPCK purificada de hojas de maíz no le han permitido mostrar que la PPCK de la planta esté ubiquitinada, sugiriendo que pueda ser debido a una falta de afinidad del anticuerpo o a la poca abundancia de esta proteína. Resultados recientes obtenidos por nuestro grupo muestran que en hojas de sorgo la degradación de la PPCK está regulada por ABA en un proceso que podría estar mediado por el proteosoma. Tanto el ABA como el inhibidor MG132, infiltrados a hojas o a discos de hojas inhiben la degradación de la PPCK. Estas son la primeras evidencias mostradas en plantas de que la degradación de la PPCK podría regularse por un mecanismo en el que estaría implicado el ABA y el proteosoma. La regulación de la degradación de la PPCK podría tomar relevancia en contextos específicos como plantas sometidas a estrés. En este sentido, hemos obtenido evidencias de que en plantas tratados con Li+ el aumento espectacular de PPCK que se mantiene a partir de 30 min de iluminación es independiente de la transcripción de la PPCK vía PLC, y se debe, en parte, a la inhibición de la degradación. En conclusión la PEPC es una enzima importante en la productividad de las plantas debido a que permite la asimilación más eficiente de CO2 atmosférico por las plantas C4 durante la fotosíntesis o cumple funciones de vital importancia en condiciones de estrés osmótico y durante el desarrollo de los vegetales. Estas características la hacen atractiva para su estudio, lo que ha llevado a la manipulación genética por técnicas de transformación en varias especies para aumentar los contenidos de esta proteína y de esta manera aumentar la productividad de los cultivos, aunque se han tenido resultados de sobreexpresión, no han sido significativos. No obstante, hay resultados que muestran que es posible aumentar los niveles de PEPC fotosintético en plantas transformadas aumentando la concentración de la enzima y mejorando el uso eficiente de agua cuando ésta es limitada, pero aún falta por hacer más. Con la obtención de plantas trasformadas eficientemente, los productos que surjan de estos serán beneficios para la sociedad.