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• Jose Julian

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• Genetica bacteriana Mutacion, reparacien y recombinacien Es importante que el ADN se replique de forma precisa para que las bacterias sobrevivan, pero se producen errores y alteraciones accidentales del ADN. Las bacterias tienen sistemas de reparacion del ADN eficientes, pero aun se siguen produciendo mutaciones y alteraciones en el ADN. La mayoria de estas mutaciones tienen escaso efecto sobre las bacterias o son nocivas, pero algunas mutaciones pueden proporcionar una ventaja selectiva para la supervivencia de las bacterias cuando se ven amenazadas por el entorno, el huesped o el tratamiento antibiotico.

Mutaciones y sus consecuencias Una mutacion se define como cualquier modificacion de la secuencia de bases de! ADN. Un cambio de una sola base puede ocasionar una transicion, en la que una purina es sustituida por otra purina o una pirimidina es reemplazada por otra pirimidina. Tambien puede aparecer una transversion, en la que una purina es sustituida por w1a pirimidina o viceversa. Una mutacion silenciosa es una rnodificacion de! ADN que no provoca cambios en la secuencia de aminoacidos de la proteina codificada. Este tipo de mutacion se debe a que un arninoacido puede estar codificado en mas de un codon. Una mutacion de sentido erroneo ( missense) es aquella que comporta la insercion de un arninoacido diferente en la proteina; sin embargo, cuando el nuevo arninoacido posee unas propiedades semejantes (p. ej., una valina que sustituye a una alanina) puede tratarse de una mutaci6n conservadora. Una mutacion sin sentido (nonsense) es aquella en la que se sustituye un codon que codifica a un aminoacido por un codon de interrupcion (p. ej., TAG [timidinaadeninaguanina]), lo que provoca que el ribosoma pierda el ARNm y finalice prematuramente la produccion de la proteina. Las mutaciones condicionales, como las mutaciones termosensibles, pueden deberse a mutaciones conservadoras que modifican la estructura o la funcion de una proteina importante cuando la temperatura es elevada. Se pueden observar modificaciones mas notables cuando la mutacion afecta a un gran numero de bases. Una pequeria delecion o insercion que no ocurra en multiples de tres produce una mutacion de desfase de lectura (Jrameshift mutation) que altera el sistema de lectura y habitualmente ocasiona la aparicion de un «peptide absurdo» y la interrupcion prematura de la proteina. Las mutaciones nulas, que destruyen completamente la funcion de! gen, aparecen cuando se registra una extensa insercion o delecion o una acusada reorganizaci6n de la estructura cromos6mica. La inserci6n de Jargas secuencias de ADN (muchos miles de pares de bases) por recombinacion, transposicion o tecnicas de ingenieria genetica puede producir mutaciones nulas por separaci6n de las partes de un gen e inactivaci6n de este. En la naturaleza se produce un gran nurnero de mutaciones de forma espontanea (p. ej., debido a errores de la polimerasa); sin embargo, las mutaciones tambien pueden ser consecuencia de agentes fisicos o quimicos. Entre los agentes fisicos utilizados para inducir la aparicion de mutaciones en las bacterias figuran los siguientes: el calor, que provoca una desaminacion de los nucleotides, la luz ultravioleta, que origina la formaci6n de dimeros de pirimidina, y laradiaci6n ionizante (p. ej., rayos X), que produce radicales hidroxilo hiperreactivos capaces de abrir la estructura anular de una base o

bien de generar roturas monocatenarias o bicatenarias en el ADN. Las sustancias quimicas de tipo mutagenico pueden agruparse en tres clases. Los analogos de nucleotides producen apareamientos err6neos y frecuentes errores en la replicaci6n de! ADN. Por ejemplo, la incorporaci6n de 5bromouracilo en la molecula de ADN en lugar de timidina permite su apareamiento con guanina en lugar de adenina, de forma que sustituye un par TA por un par GC. Los mutagenos de desfase de lectura, como algunas moleculas policiclicas planas (bromuro de etidio, derivados de la acridina), se insertan (o intercalan) entre las bases a medida que se enfrentan una a otra en la doble helice de! ADN. El aumento en el espacio existente entre los sucesivos pares de bases comporta la adici6n o supresi6n de una unica base y ocasiona la aparici6n de frecuentes errores durante la replicaci6n de! ADN. Las sustancias quimicas reactivas frente al ADN actuan directamente sobre este y modifican la estructura quimica de la base. Entre estas sustancias quimicas destacan el acido nitroso (HN0 2) y los agentes alquilantes (p. ej., nitrosoguanidina y etilrnetanosulfonato), de los que se sabe que afladen grupos metilo o etilo a los anillos de las bases de! ADN. Las bases modificadas pueden aparearse de forma anormal o bien no aparearse. Esta alteraci6n puede provocar la eliminaci6n de la base de! esqueleto de! ADN.

lntercambio genico en los procariotas Muchas bacterias, especialmente numerosas especies pat6genas, utilizan su ADN de forma promiscua. El intercambio de ADN entre celulas permite el intercambio de genes y caracteristicas entre ellas, lo que ocasiona la aparici6n de cepas bacterianas nuevas. Este intercambio puede resultar ventajoso para el receptor, especialmente cuando el ADN codifica mecanismos de resistencia a los antibi6ticos. El ADN transferido puede integrarse en el cromosoma de! receptor o bien mantenerse de manera estable en forma de elemento extracromosornico (plasmido) o como un virus bacteriano (bacteriofago) y se transmite a las bacterias hijas como una unidad dotada de capacidad aut6noma de replicaci6n. Los plasmidos son pequefios elementos geneticos cuya replicacion es independiente de! cromosoma bacteriano. La mayoría de los plasmidos son moleculas circulares bicatenarias de ADN con un numero variable de pares de bases (de 1.500 a 400.000). Sin embargo, Borrelia burgdorferi, el microorganismo etiol6gico de la enfermedad de Lyme, y la bacteria afin Borrelia hermsii presentan una caracteristica peculiar en el grupo de las eubacterias: la presencia de genomas y plasmidos lineales. Al igual que el ADN cromos6mico bacteriano, estos plasmidos se pueden replicar de forma autonorna, por lo que reciben el nombre de replicones. Algunos plasmidos, como el plasrnido F de E. coli, son episomas, lo que indica que se pueden integrar en el cromosoma de! huesped, Los plasmidos portan informaci6n genetica, la cual puede proporcionar una ventaja selectiva a las bacterias aunque no constituya una ventaja esencial para la bacteria. Por ejemplo, los plasrnidos pueden conferir un nivel alto de resistencia a antibioticos, codificar la producci6n de bacteriocinas, toxinas, determinantes de virulencia y con ten er otros genes que otorguen una ventaja respecto a la metabolizaci6n de ciertos sustratos en comparaci6n con otros microorganismos o en el interior de! organismo hospedador (fig. 1310). El nurnero de copias de plasmido producidas por una celula es especifico de cada uno

de ellos. Este numero es la relaci6n existente entre las copias de! plasrnido y el numero de copias de! cromosoma. Su valor puede ser bajo (hasta de 1 en el caso de los plasmidos grandes) o alto (hasta de 50 en los plasmidos mas pequenos). Los plasmidos de gran tamafio (20120 kb), como el factor F

de fertilidad de E. coli o el factor de transferencia de resistencia (80 kb), a menudo pueden mediar su propia transferencia de una celula a otra mediante un proceso denominado conjugacion (v. apartado «Conjugaci6n», mas adelante en este capitulo). Estos plasmidos conjugativos codifican todos los factores necesarios para su propia transferencia. En cambio, otros plasrnidos pueden ser transferidos a las celulas bacterianas por medio de mecanismos distintos de la conjugaci6n (p. ej., por transformaci6n o por transducci6n). Estos terrninos se estudian tarnbien mas adelante en este capitulo. Los bacteriofagos son virus bacterianos con un genoma de ADN o de ARN protegido generalmente por una membrana o una capa de proteinas. Estos elementos geneticos extracromos6micos pueden sobrevivir fuera de la celula de! huesped y ser transmitidos de una a otra celula. Los bacteri6fagos infectan a las celulas bacterianas y se pueden replicar hasta alcanzar un gran nurnero y condicionar la lisis celular (infeccion Utica) o, en algunos casos, integrarse en el genoma de! huesped sin destruirlo (estado Iisogenico), como sucede en el caso de! bacteri6fago lambda de E. coli. Algunos bacteri6fagos lisogenicos transportan genes para toxinas (p. ej., el corinefago beta contiene el gen de la toxina difterica), El bacteri6fago lambda sigue siendo Iisogenico mientras se siga sintetizando proteina represora, y esto evita que el fago deje de estar integrado para poder replicarse y abandonar la celula. El dano en el ADN de las celulas del huesped por radiaci6n u otro mecanismo o la incapacidad para producir la proteina represora es una serial de que la celula hospedadora ya no esta sana y no es un buen lugar para «vivir de gorra». Los transposones (genes «saltarines») son unos elementos geneticos m6viles (fig. 1311) que pueden transferir ADN de una posici6n a otra de! genoma o entre distintas moleculas de ADN dentro de una misma celula (p. ej., de un plasrnido a otro ode un plasmido a un cromosoma). Los transposones se detectan tanto en los procariotas como en los eucariotas. Los transposones mas simples se denominan secuencias de insercion y su longitud comprende de 150 a 1.500 pares de bases con repeticiones invertidas de 15 a 40 pares de bases y la informaci6n genetica minima necesaria para su propia transferencia (es decir, el gen que codifica la transposasa). Los transposones complejos contienen otros genes, como genes que proporcionan resistencia a antibi6ticos. En ocasiones, los transposones se introducen en el interior de los genes y los inactivan. Si la inserci6n e inactivaci6n tienen lugar en un gen encargado de codificar una proteina esencial, la celula muere. Algunas bacterias pat6genas utilizan un mecanismo sernejante para coordinar la expresi6n de un sistema de factores de virulencia. Los genes de actividad pueden agruparse en un islote de virulencia o patogenicidad rodeado por unos elementos m6viles semejantes a los transposones que les permiten moverse tanto en el interior del cromosoma como hacia otras bacterias. Cualquier unidad genetica puede reaccionar ante la presencia de un estimulo ambiental (p. ej., pH, calor o contacto con la superficie de la celula de! huesped) como mecanismo de coordinaci6n de la expresi6n de un proceso complejo. Por ejernplo, el islote SPI1 de Salmonella codifica 25 genes para un dispositivo de secreci6n de tipo III que permiten la entrada de esta bacteria en celulas no fagociticas.

Mecanismos de transferencia genetica entre celulas El intercambio de material genetico entre las celulas bacterianas puede tener lugar a traves de uno de los tres mecanismos siguientes (fig. 1312): 1) transformacion, que es una captaci6n activa y la incorporaci6n de ADN ex6geno o extrafio; 2) conjugacion, que consiste en un apareamiento o intercambio cuasisexual de informaci6n genetica entre una bacteria (donante) y otra bacteria (receptora), o 3) transduccion, la cual se caracteriza por la transferencia de informaci6n genetica de una bacteria a otra por media de un bacteri6fago. En el interior de la celula, el transposon puede «saltar» entre distintas moleculas de ADN (p. ej., de plasmido a plasmido ode plasrnido a cromosoma). Varios de estos mecanismos contribuyen a la generaci6n de Staphylococcus aureus resistentes a vancomicina

Transformaci6n La transforrnacion es el proceso mediante el cual las bacterias captan fragmentos de ADN desnudo y los incorporan a sus genomas. La transformaci6n fue el primer mecanismo de transferencia genetica que se descubri6 en las bacterias. En 1928, Griffith observ6 que la virulencia del neumococo se relacionaba con la presencia de una capsula de polisacarido y que los extractos de bacterias encapsuladas productoras de colonias lisas podian transmitir este rasgo a las bacterias no encapsuladas, las cuales presentan generalmente una morfologia rugosa. Alrededor de 15 anos despues, los estudios de Griffith permitieron que Avery, McLeod y McCarty identificaran el ADN como el principio clave del mecanismo de transformaci6n. Ciertas especies presentan una capacidad natural de captaci6n de ADN ex6geno (por lo que se definen como «competentes» ), como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y los generos Bacillus y Neisseria. La competencia aparece al final de la fase logaritmica de crecimiento. E. coli y la mayoria de las bacterias carecen de la capacidad natural para captar ADN, y ha de inducirse la competencia o utilizarse metodos quimicos o la electroporaci6n (empleo de pulsos de alto voltaje) para facilitar la captaci6n de ADN plasmidico y de otro tipo.

Conjugaci6n La conjugacion produce una transferencia unidireccional de ADN desde un celula donante ( o macho) has ta una celula receptora (o hembra) a traves de! llamado pilus sexual. La conjugaci6n se da en la mayoria de las eubacterias, si no en todas, por lo general entre miembros de la misma especie o de especies relacionadas, pero se ha demostrado tambien entre procariotas y celulas de plantas, animales y hongos. El tipo de acoplamiento (sexo) de la celula depende de la presencia (celula macho) o ausencia (celula hembra) de un plasrnido conjugativo, como el plasmido F de E. coli. El plasrnido F se define como conjugativo porque contiene todos los genes necesarios para su propia transferencia, como la capacidad de fabricar pili sexuales e iniciar la sintesis de ADN en el llamado «origen de transferencia» ( oriT). El pelo sexual es un tipo de secreci6n de tipo IV especializado. Al transferirse el plasmido F, las celulas receptoras se convierten en celulas macho F'. Cuando un fragmento de ADN cromos6mico se ha incorporado a la secuencia de! plasmido, se designa como «plasmido F prima» (F'). Cuando este plasmido se transfiere al interior de la celula receptora, transporta el fragmento y lo convierte en un F' macho. Cuando la secuencia de! plasmido se integra en el interior de! cromosoma bacteriano, la celula se designa como «celula Hfr» (alta frecuencia de recombinaci6n). El ADN transferido por conjugaci6n no es una molecula bicatenaria

helicoidal, sino una rnolecula monocatenaria. La movilizaci6n cornienza cuando una proteina codificada por un plasrnido introduce una rotura monocatenaria en un punto especifico de! oriT. La muesca asi formada inicia un replicaci6n por circulo rodante y la cadena lineal desplazada se dirige hacia la celula receptora. A continuaci6n, el ADN monocatenario adopta nuevamente una conformaci6n circular y sintetiza su cadena complementaria. La conjugaci6n comporta la transferencia parcial de la secuencia plasrnidica y de un fragmento de! ADN cromos6rnico bacteriano. Como consecuencia de la fragilidad de la conexi6n formada entre las dos celulas acopladas, la transferencia se suele interrumpir antes de finalizar el proceso, de modo que unicamente se transfieren las secuencias cromos6rnicas cercanas al plasrnido F integrado. La interrupci6n artificial de un acoplarniento entre un Hfr y una pareja F" ha resultado util para cartografiar el ADN cromos6mico de E. coli. Este tipo de mapas muestra la posici6n de cada gen en minutos ( en relaci6n con los 100 minutos que requiere la transferencia completa a 37 °C) segun su momento de entrada a una celula receptora respecto a un origen fijo.