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• Rob Cuevas

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Ejercicio 1

Ejercicio 2

Los alcaloides son compuestos orgánicos con actividad biológica. En un laboratorio de Farmacognosia se requiere separar, identificar y cuantificar los alcaloides presentes en una muestra de extracto vegetal. Para ello se seleccionó el método de Cromatografía Gas-Líquido y las siguientes condiciones de trabajo: columna de 1.5 m x 4 mm, de Cromosorb W impregnado en OV-101 al 5%. Como método de cuantificación se propuso la normalización de área. a) Diga qué tipo de columna se seleccionó. Justifique. Respuesta: se empleó una columna de relleno o empacada lo cual puede ser evidenciado en las dimensiones de la misma ya que las columnas capilares son mas largas. b) Diga qué condiciones de trabajo faltan por definir. Faltan por definir la temperatura del inyector, de la columna y del detector aspectos estos importantísimos en cromatografía gaseosa. Falta por definir la velocidad de flujo y el volumen de inyección. Falta por definir el tipo de detector utilizado c) Proponga y describa un método para la identificación de los componentes de la muestra. Un método de identificación puede ser por comparación de los tiempos de retención de cada compuesto que aparezca en el cromatograma con estándares de referencia correspondientes a los alcaloides analizados. d) Describa el método de cuantificación propuesto. En este método de cuantificación en caso de no realizarse con factor de corrección se suman las áreas de todos los peaks que aparecen en el cromatograma y esta suma corresponde al 100%, luego por regla de tres se determina a que por ciento corresponde el área del analito que se investiga. Es por esto que es un método que determina proporciones relativas no concentraciones exactas. Ejercicio 3 Para la determinación del contenido de aspirina y codeína en tabletas se aplica una técnica de HPLC, previa extracción de ambos principios activos con un solvente adecuado, en las siguientes condiciones cromatográficas: -

Columna Licrosorb RP C18 de 10 m (4 mm x 30 cm)

-

FM agua: metanol: acetonitrilo: ácido acético glacial (70: 15: 15: 1)

-

Detector UV de  variable a 250 nm

-

Volumen de inyección 10 L Señal

tiempo (min.)

a) ¿Qué mecanismo de separación se pone de manifiesto? ¿En qué se basó para identificarlo? Respuesta: se pone de manifiesto el mecanismo de separación reparto fase reversa o inversa, se identifica por la columna RP C18 lo que indica que la fase estacionaria en este caso es la silica gel a la cual se le enlazó un compuesto de 18 atomos de carbono haciendo de esta forma la fase estacionaria menos polar que la fase móvil. El fundamento de este método se basa en la capacidad que tienen los analitos de distribuirse entre la fase estacionaria y la fase móvil de acuerdo a su afinidad por cada una de ellas lo cual depende de la polaridad de las fases y de los analitos. b) ¿Por qué considera que se puede utilizar un detector UV para realizar esta determinación? Respuesta: Porque tanto la aspirina como la codeína tienen grupos cromóforos que permiten la absorción de radiación electromagnética proveniente de la zona Uv del espectro. c) Proponga 3 variaciones en las condiciones cromatográficas establecidas, para mejorar la resolución del cromatograma. Justifique su propuesta en cada caso. Respuesta: 1. Disminuir la velocidad de flujo. De esta manera los analitos están más tiempo en contacto con la FE y la FM pudiendo mejorarse asi la separación. 2. Utilizar una columna más larga porque así se aumentan el número de platos teóricos y aumenta el número de equilibrio entre FE-FM-analito mejorando la separación. 3. Disminuyendo el tamaño de particula del empaque de la columna cromatográfica porque asi se aumenta igualmente el número de platos teóricos y además disminuye el termino de camino tuortoso (A) de la ecuación de Van Deenter mejorando la separación. d) Una vez mejorada la resolución, explique cómo procedería experimentalmente para identificar los principios activos separados.

Respuesta: Mediante el método de comparación de los tiempos de retención. Ejercicio 4 El sunitinib es un fármaco de reciente incorporación en la terapéutica antitumoral, específicamente para el tratamiento del carcinoma avanzado de células renales. Para ajustar la dosis en pacientes con deterioro de las funciones hepáticas es necesario monitorear las concentraciones del fármaco en sangre, y para ello se utiliza la Cromatografía Líquida de Alta Resolución, previa extracción del compuesto de interés, con las condiciones cromatográficas siguientes:  Columna cianopropil Nucleodur (250 x 4 mm, 3 µm)  Sistema de solventes: acetonitrilo-acetato de amonio (55:45)  Velocidad de flujo: 1 mL/min  Temperatura: 40 0C  Detector espectrofotométrico (431 nm) a) Identifique el mecanismo de separación que se pone de manifiesto. Justifique cómo lo reconoció. Explique el principio químico físico en el que se fundamenta esta separación.

b) Justifique la utilización del detector empleado, atendiendo al principio de funcionamiento del mismo y a la estructura del compuesto analizado. c) Al comparar el cromatograma de la disolución obtenida a partir de una porción de sangre extraída de pacientes con tratamiento con el de la disolución obtenida a partir de una porción de sangre extraída de pacientes sin tratamiento, se observan tres picos en la primera disolución que no aparecen en la segunda, y que varían sus áreas en función de la dosis de fármaco administrada, lo cual hace suponer la presencia de dos de los principales metabolitos (S1 y S2) del fármaco. Describa una metodología que le permite corroborar la presencia de sunitinib y sus metabolitos en la muestra analizada. d) Si una vez identificados los componentes de interés, se desea determinar el contenido de sunitinib en la muestra analizada, describa cómo procedería experimentalmente si utiliza el método de la curva de calibración para ello.

sunitinib

Ejercicio 5 Para determinar la pureza de la materia prima de Enflurano (C 3H2ClF5O) se reporta en la farmacopea la técnica siguiente: Inyectar un volumen de enflurano (no más de 30 μL) en un cromatógrafo gaseoso equipado con un detector de conductividad térmica. El cromatógrafo debe tener una columna de acero inoxidable 3 m x 4 mm empacada con 20% de fase líquida G4 (dietilenglicol succinato poliéster) en S1A (tierras silíceas para cromatografía gaseosa) de 60-80 mesh. La temperatura de la columna se ajusta aproximadamente a 60 0 y se incrementa hasta 1200 a intervalos de 60 por minuto. El inyector debe mantenerse alrededor de 2000. Utilizar helio como gas portador a una velocidad de flujo de alrededor de 60 mL por minuto. Calcular la pureza, en porcentaje, dividendo 100 veces el área del pico correspondiente al Enflurano entre la suma de todos los picos en el cromatograma. a) Identifique las condiciones cromatográficas empleadas. b) Identifique el régimen de trabajo utilizado y diga como lo identificó. c) Explique el principio de funcionamiento del detector utilizado. d) Determine la pureza de la materia prima si se obtuvieron los siguientes resultados: Pico 1

Componente Impureza A

tR (min.) 1,23

Área 800

2

Enflurano

3,43

11900

3

Impureza B

4,05

550

Ejercicio 6 Para determinar el contenido de hidroclorotiazida y su principal metabolito en orina se extraen convenientemente ambos compuestos, se derivatizan y se analizan por una técnica de Cromatografía Gas-Líquido. Entre las condiciones cromatográficas que se definen se encuentran: -

Columna HP Ultra-1 de 25 m x 0.22 mm

-

Flujo 1 mL/min

-

Temperatura del inyector 250 º C

-

Temperatura inicial 130 º C, temperatura final 320 º C, velocidad de calentamiento 16 º C/min

a) Mencione las condiciones cromatográficas que faltan por definirse. b) Identifique el tipo de columna que se utiliza y el régimen de trabajo que se aplica. ¿En qué se basó para identificarlos? c) Explique cómo procedería para identificar los compuestos separados. d) Explique cómo procedería para cuantificar la hidroclorotiazida por adición de patrón interno, incluyendo los cromatogramas que se deben obtener de cada corrida realizada. Considere que como patrón interno se utiliza la clorotiazida (compuesto más polar que el principio activo y menos polar que el metabolito), y que los resultados deben expresarse en ppm.