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• Christian Blanqviazvl

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ELISA: FUNDAMENTOS TIPOS Y APLICACIONES GUSTAVO PANANA ACUÑA DIRECTOR TÉCNICO CENTRO DE DIAGNOSTICO CANTELLA

POR QUE ELISA?

ELISA CONCEPTOS Y FORMATOS DE ENSAYO • El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. • Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

 ELISA HOMOGÉNEO  ELISA HETEROGÉNEO  ELISA DIRECTO  ELISA DE CAPTURA  ELISA COMPETITIVO  ELISA NO COMPETITIVO

METODOLOGÍA DE ELISA Diferentes ELISA  Detección de anticuerpos específicos:  

ELISA indirecto ELISA doble sandwich

 Detección de antígenos: 



ELISA directo competitivo ELISA sandwich

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido

Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.

Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima

Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo

Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

Adición del substrato

Desarrollo del color

Unión del substrato a la enzima

QUE DETECTA?

Detección de Proteínas o un organismo

Detección de una Molécula pequeña

ELEMENTOS DE UN ELISA  Pocillos    

Microplacas de poliestireno Volumen de 350 uL Área interna de 2.5 cm2 Formato de 96 pocillos

 Adsorción de Antígenos o Anticuerpos 



Dilución del antígeno o anticuerpo en buffer carbonato (pH 9.6) e incubación 3h 37°C Tratamiento a 40-50°C con PBS hasta desecación

ELEMENTOS DE UN ELISA  Solución de Lavado    

Cloruro de Sodio Tween 20 Agua Destilada PBS

 Conjugados   

ß-galactosidasa Fosfatasa Alcalina Peroxidasa

SENSIBILIDAD  Depende exclusivamente del valor K (constante de equilibrio

entre la interacción antígeno-anticuerpo)  Con K = 1012M-1 y 1% CV, la detección más baja posible es de 10-14 M Como Incrementamos la sensibilidad?  Reducir ruido de fondo, optimizando la union antígeno al pocillo y sesiones de lavado  La baja calidad de los pocillos suele dar señales bajas o bajo nivel de unión con el antígeno  Incorporando técnicas indirectas de marcado  Aumentando los tiempos de incubación hasta el punto de equilibrio de la reacción.

TÉCNICA: MEIA

APLICACIONES Enfermedades producidas por parásitos  Babesias y tripanosomas  Toxocara canis  Toxoplasmosis  Triquinosis Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias  Mycobacterium tuberculosis  Brucelas  Enterotoxinas Vibrio cholerae  Estreptococos  Salmonelas Enfermedades producidas por virus  Enfermedad de Aujeszky  Enfermedad de Newcstle  Fiebre aftosa  Leucemia felina  Peste porcina africana  Peste porcina clásica  Rinotraqueitis infecciosa  Rotavirus  Artritis vírica

Hormonas  Gonadotropina coriónica  Progesterona  Testosterona  Hormonas tiroideas Cuantificación de inmunoglobulinas  IgG  IgE  IgA Anticuerpos  Anti-DNA  Factor reumatoide  Inmunocomplejos circulantes

EQUIPOS REQUERIDOS

FASES QUE DEBIÓ PASAR EL KIT ANTES DE PODER SER COMERCIALIZADO O EMPLEADO EN EL LABORATORIO DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO

VALIDACIÓN ANALÍTICA

VALIDACIÓN CLÍNICA

VALIDACIÓN DE ELISA En el desarrollo de un nuevo kit estos ensayos incluyen: Estudios de estabilidad 

 

De las placas, látex etc. sensibilizadas De los conjugados De los sustratos.

Análisis de muestras   

En paneles caracterizados En poblaciones al azar Establecer efecto de la matriz e interferencias

no específicas.